Приложение №8 - Биологический факультет МГУ
advertisement
На правах рукописи Голомысова Анастасия Никитична Потоковая модель метаболизма, связанного с производством водорода бактериями рода Rhodobacter 03.01.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2010 Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор Твердислов Всеволод Александрович Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор Ризниченко Галина Юрьевна кандидат биологических наук Пантелеев Михаил Александрович Ведущая организация: Институт фундаментальных проблем биологии РАН Защита состоится «24» февраля 2011 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д501.001.96 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Россия, Москва, Ленинские горы 1/12, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, «Новая» аудитория. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Автореферат разослан «20» декабря 2010 года Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М.Г. Страховская ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность В настоящее время, в связи с экономическими и экологическими проблемами, возникающими при использовании традиционных видов топлива, возрастает научная и инновационная актуальность разработок по альтернативным источникам энергии. Водород является перспективным экологически чистым топливом. Хотя в современной промышленности водород получают из ископаемых видов топлива, однако в лабораторных условиях разрабатываются пути его синтеза, безопасные для окружающей среды. Одним из наиболее перспективных путей синтеза водорода является его получение за счет солнечной энергии с помощью фотосинтезирующих микроорганизмов. В частности, пурпурные несерные бактерии способны образовывать водород как побочный продукт роста культуры на органических отходах. Когда этот процесс будет доведен до индустриальных масштабов, это позволит не только производить экологически чистое топливо, но и очищать окружающую среду. Однако такие существенные преимущества будут достигнуты, только если будет сконструирована рентабельная система производства водорода. Такая система должна быть основана на бактериальных штаммах, производящих водород с наибольшим выходом в удобных для промышленности условиях. Наиболее перспективными кандидатами для крупномасштабного производства биоводорода считаются бактерии из группы пурпурных несерных бактерий, так как они показывают наибольшую эффективность преобразования энергии и могут использовать большое разнообразие субстратов. Из этой группы бактерии рода Rhodobacter являются наиболее распространенными участниками экспериментов по производству водорода. До недавнего времени выбор подходящего штамма и условий для его оптимального роста и производства водорода требовал постановки большого количества экспериментов. В то же время современные методы системной 1 биологии дают возможность построить эффективно производящую биоводород систему теоретически, что заметно уменьшает объем экспериментальной работы. Один из таких методов, называемый метод баланса стационарных метаболических потоков (Flux Balance Analysis), предложенный в начале 90-х годов Б.О. Палсоном с соавторами (Varma&Palsson, 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60, 3724-3731), позволяет построить математическую модель метаболизма бактерии в стационарном приближении на основе данных о наборе генов бактерии. Такая модель называется потоковой или стехиометрической моделью метаболизма. Потоковая модель может быть использована для компьютерной симуляции экспериментов и подбора оптимальных условий для наработки биотоплива. Кроме того, она может быть использована для поиска генных модификаций, приводящих к увеличению наработки водорода или другого химического вещества. В связи с необходимостью конструирования эффективной производящей биоводород системы, актуальным оказывается построение потоковой модели метаболизма бактерий рода Rhodobacter, связанного с производством водорода и изучение особенностей этого метаболизма. Цель и задачи исследования Главной целью проведённой работы было создание потоковой модели анаэробного метаболизма бактерий рода Rhodobacter, а именно R. sphaeroides и R. capsulatus, с помощью которой можно будет разработать инновационную технологию производства водорода этими бактериями, а также исследовать возможности коррекции метаболизма этих бактерий. В задачи работы входило: • для каждой из бактерий R. sphaeroides и R. capsulatus создание и сопоставление с литературными данными списка биохимических реакций, описывающих анаэробный метаболизм бактерий и достаточных для описания производства водорода этой бактерией; 2 • для каждой из бактерий R. sphaeroides и R. capsulatus создание потоковой модели анаэробного фотогетеротрофного метаболизма с помощью метода баланса стационарных метаболических потоков; • поиск экспериментальных данных, достаточно подробно описывающих рост и производство водорода культурами R. sphaeroides и R. capsulatus, и проведение сравнения экспериментальных данных с предсказаниями построенной модели; • на основе потоковых моделей R. sphaeroides и R. capsulatus провести сравнение их анаэробного метаболизма; • определение изменений в экспериментальных условиях, необходимых для увеличения наработки водорода; • предсказание мутантов бактерий R. sphaeroides и R. capsulatus, производящих водород с повышенной скоростью. Научная новизна Впервые создана потоковая модель анаэробного метаболизма бактерии