Синтез гомо- и гетеродендримеров на основе а

На правах рукописи
БАЯНОВА НАДЕЖДА ВИТАЛЬЕВНА
СИНТЕЗ ГОМО- И ГЕТЕРОДЕНДРИМЕРОВ НА ОСНОВЕ αАМИНОКИСЛОТ
Специальность
02.00.06 – высокомолекулярные соединения
А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Санкт-Петербург 2007
www.sp-department.ru
2
Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте высокомолекулярных соединений Российской академии наук
Научный руководитель:
доктор химических наук,
профессор
Г.П. Власов
Официальные оппоненты:
доктор химических наук,
старший научный сотрудник
М.В. Соловский
кандидат химических наук,
старший научный сотрудник
Н.И. Колодкин
Ведущая организация:
Санкт-Петербургский государственный
университет, химический факультет,
кафедра высокомолекулярных
соединений
Защита состоится « 22 » февраля 2007 года в 10 часов
на заседании Диссертационного совета Д 002.229.01 в Институте высокомолекулярных соединений Российской академии наук по адресу:
199004, Санкт-Петербург, В.О., Большой пр., 31, конференц-зал.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института высокомолекулярных соединений РАН.
Автореферат разослан «_____» января 2007 года.
Ученый секретарь
Диссертационного совета
__________________
www.sp-department.ru
к.ф.-м.н. Н.А. Долотова
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
темы.
Водорастворимые поликатионные системы
привлекают все возрастающее внимание исследователей, что обусловлено
перспективами их использования в качестве полимеров-носителей
биологически активных веществ (БАВ), таких как противовирусных,
противобактериальных и противораковых препаратов, а также при целевом
транспорте генетического материала в новых биомедицинских технологиях,
связанных с генной терапией. Основной задачей генной терапии является поиск
оптимальных носителей для целевого транспорта ДНК в клетки определенного
вида. Ограничения, связанные с применением вирусных носителей как
транспортных средств для доставки ДНК, такие как сильный иммунный ответ
при многократном применении или токсический эффект, вызванный
продуктами их распада, явились главной причиной активного поиска новых
систем доставки ДНК с использованием синтетических носителей: так
называемый невирусный способ доставки. К настоящему времени выявлены
наиболее перспективные в этом плане поликатионные носители, такие как
катионные
липосомы,
разветвленные
полиэтиленимины
или
сверхразветвленные полиамидоаминные (ПАМАМ) молекулы - дендримеры.
Носители на их основе более всего отвечают требованиям, предъявляемым к
носителям ДНК, они компактизуют ее, обеспечивают эффективную защиту от
расщепления нуклеазами крови, способствуют эффективному выходу
комплексов ДНК из эндосом. Вместе с тем был отмечен токсический эффект,
проявляемый данными носителями. В связи с этим представляется
перспективным синтез и исследование дендримеров на основе природной αаминокислоты - лизина. Данные макромолекулы, имея все преимущества выше
отмеченных носителей, являются действительно биосовместимыми и
биодеградируемыми. Несмотря на большое количество публикаций по синтезу
и применению дендримерных макромолекул для целевого транспорта БАВ,
число работ по изучению закономерностей их синтеза, физико-химических
свойств и особенностей их строения весьма невелико. Актуальной остается
проблема получения монодисперсных дендримерных макромолекул с высоким
числом генераций и/или сложным химическим строением. Известно, что при
создании каждой последующей генерации дендримера возрастают трудности
достижения полной конверсии функциональных групп, что, в свою очередь,
усложняет получение дендримеров без дефектов в структуре. В связи с
вышесказанным разработка методов синтеза гомо- и гетеродендримеров на
основе L-лизина, изучение их структурной организации и физико-химических
свойств,
а
также
исследование
особенностей
формирования
интерполиэлектролитных комплексов (ИПЭК) с участием дендримеров
является актуальной задачей.
Актуальность
Цель работы состояла в разработке оптимальных методов синтеза новых
монодисперсных регулярных дендримерных макромолекул на основе L-лизина
различных генераций с использованием твердофазного метода, в изучении
www.sp-department.ru
4
влияния структуры дендримеров на ход их синтеза, исследовании структуры и
свойств дендримеров, а также их комплексов с ДНК или синтетическим
полианионом – полиметакриловой кислотой (ПМАК), с использованием
различных методов.
Научная новизна. Впервые с использованием полимерных носителей
получен ряд монодисперсных водорастворимых гомолизиновых дендримеров
различных
генераций;
впервые
осуществлен
синтез
регулярных
гетеролизиновых дендримеров, в структуру которых между точками
«ветвления» - остатками диацилированных лизинов - введены фрагменты
различных аминокислот: гистидина, глутаминовой кислоты, аланина и
дипептида глицил-глицина, несущие дополнительные боковые группы;
определены условия синтеза данных дендримеров на твердой фазе, что
позволило установить влияние структуры синтезируемого соединения на ход
синтеза; показана применимость таких методов анализа как массспектрометрия, спектроскопия ЯМР и КД для исследования структурных и
физико-химических характеристик лизиновых дендримеров; впервые применен
динамический метод поляризованной люминесценции (ПЛ) для изучения
структурно-динамических характеристик синтезированных дендримеров, для
этого впервые синтезированы люминесцентно меченые дендримеры, имеющие
ковалентно связанную люминесцирующую метку (ЛМ) на внешнем или
внутреннем слое дендримерной макромолекулы. Применение метода ПЛ
позволило впервые изучить влияние номера генерации и химического строения
дендримера на его способность к формированию супрамолекулярных структур
в растворе – образование ассоциатов, особенности формирования
интерполимерных комплексов и комплексов с низкомолекулярными
соединениями в качестве моделей широкого круга БАВ. Впервые исследовано
влияние химического строения дендримеров на свойства их комплексов с ДНК.
Практическая ценность. Методом твердофазного синтеза пептидов
получен ряд гомо– и гетеродендримеров на основе природных α-аминокислот
различных генераций. Показана перспективность их использования в качестве
носителей генетического материала в клетку. Определены пути оптимизации
свойств дендримеров с целью повышения трансфекционной активности
комплексов дендример/ДНК. Использование техники твердофазного синтеза
потенциально позволяет автоматизировать и масштабировать процесс синтеза
данного класса макромолекул.
Основные положения, выносимые на защиту:
• усовершенствованный метод синтеза дендримеров различных генераций и
различного химического строения на основе L-лизина на твердой фазе;
• результаты по исследованию влияния номера генерации гомодендримеров и
химического строения развязки в гетеродендримерах на ход синтеза,
особенности структурной организации дендримеров и их физико-химические
свойства;
• метод модификации дендримеров ЛМ по внешним и внутренним слоям;
www.sp-department.ru
5
• исследование структурно-динамических характеристик дендримеров и
механизмов формирования супрамолекулярных систем с участием дендримеров
в растворе;
• взаимодействие дендримеров с молекулами ДНК.
подтверждается строгим контролем
синтеза дендримеров, использованием разнообразных современных методов
анализа структуры макромолекул и воспроизводимостью полученных данных.
Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались
th
на 9 Annual meeting of ESGT (Turkey, Antalya, 2001), 27th European Peptide
Symposium (Sorento, Italy, 2002), 7th World Conference on Biodegradable Polymer
and Plastics (Pisa, Italia, 2002), 4th International Symposium "Molecular order and
Mobility in Polymer Systems" (St. Peterburg, 2002), Х Всероссийской
конференции “Структура и динамика молекулярных систем” (Казань, Москва
2003), 10th Gemany-Russian Peptide Symposium (Gemany, Fridrichroda, 2003), III
Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), 1 Российском симпозиуме по
химии и биологии пептидов (Москва, 2004), а также неоднократно на конкурсе
молодых ученых ИВС РАН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, 14
тезисов докладов на международных и всероссийских симпозиумах и
конференциях.
Личный вклад автора состоял в участии в постановке задач
исследования, в разработке методов синтеза, очистке дендримеров, в изучении
их свойств с использованием ряда физических методов, в анализе и обсуждении
результатов.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, литературного
обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка
цитируемой литературы, списка сокращений и приложения. Работа изложена на
185 страницах, содержит 15 таблиц и 65 рисунков и библиографию из 167
источников.
Работа выполнена как часть исследований, проводимых в ИВС РАН по
темам: «Гидрофильные синтетические и природные полимерные биологически
активные соединения и материалы на их основе» и «Биологически активные
полимерные системы. Синтез, структура, свойства».
Достоверность
результатов
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во ВВЕДЕНИИ обоснован выбор темы исследования и ее актуальность,
сформулированы цели работы и основные положения, выносимые на защиту.
Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР содержит сведения по методам синтеза, изучению
структурной организации и свойств дендримеров и их применению в качестве
носителей БАВ.
www.sp-department.ru
6
Глава 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. СИНТЕЗ ПОЛИЛИЗИНОВЫХ ГОМО– И ГЕТЕРОДЕНДРИМЕРОВ НА ПОЛИМЕРНОМ
НОСИТЕЛЕ
Синтез монодисперсных дендримеров проводили дивергентным методом,
что позволило осуществить четкий пошаговый контроль конверсии
реагирующих групп и провести модификацию дендримерной структуры как
введением дополнительных аминокислот между точками «ветвления»
(гетеролизиновые дендримеры), так и ЛМ по внутренним слоям или по
концевым аминогруппам (ЛМ дендримеры). В частности, были получены два
гомологических ряда дендримеров на основе L-лизина: 1 ряд –
гомодендримеры на основе лизина (К) (рис. 1, структура слева) с первой по
шестую генерации (табл. 1). На С-конец дендримеров (Y) данного ряда был
введен остаток аланина (Ala) для того, чтобы можно было с помощью
аминокислотного анализа синтезируемых дендримеров достаточно четко
контролировать их структуру; 2-ой ряд – гетеродендримеры на основе лизина
пятой генерации (рис. 1, структура справа), (табл. 2), содержащие между
точками «ветвления» - лизиновыми фрагментами (К) - остатки гистидина (H),
глутаминовой кислоты (E), аланина (A), дипептида глицил-глицина (GG):
H2N
H2N
O
OH
Lys (K)
H2N
O
OH
O
OH
Glu (E)
H2N
H2N
N
O
OH
Ala (A)
HN
O
O
OH H2N HN
OH
O
His (H)
Gly-Gly (GG) .
На С-конец данных макромолекул дополнительно был введен фрагмент Nεхлорацетиллизина (Lys(ClAc)) с целью его последующего использования для
конденсации с пептидами, «нацеленными» на клеточные рецепторы, что
должно было бы обеспечить целевую доставку комплекса дендример/ДНК.
Y
Y
Рис. 1. Схематичное представление гомолизинового дендримера пятой генерации
(слева) и гетеролизинового дендримера пятой генерации (справа), где
- лизин,
аланин, глутаминовая кислота, гистидин или диглицил, Y- аминокислоты (аланин или Nε –
хлорацетиллизин) или олигопептиды, находящиеся на карбоксильном конце дендримера.
www.sp-department.ru
7
Таблица 1
Сокращенные обозначения и структурные формулы полилизиновых
гомодендримеров 1-го ряда
Обозн Структурная формула
Г NLys
NН2
Мтеор
D1
(NH2)4(Lys)2Lys-Ala-NH2
1
3
4
473
D2
(NH2)8(Lys)4(Lys)2Lys-Ala-NH2
2
7
8
985
D3
(NH2)16(Lys)8(Lys)4(Lys)2Lys-Ala-NH2
3
15
16
2011
D4
(NH2)32(Lys)16(Lys)8(Lys)4(Lys)2Lys-Ala-NH2
4
31
32
4061
D5
(NH2)64(Lys)32(Lys)16(Lys)8(Lys)4(Lys)2Lys-Ala5
NH2
63
64
8162
D6
(NH2)128(Lys)64(Lys)32(Lys)16(Lys)8(Lys)4(Lys)2
Lys-Ala-NH2
6 127
128
16364
Таблица 2
Сокращенные обозначения и структурные формулы полилизиновых
гетеродендримеров 2-го ряда
Обозн
Структурная формула
Г
NLys
NН2
Мтеор
D5H
(NH2)64(Lys-His)32(Lys-His)16(Lys-His)8(LysHis)4(Lys-His)2Lys-Ala-Ala-Lys(ClAc)-AlaNH2
5
64
64
17004
D5E
(NH2)64(Lys-Glu)32(Lys-Glu)16(LysGlu)8(Lys-Glu)4(Lys-Glu)2Lys-Ala-AlaLys(ClAc)-Ala-NH2
5
64
64
16506
D5A
(NH2)64(Lys-Ala)32(Lys-Ala)16(LysAla)8(Lys-Ala)4(Lys-Ala)2Lys-AlaLys(ClAc)-Ala-Ala-NH2
5
64
64
12962
D5GG
(NH2)64(Lys-Gly-Gly)32(Lys-Gly-Gly)16(LysGly-Gly)8(Lys-Gly-Gly)4(Lys-Gly-Gly)2LysGly-Gly-Lys(ClAc)-Ala-Ala-NH2
5
64
64
15626
Г – генерация, NLys – число лизиновых остатков, NН2 – число терминальных аминогрупп,
Мтеор – расчетная молекулярная масса.
Синтез дендримеров проводился на бензгидриламинном полимерном
носителе с применением BОС/Bzl – стратегии и DIC/HOBt-смеси на стадии
ацилирования, используя в качестве карбоксильного компонента Nα,Nε-ди(трет-бутилоксикарбонил)-лизин. Избыток реагента, вводимого в реакцию, в
общем случае составлял 3-4 эквивалента на одну аминогруппу в расчете на
исходную емкость полимерного носителя. Полноту реакции ацилирования
контролировали по наличию свободных аминогрупп с помощью теста Кайзера
(нингидриновый тест). Защитную BОС-группу в ходе синтеза удаляли
www.sp-department.ru
8
действием трифторуксусной кислоты (ТФУК). Конечной стадией синтеза было
отщепление целевой молекулы дендримера от полимерного носителя с
одновременным полным снятием защитных групп при действии системы
трифторметансульфокислота/трифторуксусная кислота (ТФМСК/ТФУК) в
присутствие скавенжеров.
