013467 Область изобретения этанола как продукта бактериальной ферментации.

013467
Область изобретения
Данное изобретение относится к получению микроорганизмов, пригодных для продуцирования
этанола как продукта бактериальной ферментации.
Предшествующий уровень техники
Бактериальный метаболизм может осуществляться посредством ряда различных механизмов в зависимости от вида бактерий и условий окружающей среды. Гетеротрофные бактерии, которые включают
все патогены, получают энергию от окисления органических соединений, причем самыми распространенными окисляемыми соединениями являются углеводы (в частности, глюкоза), липиды и белок. Результатом биологического окисления этих органических соединений бактериями является синтез АТФ
как химического источника энергии. Этот процесс также дает возможность образования более простых
органических соединений (молекул-предшественников), которые требуются бактериальной клетке для
реакций биосинтеза. Общим процессом, посредством которого бактерии метаболизируют подходящие
субстраты, является гликолиз, который представляет собой последовательность реакций, превращающих
глюкозу в пируват с образованием АТФ. Судьба пирувата при генерировании метаболической энергии
варьирует в зависимости от микроорганизма и условий окружающей среды. Существует три основных
реакции пирувата.
Во-первых, в аэробных условиях многие микроорганизмы генерируют энергию, используя цикл
лимонной кислоты и превращение пирувата в ацетилкоэнзим А, катализируемое пируватдегидрогеназой
(PDH).
Во-вторых, в анаэробных условиях некоторые образующие этанол организмы могут осуществлять
спиртовую ферментацию путем декарбоксилирования пирувата до ацетальдегида, катализируемого пируватдекарбоксилазой (PDC), и последующего восстановления ацетальдегида до этанола посредством
НАДФ (никотинамиддинуклеотидфосфата), катализируемого алкогольдегидрогеназой (ADH).
Третьим процессом является превращение пирувата в лактат, которое происходит посредством катализа лактатдегидрогеназой (LDH).
Существует большой интерес в использовании микроорганизмов для продуцирования этанола, либо
с использованием микроорганизмов, которые претерпевают анаэробную ферментацию естественным
путем, либо посредством использования рекомбинантных микроорганизмов, которые включают гены,
вовлеченные в продуцирование этанола. Хотя достигнут некоторый успех в продуцировании этанола
путем использования этих микроорганизмов, ферментация часто подвергается риску за счет повышенной
концентрации этанола, в частности, когда микроорганизм обладает низким уровнем толерантности к этанолу.
Для продуцирования этанола предложены термофильные бактерии, и их применение обладает тем
преимуществом, что ферментацию можно проводить при повышенных температурах, которые дают возможность удаления продуцированного этанола в виде пара при температурах выше 50°С; это также позволяет проводить ферментацию с использованием высоких концентраций сахара. Однако поиск подходящих термофильных бактерий, которые могут эффективно продуцировать этанол, проблематичен.
В WO 01/49865 раскрыта грамположительная бактерия, которая трансформирована гетерологичным
геном, кодирующим пируватдекарбоксилазу, и которая обладает нативной функцией алкогольдегидрогеназы, для продуцирования этанола. Эта бактерия представляет собой термофильную Bacillus, и эта бактерия может быть модифицирована инактивацией гена лактатдегидрогеназы с использованием вставки
транспозона. Все бактерии, раскрытые в WO 01/49865, имеют происхождение от штамма Bacillus LLD-R,
штамма с дефицитом споруляции, который возник спонтанно из культуры и в котором ген Idh инактивирован спонтанной мутацией или химическим мутагенезом. Штаммы LN и TN раскрыты в качестве улучшенных производных штамма LLD-R. Однако все штаммы содержат рестрикционные системы типа Нае
III, что затрудняет плазмидную трансформацию и, следовательно, предотвращает трансформацию неметилированной ДНК.
В WO 01/85966 раскрыты микроорганизмы, которые получают путем метилирования in vivo, чтобы
преодолеть проблемы рестрикции. Это требует трансформации метилтрансферазы Нае III из Haemophilus
aegyptius в штаммы LLD-R, LN и TN. Однако штаммы LLD-R, LN и TN являются нестабильными мутантами и спонтанно ревертируют к продуцирующим лактат штаммам дикого типа, в частности, при низком
pH и при высоких концентрациях сахара. Результатом этого являются изменения продукта ферментации
с этанола на лактат, что делает эти штаммы непригодными для продуцирования этанола.