Rhodobacter. Эта модель позволяет описывать распределение стационарных потоков вещества, как в центральном метаболизме, так и в метаболизме аминокислот, липидов, и в фотосинтетическом аппарате. Проведено сравнение предсказаний модели с экспериментальными данными и продемонстрирована ее работоспособность. Впервые с помощью потоковой модели проведена интерпретация экспериментальных данных на всей продолжительности жизни бактериальной культуры. Впервые предсказаны мутанты R. sphaeroides и R. capsulatus способные производить водород с более высокой скоростью, чем природные штаммы. Практическое значение работы Построенная модель анаэробного метаболизма бактерий рода Rhodobacter позволяет провести компьютерный анализ экспериментальных данных о 3 производстве водорода бактериальной культурой и предложить пути изменения экспериментальных условий для оптимизации процесса и увеличения объема наработанного водорода. Кроме того, модель позволяет предсказать влияние различных факторов внешней среды, таких как освещение и тип субстрата, на результат эксперимента. Модель позволяет предсказать генные модификации R. sphaeroides и R. capsulatus, приводящие к созданию штаммов с повышенным выделением водорода. Использовать такой материал можно будет в создании биореакторов, подборе субстратов и штаммов для запуска производства водорода бактериями R. sphaeroides и R. capsulatus в промышленных масштабах. Апробация работы Основные результаты диссертации были представлены на XVII международной конференции "Математика. Компьютер. Образование" (Дубна, 2010). Доклады о результатах работы были представлены на семинаре сектора информатики и биофизики сложных систем кафедры биофизики биологического факультета МГУ и семинаре лаборатории физической биохимии ГНЦ РАМН. По материалам диссертации опубликовано 4 работы, из них 3 публикации в реферируемых журналах по списку ВАК и 1 тезисы в трудах международных конференций. Структура работы Диссертация представлена на 136 страницах и состоит из введения, 6 глав и трех приложений. Работа проиллюстрирована 21 рисунком и содержит 12 таблиц, список литературы включает 140 источников. 4 КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы задачи работы, кратко охарактеризованы методы и их решения, отражены научная новизна и практическая значимость результатов. Глава 1. Современные представления о производстве биоводорода бактериальными клетками В первой главе представлен обзор литературы, посвященный особенностям производства водорода биологическим путем. Особенное внимание уделено возможности выделения водорода микроорганизмами на свету за счет процесса фотосинтеза. Приведены причины, по которым пурпурные бактерии считаются наиболее перспективными производителями водорода в крупных масштабах. Обоснован выбор бактерий рода Rhodobacter в качестве предмета диссертации. В этой главе экспериментальных приведен условий, обзор известных необходимых для в настоящее производства время водорода бактериями R. sphaeroides и R. capsulatus. Проведен анализ основных задач, которые ставят перед собой экспериментаторы. Выделены основные направления, по которым необходимо исследовать производство водорода биологическим путем с помощью математического моделирования. Глава 2. Существующие модели бактериального метаболизма, основанные на методе баланса стационарных метаболических потоков Во второй главе представлен обзор литературы, посвященный методу баланса стационарных метаболических потоков (БСМП) (Назипова и др., Мат. Биол. Биоинф., 2007, 2(1), 98-119), известному в англоязычной литературе как Flux Balance Analysis (Lee et al., Brief. Bioinform., 2006, 7(2), 140-150). Обоснована применимость метода к моделированию метаболизма бактериальной клетки, как в фазе экспоненциального роста, так и в 5 стационарной фазе. Показаны возможности метода, приведены примеры его успешного применения для моделирования бактериального метаболизма, в частности, метаболизма производства водорода, и фототрофного метаболизма. Объяснено, что имеющиеся в мировой литературе потоковые модели не могут быть применены для описания метаболизма производства водорода пурпурной несерной бактерией. Глава 3. Потоковая модель метаболизма бактерий рода Rhodobacter 3.1. Метод баланса стационарных метаболических потоков (БСМП) Первая часть третьей главы посвящена описанию метода БСМП и методам поиска генных модификаций. Построенная с его помощью модель метаболизма (потоковая модель), базируется на информации о наборе биохимических реакций, который определяется по набору генов бактерии, и на данных о составе клеточной биомассы. Распределение потоков вещества находится путем максимизации прироста биомассы (или другой целевой функции – линейной комбинации потоков) при различном составе среды, различном освещении и фиксированном наборе реакций. В методе БСМП используется стационарное приближение. Для поиска мутантов используется симуляция метаболизма клетки при поочередном блокировании потоков через отдельные реакции. 3.2. Построение списка биохимических реакций Вторая часть третьей главы посвящена построению списка биохимических реакций, описывающих анаэробный метаболизм бактерий R. sphaeroides и R. capsulatus. За основу взят набор биохимических реакций, представленный для бактерий R. sphaeroides 2.4.1 и R. capsulatus в базе данных KEGG («Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes», www.genome.jp/kegg/), который был дополнен и проверен по литературным данным. Приведены причины, по которым конкретные реакции были включены в модель и обоснован выбор ограничений на направления отдельных реакций. Также проведено сравнение списков биохимических реакций, описывающих метаболизм бактерий R. sphaeroides и R. capsulatus, и сделан вывод об их различии. 