Документ 234469

www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
Содержание
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение... 5
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ... 15
1.1. Стабильность экспрессии и наследование чужеродных генов у трансгенных растений... 15
1.1.1. Клонирование генов для переноса их в геном растений... 15
1.1.2. Создание генетических конструкций... 16
1.1.3. Перенос созданных генетических конструкций в геном растений... 18
1.1.3.1. Агробактериальная трансформация: генетическая карта Ti-плазмиды и Т-ДНК... 19
1Л .3.2. Общая схема переноса Т-ДНК в клетки растений... 20
1.1.3.3. Перенос векторных последовательностей в процессе
агробактериальной трансформации... 24
1.1.4. Оценка трансгенных растений по стабильности экспрессии перенесенных генов и отбор
отдельных трансформантов для дальнейшей селекционной доработки... 26 -
1.1.4.1. Наследование трансгенов у трансгенных растений... 261
1.1.4.2. Вариабельность экспрессии перенесенных генов... 27
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
1.2. Изменение экспрессии перенесенных генов в новом окружении генома растений: эффект
замолкания... 30*
1.2.1. Частота инактивирования трансгенов у независимо полученных трансгенных растений... 30
1.2.2. Возможные причины инактивирования трансгенов... 31
1.2.3. Молекулярные механизмы инактивации трансгенов... 37
1.2.4. Генетический контроль инактивации/реактивации трансгенов 40
1.3. Изменение проявления1 собственных генов у трансгенных растений: Т-ДНК-индуцированные
мутации... 42
1.3.1. Возможные причины возникновения Т-ДНК индуцированных мутаций... 42
1.3.2. Примеры Т-ДНК индуцированных мутаций у трансгенных растений... 45
1.3.3. Перспективы использования инсерционного мутагенеза... 53
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ... 55
2.1. Создание исходного материала... 55
2.2. Подтверждение трансгенной природы растений-трансформантов 59
2.3. Анализ стабильности экспрессии маркерного гена nptll на селективных средах с антибиотиком
канамицином... 60
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
2.4. Анализ фрагментов векторной ДНК у трансгенных растений... 62
2.5. Создание коллекции трансгенных растений табака с мутантным фенотипом... 64
2.6. Анализ цитологического фенотипа трансгенных растений, характеризующихся измененной
структурой цветка и пониженным уровнем мужской фертильности... 65
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ... 67
3.1. Анализ популяции трансгенных растений табака по стабильности
экспрессии маркерного гена nptll... 67
3.1.1. Анализ трансгенных растений табака сорта «Gatersleben» по стабильности экспрессии nptllгена... 67
3.1.2. Анализ трансгенных растений табака линии SR1 по стабильности экспрессии nptll-геш... 69
3.1.3. Анализ инактивированного состояния гена nptll у трансгенных растений То-10, Nu22 и 615... 72
3.1.4. Анализ стабильности экспрессии и наследование гена nptll у трансгенных растений табака
(линия SR1) с одной инсер-цией Т-ДНК на геном... 73
3.1.5. Анализ стабильности экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака (линия SR1) со
множественными инсер-циями Т-ДНК на геном... 78
3.1.6. Анализ стабильности экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака с отклонениями от
менделевского расщепления... 81
3.2. Анализ стабильности экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака при инбридинге... 89
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
3.2.1. Наследование гена nptll у трансгенных растений линий То-5 иТ0-6... 89
3.2.2. Анализ нестабильности экспрессии гена nptll у растений линий То-5 и То-6... 96*
3.2.3. Анализ взаимодействия аллелей гена nptll у трансгенных растений линии То-5... 108
3.3. Моделирование нестабильной экспрессии чужеродных генов у трансгенных растений... 119
3.4. Т-ДНК-индуцированные мутации у трансгенных растений табака 127
3.4.1. Создание и анализ коллекции трансгенных растений табака
с мутантным фенотипом... 127
3.4.2. Анализ цитологических нарушений мейоза у трансгенных растений табака линии Res79... 144
4
3.4.3. Интеграция векторной ДНК в геном трансгенных растений табака... 156
3.4.3.1. Анализ трансгенных растений табака с мутантным фенотипом на наличие в геноме векторной
ДНК... 156
3.4.3.2. Анализ трансгенных растений табака, не проявляющих мутантного фенотипа, на наличие в
геноме векторной ДНК... 159
3.4.4. Анализ районов встраивания Т-ДНК инсерций у трансгенных растений табака с мутантным
фенотипом... 161
Заключение... 165
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
Выводы... 172
Список литературы... 174
Приложение... 192
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
Введение
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Генетическая инженерия растений представляет собой новое направление в
деятельности человека, которое позволяет целенаправленно, по заранее намеченной программе
экспериментально модифицировать геном растений. Необходимо подчеркнуть, что разработанные к
настоящему времени генно-инженерные методы и подходы дают возможность перестраивать геном
растения с использованием генетической информации из разных гетерологических систем: вирусов,
бактерий, насекомых, животных и человека. Более того, при использовании генно-инженерных
методов существенно расширяются возможности модификации генома и внутри растительного
царства, что снимает естественные барьеры между отдаленными видами растений. В этом случае
становится возможным переносить отдельные гены в систематически удаленные виды, например, из
однодольных в геном двудольных растений. Таким образом, к традиционным селекционногенетическим методам дополнительно могут быть добавлены методы генетической инженерии, что
позволит существенно расширить границы формообразовательного процесса при создании
исходного материала. Реализация таких программ невозможна при использовании только
традиционных методов селекции.