Выделение и очистку целевых молекул осуществляли с помощью
хроматографических методов, а доказательство структуры дендримеров
проводили с помощью аминокислотного анализа, MALDI TOF массспектрометрии и метода 1H ЯМР спектроскопии.
В ходе ситеза было изучено влияние химической структуры получаемых
дендримеров на ход их синтеза на полимерном носителе (рис. 2). Так, в ходе
синтеза гомодендримеров на стадии создания пятой генерации для достижения
полной конверсии аминогрупп время ацилирования приходилось увеличивать
до 20 часов против обычного 10-часового. При синтезе дендримера,
содержащего остатки глутаминовой кислоты, принципиальных сложностей не
наблюдалось. При синтезе гетеродендримеров, в структуру которых вводились
остатки аланина или диглицина, при создании четвертой и пятой генераций
потребовалось увеличение времени ацилирования до 50 ч. В случае
дендримера, содержащего гистидин, на стадии создания четвертой генерации –
присоединения лизина – потребовалось увеличить время ацилирования до 60 ч,
а в случае формирования пятой генерации присоединение лизина практически
не проходило даже после добавления в реакционную смесь в качестве
катализатора 4-N,N-диметиламинопиридина. Это свидетельствовало о
возникновении дефектов в структуре, что и было подтверждено методом
MALDI TOF масс-спектрометрии (табл. 3).
G lu-Lys
H is-Lys
Lys
G ly-G ly-Lys
Ala-Lys
t, ч 120
100
80
60
40
20
0
1
2
3
4
5
N
Рис. 2. Сравнительный анализ синтеза полилизиновых гомо– и гетеродендримеров 5-ой
генерации на полимерном носителе на примере формирования слоев из остатков лизина, где
τ – суммарное время ацилирования, N – номер генерации.
Таким образом, в ходе работы была показана принципиальная
возможность контролируемого синтеза на твердой фазе монодисперсных
дендримерных макромолекул высоких генераций гомогенного состава и
макромолекул регулируемого гетерогенного состава и было изучено влияние
химического строения дендримеров на ход их синтеза на твердой фазе.
www.sp-department.ru
9
2. ГИДРОДИНАМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДЕНДРИМЕРОВ НА ОСНОВЕ ЛИЗИНА
Из литературных данных известно, что наиболее чувствительными к
изменению ММ дендримера являются седиментационно–диффузионные
методы анализа, а не характеристическая вязкость. Полученные гомо- и
гетеродендримеры на основе лизина были исследованы методами
молекулярной
гидродинамики
(табл.
3).
В
качестве
основных
гидродинамических
характеристик
были определены
коэффициенты
поступательной диффузии (D0) и скоростной седиментации (s0). По уравнению
Сведберга был произведен расчет молекулярных масс синтезированных
дендримеров. Сопоставление гидродинамических характеристик (s0 и D0) с
молекулярной массой позволило оценить скейлинговые индексы для
гомодендримеров D3, D4 и D5. Было найдено, что s0~M(0,6±0,1), а D0~М(0,38±0,06).
Подобные скейлинговые индексы свидетельствуют о высокой симметрии этого
ряда макромолекул и близки к значениям, получаемым для сферических
гомологов и глобулярных протеинов, а также для дендримеров иного, не
аминокислотного, химического строения. Полученные оценки плотности в
несколько раз превышают величину, характерную для линейных макромолекул,
и близки к оценкам плотности, полученным для глобулярных белков.
Таблица 3
Коэффициенты поступательной диффузии (D0) и скоростной седиментации (s0),
молекулярные массы (Mtheor, MsD) дендримеров на основе лизина
Mtheor,
г·моль-1
M*эксп,
г·моль-1
D0107,
cм2/c
s0·1013,
с
MsD·10-3,
г·моль-1
Rh 108,
см
ρ,
г·см-3
D1
473
-
28.2
-
-
7.3
-
D3
2011
2011
15.6
0.65
2.7
13.4
0.49
D4
4061
4062
11.2
0.8
5.0
18.7
0.31
D5
8162
8163
8.4
1.55
13.0
24.9
0.34
D5E
16506
15226
7.1
2.45
24.5
29.5
0.38
D5H
17004
11540**
6.3
1.35
15.2
33.2
0.17
D5А
12962
12915
6.5
1.7
18
32.2
0.22
D5GG
15626
15166
7.3
1.7
16
28.7
0.28
Дендример
* MALDI TOF масс-спектрометрия, ** мольное отношение Ala:His:Lys по данным
аминокислотного анализа 3:62:64 (рассчитано) и 3:52:32 (найдено).
Используя соотношение Стокса (Rh=kT/6πη0D0), была произведена оценка
гидродинамических радиусов изученных генераций дендримеров (табл. 3). Как
и для дендримеров, построенных на основе симметричных ветвящих единиц,
для дендримеров, построенных на основе несимметричного лизина,
наблюдается линейная зависимость роста гидродинамического радиуса от
номера генерации.
www.sp-department.ru
10
3. ИССЛЕДОВАНИЕ ГОМОЛИЗИНОВЫХ ДЕНДРИМЕРОВ РАЗЛИЧНЫХ ГЕНЕРАЦИЙ
МЕТОДОМ ЯМР СПЕКТРОСКОПИИ
Для исследования структуры полученных дендримеров был применен
метод 1Н ЯМР спектроскопии. Детальный анализ полученных спектров
позволил строго отнести все сигналы к соответствующим атомам. По
химическим сдвигам удалось различить атомы, находящиеся на наружной или
во внутренней сферах дендримера. Кроме этого, для терминальных атомов
удалось различить, с какой аминогруппой - α или ε - они связаны. На основе
сравнения значений интегралов сигналов протонов, соответствующих атомам
внутренних и внешних остатков лизина, была подтверждена структура
исследованных дендримеров.
При сравнительном анализе спектров ПМР лизиновых дендримеров с 2
по 6 генерацию было обнаружено значительное изменение положения сигналов
протонов внешних метиновых групп лизина при переходе от генерации к
генерации, в то время как положения сигналов остальных протонов
практически не меняются (рис. 3). Изменение положения сигналов протонов
внешних метиновых групп лизина для D3, D4, D5, D6, при переходе от одной
генерации к другой, свидетельствует об изменении химического окружения
соответствующего атома, которое вызвано структурными изменениями, а
именно, вынужденным сближением NH3+ групп, что, в свою очередь, приводит
к смещению равновесия:
R
CH NH3
R'
R
CH NH2 + H
R'
внутр
4,2
4,0
α
ε
R-CH-CO-N Η -R
R-CH-CO-N Η -R
3,8
ρ отн. ед.
δ м.д.
