016155 B1 016155 B1 (11) 016155
реклама
Евразийское патентное ведомство (19) (11) 016155 (13) B1 (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ (45) Дата публикации и выдачи патента 2012.02.28 (21) (51) Int. Cl. C12N 9/02 (2006.01) C12P 37/00 (2006.01) Номер заявки 200900513 (22) Дата подачи заявки 2007.10.02 (54) ПОЛУЧЕНИЕ β-ЛАКТАМОВЫХ АНТИБИОТИКОВ B1 (72) Изобретатель: (74) Представитель: B1 016155 (56) WO-A1-200052152 WO-A-1998016648 WO-A-2006061425 US-A1-2005287641 016155 (31) 06121817.8; 07113095.9 (32) 2006.10.05; 2007.07.25 (33) EP (43) 2009.08.28 (86) PCT/EP2007/060460 (87) WO 2008/040731 2008.04.10 (71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL) (57) Настоящее изобретение описывает способ получения N-α-аминогидроксифенилацетил или N-αаминофенилацетил β-лактамового антибиотика, включающий IPNS-катализируемое превращение предшественника трипептида гидроксифенилглицил-цистеинил-валин (HpgCV) или фенилглицилцистеинил-валин (PgCV) соответственно в N-гидроксифенилглицил или N-фенилглицил βлактамовый антибиотик соответственно. Трипептид HpgCV или трипептид PgCV затем может быть получен контактированием аминокислот гидроксифенилглицина (Hpg) или фенилглицина (Pg), цистеина (С) и валина (V) с нерибосомальной пептидной синтетазой (NRPS) для того, чтобы осуществить образование трипептида HpgCV или трипептида PgCV, NRPS, содержащей первый модуль M1, специфичный к Hpg или Pg, второй модуль М2, специфичный к С, и третий модуль M3, специфичный к V. Более того, IPNS обеспечивает обладание улучшенной активностью в этом превращении так же, как и катализирование образования трипептидов. Также предоставлена клетка-хозяин, способная к ферментативному производству β-лактамовых антибиотиков с N-αаминогидроксифенилацетил или N-α-аминофенилацетил боковыми цепями. Ханс Маркус, Бовенберг Рулоф Ари Ланс, Классен Пол, Бур Ремон, Лаан Ван Дер Ян Метске (NL) Саломатина И.С. (RU) 016155 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к получению β-лактамовых антибиотиков. Предшествующий уровень техники β-лактамовые антибиотики являются самым большим семейством вторичных метаболитов, которые производят микроорганизмы в природе. Наиболее важными классами β-лактамовых антибиотиков и клинически, и с точки зрения экономики являются пенициллины (пенам) и цефалоспорины (цефем). Их биосинтез осуществляется посредством сложного метаболического пути. Первые две стадии являются ключевыми стадиями в путях биосинтеза β-лактамовых антибиотиков пенамового и цефенового классов. После этих двух стадий пути биосинтеза к пенициллинам и цефалоспоринам расходятся. Первой стадией в биосинтезе пенициллиновых, цефалоспориновых и цефамициновых антибиотиков является конденсирование L-изомеров трех аминокислот, L-α-аминоадипиновой кислоты (А), L-цистеина (С) и L-валина (V) в трипептид, δ-(L-α-аминоадипил)-L-цистеинил-D-валин или ACV. Эта стадия катализируется δ-(Lα-аминоадипил)-L-цистеинил-D-валин синтетазой или ACVS. На второй стадии трипептид ACV окислительно циклизируется под действием изопенициллин N синтазы (в дальнейшем называемой IPNS) или циклазой. Продуктом этой реакции является изопенициллин N; это соединение содержит типичные βлактамовые и триазолидиновые кольцевые структуры и обладает антибактериальной активностью. Из изопенициллина N пенициллины G или V образуются заменой гидрофильной α-аминоадипил боковой цепи на гидрофобную боковую цепь. Боковыми цепями, обычно используемыми в производственных процессах, являются или фенилуксусная кислота (РА), дающая пенициллин G, или феноксиуксусная кислота (РОА), дающая пенициллин V; эта реакция замещения катализируется ферментом ацилтрансферазой (AT). Вследствие субстратной специфичности фермента AT невозможно заменить α-аминоадипил боковую цепь на любую боковую цепь, представляющую интерес, хотя было показано, что адипиновая кислота и определенные тио-производные адипиновой кислоты могут быть заменены (см. WO 95/04148 и WO 95/04149). В частности, боковые цепи промышленно важных пенициллинов и цефалоспоринов не могут быть прямо заменены с помощью AT. Поэтому большинство используемых сейчас β-лактамовых антибиотиков получают полусинтетическими способами. Эти полусинтетические β-лактамовые антибиотики получают модификацией N-замещенного β-лактамового продукта посредством одной или больше химической и/или ферментативной реакции. Эти полусинтетические способы обладают тем недостатком, что они включают много стадий, не являются безвредными для окружающей среды и являются весьма дорогостоящими. Следовательно, очень желательно использовать полностью ферментативный путь к βлактамовым антибиотикам, например амоксициллину, ампициллину, цефадроксилу и цефалексину. Могут быть рассмотрены различные варианты полностью ферментативного пути к полусинтетическим пенамовым и цефемовым антибиотикам. Например, можно сфокусироваться на замене α-аминоадипил боковой цепи изопенициллина N на подходящую боковую цепь, представляющую интерес, например α-амино-ρ-гидроксифенилацетил боковую цепь в случае амоксициллина. При этом будет необходима модификация субстратной специфичности фермента AT, так как нативный фермент имеет довольно узкую субстратную специфичность и не способен катализировать такой обмен. Кроме того, это будет требовать модификации фермента СоА лигазы, который активизирует боковую цепь, которую следует заменить. Альтернативно, можно сфокусироваться на модификации первых двух стадий в пути биосинтеза пенициллина так, что амоксициллин прямо синтезируется и секретируется. Однако для этого будет необходима существенная модификация ферментов ACVS и IPNS. Например, для амоксициллина, во-первых, будет необходимо получение трипептида, производящего боковую цепь амоксициллина, т.е. трипептида D-ρ-гидроксифенилглицил-L-цистеинил-D-валина, вместо ACV. Во-вторых, будет необходим фермент, который способен циклизировать этот трипептид. ACVS является нерибосомальной пептидной синтетазой (NRPS), которая катализирует образование трипептида LLD-ACV (δ-(L-α-аминоадипил)-L-цистеинил-D-валин). В этом трипептиде пептидная связь образуется между δ-карбоксильной группой L-α-аминоадипиновой кислоты и аминогруппой L-цистеина, и, кроме того, стереохимическая конформация валина изменяется от L до D. В последние годы некоторые лаборатории и институты исследовали возможности нацеленной разработки NRPS. В качестве главных подходов были заменены домены и модули и в результате были введены новые специфичности, приводя к измененным пептидным продуктам. В большинстве случаев инженерные подходы довольствовались ферментативными фрагментами того же самого организма (или даже той же самой NRPS), строго ограничивая варианты для ферментной инженерии. Основной проблемой современной NRPS инженерии по литературе является изменение стереохимии аминокислоты пептида, т.е. изменение от L- к D-стереохимии. Образующий пептидную связь домен конденсации, находящийся непосредственно ″ниже″ домена эпимеризации, является D-специфическим для пептидильного или аминоацильного донора и L-специфическим для аминоацильного акцептора. Такой домен конденсации изображается как DCL. Домен DCL в этом положении не приводит к конденсации донорной и акцеп-1- 016155 торной частей (Clugston S.L. et al. 2003, Biochemistry, 42, 12095-12104). Следующей проблемой, которая может ограничивать варианты инженерии, является то, что домены С и А рассматриваются как нераздельная пара (Mootz H.D. et al. 2000, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 97, 5848-5853). Теперь неожиданно обнаружено, что является осуществимой такая инженерия ACVS, которая предоставит сконструированный фермент, который способен катализировать образование трипептида HpgCV или PgCV, в котором в N-концевой пептидной связи α-карбоксильная группа используется вместо δ-карбоксильной группы, которая используется в природном трипептиде ACV и, кроме того, который способен модифицировать L стереохимическую конфигурацию первой аминокислоты до D конфигурации. Более того, некоторые группы исследовали субстратную специфичность фермента IPNS. См. в продолжение этой темы Baldwin и Bradley, Chem. Rev. 1990, 90, 1079-1088 и Huffman et al. J. Med. Chem. 1992, 35, 1897-1914. Например, субстраты m-COOH-DL-фенилглицил-L-цистеинил-D-валин и ρгидроксифенилацетил-L-цистеинил-D-валин были указаны как не приводящие к антибиотической активности (Huffman et al., выше). Также было неожиданно обнаружено, что нативный фермент IPNS способен действовать на трипептиды гидроксифенилглицил-цистеинил-валин (HpgCV) и фенилглицил-цистеинил-валин (PgCV), конкретнее на DLD-разновидности этих трипептидов. Открытие этого свойства IPNS раскрывает путь к дальнейшим разработкам, среди которых скрининг разновидностей IPNS, для того, чтобы выделить молекулы IPNS с улучшенной активностью на эти ненативные пептиды. Открытия настоящего изобретения впервые делают возможным полностью ферментативное получение антибиотиков, которые раньше могли быть получены только полусинтетическими способами. Подробное описание изобретения Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения N-αаминогидроксифенилацетил или N-α-аминофенилацетил β-лактамового антибиотика, включающий контактирование трипептида гидроксифенилглицил-цистеинил-валин (HpgCV) или трипептида фенилглицил-цистеинил-валин (PgCV) с IPNS для того, чтобы осуществить образование N-α-аминогидроксифенилацетил или N-α-аминофенилацетил β-лактамового антибиотика. Настоящее изобретение неожиданно впервые показывает, что фермент IPNS способен превращать ненативные трипептидные субстраты HpgCV или PgCV соответственно в β-лактамовые соединения с Nα-аминогидроксифенилацетил или N-α-аминофенилацетил боковой цепью соответственно, такие как амоксициллин или ампициллин соответственно. Согласно изобретению "фермент IPNS" или "фермент с IPNS активностью" является ферментом, который циклизирует трипептид HpgCV или PgCV в молекулу пенамового антибиотика. Такие IPNS ферменты, как правило, имеют степень идентичности по меньшей мере 50% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 IPNS Emericella (Aspergillus) nidulans. Аминокислоты гидроксифенилглицин (Hpg) и фенилглицин (Pg) в этих трипептидах могут находиться в D- а также L-форме, но предпочтительно находятся в D-форме. Гидроксифенилглицин предпочтительно является ρ-гидроксифенилглицином. Обнаружение данной ненативной трипептид-циклизирующей активности IPNS выполняется с использованием биоанализа и/или с использованием LC/MS анализа. Для разработки биоанализа требовалось создать различные альтернативы. Например, для тестирования антибиотической активности требовалось выбрать подходящий микроорганизм. Кроме того, требовалось выбрать подходящую IPNS, так как ферменты IPNS от разных видов, по-видимому, различаются по специфической активности и стабильности. Теперь, когда обнаружена ненативная трипептид-циклизирующая активность IPNS, как указано выше, возможно оптимизировать условия реакции и провести скрининг вариантов IPNS на ферменты с улучшенной специфической активностью и/или измененной субстратной специфичностью. Циклизация ненативного трипептида in vitro для получения пенамового антибиотика, как правило, выполняется с использованием условий реакции как указано ниже. Значение рН реакционной смеси может находиться между 6 и 8 при использовании любого подходящего буфера. Реакционная смесь, кроме того, должна содержать подходящее количество ионов Fe(II). Наконец, необходимо присутствие восстановителя, например DTT или ТСЕР (трис(2-карбоксиэтил) фосфина), для поддерживания предшественника трипептида в восстановленном состоянии. Предпочтительно предшественник трипептида является предварительно обработанным таким подходящим восстановителем. Необязательно, образованный пенамовый антибиотик, такой как амоксициллин или ампициллин, затем может быть превращен с целью получения цефемового антибиотика. Это превращение требует, по меньшей мере, фермента экспандазы, например, чтобы образовать цефадроксил или цефалексин. Необязательно, другие цефемовые соединения могут быть образованы дальнейшими ферментативными превращениями с использованием, например, гидроксилазной и ацетилтрансферазной ферментативной активности или гидроксилазной и карбамоилтрансферазной ферментативной активности. Ферменты, необ-2- 016155 ходимые для этих превращений, соответственно получают от цефем-продуцирующих микроорганизмов, таких как Streptomyces clavuligerus, Nocardia lactamdurans или Acremonium chrysogenum. См. недавние обзоры Liras и Martin, International Microbiology (2006) 9: 9-19. В предпочтительном варианте осуществления изобретения фермент IPNS используют, как описано здесь ниже. В одном варианте осуществления в качестве исходных соединений в процессе используют специально сделанные трипептиды HpgCV и PgCV. В другом варианте осуществления трипептиды HpgCV и PgCV получают в процессе, включающем i) контактирование аминокислот гидроксифенилглицина (Hpg) или фенилглицина (Pg), цистеина (С) и валина (V) с нерибосомальной пептидной синтетазой (NRPS) для того, чтобы осуществить образование трипептида гидроксифенилглицин-цистеинил-валина (HpgCV) или фенилглицин-цистеинил-валина (PgCV). NRPS для применения в этом варианте осуществления является неприродной NRPS с модульным строением, содержащей три модуля, первый модуль M1, специфический к Hpg или Pg, второй модуль М2, специфический к С, и третий модуль М3, специфический к V, как описано здесь ниже. Общий способ получения N-α-аминогидроксифенилацетил или N-α-аминофенилацетил βлактамового антибиотика из его предшествующих аминокислот, таким образом, включает: i) контактирование аминокислот гидроксифенилглицина (Hpg) или фенилглицина (Pg), цистеина (С) и валина (V) с нерибосомальной пептидной синтетазой (NRPS) для