6 3.3. Параметры потоковой модели В третьей части третьей главы обоснован выбор входных и выходных потоков для стехиометрической модели (табл. 1). Описано построение потока вывода биомассы (Bf, табл. 1). Описан выбор целевых функций (табл. 1) и особенности их применения. Таблица 1. Параметры потоковой модели. Параметр SfС, ммоль/(гСБК·ч) SfN, ммоль/(гСБК·ч) Pf, ммоль/(гСБК·ч) Bf, мг/(гСБК·ч) FСO2, ммоль/(гСБК·ч) FH2, ммоль/(гСБК·ч) FPHB, мг/(гСБК·ч) FPSC, мг/(гСБК·ч) FBut, ммоль/(гСБК·ч) FFor, ммоль/(гСБК·ч) OfC = A*Bf – FCO2 – FBut – FFor OfH = A*Bf + FH2 Комментарии скорость усвоения источника углерода, входной поток скорость усвоения источника азота, входной поток интенсивность освещения, выражаемая в виде потока фотонов, поглощенных фотосинтетическим аппаратом, входной поток скорость наработки биомассы, выходной поток скорость выделения углекислого газа, выходной поток скорость выделения водорода, выходной поток скорость запасания полигидроксибутирата, выходной поток скорость запасания полисахаридов, выходной поток скорость выделения бутирата, выходной поток скорость выделения формиата, выходной поток целевая функция с акцентом на запасание веществ, A – численный коэффициент порядка 103 целевая функция с акцентом на производство водорода 3.4. Методика обработки литературных данных о росте бактериальной культуры В четвертой части третьей главы описаны методы обработки экспериментальных данных, а именно получение значений параметров модели на основе данных, публикуемых в экспериментальных работах. Показана применимость стационарной модели к фазе экспоненциального роста бактериальной культуры, если экспериментальные данные соответствуют определенным критериям. Глава 4. Тестирование потоковых моделей R. sphaeroides и R. capsulatus В настоящей главе проведена апробация потоковой модели. Она включает в себя сравнение предсказываемой моделью на основе вычислительных экспериментов качественной картины распределения потоков при фототрофном росте на различных субстратах с известными из эксперимента данными. Также 7 в настоящей главе приведен расчет численных значений некоторых выходных потоков и сравнение их с экспериментальными значениями. Кроме того, проведено сравнение расчетов, проводимых с помощью модели R. sphaeroides и модели R. capsulatus. 4.1. Распределение основных потоков вещества в метаболизме В первой части главы приведены результаты качественного исследования распределения потоков в центральном метаболизме при фототрофном росте культуры на различных субстратах (фотоавтотрофный рост, ацетат, бутират, пропионат, лактат, малат и сукцинат). Представлены краткие схемы распределения потоков и показано, что основные потоки соответствуют общепринятым представлениям о распределении потоков вещества. В качестве примера на рис. 1 приведено распределение потоков в центральном метаболизме R. capsulatus при фотогетеротрофном росте на малате. В этом случае модель предсказывает высокую активность цикла Кальвина, что подтверждается экспериментальными данными (Tichi&Tabita, 2000, Arch. Microbiol. 174, 322-333) для роста R. capsulatus на малате. Блокирование потока через цикл Кальвина приводит к появлению выделения водорода при росте на малате, что также было ранее показано экспериментально в работе (Tichi&Tabita, 2000, Arch. Microbiol. 174, 322-333). Кроме того, в части 4.1 представлено сравнение численных результатов моделирования обоих видов, позволяющие оценить, насколько различия в наборе биохимических реакций оказывают влияние на метаболизм бактерий. Оказалось, что при фотоавтотрофном росте и при росте на летучих жирных кислотах численные значения выходных потоков вещества для R. sphaeroides и R. capsulatus совпадают. При фотогетеротрофном росте на классических лабораторных субстратах появляются незначительные различия в метаболизме двух видов, в частности R. sphaeroides требуется на 2-9% меньше освещения для поддержания производства биомассы с той же скоростью, что и R. capsulatus. 8 Рис. 1. Распределение потоков в центральном метаболизме R. capsulatus при фотогетеротрофном росте на малате. Ширина стрелок пропорциональна потоку вещества через соответствующую реакцию. Ромбами отмечены ATP-зависимые реакции, квадратами – NAD(P)H-зависимые реакции, кругами – реакции, в которых участвует углекислый газ. Расшифровка обозначений метаболитов дана на стр. 25. Так как количество выделяемого или поглощаемого культурой углекислого газа при росте на органическом субстрате характеризует корректность заложенного в модель состава биомассы, было проведено сравнение расчетного значения потока CO2 с экспериментальным из работы (Ormerod, 1956, Biochem. J. 64, 373-380). В табл. 2 приведены основные результаты этого сравнения. Приведенные расчеты показывают, что модель корректно описывает известное распределение потоков в метаболизме бактерий 9 рода Rhodobacter при росте на классических лабораторных субстратах. Качественная картина распределения потоков сходна с экспериментальными данными для R. sphaeroides и R. capsulatus. Количественные расчеты в пределах погрешности совпадают с экспериментальными данными для пурпурных бактерий. Таблица 2. Расчетные и экспериментальные (Ormerod, 1956, Biochem. J. 64, 373-380) величины потока углекислого газа (ммоль/(гСБК·ч)), выделяемого при усвоении субстрата со скоростью 1 ммоль/(гСБК·ч). Субстрат Эксперимент Расчет с помощью модели R. sphaeroides Расчет с помощью модели R. capsulatus ацетат 0.25±0.04 лактат 0.12±0.09 малат 1.14±0.05 сукцинат 0.75±0.02 0.22 0.10 1.10 0.62 0.24 0.12 1.12 0.64 4.2. Рост культуры R. capsulatus на лактате и глутамате и производство водорода в этих условиях Во второй части четвертой главы проведено моделирование эксперимента, описанного в классической работе (Hillmer&Gest, 1977, J. Bacteriol. 