59 В регуляции везикулярного транспорта и клеточной

УДК 591
ВЛИЯНИЕ ФОСФАТИДИЛИНОЗИТОЛ-4-ФОСФАТ-5-КИНАЗЫ (ТИП 2 АЛЬФА) НА АКТИВНОСТЬ
НЕЙРОНАЛЬНЫХ KCNQ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ В ООЦИТАХ XENOPUS LAEVIS
Ольга Юрьевна ФЕДОРЕНКО, Светлана Александровна ИВАНОВА, Валентин Яковлевич СЕМКЕ
НИИ психического здоровья СО РАМН
634014, г. Томск, Сосновый Бор
Нейрональные потенциалзависимые калиевые KCNQ-каналы, экспрессирующиеся в мозге обычно в виде
гетеромерных комплексов KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5, регулируют возбудимость многих нейронов.
Известно, что для своего открытия им требуется фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат. В данной работе изучались эффекты нейрональной фосфатидилинозитол-4-фосфат-5-киназы (тип 2 альфа) (PIP5K2A), катализирующей образование фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата, на калиевые каналы KCNQ2, KCNQ5, KCNQ2/
KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5 в ооцитной экспрессирующей системе Xenopus стандартным двухэлектродным
методом фиксации напряжения (voltage clamp). Было показано, что дифосфорилированные фосфоинозитиды активируют гетеромерные нейрональные М-каналы KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5 в ооцитной
экспрессирующей системе Xenopus неспецифическим образом. Кроме того, обнаружено активирующее действие PIP5K2A на гетеромерные калиевые каналы KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5. Гомомерные калиевые
каналы KCNQ2 и KCNQ5 не обладали чувствительностью к PIP5K2A-киназе, свидетельствуя о том, что присутствие KCNQ3-субъединицы в канальном комплексе необходимо для PIP5K2A-опосредованных эффектов.
Ключевые слова: PIP5K2A, киназа, нейрональные калиевые М-каналы.
В регуляции везикулярного транспорта
и клеточной возбудимости фундаментальную
роль играет фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат
(PI(4,5)P2), который напрямую связывается
с белками синаптических везикул и других
внутриклеточных мембранных структур [1, 2].
В нейронах PI(4,5)P2 влияет как на экзоцитозную, так и на эндоцитозную фазы синаптического везикулярного цикла посредством связывания с синаптическими белками, подобно
синаптотагмину и клатрин-адапторному белку
АР-2 [1–4]. Дефосфорилирование синаптоянином приводит к высвобождению молекул
клатрина из эндоцитозных синаптических
везикул, что позволяет им рециркулировать
в пул, доступный для нового раунда трансмиттерного высвобождения [1, 3]. PI(4,5)P2
также является субстратом для некоторых
фосфатидилинозитол-3-киназ, которые фосфорилируют дериваты фосфатидилинозитола
в D3-положении [5].
PIP5K2A-киназа катализирует фосфорилирование инозитольного кольца в 5 положении,
используя в качестве субстратов либо фосфатидилинозитол, либо фосфатидилинозитол-4фосфат и, таким образом, вовлечена в рецепторактивируемые сигнальные пути, мембранную
трансдукцию нейротрансмиттерных сигналов,
функционирование ионных каналов и синаптических везикул, а также во внутриклеточные
сигнальные пути [6–8].
М-каналы представляют собой потенциал
зависимые K +-каналы, которые регулируют
возбудимость многих нейронов. Их прогрессивное открытие в ходе деполяризации фиксирует мембранный потенциал приблизительно
на значении –55…–60 мВ и снижает возбудимость мембраны [9]. Данные нейрональные каналы состоят из субъединиц семейства
KCNQ, обычно экспрессирующихся в нейронах мозга человека в комбинации гетеромерных калиевых каналов KCNQ2/3 и KCNQ3/5.
