Культура клеток высших растений – основа современных

Культура клеток высших растений –
основа современных растительных биотехнологий
А.М.Носов,
Биологический факультет МГУ,
ИФР РАН
Раиса Георгиевна Бутенко.
Основатель работ по культуре клеток высших растений в нашей стране
Международные конференции по культуре
клеток высших растений
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
Москва –1968
Киев – 1975
Ереван – 1979
Кишинев 1983
Новосибирск – 1988
Алматы 1993
Москва – 1997
Саратов – 2003
Звенигород -2008
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
Strasbourg – 1970
Leicester – 1974
Calgary – 1978
Tokyo – 1982
Minneapolis – 1986
Amsterdam – 1990
Firenze – 1994
Jerusalem – 1998
Barcelona - 2002
Участники первой конференции, 1968 год
Участники Кишиневской конференции, 1983 год
А. Культура клеток как биологическая система
Этой фотографии почти пятьдесят
лет: тогда культуру клеток считали
сообществом практически
одинаковых делящихся клеток...
Каллусогенез и дедифференцировка
Каллус – раневая ткань. Функции in vivo – закрыть рану, накопить
питательные вещества, индуцировать морфогенез и сформировать
дифференцированные структуры. Для однодольных не характерен.
Каллусная ткань in vitro : а) нормальная б) опухолевая
Источник каллуса in vitro : любая живая ткань растения
Стимулы: а) изолированность б) травма в) фитогормоны:
ауксины – индукция CDK, репликация ДНК; Go → S-фаза,
цитокинины – индукция циклинов, РНК-полимеразы; S →G2, M
Дедифференцировка:
Изменения метаболизма (трата запасных веществ , новые синтезы и др.)
Изменение, перестройка, разрушение клеточных структур (цитскелет и др)
Индукция деления
Вопросы: все ли клетки дедифференцируются? Сигналинг?
Каллусогенез и дедифференцировка, иллюстрации
Характеристика каллусных культур.
А. Макроскопическая.
Окраска: белая - желтая – оранжевая – бурая – темная - пигментированная
Характеристика каллусных культур.
А. Макроскопическая.
Консистенция: твердая, рыхлая, «растекающаяся» по поверхности.
ПОЛУЧЕНИЕ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
СУСПЕНЗИОННЫХ КУЛЬТУР
Способы получения: а/ из каллусной ткани
Из каллуса.
б/ из первичного экспланта в жидкой среде
~ 2 г каллуса на 100 мл среды без агара. Качалка
При плотном каллусе
1. Попробовать его «разрыхлить»
а/ снизить или убрать соли Ca 2+, в т.ч. пантотенат Ca 2+
б/ повысить или заменить ауксины – использовать 2,4 D
с/ снизить или исключить цитокинины
3. Фракционирование
4. Изменить условия культивирования – перемешивание
5. Обработка ферментами
Но: мелкоагрегированная суспензия, особенно
одноклеточная, как правило, менее жизнеспособна.
«Растительная клетка создана для взаимодействия».
Большинство ли клеток переходят в суспензию или идет отбор?
Суспензионные культуры клеток разных видов растений
Черные бобы
Пшеница Тимофеева
Диоскорея ДМ0,5
Свекла
Системы выращивания культур клеток высших растений
1. Колбы на качалке
2. Роллеры
3. Биореакторы.
А. Без механических перемешивающих устройств
- эр-лифтные
- барботажные V-образные (Вильсона)
- пневмо-импульсные
- перекачивающие суспензию
Б. С перемешивающими устройствами
Преимущества биоракторов:
- возможность контролировать процесс (рН, рО2,
рСО2, to, ионы, плотность)
- возможность управлять процессом
Коллекция культур клеток в ИФР РАН: выращивание клеток в
колбах на качалке и биореакторах
Три ипостаси культур клеток высших растений
Биологическая
система:
экспериментально
созданная популяция
соматических клеток
Модель
для исследования
физиологических
процессов:
•  фотосинтез,
•  минеральное питание,
•  вторичный метаболизм,
•  рост и развитие,
Инструмент:
•  устойчивость
•  сохранение генофонда
(коллекции штаммов, меристем),
•  микроклональное размножение,
•  оздоровление,
•  клеточная селекция,
•  создание трансгенных растений,
•  производство веществ
растительного происхождения
Основные свойства культуры клеток высших растений экспериментально созданной популяции соматических клеток
Снятие организменного
контроля развития переход к популяционным
механизмам развития системы
•  Отбор клеток по максимальной и/
или устойчивой пролиферации
основной принцип развития
поуляции
•  гетерогенность системы по
различным признакам
основа адаптационных
возможностей системы
•  Узкие адаптационые
возможности системы
следствие отсутствия длительной
эволюции
Большой невостребованный
генетический материал –
клетки in vitro имеют полную
информацию об интактном
растении
•  Влияние невостребованных
генов на развитие популяции
•  Судьба невостребованного
генетического материала –
возникновение и скорость
мутаций, сомаклональных
вариаций
•  Включение/выключение
невостребованных блоков –
программы морфогенеза,
соматического эмбриогенеза
Параметры клеточного цикла и митотический индекс культур клеток
диоскореи дельтовидной Dioscorea deltoidea, штаммы Д1 и ДМ-0,5 %o
60
50
40
30
20
10
0
1
10
21
36
51
67
76
85 100 112
160
140
120
100
80
60
40
20
0
1
8
16
31
42
54
64
76
86
98
Изменение плоидности клеток при выращивании культуры
клеток диоскореи дельтовидной в проточном режиме, штамм Д1
Гетерогенность популяций культур клеток высших растений основа адаптационных возможностей системы.
