12 Эпидемиология ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

Эпидемиология
616-036.22:579.842.1./2
ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ
PSEUDOMONAS AERUGINOSA ПРИ МНОГОКРАТНЫХ ПЕРЕСЕВАХ И ХРАНЕНИИ
М.В. Кузнецова1,2,
Т.И. Карпунина1,
Ю.К. Щербакова1,
Л.Н. Сторчеус1,
Е.В. Афанасьевская1
1ГБОУ ВПО «Пермская
государственная
медицинская академия
им. ак. Е.А. Вагнера» МЗ РФ,
2Институт экологии и
генетики микроорганизмов
УрО РАН, г. Пермь
Êóçíåöîâà
Ìàðèíà Âàëåíòèíîâíà –
e-mail: mar@iegm.ru
При динамическом изучении биологических свойств клинических штаммов P. aeruginosa
установлено, что свежевыделенные культуры вариабельны по уровню продукции
пиовердина, пиоцианина и способности к формированию биопленок. Сильная
положительная связь, выявленная между синтезом двух пигментов в первом пассаже
(R=0,704; р=0,003), проявлялась и после хранения культур на искусственных питательных
средах в течение 1,5 месяцев (R=0,592; p=0,002), но после 8 месяцев становилась
недостоверной (R=0,418; p=0,121). При многократных пересевах и хранении определены
разнонаправленные эффекты изменения биопленкообразования. Выявлены две основные
тенденции: у части штаммов изменения признаков при пересевах или смене среды
культивирования были выражены умеренно или незначительно, а после хранения
наблюдали снижение этих показателей. Напротив, другая часть изолятов, как с высоким,
так и с низким уровнем проявления признаков, вне макроорганизма их утрачивала, но
любой провоцирующий фактор обуславливал быстрое восстановление патогенного
потенциала. Можно полагать, что выявленные различия в поведении штаммов
свидетельствуют об их различном происхождении: случайный занос во внутрибольничную
среду или госпитальная природа.
Ключевые слова: P. aeruginosa, факторы патогенности,
хранение культур, признаки госпитальности.
The dynamic study of the biological properties of clinical strains Pseudomonas aeruginosa has
proved that new-grown culture is variable for the level of production of pioverdin, pyocyanin and
the ability of forming of biofilms. The strong positive connection between the synthesis of two
pigments in the first passage (R=0,704; р=0,003) has been kept also after culture storage at the
artificial nutritional mediums for 1,5 month (R=0,592; p=0,002), but after 8 months it became
invalid (R=0,418; p=0,121). Multiple passages and storage showed multidirectional effects of the
changes of biofilm formation. There were stated two tendencies: some strains had moderate or
small change of signs during passages or change of the cultivation medium, and there was a
decrease of these indices after storage. On the other hand, the other part of isolates with a high
or low level of signs manifestations lost those signs outside the macroorganism, but any promoter led to fast restoration of pathogenic potential. It is possible to consider that all the differences in strains behavior speak about their different origin: accidental getting into nosocomial
environment or hospital nature.
Key words: P. Aeruginosa, pathogenic factors, storage of culture, signs of hospital nature.
бщеизвестно, что специфика эпидемического процесса различных нозологических форм гнойносептических инфекций определяется видом возбудителя. Одной из составляющих информационных потоков
при организации эпидемиологического наблюдения являются данные о микроорганизмах, циркулирующих в отделениях стационара [1]. Постоянное мониторирование микрофлоры, выделяемой в лечебно-профилактических учреждениях, а также выявление штаммов, предположительно
госпитальных, служат основой для своевременного проведения санитарно-противоэпидемических мероприятий с
целью профилактики внутрибольничных инфекций [2].
При расследовании случаев инфекционных осложнений,
связанных с оказанием медицинской помощи, дополнительным важным критерием этиологической значимости
12
№ 2 ( 7 ) м а й 2 01 3
условно-патогенных бактерий служит определение у них
различных факторов патогенности, а их широкий набор и
выраженность могут свидетельствовать о принадлежности
штамма к внутрибольничному [3, 4]. Фенотипические проявления патогенного потенциала микроорганизмов подчинены влиянию разнообразных факторов, расшифровка
механизмов действия которых требует углубленных, зачастую пролонгированных во времени исследований.