129, 724731), в котором исследуется производство водорода культурой R. capsulatus на среде с лактатом и глутаматом в фазе роста и в стационарной фазе. Из экспериментальных данных были оценены скорости усвоения субстратов, скорость производства водорода и скорость роста культуры в фазе роста: SfС = 1.062±0.010 ммоль/(гСБК∙ч), SfN = 1.66±0.14 ммоль/(гСБК∙ч), FH2 = 1.36±0.26 ммоль/(гСБК∙ч), скорость роста µ = 0.231 h-1. На рис. 2 представлены результаты моделирования роста бактерии с входными параметрами SfС = 1.062 ммоль/(гСБК∙ч) и SfN = 1.66 ммоль/(гСБК∙ч). При значениях потока фотонов 5-20 ммоль/(гСБК∙ч), модель предсказывает скорость роста культуры (скорость производства биомассы + скорость запасания биополимеров) равной 225-245 мг/(гСБК∙ч), что хорошо описывает экспериментальные значения. Экспериментальное значение скорости наработки водорода достигается при значениях потока фотонов 17-21 10 ммоль/(гСБК∙ч). Таким образом, экспериментальные данные правильно описываются моделью при значении потока фотонов 17-20 ммоль/(гСБК∙ч). Рис. 2. Расчетная зависимость потоков наработки биомассы и биополимеров и выделения газов и аммония от потока фотонов для потоковой модели R. capsulatus (серые кривые). На вход модели подавался лактат (SfC = 1.062 ммоль/(гСБК∙ч)) и глутамат (SfN = 1.66 ммоль/ (гСБК∙ч)). Использовалась целевая функция OfH (табл. 1). В приведенном эксперименте (Hillmer&Gest, 1977, J. Bacteriol. 129, 724731) через 11 часов культура прекращает рост вследствие того, что в среде закончился источник азота. В стационарной фазе концентрация клеток в среде остается постоянной, и происходит выделение водорода (FH2 = 2.08±0.13 ммоль/ (гСБК∙ч)) и, возможно, запасание биополимеров за счет усвоения лактата (SfС = 0.55±0.02 ммоль/(гСБК∙ч)). Моделирование этой фазы роста дает максимальную скорость наработки водорода при такой скорости усвоения субстрата равной (FH2)max = 2.75±0.10 ммоль/(гСБК∙ч), для этого необходимо 19 ммоль/(гСБК∙ч) фотонов. Экспериментальное значение FH2 = 2.08±0.13 ммоль/ (гСБК∙ч) достигается при потоке фотонов 13-15 ммоль/(гСБК∙ч) – чуть ниже, чем поток фотонов в экспоненциальной фазе. В целом, проведенное сравнение расчета и экспериментальных данных показывает способность модели предсказывать экспериментальные значения потоков. 11 4.3. Рост культуры R. sphaeroides на малате и аммонии и производство водорода в этих условиях В третьей части четвертой главы проведено моделирование эксперимента, описанного в работе (Waligorska et al., 2009, J. Appl. Microbiol. 107, 1308-1318), в котором исследуется производство водорода культурой R. sphaeroides O.U.001, растущей на среде с малатом и аммонием. Фаза роста в представленных экспериментальных данных характеризуется линейным ростом со временем концентрации клеток в среде и линейным падением концентраций обоих субстратов, при этом водород не выделяется. Исходя из того, что концентрации субстратов падают линейно, можно получить, что соотношение Bf:SfC:SfN остается постоянным в течении всей фазы роста, и модельный расчет достаточно провести только для одной временной точки. Был взят момент времени, в который скорость роста µ = 0.107 h-1, SfC (скорость усвоения малата) = 1.46 ммоль/(гСБК·ч), SfN (скорость усвоения аммония) = 0.82 ммоль/(гСБК·ч). На рис. 3 темно-серыми линиями представлены результаты моделирования роста бактерии с входными параметрами SfС = 1.46 ммоль/(гСБК∙ч) и SfN = 0.82 ммоль/(гСБК∙ч). Экспериментальное значение биомассы достигается при потоке фотонов большем 5 ммоль/ч. В этом случае 20-25% биомассы составляются запасные вещества. Согласно данным (Waligorska et al., 2009, J. Appl. Microbiol. 107, 1308-1318), в анализируемом запуске после того, как культура употребила весь аммоний, концентрация запасенных веществ составляла 25%, так что предсказания модели хорошо согласуются с экспериментом. Так как считается, что запасание биополимеров конкурирует с производством водорода, было проведено моделирование роста бактерии в этих же условиях с целевой функцией с акцентом на производство водорода. Модельные зависимости скоростей наработки биомассы, запасания веществ, выделения углекислого газа и водорода от света представлены на рис. 3 светлосерыми линиями. Из графика видно, что при увеличении освещения вместо наработки полисахаридов начинает нарабатываться водород, в то время как при 12 потоке фотонов меньше 6 ммоль/ч, разницы между режимом с акцентом на запасание вещества и режимом с акцентом на выделение водорода не наблюдается. Это говорит о том, что производство водорода конкурирует не с производством полигидроксибутирата, а с производством полисахаридов. Рис. 3. Расчетная зависимость потоков наработки биомассы и биополимеров и выделения газов и аммония от потока фотонов для модели R. sphaeroides. На вход модели подавался малат (SfC = 1.46 ммоль/(гСБК∙ч)) и аммоний (SfN = 0.82 ммоль/(гСБК∙ч)), в качестве целевой функции использовалась OfС (темно-серые линии), либо OfH (светло-серые линии). В стационарной фазе жизнедеятельности культуры в этом же эксперименте (Waligorska et al., 2009, J. Appl. Microbiol. 