Успех любой селекционно-генетической программы, направленной на улучшение хозяйственно
ценных признаков у растений с применением методов генетической инженерии определяется
высоким и стабильным уровнем экспрессии перенесенных генов. Уже через несколько лет после
создания первых трансгенных растений стало очевидно, что перенесенные гены функционируют в
новом генетическом окружении растительного генома не всегда так, как предполагалось.
Наблюдалась широкая вариабельность в экспрессии трансгенов среди индивидуальных
трансформантов, а также случаи их полной инактивации.
Как правило, перенесенные гены наследуются согласно законам Менделя, однако к настоящему
времени накоплено достаточно много примеров отклонений от менделевского наследования,
обусловленных инактивирова-нием трансгенов. Потеря экспрессии (инактивирование) трансгенов,
известное как «gene silencing», представляется как нежелательное явление при создании
трансгенных растений. Несмотря на интенсивные исследования этого явления во многих ведущих
биотехнологических центрах мира, причины и молекулярно-генетические механизмы все еще
остаются до конца не выясненными.
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
Необходимо отметить, что замолкание генов встречается не только у трансгенных растений. Так,
парамутации у кукурузы были известны еще задолго до обнаружения эффекта инактивации
перенесенных генов (Brink, 1973). Однако только сравнительно недавно стали обозначаться общие
черты между этими явлениями. Трансгенные растения, у которых перенесенные ге-
ны относительно легко идентифицируются и находятся в инактивированном состоянии, могут
служить уникальными моделями для изучения молекуляр-но-генетических механизмов замолкания
трансгенов, а также поиска путей преодоления этого феномена. Поэтому накопление любых
экспериментальных фактов, касающихся феномена инактивирования трансгенов, может послужить
важным шагом в его понимании, что явится дополнением к фундаментальным представлениям о
функционировании генов в растениях.
Подобно мобильным генетическим элементам инсерции трансгенов в зависимости от места
встраивания могут менять экспрессию отдельных генов у трансгенных растений, что фенотипически
может выражаться в изменении каких-либо признаков у растений, в том числе и морфологических.
Изменения различных признаков, вызванные внедрением фрагментов ДНК, классифицируются как
инсерционные мутации. В настоящее время мутации, индуцированные у трансгенных растений
внедрением фрагментов экзогенной ДНК, достаточно широко используются в ведущих зарубежных
биотехнологических центрах для идентификации и клонирования генов, что является важным
направлением по анализу структурно-функциональной организации генома растений.
Цель и задачи исследования. Целью данной диссертационной работы явилось исследование
эффектов проявления перенесенных (гетерологич-ных) генов в новом окружении растительного
генома, а также эффектов проявления собственных генов (Т-ДНК мутации) у трансгенных растений.
Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Дать оценку стабильности экспрессии перенесенных генов у трансгенных растений. Выявить
соотношение долей трансформантов с менделев-ским типом наследования трансгенов, а также
трансформантов с отклонениями от ожидаемого типа расщепления на примере выборки из
независимо полученных трансформантов.
2. Проанализировать стабильность сохранения перенесенного гена nptll у потомков двух независимо
полученных трансгенных растений с одной инсерцией Т-ДНК на геном в течение нескольких
поколений (при самоопылении).
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
3. Создать модельные трансгенные растения табака на основе гибридов, полученных от скрещивания
трансформантов со множественными ин-серциями прШ-гена. Оценить влияние на стабильность
проявления экспрессии маркерного гена nptll числа инсерции Т-ДНК.
4. Создать трансгенные растения табака, моделирующие нестабильный уровень экспрессии
маркерного гена nptll введением дуплицированных фрагментов в состав генетических конструкций.