Получаемые при этом количественные показатели токсинои/или ферментообразования штаммов характеризуются
многофакторной детерминированностью. В значительной
степени на изучаемые характеристики оказывает влияние
тот факт, что бактериальные культуры подвергаются многократным пересевам или длительному хранению на искусственных питательных средах. Например, показано, что у
Эпидемиология
Сandida albicans способность к адгезии меняется при проведении более двух пассажей [5]. У клинических изолятов
Pseudomonas aeruginosa после нескольких пересевов ослабевают интенсивность синтеза пигментов и гемолитические
свойства [6]. Подобные эффекты могут повлиять на оценку
результатов комплексных исследований при мониторинге
нозокомиальных штаммов.
ЦЕЛЬЮ РАБ
БОТЫ явилась оценка ряда биологических
свойств клинических штаммов P. aeruginosa при многократных пересевах и хранении на искусственных питательных
средах.
МАТЕРИАЛЫ
Ы И МЕТОДЫ
В работе использовали референтный штамм P. aeruginosa
АТСС 27853 (F-53), полученный из ФГБУ «ГИСК им.
Л.А. Тарасевича» Минздрава РФ (Москва). Клинические
штаммы (n=14) изолированы в марте 2012 г. от пациентов
хирургического стационара Перми.
Ночные культуры P. aeruginosa, стандартизованные до 2,0
по МакФарленду, количественно засевали в пробирки с
бульоном Луриа-Бертани (1,0 мл стандартизованной культуры и 5,0 мл LB-бульона) и в полистироловые плоскодонные 96-луночные панели (стандартизованную культуру разводили 1:100). Через сутки определяли продукцию пиовердина, пиоцианина и пленкообразующую способность изолятов. Проведено пять пассажей, культуры между экспериментами хранили в течение недели на LB-агаре при 4°С.
Факторы патогенности определяли при каждом пассаже,
после 1,5- и 8-месячного хранения культур на скошенном
LB-агаре при 4°С (под вазелиновым маслом), а также при
посеве на среду Мак-Конки. Супернатанты получали фильтрованием (диаметр пор 0,22 мкм) после центрифугирования 2,0 мл суточной культуры P. aeruginosa при 8000 об./
мин. в течение 10 мин. на микроцентрифуге «Эппендорф»
(Германия). Содержание флуоресцирующего пигмента,
сидерофора пиовердина, оценивали согласно E. Deziel et al.
(2001), измеряя флюоресценцию при длине волны 460 нм
после возбуждения при 400 нм [7]. Продукцию феназинового сине-зеленого пигмента пиоцианина определяли
путем измерения оптической плотности (ОП) супернатантов
при длине волны 695 нм [7]. Биопленкообразование изучали согласно G.F. O`Toole et al. [8]. Биомассу пленки оценивали по уровню экстракции этанолом 0,1% водного раствора
генцианвиолета, который определяли при длине волны 580
нм в единицах оптической плотности (Ед, ОП580). Все
измерения осуществляли на многофункциональном микропланшетном ридере Infiniti M200 (Tecan, Австрия).
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием стандартных пакетов компьютерных
программ Microsoft Excel 2003 и STATISTICA 6.0 [9]. Все
показатели представлены в виде средней арифметической
и ее ошибки (M±m). Вид распределения изучаемых при-
13
№ 2 ( 7 ) м а й 2 01 3
знаков определяли с использованием критериев
Колмогорова-Смирнова, Лиллиефорса и Шапиро-Уилка.
Для исследования связи двух признаков вычисляли непараметрический коэффициент ранговой корреляции Спирмена (R),
А
Б
РИС. 1.
Уровень продукци
ии пиовердина, пио
оцианина (А) и био
опленкообразования (Б) при перви
ичном посеве штам
ммов P. aeruginosaa: 1 – АТСС 27853,
2-15 – клинически
ие изоляты.
А
Б
РИС. 2.
Уровень продукци
ии пиовердина клиническими штаммаами P. aeruginosa:
А – при многократных пересевахх и после хранен
ния (абсолютные
значения); Б – пр
ри пассаже на среду Мак-Конки (% уссиления).
Эпидемиология
РИС. 3.