107, 1308-1318) концентрация малата в среде линейно падает со временем со скоростью 0.045 мМ/ч, а объем аккумулируемого газа линейно увеличивается со скоростью 0.0185 л/ч. Соответственно, скорости потребления субстрата и наработки водорода равны SfC = 0.061 ммоль/(гСБК·ч) и FH2 = 0.98 ммоль/(гСБК·ч). Здесь сразу следует заметить, что теоретически из 0.061 ммоль малата можно получить не больше 0.061*6 = 0.366 ммоль водорода, а экспериментально получаемое количество в три раза больше. Это означает, что в реальности для производства водорода используется не только субстрат, но и внутренние ресурсы клетки. Как получено ранее, в фазе роста нарабатывалось 20% запасных веществ. Если в начале стационарной фазы 20% сухой биомассы клеток составлял PHB, то за 24 часа стационарной фазы его можно было полностью использовать со скоростью 6 мг/(гСБК·ч). Поэтому при моделировании стационарной фазы на вход модели 13 подавался малат со скоростью 0.061 ммоль/(гСБК·ч) и гидроксибутират со скоростью 6 мг/(гСБК·ч). Расчет показал, что в этих условиях максимальная скорость производства водорода равна 1.05 ммоль/(гСБК·ч). Это значение скорости производства водорода практически совпадает с экспериментальным значением в анализируемой фазе. Таким образом, предположения об источнике субстрата для производства водорода и скорости его усвоения верны. Таким образом, проведенный анализ экспериментальных данных (Waligorska et al., 2009, J. Appl. Microbiol. 107, 1308-1318) показывает, что в фазе роста культуры 20-23% субстрата идет на запасание биополимеров. При этом если избежать ингибирования нитрогеназы ионами аммония, в фазе роста теоретически возможно переключение метаболизма на выделение водорода. Однако анализ производства водорода в стационарной фазе показал, что все запасенные полимеры были преобразованы в водород. Значит, по крайней мере, в данных условиях, запасание биополимеров не является вредным фактором для производства водорода. 4.4. Заключение В четвертой части четвертой главы проводится суммирование проведенной апробации модели и формулируются соответствующие выводы (см. выводы 1 и 2 на стр. 23). Глава 5. Предсказание особенностей метаболизма и мутантов R. sphaeroides и R. capsulatus при помощи потоковой модели В настоящей главе с помощью потоковой модели проводится исследование поведения бактерий рода Rhodobacter в различных условиях. Кроме того, проводится поиск генных модификаций, приводящих к появлению выделения водорода в условиях, оптимальных для роста бактерии. 5.1. Поведение бактерий при недостатке аммония в среде В первой части пятой главы проводится исследование поведения бактерии при фотогетеротрофном росте при недостатке азота в среде, так как именно в подобных условиях, при достаточном освещении, бактерии синтезируют 14 полезные для промышленности вещества – водород и полиалканоаты. Моделирование с целевой функцией с акцентом на выделение водорода (OfH, сплошные линии на рис. 4) характеризует максимальное количество водорода, которое может быть выделено клеткой при заданном потоке субстратов и заданном освещении. Построенная модель позволяет объяснить, почему выделение водорода происходит только при сильном освещении: выделение водорода, в отличие от выделения формиата и бутирата, требует ATP, поэтому в качестве стока для NADH появляется только когда есть возможность синтезировать дополнительное количество ATP, не требуемое для роста клетки, т.е. при сильном освещении. Рис. 4. Расчетная зависимость потоков наработки биополимеров и выделения побочных продуктов от потока фотонов для потоковой модели R. capsulatus. На вход модели подавались ацетат (SfC = 3 ммоль/(гСБК·ч)) и аммоний (SfN = 1 ммоль/(гСБК·ч)). Использовалось два вида условий: i) целевая функция OfH (сплошные линии), ii) целевая функция OfC (пунктирные линии). 15 Для исследования конкуренции процессов запасания биополимеров с производством водорода было проведено моделирование роста бактерии при недостатке азота в среде с целевой функцией с акцентом на запасание углерода (OfC, пунктирные линии на рис. 4). В эту целевую функцию включено подавление выделения веществ, содержащих углерод, в среду. Моделирование показывает, что при сильном освещении бактерия запасает полисахариды, а при снижении освещения этот процесс заменяется на запасание полигидроксибутирата и выделение формиата и бутирата. Таким образом, с процессом производства водорода конкурирует (за NADH и за ATP) именно процесс запасания полисахаридов. 5.2. Производство водорода и запасание биополимеров в стационарной фазе В стационарной фазе, когда прекращается рост культуры, происходит только усвоение субстрата – источника углерода, за счет которого поддерживается жизнедеятельность культуры, запасание биополимеров и, как побочный процесс, выделение водорода. Взаимоотношения перечисленных процессов и их зависимость от освещения в стационарной фазе полностью аналогичны полученным в п. 5.1 для роста бактерии при недостатке азота в среде. Производство водорода конкурирует с запасанием полисахаридов за ATP и NADH и заменяется запасанием полигидроксибутирата при снижении освещения. Во второй части пятой главы с помощью построенной потоковой модели были исследованы пути преобразования субстрата в водород и биополимеры при неограниченном потоке фотонов. Проведенное сравнение стехиометрии образования этих веществ для R. capsulatus и R.sphaeroides показало, что распределение потоков в стационарной фазе у этих двух видов одинаково. 