1 000024 2 Изобретение относится к жидкой фарма

1
Изобретение относится к жидкой фармацевтической композиции, содержащей уратоксидазу и находящейся в форме раствора,
стабильного при 25°С и прозрачного после перемешивания. Этот раствор может быть получен, в частности, путем растворения содержащего уратоксидазу лиофилизата в растворителе.
Уратоксидазу (уратпероксидоредуктаза ЕС
1.7.3.3 Uox), протеиновый фермент, получаемый
из Aspergillus flavus, который окисляет мочевую
кислоту и аллантоин, используют для предохранения или лечения гиперурикемии во время химиотерапий, так как аллантоин в десять раз более растворим, чем мочевая кислота, и легко
удаляется через почки (Laboureur P. и др. Bull.
Soc. Chim. Biol., 1968, 50, 811-825; Kissel P. и
др. The Lancet, 1975, J25, 229).
Уратоксидаза представляет собой тетрамерный фермент, образованный четырьмя идентичными единицами молекулярной массы
34152. Каждое мономерное звено, образованное
одной полипептидной цепью из 301 аминокислоты, ацетилировано на концевом атоме азота и
не содержит дисульфидных мостиков. Оптимальное значение рН стабильности ферментативной активности уратоксидазы в растворе
составляет 8 (Bayol A. и др., акцептовано для
публикации в Biophys. Chem., 1995, 54, 229235).
кДНК, кодирующую этот протеин, клонируют и экспрессируют в E.coli (Legoux R. и др.
J. Biol. Chem., 1992, 267, 12, 8565-8570); в
A.flavus (Chevalet L. и др. Curr. Genet., 1992, 21,
447-453); и в S.cerevisiae (Leplatois P. и др.,
Gene, 1992, 122, 139-145). Поскольку наилучшие
выходы получают из S.cerevisiae, то эти дрожжи
предпочитают использовать для продуцирования рекомбинантной уратоксидазы (re-Uox).
Рекомбинантный фермент, аккумулируемый во
внутриклеточном пространстве в растворимой и
активной форме, экстрагируют, затем очищают
до достижения фармацевтического качества.
Для введения уратоксидазы человеку ее
следует использовать в виде фармацевтической
композиции. Такие композиции должны сохранять ферментативную активность уратоксидазы
с течением времени. Обычно используют лиофилизированную форму для сохранения биохимической целостности и биологической активности ферментов при самых разнообразных условиях хранения. Хорошо известно, что лиофилизированные препараты лучше сохраняют эти
свойства, чем соответствующие жидкие препараты.
Лиофилизированные препараты нужно
разбавлять фармацевтически приемлемым растворителем перед введением человеку парентерально. Поэтому предпочтение отдают жидкой
композиции, так как ее можно было бы быстрее
вводить пациенту, при условии, если она будет
физически и химически стабильной.
000024
2
Известная фармацевтическая композиция
уратоксидазы (Uricozyme) представляет собой
инъецируемый лиофилизированный препарат,
требующий разбавления растворителем. Состав
лиофилизированной формы Uricozyme следующий: уратоксидаза - 1000 ед., 8-аза-2,6диоксопурин-моногидрат, нейтральный безводный карбонат натрия, дигидрат динатрийтетрацемат - 0,37 мг, лактоза – 2 мг.
Состав растворителя для разбавления: дигидрофосфат калия (первичный фосфат калия),
гидрофосфат калия (вторичный фосфат калия),
глюкоза, вода для инъецируемых препаратов до общего объема 1 мл (Справочник VIDAL,
Париж, б 1-е издание, с. 1552, 1985).
Раствор уратоксидазы, полученный после
разбавления лиофилизата растворителем, при
хранении при 25°С постепенно становится мутным и в нем появляется протеиновый волокнистый осадок. Образование этого протеинового
осадка в растворе ускоряется с течением времени и при увеличении интенсивности перемешивания раствора. Полученный раствор физически
нестабилен.
Солюбилизирующие свойства неионных
поверхностно-активных молекул хорошо известны специалисту, а специфика взаимодействия между протеинами и поверхностноактивными веществами описана в литературе.
Задача изобретения заключается в разработке жидких растворов, фармацевтически приемлемых, на основе уратоксидазы, которые были бы стабильны при хранении.