Морфологическая - клетки
табака в суспензии
Генетическая - различное число
хромосом в клетках женьшеня
Биохимическая - флуоресценция
клеток диоскореи в культуре
перестройки хромосом в клетках пшеницы
Генетическая гетерогенность культур клеток по числу хромосом и
количеству ДНК
Serratula coronata - число хромосом
всех клеток больше 2n (2n = 22)
Ajuga reptans – у большинства клеток
число хромосом меньше 2n (2n = 32)
35
40
30
25
35
20
25
30
20
15
15
10
10
5
5
>55
50-54
45-49
40-44
35-39
30-34
25-29
<20
Распределение по количеству ядерной
ДНК клеток суспензии сахарной свеклы
20-24
0
99-120
89-98
79-88
69-78
59-68
49-58
39-48
28-38
0
Распределение по количеству ядерной
ДНК клеток суспензии кормовых бобов
% клеток
% клеток
50
70
45
60
40
50
35
30
40
25
20
30
15
20
10
10
5
0
0
2C
4C-8C
8C
8C-16C
16C
16C-32C
32C
1C
1C-2C
2C
2C-4C
4C
Генетическая гетерогенность культур клеток высших растений –
нестабильное постоянство
При стабильных условиях
культивирования гетерогенность
постоянна
Культура клеток пшеницы T.timofeevi распределение по числу хромосом
через 3 и 6 лет субкультивирования
При изменении условий профиль
гетерогенности изменяется
Изменение профиля плоидности клеток
диоскореи D.deltoidea при удалении и
возврате витаминов в среду
n
% клеток
3 года
6 лет
70
% клеток
60
60
50
50
40
40
30
30
3n
>3n
c
c
20
20
>3n
3n
10
10
0
2n
0
<10
10 17 18-24 25-31 32-38 39-45
число хромосом в клетке
>45
2n
n
0 цикл 8 цикл 13 цикл 25 цикл ^ 4 цикл 15 цикл 20 цикл
При изменении условий профиль плоидности клеток в
популяции изменяется. Но обратимо.
% клеток
Изменения профиля плоидности штамма ДМ-8
50
n
45
2n
40
3n
35
>3n
30
25
n
20
2n
% клеток
15
10
3n
>3n
60
5
50
0
0 цикл
6 цикл
10 цикл
13 цикл
3 цикл
40
30
c
c
20
>3n
3n
10
0
2n
n
0 цикл 8 цикл 13 цикл 25 цикл ^ 4 цикл 15 цикл 20 цикл
Перестройки хромосом в культуре клеток Triticum timofeevi
2 генома: Аt и G: 14 + 14 хр-м.
При субкультивировании Аt
теряются быстрее. Остается 3х
Перестройки
a/ делеция 7GL
б/ инсерция 6АtS
в/ изо-хромосомы 6GL, 3GS,
4GL
г/ транслокация 1GS
д/ неидентифицированная
хромосома, не имеющая
аналогов
е/ Увеличение
гетерохроматинового
сегмента 4GS
ж/ дицентрическая хромосома
1G : 5G
Основные свойства культуры клеток высших растений экспериментально созданной популяции соматических клеток
Снятие организменного
контроля развития переход к популяционным
механизмам развития системы
•  Отбор клеток по максимальной и/
или устойчивой пролиферации
основной принцип развития
поуляции
•  гетерогенность системы по
различным признакам
основа адаптационных
возможностей системы
•  Узкие адаптационые
возможности системы
следствие отсутствия длительной
эволюции
Большой невостребованный
генетический материал –
клетки in vitro имеют полную
информацию об интактном
растении
•  Влияние невостребованных
генов на развитие популяции
•  Судьба невостребованного
генетического материала –
возникновение и скорость
мутаций, сомаклональных
вариаций
•  Включение/выключение
невостребованных блоков –
программы морфогенеза,
соматического эмбриогенеза
Морфогенез in vitro
Этапы соматического эмбриогенеза цитрусовых
• 
Стадия глобулы
• 
Стадия торпедо
• 
Стадия сердца
• 
Проростки
Соматический эмбриоидогенез
Rauwolfia vomitoria
1
1 – каллус;
2 – эмбриоид.
