УДК 616.155.1:616.379-008.64:616.12-008.331.1 проницаемости эритроцитов у больных сахарным КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 616.155.1:616.379-008.64:616.12-008.331.1
С.В. Кремено*, О.В. Груздева*,
А.В. Ситожевский*, И.В. Петрова**
E-mail: [email protected]
УЧАСТИЕ БЕЛКОВ МЕМБРАННОГО
КАРКАСА ЭРИТРОЦИТОВ В РЕГУЛЯЦИИ
СА2+-АКТИВИРУЕМЫХ КАЛИЕВЫХ
КАНАЛОВ У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ
ДИАБЕТОМ 2-ГО ТИПА В СОЧЕТАНИИ
С АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ
* ГУ НИИ кардиологии Томского научного центра
СО РАМН;
** ГОУ ВПО Сибирский государственный
медицинский университет Росздрава, г. Томск
ВВЕДЕНИЕ
Сахарный диабет (СД) 2-го типа и артериальную
гипертензию (АГ) относят к заболеваниям, объединенным развитием состояния инсулинорезистентности, при которых сердечно-сосудистые нарушения являются основной причиной высокой инвалидизации и смертности [1]. В патогенезе сердечно-сосудистых осложнений этих заболеваний немаловажную роль играют нарушения ионной проницаемости
мембран, а также нарушения структуры и функции
эритроцитов [2, 3]. Кроме того, эритроциты периферической крови традиционно служат моделью для
оценки глубины повреждения мембран при патологическом процессе, протекающем в организме [4]. В
то же время нарушение структурно-функционального состояния мембраны эритроцитов может рассматриваться и как одно из звеньев патогенеза ряда
заболеваний, в частности сахарного диабета 2-го типа и артериальной гипертензии.
Известно, что белки мембранного каркаса эритроцитов участвуют в регуляции ряда ион-транспортных систем, таких, как Nа+/H+-обмен, Na+/K+/2Cl-котранспорт [5, 6, 7]. Усиление процессов гликозилирования белков мембранного каркаса эритроцитов, таких, как спектрин, анкирин, белок полосы 4.2
[3], а также повышение микровязкости мембран
эритроцитов при сахарном диабете может оказывать
влияние на функционирование ионтранспортных
систем клеток. Роль этого особого пути регуляции
определяется способностью эритроцитов изменять
объем при варьировании физико-химических показателей плазмы крови, деформироваться при движении по микрососудистому руслу, а также трансформироваться в патологически измененные формы.
Таким образом, целью настоящего исследования
явилась оценка роли белков мембранного каркаса
эритроцитов в регуляции Са2+-зависимой калиевой
24
проницаемости эритроцитов у больных сахарным
диабетом 2-го типа в сочетании с артериальной гипертензией.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В исследовании были использованы эритроциты
28 больных СД 2-го типа в сочетании с АГ, ожирением, дислипидемией и 29 здоровых доноров. Обследованные группы соответствовали по полу и возрасту.
Кровь забиралась из локтевой вены утром натощак в пробирки с гепарином (25 ед./мл крови). После
центрифугирования (1000g, 5 мин, 4°С) плазму и
клетки белой крови удаляли, а эритроциты дважды
промывали 3 частями изоосмотического раствора
NaCl (150 мМ), содержащего 5мМ Na-фосфатный
буфер (pH 7,4) и один раз 3 частями среды, содержащей 150 мМ NaCl, 1 мМ KCl, 1мM MgCl2, 10 мM
глюкозы. После этого упакованные эритроциты переносили на лед и хранили не более 6 часов.
В работе использовался метод регистрации мембранного потенциала эритроцитов по изменению
рН среды инкубации в присутствии протонофора
карбонилцианид-m-хлорфенилгидразона (СlССР)
[8], основанный на том, что в присутствии протонофора распределение протонов зависит от мембранного потенциала Em как Em=RT/F(pHi–pH0). Здесь
рНi и pH0 – значения рН цитоплазмы и среды инкубации соответственно. При низкой буферной емкости среды инкубации (в наших условиях она примерно в 100 раз меньше буферной емкости цитоплазмы) изменениями рНi можно пренебречь, а его
квазистационарный уровень определить при гемолизе клеток в присутствии детергента.
