П Л а б о р а т о р н...

Лабораторная диагностика
УДК 615.015.38:57.086
МИНОРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ МЕТАБОЛИЗМА В РЕГУЛЯЦИИ
БЕЛОК-БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ
Ф.Н. Гильмиярова, В.М. Радомская, Е.А. Рыскина, О.А. Гусякова,
Н.А. Колотьева, Е.А. Шахнович, Н.А. Нефедова, А.А. Чудинова,
ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет»
Гильмиярова Фрида Насыровна – e-mail: [email protected]
Изучено влияние малых молекул – этанола и пирувата – на каталитические и рецепторные белки.
Установлено,
что
этанол
активирует
глицеральдегидфосфатдегидрогеназу,
-глицерофосфатдегидрогеназу, лактатдегидрогеназу, лизату эритроцитов, а также
изолированные гомогенные белки. Пируват специфично изменяет узнавание, полноту
взаимодействия антигенов А и В эритроцитов А (II), В (III), АВ (IV) групп крови с антителами, что
визуализировано конфокальной микроскопией, проточной цитофлуорометрией.
Ключевые слова: малые молекулы, регуляция межмолекулярного
взаимодействия, антигены, группы крови АВО..
П
олучение информации о метаболомном ресурсе органов, тканей и биологических жидкостей не только диагностически значимо, но может быть источником новых
представлений о молекулярных регуляторных механизмах в
норме и патологии.
В обменных процессах значимую роль выполняют высокомолекулярные соединения, в частности, белки и в первую очередь ферменты, обеспечивающие превращения
субстратов в продукты по путям метаболизма.
Низкомолекулярные вещества служат объектом каталитического действия, выполняют важнейшую роль информационных молекул, регулируя деятельность биомолекул в
различных компартментах клетки, во внеклеточном пространстве, в биологических жидкостях. Являясь продуктами ферментативного или неферментативного превращения, метаболиты создают микроокружение, среду, в которой функционируют ферменты, надмолекулярные комплексы в мембранах, тем самым несут информацию о
реальных потребностях, образуя своеобразную память о
молекулярном событии [1, 2]. Качество взаимодействия во
многом определяется малыми молекулами, их концентрацией, структурой, стерическими, электростатическими
свойствами, которые модулируют деятельность высокомолекулярных соединений. Небольшие изменения конформации могут изменить ориентацию лиганда в активном,
аллостерическом центре. Это определит характер процесса,
его направленность[3, 4, 5].
В качестве объекта изучения информационнорегуляторной роли низкомолекулярных соединений в процессах метаболизма нами выбрано два типа белков:
во-первых, ферменты, функция которых реализуется каталитической активностью и таким образом визуализируется.
Во-вторых – антигены системы АВО, скорость и полнота
образования комплексов с антителами определяется
структурно-конформационным соответствием. Факторами,
181
регуляторный потенциал которых оценивается, выбраны
этанол, низкомолекулярное соединение с высокой физикохимической активностью, экзогенной и эндогенной природы и естественный метаболит пируват.
Цель исследования: оценить возможность малых молекул моделировать функцию белков, влиять на процесс межмолекулярного взаимодействия.
Материал и методы
В условиях in vitro этанол в конечной концентрации 0,3 мМ
в течение 5 минут инкубировался при температуре 25°С с
препаратами ферментов – глицеральдегидрофосфатдегидрогеназой (КФ 1.1.1.12), -глицерофосфатдегидрогеназой (КФ 1.1.1.8), лактатдегидрогеназой (КФ
1.1.1.27). Активность ферментов определялась спектрофотометрически на спектрометре Lambda 20 (PerkinElmer,
Швейцария). Аналогичные условия проведения экспериментов с гемолизатом, полученным разведением крови 1:10.