В WO 02/29030 раскрыто, что штамм LLD-R и его производные включают встречающийся в природе инсерционный элемент (IE) в кодирующей области гена Idh. Транспозиция этого элемента в ген Idh (и
из него) и последующая инактивация гена является нестабильной, приводя к реверсии. В качестве решения была предложена интеграция плазмидной ДНК в последовательность IE.
Таким образом, в уровне техники получение микроорганизмов для продуцирования этанола основано на модификации полученных в лаборатории, мутированных химическим путем микроорганизмов
Bacillus, их обработке in vivo с помощью методик метилирования и последующей модификации этих
микроорганизмов интеграцией плазмидной ДНК в последовательность IE. Эта процедура сложна, ненадежна, а также существуют инструкции, регулирующие использование этих штаммов.
-1-
013467
Таким образом, существует необходимость в усовершенствованных микроорганизмах для продуцирования этанола.
Краткое изложение сущности изобретения
Согласно первому аспекту настоящего изобретения способ получения термофильных микроорганизмов, пригодных для продуцирования этанола, включает:
(i) культивирование термофильного микроорганизма в аэробных или в анаэробных условиях в подходящей культуральной среде; и
(ii) включение возрастающих количеств этанола в культуральную среду для индукции толерантности к этанолу.
Описание изобретения
Настоящее изобретение основано на обработке термофильного микроорганизма для получения
микроорганизма, более толерантного к этанолу и, следовательно, обладающего лучшей способностью к
продуцированию этанола. Повышение толерантности микроорганизмов к этанолу дает возможность этим
микроорганизмам обладать большей устойчивостью к этанолу, продуцируемому в процессе их ферментации. Это позволяет улучшить ферментацию.
Способ получения термофильных микроорганизмов включает культивирование термофильных
микроорганизмов в аэробных или в анаэробных условиях в подходящей культуральной среде и включение в культуральную среду количеств этанола для индуцирования толерантности к этанолу. В одном воплощении повышение содержания этанола в культуральной среде осуществляют с течением времени и
обычно с приращениями, чтобы дать возможность микроорганизмам адаптироваться к повышенному
содержанию этанола в среде. Предпочтительно включать этанол вплоть до конечной концентрации
3% мас./об., а затем повышать концентрацию этанола на 0,5% мас./об. или менее до тех пор, пока концентрация этанола в среде не составит по меньшей мере 6% мас./об., более предпочтительно по меньшей
мере 7,5% мас./об. В одном воплощении исходная культуральная среда содержит 3% мас./об. этанола, а
затем его содержание повышают с приращениями по 0,5% до 6% мас./об., а затем с приращениями по
0,25% до 7,5% мас./об.
В течение этой процедуры можно проводить мониторинг плотности клеток, чтобы гарантировать,
что клеточный рост продолжается. Предпочтительно, если плотность клеток (определенная по ОП
600 нм) падает более чем на 25% и продолжает снижаться по мере возрастания концентрации этанола,
концентрации этанола позволяют снизиться до предшествующего самого высокого уровня, и культуру
ставят повторно, после чего продолжают обработку этанолом.
Альтернативный способ получения термофильных организмов с высокой толерантностью к этанолу
включает непрерывное культивирование термофильных микроорганизмов в аэробных или анаэробных
условиях в подходящей культуральной среде. Как только культура достигает стационарного состояния,
где рост организма достигает постоянной скорости (как определено по ОП 600 нм), к этой культуре добавляют количество этанола за одно добавление в целях доведения этанола до определенной желаемой
концентрации, например 10 или 20% мас./об. установленного рабочего объема культуры. Непрерывное
культивирование продолжают при низкой степени разбавления, предпочтительно 0,08-0,15 ч-1, что дает
возможность медленного снижения концентрации этанола до тех пор, пока не будет восстановлена исходная скорость роста термофильного микроорганизма (как определено по ОП 600 нм). В этот момент к
культуре за одно добавление добавляют второе количество этанола, такое же количество, как и первое,
снова в целях доведения этанола до определенной желаемой концентрации. Процесс возвращения культуры к исходной скорости роста повторяют и добавляют следующие партии этанола до тех пор, пока не
обнаруживают, что культура восстанавливается быстро, что принимают как минимум за 24 ч. В этот момент получают один из двух результатов. Либо проводят селекцию штаммов, толерантных к этанолу, из
этой культуры путем субкультивирования при желаемой концентрации этанола, предпочтительно выше
7,5% мас./об., либо к культуре добавляют большие количества этанола и повторяют процесс добавления
этанола с последующим восстановлением скорости роста.