Эксперименты проводились по следующему плану. К 4,75 мл среды инкубации, содержащей 150 мМ
NaCl, 1 мМ KCl, 1мM MgCl 2 , 10 мM глюкозы и
10 мкМ кальция, добавляли 0,25 мл упакованных
эритроцитов (pH 7,4). Через 5 мин инкубации при
37°С и постоянном перемешивании добавляли протонофор СlССР до конечной концентрации 20 мкМ
и спустя 2 мин добавляли 0,5 мкМ Са2+-ионофора
А23187, что приводило к открыванию Са2+-активируемых калиевых каналов и выходу ионов калия
из клетки, что сопровождалось гиперполяризацией
мембраны эритроцитов.
Амплитуду гиперполяризационного ответа
эритроцитов (E) рассчитывали по формуле:
E=RT/F×(pH1–pH2), где рН1 – исходное значение
рН среды инкубации эритроцитов, рН2 – значение
рН среды инкубации клеток в момент гиперполяризации эритроцитов и использовали в качестве интегральной характеристики активности Са2+-зависимых калиевых каналов этих клеток [8].
Регистрацию рН проводили с помощью комбинированного рН-чувствительного электрода HI 1332
(HANNA Instruments) и рН-метра TYP N517
(Poland).
С.В. Кремено, О.В. Груздева и др.
Изменение объема эритроцитов, которое, как известно, сопровождается структурными перестройками белков мембранного каркаса этих клеток [8],
осуществляли посредством изменения осмолярности среды инкубации от 220 мосм (уменьшением концентрации NaCl в среде инкубации до 100 мМ) до
520 мосм (добавлением соответствующих концентраций сахарозы к изоосмотическому раствору).
Для выявления роли спектрина в регуляции Са2+активируемой калиевой проницаемости мембраны
эритроцитов использовали подход, связанный с термической денатурацией спектрина мембранного
каркаса эритроцитов [5]. Для выявления роли актина в регуляции Са2+-активируемой калиевой проницаемости мембраны эритроцитов суспензии клеток (гематокрит 20%) обрабатывали 10 мкМ цитохалазина D в течение 10 мин.
Показатели липидного обмена определяли с помощью специализированных тест-систем фирмы
Biocon, Германия.
Достоверность различий параметров сравниваемых групп оценивали по непараметрическим критериям. Корреляционный анализ проводили с вычислением коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Результаты представлены в виде «среднее ±
ошибка среднего».
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В настоящем исследовании было установлено,
что у больных СД 2-го типа в сочетании с АГ по
сравнению со здоровыми донорами происходило
снижение амплитуды гиперполяризационного ответа эритроцитов. Исследуемый параметр составил
у больных сахарным диабетом –33,62±1,13 (n=12)
и –38,04±0,96 мВ в контрольной группе (n=12,
p<0,01). Одной из причин обнаруженного снижения
калиевой проницаемости мембраны эритроцитов
больных СД 2-го типа в сочетании с АГ может быть
повреждение белков мембранного каркаса клеток.
Так, у больных СД 2-го типа происходит увеличение
степени гликозилирования белков мембранного
каркаса эритроцитов, таких, как спектрин, анкирин,
белок полосы 4.2 [3].
Нарушение мембранного каркаса эритроцитов
может проявляться в динамических условиях функционирования клеток – значительных изменениях
осмолярности среды инкубации клеток, приводящих к колебаниям объема эритроцитов.
Согласно литературным данным, изменение
объема эритроцитов, происходящее при варьировании осмолярности среды инкубации, с одной стороны, сопровождается структурными перестройками
белков мембранного каркаса [4], а с другой стороны, – включением механизмов перераспределения
ионов, ассоциированных с изменением активности
ионно-транспортных систем клеток (Na+/H+-обменника, Na+,K+,2Cl--котранспорта, K+,Cl--котранспорта) и приводящих к восстановлению объема [6, 7, 9].