того, чтобы осуществить образование трипептида гидроксифенилглицин-цистеинил-валин (HpgCV) или фенилглицин-цистеинил-валин (PgCV), и ii) контактирование указанных трипептидов с IPNS для того, чтобы осуществить образование N-α-аминогидроксифенилацетил или N-α-аминофенилацетил β-лактамового антибиотика. Способы могут быть выполнены in vivo с использованием подходящего сконструированного микробного штамма, как описано здесь ниже. Во втором аспекте изобретения предоставлены различные полипептиды IPNS, которые модифицированы по сравнению с первоначальным (родительским) полипептидом IPNS и которые обладают улучшенной циклизирующей активностью на трипептид HpgCV или PgCV по сравнению с первоначальной IPNS. "Улучшенной активностью" разновидности фермента IPNS согласно изобретению является активность, которая обеспечивает получение по меньшей мере 2-кратного количества антибиотической активности, если исходить из предшественника трипептида, по сравнению с первоначальной IPNS, предпочтительно по меньшей мере 5-кратное количество, более предпочтительно по меньшей мере 10-кратное количество. Если первоначальная IPNS имеет неопределяемую активность на пептид-предшественник, улучшенная активность включает любую измеримую активность выше предела обнаружения. Подходящие положения для модификации в первоначальной IPNS могут быть выбраны исходя из критериев: а) создание пространства (зоны) в активном центре и/или b) ослабление связывания С-конца к активному участку. С-конец молекулы IPNS действует как квази-субстрат, когда фермент не нагружен субстратом, и, таким образом, конкурирует с субстратом за связывание активного участка. После приближения субстрата к активному центру, С-конец удаляется (отходит), создавая пространство для субстрата. Таким образом, может быть выгодным сдвинуть это соревнование в пользу связывания субстрата. Первоначальная IPNS может происходить из любого подходящего микробного источника, как указано здесь ниже. Отдельная разновидность фермента IPNS изобретения, после того как выровнена с последовательностью IPNS SEQ ID NO: 1, является модифицированной по сравнению с родительским ферментом IPNS, по меньшей мере, в положениях 75, 91, 183, 185, 287, 321, 324, 331, и способна превратить трипептид HpgCV или PgCV соответственно в антибиотик амоксициллин или ампициллин соответственно. Модификации в этих положениях создают больше пространства в кармане связывания боковой цепи пептида для размещения более объемистых боковых цепей Hpg и Pg трипептидов HpgCV и PgCV по сравнению с линейной и гибкой α-аминоадипил боковой цепью ACV. Предпочтительный вариант содержит модификацию по всем вышеупомянутым положениям. Предпочтительными модификациями в этих положениях являются модификации 75LVT, 91FH, 183ACGTVL, 185STGAC, 287HSDQMK, 321FSAVTQEM, 324NDSTVA, 331GASCVDN. Особенно предпочтительными модификациями являются 75VT, 183AG, 185GA, 287HQ, 321AVTM, 324NSA, 331ASVDN. Модификация может быть замещением отдельной аминокислоты в указанном положении(ях) на другую аминокислоту, может быть включением аминокислоты в указанное положение(я) или может быть удалением аминокислоты из указанного положения(й). Другая отдельная разновидность фермента IPNS изобретения, после того как выровнена с последовательностью IPNS SEQ ID NO: 1, модифицирована по сравнению с первоначальным ферментом IPNS, по меньшей мере, в положении 185 и необязательно по меньшей мере в одном из следующих положений, используя нумерацию положений последовательности SEQ ID NO: 1: 91, 104, 183, 190, 321, 324, 325, 331, и является допускающей превращение трипептида HpgCV или PgCV соответственно в антибиотик амоксициллин или ампициллин соответственно. Модификации в этих положениях изменяют конкуренцию -3- 016155 между субстратом и IPNS-С-концевыми остатками -Q330-T331 для связывания в активном центре в пользу субстрата посредством ослабления связывания С-конца с активным центром и/или посредством стабилизации конформации, в которой активный участок является доступным для связывания субстрата. Было неожиданно обнаружено, что модификация, по меньшей мере, в положении 185 дает сильно улучшенную активность циклизации ферменту IPNS, содержащему модификацию, по сравнению с первоначальной IPNS, не содержащей модификацию. Предпочтительная разновидность согласно изобретению содержит модификацию 185RKH, более предпочтительно модификацию 185RK, наиболее предпочтительно модификацию 185R. Исходная аминокислота в положении 185 зависит от первоначальной IPNS, которая используется, например может быть S, Т или V. В одном варианте осуществления модификация 185RKH является скомбинированной с модификацией по меньшей мере в одном из положений 91, 104, 183, 190, 321, 324, 325, 331, как указано в табл. ниже. В частности, R и K могут взаимодействовать с С-концевым Т331, когда С-концевая область N-GQ-T331 принимает активную конформацию. Неожиданно взаимодействие между 185RK и Т331 является очень выгодным для увеличения активности HpgCV и PgCV. Вероятно, 185RK способствует образованию активной конформации, используя HpgCV и PgCV в качестве субстратов. * В тех положениях, где аминокислота установлена, отдельная аминокислота является консервативной во всех нативных ферментах, известных на данное время. В настоящем изобретении обозначение, подобное, например, 185RK, означает, что аминокислота в положении 185 первоначальной IPNS, о которой идет речь, заменена или R или К, или, что в положении 185 первоначальной IPNS или R или K вставлены, когда в первоначальной IPNS нет аминокислоты, находящейся в этом положении. Природа исходного аминокислотного остатка будет зависеть от первоначальной IPNS, которая используется. Обозначение, подобное, например, VST185RK, означает, что отдельный аминокислотный остаток в положении 185, присутствующий в первоначальной IPNS, в этом примере V, S или Т, заменен другой аминокислотой, в этом примере R или K. Подходящая первоначальная IPNS представляет собой полипептид IPNS, получаемый из грибкового или бактериального организма, способного продуцировать β-лактамы. Предпочтительной первоначальной IPNS является IPNS, получаемая из Cephalosporlum acremonium, Peniciliium chrysogenum, Aspergillus (Emericella) nidulans, Streptomyces jumonjinensis, Nocardia lactamdurans, Streptomyces microflavis, Lysobacter lactamgenus, Flavobacterium species, Streptomyces clavuligerus, Streptomyces griseus и/или Streptomyces cattleya. Особенно предпочтительной первоначальной IPNS является получаемая из Streptomyces clavuligerus и/или Aspergillus (Emericella) nidulans. В основном такая первоначальная IPNS является полипептидом с IPNS активностью, который имеет степень идентичности по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 55%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 80% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1. В дополнение к модификациям, как изложено выше, предпочтительно модификации 185RKH, полипептид IPNS может содержать дополнительные модификации, которые касаются положений в полипептиде, в которых модификация не влияет существенно на свертывание или активность полипептида. В основном такие модификации могут являться консервативными модификациями, например замещениями, в которых неполярная, полярная незаряженная, полярная заряженная или ароматическая аминокислота замещена другой аминокислотой из той же самой категории, или могут иметь место вследствие внутриштаммной или внутривидовой разновидности. Полипептиды, имеющие такие дополнительные модификации, в основном имеют степень идентичности по меньшей мере 50% с последовательностью SEQ ID NO: 1. Таким образом, в одном варианте осуществления полипептид, обладающий IPNS активностью и содержащий по меньшей мере одну из модификаций, как изложено выше, имеет степень идентичности по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 55%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 80% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1. -4- 016155 Термины "гомология" или "процент идентичности" используются здесь взаимозаменяемым образом. Для цели настоящего изобретения здесь определено, что для того, чтобы определить процент идентичности двух аминокислотных последовательностей, последовательности выравнивают с целью оптимального сравнения (например, в каждую последовательность для оптимального выравнивания могут быть введены пропуски). Затем сравнивают аминокислотные остатки в соответствующих положениях аминокислот. Когда положение в первой последовательности является занятым тем же самым аминокислотным остатком, как соответствующее положение во второй последовательности, в таком случае молекулы являются идентичными в этом положении. Процент идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию числа идентичных положений, разделяемых последовательностями (т.е. % идентичности = количество идентичных положений/общее количество положений (т.е. перекрывающиеся положения, включая пропуски ("гэпы"))×100). Предпочтительно две последовательности являются одинаковой длины. Квалифицированный специалист безусловно осведомлен о том, что существуют компьютерные программы, способные определить гомологию между двумя последовательностями. Например, сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть выполнено с применением математического алгоритма. В предпочтительном варианте осуществления процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют с применением алгоритма Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)), который включен в программу GAP в комплекте программного обеспечения Accelrys GCG (доступный на http://www.acceirys.com/products/gcq/), с использованием или матрицы Blossom 62, или матрицы РАМ250, и gap weight 16, 14, 12, 10, 8, 6, или 4 и а length weight 0,5; 1; 2; 3; 4; 5 или 6. Квалифицированный специалист поймет, что все эти различные параметры будут давать несущественно отличные результаты, но что общий процент идентичности двух последовательностей не изменится существенно при использовании различных алгоритмов. Предпочтительно матрица является Blossom 62 матрицей с gap weight 10,0 и length weight 0,5. Белковые последовательности настоящего изобретения могут затем быть использованы как "запрошенная (query) последовательность" для осуществления поиска в общедоступных базах данных, например для установления других членов семейства или родственных последовательностей. Такой поиск может быть выполнен с применением программ blastp, psi-blast, phi-blast и tblastn (версия 2.0) Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. При использовании программ blastp, psi-blast, phi-blast и tblastn могут быть использованы параметры соответствующих программ, принимающие значение по умолчанию (например, программ blastp, psi-blast, phi-blast и tblastn). См. главную страницу Национального центра биотехнологической информации на сайте www.ncbi.nlm.nih.qov. В третьем аспекте предоставлен полипептид, который является нерибосомальной пептидной синтетазой, содержащей три модуля, первый модуль M1, специфичный к Hpg или Pg, второй модуль М2, специфичный к С, и третий модуль М3, специфичный к V. При использовании для описания модуля термин "специфичный к" аминокислоте означает, что отдельный модуль делает возможным введение указанной аминокислоты. Первый модуль M1 делает возможным введение первой аминокислоты L-ρгидроксифенилглицина или L-фенилглицина и предпочтительно ее превращение в соответствующую Dаминокислоту. Второй модуль М2 делает возможным введение аминокислоты L-цистеина наряду с тем, что является связанным с аминокислотой Hpg или Pg. В частности, когда аминокислота Hpg или Pg находится в ее D-форме, М2 модуль, специфический к С, содержит DCL домен, который соединен с А доменом, который к тому же является гетерологичным. Третий модуль М3 делает возможным введение аминокислоты L-валина и ее превращение в соответствующую D-аминокислоту. Таким образом, пептидная синтетаза катализирует образование DLD-трипептида гидроксифенилглицин-цистеинил-валин (HpgCV) или фенилглицин-цистеинил-валин (PgCV) из его L-аминокислотных предшественников Hpg или Pg, С и V. Термин "модуль" при использовании в данном изобретении определяет каталитическую единицу, которая делает возможным включение одного пептидного структурного звена, обычно аминокислоты, в продукт, обычно пептид, и может включать домены для модификаций, подобных эпимеризации и метилированию. Каждый модуль NRPS составлен из так называемых "доменов", каждый домен является ответственным за отдельную стадию реакции при включении пептидного структурного звена. Каждый модуль, по меньшей мере, содержит домен аденилирования (А домен), ответственный за распознавание и активацию предназначенной аминокислоты, и домен тиолирования (Т или РСР домен), ответственный за транспорт промежуточных продуктов к каталитическим центрам. Второй и следующий модули, кроме того, содержат домен конденсации (С домен), ответственный за образование пептидной связи, и последний модуль, кроме того, содержит домен терминации (ТЕ домен), ответственный за высвобождение пептида. Необязательно, модуль может содержать дополнительные домены, такие как домен эпимеризации (Е-домен), ответственный за превращение L-формы включенной аминокислоты в Dформу. См. Sieber S.A. et al. 2005, Chem. Rev., 105, 715-738 для обзора модульной структуры NRPS. -5- 016155 Подходящим источником для модуля M1 гибридной пептидной синтетазы является фермент NRPS, катализирующий образование пептида, содержащего аминокислоту X, в котором X является Hpg или Pg, для включения в качестве первой аминокислоты в трипептид XCV. Таким образом, подходящий модуль M1 выбирают, принимая во внимание природу аминокислоты для включения в качестве первой аминокислоты в трипептид. В частности, домен А модуля обусловливает