Нативные М-каналы, а также экспрессированные KCNQ2/3 и KCNQ3/5 ингибируются при
стимулировании мускариновых ацетилхолиновых рецепторов M1-mAChR [10]. Для открытия
М-каналов требуется фосфатидилинозитол4,5-дифосфат, в то время как их ингибирование при стимулировании mAChR происходит,
главным образом, за счет снижения уровня PIP2
на мембране [11]. В данной работе проводилось
исследование влияния нейрональной PIP5K2Aкиназы на активность гомомерных (KCNQ2
и KCNQ5), а также гетеромерных (KCNQ2/3
и KCNQ3/5) калиевых каналов в эксперименте
на ооцитах Xenopus laevis.
Федоренко О.Ю. – к.м.н., старш.н.с. лаборатории клеточных и молекулярно-биологических исследований,
е-mail: [email protected]
Иванова С.А. – д.м.н., профессор, руководитель лаборатории клеточных и молекулярно-биологических
исследований, е-mail: [email protected]
Семке В.Я. – академик РАМН, директор, е-mail: [email protected]
Бюллетень со рамн, № 2 (136), 2009 г.
59
Федоренко О.Ю. и др. Влияние фосфатидилинозитол-4-фосфат-5-киназы (тип 2 альфа) на... / с. 59-64
Материалы и методы
Эксперименты проведены на базе института физиологии Тюбингенского университета г. Тюбингена (Германия). KCNQ2, KCNQ3
и KCNQ5 были субклонированы в векторе
pSGEM. Все конструкции подтверждены автоматическим ДНК-секвенированием. кРНК
KCNQ2, KCNQ3 и KCNQ5 была синтезирована
с использованием набора SP6 или T7 mMessage
mMachine (Ambion Inc., США). Инъецированные по 50 нл РНК ооциты инкубировались
при 17–18 °С в течение 3 дней. Каждый ооцит
был инъецирован по 5 нг кРНК KCNQ либо по
5 нг кРНК KCNQ вместе с 5 нг кРНК PIP5K2A.
Первую контрольную группу составили ооциты,
экспрессирующие либо гомомерные (KCNQ2,
n = 44, или KCNQ5, n = 63), либо гетеромерные калиевые каналы (KCNQ2/3, n = 52, или
KCNQ3/5, n = 42). Во второй группе ооциты
экспрессировали KCNQ-каналы совместно
с нормальным, так называемым диким, типом
PIP5K2A-киназы. На 4-й день экспрессированные на поверхности мембраны калиевые
каналы KCNQ изучались стандартным двухэлектродным методом фиксации напряжения
с использованием усилителя Turbo Tec 10CX
(NPI, Tamm, Германия), интерфейса ITC-16,
объединенного с программным обеспечением
pCLAMP 8.0 (Axon Instruments Inc. / Molecular
Devices, Калифорния, США) для получения
и анализа данных. Активность KCNQ-каналов тестировалась 3-секундными импульсами
в диапазоне от удерживающего потенциала –
100 мВ к потенциалам между –120 и +60 мВ
с интервалами в 20 мВ и последующей генерацией импульсов обратно к –120 мВ. Значения
амплитуды тока определялись в конце деполяризирующих импульсов и нормализовались
относительно среднего значения тока, генерируемого KCNQ-каналами, экспрессированными в одиночку.
В серии экспериментов по изучению эффектов аналогов дифосфорилированных фосфоинозитидов в ооцитах экспрессировались гетеромерные калиевые каналы KCNQ2/KCNQ3
(n = 17) и KCNQ3/KCNQ5 (n = 11), после чего
в ооциты вводили водорастворимые аналоги
сигнальных молекул C6-PI(3,4)P2, C6-PI(3,5)P2
и C6-PI(4,5)P2 (4,6 нл, 100 мг/мл) за 30-60 минут
до регистрации.