Эти микроорганизмы можно выращивать в средах определенного состава при 55-65°С с субстратом, лимитированным углеродом, при pH от 6,0 до 7,5 (предпочтительно от 6,3 до 7,2) при степенях разбавления от 0,08 до 0,5.
В периодической культуре можно осуществлять процесс, подобный процессу, описанному выше,
при выращивании в любой подходящей среде с избытком углерода и этанола, добавляемых на ранней
логарифмической фазе роста. Затем клетки из исходной культуры можно использовать в конце логарифмической фазы роста для засева свежей колбы с приращением количества этанола, добавляемого снова в
ранней логарифмической фазе. Эту процедуру можно повторять с приращениями количества этанола,
добавляемого в культуральную среду в ранней логарифмической фазе.
Термофильные микроорганизмы для использования в настоящем изобретении могут быть модифицированы с прерыванием или усилением экспрессии генов, вовлеченных в релевантные биохимические
пути биосинтеза этанола, например, с прерыванием гена лактатдегидрогеназы. Это приводит в результате к переключению пути метаболизма пирувата от продуцирования лактата в направлении продуцирования этанола при повышенных уровнях этанола, наблюдаемых у отрицательных мутантов по лактату.
-2-
013467
Инактивация гена лактатдегидрогеназы способствует предотвращению расщепления пирувата до
лактата и, следовательно, стимулирует (в подходящих условиях) расщепление пирувата до этанола с использованием пируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы.
Микроорганизм дикого типа может представлять собой любой термофильный микроорганизм, но
предпочтительно, если этот микроорганизм принадлежит к Bacillus spp. В частности, предпочтительно,
если этот микроорганизм принадлежит к виду Geobacillus, в частности Geobacillus thermoglucosidasius.
Микроорганизмы могут представлять собой микроорганизмы "дикого типа", т.е. они не являются
мутантами, полученными в лаборатории. Эти микроорганизмы могут быть выделены из образцов окружающей среды, которые, как ожидают, содержат термофилы. Изолированные микроорганизмы дикого
типа обладают способностью к продуцированию этанола, но, если они не модифицированы, лактат, вероятно, является основным продуктом ферментации. Изоляты также отбирают на их способность к росту
на сахарах гексозах и/или пентозах при термофильных температурах. Можно также использовать микроорганизмы не дикого типа, т.е. мутантные.
Предпочтительно, чтобы микроорганизм по изобретению обладал некоторыми желательными характеристиками, которые дают возможность использования этого микроорганизма в процессе ферментации. Предпочтительно этот микроорганизм не должен иметь систему рестрикции, посредством чего избегают необходимости в метилировании in vivo. Кроме того, микроорганизм должен обладать способностью к утилизации С5 и С6 сахаров в качестве субстрата, включая целлобиозу и крахмал. Предпочтительно, если этот микроорганизм является трансформируемым при высокой частоте. Кроме того, этот микроорганизм должен иметь скорость роста в непрерывной культуре выше 0,3 ч-1.
Микроорганизм должен быть термофилом и должен расти в температурном диапазоне 40-85°С.
Предпочтительно этот микроорганизм должен расти в температурном диапазоне 50-70°С. Кроме того,
желательно, чтобы этот микроорганизм рос в условиях pH 6,5 или ниже, в частности pH 6,5-4,5.
Последовательность нуклеиновой кислоты для лактатдегидрогеназы в настоящее время известна.
