МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ N

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ
ЖУРНАЛ
ОТДЕЛЬНЫЙ ОТТИСК
N
КИЕВ — 198^
УДК 579.852.11.222’15
А М Н Н О П ЕП ТИ ДА ЗА ТЕРМ ОФИЛЬНОГО ШТАММА
b a c illu s lic h e n ifo r m is
И. Н. П а в л о ва , Т. В. Ротанова, Л . Г. Ж о л н е р
Ин-т микробиологии и вирусологии АН УССР, Киев;
Ин-т биоорган, химии А Н СССР, М осква
,
—
И з культ уральной жидкости термофильного штамма B a cillu s lich en iform is вы д е ­
лена и очищена аминопептидаза, отщепляющая предпочтительно N -концевой лейцин
в коротких пептидах, а также ги дрол и зую щ ая лейцинамид. Фермент имеет м о л ек ул я р ­
н ую м ассу, б л и зк ую к 60 кдальтон, и способен образовы ват ь агрегаты.
Аминопепт идаза м аксим ально активна при p H 8,0—8,3 и температуре 85 “С.
Фермент инактивируют м ет аллосвязываю щ ие реагенты и р едуц и рую щ и е
вещества,
тогда как ионы кобальта и П Х М Б являются его активаторами. Активность фермента,
инакт ивированного Э Д Т А , восстанавливается ионами кобальта и цинка, одн ако п о сл ед ­
ний не обладает активирующим действием.
И сследуем ы й фермент характеризуется вы сокой термостабильностью: в присутст­
вии субстрата при температуре 90 °С линейность реакции сохраняется не менее 2 ч,
а б е з субстрата вр ем я полуинактивации аминопептйдЦзы при 90 °С составляет 145 мин.
Внеклеточная аминопептидаза термофильного штамма В. lich en iform is предст ав­
ляет собой новы й фермент, отличающийся от описанных к настоящему врем ени аминопептидаз вы сокой термостабильностью, обусловли ваем ой , вероятно, присутствием в
м олекуле фермента одной или нескольких ди сульф идны х связей.
Б ак тер и и рода B acillus характери зую тся набором вы сокоактив­
ных секреторны х протеолитических ферментов, осущ ествляю щ их д е ­
струкцию р азн ооб разн ы х белковы х субстратов, в том числе и с о б р азо ­
ванием свободны х аминокислот. В то врем я к а к эндопептидазы (субтилизины и м еталлозависим ы е протеиназы ) исследованы глубоко и все­
сторонне, экзоп еп тнд азам уд еляется меньш е внимания. Эти ферменты,
к а к правило,
являю тся внутриклеточным и, но у некоторы х бац илл
(возмож но, в определенны х условиях) они секретнрую тся клеткам и .
К настоящ ем у времени н аи более подробно исследованы внутриклеточ­
ные ам инопептидазы B a cillu s subtilis и В. stearo th erm oph ilusf и лиш ь
небольш ое количество р аб от посвящ ено внеклеточны м аминопептидазам бацилл [1, 8, 12, 13, 17].
Способность гидролизовать небольш ие пептиды бы ла обнаруж ен а
нам и у терм офильного ш там м а В. licheniform is [8]. О на обусловлена
активностью внеклеточны х экзопептидаз, отщ епляю щ их концевые ам и ­
нокислоты. П ри этом отщ епление N -концевых ам инокислот происходи­
ло значительно активнее, чем ам инокислот со свободной кар б о к си ль­
ной группой. Выделению , очистке и изучению свойств ф ерм ента, оп ре­
деляю щ его ам инопептидазную активность указан ного ш там м а, и по­
свящ ена н астоящ ая работа.
М атериал и метедш . Термофильный штамм В. lich en iform is культивировали при
4 5 °С глубинным способом на качалках на среде следую щ его состава (в г /л ): сухие
клетки пекарских д р о ж ж ей — 20; К Н 2Р 0 4 — 1; M g S 0 4 — 2.
Вы деление активного материала из культуральной ж идкости осуществляли путем
высаливания сернокислым аммонием (80% насыщ ения).