РЕГУЛЯЦИЯ Са2+-АКТИВИРУЕМЫХ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ
Рис. 1. Зависимость амплитуды гиперполяризационного
ответа эритроцитов здоровых доноров и больных сахарным
диабетом 2-го типа в сочетании с артериальной гипертензией
от осмолярности среды инкубации. Параметры больных,
достоверно отличающиеся от контрольной группы: *p<0,01.
1) —●— здоровые доноры
2) —○— больные сахарным диабетом 2-го типа в сочетании
с артериальной гипертензией
Нами обнаружено, что увеличение объема
(220 мосм) и сжатие (520 мосм) клеток здоровых доноров приводило к снижению гиперполяризационного ответа эритроцитов по сравнению с изоосмотическими условиями (рис. 1). При этом у здоровых
доноров происходило снижение амплитуды гиперполяризационного ответа эритроцитов до –34,22±
1,13 мВ (n=12, p<0,01) при увеличении объема и до
–28,59±5,32 мВ (n=13, p<0,05, 520 мосм) при сжатии клеток. В эритроцитах больных достоверное
снижение параметра E до –27,25±4,01 мВ (n=12,
p<0,05) отмечалось только в гиперосмотической среде 520 мосм. При этом сжатие клеток нивелировало различия между параметрами гиперполяризационного ответа эритроцитов больных сахарным диабетом и здоровых доноров.
Известно, что выход ионов калия из клетки сопровождается потерей воды. В этом случае снижение Са2+-зависимой калиевой проницаемости мембраны эритроцитов у здоровых доноров, происходящее в гипоосмотических условиях, будет способствовать большему увеличению объема клеток и последующему лизису. При сжатии эритроцитов снижение Са2+-зависимой калиевой проницаемости, а,
следовательно, и выход воды можно рассматривать
как адаптивный механизм.
Таким образом, результаты экспериментов по
сжатию и растяжению эритроцитов позволяют предположить, что белки мембранного каркаса эритроцитов участвуют в регуляции Са2+-активируемой
калиевой проницаемости эритроцитов. У больных
сахарным диабетом 2-го типа в сочетании с АГ, вероятно, происходит нарушение этого пути регуляции.
Основным количественно преобладающим белком мембранного каркаса эритроцита является спектрин, содержание которого составляет 76%. Образуя с актином белковую сеть на цитоплазматической стороне мембраны, спектрин принимает участие
в поддержании интегративной целостности мембран
25
КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Рис. 2. Влияние термоденатурации белков мембранного
каркаса эритроцитов здоровых доноров (А) и больных
сахарным диабетом 2-го типа в сочетании с артериальной
гипертензией (Б) на амплитуду гиперполяризационного
ответа этих клеток. Параметры достоверно отличаются в
обеих выборках: *p<0,05
1) —▲— инкубация 37°С, 10 мин,
2) — ∆— инкубация 50°С, 10 мин
и обеспечении высокой деформируемости эритроцитов. При удалении спектрина из мембран клетки
теряют способность сохранять свою целостность
и распадаются на везикулы размером около 1 мкм.
Спектрин и актин являются актомиозиноподобными
сократительными белками. Они выполняют как цитоскелетную, так и цитокинетическую функции [10].
Показано, что инкубация эритроцитов при 50°С
в течение 10 мин приводит к термической денатурации спектрина, не затрагивая при этом другие белки мембранного каркаса эритроцитов [5]. Этот подход мы использовали для выяснения роли спектрина в объем-зависимой регуляции Са2+-активируемых К+-каналов.
В этой серии экспериментов (n=8) было показано, что температурная обработка эритроцитов больных и здоровых доноров (рис. 2) приводила к значительному снижению параметров гиперполяризационного ответа клеток, устраняя объм-зависимые
различия и различия между величиной гиперполяризационного ответа эритроцитов больных СД и
здоровых доноров.
Для выяснения роли актина в регуляции Са2+-активируемых калиевых каналов эритроцитов клетки
инкубировали в присутствии 10 мкМ цитохалазина
D, разобщающего взаимодействие актиновых филаментов [11]. Так, цитохалазин специфически связывается с растущими плюс-концами актиновых филаментов, блокируя присоединение к ним новых мономеров актина и, таким образом, нарушая «тредмиллинг» – процесс непреывного перемещения отдельных молекул актина от одного конца филамента к
другому [12].