нденций измененияя продукции пиовеердина штаммами
Примеры двух тен
P. aeruginosa.
После хранения культур в условиях холодильника в течение 1,5 месяцев отмечено снижение, иногда значительное,
продукции флюоресцирующего пигмента для 13 культур
(рис. 2А). Нужно отметить, что через 1,5 месяца у
P. aeruginosa АТСС 27853 уровень синтеза пиовердина снизился в 2,4 раза и восстановился только после 2–3 пересевов (данные не представлены). В то же время у 4 клинических штаммов изменения были статистически не значимы.
После восьми месяцев хранения культур на скошенном
агаре (один штамм не вырос) выявлены разнонаправленные эффекты: у 6 штаммов продукция пиовердина значительно снизилась или полностью утратилась, 6 – сохранили
уровень продукции, сопоставимый с уровнем при первичном выделении, а у двух – оказалась даже выше, чем при
выделении. Для всех культур пересев с LB-среды на среду
14
№ 2 ( 7 ) м а й 2 01 3
Мак-Конки, содержащую ингибиторы роста – желчные кислоты, приводил к усилению продукции пиовердина, в десяти случаях более чем в 2 раза (рис. 2Б).
ТАБЛИЦА 1.
Изменение продукции экзометаболи
итов и биопленкоо
образования
штаммами P. aerug
ginosa при многокр
ратных пересевах и хранении
Продукция
пиоцианина
Продукция
пиовердина
Культуры P. aeruginosa
Изучаемый
признак, пассаж АТСС 27853
Клинические изоляты, n (%)
А1 и А2
¯*
¯ - 7, ¯* - 5 (85,7%)
* - 2 (14,3%)
А1 и А5
¯*
¯ - 11, ¯* - 1 (85,7%)
* - 2 (14,3%)
А1 и Ах
¯
¯ - 10, ¯* - 2 (85,7%)
* - 2 (14,3%)
А1 и Ам
- 14 (100%)
А1 и А2
*
¯ - 6, ¯* - 4 (71,4%)
* - 4 (28,6%)
А1 и А5
*
¯ - 5, ¯* - 2 (50%)
-2, *- 5(50%)
А1 и Ах
¯
¯ - 8, ¯* - 2 (71,4%)
* - 4 (28,6%)
А1 и Ам
- 12 , * - 2 (100%)
А1 и А2
¯ - 6, ¯* - 1 (50%)
- 2, * - 5 (50%)
А1 и А5
¯ - 4, ¯* - 5 (64,3%)
- 4, * - 1 (35,7%)
А1 и Ах
¯
¯ - 7 (50%)
- 5, * - 2 (50%)
А1 и Ам
¯* - 1 (7,1%)
- 12, * - 1 (92,9%)
Биопленкообразование
достоверными считали связи при р<0,05. Силу корреляции
оценивали в зависимости от значения коэффициента корреляции: |R| ⭐ 0,25 – слабая корреляция; 0,25< |R| < 0,70 –
умеренная корреляция; |R| ⭓ 0,70 – сильная корреляция.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Ы
Установлено, что при первичном посеве клинические
изоляты P. aeruginosa существенно различались по продукции экзометаболитов: выявлены суперпродуценты, штаммы
со средним и низким уровнем синтеза пиовердина и пиоцианина (рис. 1А). Обнаружена сильная положительная связь
между этими признаками (R=0,704; р=0,003), что вполне
объяснимо, учитывая особенности регуляторных механизмов P. aeruginosa [10].
После второго пассажа происходило снижение продукции пиовердина у большей части клинических штаммов
(табл. 1). При последующих пересевах тенденция сохранялась, но с 3–4-го пассажа изменения были недостоверны
практически у всех изолятов. У 7 штаммов темп снижения
составил более 40% (тенденция выраженная).
Однонаправленность эффекта подтверждается сохранением положительной связи между показателями продукции
пиовердина во втором и пятом пассаже (R=0,686; p=0,005).
Примечание: А1 – первый пассаж, А2 – второй пассаж
ж, А5 – пятый пассаж, Ах – после хранения 1,5 месяца, Ам – пассаж на среде
Мак-Конки, * – неедостоверный эффект.
Схожие эффекты отмечены при оценке уровня пиоцианина после хранения штаммов и смене среды культивирования. Заслуживает внимания тот факт, что сильная положительная связь, выявленная между синтезом двух пигментов
в первом посеве, сохранялась и после хранения культур на
скошенном LB-агаре при 4°С в течение 1,5 месяцев (R=0,592;
p=0,020), но после 8 месяцев связь была недостоверной
(R=0,418; p=0,121).