Этапы очистки аминопептидазы:
1. И о н о о б м е н н а я
хроматография
на
ДЭАЭ-целлюлозе.
Отдиализованный против воды и лиофильно высушенный ферментный препарат (около
500 мг) растворяли в 50 мМ трис-Н С1-буфере pH 7,5 и наносили на колонку разм ером
1 ,5X 23 см. Элюцию осущ ествляли тем ж е буф ером со скоростью 25 мл/ч.
2. Х р о м а т о г р а ф и я н а б а ц н т р а ц и н - с и л о х р о м е . Белковый материал,
не сорбировавш ийся на Д Э А Э -целлю лозе в указанны х выше условиях и содерж авш ий
аминопептидазу, наносили на колонку размером 3 X 4 см. Элюцию осущ ествляли 50 мМ
трис-НС1-буфером pH 8,5 со скоростью 300 мл/ч.
3. Г е л ь-х р о м а т о г р а ф и я
н а T S К-г е л е Н W -55
(«Т о у o-S о б а » , Я п о ­
н и я ) . М атериал, не связавш ийся с бацитрацин-силохромом и проявляющий аминопеп­
тидазную активность, подвергали гель-хроматографии на T SK -геле, сконцентрировав
его предварительно в 10 раз на роторном испарителе. Р азм ер колонки 1 ,2X 46,0 см,
элюцию проводили в 50 мМ трнс-Н С1-буфере pH 7,5 с 1 М N aC l со скоростью 30 мл/ч.
На всех этапах очистки аминопептидазы осуществляли контроль аминопептидазной и протеолитической активности. При этом первую из них определяли нингидриновым методом [9] с использованием в качестве субстрата 1 мМ, раствора лейцил-глицил-глицина (L eu-G ly-G ly). О бщ ую активность эндопептидаз (ы) определяли по м ето­
М ИКРОБИ О Л.
Ж У РН .,
1989,
51,
№ 2
47
д у Ансона в модификации П етровой [6]. Субстратом служ ил 1 %-й раствор казеина
по Хаммерстену.
При исследовании физико-химических свойств аминопептидазы
термофильной
спорообразую щ ей бактерии В. lich en iform is активность определяли по гидролизу х р о ­
могенного субстрата — п-нитроанилида лейцина (L eu-pN A ). Реакционная смесь содер ­
ж ал а (если не указано иначе) 50 мкл ферментного раствора (30— 5 0 мкг белка), 50 мкл
2,5 мМ раствора Leu-pN A и 50 мМ трис-НС1-буфер pH 7,5 д о общ его объем а 1500 мкл.
Температура реакции составляла 6 0 °С (если не указано иначе), время реакции —
10 мин. О б активности судили по изменению оптической плотности реакционной смеси
вследствие освобож дения п-нитроанилина (405 нм, 1-сантиметровая кю вета). Количе­
ство окрашенного продукта рассчитывали, исходя из значения его коэффициента м о­
лярной экстянкции 9620 М -1 см -1 . З а единицу активности принято количество фермен­
та, катализирующ ее образование 1 мкмоль п-нитроанилина в условиях опыта за 1 мин.
Влияние состава и pH буф ер а на активность аминопептидазы исследовали в
50 мМ трис-ацетатном, ацетатном, цитратно-фосфатном и трис-НС1-буферных растворах
в области значений pH от 5,0 д о 9,5.
При изучении влияния ряда веществ различной природы на активность амино­
пептидазы ферментный раствор преинкубировали с эффектором в концентрации 1 мМ
(если не указано иначе) в течение 30 мин при 60 °С, после чего прибавляли в пробу
субстрат и определяли активность фермента в стандартных условиях. В качестве э ф ­
ф екторов были исследованы ионы двухвалентных металлов; анионы, входящ ие в на­
иболее часто применяемые буферные смеси; вещества, связывающие двухвалентные
металлы; реагенты на S H -группы; вещества, восстанавливающ ие дисульфидную связь,
и ингибиторы ферментов, содерж ащ их серии в активном центре. Влияние ионов д в у х ­
валентных металлов определяли после диализа ферментного раствора против 1 мМ
раствора Э Д Т А в течение 20 ч с последующ им диализом раствора от избытка Э Д Т А
против воды.