в сторону образования свободной аминогруппы. При этом наибольший сдвиг в
сильные поля наблюдается для D2 и D6, что свидетельствует о более сильном
эффекте, вызванном сближением аминогрупп.
1,2
1,1
1,0
3,6
0,9
внеш
0,8
3,4
0,7
3,2
2
3
4
5
6
2
генерация
3
4
5
6
генерация
Рис. 3. Зависимость значений химических Рис. 4. Зависимость локальной
сдвигов (δ) внутренних и внешних протонов плотности внешнего слоя лизинового
метиновых групп лизина от номера генерации дендримера от номера генерации,
дендримера.
где ρ - плотность.
www.sp-department.ru
11
В случае D2, который условно относится к дендримерам и является
низкомолекулярным соединением, близость аминогрупп задана геометрией
молекулы и аминогруппы не могут удалиться друг от друга, в то время как для
D6 данный эффект обусловлен повышением плотности упаковки лизиновых
звеньев во внешнем слое макромолекулы по сравнению с D3, D4 и D5.
Для выявления закономерностей распределения локальной плотности
звеньев лизина в единице поверхности дендримерной молекулы (ρ) в
зависимости от номера генерации был произведен расчет величины ρ для
дендримеров со второй по шестую генерации на основе экспериментально
полученных гидродинамических радиусов (рис. 4) по уравнению: ρ = NNH2 /
4πR2, где NNH2 – число аминогрупп на внешнем слое, 4πR2 – площадь сферы.
Сравнение зависимостей, представленных на рис. 3 и рис. 4, показывает,
что изменение положения химических сдвигов терминальных метиновых
протонов хорошо коррелирует с изменением теоретически расчитанной
локальной плотности структурных звеньев на поверхности дендримера, а
именно, в обоих случаях плотность проходит через минимум на четвертой
генерации, а максимальные значения плотности наблюдаются для дендримера
2-ой и 6-ой генераций.
Таким образом, в ходе исследования выявлена закономерность
распределения локальной плотности звеньев лизина на внешнем слое
дендримерной макромолекулы в зависимости от номера генерации.
4. СИНТЕЗ ЛЮМИНЕСЦЕНТНО МЕЧЕНЫХ ГОМО– И ГЕТЕРОДЕНДРИМЕРОВ НА
ОСНОВЕ ЛИЗИНА
Для изучения таких сложных полимерных систем, как дендримеры,
наиболее информативными являются методы, основанные на «меточном»
подходе. Действительно, поочередное присоединение метки к тому или иному
фрагменту сложной полимерной системы дает возможность получать
информацию о структуре и свойствах выделенного меткой структурного
фрагмента.
К
числу
высокочувствительных
методов
относятся
люминесцентные методы, в частности, метод поляризованной люминесценции
(ПЛ), позволяющий изучать наносекундную динамику макромолекул в
растворе. Кроме того, наносекундная подвижность полимерных цепей
макромолекул очень чувствительна к любым изменениям межмолекулярных
взаимодействий и к вращательной подвижности полимерного образования как
целого, и, соответственно, может служить индикатором образования
супрамолекулярных систем в растворе с участием дендримеров. C целью
изучения
структурно-динамических
и
функциональных
свойств
синтезированных дендримеров с помощью метода ПЛ получены дендримеры с
антраценовыми метками, присоединенными к звеньям внешних или
внутренних слоев дендримеров. В качестве реагента для присоединения ЛМ
был выбран 9–антрилметилизоцианат (АМИЦ), способный реагировать с
аминогруппами макромолекул в отсутствие катализаторов при комнатной
температуре:
www.sp-department.ru
12
(Boc)2LysOH
H2N
H2N
NH2
H2N
NH2
N
NH2
H2N
NH2
H2N
NH2
H2N
NH2
H2N
NH2
H2N
NH2
NH2
H2N
H2N
H2N
NH2
H2N
NH2
NH2
H2N
C
O
HN
NH2
H2N
NH2
DIC, HOBt
NH2
H2N
NH2
NH2
H2N
H2N
H2N
NH2
NH2
NH2
NH2
NH2
NH2
H2N
NH2
NH2
H2N
NH2
NH2
NH2
NH2
H2N
H2N
NH2
H2N
NH2
NH2
NH2
H2N
NH2
H2N
NH2
H2N
NH2
H2N
NH2
NH2
H2N
NH2
H2N
H2N
H2N
NH2
H2N
H2N
H2N
H2N
H2N
H2N
H2N
H2N
H2N
H2N
H2N
H2N H N
2H N
2
NH2
NH2
NH2
H2N
NH2
NH2
NH2
NH2
.
В ходе экспериментов были подобраны условия реакции, при которых к одной
молекуле дендримера присоединялось не более одной метки, что позволило
исключить вероятность электронных взаимодействий между присоединенными
ЛМ, способных повлиять на величины измеряемых фотофизических
характеристик. Количество присоединенных к молекуле дендримера ЛМ
составило одну ЛМ на 400 аминогрупп. На основе люминесцентно меченого
дендримера пятой генерации D5* был синтезирован дендример шестой
генерации D65*. Реакцию формирования внешнего шестого слоя проводили в
растворе,
используя
на
стадии
ацилирования
Nα,Nε-ди-(третбутилоксикарбонил)-лизин в качестве карбоксильного компонента. Была
предложена оригинальная методика высокой степени очистки ЛМ дендримеров
от низкомолекулярных люминесцирующих примесей, также способных
повлиять на результаты измерений. Все это позволило применить для
исследования
полилизиновых
дендримеров
высокочувствительный
динамический метод ПЛ.
5. ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ГОМО– И
ГЕТЕРОДЕНДРИМЕРОВ НА ОСНОВЕ ЛИЗИНА МЕТОДОМ ПОЛЯРИЗОВАННОЙ
ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ
Методом ПЛ определены времена релаксации τ, характеризующие
наносекундную подвижность макромолекул дендримеров в растворе, и на их
основе рассчитаны молекулярные массы (табл. 5). Зависимость τ(М) указывает
на то, что движение частицы дендримера как целого является определяющим
наносекундным релаксационным процессом, и эта зависимость такая же, как и
для белковых глобул. Сопоставление молекулярных масс показало, что
молекулы дендримеров третьей и пятой генераций при хранении в водных
растворах даже с заряженными NH3+ группами объединяются в ассоциаты.
Формирование ассоциатов приводит к тому, что определяющим
наносекундным релаксационным процессом становится подвижность ассоциата
как целого. Определенные молекулярные массы дендримеров хорошо
совпадают с Мтеор для индивидуальных макромолекул или превышают Мтеор и
характеризуют размер ассоциата. Из данных табл. 5 видно, что по мере
хранения раствора в случае D3 образующийся ассоциат состоит, в среднем, из 4
молекул дендримера, для D5 состоит из двух молекул. В то же время D6 не
проявляет тенденции к ассоциации.
www.sp-department.ru
13
Таблица 5
Времена релаксации, значения МПЛ и параметры 1/P0´,
определенные методом ПЛ
Дендример
Мтеор
Мs,D
МПЛ
D3 ‫٭‬
2010.5
2700
D5 ‫٭‬
D5 ‫٭‬Е
D5 ‫٭‬H
8160
16513
17011
13000
24500
15200
2300
2400
9600
17900
22500
29700
D65 ‫٭‬
16300
D 6‫٭‬
16364
Время
хранения
раствора
Свежий
30 дней
1 год
20000
18000
16300
τцел
1/P0´
3,1
3,1
3,6
23
29
38
25
25
9
17
10,2
8,1
26
23
21
5,7
5,7
8,5
* люминесцентно меченый дендример.