селективность для отдельной аминокислоты. Таким образом, модуль M1 может быть выбран исходя из специфичности домена А для аминокислоты, которая должна быть включена. Такой выбор может совершаться согласно специфичности определяющего характерного мотива домена А, как определено Stachelhaus Т. et al. 1999, Chem. & Biol, 8, 493-505. Модулю M1 не нужно содержать С домен и ТЕ домен, так как он является первым модулем NRPS. Таким образом, если в источнике модуля присутствует С и/или ТЕ домен, он соответственно может быть удален для того, чтобы получить первый модуль M1 без С и/или ТЕ домена. В дополнение к А и Т домену модуль M1 NRPS должен содержать Е домен, если L-аминокислоту необходимо превратить в Dаминокислоту. Таким образом, если Е домен в источнике модуля не присутствует, его соединяют с Т доменом источника модуля для того, чтобы получить первый модуль M1, содержащий А, Т и Е домен. Вообще специфичность модуля M1 NRPS к ρ-гидроксифенилглицину или фенилглицину можно оценить с помощью экспериментальных данных и/или может основываться на специфичности определяющего характерного мотива домена А, как опубликовано Stachelhaus Т. et al. 1999, Chem. & Bioi, 8, 493-505. Предпочтительно первый модуль M1 с ρ-гидроксифенилглицин специфичностью, который получают из CDA (кальцийзависимый антибиотик) синтетазы, в частности является шестым модулем CDA синтетазы (нумерация модулей CDA синтетазы дана, как опубликовано Hojati Z. et al. 2002, Chem. & Biot, 9, 1175-1187). Предпочтительно CDA синтетазу получают из Streptomyces coelicolor. Альтернативно, Hpgспецифические модули могут быть получены из хлоререномицин (Chloroerenomycin) синтетазы, и, в частности, являются четвертым и пятым модулями хлоререномицин синтетазы, предпочтительно хлоререномицин синтетазы, получаемой из Amycotatopsis orientaiis (Trauger J.W. et al. 2000, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 97, 3112-20 3117), или из комплестатин синтетазы, в частности является седьмым модулем комплестатин синтетазы, предпочтительно комплестатин синтетазы, получаемой из Streptomyces lavendulae (Chiu Н.Т. et al. 2001, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 98, 8548-8553). Все эти модули обладают специфичностью к L-Hpg и превращают его в D-стереоизомер. Предпочтительно первый модуль M1 с фенилглициновой специфичностью, который получают из пристинамицин синтетазы, в частности является С-концевым модулем протеина SnbD пристинамицин синтетазы, как опубликовано в Thibaut, D. et al. 1997, J. Bad, 179, 697-704. Предпочтительно пристинамицин синтетазу получают из Streptomyces pristinaspiralis. С-концевой источник модуля из пристинамицин синтетазы содержит ТЕ домен и не содержит Е домен. Чтобы получить модуль, функционирующий как первый модуль в пептидной синтетазе изобретения, ТЕ домен соответственно удаляют из С-концевого источника модуля, а Е домен соединяют с Т доменом модифицированного таким образом С-концевого модуля. Домен Е можно получить из любой подходящей NRPS, например из другого модуля того же самого фермента NRPS, или также из модуля другого фермента NRPS с одинаковой (например ρ-гидроксифенилглицин или фенилглицин) или отличной аминокислотной специфичностью домена аденилирования. Предпочтительно Е домен получают из CDA синтетазы из Streptomyces coelicolor, предпочтительно из шестого модуля, как указано выше. Таким образом, в этом варианте осуществления модуль M1 NRPS является гибридным модулем. Второй модуль М2 пептидной синтетазы должен дать возможность включения аминокислоты цистеина в качестве второй аминокислоты трипептида DLD-XCV, в котором X является Hpg или Pg. Выбор этого модуля может быть основан на специфичности определяющего характерного мотива А домена, как опубликовано Stachelhaus T. et al. 1999. Чтобы дать возможность соединения L-цистеинил акцептора с D-X-аминоацил донором, С домен модуля М2 является DCL доменом (как отмечено выше и как объяснено в работе Clugston S.L. et al. 2003). Этот DCL домен соединен с А доменом, который является к тому же гетерологичным. Термин "гетерологичный" при использовании в этом контексте означает, что С и А домены происходят из разных модулей. Эти различные модули могут быть из того же самого фермента или могут быть из разных ферментов. Предпочтительно А домен получают из второго модуля ACVS. Неожиданно, гибридный модуль М2, содержащий такую конфигурацию DCL-A домена, по-видимому, является способным включать аминокислоту цистеин. В предпочтительном варианте осуществления DCL домен модуля М2 получают из модуля, находящегося непосредственно "ниже" модуля, который является источником первого модуля M1 пептидной синтетазы изобретения. Например, DCL домен модуля М2 пептидной синтетазы представляет собой DCL домен седьмого модуля CDA синтетазы, которая является источником первого модуля M1. В другом варианте осуществления DCL домен модуля М2 пептидной синтетазы является DCL доменом второго модуля протеина ItuC итурин-синтетазы Bacillus subtilis RB14, как определено Tsuge K. et al. -6- 016155 2001, J. Bad, 183, 6265-6273. В предпочтительном варианте осуществления изобретения второй модуль М2 пептидной синтетазы, по меньшей мере, частично получают из фермента, который является источником третьего модуля М3 пептидной синтетазы. В частности, А и Т домены М2 модуля пептидной синтетазы получают из модуля, находящегося непосредственно "выше" модуля, который является источником третьего модуля пептидной синтетазы изобретения. Например, А и Т домены модуля М2 пептидной синтетазы могут быть А и Т доменами второго модуля ACVS. Третий модуль М3 пептидной синтетазы должен давать возможность включения аминокислоты валина в качестве третьей аминокислоты трипептида, а также ее превращения в D-форму, чтобы давать трипептид DLD-XCV. В предпочтительном варианте осуществления изобретения третий модуль пептидной синтетазы, который получают из ACVS, в частности является третьим модулем ACVS. ACVS, как указано выше, предпочтительно является бактериальной или грибковой ACVS, более предпочтительно бактериальной ACVS, получаемой из Nocardia lactamdurans или грибковой ACVS, получаемой из мицелиальных грибов, таких как Penicillium chrysogenum, Acremonium chrysogenum, Aspergillus nidulans. Модули M1, M2 и М3 пептидной синтетазы могут иметь аминокислотные последовательности, как показано ниже. Однако эти последовательности приведены только в качестве примеров и не предназначены ограничивать рамки изобретения. Квалифицированному специалисту будет понятно, что NRPS А домены, например, разделяют около 30-60% идентичности аминокислотной последовательности, даже А домены со специфичностью к той же самой аминокислоте, но из разного источника, и содержат несколько центральных мотивов, в числе которых определяющий специфичность характерный мотив (Stachelhaus T. et al., 1999). M1 модуль пептидной синтетазы, например, имеет аминокислотную последовательность согласно с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 или аминокислотную последовательность с процентом идентичности по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, даже более предпочтительно по меньшей мере 50%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 60% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4. Такие полипептидные модули с процентом идентичности по меньшей мере 30% также называются гомологичными последовательностями или гомологами. М2 модуль пептидной синтетазы, например, имеет аминокислотную последовательность согласно с SEQ ID NO: 6 или с SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность с процентом идентичности по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, даже более предпочтительно по меньшей мере 50%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 60% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8. М3 модуль пептидной синтетазы, например, имеет аминокислотную последовательность согласно с SEQ ID NO: 10 или аминокислотную последовательность с процентом идентичности по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, даже более предпочтительно по меньшей мере 50%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 60% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10. Модули пептидной синтетазы могут быть получены из природных ферментов NRPS, как указано выше, или могут быть получены из таких природных ферментов NRPS методами мутагенеза, таким как случайный и/или сайт-направленный мутагенез и/или "перетасовкой" генов. При необходимости источник модуля, кроме того, может быть сконструирован для того, чтобы добавить необходимые домены, исключить ненужные домены или заменить домен на соответствующий домен из другого модуля. В основном А домен модуля определяет специфичность к отдельной аминокислоте, тогда как Е и С домены могут быть получены из любого выбранного модуля. Например, в ситуации, когда выбранный источник модуля для включения первой аминокислоты X не является первым модулем (M1 модуль) в ферментеисточнике и таким образом содержит С домен, С домен источника модуля может быть исключен. В ситуации, когда модуль-источник не содержит Е домен, в то время как эпимеризация включенной аминокислоты является желательной, может быть добавлен подходящий Е домен. Сконструированные NRPS ферменты могут быть созданы посредством интеграции соответствующих доменов и/или модулей в соответствующем порядке. Также возможно заменить модуль или домен фермента на подходящий модуль или домен другого фермента. Это объединение или обмен доменов и/или модулей может быть сделано с помощью методов генной инженерии, общеизвестных в данной области техники. Объединение двух различных доменов или модулей может быть сделано в основном в линкерных областях, которые находятся внутри между модулями и доменами. См., например, ЕР 1255816 и Mootz H.D. et al. 2000, раскрывающие эти типы конструкций. Часть или все последовательности также могут быть получены с помощью специального синтеза соответствующей полинуклеотидной последовательности(ей). Например, объединение ATE тридоменного фрагмента из Hpg-специфического NRPS модуля с бимодульным Cys-Val-специфическим фрагментом ACVS может быть сделано следующим образом. ATE фрагмент Hpg специфического модуля может быть выделен посредством обработки рестрикционным ферментом соответствующего гена NRPS в линкерных положениях, конкретнее, между С доменом и А -7- 016155 доменом Hpg специфического модуля, в случае С-концевого модуля, или между С доменом и А доменом Hpg специфического модуля и между Е доменом и следующим доменом (С или ТЕ домен), в случае внутренней элонгации модуля. Бимодульный Cys-Val фрагмент ACVS может быть получен 1) оставлением С-конца интактным, и 2) заменой С домена Cys специфического модуля 2 на С домен, который имеет D CL специфичность. По аналогии с выделением ATE фрагмента может быть выделен АТЕС четырехдоменный фрагмент, включая С домен соседнего, находящегося "ниже" модуля. Последний соединяется с бимодульным Cys-Val фрагментом ACVS без находящегося "выше" С домена. Ферменты NRPS, как описано здесь, соответственно могут быть подвергнуты методам мутагенеза, например, для улучшения каталитических свойств ферментов. Полипептиды, как описано здесь, можно получить синтетическими способами, хотя обычно они могут быть сделаны рекомбинантно посредством выделения полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, в подходящем организме-хозяине. В четвертом аспекте предоставлены полинуклеотиды (например, выделенные и/или очищенные), содержащие полинуклеотидную последовательность, кодирующую разновидность IPNS или полипептиды NRPS предшествующих аспектов изобретения. Полинуклеотиды настоящего изобретения, кроме того, включают любые вырожденные варианты полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид. Например, квалифицированный специалист может, используя обычные методики, делать нуклеотидные замены, которые не затрагивают белковую последовательность, закодированную в полинуклеотидах изобретения, для того, чтобы отразить использование кодона любого отдельного организмахозяина, в котором полипептиды изобретения экспрессируются. Предпочтительно кодирующие последовательности в полинуклеотидах оптимизируются посредством оптимизации кодоновой пары. Полинуклеотидная последовательность изобретения может представлять собой РНК или ДНК и включает геномную ДНК, синтетическую ДНК или кДНК. Предпочтительно полинуклеотид представляет собой ДНК последовательность. Полинуклеотиды, кодирующие модули M1, M2 и М3 фермента NRPS первого аспекта, например, могут иметь нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 11, кодирующими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 10, или могут быть нуклеотидными последовательностями, кодирующими гомологи вышеупомянутых аминокислотных последовательностей, как определено выше. Полинуклеотиды могут быть синтезированы согласно способам, хорошо известным в данной области техники. Они могут быть получены комбинированием олигонуклеотидов, синтезированных согласно и в соответствии с нуклеотидной последовательностью полинуклеотида изобретения. Альтернативно, они могут быть синтезированы посредством мутагенеза родительского полинуклеотида в любом желательном положении. Полинуклеотиды, кроме того, могут быть использованы для получения полинуклеотидов, кодирующих дополнительный модифицированный полипептид, например, подвергая полинуклеотиды дополнительным методам мутагенеза. Таким образом, полипептиды с улучшенной активностью в основном получают способом, включающим стадии подвергания полинуклеотида, кодирующего полипептид, мутагенезу, скрининга полученной популяции различных полипептидов на желательную активность и выделение разновидностей с улучшенной активностью. Мутагенез может быть выполнен с помощью