Объектом настоящего изобретения является жидкая фармацевтическая композиция в виде
раствора уратоксидазы, содержащая 0,1 - 10
мг/мл блоксополимера этиленоксида с пропиленоксидом, обозначаемого Poloxamer 188, в водной буферной среде. Эта композиция является
прозрачной и физически и химически стабильной после интенсивного перемешивания или
после хранения в течение по крайней мере 48 ч
и до года при температуре 25°С.
Преимущество, которое дает эта форма,
заключается в большой простоте ее использования в клинических условиях благодаря возможности ее прямого введения пациенту и хранению в готовом к употреблению виде в течение
длительного времени.
Другое преимущество композиции заключается в том, что эта форма не нуждается в особых мерах предосторожности при хранении,
обычно необходимых для инъецируемых растворов, чтобы избежать осаждения в них протеиновых волокон, так как композиция согласно
изобретению обладает той особенностью, что
осаждение протеиновых волокон в растворе
отсутствует.
Жидкая водная композиция согласно изобретению является прозрачной, стабильной,
стерильной и фармацевтически приемлемой и
может быть введена путем инъекции человеку
3
или животному подкожно, внутривенно или
внутримышечно.
В настоящем изобретении подразумевается, что термин "уратоксидаза" обозначает протеин, получаемый путем ферментации природного штамма или штамма, мутированного путем
генной инженерии, фермент, следовательно,
получают путем извлечения из природного
штамма или из культур клеток. Уратоксидаза,
используемая в композициях настоящего изобретения, может быть получена, например, согласно методам, описанным в следующих документах: патент США № 3810820; патент ГДР
№ 284689; патент ГДР № 296804; патент ГДР
№ 300781; патент ФРГ № 2164018; патент ФРГ
№ 1517742; патент Франции № 2664286; патент
Великобритании № 2221910; патент Японии
№ 76-007749; патент Японии № 75-030237; патент Японии № 84-023987; патент Японии № 73018473; патент Японии № 47-029575; патент
CCCP № 565935; патент США № 4062731; европейский патент № 545688 или согласно европейскому патенту № 435776.
Термин "фармацевтически эффективное
количество" обозначает любое количество уратоксидазы, которое дает терапевтический эффект.
Соответствующие изобретению растворы
содержат фармацевтически эффективное количество уратоксидазы. Предпочтительно эти растворы содержат 0,1 - 50 мг/мл уратоксидазы в
зависимости от желаемой дозировки. Интервал
концентраций уратоксидазы не является критическим для изобретения и может изменяться в
зависимости от препаратов.
Растворы согласно изобретению содержат
неионное поверхностно-активное вещество типа
блоксополимера оксиэтилена с оксипропиленом, обозначаемого Poloxamer 188 и отвечающего формуле
НО(СН2СН2O)75[СН(СН3)СН2O]30(CH2CH2O)75H
Этот продукт выпускается в продажу фирмой I.C.I, под названием " Synperonic F 68" и
фирмой B.A.S.F. под названием "Pluronic F 68".
Необходимые количества Poloxamer 188 для
получения физически стабильных растворов
уратоксидазы составляют 0,1-10 мг/мл, предпочтительно 0,5-5 мг/мл.
Значение рН раствора предпочтительно
составляет 7,5-8,5. Когда рН равен 8, то уратоксидаза особенно химически стабильна в растворе.
Обычно предпочитают использовать буфер
на основе фосфата натрия для буферирования
среды. Концентрация буфера предпочтительно
составляет 5-100 ммоль. Предпочтительно используемым буфером является буфер с рН 8 на
основе фосфата натрия в концентрации 5-100
ммоль.
000024
4
Жидкая композиция согласно изобретению
предпочтительно является изотонической и
включает предпочтительно эксципиенты, необходимые для получения изотонического раствора, такие как маннит или аланин.
Раствор может содержать, в частности,
маннит предпочтительно в концентрации 1-50
мг/мл.
Раствор может содержать, в частности,
аланин предпочтительно в концентрации 1-50
мг/мл.
Раствор содержит предпочтительно маннит и аланин в любом соотношении, которое
сохраняет изотоничность раствора, предпочтительно в количестве 1-50 мг/мл маннита и 1-50
мг/мл аланина.