Исследовать стабильность экспрессии nptll-гена у полученных модельных трансгенных растений
табака и их гибридов.
5. Определить частоты появления растений с мутантным фенотипом среди трансгенных растений
табака и создать коллекцию Т-ДНК индуцированных мутаций с измененным строением цветка и
пониженной мужской фертильностью.
6. Изучить характер проявления и наследование мутантного фенотипа с измененным строением
цветка и пониженной мужской фертильностью у созданных трансгенных растений табака.
7. Описать цитологический фенотип проявления мутации на примере трансгенного растения Res79
(нарушения мейоза, микроспоро- и микрога-метогенеза).
8. Оценить частоты встраивания в геном трансгенных растений фрагментов векторных ДНК.
9. Провести анализ нуклеотидных последовательностей районов интеграции Т-ДНК инсерций у
отдельных трансгенных растений.
Основные положения, вынесенные на защиту.
1. В популяции независимо полученных трансгенных растений табака экспрессия маркерного гена
nptll в новом окружении растительного генома может быть изменена уже среди потомков первого
поколения от самоопыления (полная инактивация трансгена: мозаицнзм по инактивации трансгена).
2. При инбридинге у потомков от самоопыления трансгенных растений табака в течение нескольких
поколений экспрессия nptll-rena может быть изменена (инактивация и реактивация трансгена).
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
3. Введение в состав генетических конструкций дуплицированных фрагментов экзогенной ДНК в
прямой и обратной ориентации приводит к нестабильности экспрессии nptll-тъш как у потомков от
самоопыления независимо полученных трансформантов, так и у гибридов от их скрещивания.
4. Перенесенные гены вызывают изменения проявления собственных генов у трансгенных растений
(инсерционный мутагенез). Описан синдром морфологических изменений строения цветка и
снижения уровня мужской фертильности. Выявлены причины, приводящие к снижению мужской
фертильности, связанные с различными нарушениями мейоза, а также с цитомиксисом.
5. Фрагменты векторной ДНК могут быть перенесены в геном трансгенного растения и являться
потенциальным источником мутационных изменений инсерционной природы.
6. Анализ состава нуклеотидных последовательностей районов интеграции Т-ДНК инсерций может
свидетельствовать о предпочтительности районов встраивания фрагментов экзогенной ДНК при
агробактериальной трансформации.
Научная новизна. Установлено, что у большей части независимо полученных методом
агробактериального переноса трансгенных растений табака маркерный ген nptll наследуется
потомками первого поколения от самоопыления в соответствии с законами Менделя, что
свидетельствует о сохранении его стабильного уровня экспрессии. Отклонения от менделевского
расщепления, свидетельствующие о нестабильности экспрессии перенесенных генов, в долевом
отношении выявляются в 6 % случаев и полная потеря экспрессии — в 2 % случаев.
Стабильность экспрессии nptll-гена изменяется в потомстве гибридных растений. Показано, что среди
50 реципрокных комбинаций F2 у 15 независимо полученных моноинсерционных трансгенных
растений табака в 18 % случаев наблюдались отклонения от менделевского расщепления по
дигибридной схеме.
Установлено, что увеличение числа инсерций, интегрированных в разные группы хромосом, не
влияло на стабильность экспрессии анализируемого маркерного гена. У гибридов, полученных от
скрещивания трансформантов со множественными инсерциями Т-ДНК, не выявлено случаев полного
инактивирования nptll-rena.
На примере линии То-5 трансгенных растений табака впервые выявлено три аллельных состояния
nptll-гена (активное, инактивированное и реактивированное). Проведен генетический анализ
взаимодействия аллелей nptll-гена,. Установлен доминантный характер наследования аллеля,
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
определяющего активное состояние nptll-гена по отношению к рецессивному характеру
наследования аллеля, определяющего его инактивированное состояние.
Создана серия трансгенных растений табака, моделирующих нестабильный уровень экспрессии гена
nptll введением дуплицированных повторенных фрагментов (в прямой и обратной ориентации) в
состав Т-ДНК инсерций. Впервые показано, что инактивация гомологичных трансгенов существенно
возрастает в геноме гибридных растений.
Впервые создана коллекция трансгенных растений табака, проявляющих мутантный фенотип
(измененное строение цветка и пониженный уровень мужской фертильности) для дальнейшего
анализа флорального морфогенеза, микроспоро- и микрогаметогенеза.