любого подходящего способа, известного специалисту в данной области техники. Мутагенез может включать подвергание случайному мутагенезу, так же как и сайт-направленному мутагенезу. При использовании сайт-направленного мутагенеза его предпочтительно комбинируют с насыщающим мутагенезом в выбранном положении(ях), давая возможность замещения первоначальной аминокислоты любой другой аминокислотой. Технология "перетасовки" полинуклеотидов ("перетасовка" генов) (например, как описано в WO 95/22625, WO 98/27230, WO 98/01581, WO 00/46344 и/или WO 03/010183) может быть использована для получения разновидностей со случайной комбинацией любых отличающихся положений, присутствующих в любом представителе исходной популяции молекул. Исходная популяция, кроме того, может включать одну или больше разновидностей согласно изобретению. Изобретение также обеспечивает векторы, содержащие полинуклеотид изобретения, включая клонирующий и экспрессионный векторы или кассеты. В экспрессионном векторе или кассете полинуклеотид является функционально связанным с регуляторной последовательностью, которая способна обеспечивать экспрессию полипептида из его кодирующей последовательности клеткой-хозяином. Термин "функционально связанный" относится к смежному положению, в котором описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать предназначенным образом. Регуляторная последовательность, такая как промотор, энхансер или другой экспрессионный регуляторный сигнал, "функционально связанный" с кодирующей последовательностью, располагается так, что экспрессия полипептида из его кодирующей последовательности достигается при условиях, совместимых с регуляторными последовательностями. Промоторы/энхансеры и другие экспрессионные регуляторные сигналы могут быть выбраны для -8- 016155 того, чтобы быть совместимыми с клеткой-хозяином, для которой создан полигенный экспрессирующий кластер (expression cassette) или вектор. Если полипептид продуцируется как секретируемый протеин, полинуклеотидная последовательность, кодирующая зрелую форму полипептида в полигенном экспрессирующем кластере, является функционально связанной с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальный пептид. Последовательность ДНК, кодирующую полипептид изобретения, предпочтительно помещают в подходящего хозяина как часть полигенного экспрессирующего кластера. Для трансформации подходящего хозяина полигенным экспрессирующим кластером пригодны способы трансформации, которые хорошо известны квалифицированному специалисту. Полигенный экспрессирующий кластер может быть использован для трансформации хозяина как часть вектора, несущего селектируемый маркер, или полигенный экспрессирующий кластер может быть совместно трансформирован как отдельная молекула вместе с вектором, несущим селектируемый маркер. Вектор может содержать один или больше селектируемых маркерных генов. Для большинства мицелиальных грибов и дрожжей экспрессирующая конструкция предпочтительно является интегрированной в геном клетки-хозяина для получения устойчивых трансформантов. В таком случае конструкции являются или интегрированными в случайные локусы в геноме, или в предопределенные локусы-мишени с использованием гомологичной рекомбинации. Таким образом, пятый аспект изобретения обеспечивает клетки-хозяева, трансформированные или содержащие полинуклеотид или вектор изобретения. Подходящими клетками-хозяевами являются клетки-хозяева, которые делают возможным высокий уровень экспрессии представляющего интерес полипептида. Такие клетки-хозяева являются удобными в случае, если полипептиды нужно получить и затем использовать, например, в реакциях in vitro. Может быть выбран гетерологичный хозяин, в котором полипептид изобретения производится в форме, которая является, по существу, свободной от других полипептидов со сходной активностью, как полипептиды изобретения. Этого можно достигнуть выбором хозяина, который обычно не производит подобные полипептиды со сходной активностью. Подходящими клетками-хозяевами также являются клетки, способные производить β-лактамовые соединения, предпочтительно клетками-хозяевами, обладающими способностью производить βлактамовые соединения на высоких уровнях. Клетками-хозяевами, например, могут быть прокариотические (например, бактериальные), грибковые или дрожжевые клетки. Хозяин может быть выбран на основе альтернативы - производить пенамовое или цефемовое соединение. Когда рассматривается получение цефемового соединения, хозяин может нативно содержать необходимые гены пути биосинтеза, приводящего к цефемовому соединению, в частности гены, кодирующие экспандазную активность и, необязательно, гидроксилазную и ацетилтрансферазную активность. Альтернативно, один или больше генов пути биосинтеза, приводящего к цефемовому соединению, могут быть трансформированы в клеткухозяин, лишенную этих генов. В связи с этим квалифицированному специалисту известно, что ферменты экспандаза и экспандаза/гидроксилаза способны к разложению ампициллина и амоксициллина (Chin et al. 2003, FEMS Microbiol. Lett., 218, 251-257; Lloyd et al. 2004, J. Biol. Chem. 279, 15420-15426). В одном варианте осуществления подходящая клетка-хозяин представляет собой клетку, в которой нативные гены, кодирующие ферменты ACVS и/или IPNS, инактивированы, например, инсерционной инактивацией. Также возможно удалить полный кластер биосинтеза пенициллина, содержащий гены, кодирующие ACVS, IPNS и AT. В этом случае получение представляющего интерес β-лактамового соединения возможно без одновременного получения природного β-лактама. Инсерционная инактивация, таким образом, может совершаться с использованием гена, кодирующего NRPS, и/или гена, кодирующего IPNS, как описано выше. В клетках-хозяевах, которые содержат множественные копии β-лактамовых генных кластеров, могут быть отобраны клетки-хозяева, в которых эти кластеры спонтанно ликвидированы. Например, устранение β-лактамовых генных кластеров описано в патентной заявке РСТ/ЕР 2007/054045. Другой подходящей клеткой-хозяином является клетка, которая способна синтезировать предшественник аминокислот Hpg или Pg. Гетерологичная экспрессия генов пути биосинтеза, ведущего к Hpg или Pg, раскрыта в WO 02/34921. Биосинтез Pg или Hpg достигается удалением фенилпирувата (РР) или ρгидроксифенилпирувата (НРР) соответственно из ароматического аминокислотного пути, превращающего РР или НРР в миндальную кислоту (МА) или ρ-гидроксиминдальную кислоту (НМА) соответственно, превращающего МА или НМА в фенилглиоксилат (PGL) или ρ-гидроксифенилглиоксилат (HPGL) соответственно и окончательно превращающего PGL или HPGL в D-Pg или D-Hpg соответственно. Пример 15 приводит пример экспрессии пути биосинтеза Hpg или Pg в Penicillium chrysogenum. Другой подходящей клеткой-хозяином является клетка, которая (сверх)экспрессирует 4'-фосфопантетеин трансферазу (РРТаза). 4'-Фосфопантетеин (РРТ) представляет собой важнейшую простетическую группу в числе других ацил-несущих протеинов синтаз жирных кислот и поликетидсинтаз и пептидил-несущих протеинов NRPS. Свободная тиоловая часть РРТ, как тиоэфиры, служит для ковалентного связывания промежуточных соединений ацильной реакции, обычно ацетил, малонил и аминоацил групп, -9- 016155 во время многошаговой сборки мономерных предшественников. РРТ часть получают из коэнзима А (СоА) и посттрансляционно переносят на инвариантную боковую цепь серина. Это Mg2+-зависимое превращение апопротеинов в голопротеины катализируется 4'-фосфопантетеин трансферазами (РРТазы). Полезно (сверх)экспрессировать РРТазу с широкой субстратной специфичностью. Такая РРТаза кодируется, например, геном gsp из Bacillus brevis (Borchert et al. 1994, J. Bacteriology, 176, 2458-2462). Хозяин может соответственно включать одну или больше модификаций, как упомянуто выше. Предпочтительным хозяином является штамм Penicillum chrysogenum. В следующем аспекте изобретение обеспечивает способ получения полипептида согласно изобретению культивированием клетки-хозяина (например, трансформированной экспрессионным вектором или кассетой, как описано выше) при условиях, ведущих к экспрессии (посредством вектора или кассеты) полипептида согласно изобретению и, необязательно, извлечения экспрессированного полипептида. Полипептид может быть произведен как секретируемый протеин, и в этом случае полинуклеотидная последовательность, кодирующая зрелую форму полипептида в экспрессирующей конструкции, является функционально связанной с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальный пептид. Полипептид также может быть произведен как слитый (гибридный) протеин, т.е. соединенный с (частью) другим полипептидом, например слитый с мальтозу-связывающим протеином. Для реакций in vitro может быть использован секретируемый полипептид или бесклеточный экстракт, содержащий полипептид. Необязательно, полипептид может быть (частично) очищен перед его использованием. В следующем аспекте изобретение обеспечивает способ получения β-лактамового соединения культивированием клетки-хозяина предыдущего аспекта при таких условиях, чтобы обеспечить экспрессию EPNS и/или NRPS полипептида(ов), как описано здесь, и подходящих для производства βлактамового соединения, но необязательно извлечения β-лактамового соединения. Согласно изобретению β-лактамовое соединение, которое производится, является N-ацилированным β-лактамовым соединением, в котором N-ацил боковая цепь является N-α-аминогидроксифенилацетил или N-αаминофенилацетил боковой цепью. Преимущественно настоящее изобретение раскрывает полностью ферментативное получение таких β-лактамовых антибиотиков. Примерами таких β-лактамовых антибиотиков являются амоксициллин, ампициллин, цефадроксил и цефалексин. Клетки-хозяева согласно изобретению можно культивировать с помощью методов, известных в данной области техники. Для каждой комбинации промотора и клетки-хозяина имеются условия культивирования, которые являются благоприятными для экспрессии полипептида изобретения. После достижения необходимой плотности клеток или титра полипептида культивирование останавливают и полипептид отделяют, используя известные методы. Дополнительно могут быть установлены условия ферментации, способствующие получению β-лактама. Ферментативная среда может включать известную культуральную среду, содержащую источник углерода (например, глюкозу, мальтозу, мелассу), источник азота (например, сульфат аммония, нитрат аммония, хлорид аммония, источники органического азота, например экстракт дрожжей, солодовый экстракт, пептон), витамины и другие неорганические питательные источники (например, фосфат, магний, калий, цинк, железо, микроэлементы и т.д.). Необязательно, может быть включен индуктор. Выбор подходящей среды может основываться на выборе хозяина экспрессии и/или исходя из регулятивных требований экспрессирующей конструкции. Подобные среды хорошо известны специалистам в данной области техники. Среда может, при необходимости, содержать дополнительные компоненты, поддерживающие трансформированных экспрессирующих хозяев больше других потенциально загрязняющих микроорганизмов. Также может быть необходимо дополнить среду соединениямипредшественниками β-лактамовых соединений, которые должны производиться. Например, может быть необходимо, в зависимости от хозяина, который используется, включать аминокислоты Hpg или Pg в культуральную среду. Если так, эти аминокислоты предпочтительно добавляются как отдельное питание. Ферментация может быть выполнена в течение периода 0,5-30 дней. Это может быть периодический, непрерывный или подпитываемый процесс, соответственно, при температуре в пределах между 0 и 45°С и, например, при значении рН между 2 и 10. Предпочтительными условиями ферментации являются температура в пределах между 20 и 37°С и/или значение рН между 3 и 9. Соответствующие условия обычно выбирают, исходя из выбора экспрессирующего хозяина и протеина и/или β-лактамового соединения, которое будет экспрессироваться. После ферментации, если необходимо, клетки могут быть удалены из ферментационного бульона посредством центрифугирования или фильтрации. После остановки ферментации и/или после удаления клеток полипептид изобретения или полученное β-лактамовое соединение может быть извлечено с использованием обычных способов. Извлечение (восстановление) может включать стадии очистки, и/или экстракции, и/или кристаллизации. Удобнее всего полипептид изобретения или β-лактамовое соединение комбинируют с подходящими (твердыми или жидкими) носителями или растворителями, включая буферы, для получения композиции полипептида или β-лактамового соединения. Полипептид или β-лактамовое соединение может быть прикреплено к или смешано с носителем, например иммобилизовано на твердом носителе. Таким обра- 10 - 016155 зом, настоящее изобретение в следующем аспекте обеспечивает композицию, содержащую полипептид изобретения или β-лактамовое соединение. Она может иметь форму, подходящую для упаковки, транспортировки и/или хранения, предпочтительно, когда активность полипептида сохраняется. Композиции могут быть в форме пасты, жидкости, эмульсии, порошка, хлопьев, гранулята, шарика или другой экструдируемой форме. Примеры Основные материалы и методы. Стандартные ДНК методы были выполнены, как описано в других работах (Sambrook, J. et al., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), если не указано особо. ДНК была амплифицирована с применением корректирующего фермента (proofreading) Phusion полимеразы (Finnzymes). Использовали рестрикционные ферменты от компании Invitrogen или New England Biolabs. Грибковый рост осуществляли в минеральной среде, содержащей (г/л): глюкозу (5); лактозу (80); мочевину (4,5); (NH4)2SO4 (1,1); Na2SO4 (2,9); KH2PO4 (5,2); K2HPO4 (4,8) и 10 мл/л раствора микроэлементов А, содержащего