В проведенной серии экспериментов (n=7) было
обнаружено, что цитохалазин D в изоосмотических
условиях не вызывал изменения активности Са2+-активируемых калиевых каналов эритроцитов у больных и у здоровых доноров (рис. 3). При увеличении
объема и сжатии клеток также не происходило выраженных изменений Са2+-активируемой калиевой
проницаемости эритроцитов.
На основании полученных данных можно предположить, что наиболее важную роль в регуляции
Са2+-зависимой калиевой проницаемости мембраны
эритроцитов как у больных СД 2-го типа в сочетании с АГ, так и у здоровых доноров, играет спектрин.
Отсутствие эффекта цитохалазина D на калиевую
проницаемость мембраны, возможно, связано с невысоким содержанием актина в мембранном каркасе
эритроцитов, в отличие от других клеток, например,
макрофагов, регуляторное изменение объема которых заметно подавляется цитохалазином [13].
Регуляторное влияние на Са2+-зависимые калиевые каналы эритроцитов спектрин может оказывать
как через белок-белковые взаимодействия, так и опосредованно через липидный матрикс клеток. Известно, что в эритроцитах больных СД 2-го типа происходят изменения и в составе липидного бислоя мембраны: отмечается повышение содержания холестерола, сфингомиелина и снижение содержания фосфатидилсерина [14, 15], что может приводить к нарушению белок-липидных взаимодействий.
Известно, что в мембране эритроцитов не происходит синтеза липидов de novo, однако эффективно
Рис. 3. Влияние цитохалазина D на амплитуду гиперполяризационного ответа эритроцитов здоровых доноров (А) и больных
сахарным диабетом 2-го типа в сочетании с артериальной гипертензией (Б).
– инкубация 37°С,
26
– инкубация 37°С в присутствии цитохалазина D
С.В. Кремено, О.В. Груздева и др.
работают механизмы их обновления и обмена в результате взаимодействия с липопротеинами плазмы
[16]. Существует предположение, что изменения
липидного состава мембран эритроцитов могут отражать общие нарушения липидного обмена в организме [14].
У обследованных нами пациентов наблюдалась
дислипидемия, проявляющаяся повышением общего холестерола, холестерола липопротеинов низкой
плотности (ХС ЛПНП), триацилглицеролов, снижением холестерола липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП) и соответствующим повышением
индекса атерогенности (ХС ЛПНП/ ХС ЛПВП).
Нами обнаружены отрицательные корреляционные зависимости между амплитудой мембранного
потенциала эритроцитов больных СД 2-го типа в
сочетании с АГ и содержанием общего холестерола
плазмы крови (n=20, -0,42, р=0,04), ХС ЛПНП (n=20,
-0,56, р=0,0038) и индексом атерогенности (n=20,
-0,56, р=0,0042), а также прямая зависимость с содержанием ХС ЛПВП плазмы крови (n=20, 0,38,
р=0,05). Возможно, нарушения липидного обмена
могут оказывать опосредованное влияние на активность Са2+-активируемых калиевых каналов эритроцитов больных СД 2-го типа вследствие изменения липидного состава мембраны.
Таким образом, установлено, что у больных СД
2-го типа в сочетании с АГ отмечается снижение калиевой проницаемости мембраны эритроцитов, одной из причин изменения которой может быть повреждение спектрина, основного белка мембранного
каркаса этих клеток, либо нарушение белок-липидных взаимодействий, обусловливающих взаимосвязь
белков мембранного каркаса, липидного матрикса и
канала.
ЛИТЕРАТУРА
1. Neri S., Bruno C.M., Leotta C. et al. Early endothelial
alterations in non-insulin-dependent diabetes mellitus //
Int J Clin Lab Res. – 1998. – V. 28. – P. 100–103.
2. McMillan D.E., Utterback N.G., Puma J. La Reduced
erythrocyte deformability in diabetes // Diabetes. – 1978.
– Vol. 27. – P. 895.
3. Schwartz R.S., Madsen J.W., Rybicki A.C., Nagel R.L.
Oxidation of spectrin and deformability defects in diabetic
erythrocytes // Diabetes. – 1991. – Vol. 40, № 6. – P. 701–708.