Предпочтительно раствор содержит около
10,6 мг/мл маннита и около 15,9 мг/мл аланина.
Жидкая композиция согласно изобретению
предпочтительно включает консерванты, необходимые для бактериологической консервации
раствора, в частности бензиловый спирт, фенол,
м-крезол, метилпарабен, пропилпарабен, бензалконийхлорид или бензэтонийхлорид.
Раствор может быть получен путем прямого растворения компонентов в воде; путем разведения лиофилизата, содержащего уратоксидазу, с помощью водного растворителя, содержащего Poloxamer 188, или путем разведения лиофилизата, содержащего уратоксидазу и Poloxamer 188, с помощью водного растворителя.
Предметом изобретения является также
лиофилизированная, растворимая в водном растворителе композиция, содержащая уратоксидазу и Poloxamer 188, причем массовое
соотношение Poloxamer 188 и уратоксидазы
составляет 0,01-50.
Лиофилизированная композиция предпочтительно может содержать буфер, указанный
выше для раствора.
Она также может включать предпочтительно эксципиенты, обеспечивающие изотонию водного раствора, который получают путем
растворения лиофилизата в водном растворителе, например аланине или манните, в количествах, изменяющихся в зависимости от объема
используемого растворителя для восстановления.
Следующие примеры иллюстрируют изобретение, не ограничивая, однако, его объема
охраны.
Пример 1. Раствор уратоксидазы получают
путем растворения компонентов в воде, мг: уратоксидаза 1,5, маннит 10,6, L-аланин 15,9, додекагидрат динатрийфосфата 14,32, Poloxamer 188
1, вода для инъецируемых препаратов до общего объема 1 мл.
Пример 2. Раствор уратоксидазы, приготовленный из лиофилизата уратоксидазы, разведенного с помощью содержащего Poloxamer
188 поглощающего лиофилизат водного растворителя.
5
Состав лиофилизата, мг: уратоксидаза 1,5,
маннит 10,6, L-аланин 15,9, додекагидрат динатрийфосфата 14,32.
Состав растворителя: Poloxamer 188 - 1 мг,
вода для инъецируемых препаратов до общего
объема 1 мл.
Пример 3. Раствор уратоксидазы приготовлен из лиофилизата уратоксидазы, содержащего Poloxamer 188, разведенного с помощью
воды.
Состав лиофилизата, мг: уратоксидаза 1,5,
маннит 10,6, L-аланин 15,9, додекагидрат динатрийфосфата 14,32, Poloxamer 188 1 Состав
растворителя : вода для инъецируемых препаратов до общего объема 1 мл. Преимущества композиции согласно изобретению иллюстрируются путем сравнения свойств различных композиций на основе уратоксидазы, указанных в таблице и на прилагаемых рисунках.
Приготовление композиций. Растворы уратоксидазы согласно изобретению могут быть
получены различными способами, например:
путем смешения водного концентрированного раствора уратоксидазы, содержащего натрий-фосфатный буфер с рН 8, с водным раствором, содержащим Poloxamer 188 и, в случае
необходимости, эксципиенты, которые обеспечивают изотонию смешанного раствора, и, в
случае необходимости, консерванты;
путем растворения лиофилизата, содержащего уратоксидазу, натрийфосфатный буфер с
рН 8, дополнительные эксципиенты, которые
обеспечивают изотонию, такие как аланин и
маннит, в водном растворителе, содержащем
Poloxamer 188 и, в случае необходимости, консерванты;
путем растворения лиофилизата, содержащего уратоксидазу, натрийфосфатный буфер с
рН 8, балластные эксципиенты, такие как аланин и маннит, и Poloxamer 188, в водном растворителе, содержащем в случае необходимости
консерванты.
Полученные этими тремя способами растворы при необходимости фильтруют в стерильных условиях.
Они сохраняют свою физическую стабильность, а также химическую стабильность и ферментативную активность уратоксидазы в течение 1 месяца при 25°С.
Для измерения различных параметров, таких как мутность или доза ферментативной активности, применяют различные аналитические
методы.