Концентрацию белка в растворах определяли по м етоду Л оури.
М олекулярную массу определяли методом
гель-фильтрации [7] на ТБКтгеле
H W -55 (50 мМ трис-НС1-буфер pH 8,3 с 0,1 М N a C l). Колонку калибровали бычьим
сывороточным альбумином (66 кдальтон), овальбумином (45 кдальтон), химиотрипсиногеном (25 кдальтон) и цитохромом С (12,3 кдальтон).
Э лектрофорез в П ААГ проводили в пластинах с 7,5 %-м гелем и 1 % додецилсульф атом Na в щелочной системе (pH 8 ,6 ). Белковые полосы окрашивали кумассибриллиант-голубым G-250.
О пределение К м проводили графическим методом [2]. И з графика зависимости
двойных обратных величин
(Л айнуивера— Берка)
была рассчитана максимальная
скорость (К т а х ). При определении К м и Ушах количество субстрата в пробе варьиро­
вало от 12,5 д о 125 нмоль.
Константы ингибирования для ДТТ, Э Д Т А и о-фенантролина были рассчитаны
по формуле:
гд е V0 — начальная скорость реакции в отсутствие ингибитора, ед/м и н; К,- — началь­
ная скорость реакции в присутствии ингибитора, ед/м и н; [ / ] — концентрация ингиби­
тора, М ; К г —-константа ингибирования, М [2 ].
Результаты и их обсуж дение. Ф ерм ент, отщ епляю щ ий концевую
ам инокислоту со свободной аминогруппой, был выделен из смеси вне­
клеточны х белков терм оф ильной бациллы , т. е. из неочищ енного ф ер ­
ментного п реп арата, полученного при вы саливании белков сернокислы м
ам монием , путем колоночной хром атограф ии. С ледует ск азать, что ряд
бал л астн ы х белков и коричневы й пигмент были удален ы из ф ерм ентно­
го п р еп ар ата на этап е хром атограф и и на Д Э А Э -целлю лозе. Н а всех
этап ах очистки этого ф ерм ен та вели контроль не только аминопептидазной, но и казеинолитической активности. П оследнее вы звано тем,
что особенно важ н ы м было отделение ам инопептидазы от сериновой
протеиназы , активный биосинтез которой осущ ествляется терм оф ильной
В. licheniform is [5]. А т а к к а к д л я этой протеиназы , к а к и д л я других
субтилизинов, х ар а к тер н а ш и рокая специфичность [3], н ельзя было
исклю чать возмож ность, что гидролиз низком олекулярного суб страта
яв л яется следствием действия сериновой протеиназы.
О тделение ам инопептидазы от протеиназы было достигнуто при
хром атограф ии н а бацитрацин-силохром е: если сериновая п ротеи наза
полностью связы вал ась с бацитрацином своим специфическим л и га н ­
дом, то до 80 % ам инопептидазной активности, нанесенной н а колонку,
элю и ровалось со стартовы м буфером (ф ракц ия 1, именуем ая далее
фракцией Б цс-1).
48
М ИКРОБИОЛ.
Ж У Р Н ..'
1989,
51,
№
2
Д альн ей ш ую очистку ам инопептидазы осущ ествляли н а T S K -геле
HW -55. П ри этом ф ракц и я Бцс-1 р азд ел и л ась н а три белковы х пика, и
в первых двух о б н аруж и вали ам инопептидазную активность (рис. 1).
О казал о сь, что гомогенным (при электроф ор езе в денатурирую щ ей си­
стем е)
явл яется только м атери ал 2-го пика, содерж ащ ий основную
часть
активности. Он соответствует б елку с м олекулярной массой
60 кдальтон, тогда к а к в 1-м пике содерж ится белок с молекулярной
м ассой 110 кдальтон (по данны м гель-ф и льтраци и на колонке TSK -reл я ) . И звестно, что некоторы е ам инопептидазы бацилл образую т субъ-
Рис. 1. Р азделен ие аминопептидазы на T SK -геле H W -55. 1 — элюционный
Е 28о; 2 — активность аминопептидазы.