4. Черницкий Е.А., Воробей А.В. Структура и функции
эритроцитарных мембран.– Минск, 1981. – 260 с.
5. Shnyrov V.L., Orlov S.N., Zhadan G.G., Pokudin N.I.
Thermal inactivation of membrane proteine, volume dependent Na+, K+, 2Cl--cotransport and protein kinase C
activator – induced changes of the shape of human and rat
enterocytes // Biomed. biochim. acta. – 1990. – V. 49. –
P. 445-453.
6. Орлов С.Н., Покудин Н.И., Ряжский Г.Г. и др. О механизме регуляции транспорта ионов через плазматическую мембрану при изменении обьема клетки // Биол.
мембраны. – 1988. – Т. 5. – С. 1030-1041.
7. Орлов С.Н., Покудин Н.И., Ряжский Г.Г. и др. Валиномицин индуцирует Na+/H+- обмен в эритроцитах
крысы: влияние активаторов протеинкиназ А и С. //
Биол. мембраны. – 1987. – Т. 4. – С. 1036-1046.
РЕГУЛЯЦИЯ Са2+-АКТИВИРУЕМЫХ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ
8. Орлов С.Н., Петрова И.В., Покудин Н.И. и др. Са2+активируемые калиевые каналы эритроцитов, исследованные методом регистрации Са2+-индуцированных
изменений мембранного потенциала // Биологические
мембраны. – 1992. – Т. 9. № 8. – С. 885-903.
9. Brugnara C., Tosteson D.C. Cell volume, K transport, and
cell density in human erythrocytes // Am.J.Physiol. – 1987252 (Cell Physiol. 21). – Р. 269-276.
10. Сторожок С.А., Санников А.Г., Захаров Ю.М. Молекулярная структура мембран эритроцитов и их механические свойства. – Тюмень, 1997. – 140 с.
11. Goddette D.W., Frieden C. Actin polymerization. The
mechanism of action of cytochalasin D // J. Biol. Chem. –
1986. – Vol. 261. – P. 15974-15980.
12. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Д. и др. Молекулярная
биология клетки: В 3 томах. Т. 2. М.: Мир, 1993. –
С. 254-337.
13. Галкин А.А. Регуляторное уменьшение объема макрофагов в гипоосмотической среде, обусловленное активацией фуросемидчувствительной системы ионного
транспорта / А.А. Галкин, Б.И. Ходоров // Внутриклеточная сигнализация. – М.: Наука, 1988. – С. 166-171.
14. Максимов О.В., Солун М.Н. Особенности липидного
состава эритроцитарных мембран у больных сахарным
диабетом // Пробл. эндокринол. – 1989. – Т. 35, № 2. –
С. 14-18.
15. Martinez M., Vaya A., Server R. Alterations in erythrocyte
aggregability in diabetics: the influence of plasmatic
fibrinogen and phospholipids of the red blood cell membrane // Clin Hemorheol Microcirc. – 1998. – Vol. 18, № 4.
– P. 253-258.
16. Lange Y., Molinaro A.L., Chauncey T.R., Steck T.L. On
the mechanism of transfer of cholesterol between human
erythrocytes and plasma // J. Biol. Chem. – 1983. – Vol. 258,
№ 6. – P. 6920-6926.
PARTICIPATION OF MEMBRANE TYPE
PROTEINS IN THE REGULATION
OF CA2+-ACTIVATED SODIUM CHANNELS
IN PATIENTS WITH THE 2-ND TYPE
DIABETES MELLITUS COMBINED WITH
ARTERIAL HYPERTENSION
S.V. Kremeno, O.V. Grouzdeva, A.V. Sitozhevski,
I.V. Petrova
SUMMARY
The given work results established that patients with
the diabetes mellitus of the 2-nd type combined with
arterial hypertension have decreased Са2+-dependent
sodium membrane permeability of erythrocytes.
Key words: erythrocytes, Ca2+-activated potassium
channels, spectrin, dyslipidaemia, diabetes mellitus of
the 2-nd type, arterial hypertension.
27