лимонную кислоту (150); FeSO4⋅7H2O (15); MgSO4⋅7H2O (150); Н3ВО3 (0,0075); CuSO4⋅5H2O (0,24); CoSO4⋅7H2O (0,375); ZnSO4⋅7H2O (5); MnSO4⋅H2O (2,28); CaCl2⋅2Н2О (0,99); pH перед стерилизацией 6,5. В качестве обогащенной среды была использована YEPD, содержащая (г/л): дрожжевой экстракт (10); пептон (10); глюкозу (20). Культуры инкубируют при 25°С в орбитальном шейкере при 280 об/мин в течение 72-168 ч. Трансформации Penicillium chrysogenum были выполнены на штамме Wisconsin 54-1255 (АТСС 28089). Также являются подходящими другие штаммы P. chrysogenum, включая мутанты штамма Wisconsin 54-1255, имеющие улучшенный выход β-лактама. Примером такого штамма является CBS 455.95. Кроме того, штаммы P. chrysogenum с мутациями или делециями, приводящими к отсутствию или уменьшению производства β-лактама, также являются подходящими как организмы-хозяева трансформации, например штаммы в которых β-лактамовые генные кластеры ликвидированы, как описано в патентной заявке РСТ/ЕР 2007/054045. Трансформация P. chrysogenum была выполнена, как описано в WO 2004/106347. Пример 1. Культивирование Penicillium chrysogenum и исследование неприродных трипептидов, таких как DLD-Hpg-Cys-Val или DLD Pg-Cys-Val. Penicillium chrysogenum культивировали в неорганической среде (25 мл) в течение 96 ч при 25°С. Необязательно, культуры были выращены с или без аминокислот, таких как L-Hpg (1 мМ окончательная концентрация) или L-Pg (1 мМ окончательная концентрация). В конце ферментации мицелий удаляли центрифугированием или фильтрацией, причем мицелий отмывали физиологическим раствором. И мицелий, и среду анализировали на трипептиды, такие как DLD-Hpg-Cys-Val и DLD-Pg-Cys-Val, с помощью MS методов, таких как LC-MS/MS. В качестве стандартов были использованы синтезированные по заказу трипептиды DLD-Hpg-Cys-Val и DLD-Pg-Cys-Val. В результате ни в мицелии, ни в среде не были обнаружены трипептиды, такие как DLD-Hpg-Cys-Val и DLD-Pg-Cys-Val. Как заключение, P. chrysogenum не вырабатывает эти неприродные трипептиды. Пример 2. Клонирование модуля нерибосомальной пептидной синтетазы и доменных кассет. 2а. Клонирование модульных фрагментов NRPS, которые катализируют включение и последующую эпимеризацию L-Hpg в D-Hpg. Хромосомная ДНК была выделена из Streptomyces coelicolor A3(2). Позже были выполнены ПЦР реакции с добавлением 3-8% DMSO к реакционным смесям, кроме того, и применением стандартных условий. Были использованы следующие олигонуклеотиды: HpgFw1 (caccatggcgacgctgccggaactgttc; SEQ ID NO: 12) и HpgRev1 (tcaattaattaaccactcggactcaaggtcggac; SEQ ID NO: 13). Полученный ПЦР фрагмент Hpg1, дающий ATE тридомен модуля CDA I синтетазы из S. coelicoior, клонировали в pENTR/SD/D-Topo вектор (Invitrogen, Нидерланды), дающий в результате плазмидный pHpg1. 2b. Специальный синтез синтетического модульного фрагмента NRPS, который катализирует включение и последующую эпимеризацию L-Pg в D-Pg. Синтетический фрагмент ДНК, состоящий из последовательности ДНК согласно SEQ ID NO: 5 был синтезирован по заказу (DNA 2.0, Menlo Park, Калифорния, США). ДНК фрагмент содержал тридомен ATE. Фрагмент AT происходил из С-концевого модуля протеина SnbD пристинамицин синтетазы S. pristinaspiralis. Е-домен был взят из модуля 6 синтетазы CDA S. coelicoior. Фрагмент ДНК был клонирован в вектор pCR-Blunt (Invitrogen) с использованием протокола, предоставленного поставщиком, дающий вектор pPg1. 2с. Клонирование бимодульных фрагментов NPRS, специфичных к включению цистеина и валина. Для этих экспериментов гены ACV (5(L-α-аминоадипат)-L-цистеин, D-валин) трипептид синтетазы из Penicillium chrysogenum и Nocardia tactamdurans были взяты как образцы. Были выполнены реакции ПЦР амплификации с использованием образцов ДНК каждого организма. Были использованы следующие олигонуклеотиды для P. chrysogenum: олигопара PcM2M3fw1 (caccttaattaatgaggagaatgcagcaacggac; SEQ ID NO: 14) и PcM2M3rev1 (tcaatagcgagcgaggtgttc; SEQ ID NO: 15), дающая в результате фрагмент РсМ2М3_1 (доменная организация САТСАТЕТе), олигопара PcM2M3fw2 (caccactagtctggagtatctctcatctatc; - 11 - 016155 SEQ ID NO: 16) и PcM2M3rev1 (tcaatagcgagcgaggtgttc; SEQ ID NO: 15), дающая в результате фрагмент РсМ2М3_2 (доменная организация АТСАТЕТе). Фрагмент РсМ2М3_1 был клонирован в pENTR/SD/DTopo, дающий рРсМ2М3_1, и клонирование фрагмента РсМ2М3_2 в тот же самый вектор дало плазмиду рРсМ2М3_2. Аналогичным образом были выполнены ПЦР амплификации с хромосомной ДНК Nocardia lactamdurans. Реакции с использованием олигонуклеотидов NIM2M3fw1 (caccttaattaatgccgaagaggtcaccacc; SEQ ID NO: 17) и NIM2M3rev1 (ggtcatcgctccctagg; SEQ ID NO: 18) дали фрагмент ДНК NIM2M3_1 (доменная организация САТСАТЕТе), тогда как реакции с олигами NIM2M3fw2 (caccactagtctcatctcaccgtcgatg; SEQ ID NO: 19) и NIM2M3rev1 (ggtcatcgctccctagg; SEQ ID NO: 18) давали в результате фрагмент NIM2M3_2 (доменная организация АТСАТЕТе). Оба фрагмента были окончательно клонированы в pENTR/SD/D-Topo векторы, давая плазмиды pNIM2M3_1 и pNIM2M3_2 соответственно. 2d. Клонирование доменного фрагмента конденсации NRPS, специфичного к образованию пептидной связи между D- и L-аминокислотой. Были клонированы два различных домена конденсации с DCL стереохимией. Первый домен был ПЦР-амплифицирован из CDAI синтетазы с использованием хромосомной ДНК Streptomyces coelicolor, с применением олигонуклеотидов sc_C_fw (caccttaattaatagccagcaaccgacccgtgcg; SEQ ID NO: 20) и sc_C-rev (ttactagtgtcgcgggcgtacgcctcgtc; SEQ ID NO: 21), давая фрагмент sc_C. Второй фрагмент, который состоял из NRPS DCL С домена из модуля ItuC С2 итурин синтетазы В. subtilis, согласно SEQ ID NO: 22, был специально синтезирован и назван Bs_C. Оба фрагмента были клонированы в вектор pENTR/SD/D-Topo, давая в результате плазмиды pSCC и pBSC соответственно. Пример 3. Создание генов трипептида нерибосомальной пептидной синтетазы объединением (слиянием) клонированного модуля NRPS и доменных кассет. Плазмидный pHpg1 был обработан рестрикционными ферментами Pacl и Ascl, давая в результате фрагмент ДНК 5,9 кб, который содержит ген Hpg-специфического NRPS модуля и большую часть векторной последовательности. Плазмиды pPcM1M2_1 были порезаны Ascl и Pacl, показывая фрагмент ДНК 8,5 кб. Лигирование этого фрагмента и фрагмента 5,9 кб из pHpg1 дало вектор pSCPC Гибрид1. Плазмиды pPcM1M2_2, pSC_C были ограничены Spel и Ascl, давая в результате фрагменты 7,0 кб и 1,4 кб соответственно. Оба фрагмента были лигированы и дали плазмиду pPcM1 M2_3. Плазмиды pPcM1M2_3 и плазмида pHpg1 были порезаны Pcil и Pacl, давая фрагменты ДНК 12 и 4,5 кб соответственно. Лигирование двух фрагментов давало в результате окончательную конструкцию pSC_SC_C_PCM2М3 Гибрид1. Дальнейшая рестрикция (ограничение) pSC_SC_C_PCM2M3 Гибрид1 и pBS_C с помощью Pacl и Spel привела к фрагментам 16 кб (pSC_SC_C_PCM2M3 Гибрид1 без С домена модуля 2 ACV синтетазы) и 1,4 кб (С домен Bacillus subtilis) соответственно. Лигирование двух фрагментов дало плазмиду pSC_BS_C_PCM2M3 Гибрид2. Ограничение (рестрикция) pHpg1 и pNIM1M2_1 с помощью Pacl и Aflll дало ДНК фрагменты 3,7 и 8,8 кб. Лигирование обоих фрагментов дало плазмиду pSCNL Гибрид1 Плазмиды pSC_SC_C_PCM2M3 Гибрид1 и pNIM1M2_2 были ограничены Spel и Aflll, давая в результате 4 кб (АТЕС тетрадоменную организацию из Hpg модуля и (D)C(L) домена) и 7 кб (АТСАТЕТе организацию) фрагменты соответственно. Лигирование обоих фрагментов дало плазмиду pSC_C_C_NLM2М3 Гибрид1. По аналогии плазмиды pSC_BS_C_PCM2M3 Гибрид1 и pNIM1M2_2 были ограничены Spel и Aflll, давая в результате 4 кб (АТЕС тетрадоменную организацию из Hpg модуля и (D)C(L) домена) и 7 кб (АТСАТЕТе организация) фрагменты соответственно. Лигирование давало плазмиду pSC_BS_С_NLM2M3 Гибрид2. Для конструкции гибридного гена фенилглицин специфической нерибосомальной пептидной синтетазы плазмиды pPg1 и pSC_SC_C_NLM2M3 Гибрид1 были ограничены каждый ферментами рестрикции Aflll и Pacl. Фрагмент ДНК 3,4 кб (содержащий ATE NRPS тридомен) pPg1 был лигирован в 14 кб векторные фрагменты, полученные рестрикцией pSC_SQ_C_NLM2M3 Гибрид1, давая в результате плазмиду pPg_SC_C_NIM2M3 Гибрид1. Аналогично, если вектор pSC_SC_C_NLM2M3 Гибрид1 был замещен вектором pSC_BS_C_NLM2M3 Гибрид2, полученной плазмидой была pPg_BS_С_NIM2M3 Гибрид2. Пример 4. Создание входного экспрессирующего целевого вектора (Gateway® expression destination vector) Penicillium chysogenum для гибрид-нерибосомальных пептидных синтетаз. Плазмидная рРТ12, содержащая Notl-фланкированную промотор-терминаторную кассету из IPN синтетазы из Penicillium chrysogenum, была обработана Notl (описание вектора см. Theilgaard et al. 2000, Biotechnology and Bioengineering, 72, 380-387). Таким образом, полученная IPNS промотортерминаторная кассета была клонирована в pBluescriptll SK (Stratagene, Нидерланды), который был также обработан Notl. Лигирование привело к рПродукту1. Плазмидный рПродукт1 был ограничен BamH1 и Xhol. Кроме того, был специально синтезирован фрагмент ДНК, который содержал кассету устойчивости к флеомицину под контролем промотора gpdA. Кассета имеет последовательность согласно SEQ ID NO: 23. После рестрикции этого специально синтезированного фрагмента ДНК с помощью BamHI и XhoI, полученная ДНК была лигирована в вектор рПродукт1 (который был открыт с помощью BamHI, XhoI). Полученная плазмида была названа рПродукт2. В завершающей стадии клонирования фрагмент ДНК, содержащий attR1-cat-ccdB-attR2 кассету (ген резистентности и токсичности к хлорамфениколу для Е. - 12 - 016155 coli), был ПЦР-амплифицирован из входного целевого (Gateway® Destination) вектора, такого как рЕТDEST42 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). Были использованы следующие олигонуклеотиды: fw: ttatcgatttgcataaaaaacagac (SEQ ID NO: 24), rev: ttatcgatgcttaccttcaagcttcg (SEQ ID NO: 25). Полученный фрагмент ДНК был ограничен Clal и позже клонирован в рПродукт2, который также был предварительно открыт обработкой Clal. Здесь были отобраны плазмиды, которые содержали фрагмент attR1-cat-ccdBattR2 в такой ориентации, что attR1 соединялся затем с промотором IPNS PIPNS. Полученный входной целевой (Gateway® destination) вектор был назван pDEST-Pcexpr1. Пример 5. Создание экспрессирующих конструкций P. chrysogenum для нерибосомальных пептидных синтетаз. Для создания экспрессирующих конструкций P. chrysogenum была выполнена Gateway® LRClonase реакция с использованием стандартных условий, как описано Invitrogen. Подробные протоколы см. в руководствах от Gateway® technology на http://www.invitrogen.com. Для реакции каждый из входных векторов pSCNL Гибрид1, pSC_SC_C_NLM2M3 Гибрид1 и pSC_BS_C_NLM2M3 Гибрид2 был проинкубирован с Gateway® destination вектором pDEST-Pcexpr1. Названия полученных экспрессирующих плазмид см. в табл. 1. Альтернативно, для создания экспрессирующих конструкций P. chrysogenum, конструкции, содержащие сконструированные трипептидные NRPS-гены, были функционально связаны с Notlфланкированной промотор-терминаторной кассетой из pcbC-гена от Penicillium chrysogenum (описание вектора см. Theilgaard et al. 2000, Biotechnology and Bioengineering, 72, 380-387) с помощью слияния-ПЦР (fusion-ПЦР). Названия полученных экспрессирующих плазмид см. в табл. 1. Таблица 1 Пример 6. Трансформация Penicillium chrysogenum линеаризированной плазмидой pEXPR-NRPS4, культивирование и исследование трипептидов. В независимых экспериментах Penicillium chrysogenum был трансформирован pEXPR-NRPS4, который был линеаризирован перед трансформацией подходящими ферментами, которые вмешиваются в векторный остов, такой как Psil или Pcil. Отбор трансформантов был сделан на чашках с неорганической агаровой средой с 50 г/мл флеомицина и 1М сахарозы. Колонии, устойчивые к флеомицину, появляющиеся на этих чашках регенерации протопласта (protoplast regeneration plates), были еще раз посеяны ″штрихом″ на свежие чашки с флеомицином без сахарозы и росли до споруляции. Был произведен отбор трансформантов, устойчивых к флеомицину, с помощью метода молекулярных колоний ПЦР в геле (colony PCR) на наличие генов NRPS. Для этого небольшую часть колонии суспендировали в 50 л буфера ТЕ (Sambrook et al., 1989) и инкубировали в течение 10 мин при 95°С. Для избавления от обломков клеток смесь центрифугировали в течение 5 мин при 3000 об/мин. Супернатант (5 л) был использован как образец для ПЦР реакции с Super-Taq от компании НТ Biotechnology Ltd. ПЦР реакции анализировали на E-gel96 от компании Invitrogen. Следующие олигонуклеоитды были использованы в ПЦР скрининге колоний (см. SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27): Ожидаемый размер этих ПЦР реакций составлял 303 п.