5.3. Путь усвоения ацетил-CoA у R. capsulatus В третьей части пятой главы проведено дополнительное исследование роста R. capsulatus на ацетате, так как у этой бактерии отсутствует активная изоцитрат-лиаза – ключевой фермент глиоксилатного шунта, необходимого для 16 усвоения ацетата. Было проведено моделирование роста и производства водорода бактерией R. capsulatus на ацетате при включении либо глиоксилатного шунта, либо цитрамалатного пути, либо этилмалонилового пути, после чего полученные результаты сравнивались друг с другом и с экспериментальными данными. В табл. 3 представлены результаты моделирования роста бактерии на ацетате и аммонии. В экспериментах (Ormerod, 1956, Biochem. J. 64, 373-380) для пурпурных несерных бактерий получено значение скорости выделение углекислого газа при росте на ацетате равное 0.25 моль/моль субстрата. Как видно из табл. 3, это значение близко к результату, получаемому в модели с этилмалониловым путем, и заметно отличается от предсказаний моделей с цитрамалатным путем или глиоксилатным шунтом. Таблица 3. Величины потоков (ммоль/ч), предсказываемые моделью при усвоении ацетата со скоростью 1 ммоль/ч. Путь усвоения ацетил-CoA глиоксилатный цитрамалатный этилмалониловый шунт путь путь Скорость производства 0.57 0.57 0.52 биомассы Необходимое количество 5.94 5.95 3.63 фотонов Скорость усвоения NH3 0.49 0.49 0.45 Скорость выделения СО2 0.06 0.07 0.24 Активность цикла Кальвина 0.36 0.35 0.00 Активность дополнительного пути 0.40 0.40 0.35 усвоения ацетил-CoA Также было проведено сравнение количества выделяемого в стационарной фазе водорода для модели бактерии с разными путями усвоения ацетил-CoA при максимальном освещении с экспериментальными данными. Оказалось, что для моделей, в которых усвоение ацетата происходит по этилмалониловому пути, производство водорода осуществляется по суммарной реакции: CH3COOH + 2H2O → 3H2 + 2H+ + 2CO2 Для моделей с цитрамалатным путем или глиоксилатным шунтом имеет место реакция: CH3COOH + 2H2O → 4H2 + 2CO2 17 В экспериментальных работах, относящихся к росту R. capsulatus на ацетате, указывается максимальная скорость производства водорода от 2.5 до 3 моль водорода/моль субстрата, что ближе всего к работе модели по этилмалониловому пути. По результатам сравнения предсказаний модели с двумя видами экспериментальных данных можно сказать, что модель с включенным этилмалониловым путем лучше описывает экспериментальные данные по выделению водорода и углекислого газа, чем модель с цитрамалатным путем или с глиоксилатным шунтом. Результаты каждого из экспериментов, относящихся к этому режиму роста, можно объяснить недостатком освещения или склонностью к запасанию биополимеров, тем не менее, представленные в настоящей работе данные численного моделирования дают возможность провести аккуратную экспериментальную проверку. 5.4. Предсказание генных модификаций, приводящих к увеличению наработки водорода в фазе роста В четвертой части пятой главы описаны результаты использования модели для предсказания блокированию нокаутов потока через (генных реакцию, модификаций, приводящих катализируемую к продуктом соответствующего гена), приводящих к увеличению потока наработки водорода в фазе роста бактерии. Для расчета используется метод двухуровневого линейного программирования, описанный в главе 3. Первой целевой функцией при этом является поток наработки биомассы (Bf), а второй – поток наработки водорода (FH2). Были изучены группы, содержащие не более 4х нокаутов. Набор нокаутов, приводящий к увеличению наработки водорода, зависит от вида бактерии (R. sphaeroides или R.capsulatus) и от субстрата, поэтому были проведены исследования для всех допустимых в модели комбинаций (12 вариантов). Приведено обсуждение влияния отдельных нокаутов на метаболизм бактерии. В качестве примера в табл. 4 приведен набор нокаутов, приводящий к увеличению наработки водорода при росте R. capsulatus на малате. 18 Таблица 4. Предсказанные моделью группы нокаутов, приводящие к увеличению скорости наработки водорода в фазе роста R. capsulatus на малате. Знаком "ʘ" обозначено блокирование соответствующего ферменту потока. Скорость усвоения субстрата SfC = 1 ммоль/(гСБК·ч). Обозначения ферментов расшифрованы на стр. 25 автореферата. Скорость производства Скорость биомассы по производства Нокаут сравнению с диким водорода, типом ммоль/(гСБК·ч) RuBisCO PFL ʘ ʘ ʘ ʘ ʘ ʘ ʘ STK + PC SCOT TD 93% 85% 93% 90% 92% 90% 86% ʘ ʘ ʘ ʘ ʘ ʘ ʘ ʘ 0.14 0.53 0.41 0.22 0.47 0.48 0.79 При внесении полученных нокаутов в потоковую модель производство водорода появляется за счет перераспределения потоков таким образом, что в клетке возникает избыток NAD(P)H, при условии блокирования всех дополнительных стоков NAD(P)H, при этом скорость наработки биомассы снижается. Различия в списке биохимических реакций R. sphaeroides и R. capsulatus проявляются именно в наборах нокаутов. Группы нокаутов, предсказываемые для R. capsulatus основаны на блокировании RuBisCO (сток NADH) и PFL (выделение формиата), а группы нокаутов, предсказанные для R. sphaeroides, основаны на перенаправление синтеза глицеральдегид-3-фосфата с глюконеогенеза на синтез через D-глицерат. Однако надо иметь ввиду, что в модели не были введены ограничения на скорость реакции, поэтому в реальной клетке при перераспределении потоков может оказаться, что реакция, на которую пришелся основной поток вещества в мутанте, на это не рассчитана. 