Впервые проведен детальный цитологический анализ мейоза у растения Res79, выявивший серию
нарушений, проявляющихся в различной степени среди других трансгенных растений с мутантным
фенотипом. Нарушения включали образование деформированных ядер в телофазе I и ориентацию
веретен деления в метафазе II мейоза, перфорацию клеточной стенки с образованием
цитомиктических каналов и перемещением по ним хроматина из одного мейоцита в другой,
приводящих к образованию полиад и формированию пыльцевых зерен с пониженной
фертильностью.
Показано, что при агробактериальной трансформации в геном трансгенного растения могут быть
перенесены фрагменты векторных ДНК. Установлено, что среди независимо полученных
трансформантов доля растений с фрагментами векторных ДНК составила 33 %.
Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов растительных ДНК, фланкирующих Т-ДНК
встройки, в отдельных случаях выявил наличие гомологии с известными нуклеотидными
последовательностями мирового банка данных «Gene bank».
Научная и практическая ценность работы. Настоящая работа направлена на изучение особенностей
проявления гетерологичных генов у трансгенных растений, а также на изучение их влияния на
проявление собственных генов растения (Т-ДНК-мутации). Охарактеризована популяция независимо
полученных трансгенных растений табака по стабильности экспрессии маркерного гена nptll,
установлено долевое соотношение групп растений со стабильным уровнем экспрессии,
соответствующим расщеплению потомков в соответствии с законами Менделя. Выделены группы
растений, проявляющие отклонения от менделевского расщепления, что свидетельствует о
нестабильности экспрессии, а также группа растений с полной потерей экспрессии исследуемого
трансгена. Проведен анализ наследования трансгенов у гибридов от скрещивания трансгенных
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
растений с одной и множественными Т-ДНК-инсерциями. Полученные результаты могут служить
основой при создании хозяйственно ценных сортов, созданных при объединении нескольких
трансгенов в геноме гибридов. Впервые проанализировано сохранение стабильного уровня
экспрессии гена nptll у потомков^ двух независимо полученных линий трансгенных растений табака в
течение нескольких поколений. Показано, что у части потомков линии То-5 экспрессия
анализируемого гена может быть инактивирована и в последующих поколениях восстановлена у
отдельных потомков. Проанализировано взаимодействие аллелей гена nptll. Создана серия
трансгенных растений табака, моделирующих нестабильный уровень экспрессии nptll-гсиа
введением ду-плицированных фрагментов (в прямой и обратной ориентации) в состав Т-ДНК
инсерций. Установлено, что инактивация гомологичных трансгенов существенно возрастает в геноме
гибридных растений. Полученные результаты представляют большое значение для дальнейших
фундаментальных и прикладных исследований по изучению функционирования генов растений.
Создана серия трансгенных растений табака с мутантным фенотипом. Установлено, что растения с
мутантным фенотипом выявляются среди независимо полученных трансформантов с частотой около
5 %. Большая часть растений с мутантным фенотипом проявляла сцепленное наследование
измененного признака с устойчивостью к антибиотику, что подтверждало их инсер-ционную
природу. Проведен детальный цитологический анализ нарушений мейоза, приводящих к снижению
мужской фертильности. Установлено, что
10
при агробактериальной трансформации одновременно с Т-ДНК в геном растения могут быть
перенесены фрагменты бактериальной ДНК, что представляется нежелательным с точки зрения
коммерческого использования трансгенных растений. Полученные результаты представляют
большое значение при разработке и уточнении правил по биобезопасности использования
генетически модифицированных организмов.
Данные, полученные в ходе исследования, используются при чтении лекций в курсе «Генетическая
инженерия растений» в Томском государственном университете.
Аппробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях,
симпозиумах и конгрессах:
1. International conference «Plant biotechnology and molecular biology», Moscow, 1991.
2. International Conference «Plant Biotechnology and Genetic Engineering», Oct. 3-6, Kiev, Ukraine, 1994.
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
3. Plant Genome III Conf., SanDiego (January 15-19), 1995.
4. Международная конференция, посвященная памяти акад. А.А. Баева. Москва, 20-22 мая, 1996.
5. German-Russian Cooperation in Biotechnology. Workshop IV. Russia, St-Petersburg. October 10-13,
1996.
6. Международная конференция «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение
генофонда». Москва, 1997.
7. Международная конференция «Новые направления биотехнологии», Москва, 27-29 апреля, 1998.
8. International Congres «Plant Biotechnology and in vitro biology in the 21st century». Jerusalem, Israel,
June 14-19, 1998.
9. Всероссийский симпозиум «Изучение генома и генетическая трансформация растений». 23-27
августа 1999, Иркутск.
10. IV съезд Общества физиологов растений (ОФР), 4-9 октября 1999, Москва.
11.11 съезд Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (ВОГИС), 1-5 февраля 2000.
