Разработка метода выделения деградированной ДНК с

Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №6,А, 2009 г
УДК
РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВЫДЕЛЕНИЯ ДЕГРАДИРОВАННОЙ ДНК С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАНОЧАСТИЦ И МИКРОКРИСТАЛЛОВ
Кравцова О.А.1, Аникеев О.Е.1, Бикмуллин А.Г.1
1. Казанский государственный университет
420008, г.Казань, ул.Кремлевская, 18, кафедра биохимии
E-mail: [email protected], тел. 89060112550
Проблемой исследования древней ДНК занимаются ученые различных дисциплин: геологии,
палеонтологии, археологии, истории. Изучение древнего генетического материала было начато еще в начале прошлого века. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – уникальный метод
современной молекулярной биологии – способствовал не только значительному прогрессу в
изучении древней ДНК, но и появлению новой научной дисциплины – молекулярной археологии, или палеогенетики.
Однако изучение древней ДНК связано с определенными трудностями, в первую очередь сопряженными с ее выделением, так как не из любых, даже хорошо сохранившихся, останков
можно получить ДНК. Если же древняя ДНК и сохранилась в образце, то возникает проблема извлечения ее в неповрежденном виде и без примесей, ингибирующих ПЦР. Таким образом, данная работа была предпринята с целью оптимизации метода выделения древней деградированной ДНК с помощью магнитных наночастиц и микрокристаллов.
Ключевые слова: деградированная ДНК, наночастицы, микрокристаллы.
Выделение ДНК из деградированных образцов можно проводить различными методами (фенол-хлороформная экстракция, силикатные методы). Однако процедура выделения затрудняет дальнейшее изучение образца, происходит
потеря ДНК, методы достаточно трудоемкие, дорогостоящие и предполагают
использование агрессивных органических соединений. Поэтому актуальной
проблемой при исследовании деградированных образцов ДНК остается разработка методов экстракции, которые могли бы обеспечить получение молекул
ДНК, пригодных для дальнейших анализов.
Для достижения положительного результата были поставлены следующие
задачи:
1. Определить оптимальное время и количество наночастиц, необходимое
для полной сорбции ДНК.
2. Определить возможность сорбции ДНК на модифицированные наночастицы из различных буферов, используемых для экстракции ДНК, спектрофотометрически оценить выход ДНК.
3. Выделить ДНК из костных останков, датируемых XVI в. и провести
предварительную качественную оценку препаратов ДНК методом ПЦР.
4. Предложить возможную методику выделения ДНК из образцов древних
костных останков.
49
Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №6,А, 2009 г
Оптимизация метода выделения ДНК с помощью магнитных наночастиц
Для определения оптимального количества наночастиц, необходимого для
лучшей сорбции мы использовали ДНК с известной концентрацией, в водный
раствор которой помещали разное количество наночастиц (от 5 до 100 мкл на 1
мл раствора ДНК) и определяли концентрацию сорбированной ДНК с помощью
спектрофотометрического метода. В результате, нами было установлено, что
это количество составляет 20 мкл раствора модифицированных наночастиц на 1
мл раствора ДНК (Таб. 1.).
№ образца
Количество наночастиц
Концентрация ДНК
Сорбции (%)
(мкл/мл)
(нг/мкл)
1
5
3,5
26
2
10
6,6
50
3
15
5,8
44
4
20
10,2
77
5
25
5,3
40
6
30
4,3
33
7
40
5,3
40
8
50
2,2
16
9
100
5,4
40
Контрольная ДНК
-
13,2
-
Таблица 1. Результаты спектрофотометрического определения количественного содержания ДНК, выделенных на различном количестве модифицированных наночастиц.
При этом из раствора сорбировалось 50 % всей ДНК. Полученные образцы ДНК амплифицировали с помощью ПЦР, используя праймер аутосомного
микросателлитного локуса VWA31A. Результаты разделения продуктов амплификации представлены на Рис. 1.
50
Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №6,А, 2009 г
Далее
мы
определили
время
сорбции, для этого
также использовали
ДНК с известной
концентрацией. По
данным спектрофотометрического метода количественного определения ДНК
в полученных образцах,
оптимальное
Рис.1. Электрофореграмма разделения продуктов амплификации
время сорбции состасовременной ДНК по аутосомному STR локусу VWA31A,
выделенной с различным количеством магнитных наночастиц. 1 вило 30 мин.
Нас также инте– 5 мкл раствора модифицированных наночастиц на 1 мл ДНК, 2
– 10 мкл, 3 – 15 мкл, 4 – 20 мкл, 5 – 25 мкл, 6 – 30 мкл, 7 – 40
ресовала сорбируюмкл, 8 – 50 мкл, 9 – 100 мкл, 10 – контрольная ДНК с
щая способность наконцентрацией132,2 нг/мкл, 11 – маркерная лестница.