о. Положительные клоны подвергались одной добавочной стадии очистки на свежих агаровых чашках с флеомицином без сахарозы. Потом они росли на неорганической среде, как описано в "Основных материалах и методах". Дополнительно аминокислота L-Hpg (4-гидроксифенилглицин) или L-Pg (фенилглицин) была добавлена до окончательной концентрации 1 мМ, в зависимости от того, какой трипептид исследовали. Культивирование проводили во встряхиваемой колбе или на 24-луночных тетрационных микропланшетах. В конце ферментации мицелий удаляли центрифугированием или фильтрацией, а мицелий промывали физиологическим раствором. И мицелий, и среда были оценены на трипептиды, такие как DLD-Hpg-Cys-Val (если L-Hpg был добавлен к среде) и DLD-Pg-Cys-Val (если L-Pg был добавлен к среде), с помощью MS методов, таких как LC-MS/MS. В качестве стандартов использовали специально синтезированные трипептиды DLD-Hpg-Cys-Val и DLD-Pg-Cys-Val. В результате ни в мицелии, ни в среде трипептиды, такие как DLD-Hpg-Cys-Val и DLD-Pg-Cys-Val, не были обнаружены. В качестве за- 13 - 016155 ключения P. chrysogenum не производит эти неприродные трипептиды, если были интегрированы NRPS конструкции полигенных экспрессирующих кластеров, такие как pEXPR-NRPS4. Пример 7. Трансформация Penicillium chrysogenum линеаризированными плазмидами pEXPR-20 NRPS5 и pEXPR-NRPS6, культивирование и получение трипептида DLD-Hpg-Cys-Val. В независимых экспериментах Peniciliium chrysogenum был трансформирован или pEXPR-NRPS5 или pEXPR-NRPS6, которые были линеаризированы до трансформации подходящими ферментами, которые вмешиваются в векторный остов, такой как Psil или Pcil. Трансформация P. chrysogenum была выполнена при условиях, например, описанных в WO 2004/106347. Отбор трансформантов был сделан на агаровых чашках с неорганической средой с 50 г/мл флеомицина и 1М сахарозой. Колонии, устойчивые к флеомицину, появляющиеся на этих чашках регенерации протопласта, были еще раз посеяны ″штрихом″ на свежие чашки с флеомицином без сахарозы и росли до споруляции. Был произведен отбор трансформантов, устойчивых к флеомицину, с помощью ПЦР-колоний на наличие генов NRPS. Для этого небольшую часть колонии суспендировали в 50 л ТЕ буфера (Sambrook et al., 1989) и инкубировали в течение 10 мин при 95°С. Для избавления от обломков клеток смесь центрифугировали в течение 5 мин при 3000 об/мин. Супернатант (5 л) был использован как образец для ПЦР реакции с Super-Taq от компании НТ Biotechnology Ltd. ПЦР реакции анализировали на E-gel96 от компании Invitrogen. Следующие олигонуклеоитды были использованы в ПЦР скрининге колоний (см. SEQ 5 ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27): Ожидаемый размер этих ПЦР реакций составлял 303 п.о. Положительные клоны подвергались одной добавочной стадии очистки на свежих агаровых чашках с флеомицином без сахарозы. Потом они росли на неорганической среде, как описано в "Основных материалах и методах". Дополнительно аминокислота L-Hpg (4-гидроксифенилглицин) или L-Pg (фенилглицин) была добавлена до окончательной концентрации 1 мМ в зависимости от того, какой трипептид исследовали. Культивирование проводили во встряхиваемой колбе или на 24-луночных тетрационных микропланшетах. В конце ферментации мицелий удаляли центрифугированием или фильтрацией, а мицелий промывали физиологическим раствором. И мицелий, и среда были оценены на трипептиды, такие как DLD-Hpg-Cys-Val (если L-Hpg был добавлен к среде) и DLD-Pg-Cys-Val (если L-Pg был добавлен к среде), с помощью MS методов, таких как LC-MS/MS. В качестве стандартов использовали специально синтезированные трипептиды DLD-Hpg-Cys-Val и DLD-Pg-Cys-Val. Мицелий и супернатант показали значительные уровни трипептида DLD-Hpg-Cys-Val. Отрицательный контроль, для которого был использован нетрансформированный штамм Р. chrysogenum Wisconsin 54-1255 (АТСС 28089), не показал образование DLD-Hpg-Cys-Val трипептида. Этот результат дает доказательство того, что трансформированные сконструированные нерибосомальные пептидные синтетазы производят неприродный трипептид DLD-Hpg-Cys-Val. Пример 8. Трансформация Penicillium chrysogenum линеаризированной плазмидой pEXPR-NRPS7 и pEXPR-NRPS8, культивирование и получение трипептида DLD-Pg-Cys-Val. В независимых экспериментах Peniciliium chrysogenum был трансформирован или pEXPR-NRPS7 или pEXPR-NRPS8, которые были линеаризированы до трансформации подходящими ферментами, которые вмешиваются в векторный остов, такой как Psil или Pcil. Трансформация Р chrysogenum была выполнена при условиях описанных, например, в WO 2004/106347. Отбор трансформантов был сделан на агаровых чашках с неорганической средой с 50 г/мл флеомицина и 1М сахарозы. Колонии, устойчивые к флеомицину, появляющиеся на этих чашках регенерации протопласта, были еще раз посеяны ″штрихом″ на свежие чашки с флеомицином без сахарозы и росли до споруляции. Был произведен отбор трансформантов, устойчивых к флеомицину, с помощью ПЦР-колоний на наличие генов NRPS. Для этого небольшую часть колонии суспендировали в 50 л ТЕ буфера (Sambrook et al., 1989) и инкубировали в течение 10 мин при 95°С. Для избавления от обломков клеток смесь центрифугировали в течение 5 мин при 3000 об/мин. Супернатант (5 л) был использован как образец для ПЦР реакции с Super-Taq от компании НТ Biotechnology Ltd. ПЦР реакции анализировали на E-gel96 от компании Invitrogen. Следующие олигонуклеоитды были использованы в ПЦР скрининге колоний (см. SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27): Ожидаемый размер этих ПЦР реакций составлял 303 п.о. Положительные клоны подвергались одной добавочной стадии очистки на свежих агаровых чашках с флеомицином без сахарозы. Потом они росли на неорганической среде, как описано в "Основных материалах и методах". Дополнительно аминокислота L-Hpg (4-гидроксифенилглицин) или L-Pg (фенилгли- 14 - 016155 цин) была добавлена до окончательной концентрации 1 мМ в зависимости от того, какой трипептид исследовали. Культивирование проводили во встряхиваемой колбе или на 24-луночных тетрационных микропланшетах. В конце ферментации мицелий удаляли центрифугированием или фильтрацией, а мицелий промывали физиологическим раствором. И мицелий, и среда были оценены на трипептиды, такие как DLD-Pg-Cys-Val (если L-Pg был добавлен к среде), с помощью MS методов, таких как LC-MS/MS. В качестве стандартов использовали специально синтезированные трипептиды DLD-Hpg-Cys-Val и DLDPg-Cys-Val. Мицелий и супернатант показали значительные уровни трипептида DLD-Pg-Cys-Val. Отрицательный контроль, для которого использовали нетрансформированный штамм P. chrysogenum Wisconsin 54-1255 (АТСС 28089), не показал образование трипептида DLD-Pg-Cys-Val. Этот результат дает доказательство того, что трансформированные сконструированные нерибосомальные пептидные синтетазы производят неприродный трипептид DLD-Pg-Cys-Val. Пример 9. Получение амоксициллина in vitro посредством превращения DLD-HpgCV. Три различные конструкции, содержащие pcbC-гены Penicillium chrysogenum (pAJL-pcbC), Nocardia lactamdurans (pAJL-pcbC-NL) и Aspergillus nidulans (pXTN313), были инокулированы из глицеринового исходного раствора и росли в течение ночи при 37°С, в 2× TY и 35 мкг хлорамфеникола на мл. Соответствующие pcbC-гены кодируют IPNS, которые производятся как гибридные протеины с МВР (мальтозасвязывающий протеин), кодируемым ma/E-геном от Escherichia coli. Гибридные гены malE-pcbC находятся под контролем IPTG-индуцируемого tac-промотора. Плазмидная ДНК была выделена из ночных культур. Выделенную ДНК использовали для трансформации Е. coli TOP10 (Invitrogen). Одну выделенную колонию использовали для инокуляции 10 мл 2× TY с добавлением 35 мкг хлорамфеникола на мл. После O/N инкубации при 37°С и 280 об/мин измеряли OD600. Штаммы разбавляли до 100 мл свежей средой до окончательного значения OD600 0,015. Был разрешен рост при 37°С и 280 rpm до тех пор, пока значение OD600 достигало значения между 0,4 и 0,6. IPTG добавляли до окончательной концентрации 0,5 мМ. Инкубацию продолжали при 22°С и 220 об/мин в течение ночи. Клетки собирали центрифугированием и отмывали 0,9% NaCl в очищенной воде milliQ. Клеточные осадки ресуспендировали в 1,5 мл буфере для экстракции (50 мМ Трис HCl рН 7,5; 0,5 мг лизозим/мл, 5 мМ DTT). Для лизирования клеток осуществляли обработку ультразвуком. После центрифугирования в течение 10 мин при 14000 об/мин в цетрифуге Eppendorf, отбирали аликвоты 200 мкл и замораживали в жидком азоте. Замороженные бесклеточные экстракты хранили при -80°С. Исследования активности IPNS было выполнено с ACV и HpgCV в качестве субстратов. Кроме стандартных условий исследования для изучения IPNS активности были применены модификации смесей для того, чтобы предельно увеличить возможность успеха. Реакционные смеси были следующие. Реакционная смесь 1 (стандартное исследование). 30-50 мМ Трис HCl рН 8.0 (предпочтительно 36 мМ) 1-6,7 мМ аскорбат (предпочтительно 3 мМ) от 50 мкМ до 2 мМ FeSO4 (предпочтительно 86 мкМ) 0,3-2 мМ трипептида (предпочтительно 1,5 мМ для ACV и 0,75 мМ для HpgCV) 0,75-4 мМ DTT (предпочтительно 3 мМ) Бис-ACV был уменьшен до ACV посредством смешивания двух аликвот 7,5 мМ бис-ACV с одной аликвотой 60 мМ DTT, с последующей инкубацией от 5 до 25 мин при комнатной температуре. Аналогично HpgCV был уменьшен перед текущим исследованием. Реакционная смесь 2 (альтернативное исследование). 30-50 мМ HEPES рН 7,0 (предпочтительно 36 мМ) 0,1-0,2 мМ аскорбат (предпочтительно 0,1 мМ) 1-50 мкМ FeSO4 (предпочтительно 25 мкМ) 0,3-2 мМ трипептида (предпочтительно 1,5 мМ для ACV и 1,5 мМ для HpgCV) 0,2-1,2 мМ ТСЕР (Трис(2-карбоксиэтил)фосфин) (предпочтительно 1 мМ). бис-ACV и HpgCV были предварительно обработаны ТСЕР для того, чтобы разорвать S-S связи в димерах. Для этого две аликвоты 7,5 мМ бис-ACV или HpgCV смешивали с одной аликвотой 20 мМ ТСЕР с последующей инкубацией от 5 до 25 мин при комнатной температуре. 5 мкл CFE, содержащих гибридные протеины MBP-IPNS, инкубировали с 595 мкл реакционных смесей, указанных выше. После 10 мин инкубации при 25°С реакцию останавливали добавлением 125 мкл реакции с 50 мкл ледяного метанола. После инкубации при -20°С в течение по меньшей мере 1 ч образцы анализировали с помощью LC/MS. Исследование LC/MS выполняли на приборе LCQ (Thermo Scientific), используя следующие установочные параметры: - 15 - 016155 Образцы были разведены в 10 раз очищенной водой milliQ и 25 мкл было инжектировано в LC/MS систему. Субстраты (ACV, HpgCV, PgCv) и продукты (IPN, амоксициллин, ампициллин) были идентифицированы, исходя из времени удерживания (LC), значения отношения (MS) массы к заряду (m/z), а также образца фрагментации во время фрагментации в MSn-способе. Результаты суммированы в таблице ниже. Таблица 2 Превращение субстратов ACV и HpgCV в IPN и амоксициллин соответственно гибридными протеинами MBP-IPNS из различных источников Неожиданно при экспериментальных условиях реакционной смеси 2 MBP-IPNS оказывается способным к превращению HpgCV в амоксициллин, тогда как при условиях реакционной смеси 1 не наблюдается превращение в амоксициллин. Пример 10. Проведение биопробы, позволяющей определить превращение DLD-HpgCV в амоксициллин. Бактериальные штаммы Escherichia coli ESS, Bacillus subtilis ATCC6633 и Micrococcus luteus - 16 - 016155 ATCC9341 выращивали в течение ночи в 2× TY-среде при 30°С и 280 об/мин. После 16 ч роста измеряли OD600. Обычно OD600 составляет 5,0, в пределах от 2,0 до 8,0. Раствор амоксициллина был сделан в концентрации 7 мг/мл. Потом были сделаны последовательные разведения в пределах от 1 мг/л до 0,001 мг/л. В качестве отрицательного контроля служила вода MilliQ. 25 мкл серийных разведений были отмерены пипеткой в лунки 96-луночных микропланшетов. Каждый микропланшет был приготовлен дважды. Ночные бактериальные культуры разводили в свежей 2× TY-среде до окончательного значения OD600 0,01. В каждую лунку было добавлено 150 мкл разведенных бактериальных культур. Микропланшеты закрывали крышкой и инкубировали в течение ночи при 25°С, а аналогичный микропланшет - при 37°С. После 16 ч инкубации снимали показания OD600 на микропланшетном ридере. Из результатов можно было узнать концентрацию амоксициллина, все еще допускающую неингибированный рост тестируемых микроорганизмов. Таблица 3 Концентрация амоксициллина, все еще допускающая неингибированный рост в 2× TY среде Пример 11. Проведение биопробы, позволяющей определить превращение DLD-PgCV в ампициллин. Бактериальные штаммы Escherichia coli ESS, Bacillus subtilis ATCC6633 и Micrococcus luteus ATCC9341 выращивали в течение ночи в 2× TY-среде при 30°С и 280 об/мин. После 16 ч роста измеряли OD600. Обычно значение OD600 составляет 5,0, в пределах от 2,0 до 8,0. Раствор ампициллина был сделан в концентрации 7 мг/мл. Потом были сделаны последовательные разведения в пределах от 1 до 0,001 мг/л. В качестве отрицательного контроля служила вода MilliQ. 