12. International conference «Plant Biotechnology — Facing the New Millenium», 16-18 Oct. 2000.
Kostinbrod. Bulgaria.
13. Международный симпозиум «Молекулярные механизмы генетических процессов и
биотехнология», Москва (18-21 ноября) - Минск (22-24 ноября) 2001.
14. 1-й Международный конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития». Москва, 1418 октября 2002.
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
15. 2-я конференция Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова. Москва,
20-21 февраля 2003.
11
16. 8-я Международная конференция «Биология клеток растений ш vitro и биотехнология». Саратов.
9-13 сентября 2003.
17. 2-й Международный конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития». Москва, 1014 ноября 2003.
Список работ по теме диссертации, опубликованных в журналах и периодических изданиях:
1. Дейнеко Е.В., Ривкин М.И., Комарова М.Л., Вершинин Л.В., Шумный В.К. Генетическая
трансформация люцерны с использованием Ti-плазмидной системы Agrobacterium tumefaciens II
Докл. АН. 1991. Т. 19, №6. С. 1473-1476.
2. Дейнеко Е.В., Ситникова В.В., Ривкин М.И. К вопросу о стабильности встраивания и наследования
чужеродных генов в геноме трансгенных растений // Особенности реконструкции генома и
популяций высших растений. Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 1993. С. 16-23.
3. Ривкин М.И., Дейнеко Е.В., Комарова М.Л., Кочетов А.В., Шумный В.К. Оценка вирусоустойчивости
трансгенных растений табака, несущих ген бета-интерферона человека//Докл. АН. 1993. Т. 331. С.
652-654.
4. Дейнеко Е.В., Ривкин М.И., Шумный В.К. Использование методов генетической инженерии в
селекционно-генетических программах по улучшению хозяйственно-ценных признаков растений //
Особенности реконструкции генома и популяций высших растений. Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 1993.
С. 5-15.
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
5. Дейнеко Е.В., Загорская А.А., Филипенко М.Л., Кочетов А.В., Шумный В.К. Изменение уровня
экспрессии и наследование маркерного гена nptll в потомстве трансгенных растений табака Nicotiana
tabacum L. // Докл. АН. 1995. Т. 344, № 3. С. 407-411.
6. Rivkin M.I., Deineko E.V., Komarova M.L., Shumnyi V.K. Analysis of virus resistance of tobacco and alfalfa
transgenic plants bearing human p-interferone gene // Biotechnol. and Biotechnolog. Equipment. 1995. N
1. P. 40-44.
7. Deineko E.V., Zagorskaya A.A., Filipenko M.L., Filipenko E.A., Novo-selya T.V., Komarova M.L., Kochetov
A.V., Shumny V.K. Instability of nptll gene expression in the progeny of transgenic tobacco plants //
Biotechnol. and Biotechnolog. Equipment. 1996. N 3. P. 89-92.
8. Кочетов А.В., Шакирова Н.В., Лукашева В.В., Пилюгин М.В., Комарова М.Л., Дейнеко Е.В., Шумный
В.К. Экспрессия бицистронов у трансгенных растений // Докл. АН. 1996. Т. 349, № 4. С. 549-582.
9. Кочетов А.В., Лукашева В.В., Пилюгин М.В., Комарова М.Л., Ривкин М.И., Дейнеко Е.В., МакКлин Ф.,
Шумный В.К. Оперонная организация транскрипционных единиц в клетках растений: экспрессия
модельных бицистронов // Цитология и генетика. 1997, № 6. С. 17-28.
12
10. Дейнеко Е.В., Загорская Л.А., Филипенко М.Л., Кочетов А.В., Шумный В.К. Нестабильность
экспрессии гена прШ у трансгенных растений при инбридинге // Генетика. 1998. Т. 34, № 9. С. 12121219.
11. Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Филипенко Е.А., Шумный В.К. Стабильность экспрессии и
наследование гена nptll в популяции трансгенных растений табака // Докл. АН. 1999. Т. 369, № 3. С.
420-423.
12. Дейнеко Е.В., Сидорчук Ю.В., Загорская А.А., Новоселя Т.В., Филипенко Е.А., Шумный В.К.
Аномалии строения цветков и мужская стерильность у трансгенных растений табака // Докл. АН.
1999. Т. 368, № 1. С. 135-138.
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
13. Новоселя Т.В., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Стабильность экспрессии гена nptll у трансгенных
растений табака со множественными инсерция-ми // Генетика. 2000. Т. 36, № 3. С. 427-430.