Рис. 2. Влияние pH на активность аминопептидазы. 1 — трис-ацетатный
трис-НС1-буфер.
профиль,
буф ер; 2 —
единичны е структуры [16] или агрегаты [1]. П оэтом у мож но п ред пола­
гать, что в 1-м белковом пике находится димер исследуемой ам ино­
пептидазы .
Основные этап ы очистки ам инопептидазы представлены в таблице.
Р аб о ту по исследованию физико-химических свойств ам инопептидазы
проводили с гомогенным м атери алом 2-го пика.
У становлено, что ф ерм ент активен при pH 5,5— 9,5, причем область
оп тим альн ы х значений pH находится м еж ду 7,5 и 8,5 (рис. 2 ). А ктив­
ность ф ерм ента зави сел а не только от концентрации водородных ионов,
но и в определенной степени от состава буф ера: ион ц и трата в 50 мМ
Очистка аминопептидазы В . licheniform is
Активность
Белок
Объем,
мл
Препарат, фракция
К ультуральная ж и д ­
кость
Раствор ферментного
препарата (осаж дени е
сернокислым аммони­
ем )
Д Э А Э -целлю лоза,
фракция 1
Бацитрацин-силохром,
фракция 1
T SK -гель HW -55, фрак­
ция 1
TSK -гель HW -55,
фракция 2
М ИКРО БИ О Л.
Ж У Р Н .,
19&9,
Удельная
акти в­
ность,
Выход,
Ед на 1 мг
%
белка
О чистка,
количест­
во раз
мг/мл
Всего,
мг
Ед/мл
Всего,
Ед
2 , 16
8 4 2 ,4
4 ,4 5
1735,5
100
2 ,0 6
1
85
3 ,7
3 1 4 ,5
15,22
1293,7
7 4 ,5
4, 11
2
250
0 ,6 1
152,5
4 ,0 8
1020,0
5 8 ,8
6 ,6 9
3 ,2 5
250
0 ,4 2
105,0
3 ,2 5
8 1 2 ,5
4 6 ,8
7 ,7 4
3 ,7 5
40
0 ,6 3 8
2 5 ,5 2
3 ,2 7 5
131,0
5 ,1 9
2 ,5
50
0 ,1 4 2
7 ,1
390
51,
№
2
10,34
4 -9 -5 6
5 1 7 ,0
7 ,5 4
2 9 ,8
7 2 ,8
3 5 ,3
44
концентрации актишф ^ал фермент ( ~ 3 0 % ), ион хлора несколько сни­
ж а л активность, а сульф ат- и борат-ионы у ж е при концентрации 10“ 3 М.
п о давл яли активное,::, ам инопептидазы почти наполовину. О дн овалент­
ные катионы , обычно плодящ ие в состав буферов, практически не в л и я ­
л и н а ферм ент. Б олее чувствительным он о к а за л с я к действию ионов
двухвалентны х мега/.-лш . д и али з против Э Д ТА (10~3 М ) ф ракци и Бцс-1
сн и ж ал активность ам инопептидазы в 2,5 р а за . А ктивность можно бы л о
не только восстановить, но и значительно повысить ионами к о б ал ь та.
М енее эф ф ективны ми о казал и сь ионы ц ин ка (рис. 3 ). С л аб о е активи ру­
ющее действие на ф ерм ент, обработанны й ЭД ТА , о казы в ал и ионы м е д а
55
85
85
75
. Э5
Рис. 3. Восстановление активности аминопептидазы, обработанной Э Д ТА , ионами
С о 2+ ( / ) и ионами Z n2+ (2). Активность необработанной аминопептидазы 100 %.
Рис. 4. Влияние температуры на активность аминопептидазы.
(наблю даем ы й эф ф ект был на порядок ниж е, чем с ионами ц инка) и
кал ь ц и я (на 1 5 % ниж е действия м еди). Н и какого влияния на актив­
ность ам инопептидазы не о к азы вал и ионы M g 2+, M n 2+, N i2+.