В экспериментах по изучению эффекта скэвинджера PI(4,5)P2, PIP2-Grip, в часть ооцитов, экспрессирующих гетеромерные калиевые
каналы KCNQ2/KCNQ3 (n = 18) в одиночку или
коэкспрессирующих с PIP5K2A, за 30-60 минут
60
до регистрации вводили по 4,6 нл водорастворимого аналога PI(4,5)P 2 или PIP 2-Grip
(100 мг/мл).
Графический анализ и статистическая обработка результатов выполнялись с использованием
программного обеспечения Origin 6.0 (Microcal,
Германия). На рисунках результаты представлены в виде средних арифметических, в качестве
интервалов погрешностей приведены стандартные ошибки средних арифметических. Значимость различий между группами определяли
с помощью t-критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Гомомерные нейрональные калиевые каналы
KCNQ2 и KCNQ5 экспрессировались в одиночку или совместно с ферментом PIP5K2A.
Коэкспрессия с PIP5K2A не приводила к существенным изменениям амплитуды тока при
+50 мВ: для канала KCNQ2 прирост составил
7% (p = 0,7), KCNQ5 – 3% (p = 0,76) (рис. 1, 2).
Таким образом, подтипы нейрональных калиевых каналов KCNQ2 и KCNQ5 не обладают
чувствительностью к нормальному (дикому)
типу PIP5K2A.
Рис. 1. Ток, генерируемый гомомерными калиевыми
каналами KCNQ2, экспрессированными
в одиночку и коэкспрессированными с PIP5K2A
в ооцитах Xenopus laevis. Здесь и на рис. 2–4:
черные кружки обозначают средние значения
амплитуды тока, генерируемого калиевыми
каналами KCNQ2, экспрессированными без
PIP5K2A, белые – с PIP5K2A.
Бюллетень со рамн, № 2 (136), 2009 г.
Федоренко О.Ю. и др. Влияние фосфатидилинозитол-4-фосфат-5-киназы (тип 2 альфа) на... / с. 59-64
Рис. 2. Ток, генерируемый гомомерными калиевыми
каналами KCNQ5, экспрессированными
в одиночку и коэкспрессированными с PIP5K2A
в ооцитах Xenopus laevis
Рис. 3. Ток, генерируемый гетеромерными калиевыми
каналами KCNQ2/KCNQ3, экспрессированными
в одиночку и коэкспрессированными с PIP5K2A
в ооцитах Xenopus laevis
Бюллетень со рамн, № 2 (136), 2009 г.
В случае коэкспрессии гетеромерных калиевых каналов KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/
KCNQ5 с PIP5K2A амплитуды токов значительно возросли, на 53% (p = 0,0056) и на 115%
(p = 0,0006) соответственно по сравнению
с амплитудами токов, генерируемых каналами,
экспрессированными в одиночку (рис. 3, 4).
Обнаруженное увеличение не сопровождалось
заметными изменениями в кинетике работы
каналов (не было сдвига потенциальной зависимости и изменения временного цикла активации – дезактивации).
Выявленное PIP5K2A-опосредованное увеличение амплитуды тока в гетеромерных
калиевых каналах KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/
KCNQ5 может быть опосредовано присутствием KCNQ3-субъединицы в гетеромерном
канальном комплексе.
PIP5-киназы образуют PI(4,5)P2, который
необходим для активации М-каналов [11].