25 мкл серийных разведений были отмерены пипеткой в лунки 96-луночных микропланшетов. Каждый микропланшет был приготовлен дважды. Ночные бактериальные культуры разводили в свежей 2× TY-среде до окончательной OD600 0,01. В каждую лунку было добавлено 150 мкл разведенных бактериальных культур. Микропланшеты закрывали крышкой и инкубировали в течение ночи при 25°С, а аналогичный микропланшет - при 37°С. После 16 ч инкубации снимали показания OD на микропланшетном ридере. Из результатов можно было узнать концентрацию ампициллина, все еще допускающую неингибированный рост тестируемых микроорганизмов. Таблица 4 Концентрация ампициллина, все еще допускающая неингибированный рост в 2× TY среде Пример 12. Скрининг pcbC-генов из разных видов для превращения DLD-HpgCV в амоксициллин in vitro. Кодирующие области pcbC-генов из 11 видов были расположены на ДНК 2,0 (1430 O'Brien Drive, Suite E, Menlo Park, CA 94025, США). Для этого последовательность ДНК кодирующей области была взята как основа. Были отобраны следующие виды: Cephalosporium Acremonium, Penicillium chrysogenum, Aspergillus (Emericella) nidulans, Streptomyces jumonjinensis, Nocardia lactamdurans, Streptomyces microflavis, Lysobacter lactamgenus, Flavobacterium species, Streptomyces clavuligerus, Streptomyces griseus, Streptomyces cattleya. Последовательность стартового (инициирующего) кодона была изменена до CATATG, сайт узнавания Ndel для того, чтобы облегчить дальнейшие стадии клонирования. Аналогично, Nsil-сайт (ATGCAT) был введен непосредственно после стоп-кодона (терминирующий кодон). Внутренние Nsil- и Ndel-сайты были удалены настолько, насколько возможно. Плазмиды, несущие pcbC-гены, были вырезаны с Nsil и Ndel, и кодирующая область pcbC-гена была выделена и субклонирована в вектор pSJ127, который был вырезан с теми же самыми ферментами. Таким образом, кодирующая область pcbC-гена является клонированной в рамку с malE-геном, кодирующим мальтозосвязывающий протеин, под контролем индуцируемого промотора. При индукции экспрессии будет синтезироваться гибридный протеин, состоящий из мальтозосвязывающего протеина на N-конце гибридного протеина и IPNS на С-конце. - 17 - 016155 E.coli TOP10, трансформированную malE-pcbC-плазмидами, выращивали в 2× TY-среде, содержащей 35 мкг хлорамфеникола/мл, в течение ночи при 37°С и 280 об/мин. На следующий день измеряли OD600 и клетки разводили свежей средой до окончательного значения OD600 0,015. Затем клетки росли (37°С, 280 об/мин) до тех пор, пока значение OD600 достигало 0,4-0,6. IPTG добавляли до окончательной концентрации 0,5 мМ. Рост продолжался в течение ночи при 22°С, 280 об/мин. Клетки собирали центрифугированием в течение 10 мин при 5000 об/мин и 4°С. Клетки отмывали 0,9% раствором NaCl и осаждали вновь центрифугированием. Клеточные осадки замораживали при -20°С в течение по меньшей мере 16 ч. Клеточные осадки ресуспендировали в 1,5 мл буфера для экстракции (50 мМ Трис-HCl рН 7,5; 5 мМ DTT), а экстрагирование проводили с помощью обработки ультразвуком. Экстракты центрифугировали для удаления обломков клеток в центрифуге для сосудов Эппендорфа (10 мин, 14000 об/мин, 4°С). Аликвоты супернатанта (бесклеточный экстракт, CFE) помещали в свежие пробирки Эппендорфа и замораживали в жидком азоте и потом хранили при -80°С. Превращение HpgCV в амоксициллин оценивали следующим образом. Во-первых, субстрат HpgCV восстанавливали смешиванием 500 мкл 200 мМ HpgCV и 500 мкл 20 мМ ТСЕР с последующей инкубацией при 25°С в течение 10 мин. Во-вторых, приготавливали следующую смесь для анализа (для 10 реакций): 300 мкл 0,5 мМ FeSO4⋅7H2O; 480 мкл 1,25 мМ аскорбата; 4270 мкл 50 мМ HEPES (рН 7,0). Исследование начинали смешиванием 90 мкл восстановленного субстрата, 505 мкл смеси для анализа и 5 мкл CFE, содержащего гибридный протеин MBP-IPNS. Реакционную смесь инкубировали при 25°С в течение 10 мин. В микропланшете смешивали 25 мкл реакционной смеси с 150 мкл разбавленной в 2× TY (OD600=0,01) ночной культуры Micrococcus luteus. Для того чтобы проверить, что любое возможное ингибирование роста было вызвано образованием амоксициллина, каждый образец также был проверен в присутствии β-лактамазы (Penase® от BBL Difco), которая расщепляет β-лактамовое кольцо и таким образом инактивирует антибиотическую активность. Микропланшет накрывали крышкой и инкубировали в течение ночи при 30°С и 550 об/мин. OD600 определяли с помощью ридера для микропланшет. Неожиданно, гибридные протеины MBP-IPNS, происходящие из pcbC-генов А. nidulans, а также S. clavutigerus, оба продемонстрировали ингибирование роста М. luteus, который вполне рос в присутствии Penase®, демонстрируя, что ингибирование происходило из-за образования амоксициллина из DLDHpgCV. Это было подтверждено с помощью LC-MS/MS исследования. Для этого реакцию останавливали добавлением 125 мкл реакционной смеси с 50 мкл метанола (-20°С). Образцы инкубировали в течение по меньшей мере 1 ч при -20°С. Выполняли стадию центрифугирования (14000 об/мин в течение 15 мин при 4°С) с последующим LC-MS/MS исследованием (см. пример 9). Результаты подтвердили результаты биоанализа. В качестве контроля был включен LLD-ACV. Действительно, как ожидалось, почти все гибридные протеины MBP-IPNS образовывали IPN (изопенициллин N). Добавление Penase® к реакционной смеси ликвидировало наблюдаемый эффект. Результаты вновь были подтверждены с помощью LC-MS/MS. Пример 13. Конструирование pcbC-генов. Клоны pSJ-AnlPNS (pcbC-ген от A. nidulans) и pSJ-SclPNS (pcbC-ген от S. clavuligerus) были подвергнуты ошибочно-направленной ПЦР (ЕР-ПЦР) с применением набора Diversify PCR от компании Clontech в соответствии с рекомендациями поставщика. Кратко, количество ошибок, внесенных при ПЦР, может быть изменено применением различных условий ПЦР. Амплифицированные pcbC-″вставки″ были субклонированы в экспрессирующий вектор pBADMHmalEDEST с помощью рестрикционных ферментов Ndel и Nsil. Также в этой плазмиде IPNS будет вырабатываться как гибридный протеин МВР. В результате каждого примененного условия были секвенированы (sequenced) 10 клонов. Библиотеки, в которых была найдена частота мутаций приблизительно 1 мутация на 1 кб, были отобраны для проведения скрининга на улучшенные разновидности в отношении превращения HpgCV в амоксициллин. Отобранные A. Nidulans и S. clavuligerus pcbC библиотеки были выращены, а ″вставка″ была субклонирована в экспрессирующий вектор pBADMHmalEDEST с помощью рестрикционных ферментов Ndel и Nsil. Также в этой плазмиде IPNS будет вырабатываться как гибридный протеин МВР. Была создана третья библиотека, в которой мутации были введены в специфические положения внутри pcbC-гена от A. nidulans (сайт-направленный подход). Эти положения были отобраны по двум критериям: a) создание пространства в активном центре и b) ослабление С-концевого связывания. Создание пространства в активном центре может быть полезно для улучшения активности нативной IPNS на HpgCV, так как Hpg-часть больше, чем α-аминоадипат-часть в ACV. С-конец молекулы IPNS действует как квазисубстрат, когда фермент не нагружен субстратом. После приближения субстрата к активному центру С-конец удаляется, создавая пространство для субстрата. Для предотвращения этого соревнования между С-концом и субстратом в этом месте также были введе- 18 - 016155 ны изменения. Для модификации были отобраны восемь положений аминокислот: I75, Y91, S183, V185, N287, L321, L324 и Т331. Были разработаны праймеры, 33-меры, в которых три средних нуклеотида (кодирующие аминокислоту, которую следует модифицировать) были рандомизированы (NNN), таким образом, создавая возможность для любой аминокислоты находиться в получающейся молекуле IPNS в указанных положениях. Все восемь положений, таким образом, были модифицированы ПЦР слияния, давая в результате восемь подбиблиотек, каждая с мутацией в одном сайте. Была сделана одна дополнительная библиотека, в которой все мутации были скомбинированы случайным образом. Также в этом случае ″вставки″ таким образом полученных библиотек были субклонированы в экспрессирующий вектор pBADMHmalEDEST с использованием рестрикционных ферментов Ndel и Nsil. Три библиотеки были высеяны из исходного раствора глицерина на селективную агаровую среду, содержащую 50 мкг зеоцина на 1 мл. Из каждой ЕР-ПЦР библиотеки отбирали 2500 независимых клонов и использовали для инокуляции в 150 мкл 2× TY-среды, содержащей 50 мкг зеоцина на 1 мл, в 96 луночные планшеты. Из сайт-направленной библиотеки было отобрано 200 клонов из каждой подбиблиотеки для инокуляции в 150 мкл 2× TY-среды, содержащей 50 мкг зеоцина на 1 мл, в 96 луночные чашки. После роста в течение ночи при 37°С и 280 об/мин 5 мкл сливающихся культур было перенесено в 1 мл свежей 2× TY-среды, содержащей 50 мкг зеоцина на 1 мл, в микропланшеты с глубокими лунками. Культурам давали расти при 37°С и 280 об/мин до тех пор, пока значение OD600 достигало значения между 0,4 и 0,6 в среднем по микропланшету. Клетки индуцировали к производству гибридного протеина MBP-IPNS добавлением 40 мкл 5% L-арабинозы на каждую отдельную лунку. Потом клетки росли в течение 24 ч при 22°С и 220 об/мин. Клетки собирали центрифугированием. Супернатант выливали, а клеточные осадки замораживали в течение ночи при -20°С. В каждую лунку, содержащую клеточный осадок, было добавлено 100 мкл лизирующего буфера (50 мМ HEPES рН 7,0; 0,5 мг/мл лизозима; 0,1 мг/мл DNAsel; 5М DTT; 5 мМ MgSO4) с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 30 мин. Микропланшеты откручивали (were spun) и 50 мкл супернатанта переносили в свежий микропланшет. 50 мкл смеси для анализа (50 мМ HEPES рН 7,0; 1 мМ ТСЕР; 100 мкМ Na-аскорбата; 25 мкМ Feсульфата; 5 мМ HpgCV) добавляли к супернатанту с последующей инкубацией в течение 30 мин при 25°С. Добавляли 125 мкл разбавленной культуры М. Luteus в 2× TY (окончательное значение OD600 составляет 0,01). Планшет инкубировали в течение ночи при 30°С. Показания OD600 снимали с помощью микропланшетного ридера. Из сайт-направленной библиотеки A. nidulans были отобраны 18 клонов, 16 происходили из V185 подбиблиотеки и 2 - из рекомбинированной подбиблиотеки. Все эти клоны продемонстрировали полное ингибирование роста М. luteus, указывая, что было образовано соединение, ингибирующее рост индикаторного штамма. Это ингибирование было повторно проверено согласно вышеупомянутому протоколу и опять было положительным. Более того ингибирование отсутствовало после добавления Penase®, показывая, что ингибиторное соединение является β-лактамом. Положительные клоны выращивали в 10 мл 2× TY с 50 мкг зеоцина на 1 мл. pBAD-AnpcbC был включен в исследование в качестве контрольного источника IPNS. После роста в течение ночи при 37°С и 280 об/мин определяли OD600. 100 мл 2× TY среды, содержащей 50 мкг зеоцина на 1 мл, было инокулировано до первоначального значения OD600 0,015. Клетки росли при 37°С и 280 об/мин до тех пор, пока OD600 не достигало значения от 0,4 до 0,6. Выработку гибридного протеина MBP-IPNS индуцировали добавлением L-арабинозы до окончательной концентрации 0,2%. Рост поддерживали при 22°С и 220 об/мин в течение ночи. Клетки собирали, отмывали и замораживали при -20°С в течение ночи. Клеточные лизаты получали добавлением 1,5 мл лизирующего буфера (50 мМ HEPES рН 7,0; 0,5 мг/мл лизозима; 0,1 мг/мл DNAsel; 5 мМ DTT; 5 мМ MgSO4) с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 30 мин. Экстракт центрифугировали и супернатант (CFE) переносили пипеткой в свежую пробирку. Было проведено два биоанализа: 1) жидкий биоанализ: 8 мкл CFE смешивали с 592 мкл смеси для анализа (50 мМ HEPES рН 7,0; 1 мМ ТСЕР; 100 мкМ Na-аскорбата; 25 мкМ Fe-сульфата; 5 мМ HpgCV). После инкубирования в течение 10 мин при 25°С добавляли 25 мкл разбавленной культуры М. luteus в 2× TY (окончательное значение OD600 составляет 0,01). В качестве контрольных субстратов использовали ACV (можно было использовать и LLD- и DLD-PgCV, хотя предпочтительным субстратом является DLD-PgCV). Кроме того, для каждого образца был включен специальный контроль, в котором к смеси для анализа была добавлена Penase®. После роста в течение ночи при 30°С снимали показания OD600; 2) биоанализ на агаровых чашках: 8 мкл CFE смешивали с 592 мкл смеси для анализа (50 мМ HEPES рН 7,0; 1 мМ ТСЕР; 100 мкМ Na-аскорбата; 25 мкМ Fe-сульфата; 5 мМ HpgCV). После инкубирования в течение 10 мин при 25°С 50 мкл смеси для анализа наносили пятнами (spotted) в агаровую - 19 - 016155 чашку, покрывая ее целиком. Для каждого образца был включен специальный контроль, в котором к смеси для анализа была добавлена Penase®. Агар, состоящий из 2× TY-агара, дополняли М. luteus до окончательного значения OD600 0,01. После инкубирования в течение ночи при 30°С было подсчитано наличие или отсутствие чистых областей вследствие действия β-лактамов. Табл. 5 демонстрирует активность некоторых мутантов. Каждый мутант представляет большую группу мутантов, имеющих сравнимую активность IPNS на HpgCV как субстрат. Активность ферментов IPNS дикого типа из A. nidulans и S. clavuligerus была в этом скрининге ниже предела обнаружения. Таблица 5 Обзор биоанализов на активность IPNS отобранных клонов и контролей Все положительные клоны в скрининге подвергались секвенированию, а типичные клоны подвергались LC/MS исследованиям. Было выполнено LC/MS исследование, давая возможность идентификации образованных продуктов, исходя из времени удерживания, массы соединения и паттерна фрагментации продукта. Количество амоксициллина, который вырабатывается, определяли стандартным способом добавления и выражали в AU/мг протеина, где AU представляет количество амоксициллина (в нг), образованное за 10 мин при указанных условиях реакции. Табл. 6 суммирует клоны, заряженные аминокислотные остатки и активность клонов на HpcCV (в AU амоксициллин/мг протеина в E.coli CFE). Таблица 6 Мутации и активность действующих IPNS мутантов на HpcCV n.d. = не определено Пример 14. Превращение DLD-PgCV в ампициллин. Была определена активность мутантных pabC-клонов 36А4 (V185R), 35А12 (V185K), 35F1 (V185K, V293A), 36F3 (Т111А, H135R, V185R), 35Н12 (V185K, Р190Н), 36С4 (V185H, Т331С) и pcbC-гена дикого типа от A. nidulans на DLD-PgCV в качестве субстрата. Для этого клоны культивировали в 10 мл 2× TY с 50 мкг зеоцина на 1 мл. После роста в течение ночи при 37°С и 280 об/мин определяли OD600. 100 мл 2× TY среды, содержащей 50 мкг зеоцина на 1 мл, было инокулировано до первоначального значения OD600 0,015. Клетки росли при 37°С и 280 об/мин до тех пор, пока OD600 достигало значения от 0,4 до 0,6. Выработку гибридного белка MBP-IPNS индуцировали добавлением L-арабинозы до окончательной концентрации 0,2%. Рост поддерживали при 22°С и 220 об/мин в течение ночи. Клетки собирали, отмывали и замораживали при -20°С в течение ночи. Клеточные лизаты получали добавлением 1,5 мл лизирующего буфера (50 мМ HEPES рН 7,0; 0,5 мг/мл лизозим; 0,1 мг/мл DNAsel; 5 мМ DTT; 5 мМ MgSO4) с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 30 мин. Экстракты центрифугировали и супернатант (CFE) разливали пипеткой в свежие пробирки. 