П ри исследовании влияния тем пературы в и нтервале значений 30—
9 5 °С на скорость гидроли за хромогеппого субстрата ам инопептидазой
установлено, что тем пературны й оптимум ф ерм ента находится в о б л а ­
сти 75— 95 °С (рис. 4 ). П ри этом стабильность ам инопептидазы в при­
сутствии субстрата очень вы сока: так, при 90 °С линейность реакции не
н ар у ш ал ась в течение 120 мин. П рогревани е ам инопептидазы без суб­
стр а т а в 50 мМ трис-Н С1-буфере pH 8,0 в течение 4 ч при 70 °С в ы зы в а­
ло сниж ение активности ф ерм ен та н а 25 %, а врем я полуинактивации
ам инопептидазы
при 90 °С составляло 145 мин. М енее стойким был
ф ерм ен т при pH выш е 9,5 и в кислы х растворах: при 60 °С ферм ент з а
1 ч при pH 5,0 терял половину активности, а при pH 9,5—25 %. Н е ­
см отря на то, что многие из ам инопептидаз бацилл являю тся тер м о ста­
бильны ми белкам и, исследуем ы й ферм ент превосходит все остальны е.
Т ак ая вы сокая терм остабильность, несомненно, св яза н а с определен­
ными структурны ми особенностям и ферм ента.
И н ф орм аци я о некоторы х особенностях структурной орган и зац ии
м олекулы ам инопептидазы бы ла получена при исследовании влияни я
ингибиторов различны х групп н а каталитическую активность ф ерм ен та.
О казал ось,
что дитиотрейтол (Д Т Т ) — реагент, восстанавливаю щ ий
дисульф идную связь, угнетает активность ф ерм ен та полностью при кон ­
центрации 10-4 М (рис. 5, а ) , а п арахлорм еркури йб ен зоат (П Х М Б)
при этой ж е концентрации повы ш ает ее в 4,5 р а з а (рис. 5, б ). Н а ос­
новании результатов измерения начальной скорости гидроли за суб стра­
та ам инопептидазой В. licheniform is в присутствии Д Т Т в разли чн ы х
концентрациях бы ла рассчитана кон станта ингибирования, составляю ­
щ ая 6 X 1 0 -6 М. П орядок этой величины п озволяет сд ел ать вывод о р е­
50
М ИКРОБИОЛ.
Ж У РН .,
1989 ,
51,
№ 2
ш аю щ ем значении дисульф идны х связей в создании нативной конф игу­
рации молекулы исследуемого ф ерм ента. К настоящ ем у времени не опи­
саны ам инопептидазы бацилл, содерж ащ и е дисульф идны е связи.
У становленны й ранее ф ак т сниж ения активности ам инопептидазы A s ­
p erg illu s oryzae довольно высокими концентрациям и ( 4 х Ю -3 М ) р е­
дуцирую щ их вещ еств (цистеина, p -м еркап тоэтан ола) авторы [4] о б ъ ­
ясняю т
тем, что реагенты связы ваю т м еталл в активном центре.
Н аблю д аем ое нами действие Д Т Т на исследуемый фермент, очевидно,
носит другой х ар актер и у к а зы в ае т на специфическое воздействие ин­
гибитора н а дисульфидную связь. Н али чие одной или нескольких ди-
Рис. 5. Влияние эффекторов на активность аминопептидазы: а — ДТТ; б — ПХМБ; а —
о-фенантролин (сплошная линия) и Э Д Т А (пунктир). К — активность аминопептидазы
без эффектора.
сульф идны х связей в молекуле ам инопептидазы терм офильной б ак те­
рии В. licheniform is д ел ает ее очень прочной структурой, д л я н аруш е­
ния
которой требую тся
значительны е
энергетические затраты .
В е р о я т н а именно эта особенность и определяет высокую терм остаб и ль­
ность исследуемого ферм ента. М ож но предполож ить, что это свойство
возникло в эволю ционном процессе вида и связан о с физиологическими
особенностям и ш там м а, вегетирую щ его при тем пературе до 54 °С.