С другой стороны, ингибирование М-каналов
путем стимулирования mAChR происходит,
главным образом, вследствие снижения уровня
PIP2 на мембране [11]. Возможно, стимуляция
mAChR и активация фосфатидилинозитол-4и фосфатидилинозитол-5-киназ подобно
Рис. 4. Ток, генерируемый гетеромерными калиевыми
каналами KCNQ3/KCNQ5, экспрессированными
в одиночку и коэкспрессированными с PIP5K2A
в ооцитах Xenopus laevis
61
Федоренко О.Ю. и др. Влияние фосфатидилинозитол-4-фосфат-5-киназы (тип 2 альфа) на... / с. 59-64
PIP5K2A-киназе выступают в качестве антагонистических модуляторов функционирования
М-каналов, благодаря которым мембранное
содержание PIP2 представляет собой контролируемый переменчивый процесс [12]. Известно,
что PIP2 напрямую присоединяется к каналам
KCNQ2/KCNQ3 и регулирует вероятность их
открытия (Po) [13, 14]. Дивергентные аффинности KCNQ-каналов для PIP2 могут лежать
в основе дифференциальной максимальной Po
нейрональных гомо- и гетеромерных KCNQканалов, наблюдаемых в неповрежденных
клетках (cell-attached patches) [13]. В упомянутой работе было показано, что сродство
канала KCNQ3 к аналогам PI(4,5)P2 с короткой С-цепочкой составляет около 2,6 мкМ, что
в 100 раз больше аффинности нейрональных
каналов KCNQ2 и KCNQ4 (50%-я эффективная концентрация (EC50) для канала KCNQ2
была равна 205 мкМ, для канала KCNQ4 –
215 мкМ). Присутствие KCNQ3 в гетеромерном
канальном комплексе KCNQ2/KCNQ3 придает
соответствующим каналам повышенную чувствительность (EC50 = 40 мкМ) [13]. К сожалению, калиевые каналы KCNQ3 слабо экспрессируются в ооцитах, поэтому они не могут быть
напрямую, как гомомерные каналы, тестированы на чувствительность к PIP5K2A-киназе.
Тем не менее их функциональную активность
можно оценить в комплексе гетеромерных
каналов. Присутствие KCNQ3 в гетеромерных
комплексах KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5
может также передавать восприимчивость
к PIP5K2A через увеличение концентрации PIP2,
предполагаемого продукта PIP5K2A-киназы.
Таким образом, PIP5K2A является функциональным модулятором гетеромерных KCNQ
каналов.
Чтобы установить, был ли обнаруженный
стимулирующий эффект PIP5K2A-киназы на
активность калиевых каналов KCNQ2/KCNQ3
и KCNQ3/KCNQ5 следствием образования
фосфатидилинозитол-4,5-бифосфата, ее прямого продукта, а также изучить селективность
гетеромерных канальных комплексов в отношении дифосфорилированных фосфоинозитидов, гетеромерные калиевые каналы KCNQ2/
KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5 экспрессировались
в ооцитах, в которые затем вводили водорастворимые аналоги сигнальных молекул C6-PI(3,4)P2,
C6-PI(3,5)P2 и C6-PI(4,5)P2.
Оба гетеромерных канала были активированы всеми тремя аналогами PI(4,5)P2 при
+50 мВ (рис. 5, 6), соответствующие приросты
амплитуды тока составили: для канала KCNQ2/
62
KCNQ3, PI(3,4)P2 – 128% (p = 0,022), PI(3,5)P2 –
175% (p = 0,016), PI(4,5)P2 – 142% (p = 0,0005);
для канала KCNQ3/KCNQ5, PI(3,4)P 2 –
83% (p = 0,028), PI(3,5)P2 – 139% (p = 0,041),
PI(4,5)P2 – 106% (p = 0,048).
Таким образом, дифосфорилированные
фосфоинозитиды активируют гетеромерные
нейрональные М-каналы KCNQ2/KCNQ3
и KCNQ3/KCNQ5 в ооцитной экспрессирующей системе неспецифическим образом. Остается неизученной физиологическая роль стимуляции каналов PI(3,4)P2 и PI(3,5)P2, так как
содержание этих аналогов PIP2 на плазматической мембране намного меньше, чем основного, PI(4,5)P2.