Для изучения биологического действия пирувата на
антигены А, В, А(II), В(III), AB(IV) группы крови системы
АВО перед постановкой реакции гемагглютинации эритроциты инкубировали с раствором пирувата в конечной
концентрации 2мМ. Агглютинация подсчитывалась по
W. Marsh с индикацией степени агглютинации (балльная
оценка интенсивности агглютинации – pt).Визуализация
белок-белковых комплексов проводилась при помощи
экспериментального стенда, который реализован на базе
конфокального оптического микроскопа OlympusIX 71
(Olympus, Япония), конфокального сканирующего блока
и лазерного комбайна (фирма ANDOR); на проточном
цитофлуориметре FACSCalibur компании Beckton Dikinson
(США), с использованием специфичных моноклональных конъюгированных антител BloodgroupA-antigen
(Z2A), BloodgroupB-antigen (89-F), меченными флуоресцеинизотиоционатом (FITC) фирмы SantaCruzbiotechnology,
Inc, (США).
№ 2 (26) май 2013 МЕДИЦИНСКИЙ А ЛЬМАНАХ
Л АБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
It is studied influence of small molecules – ethanol and piruvat on catalytic and receptor proteins. It is
established that ethanol activates gluceraldegidfosfatdegidrogenaza, -glucerofosfatdegidrogenaza, laktatdegidrogenaza, a lysate of erythrocytes, and also the isolated homogeneous proteins. Piruvat is specific change recognition, completeness of interaction of antigenes A and B erythrocytes of A(II), B (III), AB
(IV) blood types with antibodies that is visualized by confocal microscopy, a flowing fluorometry.
Key words: small molecules, regulation of intermolecular interaction, antigens, blood types ABO..
Лабораторная диагностика
РИС. 1.
Активность дегидрогеназ гемолизата, модифицируемая этанолом.
РИС. 2.
Влияние этанола на активность изолированных ферментов.
А
РИС. 3.
Б
Л АБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
Экспрессия антигенов АВО системы крови после инкубации
пируватом (а) антиген А(II) группы крови; (б) антиген
В(III) группы крови.
А
Б
В
Г
РИС. 4.
Микроскопическая картина образования комплексов антиген –
антитело, меченных флуорохромом FITC в режиме флуоресценции:
(а) эритроциты A(II) группы крови; (б) эритроциты А(II) группы
крови после инкубации с пируватом; (в) эритроциты В(III) группы
крови; (г) эритроциты В(III) группы крови после инкубации
с пируватом
182
Статистический анализ данных проводили в среде статистического пакета прикладных программ SPSS 12.0 и в программе MSEXCEL 2007.
Результаты и их обсуждение
Установлено, что в лизате эритроцитов удельная активность ГАФД, ключевого фермента гликолиза, в среднем
составляет 0,255±0,001 Е/мг. Этанол вызывает значительное
повышение дегидрогеназной активности фермента (рис. 1).
Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (Д-глицеральдегид-3-фосфат:НАД-оксидоредуктазафосфорилирующая
КФ 1.2.1.12) катализирует обратимое окислительное фосфорилирование Д-глицеральдегид-3-фосфата до 1,3-дифосфоглицерата, используя НАД в качестве кофермента. В
настоящее время расшифрована структура ГАФД из различных тканей млекопитающих. Существует представление, что
ГАФД – это тетрамер, организованный как димер с тремя
неэквивалентными поверхностями [6].
Выявленное нами усиление активности ГАФД гемолизата
после инкубации с этанолом свидетельствует о том, что этиловый спирт, обладающий реакционоспособной гидроксильной группой в силу наличия короткого двууглеродного
радикала и незначительного индуктивного эффекта, может
вступить в донорно-акцепторные отношения с функциональными группами апофермента, что ведет к повышению
его реакционной способности. Наличие катионных и анионных локусов в холоферменте ГАФД создает реальные условия для взаимодействия с низкомолекулярными лигандами,
что может вызвать стерические, конформационные изменения, активацию функциональных групп, повышение активности фермента, так как создает благоприятные условия для
протекания катализа [6]. Следует учесть, что действие этанола на активность ГАФД изучалось в системе гемолизата, т. е.
в многокомпонентной среде из высоко- и низкомолекулярных соединений сразличными свойствами. Нельзя исключить в этих условиях, наряду с прямым действием этанола, и
косвенные эффекты, т. е. опосредованные взаимодействием
этилового спирта с другими реакционоспособными соединениями и создание оптимального микроокружения для
взаимодействия с коферментом и субстратом.При изучении
действия этанола на активность -глицерофосфатдегидрогеназы установлено, что активность фермента под
действием этанола также увеличивается (рис. 1).