Активность очищенной ам инопептидазы , так ж е, к ак и частично
очищ енной, сущ ественно угн еталась хетато р ам и двухвалентны х м е тал ­
лов, однако эф ф ективность м еталлосвязы ваю щ и х агентов к ак ингиби­
торов исследуемого ф ерм ента на 2— 3 п орядка ниже, чем эф ф екти в­
ность Д Т Т (рис. 5, в). К,- для о-ф енангроли н а составляет 10-4 М, д ля
ЭД ТА — 8 х Ю - 4 М.
В оптим альны х условиях (pH 8,3; тем п ература 80 °С; присутствие
С 0 2+, 10~4 М ) ам ин оп еп тидаза В. licheniform is ги дроли зовала синте­
тический трипептид лейцил-глицил-глицин и хромогенный субстрат
Leu-pN A в соответствии с кинетикой М и хаэли са — М ентен. И сходя из
гр аф и ка зависим ости двойных обратны х величин д л я последнего суб­
ст р а та были рассчитаны зн ачен ия К м (1,25 мМ ) и Vmax (74,5 Е д ).
А м инопептидаза т ак ж е ги дроли зовала п-нитроанилиды лизин а, арги ­
нина и глутаминовой кислоты со скоростью, составляю щ ей от ско­
рости гидроли за Leu-pN A соответственно 70,6; 37,4 и 12,9 %. п-Нитроанилиды
ал ан и н а и пролина ферм ентом не расщ еплялись. Ф ермент
гидроли зовал лейцинам ид, хотя и с небольш ой скоростью .
Н есм отря на то, что был испытан д ал еко не полный набор анилидов аминокислот, можно заклю чить, что специфичность исследуемого
ф ерм ента аналогична специфичности ранее описанной ам инопептидазы
мезофильного ш там м а В. licheniformis [13], однако к атал и ти ч еск ая
активность первого на порядок выше.
И так, из культуральной ж идкости терм оф ильного ш там м а В. liche­
n ifo rm is вы делена и очищ ена новая ам инопептидаза, отли чаю щ аяся
особенностями структурной организации, высокой каталитической ак­
тивностью и чрезвычайной терм остабильностью от описанны х ранее
ам инопептидаз этого ж е вида микроорганизм ов [8, 13], а та к ж е от тер ­
м остабильны х ам инопептидаз других бацилл [10, 11, 14, 15, 16].
М ИКРОБИОЛ.
Ж У Р Н .,
1939,
51,
№
2
4*
51
A M IN O P E P T ID A SE O F THE TH ER M O PH ILIC STR AIN
O F B A C IL L U S L IC H E N IF O R M IS
I. N. P a v lo v a , Т. V. R o ta n o v a , L. G. Z h oln er
Summar y
A m inopeptidase is isolated and purified from the culture liquid of the therm ophilic
strain of B a cillu s licheniform is. The am inopeptidase predom inantly sp lits o ff N -term inal
leucin in short peptides and hyd rolyzes leucinam ide as w ell. The m olecular w e ig h t of
the en zym e is about 60 kD a. The enzym e is able to form a g g r eg a te s.
O ptim um of am inopeptid ase activ ity w a s dem onstrated at pH 8.0-8.3 and tem pera­
ture of 85 °C. The enzym e is in activated by m etal-b in d in g reagen ts and reducing su b­
stan ces, and is activated by cobalt and PCM B ions. The E D T A -inactivated enzym e
activity is reduced by cobalt and zinc ions, how ever the latter has no activ a tin g action.
The en zym e under stu d y is characterized by high therm ostability: in the presence
of .th e su bstrate at the tem perature of 90 °C the reaction lin earity is retained for not
le ss than 2 h and w ithout the substrate the h a lf-life of the am inopeptid ase at 90 °C
is 145 m in.
E xtracellu lar am inopeptid ase of the therm ophilic strain of B. lich en iform is is a
new enzym e d ifferin g from the am inopeptid ases described by the present in high therm o­
stab ility, induced, evid en tly, by the presence of one or several disulphide bonds in the
enzym e m olecule.
1. В а га н о ва Т. И., И ва н о ва H. М., К леп и кова Ф. С, и др. Вы деление и свойства ами­
нопептидазы
из
B acillu s
th u rin g ien sis / / Биохимия.— 1984.— 49,
№ 11.—
С. 1899— 1907.