Дополнительные эксперименты с предварительным инъецированием ооцитов скэвинджером PI(4,5)P2 PIP2-Grip позволили установить
стимулирующий эффект экзогенного PI(4,5)P2
в отношении канала KCNQ2/KCNQ3 при
+50 мВ только в случае отсутствия PIP5K2A
Рис. 5. Ток, генерируемый гетеромерными калиевыми
каналами KCNQ2/KCNQ3 (n = 17),
экспрессированными в ооцитах Xenopus
laevis, неинъецированных и инъецированных
водорастворимыми аналогами C6-PI(3,4)P2
C6-PI(3,5)P2 и C6-PI(4,5)P2 Здесь и на рис. 6:
черные кружки обозначают средние значения
амплитуды тока, генерируемого калиевыми
каналами KCNQ2/KCNQ3,
экспрессированными в одиночку, белые символы –
каналами, коэкспрессированными: кружки –
с C6-PI(3,4)P2 , квадраты – с C6-PI(3,5)P2 ,
треугольники – с C6-PI(4,5)P2 .
Бюллетень со рамн, № 2 (136), 2009 г.
Федоренко О.Ю. и др. Влияние фосфатидилинозитол-4-фосфат-5-киназы (тип 2 альфа) на... / с. 59-64
(прирост амплитуды тока составил 68%), наряду
с ингибированием канала KCNQ2/KCNQ3 PIP2Grip исключительно в присутствии PIP5K2A
(в этом случае снижение амплитуды тока составило 20%) (рис. 7).
Рис. 6. Ток, генерируемый гетеромерными
калиевыми каналами KCNQ3/KCNQ5 (n = 11),
экспрессированными в ооцитах Xenopus laevis,
неинъецированных и инъецированных водорастворимыми
аналогами C6-PI(3,4)P2, C6-PI(3,5)P2 и C6-PI(4,5)P2 .
Рис. 7. Ток, генерируемый гетеромерными
калиевыми каналами KCNQ2/KCNQ3 (n = 18),
экспрессированными в одиночку или с PIP5K2A
в ооцитах Xenopus laevis, в присутствии
водорастворимого аналога PI(4,5)P2 или
скэвинджера PIP2-Grip.
Бюллетень со рамн, № 2 (136), 2009 г.
Полученные данные указывают на то, что
базальный уровень PI(4,5)P2 на плазматической мембране ооцитов недостаточно высок
для насыщения активности каналов KCNQ2/
KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5, что позволяет стимулировать их либо прямым воздействием экзогенного PIP2, либо продукцией PIP2 PIP5K2Aкиназой.
Таким образом, было показано, что нейрональная PIP5K2A-киназа является функциональным модулятором гетеромерных каналов
KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5, в то время
как гомомерные подтипы нейрональных калиевых каналов KCNQ2 и KCNQ5 не обладают
чувствительностью к ферменту. Выявленное
PIP5K2A-опосредованное увеличение амплитуды тока в гетеромерных калиевых каналах
KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5 может быть
опосредовано присутствием в канальном комплексе субъединицы KCNQ3. Кроме того, получены данные о том, что дифосфорилированные фосфоинозитиды активируют гетеромерные нейрональные М-каналы KCNQ2/KCNQ3
и KCNQ3/KCNQ5 в ооцитной экспрессирующей системе неспецифическим образом.
Работа выполнена при поддержке гранта
INTAS (Ref. N. 04-83-3764).
Литература
1. Cremona O., Di Paolo G., Wenk M.R. et al.
Essential role of phosphoinositide metabolism in synaptic
vesicle recycling // Cell 1999. 99: 179-188.
2. Di Paolo G., De Camilli P. Phosphoinositides in
cell regulation and membrane dynamics // Nature. 2006.
12: 651-657.
3. McPherson P.S., Garcia E.P., Slepnev V.I. et al. A
presynaptic inositol-5-phosphatase // Nature. 1996. 379:
353-357.
4. Osborne S.L., Meunier F.A., Schiavo G. Phosphoinositides as key regulators of synaptic function // Neuron.
2001. 32: 9-12.
5. Cockcroft S., De Matteis M.A. Inositol lipids as
spatial regulators of membrane traffic // J. Membr. Biol.
2001. 180: 187-194.