Сопоставление молекулярных масс, определенных для гетеродендримеров,
также показывает склонность данных макромолекул образовывать ассоциаты в
растворе. Ассоциация дендримеров в растворе может быть объяснена
встречным
проникновением
подвижных
боковых
тетраметиленовых
фрагментов лизинов, находящихся на внешних слоях макромолекул, и
возникновением гидрофобных контактов, которые начинают превалировать над
электростатическим отталкиванием NH3+ групп. Из этого следует, что с
уменьшением номера генерации или при переходе к гетероструктуре
дендримеры имеют более рыхлую упаковку структурных звеньев.
Действительно, анализ значений параметра 1/Ро´ (табл. 5) показал, что с
увеличением номера генерации плотность упаковки лизиновых фрагментов в
макромолекуле дендримера возрастает, изменяясь от плотности, близкой к
плотности клубка линейного полиэлектролита для D3 (1/Ро´ = 25), до плотности
макромолекулярной глобулы для D6 (1/Ро´ = 5,7). Такая особенность
структурной организации должна оказывать существенное влияние на
способность дендримеров к формированию в растворах не только ассоциатов,
но и супрамолекулярных структур гетерогенного состава - интерполимерных
комплексов и комплексов с низкомолекулярными соединениями.
6. ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСООБРАЗУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ПОЛИЛИЗИНОВЫХ
ДЕНДРИМЕРОВ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫМ ОРГАНИЧЕСКИМ
АНИОНОМ КАК МОДЕЛЬЮ БАВ
Методом ПЛ была исследована комплексообразующая способность
макромолекул
лизиновых
дендримеров
при
взаимодействии
с
низкомолекулярным
органическим
анионом
8–анилинонафталин–1–
сульфонатом (АНС). Связанный с дендримерной молекулой, АНС
люминесцирует при наличии в ней участков с высоким (или повышенным)
содержанием метиленовых групп лизиновых фрагментов, т.е. интенсивность
люминесценции АНС зависит от плотности упаковки таких групп. Связывание
аниона с дендримерной макромолекулой обеспечивается наличием у
www.sp-department.ru
14
дендримера положительно заряженных NH3+. Долю NH3+ групп в дендримере
задавали путем добавления к исследуемому раствору HCl.
Анализ изменений интенсивности люминесценции (Iлюм) АНС в растворах
гомо– и гетеродендримеров (рис. 5) показывает, что молекулы дендримеров на
основе лизина с ионизованными аминогруппами сохраняют повышенную
комплексообразующую способность при взаимодействии с АНС по сравнению
с комплексообразующей способностью линейного полилизина. При этом
высокие значения Iлюм АНС в молекулах D5 с ионизованными группами (рис.
5а) указывают на высокую плотность метиленовых групп, существенно
превышающую плотность метиленовых групп в рыхлом макромолекулярном
клубке линейного полилизина с заряженными аминогруппами, а низкие
значения Iлюм АНС для D4 по сравнению с D5 при одинаковой доле NH3+ групп
свидетельствуют о более рыхлой упаковке метиленовых групп остатков лизина
в молекуле D4.
а
IАНС, отн. ед.
IАНС, отн. ед.
б
D5
4,5
D5A
4,5
D5GG
3,0
D4
3,0
polyLys
1,5
D5E
polyLys
1,5
0,0
0,2
0,4
a
0,6
0,8
1,0
+
0,0
0,0
0,2
[NH3]
0,4
б
0,6
0,8
1,0
+
[NH3]
Рис. 5. Зависимости интенсивности люминесценции (Iлюм) от содержания ионизованных
аминогрупп в системах: а) АНС – линейный полилизин (polyLys) и АНС – D4, D5 и б) АНС –
линейный полилизин (polyLys) и АНС - D5Е, D5GG, D5А.
Изменение интенсивности люминесценции Iлюм АНС для гетеродендримеров с
различными аминокислотами между точками ветвления (рис. 5б) отражает
влияние строения расставки на комплексообразующую способность молекул
гетеродендримеров при близком количественном содержании в молекуле
гетеродендримера NH2- и NH3+ групп.
Таким образом, в ходе исследования показано, что дендримеры в сравнении
с линейными поликатионами могут быть более оптимальными носителями
низкомолекулярных БАВ, а также показана возможность оптимизации их
комплексообразующей способности при изменении химического строения.
7. ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПОЛИЛИЗИНОВЫХ ДЕНДРИМЕРОВ С
ПОЛИМЕТАКРИЛОВОЙ КИСЛОТОЙ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ И СТАБИЛЬНОСТЬ
ОБРАЗУЮЩИХСЯ КОМПЛЕКСОВ
Изучение формирования супрамолекулярных структур с участием
дендримеров и ДНК на первом этапе проводили на примере взаимодействия
www.sp-department.ru
15
дендримеров с макромолекулами ионизованной полиметакриловой кислоты
(ПМАК). Изучались зависимости изменения наносекундной подвижности
люминесцентно меченых молекул ПМАК при добавлении «темновых» (без
меток) молекул лизиновых дендримеров и люминесцентно меченых молекул
дендримеров при добавлении «темновых» молекул ПМАК. Значения времен
релаксации (τ), характеризующих наносекундную подвижность молекул ЛМ
дендримеров разных генераций и макромолекул полиметакриловой кислоты
(ПМАК), были определены методом ПЛ. При формировании комплексов
ПМАК – дендример использовали ПМАК с ММ = 9·104 при степени ионизации
ПМАК α = 0,84.