14. Дейнеко Е.В., Загорская А.А., Новоселя Т.В., Филипенко Е.А., Шумный В.К. Нестабильность
экспрессии чужеродных генов у трансгенных растений табака // Физиология растений. 2000. Т. 47, №
3. С. 446-452.
15. Филипенко Е.А., Филипенко М.Л., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Анализ сайтов встраивания Т-ДНК у
трансгенных растений табака с мутантным фенотипом //Докл. АН. 2000. Т. 370, № 2. С. 273-276.
16. Сидорчук Ю.В., Загорская А.А., Дейнеко Е.В., Шамина Н.В., Шумный В.К. Т-ДНК индуцированные
аномалии цветков и мужская стерильность у трансгенных растений табака: морфометрический и
цитологический анализ // Цитология и генетика. 2000. Т. 34, № 6. С. 3-8.
17. Шамина Н.В., Дорогова Н.В., Сидорчук Ю.В., Загорская А.А., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Нарушения
мужского мейоза в трансгенной линии res9\ табака // Цитология. 2000. Т. 42, № 12. С. 1173-1178.
18. Дейнеко Е.В., Загорская А.А., Сидорчук Ю.В., Новоселя Т.В., Филипенко Е.А., Комарова М.Л.,
Шумный В.К. Особенности морфологических признаков и фертильности пыльцы у трансгенных
растений табака // Физиология растений. 2000. Т. 47, № 1. С. 73-78.
19. Shamina N.V., Dorogova N.V., Zagorskaya A.A., Deineko E.V., Shum-ny V.K. Abnormalities of meiotic
division caused by T-DNA tagged mutation in tobacco {Nicotiana tabacum) IICBI. 2001. V. 25, N 4. P. 367369.
20. Novoselya T.V., Deineko E.V., Filipenko E.A., Shumny V.K. Expression stability of marker gene nptll in
transgenic plants Nicotiana tabacum L. with single T-DNA insertion // Biotechnol. and Biotechnolog.
Equipment. 2001. V. 15, N2. P. 3-7.
21. Загорская А.А., Дейнеко Е.В., Сидорчук Ю.В., Шумный В.К. Наследование признака измененного
строения цветка и устойчивости к антибиотику канамицину у трансгенных растений табака //
Генетика. 2001. Т. 37, № 6. С. 784-790.
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
22. Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Загорская А.А., Филипенко Е.А., Пухначе-ва Н.В., Шумный В.Л.
Инактивирование чужеродных генов у трансген-
13
ных растений табака (обзор) // Изучение генома и генетическая трансформация растений.
Новосибирск: Наука, 2001. С. 132-142.
23. Новоселя Т.В., Дейнеко Е.В. Моделирование нестабильности экспрессии nptll-гена у трансгенных
растений табака // Физиология растений. 2002. Т. 49, №3. С. 437-443.
24. Сидорчук Ю.В., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Цитомиксис в материнских клетках пыльцы у
трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) // Докл. АН. 2004. Т. 394, № 2. С. 282-285.
25. Deineko E., Kieft H., Anne Mie Emons, van Lammeren A.A.M. T-DNA insertions leads to male sterility in
tobacco through cytomixis and chromatin translocation. Protoplasma, 2004.
Объем и структура работы. Работа изложена на 198 страницах и состоит из введения, трех глав с
описанием современного состояния проблемы на основании источников литературы, описанием
исходного материала и методов, используемых при решении поставленных задач,
экспериментальных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой
литературы, включающего 249 наименований и приложения. Работа иллюстрирована 36 таблицами
и 54 рисунками. Фактический материал получен автором лично, а также в ходе работ с сотрудниками
Института цитологии и генетики СО РАН.
Работа выполнена в лаборатории гетерозиса растений Института цитологии и генетики СО РАН, а
также в лаборатории биологии растительных клеток университета г. Вагенингена в Нидерландах и в
разные периоды была поддержана отечественными и зарубежными грантами, в которых соискатель
была исполнителем и руководителем:
- РФФИ (№ 02-04-49295) - Молекулярно-генетический анализ Т-ДНК индуцированной изменчивости у
трансгенных растений табака.
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
- РФФИ-Белорусия (№ 00-04-81077Бел2000а) - Мутационная изменчивость у растений рода
Solanaceae как результат интеграции чужеродной ДНК.
- РФФИ (№ 00-04-49557) - Молекулярно-генетические механизмы функционирования чужеродных
генов в геноме трансгенных растений.
- РФФИ (№ 99-04-49324) - Т-ДНК индуцированная изменчивость у трансгенных растений табака:
молекулярно-генетический и цитологический анализ.