5.5. Заключение В пятой части пятой главы проводится суммирование проведенного исследования метаболизма бактерии и формулируются соответствующие выводы (см. выводы 3-6 на стр. 23). 19 Глава 6. Обсуждение результатов В данной главе суммированы выполненные в работе исследования, проводится обсуждение полученных результатов и их места в мировой науке. Приводятся дальнейшие направления развития модели. Дадим краткое резюме. Бактерии рода Rhodobacter являются одними из наиболее перспективных производителей биоводорода. В настоящее время многие исследовательские группы ищут пути влияния на метаболизм этих бактерии, чтобы приспособить их для производства водорода в крупных масштабах. Однако условия, в которых бактерии рода Rhodobacter дают наибольший выход биогаза различаются для разных штаммов и поиск оптимальных условий идет методом подбора для каждого следующего штамма. В этой исследовательской задаче не хватает теоретического осмысления получаемых экспериментальных данных, которое может дать модель метаболизма бактериальной клетки. Потоковые модели метаболизма уже зарекомендовали себя как полезные инструменты для анализа распределения потоков вещества в метаболизме различных бактерий и для предсказания возможного влияния на жизнедеятельность клетки путем нокаутов. Хотя уже построено много моделей разных бактерий, они не могут быть использованы для анализа метаболизма бактерий рода Rhodobacter, так как отличаются от нее условиями жизнедеятельности. В настоящей работе представлена потоковая модель анаэробного фотогетеротрофного метаболизма, объединяющая бактерии R. sphaeroides и R.capsulatus. Эта модель, включая в себя кроме путей центрального метаболизма, пути биосинтеза аминокислот, липидов, нуклеиновых кислот и фотосинтетических пигментов, и процессы, происходящие при фотосинтезе, а так же реакции, связанные с выделением водорода и запасанием полимеров, является практически полной моделью анаэробного метаболизма Rhodobacter. При построении модели были учтены такие особенности, как наличие альтернативного пути усвоения ацетата и различный синтез фотосинтетических мембран при разном освещении. Хотя при построении моделей использовались 20 отдельные наборы биохимических реакций для R. sphaeroides и R. capsulatus, при тестировании модели оказалось, что эти различия не имеют существенного влияния на результаты моделирования, поэтому был сделан вывод о схожести метаболизмов этих двух видов. Тестирование модели было проведено путем сравнения известных из эксперимента потоков с расчетными, как для фазы экспоненциального роста бактерии, так и для стационарной фазы. Тестирование показало, что модель правильно предсказывает реальные потоки вещества и может быть использована для анализа и интерпретации экспериментов. Для демонстрации работоспособности модели был проведен анализ двух экспериментальных работ. На первом наборе экспериментов, опубликованном в работе (Hillmer&Gest, 1977, J. Bacteriol. 129, 724-731) продемонстрирована способность модели корректно предсказывать распределение потоков в метаболизме R. capsulatus в фазе роста и в стационарной фазе при выделении водорода этой бактерией. Тоже было показано и на втором наборе экспериментов, относящихся к росту культуры R. sphaeroides на среде с малатом и аммонием (Waligorska et al., J. Appl. Microbiol., 2009, 107(4), 13081318). Применение двух различных видов целевой функции при моделировании последних данных позволило предположить, что блокирование синтеза биополимеров может привести к возрастанию скорости наработки водорода в фазе роста. Более подробное исследование запасания биополимеров при недостатке азота в среде и в стационарной фазе подтвердило это предположение. Кроме того, численный анализ данных (Waligorska et al., J. Appl. Microbiol., 2009, 107(4), 1308-1318) показал, что бактерии используют весь запасенный стационарной полигидроксибутират фазе. Этот результат, для хотя производства и водорода предполагался ранее в в экспериментальных работах, впервые получил однозначное подтверждение. С помощью построенной модели также сделаны предположения о генных модификациях, которые могут привести к увеличению наработки водорода. Увеличение скорости производства водорода во всех случаях происходит за 21 счет уменьшения скорости наработки биомассы, т.е. снижения скорости роста культуры. Это положительный момент, так как медленно растущая культура медленнее заполняет объем, и среда дольше пропускает свет. Кроме того, оказалось, что различия в наборах биохимических реакций, описывающих метаболизма бактерий R. sphaeroides и R. capsulatus, приводят к различным наборам предсказанных нокаутов для этих двух видов бактерий. Все предсказанные нокауты, кроме блокирования потока через цикл Кальвина, в настоящей работе предлагаются впервые. Однако надо помнить, что построенная модель метаболизма использует стационарное приближение, поэтому обладает определенными ограничениями. В то время как модель способна предсказать, как будет распределяться усвоенный клеткой субстрат при различном освещении, она не может дать представления о скорости усвоения субстрата при изменении его концентрации в среде. Поэтому построение кинетической модели метаболизма для предсказания поведения бактерии в различных условиях является одним из возможных направлений развития модели метаболизма бактерий рода Rhodobacter. Другим возможным направлением развития является добавление известной генетической регуляции процессов, управляющей переключением потоков между различными метаболическими путями. Хотя в настоящее время недостаточно экспериментальных данных для построения полной картины, объединение потоковой модели метаболизма и модели генетической регуляции метаболизма позволит спланировать соответствующие эксперименты. В целом, уже в настоящем виде построенная потоковая модель обладает большим исследовательским потенциалом и может быть использована для анализа данных различных экспериментов по производству не только водорода, но и других полезных веществ, и одновременно может применяться для эффективного планирования новых экспериментов. 