В ходе эксперимента обнаружена определенная корреляция между
структурной организацией образующегося интерполимерного комплекса (ИПК)
и склонностью того или иного дендримера к ассоциации. Из данных рис. 7а
видно, что τ для ПМАК имеет низкое значение (τ = 90 нс) при значительном
содержании D3 по сравнению с τ для D3 (τ = 250 нс). Из этого следует, что в
комплексе D3 – ПМАК имеются подвижные участки цепей ПМАК, свободные
от D3, и участки ПМАК, несущие ассоциированные молекулы D3. То есть при
формировании ИПК для D3 ассоциаты дендримеров возникают не только в
растворе, но и на комплементарном полимере, играющем роль матрицы. В
системе D6 – ПМАК (рис. 7б) высокие значения τ для ПМАК указывают на
равномерное распределение молекул D6 вдоль цепи ПМАК. Для дендримерных
τ , н с [ τ ПМ АК , (1), τ Д , (2)]
τ , н с [ τ П М А К , (1 ), τ Д , ( 2 )]
240
180
180
2
120
1
120
1
2
60
60
0,0
0,3
0,6
0,9
0 ,0
*
β = [D 3 ] / [П М АК ] (1) или
*
β ' = [П М АК] / [D 3 ] (2)
а
0 ,3
0 ,6
0 ,9
*
β = [D 6 ]:[П М А К ] ( 1 ) и л и
'
*
β = [П М А К ]:[D 6 ] ( 2 )
б
Рис. 7(а,б). Изменение времени релаксации τ, характеризующего наносекундную
подвижность меченой молекулы, при формировании интерполимерного комплекса, т.е. при
добавлении второго компонента к раствору люминесцентно меченого полимера: D3 и
ПМАК* (1а), ПМАК и D3* (2а); D6 и ПМАК* (1б), ПМАК и D6* (2б). Люминесцентно
меченый компонент выделен *. Величина β(β΄), определяется количеством добавлялемого
немеченого компанента.
макромолекул шестой генерации D6, не проявляющих склонности к ассоциации
в растворе, исходные низкие значения τ приближаются к значениям τ для
www.sp-department.ru
16
ПМАК в комплексе с D6 по мере увеличения содержания ПМАК в растворе и
переходе молекул D6 на ПМАК, что также свидетельствует о равномерном
распределении молекул D6 на цепях ПМАК.
Известно, что при создании полимерных носителей ДНК важную роль
играет стабильность ИПК носитель – ДНК в условиях высокой концентрации
хлористого натрия и белков плазмы крови, способных вытеснять ДНК из
комплекса с поликатионом. При исследовании стабильности ИПК ПМАК –
дендример в водно–солевых растворах были определены зависимости доли
связанного (включенного в комплекс) компонента Өсвяз от содержания NaCl в
водном растворе и сопоставлены со стабильностью ИПК ПМАК – линейный
полилизин. Было обнаружено, что комплексы ПМАК – дендример проявляют
повышенную стабильность в сравнении с комплексом ПМАК – линейный
полилизин. Установлено, что стабильность комплексов ПМАК с дендримерами
3–ей и 6–ой генераций при переходе от водных растворов к водно–солевым
связана с различной структурной организацией исследуемых интерполимерных
комплексов. Наиболее стабильным является комплекс D6 – ПМАК, это можно
объяснить отсутствием ассоциатов D6 - D6 на цепях ПМАК в отличие от D3 и
множественностью контактов ионизованных карбоксильных групп ПМАК с
NH3+ группами одной и той же макромолекулы D6, а также гидрофобными
взаимодействиями обращенных наружу неполярных групп ПМАК друг с
другом.
Сопоставление изменений времен релаксации τ, характеризующих
изменение внутримолекулярной наносекундной подвижности ПМАК* при
взаимодействии с линейным полилизином или дендримерами D3 и D5 (рис. 8),
показало более высокую заторможенность цепей ПМАК* в комплексах с
дендримерами по сравнению с внутримолекулярной подвижностью ПМАК*,
взаимодействующих с линейным полилизином, и наличие подвижных участков
ПМАК* в комплексе с ассоциатами D3, образующимися на цепях ПМАК*, или
их отсутствие в комплексе ПМАК* - D5.
τ ПМ АК , нс
D5
150
100
polyLys
D3
50
0
0,0
0,5
1,0
β = [D]:[ПМ АК*]
Рис. 8. Зависимость τПМАК(β), влияние линейного полилизина или дендримеров на основе
лизина на внутримолекулярную подвижность ПМАК* (α = 0,84) в воде, сПМАК = 0,2 мг/мл, β
= [D]:[ПМАК*].
Таким образом, в ходе исследований было показано, что дендримеры на
основе лизина обладают повышенной комплексообразующей способностью по
сравнению с линейным аналогом не только в отношении низкомолекулярных
www.sp-department.ru
17
веществ, но и высокомолекулярных соединений. Обнаружено, что разная
плотность упаковки структурных фрагментов в макромолекулах лизиновых
гомо– и гетеродендримеров проявляется не только в формировании в растворах
супрамолекулярных ассоциатов, но и в механизмах образования
макромолекулярных
комплексов,
возникающих
при
взаимодействии
дендримеров с комплементарными соединениями иного химического строения,
и оказывает влияние на стабильность образующихся комлексов, играющую
принципиальное значение для «выживания» комплекса в экспериментах in vivo.
8. ИССЛЕДОВАНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ КОМПЛЕКСА ДЕНДРИМЕР/ДНК МЕТОДОМ
СПЕКТРОСКОПИИ КРУГОВОГО ДИХРОИЗМА
Для изучения структурных особенностей дендримеров и их способности
взаимодействовать с молекулами ДНК был применен метод спектроскопии
кругового дихроизма (КД). В ходе экспериментов было показано, что
дендримеры не проявляют способности к регулярной укладке аминокислот ( αспираль или β-структура). Более того, введение в структуру дендримера
дополнительных аминокислот различного химического строения также не
оказывает влияния на форму спектров КД дендримеров независимо от рН
раствора и полярности растворителя. Эти факты еще раз подтверждают данные
о том, что дендримеры является жесткими структурами.
Исследование взаимодействия гомодендримера пятой генерации D5 и
гетеродендримеров D5Н, D5Е, D5А, D5GG с молекулами ДНК показало, что
изменение вторичной структуры ДНК происходит во всех исследованных
системах и зависит от весового соотношения компонентов в растворе (r).
Способность дендримеров связывать молекулы ДНК изучалась по изменению
амплитуды положительной и отрицательной полос спектров КД, а также по
изменению их формы в области 230-290 нм (рис. 9).
Рис. 9. Спектры кругового дихроизма, полученные для системы D5/ДНК в зависимости от
концентрации D5 в растворе 0,15мМ NaCl.
Для каждой системы было определено значение r, при котором
начинается взаимодействие ДНК с дендримером. Обнаружено, что спектры КД
www.sp-department.ru
18
в исследованных системах неидентичны, что может свидетельствовать о
различной структуре образующихся комплексов.