- РФФИ (№ 97-04-48763) — Инактивирование чужеродных генов в геноме трансгенных растений:
молекулярно-генетические механизмы.
- РФФИ (№ 97-04-49334) - Нестабильность экспрессии чужеродных генов в поколениях трансгенных
растений: исследование роли дупликаций в структуре Т-ДНК.
- РФФИ (№ 96-04-51075) — Наследование и стабильность экспрессии чужеродных генов в геноме
трансгенных растений: молекулярно-генетический анализ гена nptll у трансгенных растений табака.
14
- РФФИ (00-15-97968) - Особенности преобразования геномов и функционирование генов в процессе
хромосомной и генной инженерии растений.
- Грант Минпромнауки № 43.106.11.11.0004 — Создание трансгенных растений — биопродуцентов
белков медицинского назначения.
- Госконтракт 43.050. 11.1537 от 05.02.2002 - Молекулярно-биологический анализ генетических
факторов, влияющих на «замолкание» целевого гена в ряду поколений трансгенных растений табака.
- Грант IAC (2002, Wageningen, The Netherlands) для проведения исследований по анализу
цитологического фенотипа у трансгенных растений линии Res79.
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
Автор выражает благодарность директору Института цитологии и генетики СО РАН академику В.К.
Шумному за предоставленную возможность и помощь в выполнении данной работы. Автор
выражает крайнюю признательность сотрудникам лаборатории гетерозиса растений и сектора
генетической инженерии растений Института цитологии и генетики СО РАН, а также Хенку Кифту,
Андре Ван Ламмерену и Анни Мие Эмонс (университет г. Вагенингена, Нидерланды), которые на
разных этапах исследований принимали участие либо в выполнении ряда экспериментов, либо
обсуждении полученных данных, что нашло отражение в совместных публикациях.
15
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Стабильность экспрессии и наследование чужеродных генов
у трансгенных растений
Использование генно-инженерных методов для переноса генов, определяющих хозяйственно
ценные признаки у растений, открывает большие возможности для улучшения важных
сельскохозяйственных культур. За последнее десятилетие значительно возрос интерес к трансгенным
растениям и как биопродуцентам различных белков медицинского назначения (Tacket, Mason, 1999;
Smith, Glick, 2000; Stretfield et al., 2000; Korpowski, Yusibov, 2001; Daniell et al, 2001; Park, Cheong,
2002). По некоторым оценкам трансгенные растения могут быть более дешевым и безопасным
источником ре-комбинантных белков по сравнению с традиционными системами на основе
бактерий, дрожжей, клеточных культур насекомых и млекопитающих (Giddings et al, 2000; Daniell et
al, 2001). Необходимо подчеркнуть, что успех в развитии этого направления прежде всего будет
определяться высоким и стабильным уровнем экспрессии перенесенных генов в геноме трансгенных
растений.
Современные технологии создания трансгенных растений включают несколько основных этапов:
- клонирование генов, представляющих интерес для дальнейшего переноса в растительный геном;
— создание генетических конструкций для экспрессии трансгенов в растениях;
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
- перенос созданных генетических конструкций в геном растений;
— оценка трансгенных растений по стабильности экспрессии перенесенных генов и отбор отдельных
трансформантов для дальнейшей селекционной доработки.
Рассмотрим отдельные этапы создания трансгенных растений и попытаемся обозначить круг
наиболее важных проблем, все еще не решенных к настоящему времени.
1.1.1. Клонирование генов для переноса их в геном растений
К настоящему времени проблема клонирования генов из различных гетерологических систем и
адаптация их для экспрессии в растительном геноме практически решена. В ряде обзоров накоплена
и обобщена обширная информация о возможностях генетической инженерии по изменению состава
накапливаемых в растении углеводов (Shevvmaker, Stalker, 1992; Zrenner et al., 1995), вторичных
метаболитов (Penarrubia et al., 1992; Bachem et al, 1994), по изменению аминокислотного состава
запасных белков (Saalbach et al, 1995; Khan et al, 1996), состава растительного масла (Topfer et al,
1995),
16
по накоплению в тканях растений белков медицинского назначения (Tacket, Mason, 1999; Smith, Glick,
2000; Stretfield et al., 2000; Korpowski, Yusibov, 2001; Daniell et al., 2001; Park, Cheong, 2002), по
изменению окраски цветков у декоративных растений (Napoli et al., 1990; Elomaa, Holton, 1994;
Holton, Tanaka, 1994) и т. д. Таким образом, в зависимости от поставленных в конкретном
биотехнологическом проекте целей и задач уровень развития генно-инженерных методов в
настоящее время позволяет клонировать разнообразные гены.