В функциональном отношении -глицерофосфатдегидрогеназа сопряжена с ГАФД, реализуя одну из фосфотриоз в -глицерофосфат, используемый для пластических
целей – в липосинтезе, глюконеогенезе и, кроме того, создает своеобразное депо восстанавливающих эквивалентов в
структуре -глицерофосфата. Димерная молекула
-глицерофосфатдегидрогеназы (-глицерол-3-фосфат:
НАД-оксидоредуктаза, КФ 1.1.1.8) катализирует обратимое
окисление -глицерол-3-фосфата в диоксиацетонфосфат.
В настоящее время фермент охарактеризован и клонирован
из многочисленных источников [6, 7].
Сравнивая активирующее влияние этанола на ГАФД и
-ГФД, очевидно более значимое влияние этанола на глицеральдегидфосфатдегидрогеназу, чем на -глицерофосфатдегидрогеназу. Эти данные свидетельствуют, что эффекты
этанола при одинаковой биодоступности ферментов определяются их субъединичным составом. Есть данные в литературе, свидетельствующие о том, что этанол за счет
№ 2 (26) май 2013 МЕДИЦИНСКИЙ А ЛЬМАНАХ
Лабораторная диагностика
183
генность, роль в формировании иммунного ответа защиты
клеток от чужеродного материала [8, 9, 10, 11]. В этом плане
перспективным является исследование антигенов и антител
АВО системы в качестве объектов межмолекулярных, в том
числе белок-белковых взаимодействий.
В условиях in vitro при инкубации пировиноградной кислоты с эритроцитами А(II) группы крови время начала агглютинации увеличилось по сравнению с контролем и с эритроцитами у В(III) группы крови (таблица 1).
ТАБЛИЦА 1.
Влияние пировиноградной кислоты на антигены А
и В эритроцитов А(II) и В(III) групп крови
6*
6
4+
4+
0
0
0
6,4
6
6
0,51
Агглютинация
4+
4+
Антиген В
В (III)
Время (с)
0
Агглютинация
0
7*
7
16
0,81
Время (с)
4+
4+
Контроль
В (III)
Агглютинация
6*
6
Антиген А
A (II)
Время (с)
Агглютинация
M
Ме
%
SE
* - р <0,05
Время (с)
Контроль
A (II)
4+
4+
0
ТАБЛИЦА 2.
Влияние пировиноградной кислоты на антигены А
и В эритроцитов АВ(IV) группы крови
4+
4+
0,51
0
0
7,4*
7
23
0,51
3,6+
4+
0,51
В аналогичных условиях агглютинация антигенов А и В
эритроцитов АВ(IV) группы крови время агглютинации возросло на 23%, степень агглютинации выражена слабее, чем
в контрольных образцах. Существенно снижается полнота
взаимодействия, процесс преципитации белковых комплексов. При этом нивелируется специфика, характерная для
анти-А и анти-В антигенов (таблица 2).
В основе неоднотипной тенденции выявленных сдвигов
могут быть различия в строении А и В антигенов. Оба они
содержат общий структурный компонент – вещество Н, а
групповую антигенную специфичность, как известно, антигена А определяет то, что у N-ацетилгалактозамина в позиции «С» располагается наиболее реакционно способный
NHCOCH3, а у Д-галактозы В-антигена в этой позиции находится ОН–группа. Специфичность взаимодействия антигенов с антителами определяется особенностями строения
поверхностной структуры антигенов – наличием различных
химических групп, их пространственным расположением
[12, 13].
Нами с целью количественной оценки результатов взаимодействия антигенов и антител при введении малых
№ 2 (26) май 2013 МЕДИЦИНСКИЙ А ЛЬМАНАХ
Л АБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
6*
6
Агглютинация
3,6+
4+
Антиген В
АВ (IV)
Время (с)
0
Агглютинация
0
7,4*
7
23
0,51
Контроль
AВ (IV)
Время (с)
4+
4+
Время (с)
6*
6
Антиген А
AВ (IV)
Агглютинация
M
Ме
%
SE
* - р <0,05
Агглютинация
Контроль
AВ (IV)
Время (с)
неферментативного взаимодействия с функциональными
группами белков модулирует их функцию [7].
Далее нами изучено влияние этанола на активность в
гемолизате лактатдегидрогеназы (рис. 1). Инкубация с этанолом ведет к значимому повышению активности лактатдегидрогеназы, величина сопоставима с уровнем активации
ГАФД. Это может свидетельствовать о сходстве механизмов
влияния этанола на тетрамерные молекулы каталитических
белков и об обеспечении им слаженности и преемственности реакций гликолиза.
Лактатдегидрогеназа(L-лактат-НАД-оксидоредуктаза КФ
1.1.1.27), как известно, катализирует обратимое восстановление пирувата в лактат. Обладая высокой активностью, она
вносит весомый вклад в реокисление НАДН, обеспечивая
цитоплазматические
дегидрогеназы
окисленным
ко-ферментом, создавая условия бесперебойности гликолиза. Фермент регулирует баланс фонда субстратной пары
пируват-лактат, формируя молекулярную базу анаболических и катаболических процессов, в которых лактат служит
фактическим резервом пирувата, используемого в разнообразных превращениях синтеза и распада.
Известно, что гликолитические ферменты, а именно глицеральдегидфосфатдегидрогеназа и лактатдегидрогеназа
ассоциированы со структурными белками клеток, в частности с А-актином, что влияет на кинетические свойства ферментов и вызывает структурное изменение белка, с которым
дегидрогеназы связаны. Таким образом, этанол может непосредственно влиять на макромолекулу белка, создавать
специфическое микроокружение для активного центра, а
также действовать опосредовано через белки, с которыми
ассоциирован фермент (рис. 1).
В экспериментах с изолированными гомогенными ферментами установлено, что тенденция сдвигов, которые
вызывает этанол, аналогична тем, которые выявлены для
гликолитических ферментов гемолизата. Характерно, что в
количественном отношении они значительно менее выражены. Активность глицеральдегидфосфатдегидрогеназы
увеличилась на 30,1%, глицерофосфатдегидрогеназы – на
11,2%, лактатдегидрогеназы – на 26,7% (рис. 2).
Сравнение полученных результатов свидетельствует о
том, что, во-первых, отчетливо прослеживается разница в
количественном изменении активности дегидрогеназ. Она
существенно выше в гемолизате. Очевидно, в условиях
гемолизата суммируются прямое и опосредованное влияние, обусловленное многокомпонентным составом среды, в
которой распределены ферменты. Активирующее действие
этанола на изолированные белки существенно менее выражено (рис. 2). Воспроизводится направленность изменений,
т. е. активация, а также фактическая разница повышения
активности
глицеральдегидфосфатдегидрогеназы,
-глицерофосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы, о
чем свидетельствуют близкие отношения активности ГАФД/
ГФД, ГАФД/ЛДГ, ЛДГ/ГФД ферментов гемолизата и индивидуальных белков. Экстраполируя эти данные к statusvivo,
можно предположить, что поступление экзогенного этанола
закономерно усиливает процесс окислительного метаболизма углеводов, не вызывая изменения соотношения в активной системе НАД-зависимых дегидрогеназ.
Современные представления о структуре и топографии
антигенов А, В, Н позволяют объяснить их высокую иммуно-
Л АБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
Лабораторная диагностика
молекул в систему использован метод проточной цитофлуориметрии (рис. 3).
Установлено, что количество образующихся иммунных
комплексов уменьшилось в образцах А(II) группы, менее
значительно уменьщилось – в В(III) и АВ(IV) группах крови.
При визуализировании комплексов антиген-антитело флуоресцентными зондами с помощью лазерной сканирующей
конфокальной микроскопии выявлено уменьшение пиков
флуоресценции в эритроцитах А(II) и В(III) группы крови
после инкубации с пируватом по сравнению с контролем
(рис. 4).
Пируват, по-видимому, конкурирует за активные реакционно способные группы антигенов А и В с моноклональными
антителами, меченными флуоресцеинизотиоцианатом, что
отражается на конформационной структуре белковой молекулы, способности антигенов образовывать комплексы
антиген–антитело.
Заключение
Полученные данные свидетельствуют о регуляторном влиянии этанола на метаболические процессы за счет прямого
эффекта на ферментные белки и изменение их микроокружения.
Показано, что пируват выполняет регуляторную роль,
определяя характер и интенсивность антиген-антительного
взаимодействия. Он изменяет сродство антигена А к антителу более интенсивно по сравнению с антигеном В, что выражается в уменьшении способности образовывать комплексы
антиген–антитело, снижении степени и увеличении времени
начала агглютинации. Действие пирувата на выраженность
антиген-антительного взаимодействия подтверждено методом проточной цитофлуориметрии, выявившим изменение
количества образующихся иммунных комплексов.
Визуализация антиген-антительных комплексов с помощью
конфокальной микроскопии при введении в систему пирувата позволило выявить уменьшение количества антигенантительных комплексов.
Полученные результаты свидетельствуют об успешном
использовании малых молекул, в частности пирувата, в
184
качестве молекулярных зондов и перспективности применения эритроцитов с экспрессированными на их мембранах
антигенными детерминантами системы АВО для изучения
белок-белковых взаимодействий в силу наглядности визуализации, возможности количественной оценки этого процесса.
ЛИТЕРАТУРА
1.Зимин Ю.В., СяткинС.П., Березов Т.Т. Надмолекулярная регуляция активности некоторых оксидоредуктаз клетки в норме и патологии. Вопросы медицинской химии. 2001. № 3. С. 24-30.
2. Kain К. Usingyeasttounderstandproteinfoldingdiseases: aninterviewwith
SusanLindquist. /Dis. Modelmech. 2008. V. 1. № 1. P. 17-19.
3. Курганов Б.А. Стабильность и фолдинг белков. Биохимия. 1998. Т. 63.
Вып. 3. С. 291-293.
4. Воротников А.В., Крымский М.А., Иринский В.П.Внутриклеточная сигнализация и фосфорилирование белков при сокращении гладких мышц.
Биохимия. 2002. Т. 67. Вып. 12. С. 1587-1610.
5.Плетень А.М. Шапероны и формирование устойчивых к протеазам амилоидных структур. Сб. материалов VI симпозиума «Химия протеолитических
ферментов». М. 2007. 17 с.
6. Skarzynski T., Wonacott A.J. Coenzyme-induced conformational changes in
glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase from Bacilusstearothermophilus.
J. mol. boil. 1988. V. 203/4. P. 1097-1118.
7. Горбунова О.Б. Роль никотиновых холинорецепторов в формировании
совместной зависимости от никотина и этанола. 2. Молекулярные механизмы
действия этанола и его взаимодействие с никотиновымхолинорецептором.
Успехи современной биологии. 2005. Т. 125. № 1. С.48-50.
8. Сахаров Р.С. Кондратова И.В. и др. Современные представления о структуре и функции эритроцитарных антигенов (Обзор литературы к 100-летию
открытия групп крови). Судебно-медицинская экспертиза. 2001. № 5.
С. 38-43.
9. Оловникова Н.И., Николаева Т.Л. Антигены эритроцитов человека.
Гематология и трансфузиология. 2001. № 5. С. 37-45.
10. Донсков С.И. Группы крови в биологии человека – факты и предположения. Гематология и трансфузиология. 2001. Т. 46. № 5. С. 32-33.
11. Smolarek D. et al. Molecularbackground of the AB0 bloodgroupsystem.
PostepyHigMedDosw. (online). 2008. № 62. Р. 4-17.
12. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. М.:
Медицина, 2000. 429 с.
13. Малинка М.К., Петриев В.М., Подгородниченко В.К. Иммунология.
2007. № 1. С. 16-19.
№ 2 (26) май 2013 МЕДИЦИНСКИЙ А ЛЬМАНАХ