Используя эту последовательность, специалист в данной области техники имеет возможность использовать ген лактатдегидрогеназы в качестве мишени для достижения инактивации этого гена посредством
различных механизмов. Предпочтительно, если ген лактатдегидрогеназы инактивируют либо путем инсерции транспозона, либо предпочтительно путем делеции последовательности этого гена или участка
последовательности этого гена. Делеция является предпочтительной, поскольку позволяет избежать
трудностей повторной активации последовательности гена, которая часто происходит при использовании транспозонной инактивации. В предпочтительном воплощении ген лактатдегидрогеназы инактивируют путем интеграции термочувствительной плазмиды (плазмиды pUB190-Idh), которая достигается
естественной гомологичной рекомбинацией или интеграцией между плазмидой и хромосомой микроорганизма. Хромосомные интегранты можно отобрать на основании их устойчивости к антибактериальному агенту (канамицину). Интеграция в ген лактатдегидрогеназы может происходить посредством события рекомбинации по типу одиночного кроссинговера или посредством события рекомбинации по типу
двойного (или более чем двойного) кроссинговера.
В предпочтительном воплощении микроорганизм содержит гетерологичный ген алкогольдегидрогеназы и гетерологичный ген пируватдекарбоксилазы. Результатом экспрессии этих гетерологичных генов является продуцирование ферментов, которые меняют направление метаболизма таким образом, что
этанол является основным продуктом ферментации. Эти гены могут быть получены из микроорганизмов,
которые типично претерпевают анаэробную ферментацию, включая виды Zymomonas, включающие Zymomonas mobilis.
Способы получения и включения этих генов в микроорганизмы известны, например, в Ingram et al.,
Biotech & BioEng, 1998; 58 (2+3): 204-214 и US 5916787, где содержание каждой публикации включено
здесь путем ссылки. Эти гены могут быть введены на плазмиде или интегрированы в хромосому, как
должно быть известно специалистам в данной области техники.
Микроорганизмы по изобретению можно культивировать в общепринятых условиях культивирования в зависимости от выбранного термофильного микроорганизма. Выбор субстратов, температуры, pH
и других условий роста можно произвести на основании известных требований к культивированию, например, см. WO 01/49865 и WO 01/85966. Подходящие условия культивирования и ферментации указаны
в табл. 1-3.
-3-
013467
Таблица 1
Таблица 2
Концентрированный раствор сульфатных микроэлементов
Таблица 3
Условия ферментера
Изобретение проиллюстрировано в приведенном ниже примере со ссылкой на сопровождающие
графические материалы.
Пример.
Готовили приведенные ниже среды
SAM2 - на 1 л
Суммарный объем в дистиллированной воде: 950 мл, доводят pH до 7,0 с помощью NaOH или
H2SO4. Автоклавируют.
После охлаждения добавляют 2,5 мл концентрированного раствора сульфатных микроэлементов
(см. табл. 2) вместе с 50 мл 20% мас./об. раствора сахара, стерилизованного фильтрованием.
-4-
013467
Модифицированная US (солями и мочевиной) среда (USM)
Для твердой среды добавляли 20,0 г/л бактоагара. Корректировали до pH 7 перед стерилизацией с
помощью 3 М NaOH.
Среда TGP
Для твердой среды добавляли 20,0 г/л бактоагара. Среду корректировали до pH 7 перед стерилизацией с помощью 3 М NaOH.
Толерантность к этанолу микроорганизма дикого типа (NCIMB 11955) тестировали с целью определения исходной точки. Организм выращивали в течение ночи (чашка с агаром LB, 60°С) и использовали колонию для инокуляции ночной культуры (100 мл USM, 1% глюкоза, 60°С, 250 об/мин). Затем эту
культуру использовали для инокуляции тройной серии колб, содержащих 0, 1, 2, 3 или 4% этанола, которые затем выращивали в течение 36 ч, после чего измеряли рост (50 мл USM, 1% глюкоза, 60°С,
250 об/мин). Результаты представлены на фиг. 1 и позволяют предположить, что NCIMB 11955 не переносит более 4% этанола.
Используя этот результат как основу для сравнения, проводили эксперименты по повышению толерантности к этанолу мутанта ТМ89 до 8% об./об. этанола.