При изучении способности к образованию биопленок
выявлено, что клинические штаммы также различались по
этому признаку (рис. 1Б), при этом достоверных связей с
продукцией изучаемых пигментов не выявлено (R=0,336;
p=0,221 – для пиоцианина и R=0,371; p=0,173 – для пиовердина). При многократных пересевах и хранении на искусственных питательных средах определены разнонаправленные эффекты изменения биопленкообразования, за исключением пассажа на среду Мак-Конки, когда биомасса пленок достоверно увеличивалась у референтного и у 13 клинических штаммов. Вариабельность пленкообразующей способности может объясняться тем, что данный процесс опосредован разнообразными структурами и физиологическими свойствами бактерий (гидрофобность клеточной стенки,
адгезины, жгутики, подвижность, синтез матриксных компонентов экзополисахаридов и др.), которые могут изменяться в процессе пересевов и хранения.
ОБСУЖДЕНИ
ИЕ
Таким образом, при многократных пересевах и хранении
нозокомиальных штаммов P. aeruginosa показано следующее: свежевыделенные культуры оказались вариабельными по уровню продукции пиовердина, пиоцианина и
Эпидемиология
способности к формированию биопленок, при этом и
высокий, и низкий уровень продукции экзометаболитов
мог сочетаться с выраженным биопленкообразованием.
Это согласуется с представлениями о видовой и популяционной гетерогенности микроорганизмов, которая, по мнению В.Д. Белякова и соавт. (1987), является важнейшей
движущей силой эпидемиологического (инфекционного)
процесса [11].
Несмотря на то, что для P. aeruginosa характерно разнообразие тонких механизмов регуляции экспрессии факторов вирулентности, выявлено две основные тенденции: у
части штаммов изменения признаков при пересевах или
смене среды культивирования были выражены умеренно
или незначительно, а при хранении наблюдалось снижение
синтеза пиовердина/пиоцианина и биопленкообразующей
способности (рис. 3). Напротив, другая часть изолятов, как с
высоким, так и с низким уровнем проявления признаков,
вне макроорганизма их утрачивала, но любой провоцирующий фактор – смена условий или среды культивирования –
обуславливал быстрое восстановление патогенного потенциала. Такая ответная реакция отражает выраженность
адаптивных свойств у ряда штаммов, что позволяет им оптимизировать механизмы паразитирования и обеспечивает
максимальную экономичность с энергетической точки зрения [12]. При пребывании штаммов во внешней среде синтез
факторов вирулентности ингибируется, при попадании их
во внутреннюю среду организма их продукция интенсифицируется, приводя к развитию острого (штаммы с выраженной активностью) или хронического (штаммы с низкой
активностью) инфекционного процесса. Можно полагать,
что выявленные различия в поведении штаммов могут свидетельствовать об их различном происхождении.
ЗАКЛЮЧЕНИ
ИЕ
Большая часть свойств микроорганизмов, включая синтез
факторов патогенности, может экспрессироваться лишь в
благоприятных условиях, в том числе при колонизации различных биотопов в организме человека, то есть проявляется именно в связи с процессами, важными для налаживания
отношений между микро- и макроорганизмом. Например,
известно, что «легочные» варианты P. aeruginosa продуцируют фосфолипазу в большей степени, чем штаммы, выделенные из других биотопов, а изоляты уропатогенной E. coli
проявляют выраженные адгезивные свойства [13, 14]. Такая
стратегия более характерна для условно патогенных бактерий, однако, изменение их патогенного потенциала и in
vivo, и in vitro зачастую подчиняется различным, трудно прогнозируемым закономерностям. Как показали наши исследования, при выращивании таких микроорганизмов (на
примере P. aeruginosa) на искусственных питательных средах нередко наблюдается разнонаправленное изменение
активности изучаемых факторов в зависимости от условий
и состава среды, числа пассажей и времени хранения.
Биологические свойства псевдомонад, включая патогенные, в первичном посеве и вектор их изменений при периодических пересевах зависят, в том числе, и от состава диссоциантов в исходной популяции, выживаемость которых
меняется и при хранении [15]. По-видимому, в экспериментальных клинических исследованиях, когда существенно
важно определение корреляционной зависимости между
15
№ 2 ( 7 ) м а й 2 01 3
локусом/биотопом/условиями обитания изолятов и продукцией ими секретируемых факторов патогенности, наиболее корректные результаты могут быть получены лишь
при немногочисленных пересевах и минимально возможных сроках хранения культур.