ночастиц в различных растворах. При этом исследовании мы использовали ДНК с известной концентрацией (39,92 нг/мл), растворенную в следующих растворах: хлороформ;
лизирующий раствор, содержащий протеиназу К; лизирующий раствор с гуанидин изотиоционатом; ЭДТА (0,5 М); фосфатный буфер (0,5 М, pH 8,3). Полученные образцы ДНК использовали для постановки ПЦР, при которой использовали праймер аутосомного микросателлитного локуса VWA31A. Из электрофореграммы разделения продуктов амплификации, представленной на Рис. 2
видно, что
1
2
3
4
5
6
7
лучшая сорбция
ДНК происходит
из
фосфатного
буфера, тогда как
другие образцы
имеют меньшую
интенсивность
полос. Результаты
разделения продуктов амплификации полностью
Рис. 2. Электрофореграмма разделения продуктов амплификации
согласуются
со
современной ДНК, выделенной из различных растворов. 1- водная
спектрофотометфаза, после очистки хлороформом, 2 – лизирующий с гуанидин
данизотиоционатом, 3 – фосфатный буфер, 4 – ЭДТА, 5 – лизирующий с рическими
ными.
протеиназой К, 6 – современная ДНК, 7 – маркерная лестница.
Спектрофотометрические измерения также показали наилучшую сорбцию ДНК из фос1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12
51
Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №6,А, 2009 г
фатного буфера, процент сорбции составил 20 %, тогда как в других образцах
этот показатель составлял не более 5%. Далее оптимизированные условия
сорбции использовались для выделения древней ДНК из костных останков.
Таким образом, предлагаемый нами метод основан на применении магнитных наночастиц (Fe2O3) для выделения деградированной ДНК. Данная стратегия выделения имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами:
наночастицы можно легко и быстро приготовить, допускается длительное время их хранения, сама процедура выделения проста в исполнении, дешевизна
используемых реактивов позволяет затрачивать минимальные материальные
ресурсы, получая при этом максимальный выход ДНК. Также целью наших
дальнейших интересов является отработка метода выделения ДНК из образцов
древних костей с использованием микрокристаллов карбоната кальция, модифицированных магнитными наночастицами.
Выводы
1. Были оптимизированы условия и время сорбции ДНК магнитными наночастицами. Количество наночастиц, необходимое для лучшей сорбции ДНК
составило 20 мкл раствора наночастиц (0,5 мг/мл) в расчете на 1 мл раствора
ДНК. Сорбирующая способность наночастиц при этом составила 50%. Оптимальное время сорбции составило 30 мин инкубации при комнатной температуре.
2. С использованием магнитных наночастиц выделена древняя ДНК из костных
образцов, найденных на территории Казанского Кремля.
3. Определили, что ДНК может быть выделена из разных растворов с помощью наночастиц.
4. Отботана возможная методика выделения ДНК из образцов древних костных
останков.
Литература
1. Anzai, T. HLA genotyping of 5,000- and 6,000-year-old ancient bones in Japan / T. Anzai, T.K.
Naruse, K. Tokunaga et al. // Tissue Antigens. – 1999. – Vol.54. – P.53-58.
2. Deagle, B. Quantification of damage in DNA recovered from highly degraded samples – a case
study on DNA in fasces / B. Deagle, J. P. Eveson, S. N Jarman // Front. Zool. – 2006. – Vol. 3,
№ 11– P. 53-63.
3. Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA / T. Lindahl // Nature. – 1993.
– Vol. 362. – P. 709-715.
4. Sampietro, M. L. Tracking down human contamination in ancient human teeth / M. L. Sampietro, M. P. Gilbert, O. Lao, et al. // Mol. Biol. Evol. – 2006. – Vol. 23, № 9. – P. 1801-1807.
52
Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». №6,А, 2009 г
DEVELOPMENT OF THE METHOD OF ALLOCATION OF DEGRADED
DNA WITH USE NANOCHAINS AND MICROCRYSTALS
Kravtsova О.А.1, Anikeev О.Е.1, Bikmullin A.G.1
1. Kazan State University
420008, Kazan, street Kremlin, 18, dep. Biochemistry
E-mail [email protected], ph. 89060112550
Scientists of various disciplines are engaged in a problem of research of ancient DNA: geology, paleontology, archeology, history. Studying of an ancient genetic material has been begun in the beginning of the last century. Polymerase chain reaction (PCR) – is unique method of modern molecular biology – promoted not only to significant progress in studying ancient DNA, but also to occurrence of new scientific discipline – molecular archeology, or paleontogenetic.
However studying of ancient DNA is connected with the certain difficulties, in the first place interfaced with its allocation as not from any which even have well kept, remains it is possible to receive
DNA. If ancient DNA also was kept in the sample there is a problem to take it in the intact kind and
without impurity, inhibition PCR process. Thus, the given work has been undertaken with the purpose of optimization of a method of allocation of ancient degraded DNA by means of magnetic nanjchains and microcrystals.
Keywords: DNA, nanochains, microcrystals.
Сведения об авторах
№
Ф.И.О.
№
1 Кравцова Ольга
Александровна
2
Аникеев Олег Евгеньевич
3
Бикмуллин Айдар
Должность и место работы
к.б.н., ст.преподаватель кафедры биохимии, биолого-почвенный факультет.
Казанский государственный университет
Студент 5 курса кафедры биохимии, биолого-почвенный факультет
Казанский государственный университет
Студент 4 курса кафедры биохимии, биолого-почвенный факультет
Казанский государственный университет
Телефон рабочий
E-mail
(843)2315245
[email protected]
89060112550
[email protected]
om
[email protected]
53