2
Соматический эмбриоидогенез Rauwolfia vomitoria
(продолжение)
3
3 – проросток;
4 – растения,
полученные
in vitro.
4
Каковы же будут растения-регенеранты?
Сомаклональная вариабельность: проявление
Для пшеницы:
•  изменения по морфологическим и биохимическим признакам,
находящимся под простым (состав глиадинов, цвет зерна) и полигенным
контролем (высота растений, сроки колошения, урожайность)
•  сомаклональные мутанты могут быть рецессивными (остистость, цвет
зерна), доминантными (цвет шелухи зерна, безостость) или
кодоминантными (глиадины).
•  сомаклоны могут быть вариантами по ряду признаков, которые в
потомстве группируются независимо
•  в регенерантах Rо бывают как гетерозиготные, так и гомозиготеые
мутанты. Некоторые сомаклоны могут иметь оба состояния в разных
генах
•  мутации могут быть по признакам, генные локусы которых
локализованы во всех семи гомеологических группах.
Сомаклоналные варианты кукурузы
Два регенеранта из одного
каллуса
«Кустистая» кукуруза
«Кукурузный
транссексуал»
Сомаклональная вариабельность: механизмы и закономерности
•  одной из причин сомаклональной вариабельности может быть
одиночные генные мутации, иногда с достаточно высокой частотой – до
4%. Это могут быть доминантные, семидоминантные и рецессивные
ядерные мутации. При этом возможны мутации, которые не обнаружены
при обычном мутагенезе. Часто моногенные признаки R1 расщепляются
3 : 1, что указывает на клоновое происхождение вариантов
•  одной из причин сомаклональной вариабельности может быть
митотическая рекомбинация
•  одной из причин сомаклональной вариабельности может быть мутации
хлоропластной и митохондриальной ДНК
•  одной из причин сомаклональной вариабельности может быть
длительные модификации генома – прежде всего метилирование ДНК
Полиморфизм ДНК-маркеров у сомаклонов кукурузы
Генетическое расстояние,%
Генетические расстояния между линией
кукурузы А188 и полученными из нее
сомаклонами
25
20
15
10
5
0
R11
R14
R27
R54
R105
R106
R107
R119
Практическое использование культур клеток высших растений
1.  Промышленная биотехнология.
Производство веществ растительного происхождения
2.
Сельскохозяйственная биотехнология
а/ микроклональное размножение,
b/ оздоровление,
c/ клеточная селекция,
d/ создание трансгенных растений
3.  Сохранение генофонда:
Коллекции клеточных штаммов, меристем, растений in vitro. (в
том числе криоколлекции)
Биореакторы промышленного объема и получаемая биомасса
культуры клеток женьшеня
Привлекательность использования культур клеток высших растений
для получения биологически-активных веществ растительного
происхождения
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
практически абсолютная экологическая чистота производства биомассы
культуры клеток;
Возможность получения биомассы редких и исчезающих видов растений
гарантированное получение растительной биомассы с заданными
характеристиками независимо от сезона, климатических и погодных
условий;
высокие скорости получения биомассы: до 2 граммов сухой биомассы с
литра среды за сутки (для сравнения - прирост корня женьшеня на плантации 1 грамм в год);
гарантированное отсутствие в биомассе пестицидов, гербицидов,
радиоактивных соединений и других поллютантов;
возможность использования для получения биомассы стандартного
оборудования микробиологических производств (биореакторов,
постферментационных систем и др.);
более высокое содержание целевого продукта, чем в интактном растении
(при наличии эффективного промышленного штамма-продуцента)
Алкалоиды – азотсодержащие «растительные яды»
… как, впрочем, и лекарства…
Фенольные соединения тоже небесполезны…
Изопреноиды: фитохимический «рог изобилия»
Полынь гладкая
O
H
O
O
Арглабин
Тис ягодный
(Taxus baccata)
Паклитаксел
Два пути синтеза изопреноидов в растительной клетке
1-Deoxy-D-xylulose (d2-DOX)
Mevalonic acid (d2-MVA)
Linalool
Myrcene
Ocimene
Синтез фуростаноловых гликозидов в культуре клеток
Dioscorea deltoidea
Протодиосцин
В клетках диоскореи
синтезируются стероидные
гликозиды, характерные
как для листьев
(протодиосцин), так и для
корневища (дельтозид)
интактного растения. Кроме
того появляются 26-Sизомеры, не характерные
для интакнтого растения.
S-
Женьшень и структура гинзенозидов - тритерпеновых
гликозидов даммаранового ряда
Cструктура семи основных гинзенозидов
Гинзенозиды Rg-группы
Гинзенозиды Rb-группы
Содержание гинзенозидов в культуре клеток Panax ginseng в трех
последовательных субкультивированиях на двух разных средах
%5
1-й цикл
2-й цикл
3-й цикл
4
Среда ТО
3
%5
2
4
1
0
1-й цикл
2-й цикл
3-й цикл
3
7 сут
14 сут
21 сут
2
1
Среда 62
0
7 сут
14 сут
21 сут
мг/г сухой массы
Содержание гинзенозидов в цикле выращивания
суспензионной культуры клеток Panax japonicus (repens)
25
Общее содержание гинзенозидов
70-й цикл
85-й цикл
20
Соотношение гинзенозидов
Rg/Rb групп
100 цикл
15
9
Rg/Rb
10
70-й цикл
8
85-й цикл
7
5
100 цикл
6
5
0
1
3
7
10
14
17
21
24
30 сутки
4
3
2
1
0
1
3
7
10
14
17
21
24
30
сутки
Содержание индивидуальных гинзенозидов
Rb1, Rc, Rb2, Rd (Rb) Rf, Rg1, Re (Rg)
Привлекательность использования культур клеток высших растений
для получения биологически-активных веществ растительного
происхождения
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
практически абсолютная экологическая чистота производства биомассы
культуры клеток;
Возможность получения биомассы редких и исчезающих видов растений
гарантированное получение растительной биомассы с заданными
характеристиками независимо от сезона, климатических и погодных
условий;
высокие скорости получения биомассы: до 2 граммов сухой биомассы с
литра среды за сутки (для сравнения - прирост корня женьшеня на плантации 1 грамм в год);
гарантированное отсутствие в биомассе пестицидов, гербицидов,
радиоактивных соединений и других поллютантов;
возможность использования для получения биомассы стандартного
оборудования микробиологических производств (биореакторов,
постферментационных систем и др.);
более высокое содержание целевого продукта, чем в интактном растении
(при наличии эффективного промышленного штамма-продуцента)
Биореакторы промышленного объема и получаемая биомасса
культуры клеток женьшеня
Получение лекарственных препаратов и пищевых добавок на
основе культур клеток высших растений.
Совместно с НПФ «Биофармтокс» (С-Петербург) на основе биомассы культуры
клеток полисциаса Polyscias filicifolia созданы нутрицевтики «Витагмал»,
«Трифитол», серия мазей «Витагмалин». Биомасса нарабатывается на установках
Отдела биологии клетки ИФР РАН (биореакторы объемом 0,63 м3)
С/х биотехнология.
1. Микроклональное размножение и оздоровление растений
С/х биотехнология
2. Клеточная селекция
Эффективность клеточной селекции обусловлена
гетерогенностью популяции клеток in vitro
Отбор клеток сахарного
тростника, устойчивых к аноксии
Регенеранты кукурузы линии А188
с разной устойчивочтью к засолению
Отбор растений, толерантных к недостатку кислорода
Индекс роста, % к
контролю
Индекс роста каллуса, прошедшего
анаэробную инкубацию, после месяца
культивирования в нормальных условиях
исх. каллус
120
уст.линия
100
80
60
Выживаемость растений пшеницы
после затопления, %
Исходные
33,3
После селекции 72,7
40
20
0
6
24
48
72
96
Время анаэробной инкубации, ч
Выживаемость потомства
толерантных растений пшеницы
после 8 дней затопления, %
Исходные
Регенеранты без селекции
Регенеранты после селекции
0
4,5
32
Сохранение ценных штаммов-продуцентов и исчезающих
видов путем криоконсервации
Морфогенный каллус
диоскореи кавказской D.caucasica
после хранения при
-196оС
Растения после хранения при -196оС
диоскорея балкалнская
D.bakcanica
орхидея
Calanthe vestita
Криосохранение меристем ценных сортов декоративных и
плодовых культур
Земляника после хранения
при -196оС
Роза после хранения
при -196оС
Биология растительной клетки in vitro – лужок с еще не
выщипанной травкой…