Вместе с тем, при проведении мониторинга и сравнительном изучении длительно хранящихся изолятов может быть
получена дополнительная информация, значение которой
требует более углубленного анализа. Представляется, что, как
минимум, два предположения вытекают из данных наблюдений. Во-первых, подход, который традиционно используется
для ослабления вирулентности «безусловных» патогенов,
основанный на многократных пересевах культур в неблагоприятных условиях вне макроорганизма, зачастую обеспечивает разнонаправленную реакцию у условно патогенных возбудителей. Во-вторых, если большинством исследователей
признается, что для оценки этиологической значимости штаммов условных патогенов, изолируемых от пациентов с различными гнойно-септическими инфекциями, важным критерием может служить высокий уровень продукции факторов
патогенности, то, по-видимому, для закрепления в условиях
стационара более важной характеристикой является выраженная пластичность и адаптационные возможности, обеспечивающие им преимущества при циркуляции в изменяющихся условиях внутрибольничной среды.
ЛИТЕРАТУРА
А
1. Зуева Л.П., Соусова Е.В., Колосовская Е.Н., Хаджидис А.К.,
Кафтырева Л.А. Микробиологический мониторинг в системе инфекционного
контроля. TERRA MEDICA nova. 2008. № 2 (52).
2. Сергевнин В.И., Маркович Н.И. Внутрибольничные инфекции и направления микробиологического мониторинга. Эпидемиол. вакцинопрофил.
2008. № 2. С. 25-28.
3. Брусина Е.Б., Рычагов И.П. Внутрибольничные инфекции, обусловленные формированием госпитального штамма. Стерилиз. госпит. инф. 2006.
№ 2. С. 32-34.
4. Зуева Л.П., Яфаев Р.Х., Еремин С.Р. Эпидемиологическая диагностика.
СПб: ГОУ ВПО СПбГМА им. И.И. Мечникова МЗ России, 2003. 264 с.
5. Лисовская С.А. Новый подход к оценке патогенного потенциала клинических штаммов Candida albicans.: Автореф. … канд. биол. наук. Казань, 2008.
25 с.
6. Аветисян Л.Р., Чернуха М.Ю., Габриелян Н.И. и др. Генотипические особенности штаммов Pseudomonas aeruginosa, циркулирующих в хирургическом стационаре. Журнал микробиол. 2009. № 5. С. 33-38.
7. Deziel E., Comeau Y., Villemur R. Initiation of biofilm formation by
Pseudomonas aeruginosa 57RP correlates with emergence of hyperpiliated and
highly adherent phenotypic variants deficient in swimming, swarming, and
twitching motilities. J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 1195-1204.
8. O`Toole G.F., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial
development. Ann. Rev. Microbiol. 2000. V. 54. P. 49-79.
9. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение
пакета прикладных программ STATISTICA. М.: МедиаСфера, 2006. 312 с.
10. Van Delden C., Iglewski B. Cell-to-cell signaling and Pseudomonas aeruginosa
infections. Emerg. Infect. Dis. 1998. V. 4. P. 551-560.
11. Беляков В.Д., Голубев О.Б., Каминский Г.Д., Тец В.В. Саморегуляция
паразитарных систем (молекулярно-генетические механизмы). Л.: Медицина,
1987. 92 с.
12. Сидоренко С.В., Резван С.П., Стерхова Г.А., Грудинина С.А. Госпитальные
инфекции, вызванные P. aeruginosae. Распространение и клиническое значение антибиотикорезистентности. Антиб. химиотер. 1999. № 3. С. 25-34.
13. Перепанова Т.С., Кудрявцев Ю.В., Хазан П.Л. Неосложненная инфекция
мочевых путей. Consilium-medicum. 2003. Т. 5. № 1.
14. Berka R.M., Gray G.L., Vasil M.L. Studies of phospholipase C (heat-labile
hemolysin) in Pseudomonas aeruginosa. Infect. Immun. 1981. V. 34 (3). P. 10711074.
15. Милько Е.С., Мартынкина Л.П. Морфологические и физиологобиохимические особенности диссоциантов Pseudomonas aeruginosae.
Микробиология. 1996. Т. 65. № 3. С. 352-356.