Влияние кинетина in vitro на рибулозо

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН
2014, том 57, №5
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.1:577
М.А.Бабаджанова, Ш.А.Эсаналиева, А.К.Мирзорахимов, М.С.Нарзулоев, Н.Нематова,
А.К.Сайфутдинов
ВЛИЯНИЕ КИНЕТИНА IN VITRO НА
РИБУЛОЗОБИСФОСФАТКАРБОКСИЛАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ
МУЛЬТИФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА ЦИКЛА КАЛЬВИНА
В ЭКСТРАКТАХ ИЗ ЛИСТЬЕВ ХЛОПЧАТНИКА
Таджикский национальный университет
(Представлено академиком АН Республики Таджикистан М.М.Якубовой 26.03.2014 г.)
В статье приводятся экспериментальные данные по изучению влияния различных концентраций кинетина (6-бензиламинопурин) на карбоксилазную активность рибулозобисфосфаткарбоксилазы/ оксигеназы (РБФК/О) в присутствии рибозо-5-фосфата+АТФ. Установлены концентрации
кинетина, при которых проявлялось его наибольшее стимулирующее действие на карбоксилазную
активность РБФК/О мультиферментного комплекса. Анализ величин активирующего действия кинетина на активность фосфорибулокиназы и РБФК/О при использовании собственных специфических субстратов и в присутствии рибозо-5-фосфата+АТФ свидетельствуют о проявлении координированной регуляции активности ферментов в мультиферментном комплексе.
Ключевые слова: хлопчатник – кинетин – рибулозобисфосфаткарбоксилазная активность – мультиферментный комплекс – цикла Кальвина.
Стимулирующее действие кинетина (6-бензиламинопурин) на формирование структуры фотосинтетического аппарата и его функциональную активность, возрастание синтеза и активности
многих ферментов, особенно ключевого фермента фотосинтеза рибулозобисфосфаткарбоксилазы
оксигеназы (РБФК/О, КФ 4.1.1.39), установлено исследованиями многих авторов на листьях различных растений [1-4].
В работе [5] было изучено влияние кинетина на карбоксилазную активность РБФК/О в препаратах различной степени очистки, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф в фазе 5-6 настоящих листьев. Добавление кинетина в реакционную среду приводило к возрастанию в 2.6 раза
карбоксилазной активности РБФК/О в экстрактах и на 43% во фракции белков, осаждённых при 3550% насыщении сульфатом аммония. Очистка этой фракции белков гель-хроматографией на сефадексе G-200 приводила к потере способности РБФК/О активироваться кинетином. Эти исследования
были проведены при использовании собственного субстрата РБФК/О - рибулозо-1.5-бисфосфата и
концентрации кинетина 2 мкмоль/мл реакционной среды.
В работе [6] было изучено влияние различных концентраций кинетина в реакционной среде
на активность фосфорибулокиназы (ФРК, КФ 2.7.1.19) в экстрактах из листьев хлопчатника (фаза
Адрес для корреспонденции: Эсаналиева Шахноза Акрамовна. 734042, Республика Таджикистан, Душанбе,
пр. Рудаки, 17, Таджикский национальный университет. E-mail: [email protected]
408
Физиология растений
М.А.Бабаджанова, Ш.А.Эсаналиева и др.
развития растений 5-6 настоящих листьев) при использовании собственного специфического субстрата – рибулозо-5-фосфата и рибозо-5-фосфата, субстрата рибозофосфатизомеразы (КФ 5.3.1.6),
катализирующей предшествующую реакцию.
Было установлено, что зависимость от концентрации действия кинетина на активность ФРК
подчинялась общему механизму гормональной регуляции – в низких концентрациях гормоны оказывают активирующее действие, а в высоких – ингибирующее.
Величины активирующего действия кинетина на фосфорибулокиназную активность были более высокими при использовании рибозо-5-фосфата+АТФ, а не собственного специфического субстрата рибулозо-5-фосфата + АТФ.
Полученные данные являются веским доказательством наличия в экстракте из листьев хлопчатника мультиферментного комплекса, обладающего большей чувствительностью к кинетину.
Целью данной работы являлось изучение влияния различных концентраций кинетина в реакционной среде на карбоксилазную активность РБФК/О в экстрактах из листьев хлопчатника при использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата+АТФ.
Методы исследования
В качестве объектов исследования были взяты листья хлопчатника Gossypium hirsutum L. сорта 108-Ф в фазе 5-6 настоящих листьев. Хлопчатник выращивали в полевых условиях с соблюдением
всех агротехнических мероприятий на экспериментальном участке Института ботаники, физиологии
и генетика растений АН Республики Таджикистан (г. Душанбе).
Получение экстракта из листьев подробно описано в нашей работе [7]. Количественное содержание белка определяли с реактивом Бенедикта [8]. Карбоксилазную активность РБФК/О определяли спектрофотометрически по методике Рэккера, модифицированной А.К.Романовой [9].
Активность РБФК/О выражали в мкмоль СО2, фиксированной за 1 минуту в расчёте на 1 мг
белка, то есть Е/мг белка.
Результаты и их обсуждение
Результаты, полученные при определении влияния различных концентраций кинетина в реакционной среде на карбоксилазную активность РБФК/О в экстрактах из листьев хлопчатника сорта
108- Ф, представлены в таблице.
Таблица
Влияние кинетина на РБФ-карбоксилазную активность мультиферментного комплекса в экстракте из
листьев хлопчатника сорта 108-Ф в фазе 5-6 настоящих листьев (субстрат: рибозо-5-фосфат + АТФ)
Кинетин, мкмоль/мл реакционной
среды
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
5.0
Активность РБФК, мкмоль
СО2/мин на 1 мг белка
0.042 ± 0.001
0.045 ± 0.001
0.051 ± 0.001
0.062 ± 0.001
0.101 ± 0.002
0.105 ± 0.002
0.098 ± 0.002
0.087 ± 0.002
0.078 ± 0.001
0.056 ± 0.001
409
Активация, %
100
109
124
151
246
250
238
212
192
141
Доклады Академии наук Республики Таджикистан
2014, том 57, №5
Из представленных в таблице данных видно, что при концентрациях кинетина 1-5 мкмоль/мл
реакционной среды, РБФ-карбоксилазная активность мультиферментного комплекса значительно
возрастало. Наибольшее активирующее действие кинетина – 246-212 % проявлялось при концентрациях 2-3.5 мкмоль/мл реакционной среды.
В работе [10] было обнаружено, что при использовании в качестве субстрата рибозо-5фосфата + АТФ наибольшая активация кинетином – 174-157% фосфорибулокиназной реакции также
проявлялось при концентрациях 3-4 мкмоль/мл реакционной среды, но уже при концентрации кинетина 0.5-1 мкмоль/мл реакционной среды скорость фосфорибулокиназной реакции возрастала на 121135%.
Полученные данные о более эффективной и быстрой активации кинетином фосфорибулокиназной реакции при использовании первого субстрата метаболической цепи свидетельствует о большей чувствительности к кинетину мультиферментного комплекса.
АТФ
РФИ
Рибозо-5-Ф
СО2
ФРК
рибулозо-5-Ф
РБФК
рибулозо-1.5-Ф
3-ФГК
Наибольшая активация при одних и тех же концентрациях кинетина фосфорибулокиназной
реакции при использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата + АТФ составляла 174%, а РБФкарбоксилазной реакции – 246%. Более эффективная или высокая активация кинетином рибулозобисфосфаткарбоксилазной реакции указывает на проявление в мультиферментном комплексе координированной регуляции активности ферментов, когда конформационные изменения, вызванные
активатором или ингибитором, с одного фермента комплекса фосфорибулокиназы передаются с помощью различных контактов на другой фермент комплекса – рибулозобисфосфаткарбаксилазу [11].
Поступило 28.03.2014 г.
Л И Т Е РАТ У РА
1. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функция. – М.: Наука, 1973, 263 с.
2. Мокроносов А.Т. Фотосинтетическая функция и целостность растительного организма. – М.: Наука, 1983, 64 с.
3. Кефели В.И. Фотоморфогенез фотосинтеза и рост как основа продуктивности растений. – Пущино: ОНТИ ПНЦ АН СССР, 1991, 133 с.
4. Романов Г.А. Как цитокинины действуют на клетку. – Физиология растений, 2009, т.56, №2,
с.295-319.
5. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Нарзуллоев М.С., Эсаналиева Ш.А., Нематова Н., Сайфидинов А.К. Влияние кинетина на активность рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы в
ферментных препаратах различной степени очистки. – ДАН РТ, 2007, т.50, № 8, с. 711-715.
6. Бабаджанова М.А., Эсаналиева Ш.А., Нарзуллоев М.С. Онтогенетическая зависимость активирующего действия кинетина in vitro на фосфорибулокиназную активность мультиферментного
комплекса цикла Кальвина в экстрактах из листьев хлопчатника. – ДАН РТ, 2013, т.56, № 1, с.6064.
410
Физиология растений
М.А.Бабаджанова, Ш.А.Эсаналиева и др.
7. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. – М.: Высшая школа,1980, 272 с.
8. Бабаджанова М.А., Нарзуллоев М.С. Влияние фитогормонов in vivо на фосфорибулокиназную
активность мультиферментного комплекса цикла Кальвина в онтогенезе растений хлопчатника. –
ДАН РТ, 2012, т.55, № 12, с.1001-1003.
9. Романова А.К. Биохимические методы изучения автотрофии у микроорганизмов. – М.: Наука,
1980, 160 с.
10. Бабаджанова М.А., Эсаналиева Ш.А., Нарзуллоев М.С. Влияние кинетина in vitrо на фосфорибулокиназную активность мультиферментного комплекса цикла Кальвина в экстрактах из листьев
хлопчатника. – Изв.АН РТ: Отд.биол. и мед.н., 2012, №4(181), с.51-55.
11. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы. – М.: Мир, 1986,
374 с.
М.А.Бобољонова, Ш.А.Эсаналиева, А.К.Мирзорањимов, М.С.Нарзулоев, Н.Нематова,
А.К.Сайфутдинов
ТАЪСИРИ КИНЕТИН IN VITRO БА ФАЪОЛНОКИИ
РИБУЛОЗОБИСФОСФАТКАРБОКСИЛАЗИИ МАЉМЎИ
МУЛТИФЕРМЕНТИИ СИКЛИ КАЛВИН ДАР ШИРАИ АЗ БАРГЊОИ
ПАХТА ЉУДОКАРДАШУДА
Донишгоњи миллии Тољикистон
Дар маќола натиљањои тадќиќотњои таљрибавї доир ба таъсири консентрасияњои гуногуни кинетин (6-бензиламинопурин) ба фаъолнокии карбоксилазии рибулозобисфосфаткарбоксилаза дар иштироки рибозо-5-фосфат+АТФ оварда шудаанд. Консентрасияњои нисбатан ба
фаъолнокии карбоксилазии РБФК/О-и маљмўи мултиферментии таъсири баланд доштани кинетин муайян карда шудааст. Тањлили бузургињои таъсири баланд доштани кинетин ба фаъолнокии фосфорибулокиназї ва рибулозобисфосфаткарбоксилази/оксигеназї њангоми истифода
кардан аз субстратњои махсус ва дар иштироки рибозо-5-фосфат +АТФ аз танзими координиронии фаъолнокии ферментњои маљмўи мултиферментї шањодат медињанд.
Калимањои калидї: пахта – кинетин – фаъолнокии рибулозобисфосфаткарбоксилаза – маљмўи
мултиферментї – сикли Калвин
M.A.Babajanova, Sh.A.Esanalieva, А.К.Mirzorakhimov, М.S.Narzulooev, N.Nematova,
А.К.Saifutdinov
THE EFFECT OF KINETIN IN VITRO ON RIBULOSE-BISPHOSPHATE
CARBOXILASE/OXYGENASE ACTIVITY OF CALVIN CYCLE MULTIENZYME
COMPLEXES IN COTTON LEAVES EXTRACTS
Tajik National University
The article presents the results of experimental studies on the effect of different concentrations of kinetin (6- benzylaminopurine) on the activity of ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase in the presence
411
Доклады Академии наук Республики Таджикистан
2014, том 57, №5
of ribose-5-phosphate + ATP. The concentrations of kinetin in which it manifested the greatest stimulatory
effect on the carboxylase activity of Rubisco multi-enzyme complex were defined. Analysis of values of an
activating effect of kinetin on the activity of phosphoribulokinase and ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase upon using their own specific substrates and in the presence of ribose-5-phosphate + ATP
indicates the coordinated regulation of the activity of enzymes in multi-enzyme complexes.
Key words: cotton – kinetin – ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activity – multi-enzyme complex
– the Calvin cycle.
412