6. Chatah N.E., Abrams C.S. G-protein-coupled
receptor activation induces the membrane translocation and
activation of phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase
I alpha by a Rac- and Rho-dependent pathway // J. Biol.
Chem. 2001. 276: 34059-34065.
7. Shyng S.L., Barbieri A., Gumusboga A. et al.
Modulation of nucleotide sensitivity of ATP-sensitive
potassium channels by phosphatidylinositol-4-phosphate
5-kinase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. 97:
937-941.
8. Wenk M.R., Pellegrini L., Klenchin V.A. et al.
PIP kinase Igamma is the major PI(4,5)P(2) synthesizing
enzyme at the synapse // Neuron 2001. 32: 79-8.
63
Федоренко О.Ю. и др. Влияние фосфатидилинозитол-4-фосфат-5-киназы (тип 2 альфа) на... / с. 59-64
9. Marrion N.V. Control of M-current // Annu.
Rev. Physiol. 1997. 59: 483–504.
10. Jentsch T.J. Neuronal KCNQ potassium channels:
physiology and role in disease // Nat. Rev. Neurosci. 2000.
1: 21-30.
11. Delmas P., Brown D.A. Pathways modulating
neural KCNQ/M (Kv7) potassium channels // Nat. Rev.
Neurosci. 2005. 6: 850-862.
12. Suh B.C., Hille B. Recovery from muscarinic
modulation of M current channels requires phospha-
tidylinositol 4,5-bisphosphate synthesis // Neuron. 2002.
35: 507-520.
13. Li Y., Gamper N., Hilgemann D.W., Shapiro M.S.
Regulation of Kv7 (KCNQ) K+ channel open probability
by phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate // J. Neurosci.
2005. 25: 9825-9835.
14. Zhang H., Craciun L.C., Mirshahi T. et al. PIP2
activates KCNQ channels, and its hydrolysis underlies
receptor-mediated inhibition of M currents // Neuron.
2003. 37: 963-975.
INFLUENCE OF PHOSPHATIDIL INOSITOL – 4-PHOSPHAT-5-KINASE (TYPE 2ALFA) ON ACTIVITY OF
NEURONAL KCNQ POTASSIUM CHANNELS IN OOCYTE XENOPUS LAEVIS
Olga Yurjevna FEDORENKO, Svetlana Aleksandrovna IVANOVA, Valentin Yakovlevich SEMKE
Institutе of the Russian Academy of Medical Sciences Research Institute for mental health of Siberian Branch RAMS
Sosnovyi Bor settlement, Tomsk, 634014
Regulated by the product PIP2 of PIP5K2A are M-channels, voltage-gated K+ channels that regulate the excitability
of many neurons. Neuronal KCNQ2/KCNQ3 and KCNQ3/KCNQ5 channels require PIP2 to open. Standart Two
Electrode Voltage Clamp method was performed to study the effects of the neuronal PIP5K2A on KCNQ2, KCNQ5,
KCNQ2/KCNQ3 and KCNQ3/KCNQ5 in the Xenopus expression system. Bi-phosphorylated phosphoinositides have
been shown to activate heteromeric neuronal M-channels KCNQ2/KCNQ3 and KCNQ3/KCNQ5 in the oocyte
expression system in a non-specific manner. Moreover, wild type-PIP5K2A has been found to activate heteromeric
KCNQ2/KCNQ3 and KCNQ3/KCNQ5. Homomeric KCNQ2 and KCNQ5 channels have been not activated by the
PIP5K2A kinase indicating that the presence of KCNQ3 in the channel complex is required for the kinase mediated
effects.
Key words: PIP5K2A, kinase, M neuronal potassium channels.
Fedorenko O. Yu. – Ph.D., the laboratory of cell and molecular biological research, е-mail: [email protected]
Ivanova S.A. – Ph.D., professor, the head of the laboratory of cell and molecular biological research,
е-mail: [email protected]
Semke V.Y. – academician, director, е-mail: [email protected]
64
Бюллетень со рамн, № 2 (136), 2009 г.