Параллельно был проведен анализ агрегативной устойчивости
комплексов дендример/ДНК с помощью исследования зависимости
характеристической
«мутности»
раствора,
выраженной
отношением
оптической плотности раствора при 320 нм (обусловленной рассеянием света
на частицах) и оптической плотности при 260 нм (определяемой концентрацией
ДНК), от доли дендримера r в исследуемой системе. Было обнаружено, что в
системах ДНК/D5А и ДНК/D5GG наблюдается критическое значение
концентрации дендримера (rкрит = 0,5), при котором характеристическая
«мутность» имеет максимальное значение и свидетельствует об образовании
агрегатов комплексов, при этом в спектрах КД происходит исчезновение
полосы поглощения ДНК. После полной нейтрализации зарядов ДНК
дендримерами D5А и D5GG и агрегации комплексов, при дальнейшем
увеличении содержания дендримера в системе (r > rкрит) происходит
восстановление типичных для комплексов ДНК/дендример полос КД, что
может свидетельствовать о диссоциации первоначально образовавшихся
крупных ассоциатов. В системе ДНК/D5Е определено пороговое значение rпор =
2,0, при котором комплексы теряют агрегативную устойчивость, и далее, с
ростом концентрации дендримера в растворе (r > rпор), диссоциации
агрегировавших комплексов не происходит, полосы ДНК в спектрах КД
исчезают и не восстанавливаются. Особым образом проходят процессы
комплексообразования в системе ДНК/D5Н. Было определено rкрит = 1, однако,
при увеличении концентрации дендримера (r > rкрит) характеристическая
мутность раствора растет пропорционально росту концентрации дендримера,
но полосы ДНК в спектрах КД сохраняются. Это может свидетельствовать о
продолжении процесса комплексообразования в растворе и о формировании
комплексов большего размера.
Из полученных данных можно сделать вывод, что строение дендримера
влияет на строение и свойства его комплексов с ДНК, а изменение химического
строения расставки между остатками лизина в структуре дендримера
определяет пути направленного регулирования свойств комплексов
ДНК/дендример, в частности, их агрегативной устойчивости, которая имеет
принципиальное значение для эффективного генного переноса.
9. ИССЛЕДОВАНИЕ ДНК – КОМПАКТИЗУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ДЕНДРИМЕРОВ
НА ОСНОВЕ ЛИЗИНА МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
ДНК–компактизующая способность гомодендримеров третьей и пятой
генераций была исследована методом агарозного гель-электрофореза. Известно,
что при образовании комплексов происходит изменение электрофоретической
подвижности молекул ДНК – при оптимальном соотношении реагентов
комплекс остается на старте (рис. 10).
Было установлено, что полная задержка ДНК в случае гомодендримеров
D3 и D5 наблюдается при одинаковом зарядовом соотношении ДНК/носитель
равном 1:1. Однако, при увеличении концентрации D5 (рис. 10б, дорожка 5,6)
www.sp-department.ru
19
свечение комплекса в лунках уменьшается, что, видимо, означает увеличение
их
плотности,
которое
затрудняет
проникновение
в
комплекс
интеркалирующего красителя бромистого этидия, который используется для
обнаружения ДНК в экспериментах. Комплексы же ДНК/D3 остаются в
достаточной степени «рыхлыми» для его проникновения, и затухание
флуоресценции комплекса не происходит.
1
2
3
4
5
6
а
б
Рис. 10. Электрофорез в 0,8% агарозном геле смеси плазмидной ДНК pCMV-nlsLacZ с D3 (а)
и D5 (б) при зарядовых соотношениях: ДНК/D3 - 1:0.1 (2), 1:0.5 (3), 1:1 (4), 1:2 (5), 1:4 (6), 1:6
(7), 1:8 (8), 1:10 (9), ДНК/D5 - 1:0.5 (2), 1:1 (3), 1:2 (4), 1 4 (5), 1:6 (6). Контроль – свободная
(«несвязанная») плазмидная ДНК (1).
10. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТРАНСФЕКЦИИ КОМПЛЕКСАМИ
ДНК/ДЕНДРИМЕР И АНАЛИЗ ЭНДОСОМОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
ГОМОДЕНДРИМЕРОВ ТРЕТЬЕЙ И ПЯТОЙ ГЕНЕРАЦИЙ
Эффективность трансфекции, т.е. экспрессии бактериальной β-галактозы,
комплексами ДНК/D3 и ДНК/D5 была определена на примере клеточной линии
HeLa с маркерным геном pCMV-nlsLacZ.
При подборе соотношения ДНК/дендример в серии экспериментов было
показано, что максимальная эффективность трансфекции комплексом ДНК/D3
без добавления эндосомолитических агентов (например, хлорокина)
достигалась при зарядовом соотношении ДНК/D3 равном 1:2 и составляла 0,86
± 0,41% от общего числа трансфецируемых клеток. Эффективность
трансфекции при использовании комплекса ДНК/D5 в целом была сравнима с
трансфекционной активностью комплекса с D3 и составила 0,94 ± 0,05% от
общего числа клеток. Однако добавление в систему хлорокина обнаруживает
резкое отличие D5 от D3 - присутствие хлорокина увеличивает эффективность
трансфекции комплексом ДНК/D5 почти на порядок - от 0,94 ± 0,05% до 7,9 ±
4,0% от общего числа клеток. На эффективность проникновения в клетки
комплекса ДНК/D3 хлорокин, напротив, действия не оказал.
Таким образом, изучение эффективности трансфекции клеток линии HeLa
комплексами ДНК/D3 и ДНК/D5 в отсутствие лизосоморазрушающих
соединений показало, что уровни трансфекции сопоставимы между собой.
Однако,
добавление
к
трансфецирующей
системе
сильного
эндосомолитического агента хлорокина приводит к значительному увеличению
уровня трансфекции комплексом ДНК/D5.
www.sp-department.ru
20
ВЫВОДЫ
1. Впервые проведен твердофазный синтез гомолизиновых дендримеров без
структурных дефектов и гетеролизиновых дендримеров, имеющих между
точками «ветвления» - диацилированными остатками лизина дополнительные α-аминокислоты с различными функциональными
группами и выявлено влияние химической природы дендримера на ход
синтеза.
2. Впервые двумя методами молекулярной гидродинамики и ПМР
спектроскопии показано, что локальная плотность структурных звеньев в
молекулах полилизиновых дендримеров имеет минимум на четвертой
генерации и резко увеличивается при переходе к шестой генерации.
Показано, что дендримеры, построенные на основе несимметричного
лизина, имеют характеристики, присущие симметричным дендримерам.
3. Разработан метод синтеза люминесцентно меченых лизиновых дендримеров
высокой степени чистоты с метками антраценовой природы, ковалентно
присоединенными к внешними и внутренним слоям дендримерных молекул.
Методом поляризованной люминесценции показано, что плотность
упаковки лизиновых фрагментов в гомодендримерах возрастает с ростом
номера генерации, в то время как в гетеродендримерах она понижается.
4. Методом ПЛ обнаружено явление ассоциации лизиновых дендримеров.
Тенденция к ассоциации дендримеров падает с ростом номера генерации
дендримера и возрастает при переходе от гомодендримера к
гетеродендримеру с тем же номером генерации.
5. При сравнительном анализе особенностей комплексообразования и
стабильности комплексов лизиновых дендримеров и линейного полилизина
с низкомолекулярными (АНС) и высокомолекулярными (ПМАК)
соединениями впервые показаны явные преимущества лизиновых
дендримеров по сравнению с линейным полилизином как на стадии
образования комплексов, так и при исследовании их стабильности.
Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях:
1. Г.П. Власов, Г.М. Павлов, Н.В. Баянова, Е.В. Корнеева, C. Эбель, М.А.
Ходорковский, Т.О. Артамонова. Дендримеры на основе α-аминокислот:
синтез и гидродинамические характеристики // ДАН. 2004. Т. 399. № 3. С.