1.1.2. Создание генетических конструкций
Развитие генно-инженерных методов на современном уровне позволяет также адаптировать
выделенные из различных гетерологических систем гены для экспрессии в геноме трансгенных
растений. Для этих целей разработаны различные методы и приемы, хорошо представленные и
описанные в ряде методических руководств для лабораторных исследований (Дрейпер и др., 1991;
Маниатис и др., 1994; Sambrook, Russel, 2001). В общем виде генетические конструкции, создаваемые
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
для планируемого переноса в геном растений различных генов, включают следующие необходимые
элементы (рис. 1):
- белок-кодирующую структурную последовательность (целевой ген);
- промотор, узнаваемый РНК-полимеразой растительной клетки;
- терминатор, узнаваемый РНК-полимеразой растительной клетки;
- селективный маркерный ген для отбора трансформантов в селективных условиях.
Рис. 1. Схема генетической конструкции для агробактериального переноса при создании
трансгенных растений.
LB, RB - левая и правая пограничные последовательности;
I маркерный ген; II - целевой ген; PI, P2 - промоторы; Tl, T2 - терминаторы.
Основными элементами генетических конструкций являются непосредственно сами целевые гены,
представляющие собой белок-кодирующие последовательности генов различного гетерологического
происхождения, а также их регуляторные элементы - промоторы (рис. 1). Экспрессия целевых генов в
геноме трансгенного растения позволяет достичь желаемой экспериментатором цели по изменению
тех или иных свойств растения.
В качестве регуляторных элементов в генетической инженерии растений в настоящее время
используются два вида промоторов: конститутивные
17
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
и тканеспецифичные. Конститутивные промоторы, среди которых наиболее широко применяется
промотор гена 35Б-белка вируса мозаики цветной капусты (Frank et al, 1980), активны во всех тканях
растения на протяжении всего жизненного цикла его развития. Активность тканеспецифичных
промоторов ограничивается функционированием генов в какой-либо определенной ткани растения.
Например, промоторы генов запасных белков, таких как глютелин риса (Zhao et ah, 1994), легумин-В4
бобовых (Ellis et al, 1988), напин капусты (Stalberg et al, 1993) и у-кафирин сорго (De Freitas et al., 1994)
ограничивают экспрессию трансгена в запасных тканях семян. Промотор гена
рибулозобифосфаткарбоксилазы (RuBisCo) используется для тка-неспецифичной экспрессии белков в
фотосинтезирующей ткани растения (Gittins et al, 2000).
Следует подчеркнуть, что поиск тканеспецифичных промоторов является крайне важным, так как при
наличии необходимых тканеспецифичных промоторов становится возможным экспрессировать те
или иные целевые гены в определенных тканях растения. Ярким примером может служить
активация гена-киллера, кодирующего синтез РНКазы барназы только в тканях тапетума у
трансгенных растений табака и рапса. Процесс формирования пыльцевых зерен у таких растений
замедляется, что приводит к мужской стерильности (Mariani et al., 1990). Несмотря на то что к
настоящему времени генетическая инженерия располагает достаточно широким набором
необходимых промоторов, поиск новых промоторов, а также регуляторных элементов интенсивно
продолжается.
Необходимыми элементами в составе генетических конструкций для экспрессии целевых генов в
тканях трансгенных растений являются селективные и репортерные гены (рис. 1). Среди селективных
генов наиболее широко при создании трансгенных растений применяется ген nptll, кодирующий
синтез фермента неомицинфосфотрансферазы-И, что обеспечивает растительным клеткам
устойчивость к антибиотикам канамицину и не-омицину.
Простота идентификации и возможность одновременного анализа большого числа транс формантов
позволяют использовать их не только в качестве маркеров для отбора трансформированных клеток в
условиях селективной среды, но и для исследования больших выборок трансгенных растений и
выявления случаев инактивирования трансгенов. Именно эти маркеры были использованы в первых
экспериментах по оценке стабильности экспрессии перенесенных генов в потомстве трансгенных
растений (Horsch et al, 1985; Potrycus et al, 1985; Budar et al., 1986; Deroles, Gardner, 1988; HeberleBors^tf/., 1988; Kilby etal, 1992).
Известен и ряд других селективных генов, среди которых можно назвать ген устойчивости к
антибиотику гигромицину hpt (Gritz, Davies, 1983), а также гены, обеспечивающие устойчивость к
ряду различных гербицидов (De Blok etal, 1987; Eichholtzetal, 1987).
Список литературы
www.diplomrus.ru ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок