ПРОДУЦИРОВАНИЕ ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗ МИЦЕЛИАЛЬНЫМИ

Реклама
Полная исследовательская публикация
Тематический раздел: Химия и технология растительных веществ. _____________________
Подраздел: Биотехнология.
Регистрационный код публикации: 2рс010
Поступила в редакцию 26 июля 2002 года УДК 57.083.132+577.151.54+577.152.32
Тематическое направление: Биотехнология пектинолитических ферментов как инструментов для структурного
исследования растительных полисахаридов. Часть I.
ПРОДУЦИРОВАНИЕ ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗ МИЦЕЛИАЛЬНЫМИ ГРИБАМИ ASPERGILLUS
NIGER ВКМ F-1119 И PENICILLIUM DIERCXII ВКПМ F-152.
© Шубаков Анатолий Александрович* и Елькина Елена Андрияновна+
Отдел молекулярной иммунологии и биотехнологии. Институт физиологии Коми научного центра УрО РАН.
Ул. Первомайская, 50. г. Сыктывкар 167982. Россия. Тел./факс: (8212) 241-001. E–mail: [email protected]
__________________________________________
*Ведущий направление, +Поддерживающий переписку
Ключевые слова: полигалактуроназы, мицелиальные грибы, Aspergillus niger, Penicillium dierckxii, биосинтез
пектинолитических ферментов.
Резюме
Изучено продуцирование полигалактуроназ (ПГ) мицелиальными грибами Aspergillus niger ВКМ F-1119 и Penicillium dierckxii ВКПМ F152. Установлен индуцируемый характер биосинтеза ПГ у обеих культур. Показано, что наиболее активным индуктором является
свекловичный пектин, а для P. dierckxii кроме того, зостеран – пектин морских трав сем. Zosteraceae. Установлено, что наиболее эффективным
источником азота для обеих культур является сульфат аммония в концентрации 2.5 г/л. Максимальное продуцирование ПГ грибом A. niger
наблюдается при исходном значении рН среды 3.0-4.0, а образование ПГ грибом P. dierckxii существенно не зависит от исходного значения рН
среды. Найдено, что P. dierckxii является более активным продуцентом ПГ, чем A. niger.
Введение
В природе метаболизм пектиновых веществ, в основе которых лежит главная линейная углеводная цепь из α-1,4связанных остатков D-галактуроновой кислоты, обусловлен действием различных ферментов-пектиназ, таких как
полигалактуроназы, рамногалактуроназы, метилгалактуроназы, пектинметилэстеразы, пектат- и пектинлиазы [1].
Пектиназы участвуют в различных физиологических процессах, происходящих в растениях, в частности, в созревании
плодов [2]. Пектинолитические ферменты микроорганизмов играют важную роль в патогенезе растений [3]. Пектиназы являются
перспективными для получения углеводсодержащих соединений, обладающих иммуномодулирующей активностью, для
получения протопластов в клеточной инженерии, в селекции растений, а также для осветления соков и вин [2-4]. Пектиназы
являются одним из инструментов для исследования структуры пектиновых полисахаридов [5]. Полигалактуроназы (ПГ, КФ
3.2.1.15) обладают эндо-карбогидразной активностью и катализируют гидролитическое расщепление α-(1→4)-гликозидных связей
между неэтерифицированными остатками D-галактопиранозилуроновой кислоты в углеводной линейной цепи галактуронана –
кора пектиновых полисахаридов [2].
ПГ синтезируются высшими растениями, рядом бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов [6,7]. Одним из основных
источников получения ПГ служат мицелиальные грибы, характерной особенностью которых является способность
продуцировать широкий спектр внеклеточных пектиназ [8].
Препаративное получение ферментов-пектиназ с высоким выходом может быть достигнуто путем поиска новых
эффективных продуцентов, мутагенезом, использованием генно-инженерных методов, оптимизацией культивирования
продуцентов [9]. Одним из простых и доступных приемов для получения ферментных препаратов с высокой ПГактивностью является отработка оптимальных условий культивирования продуцента.
Данная работа посвящена сравнительному изучению продуцирования ПГ мицелиальными грибами Aspergillus niger
ВКМ F-1119 и Penicillium dierckxii ВКПМ F-152.
Шубаков Анатолий Александрович – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник.
1958 года рождения, в 1981 году закончил Сыктывкарский госуниверситет по специальности биология.
С 1988 года работает в Институте физиологии Коми НЦ УрО РАН. В 1991 году закончил аспирантуру
Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (г. Пущино) по спец. биотехнология.
Кандидат биологических наук с 1994 года. Сфера научных интересов Шубакова А.А. микробиология и
биотехнология. Занимается исследованиями регуляции биосинтеза ксиланаз и пектиназ у дрожжей и
мицелиальных грибов. Шубаков А.А. является автором 15 печатных работ и совместно с сотрудниками
Лесного института имеет патент на способ отбеливания целлюлозы. Преподает в Лесном институте и в
Сыктывкарском госуниверситете. Под его руководством защищено 15 дипломных работ.
Елькина Елена Андрияновна – младший научный сотрудник. 1975 года рождения, в 1998 году
закончила Лесной институт по специальности инженер-химик. С 1992 года работает в Институте
физиологии Коми НЦ УрО РАН. Сфера научных интересов Елькиной Е.А. микробиология и
биотехнология. Занимается исследованиями регуляции биосинтеза ксиланаз и пектиназ у дрожжей и
мицелиальных грибов, а также регуляторами роста растений. Елькина Е.А. является автором 7
печатных работ. Преподает в Лесном институте и в Сыктывкарсом филиале Вятской сельхозакадемии.
© Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. 2002. № 7.
______ Ул. К. Маркса, 68. 420015 Казань. Татарстан. Россия. __________ 65
Полная исследовательская публикация _________________________________________ Шубаков А.А. и Елькина Е.А.
Результаты и дискуссия
Биосинтез ПГ индуцируется пектиновыми веществами и подвергается ингибированию в присутствии легко
метаболизируемых моносахаридов (глюкоза, фруктоза и т.д.) и ряда других соединений [12-16]. Например, ПГ A. niger, A.
alliaceus, Geotrichum lactis, Neurospora crassa являются индуцибельными ферментами [6, 14-16]. ПГ некоторых мицелиальных
грибов (Fusarium oxysporum) и дрожжей (Kluyveromyces fragilis, Rhodotorula spp.) продуцируются конститутивно [6,17,18].
Для выяснения зависимости биосинтеза ПГ грибами A. niger F-1119 и P. dierckxii F-152 от различных источников
углерода определяли биомассу и активность ПГ через 5 суток роста (табл. 1).
Табл. 1. Биосинтез ПГ мицелиальными грибами в зависимости от источника углерода.
A. niger F-1119
Источник углерода
Биомасса,
г/л
ПГ, ед/мл
P. dierckxii F-152
ПГ,
ед/мг с.б.
Биомасса,
г/л
ПГ,
ед/мл
ПГ,
ед/мг с.б.
Глюкоза
4.7
0.0
0.0
5.9
0.0
0.0
Фруктоза
4.5
0.0
0.0
5.8
0.0
0.0
Галактоза
3.8
5.4
1.4
6.7
0.5
0.07
Лактоза
3.2
2.9
0.9
6,3
0.5
0.08
Зостеран
1.8
6.9
3.8
4.1
36.6
8.9
Пектин свекловичный
2.1
23.9
11.4
2.4
32.6
13.6
Пектин цитрусовый
2.2
10.8
4.9
2.6
20.7
2.0
Пектин яблочный
2.1
12.8
6.1
2.3
21.4
9.3
Контроль
с.б. – сухая биомасса
0.6
0.3
0.5
0.5
0.2
0.4
Нами показано, что A. niger F-1119 и P. dierckxii F-152 осуществляют биосинтез ПГ в зависимости от типа пектинаиндуктора. Так, свекловичный пектин индуцирует ПГ с активностью 23.9 и 32.6 ед/мл, цитрусовый пектин – 10.8 и 20.7 ед/мл,
яблочный пектин – 12.8 ед/мл и 21.4 ед/мл соответственно для каждого из видов грибов. Синтез фермента с наибольшей
активностью происходит на среде со свекловичным пектином (удельная активность ПГ 11.4 и 13.6 ед/мг с.б. соответственно).
Эффективным индуктором ПГ P. dierckxii является зостеран, уникальный апиогалактуронановый пектин морских трав сем.
Zosteraceae. Глюкоза и фруктоза ингибируют биосинтез ПГ, а в присутствии галактозы и лактозы происходит синтез фермента
в относительно небольшом количестве и с низкой ферментативной активностью (0,5-5,4 ед/мл).
Для изучения влияния источников азота на биосинтез ПГ A. niger F-1119 и P. dierckxii F-152 в среду, содержащую в
качестве источника углерода цитрусовый пектин (10 г/л), добавляли органический (казеин, пептон) или неорганический [NH4Cl,
NH4NO3, (NH4)2SO4)] источник азота. Контролем служила среда без источника азота (табл. 2).
Высокие значения ПГ-активности по
Табл. 2. Влияние источника азота на синтез ПГ.
сравнению с контролем (2.7-2.4 ед/мл) получены на
среде с пептоном, казеином и сульфатом аммония:
A. niger F-1119
P. dierckxii F-152
Источник
для A. niger - 14.1, 11.8 и 12.4 ед/мл, для P. dierckxii
Биомасса,
ПГ,
ПГ,
Биомасса,
ПГ,
ПГ,
азота
– 17.7, 19.9 и 21.1 ед/мл соответственно. Самый
г/л
ед/мл
ед/мг с.б.
г/л
ед/мл
ед/мг с.б.
высокий выход ПГ по удельной активности
Пептон
3.7
14.1
3.8
3.9
17.7
4.5
получен на среде с сульфатом аммония – 4.6 и 6.8
Казеин
4.5
11.8
2.6
5.2
19.9
3.8
ед/мг с.б. для A. niger и P. dierckxii соответственно.
2.7
3.0
1.1
2.7
11.9
4.4
NH4NO3
Можно полагать, что из всех испытанных
2.4
1.4
0.6
2.9
12.1
4.2
NH4Cl
источников азота наиболее оптимальным для
2.7
12.4
4.6
3.1
21.1
6.8
(NH
)
SO
4
2
4
накопления ПГ в среде является сульфат аммония,
Контроль
2.6
2.7
1.0
2.4
2.4
1.0
который
также
способен
оказывать
стабилизирующее влияние на ферменты [19].
При изучении влияния сульфата аммония на биосинтез ПГ грибами A. niger А-1119 и P. dierckxii F-152 были испытаны
растворы сульфата аммония в концентрации в среде от 0.25 до 5.0 г/л. В качестве контроля использовали среду без сульфата
аммония (табл. 3).
Установлено,
что
оптимальная
Табл. 3. Влияние концентрации сульфата аммония на синтез ПГ.
концентрация сульфата аммония в среде
составляет 2.5 г/л для обоих видов грибов. Более
A. niger F-1119
P. dierckxii F-152
Концентрация
высокая концентрация приводит к возрастанию
(NH4)2SO4,
Биомасса,
ПГ,
ПГ,
Биомасса,
ПГ,
ПГ,
ионной силы раствора, что может снизить
г/л
г/л
ед/мл
ед/мг с.б.
г/л
ед/мл
ед/мг с.б.
эффективность методов очистки фермента.
0.25
3.2
6.8
2.1
3.5
12.4
3.5
0.5
0.75
1.0
2.5
5.0
3.3
3.3
3.3
3.6
3.6
7.5
8.3
9.4
10.5
11.9
2.3
2.5
2.8
2.9
3.3
4.2
4.4
4.5
5.0
5.1
19.2
22.0
23.5
25.8
24.3
4.6
5.0
5.2
5.2
4.8
Контроль
2.9
7.7
2.7
2.0
0.9
0.5
На биосинтез ферментов могут оказывать влияние не только состав
питательной среды, но также и другие условия культивирования, например,
рН среды, который лимитирует рост культуры или воздействует на
каталитическую активность фермента [20]. Влияние рН среды на синтез ПГ и
рост культур A. niger F-1119 и P. dierckxii F-152 изучено при семи значениях
рН в диапазоне от 2.0 до 8.0, источником углерода при этом служил
цитрусовый пектин (10 г/л) (табл. 4).
66 _________________
http://chem.kstu.ru
__________________
Табл. 4. Влияние исходного значения
рН среды на биосинтез ПГ.
ПГ, ед/мл
рН
A. niger F-1119
P. dierckxii F-152
2.0
17.2
21.8
3.0
20.1
23.1
4.0
16.6
24.0
5.0
10.4
25.0
6.0
6.0
24.8
7.0
5.1
25.0
8.0
4.9
25.0
© Chemistry and Computational Simulation. Butlerov Communications. 2002. No. 7. 65.
ПРОДУЦИРОВАНИЕ ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗ МИЦЕЛИАЛЬНЫМИ ГРИБАМИ __________________________________________________
65-68
Максимальная ПГ-активность в культуральной жидкости наблюдается при культивировании A. niger F-1119 в среде с
кислыми исходными значениями рН в диапазоне 2.0-4.0 (оптимум 3.0). Аналогично у грибов A.niger ZIMET 43692 и
Aspergillus sp. CH-J-1043 максимальный биосинтез ПГ происходит при исходном рН среды от 2.0 до 4.0 [20, 21].
В случае P. dierckxii F-152 биосинтез ПГ существенно не зависит от рН среды, и достаточно высокие значения ПГактивности наблюдаются в кислом и в щелочном диапазонах исходных значений рН среды (в пределах от 2.0 до 8.0). Повидимому, синтез фермента культурой A. niger F-1119 является рН-зависимым в отличие от культуры P. dierckxii F-152, синтез
ПГ которой практически не зависит от
исходных значений рН среды в пределах
исследованного диапазона.
Ферменты являются биологическими
катализаторами
белковой
природы.
Естественной для белков является внутренняя
среда организма, ее рН и температура.
Изменение среды может сопровождаться
частичной или полной денатурацией белка.
Это не имеет значения при получении
кормовых белков [22]. В случае с ферментами
денатурация белка влечет за собой потерю
каталитической активности. Чтобы исключить
инактивацию
фермента,
необходимо
подобрать
оптимальные
условия
для
сохранения его активности, то есть определить
Рис. 1. ПГ-оптимумы рН
оптимальное значение рН, при котором
сохраняется активность фермента при различных температурах.
Грибные ПГ проявляют максимум активности обычно при рН 3.8-5.2 и температуре 35-45о С. Эндо-ПГ A. alliaceus
проявляет максимум активности при рН 5.5 и при температуре 35о С [1]. Оптимум рН для ПГ P. expansum составляет 5.5 [23].
Нами показано, что ПГ A. niger F-1119 и P. dierckxii F-152 проявляют максимальную каталитическую активность при
рН 5.0 (рис. 1).
При этом активность ПГ A. niger F-1119 по сравнению с ПГ P. dierckxii F-152 в большей степени зависит от рН среды.
В первом случае активность фермента не обнаруживается в сильнокислой среде (рН 2.0) и в щелочных условиях. Во втором
случае активность ПГ не обнаруживается только при сильнощелочном значении рН (9.0 и более).
Установлено, что оптимум температуры для
ПГ A. niger F-1119 составляет 50о С, а для ПГ
Penicillium dierckxii F-152 - 60о С (рис. 2). При этом
ПГ P. dierckxii более устойчива к действию
повышенных температур, чем ПГ A. niger.
Таким образом, биосинтез ПГ мицелиальными
грибами A. niger F-1119 и P. dierckxii F-152 является
индуцируемым, и наиболее эффективным индуктором
для обеих культур является свекловичный пектин, а
для P. dierckxii, кроме того, зостеран. Сульфат
аммония в концентрации 2.5 г/л служит оптимальным
источником азота в среде для обеих культур.
Максимальный биосинтез ПГ грибом A. niger
происходит в среде при исходном рН 3.0-4.0, а
образование ПГ у P. dierckxii существенно не зависит
от исходного рН среды. P. dierckxii F-152 является
Рис. 2. Оптимум температуры ПГ
более активным продуцентом ПГ, чем A. niger F1119, и продуцирует фермент с меньшей чувствительностью к рН и температуре.
Экспериментальная часть
Объектами исследования являлись продуценты пектинолитических ферментов: мицелиальные грибы Aspergillus niger ВКМ F-1119 и Penicillium dierckxii
ВКПМ F- 152. Культуры поддерживали на агаризованной среде Чапека при температуре +4о С.
В качестве посевного материала использовали 2-х суточные культуры грибов, выращенные на среде с 1% глюкозы. Засев производили в расчете 10 мл
посевного материала на 100 мл среды. Культуры выращивали в колбах при перемешивании (220 об/мин) с объемом питательной среды 100 мл при 24о С.
Ферментационная среда имела следующий состав (г/л): (NH4)2SO4 – 5.0; KH2PO4 – 2.0; MgSO4 . 7H2O – 0.5; раствор микроэлементов - 1 мл/100 мл среды.
Раствор микроэлементов содержал (г/л): MnSO4 . 5H2O – 0.08; CuSO4 . 5H2O – 0.4; ZnSO4 . 7H2O – 0.8; Co(NO3)2 . 6H2O – 0.1; FeSO4 . 7H2O - 0.1; (NH4)6Mo7O24 . 4H2O
- 0.3; H3BO3 - 0.06; CaCl2 . 6H2O - 1.0. В качестве источников углерода использовали (г/л): глюкозу – 10.0; фруктозу – 10.0; лактозу – 10.0; галактозу – 10.0;
зостеран – 10.0; пектин цитрусовый – 10.0; пектин яблочный – 10.0; пектин свекловичный – 10.0. Источниками азота служили (г/л): пептон – 5.0; казеин – 5.0;
NH4Cl – 5.0; NH4NO3 – 5.0; (NH4)2SO4 – 5.0. Исходное значение рН среды для обеих культур было 5.0 без дальнейшего регулирования. В опытах по изучению
влияния рН на синтез полигалактуроназы исходное значение рН устанавливали на уровне 2-9.
Вес сухой биомасы определяли фильтрованием грибных культур через бумажные фильтры и высушиванием их до постоянного веса при 60о С.
ПГ - активность определяли по накоплению редуцирующих сахаров после 10 мин инкубации раствора фермента при 50о С с 1%-ным раствором
галактуронана (Serva) в 0.05 М натрий-ацетатном буфере (рН 5.0). Образовавшиеся восстанавливающие сахара определяли по методу Нельсона-Сомоджи [10, 11].
Калибровочный график строили по D-галактуроновой кислоте. За единицу ПГ-активности принимали такое количество фермента, которое освобождало в данных
условиях из галактуронана 1 мкмоль D-галактуроновой кислоты за 1 мин. Удельную активность определяли в единицах активности на 1 мг сухой биомассы (с.б.).
Цифровые данные в статье представляют собой средние величины, полученные из трех независимо проведенных друг от друга экспериментов.
Благодарность
Авторы статьи глубоко признательны акад. Оводову Ю.С. за постоянное внимание к работе и ценные советы в процессе
ее выполнения.
Литература
[1] Сапунова Л.И., Михайлова Р.В., Лобанок А.Г. Прикл. биохим. микробиол. 1996. Т.32. С.506-509.
[2] Родионова Н.А., Безбородов А.М. Прикл. биохим. микробиол. 1997. Т.33. С.467-487.
[3] Аветисов В.А., Давыдова Ю.В., Шаврова А.П., Мелик-Саркисов О.С. Докл. АН. 1997. Т.352. С.127-129.
[4] I. Alkorta, M. Garbisu, M.J. Llama, L. Serra. Proc. Biochem. 1998. V.33. P.21-28.
[5] Бушнева О.А., Оводова Р.Г., Мишарина Е.А. Химия раст. сырья. 1999. №1. С.27-32.
© Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. 2002. №. 7.
__________________
E-mail: [email protected]__________________
67
Полная исследовательская публикация _________________________________________ Шубаков А.А. и Елькина Е.А.
[6] A.M. McKay. FEMS Microbiol. Lett. 1988. V.56. P.355-358.
[7] N.A. Devi, A.G.A. Rao. Enz. Microb. Technol. 1996. V.18. P.59-65.
[8] Астапович Н.И., Рябая Н.Е. Прикл. биохим. микробиол. 1997. Т.33. С.287-291.
[9] Астапович Н.И., Рябая Н.Е., Лобанок А.Г. Прикл. биохим. микробиол. 1990. Т.26. С.743-747.
[10] N. Nelson. J.Biol.Chem. 1944. V.153. P.375-389.
[11] M. Somogyi. J.Biol.Chem. 1945. V.160. P.61-68.
[12] Лобанок А.Г., Астапович Н.И., Михайлова Р.В. Биотехнология микробных ферментов. Минск: Наука и техника. 1989. 205с.
[13] G. Aguilar, C. Huitron. Enz.Microb.Technol. 1986. V.9. P.541-548.
[14] C. Pardo, M.A. Lapena, M. Gacto. Can.J.Microbiol. 1991. V.37. P.974-977.
[15] Сапунова Л.И., Михайлова Р.В., Лобанок А.Г. Прикл. биохим. микробиол. 1990. Т.26. С.748-753.
[16] M. Polizeli, T.M.de Lourdes, J.A. Jorge, H.F. Trenzi. J.Gen.Microbiol. 1991. V.137. P.1815-1823.
[17] Михайлова Р.В., Сапунова Л.И., Лобанок А.Г. Прикл. биохим. микробиол. 1992. Т.28. С.249-255.
[18] A. Mehta, S. Chopra, V. Kare, P. Mehta. Zbl. Microbiol. 1992. V.147. P.557-561.
[19] Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир. 1985. 358с.
[20] G. Aguilar, B.A. Trejo, J.M. Garcia, C. Huitron. Can.J.Microbiol. 1991. V.37. P.912-917.
[21] A. Leuhctenler, E. Friese, H. Ruttoff. Biotechnol.Lett. 1989. V.11. P.255-258.
[22] Рид Дж. Ферменты в пищевой промышленности. М.: Пищевая промышленность. 1971. 414с.
[23] C. Yao, S. Conway, C.E. Sams. Phytopathology. 1996. V.86. P.1160-1166.
68 _________________
http://chem.kstu.ru
__________________
© Chemistry and Computational Simulation. Butlerov Communications. 2002. No. 7. 65.
Скачать