366-368.
2. Г.П. Власов, В.И. Корольков, И.А. Гурьянов, Н.В. Баянова, А.Н. Баранов,
А.В. Киселев, Е.А. Лесина, В.С. Баранов. Оптимизация трансфицирующих
свойств комплексов ДНК с лизиновыми дендримерами // Биоорган. Химия.
2005. № 2. С. 167-174.
3. Н.В. Баянова, Г.П. Власов, Е.В. Ануфриева, Т.Н. Некрасова, Т.Д. Ананьева,
М.Г. Краковяк. Водорастворимые дендримеры на основе α-аминокислот:
синтез, функциональные свойства и наносекундная динамика // Структура и
динамика молекулярных систем. 2003. X (1). С. 21-23.
www.sp-department.ru
21
4. E. Anufrieva, T. Ananieva., N. Bayanova., G. Vlasov, M. Krakovyak., O.
Nazarova, T. Nekrasova., E. Panarin, and R. Smyslov. Nanosecond Mobility of
the Molecules in the Research of Supramolecular Assemblies of Dendrimers,
DNA, or Fullerene-Containing Compounds // Macromolecular Symposia. 2006.
V. 237 (1). Р.1-6.
5. Е.В. Скворцова, А.Н. Скворцов, В.И. Воробьев, Н.В. Баянова, И.И.
Тарасенко, Г.П. Власов. Гетеродендримеры на основе лизина и
гомологичные им гиперразветвленные полимеры: физико-химические
свойства и взаимодействие с ДНК // Структура и динамика молекулярных
систем. 2006. XIII (II). C. 245-248.
6. G. Vlasov, V. Korol’kov, G. Pankova, N. Bajanova, I.Tarasenko, V. Baranov, A.
Baranov, A. Kiselev, P. Glazkov, O. Ostapenko, and E. Lesina. Lysine
dendrimers and their starburst polymer derivatives as carriers for the DNA
delivery // Journal of Peptide Sciences. 2002. Suppl. 8. P. 189.
7. G. Vlasov, V. Korol’kov, G. Pankova, I. Tarasenko, N. Bajanova, O. Harenko,
V. Baranov, A. Baranov, A. Kiselev, P. Glaskov, O. Ostapenko, E. Lesina.
Starburst polymer protein and lysine dendrimer conjugates search of DNA
targeted delivery // 7-th World Conference on biodegradable polymers & plastics.
Pisa, Italy. 2002. P. 61.
8. G. Vlasov, V. Korol'kov, G. Pankova, I. Tarasenko, N. Bajanova, O. Harenko, V.
Baranov, A. Baranov, A. Kiselev, P. Glaskov, O. Ostapenko, E. Lesina. Starburst
polymer protein and lysine dendrimer conjugates seach of DNA targeted
delivery // 4th International Symposium "Molecular order and Mobility in Polymer
Systems". St. Petersburg. 2002. P. 246.
9. N. Bajanova and G. Vlasov. Synthesis and investigation of heterogenic dendrimers on
the basis of aminoacid // 4-th International Symposium "Molecular order and
Mobility in Polymer Systems". St. Petersburg. 2002. P. 248.
10. Г.П. Власов, Н.В. Баянова, И.А. Гурьянов, Г.А. Панкова, В.И. Воробьев, Е.В.
Авдеева, Е.В. Чихиржина, Э. Бок, В.А. Березин. Синтез и изучение
вторичной структуры FGL-фрагмента белка NCAM в димерной и
тетрамерной форме // Тезисы Российского симпозиума по химии и биологии
пептидов. Москва. 2003. С. 11.
11. G. Vlasov, I. Guryanov, G. Pankova, I. Tarasenko, N. Bajanova, O. Charenko, A.
Zhukov, V. Baranov, A. Baranov, A. Kiselev, E. Lesina, V. Vorobyev, E.
Avdeeva, E. Chihirdzhina. Synthesis and comparative study of carriers for DNA
targeted delivery // 10th Germany – Russian Peptide Symposium.
Friedrichroda/Thuringia. 2003. P. 74.
12. G. Vlasov, N. Bajanova, V. Vorobyev, E. Avdeeva, E. Korneeva, N. Michailova,
G. Pavlov. Lysine dendrimers: Synthesis and investigation of hydrodynamic
propeties and their ability to interact with DNA // 3-th International Dendrimer
Symposium. Berlin, Germany. 2003. P. 86.
13. Н.В. Баянова, Г.П. Власов, Е.В. Ануфриева, Т.Н. Некрасова, Т.Д. Ананьева,
М.Г. Краковяк. Водорастворимые дендримеры на основе α-аминокислот:
синтез, функциональные свойства и наносекундная динамика // Структура и
динамика молекулярных систем. Яльчик. 2003. В. 13.
www.sp-department.ru
22
14. Г.П. Власов, Н.В. Баянова, Е.В. Корнеева, C.Ebel, Н.А. Михайлова, Г.М.
Павлов. Дендримеры на основе α-аминокислот: синтез и гидродинамические
и молекулярные характеристики // Третья Всероссийская Каргинская
Конференция «Полимеры-2004». 2004. Т. 2. С. 208.
15. G.P. Vlasov, I.A. Guryanov, N.V. Bajanova, G.A. Pankova,V.I. Vorobyov, E.V.
Avdeeva, E.V. Chihirzhina, E.Bock, I.A. Berezin. Plural forms of FGL fragment of
NCAM: structure and interaction with specific antibodies // J. Pept. Sci. (3rd
International and 28th European peptide symposium). Prague, Czech Republic.
2004. Suppl. 10. P. 265.
16. Е.В. Скворцова, Н.В. Баянова, И.И. Тарасенко, Г.П. Власов. Цепные
линейные, разветвленные и сферические невирусные полимерные носители,
синтезированные на основе лизина // 3-й съезд биофизиков России.
Воронеж. 2004. С. 167.
17. Г.П. Власов, И.А. Гурьянов, Н.В. Баянова, И.И. Тарасенко, М.Н. Богданова,
В.В. Захаров, М.Г. Мосевицкий. Синтез аналогов пятнадцатичленного FGL
фрагмента белка NCAM и их воздействие на процессы в аксоновых
окончаниях нейронов // Мат. II Российского симпозиума по химии и
биологии пептидов. Санкт-Петербург. 2005. Р. 26.
18. E. Anufrieva, T. Nekrasova, G. Vlasov, М. Krakovyak, N. Bayanova, T.
Ananieva, R. Smyslov. Formation and Dynamiic Properties of Supramolecular
Structures of Dendrimers on a Lysine Basis in Water and Aqueous – salt Solution
// V Iternational Symposium «Molecular Mobility and Order in Polymer
Systems». Sankt-Petersburg. 2005. P. 093.
www.sp-department.ru
23
www.sp-department.ru
24
Бесплатно
Напечатано методом ризографии
ИВС РАН. 2007 г.
тир. 100 экз.
www.sp-department.ru