1. Измерение мутности. Мутность растворов уратоксидазы определяют с помощью турбидиметра (нефелометра) Ratio Hach. Результаты определения мутности выражают в нефелометрических единицах мутности (НЕМ), определяемых согласно стандартным методам анализа воды и сточной воды Американской Ассоциации Здравоохранения (Standard methods for
the examination of water and wastewater de 1'
000024
6
American Public Health Association). Величина
мутности указывает степень агрегации уратоксидазы в растворе.
2. Определение ферментативной активности уратоксидазы. Ферментативную активность
уратоксидазы определяют с помощью спектрофотометрии в термостатированной при 30°С
кювете, следя за исчезновением мочевой кислоты при 292 нм (Legoux R. и др. J.Biol. Chem.,
1992, 267,12, 8565-8570).
Испытания на стабильность раствора, полученного поглощением лиофилизата согласно
примеру 2, осуществляют при 25°С. В приводимой таблице представлена стабильность растворов, полученных поглощением лиофилизата с
помощью воды и с помощью растворителей,
содержащих, соответственно 1 мг Полисорбата
80 (Твин 80) или 1 мг Poloxamer 188 согласно
изобретению, с добавлением количества воды,
достаточного для получения объема 1 мл.
Фиг.1 показывает изменение мутности в
единицах НЕМ в течение 24 ч пяти растворов
уратоксидазы, соответствующих и не соответствующих изобретению, в зависимости от содержания в них неионных поверхностно-активных
веществ, после перемешивания в течение 1 мин
с помощью вихревой мешалки.
Композиция № 1: 15 мг уратоксидазы, 106
мг маннита, 159 мг L-аланина, 143,2 мг додецилгидратированного динатрийфосфата и 10 мл
воды для инъецируемых препаратов.
Композиция № 2: 15 мг уратоксидазы, 106
мг маннита, 159 мг L-аланина, 143,2 мг додекагидратированного динатрийфосфата, 10 мг Полисорбата 80 и 10 мл воды для инъецируемых
препаратов.
Композиция № 3: (согласно изобретению):
15 мг уратоксидазы, 106 мг маннита, 159 мг Lаланина, 143,2 мг додекагидратированного динатрийфосфата, 10 мг Poloxamer 188 и 10 мл
воды для инъецируемых препаратов.
Композиция № 4: 15 мг уратоксидазы, 106
мг маннита, 159 мг L-аланина, 143,2 мг додекагидратированного динатрийфосфата, 100 мг
Полисорбата 80 и 10 мл воды для инъецируемых препаратов.
Композиция № 5 (согласно изобретению):
15 мг уратоксидазы, 106 мг маннита, 159 мг Lаланина, 143,2 мг додекагидратированного динатрийфосфата, 100 мг Poloxamer 188 и 10 мл
воды для инъецируемых препаратов.
Фиг. 2 показывает изменение в течение 24
ч мутности в единицах НЕМ после перемешивания в течение 1 мин с помощью вихревой мешалки шести растворов уратоксидазы, содержащих Poloxamer 188 согласно изобретению, в
зависимости от содержания в них Poloxamer
188.
Композиция № 5: 15 мг уратоксидазы, 106
мг маннита, 159 мг L-аланина, 143,2 мг додекагидратированного динатрийфосфата, 100 мг
7
Poloxamer 188 и 10 мл воды для инъецируемых
препаратов.
Композиция № 3: 15 мг уратоксидазы, 106
мг маннита, 159 мг L-аланина, 143,2 мг додекагидратированного динатрийфосфата, 10 мг
Poloxamer 188 и 10 мл воды для инъецируемых
препаратов.
Композиция № 6: 15 мг уратоксидазы, 106
мг маннита, 159 мг L-аланина, 143,2 мг додекагидратированного динатрийфосфата, 7,5 мг
Poloxamer 188 и 10 мл воды для инъецируемых
препаратов.
Композиция № 7: 15 мг уратоксидазы, 106
мг маннита, 159 мг L-аланина, 143,2 мг додекагидратированного динатрийфосфата, 5 мг
Poloxamer 188 и 10 мл воды для инъецируемых
препаратов.
Композиция № 8: 15 мг уратоксидазы, 106
мг маннита, 159 мг L-аланина, 143,2 мг додекагидратированного динатрийфосфата, 2,5 мг
Poloxamer 188 и 10 мл воды для инъецируемых
препаратов.