22 Выводы 1. Впервые построена и апробирована потоковая модель анаэробного метаболизма бактерии рода Rhodobacter. Показано, что предсказываемые моделью скорости роста культуры и наработки побочных продуктов хорошо согласуются с экспериментальными данными. 2. Выявлены различия характеризующими между наборами анаэробный биохимических метаболизм реакций, бактерий R. sphaeroides и R. capsulatus. Теоретически доказано, что эти различия не оказывают существенного влияния на физиологию фототрофного роста указанных бактерий. 3. С использованием построенной модели теоретически показано, что усвоение ацетата при фототрофном росте R. capsulatus не идет по цитрамалатному пути, как считалось ранее. На основании модельных расчетов высказана гипотеза о том, что у R. capsulatus этой цели служит этилмалониловый путь. 4. С помощью разработанной модели показано, что блокировка синтеза полисахаридов у бактерий R. sphaeroides и R. capsulatus приводит к заметному увеличению скорости производства водорода. 5. Предложены группы эффективных генных модификаций клетки R. sphaeroides, приводящие к увеличению скорости наработки водорода в фазе роста культуры. Основной предложенной генной модификацией является выключение гена, кодирующего фосфоглицерат киназу (EC 2.7.2.3). 6. Предложены группы эффективных генных модификаций клетки R. capsulatus, приводящие к увеличению скорости наработки водорода в фазе роста культуры. Основной предложенной генной модификацией является выключение гена, кодирующего пируват: формиат лиазу (EC 2.3.1.54). 23 Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. А.Н. Голомысова, П.С. Иванов. «Моделирование анаэробного метаболизма Rhodobacter sphaeroides методом баланса стационарных метаболических потоков». Тезисы Всероссийской научной конференции «Математика. Компьютер. Образование», т.17, (Москва-Ижевск) - 2010 – С. 229. 2. А.Н. Голомысова, М. Гомельский, П.С. Иванов. «Математическое моделирование бактериального метаболизма». Вестник Московского Университета. Серия 3. 2010 №3, 73-76 3. Golomysova A, Gomelsky M and Ivanov PS, «Flux Balance Analysis of photoheterotrophic growth of purple nonsulfur bacteria relevant to biohydrogen production», International Journal of Hydrogen Energy, 2010, 35(23), 1275112760. 4. А.Н. Голомысова, П.С. Иванов, «Исследование анаэробного метаболизма бактерий Rhodobacter capsulatus с помощью потоковой модели», Биофизика, 2011, 56(1), 85-98. Благодарности Автор выражает благодарность своему научному руководителю, Всеволоду Александровичу Твердислову, за внимание и всестороннюю поддержку проведенного исследования. Автор глубоко признателен научному руководителю своей дипломной работы, сотруднику кафедры биофизики физического факультета МГУ Иванову Павлу Сергеевичу за интересную постановку задачи для кандидатской работы, многочисленные и плодотворные обсуждения получаемых результатов и сотрудничество в их публикации. 24 Список использованных сокращений 2PG 2-фосфоглицерат OA оксалоацетат 3PG 3-фосфоглицерат Ogl 2-оксоглутарат пируват карбоксилаза (Pyruvate AacCoA ацетоацетил-CoA PC AcCoA ацетил-CoA carboxylase), EC 6.4.1.1 ATP аденозин-5'-трифосфат PEP фосфоенолпируват Bchl бактериохлорофилл a PFL пируват: формиат лиаза (pyruvate But бутират, масляная кислота formate-lyase), EC 2.3.1.54 Car каротиноиды PHB поли- β-гидроксибутират Cit лимонная кислота PL фосфолипиды CoA кофермент А PrCoA E4P эритрозо-4-фосфат PRP2 фосфорибозил пирофосфат F1P фруктозо-1-фосфат PSC полисахариды F6P фруктозо-6-фосфат Pyr пируват FA жирные кислоты R5P рибозо-5-фосфат RPI рибозофосфат изомераза (Ribose- Formate формиат, муравьиная кислота FP2 фруктозо-1,6-бисфосфат G глицеральдегид G1P пропаноил-CoA 5-phosphate isomerase), ЕС 5.3.1.6 глюкозо-1- Ru5P рибулозо-5-фосфат фосфат RuBisCO G3P глицеральдегид-3-фосфат карбоксилаза G6P глюкозо-6-фосфат RuP2 рибулозо-1,5-бисфосфат GlP2 1,3-бисфосфоглицерат S7P GP глицерон-фосфат SCOT сукцинил-CoA трансфераза KDGP 2-кето-3-дезоксиглюконат-6- седогентулозо-7-фосфат (succinyl-CoA:3-oxoacid coenzyme A фосфат KEGG рибулозобисфосфат transferase), EC 2.8.3.5 «Kyoto Encyclopedia of Genes SP2 седогентулозо-1,7-бисфосфат and Genomes», база данных о биохимических STK сукцинат: CoA лигаза (Succinate реакциях thiokinase), EC 6.2.1.5 Mal Suc малат, яблочная кислота MaCoA малонил-CoA NADH восстановленная SucCoA форма TD никотинамид-аденин-динуклеотида NAD(P)H восстановленная сукцинат, янтарная кислота сукцинил-CoA треанин деаминазе (L-threonine ammonia-lyase), EC 4.3.1.19 форма UG UDP-глюкоза никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфата, X5P ксилулозо-5-фосфат либо никотинамид-аденин-динуклеотида СБК сухая биомасса клеток 25 26