2. Д и ксон М., У эбб Э. Ферменты.— М. : Мир, 1982.— 392 с.
3. Ж о л н е р Л . Г., П а вл о ва И. Н., Тиньянова Н. 3. П ротеазы и их роль в литической
активности термофильного штамма B acillu s sp. 86 / / М икробиол. ж урн.— 1988.—
50, № 1 — С. 20—25.
4. И ва н о ва И. М., В а га н о ва Т. И., Стронгин А. Я., Степанов В. М . Выделение и
свойства лейцинаминопептидазы из A sp e rg illu s o ry za e / / Биохимия.— 1977.— 42,
№ 5,— С. 843— 849.
5. П а вл о ва И. И., Ж о л н е р Л . Г., З а х а р о в а И.. Я . и др. Сериновая протеиназа с литическими свойствами //М и к р о б и о л о ги я .— 1988.— 57, № 3.— С. 398— 404.
6. Петрова И. С., Винцюнайте М . М. Определение протеолитической активности ф ер­
ментных препаратов микробиологического происхож дения / / Прикл. биохимия и
микробиология.— 1966.— 2, № 3.— С. 322— 327.
7. A n d r e w s P. The g e l filtration behaviour of proteins related to their m olecular w e ig h t
over a w ide ran ge 11 Biochem . J.— 1965.— 96, N 4.— P. 595— 606.
8. H a ll F. F., K u n kel H. O., P re sc o tt J. M . M ultip le proteolytic en zym es of B acillu s
lich en iform is / / Arch. Biochem . and B ioph ys.— 1966.— 114, N 1.— P. 145— 153.
9. M a th eso n T. A m odified Yemm and C ocking nynhydrin reagen t for peptidase a s s a y / /
Can. J. B iochem .— 1964.— 42, N 1.— P. 95— 103.
10. M a tsu m u ra Y M i n a m i u r a N„ F uku m oto I., Y am am oto T. In tracellular peptidases
of B a c illu s su b tilis / / A gr. B iol. Chem .— 1971.— 35, N 5.— P. 975—982.
11. M y rin P. A ., H o fste n В. V. P u rification and m etal activation of an am inopeptidase
from B acillu s stea ro th erm o p h ilu s / / B iochim . et biophys. acta.-— 1974.— 350, N 1.—
P. 13— 25.
12. R a y L. E„ W agn er F. W. C haracteristics of an am inopeptid ase activ ity from the
cultural fluid of B a c illu s su b tilis / / Can. J. M icrobiol.— 1972.— 18, N 6.— P. 853— 859.
13. R o d rig u e z-A b s i I., P re sc o tt I. M . Isolation and properties of an am inopeptid ase from
B a c illu s lich en iform is //A r c h . Biochem . and B ioph ys.— 1978.— 186, N 2.— P. 383 391.
14. R on cari G„ Z u ber H. Therm ophilic am inopeptid ases from B a cillu s ste a ro th e rm o p h i­
lu s I I Int. J. P rotein R es.— 1969.—■1, N 1.— P. 45— 61.
15. S to ll E„ W eder H„ Z uber H. A m inop ep tid ase II from B a c illu s s te a r o th e r m o p h ilu s //
Biochim . et biophys. acta.— 1976.— 438, N 1.— P. 212— 220.
16. S to ll E„ H erm o d so n M . A ., E ric sso n L. H „ Z u ber H. Subunit structure of the therm o­
philic am inopeptidase 1 from B a cillu s ste a ro th e rm o p h illu s / / B ioch em istry.— 1972.
11, N 25,— P. 4731— 4735.
17. W agn er F. W ., C hu ng L. E„ R a y L. E. C haracteristics of an am inopeptid ase from
B a c illu s su b stilis as an extracellular e n z y m e //C a n . J. M icrobiol.— 1972.— 18, N 10.
P. 1883— 1891.
nllM
Получено 22.11.88
52
М ИКРО БИ О Л.
Ж У Р И .,
1989,
51,
№
2