Способ ферментации
Стратегия была приспособлена для:
1) достижения стационарного состояния и измерения выходов продукта/утилизации сахара; и
2) стимуляции культуры этанолом, возможности восстановления культуры (этанол вымывается с
течение времени), взятия образцов и приготовления концентрированных глицериновых растворов, повторения стадии (2) по необходимости.
В целях оценки толерантности к этанолу разработали приведенный ниже протокол.
1. Добавляют 5 мл бульона TGP в две стерильные универсальные пробирки.
2. Добавляют 100 мкл концентрированного глицеринового раствора ТМ-89 и ТМ89-1 в каждую
пробирку соответственно.
3. Культивируют в течение 5-6 ч (следовательно, клетки активны, поскольку они должны находиться в логарифмической фазе) при 60°С при перемешивании.
4. Измеряют ОП600 каждой культуры (чтобы знать исходное значение ОП600).
-5-
013467
5. Готовят 11 стерильных универсальных пробирок с конечным объемом 10 мл бульона TGP, содержащего 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10% (об./об.) концентрации этанола, в двух повторах для каждого
штамма ТМ-89 (т.е. 44 пробирки).
6. Инокулируют каждую пробирку 100 мкл клеток из соответствующих 5 мл бульонов TGP со стадий 1+2.
7. Культивируют в течение ночи при 60°С при перемешивании.
8. Отбирают 1 мл из каждой пробирки, разводят 1:5 и измеряют ОП600 против чистого контроля
Н2О.
Результаты анализировали, как описано ниже.
(1) Оптическую плотность культуры измеряли с использованием спектрофотометра Jencons [концентрацию клеток (г/л) вычисляли из А600×0,3].
(2) Концентрацию глюкозы измеряли, используя глюкометр крови (Roche).
(3) Концентрацию этанола измеряли путем использования аналитического набора на ферментативной основе (поставляемого фирмой R-Biopharm).
Результаты проиллюстрированы на фиг. 2. Штамм, выделенный в конце ферментации, проявлял последовательно более высокие значения ОП, чем исходный штамм ТМ89 в TGP и в TGP с серией концентраций этанола. Существовало значимое различие в росте при 5% этаноле, указывающее на улучшенную
толерантность к этанолу.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения термофильных микроорганизмов, пригодных для продуцирования этанола,
при котором:
(i) культивируют термофильный микроорганизм в аэробных или в анаэробных условиях в подходящей культуральной среде и
(ii) включают количества этанола в культуральную среду для индукции толерантности к этанолу,
где термофильный микроорганизм дикого типа модифицирован путем инактивации нативного гена
лактатдегидрогеназы и где нативный ген лактатдегидрогеназы или его участок делетирован.
2. Способ по п.1, при котором в культуральную среду добавляют возрастающее количество этанола
и микроорганизмам дают возможность адаптироваться к добавленному этанолу перед следующим приращенным добавлением этанола.
3. Способ по п.1 или 2, при котором этанол включают до конечной концентрации по меньшей мере
3% мас./об.
4. Способ по любому из пп.1-3, при котором этанол включают до конечной концентрации по меньшей мере 6% мас./об.
5. Способ по любому из пп.1-4, при котором этанол включают до конечной концентрации по меньшей мере 7,5% мас./об.
6. Способ по любому из пп.1-5, при котором этанол включают с приращениями 0,5% мас./об. или
менее.
7. Способ по любому из пп.1-6, при котором этанол включают в культуральную среду в ранней логарифмической фазе.
8. Способ по любому из пп.1-7, где микроорганизм не содержит рестрикционную систему.
9. Способ по любому из пп.1-8, где микроорганизм представляет собой Geobacillus thermoglucosidasius.
10. Способ по любому из пп.1-9, где микроорганизм содержит гетерологичный ген pdc.
11. Способ по любому из пп.1-10, где микроорганизм содержит гетерологичный ген adh.
12. Способ по любому из пп.1-11, где микроорганизм может метаболизировать целлобиозу и(или)
крахмал или их олигомеры.
13. Способ по любому из пп.1-12, где микроорганизм является трансформируемым при высокой
частоте.
14. Способ по любому из пп.1-13, где микроорганизм растет при температуре 40-85°С, предпочтительно 50-70°С.
-6-
013467
Фиг. 1
Фиг. 2
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
-7-