Композиция № 9: 15 мг уратоксидазы, 106
мг маннита, 159 мг L-аланина, 143,2 мг додекагидратированного динатрийфосфата, 1 мг
Poloxamer 188 и 10 мл воды для инъецируемых
препаратов.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного начала уратоксидазу, отличающаяся тем, что она содержит
эффективное количество уратоксидазы и 0,1-10
мг/мл блоксополимера этиленоксида и пропиленоксида общей формулы:
НО(СН2СН2О)75[СН(СН3)СН2O]30(CH2CH2O)75H
в среде буферного раствора.
2. Композиция по п.1, отличающаяся тем,
что она содержит 0,5-5 мг/мл указанного блоксополимера.
3. Композиция по п.1, отличающаяся тем,
что она дополнительно содержит аланин.
4. Композиция по п.3, отличающаяся тем,
что количество аланина составляет 1-50 мг/мл.
5. Композиция по п.1, отличающаяся тем,
что она дополнительно содержит маннит.
6. Композиция по п.5, отличающаяся тем,
что количество маннита составляет 1-50 мг/мл.
7. Композиция по п.1, отличающаяся тем,
что она содержит аланин и маннит.
000024
8
8. Композиция по п.7, отличающаяся тем,
что она содержит 1-50 мг/мл аланина и 1-50
мг/мл маннита.
9. Композиция по п.8, отличающаяся тем,
что она содержит 15,9 мг/мл аланина и 10,6
мг/мл маннита.
10. Композиция по п.1, отличающаяся тем,
что она содержит эксципиент, обеспечивающий
изотонию.
11. Композиция по п.1, отличающаяся тем,
что она содержит буфер на основе фосфата натрия.
12. Композиция по п.1, отличающаяся тем,
что концентрация буфера составляет 5-100 мМ.
13. Композиция по п.1, отличающаяся тем,
что ее рН равен 7,5-8,5.
14. Композиция по п.1, отличающаяся тем,
что она дополнительно содержит один или несколько консервантов, выбранных из фенола,
бензилового спирта, м-крезола, метилпарабена,
пропилпарабена, хлорида бензалкония или хлорида бензэтония.
15. Композиция по п.1, отличающаяся тем,
что она получена растворением в водном растворителе лиофилизата, содержащего уратоксидазу.
16. Композиция по п.15 в форме инъецируемого раствора, отличающаяся тем, что она
получена растворением лиофилизата, содержащего, мас. %: уратоксидазу - 3,55, маннит 25,05, L-аланин - 37,60, додекагидрат динатрийфосфат - 33,80, в водном растворителе, содержащем, мас.%: указанный блоксополимер 0,1, вода, для инъецируемого препарата - 99,9.
17. Лиофилизат для получения фармацевтической композиции по п.1, содержащий уратоксидазу, отличающийся тем, что он содержит
блоксополимер этиленоксида и пропиленоксида
формулы
НО (CH2CH2O)75[CН(СН3)СН2O]30(СН2СН2О)75Н
при весовом соотношении сополимер/уратоксидаза, равном 0,01-50.
18. Лиофилизат по п.17, отличающийся
тем, что он содержит буфер.
19. Лиофилизат по п.17, отличающийся
тем, что он содержит эксципиенты, обеспечивающие изотонию водного раствора, получаемого растворением лиофилизата в водном растворителе.
9
000024
10
Стабильность растворов, полученных разбавлением лиофилизата при 25°С
Время, ч
Растворитель Вид
Вода
>IV
0,1% Твин 80 II
0,1% PoloxII
amer 188
0
UАЕ/мл ферментативная
активность
8,01
26,1
8,0
26,0
8.0
24,7
РН
24
UАE/мл фер- Вид
ментативная
активность
>IV 8,01
26,5
>IV
II-III 8,0
28,1
III-IV
II
8.0
28,9
II
Вид
РН
48
UAЕ/мл ферментативная
активность
8,01
27,9
8,0
29,1
8,0
28,5
рН
UAE = единица ферментативной активности
Вид (опалесценцию) раствора определяют согласно методу, описанному в Европейской Фармакопее II т.6 при сравнении анализируемого образца с контрольной суспензией.
Фиг. 2
Фиг. 1
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, Москва, ГСП 103621, М. Черкасский пер., 2/6