8 мкл CFE смешивали с 592 мкл смеси для анализа (50 мМ HEPES рН 7,0; 1 мМ ТСЕР; 100 мкМ Naаскорбата; 25 мкМ Fe-сульфата; 5 мМ HpgCV). После инкубирования в течение 10 мин при 25°С 100 мкл - 20 - 016155 разбавленной культуры М. luteus в 2× TY (окончательное значение OD600 составляет 0,01) было добавлено к 50 мкл реакционной смеси. В качестве контрольного субстрата использовали ACV. Кроме того, для каждого образца был включен специальный контроль, в котором к смеси для анализа была добавлена Penase®. После роста в течение ночи при 30°С снимали показания OD600. Все образцы, даже IPNS гибридный протеин дикого типа A. nidulans MBP, неожиданно приводил к ингибированию роста М, luteus. Было выполнено LC/MS исследование этих образцов, предоставляя возможность идентификации образованных продуктов, исходя из времени удерживания, массы соединения и паттерна фрагментации продукта. Количество ампициллина, который был произведен, определяли стандартным способом добавления. В табл. 7 суммирована активность на PgCV. Таблица 7 Активность мутантных гибридных протеинов и гибридных протеинов дикого типа MBP-IPNS на PgCV (в нг продукта на 1 мг общего протеина за 10 мин) как определено с помощью LC-MS исследования Пример 15. Создание штамма Penicillium, продуцирующего D-Hpg или L-Hpg. 15а. Создание экспрессирующих плазмид Penicillium. Гены гидроксиманделат синтазы от Amycolatopsis orientalis и Streptomyces coelicolor (hmaS) и гены, кодирующие гидроксифенилглицин аминотрансферазу (hpgAT от Pseudomonas putida и hpgT от Streptomyces coelicolor соответственно), были клонированы в плазмиду pIPCLTA с помощью ПЦР амплификации этих генов из различных соответствующих pBAD плазмид, описанных в WO 02/34921. Ген mdlB, кодирующий манделатдегидрогеназу от Pseudomonas putida, был амплифицирован из pGEM-Bldm. Было выбрано включение в Ndel и Nsil сайтах pIPCLTA, приводящее к ATG слиянию соответствующего гена с промотором Penicillium. Все гены были амплифицированы с помощью ПЦР, и праймеры амплификации были созданы введением сайта рестрикции Ndel в выше расположенный праймер и сайта рестрикции Nsil в ниже расположенный праймер. Так как гены hpgAT из Pseudomonas putida содержат внутренний Nsil-сайт, был выполнен альтернативный подход, в котором ″вставка″ была амплифицирована с использованием праймеров, которые вводили Ndel и Bsal-сайты. ПЦР фрагмент с дополнительными Ndel/Bsal сайтами был субклонирован как фрагмент тупых концов в клонирующий вектор ПЦР-blunt-TOPO (Invitrogen), приводящий к конструкции ПЦР-bl-hpgATPp. После установления последовательности, показавшей, что она содержала правильную вставку, включая фланкирующие Ndel/Bsal сайты, эта плазмида была использована для создания plPphpgATgWA клонированием фрагмента Ndel/Bsal, содержащего ген hpgATPp в Ndel//Ppu101 сайт plPCLTA. В plPCLTA гены, введенные в этот вектор, находятся под контролем pcbC-промотора Penicillium chrysogenum. Кроме того, терминатор транскрипции penDE-гена, кодирующего ацилтрансферазу, использовали в этих конструкциях. Следующие полигенные экспрессирующие кластеры были сконструированы Были использованы следующие праймеры в клонирующей амплификации генов, упомянутых выше: - 21 - 016155 15b. Трансформация Pencillium chrysogenum. Плазмиды plAohmaSgWA, plScohmaSgWA, plPpmdIBgWA, plPphpgATgWA и plScohpgTgWA были разрезаны с помощью Notl, который удаляет полигенный экспрессирующий кластер из вектора. Penicillium chrysogenum DS12975, штамм, промышленно производящий пенициллин из DSM, был трансформирован 4 мкг ДНК (т.е. Notl-обработанной) и 0,25 мкг выбранного маркерного фрагмента. В этом случае был использован фрагмент, который придает устойчивость к флеомицину. Следующие комбинации полигенных экспрессирующих кластеров были трансформированы Отбор трансформантов был сделан на агаровых чашках с неорганической средой с 1 г на 1 л 1М сахарозы. Колонии, устойчивые к флеомицину, появившиеся на чашках для регенерации протоплатса, были вновь посеяны штрихом на свежие агаровые планшеты с флеомицином без сахарозы и росли до споруляции. Трансформанты были посеяны штрихом на ту же самую среду, и интеграция полигенных экспрессирующих кластеров была подтверждена с помощью ПЦР с использованием специфических праймеров для отдельных генов. Трансформанты, содержащие три намеченных гена, были посеяны на агаровые пробирки с наклоном и спорулировали на рисе. Следующие штаммы были выбраны для дальнейшего исследования: - 22 - 016155 15с. Ферментативное получение D-Hpg с помощью трансформантов Penicillium. Трансформанты Penicillium chrysogenum AFF108, AFF133, AFF146 и AFF152 культивировали на встряхиваемых колбах в течение 6 дней. Внутриклеточные и внеклеточные продукты определяли с помощью NMR. Таблица 8 Внутриклеточные концентрации D-Hpg, определенные с помощью NMR Клетки выращивали в течение от 3 до 6 дней Клетки выращивали в течение 3, 4, 5 и 6 дней для того, чтобы найти оптимум для получения D-Hpg. Концентрация после 3 дней была достаточно высокой, чтобы определить пики в спектре NMR и измерить содержание D-Hpg. Все отобранные трансформанты производили определимые количества D-Hpg, но самая высокая D-Hpg концентрация наблюдалась в AFF133 (80 мкг/г DW). Результаты перечислены в табл. 8. 15d. Ферментативное получение L-Hpg с помощью трансформантов Penicillium. Штаммы Penicillium chrysogenum AFF158, AFF162, AFF164, AFF191, AFF193 и AFF195, содержащие биосинтетические гены L-Hpg, культивировали на встряхиваемых колбах в течение 3, 4, 5 и 6 дней. Внутриклеточные и внеклеточные продукты определяли с помощью NMR. Опять внеклеточный продукт не определялся, а внутриклеточно были выявлены значительные уровни L-Hpg (см. табл. 9). Внутриклеточные уровни L-Hpg можно было измерить во всех штаммах, и они перечислены в табл. 6. В отличие от D-Hpg уровня уровни L-Hpg увеличивались со временем и достигали оптимума через 5 или 6 дней роста. Самая высокая концентрация, которая была измерена в AFF195 мицелии, составляла 2,6 мг L-Hpg на 1 г сухого веса. Штаммы, производящие L-Hpg, давали внутриклеточную концентрацию приблизительно в 30 раз больше, чем AFF133, самый лучший производитель D-Hpg. Таблица 9 Внутриклеточные концентрации L-Hpg, определенные с помощью NMR В следующем эксперименте клетки культивировали в течение 5, 6 и 7 дней, однако, после 5 или 6 дней концентрация L-Hpg не увеличивалась далее, а начинала уменьшаться (данные не показаны). Пример 16. Ферментативное получение амоксициллина с помощью P. chrysogenum. Штамм Pencillium chrysogenum, не имеющий кластеров биосинтеза пенициллина, как описано в патентной заявке РСТ/ЕР 2007/054045, был трансформирован комбинациями из 1) плазмиды pEXPRNRPS6 (см. табл. 1), содержащей NRPS-ген, кодирующий HpgCVS (DLD-Hpg-Cys-Val синтетаза), 2) плазмиды, содержащей ген, кодирующий IPNS мутант V185R, и 3) плазмиды, содержащей gsp-ген из Bacillus brevis, кодирующий Ppant-трансферазу (РРТ), под контролем gpdA-промотора. Отбор трансформантов был сделан на агаровых чашках с неорганической средой с 50 мкг флеомицина на 1 мл и 1М сахарозы. Колонии, устойчивые к флеомицину, появившиеся после регенерации протопласта, были вновь посеяны штрихом на свежие агаровые чашки с флеомицином без сахарозы и росли до споруляции. Около 100 колоний из каждой трансформации было выращено на неорганической среде Кроме того, аминокислота L-Hpg была добавлена в концентрации, меняющейся от 1 до 10 мМ. Культивирование выполняли на встряхиваемых колбах или в 24-луночных титрационных микропланшетах. Инкубацию проводили при 25°С в течение одной недели при 200 об/мин. В разные моменты времени (от 4 до 7 дней) были взяты образцы. Для того чтобы удалить мицелий ″бульон″ центрифугировали. Полный образец ″бульона″ был отобран и лиофилизирован. И лиофилизированный образец, и супернатант были проанализированы на присутствие амоксициллина. В случае супернатанта 10 и 50 мкл супернатанта было добавлено к 190 и 150 мкл, соответственно, к разбавленной культуре М. luteus, как описано в примере 2. В качестве контроля к образцу была добавле- 23 - 016155 на Penase®, которая разрушает амоксициллин. Некоторые трансформанты показали ингибирование роста М. luteus, показывая действие амоксициллина, произведенного трансформантом. Добавление Penase® предотвращало ингибирование роста М. luteus. Лиофилизированные образцы ″бульона″ обрабатывали 100-500 мкл горячей воды milliQ (90°C; объем в зависимости от количества биомассы) для получения лизата. 10 и 50 мкл лизата смешивали с 150 и 190 мкл разбавленной культуры М. luteus соответственно, как описано выше. Также был добавлен контроль с Penase®. Также в этом случае некоторые образцы не ингибировали рост М. luteus. Положительные экстракты соответствовали образцам супернатанта. С помощью LC/MS/MS была установлена идентичность β-лактама, который был образован, с амоксициллином, как описано в примере 9. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения N-α-аминогидроксифенилацетил или N-α-аминофенилацетил β-лактамового антибиотика, включающий контактирование трипептида гидроксифенилглицил-цистеинил-валин (HpgCV) или трипептида фенилглицил-цистеинил-валин (PgCV) с IPNS для того, чтобы осуществить образование N-α-аминогидроксифенилацетил или N-α-аминофенилацетил β-лактамового антибиотика, в котором в качестве исходных соединений либо используют коммерчески доступные трипептиды HpgCV и PgCV, либо трипептиды HpgCV и PgCV получают путем контактирования аминокислот гидроксифенилглицина (Hpg) или фенилглицина (Pg), цистеина (С) и валина (V) с NRPS. 2. Способ по п.1, в котором IPNS имеет степень идентичности по меньшей мере 50% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 и при выравнивании с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 содержит аргинин, лизин или гистидин в положении 185 и необязательно модификацию по меньшей мере в одном из положений 91, 104, 183, 190, 321, 324, 325, 331, используя нумерацию положений последовательности SEQ ID NO: 1. 3. Способ по п.1 или 2, в котором трипептид HpgCV или трипептид PgCV получают посредством контактирования аминокислот гидроксифенилглицина (Hpg) или фенилглицина (Pg), цистеина (С) и валина (V) с нерибосомальной пептидной синтетазой (NRPS) для того, чтобы осуществить образование трипептида HpgCV или трипептида PgCV, NRPS, содержащей первый модуль M1, специфичный к Hpg или Pg, второй модуль М2, специфичный к С, и третий модуль M3, специфичный к V. 4. Способ по любому из пп.1-3, в котором гидроксифенилглицил-цистеинил-валин является DLD-ρгидроксифенилглицил-цистеинил-валином, а N-α-аминофенилацетил β-лактамовый антибиотик является амоксициллином. 5. Способ по любому из пп.1-3, в котором фенилглицил-цистеинил-валин является DLD-ρфенилглицил-цистеинил-валином, а N-α-аминофенилацетил β-лактамовый антибиотик является ампициллином. 6. Способ по любому из пп.1-5, в котором IPNS осуществляет образование пенамового βлактамового антибиотика, и пенамовый β-лактамовый антибиотик превращается затем в цефемовый βлактамовый антибиотик. 7. Способ по п.6, в котором цефемовый β-лактамовый антибиотик является цефадроксилом или цефалексином. 8. Способ по любому из пп.1-7, который осуществляется in vivo. 9. Фермент IPNS, который имеет степень идентичности по меньшей мере 50% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 и которая при выравнивании с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 содержит аргинин, лизин или гистидин в положении 185 и необязательно модификацию, по меньшей мере, в положениях 91, 104, 183, 190, 321, 324, 325, 331, используя нумерацию положений последовательности SEQ ID NO: 1. 10. Нерибосомальная пептидная синтетаза (NRPS), которая катализирует образование трипептида HpgCV или трипептида PgCV, NRPS, содержащая первый модуль M1, специфичный к Hpg или Pg, второй модуль М2, специфичный к С, и третий модуль М3, специфичный к V, где модуль M1 имеет аминокислотную последовательность с процентом идентичности по меньшей мере 50% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, модуль М2 имеет аминокислотную последовательность с процентом идентичности по меньшей мере 50% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8 и модуль М3 имеет аминокислотную последовательность с процентом идентичности по меньшей мере 50% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10. 11. Пептидная синтетаза по п.10, в которой первый модуль M1, специфичный к Hpg, получен из CDA синтетазы, хлороереномицин синтетазы и/или комплестатин синтетазы. 12. Пептидная синтетаза по п.10, в которой первый модуль M1, специфичный к Pg, получен из пристинамицин синтетазы. 13. Пептидная синтетаза по любому из пп.10-12, в которой модуль М2 содержит домен DCL, который соединен с доменом А, получаемым из второго модуля ACVS, в котором домен DCL является гетерологичным домену А. - 24 - 016155 14. Пептидная синтетаза по любому из пп.10-13, в которой DCL домен модуля М2 получен из фермента, который является источником первого модуля M1. 15. Пептидная синтетаза по любому из пп.10-13, в которой DCL домен модуля М2 является доменом С седьмого модуля CDA синтетазы. 16. Пептидная синтетаза по любому из пп.10-13, в которой DCL домен модуля М2 является С доменом второго модуля итурин синтетазы. 17. Пептидная синтетаза по любому из пп.10-16, в которой А и Т домены модуля М2 и полный М3 модуль получены из ACVS, предпочтительно бактериальной или грибковой ACVS. 18. Полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, кодирующую IPNS по п.9. 19. Полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, кодирующую пептидную синтетазу по любому из пп.10-17. 20. Клетка для получения N-α-аминогидроксифенилацетил или N-α-аминофенилацетил βлактамового антибиотика, трансформированная полинуклеотидом по п.18 и/или 19. 21. Клетка по п.20, дополнительно трансформированная генами пути биосинтеза аминокислот Hpg или Pg. 22. Клетка по п.20 или 21, содержащая биосинтетический путь к β-лактамовым антибиотикам, предпочтительно в котором гены, кодирующие ACVS и/или IPNS, инактивированы. 23. Способ получения N-α-аминогидроксифенилацетил или N-α-аминофенилацетил β-лактамового антибиотика, включающий культивирование клеток по любому из пп.20-22, в условиях, подходящих для получения β-лактамового антибиотика. 24. Способ по п.23, в котором β-лактамовый антибиотик является амоксициллином, ампициллином, цефадроксилом или цефалексином. - 25 - 016155 Список последовательностей - 26 - 016155 - 27 - 016155 - 28 - 016155 - 29 - 016155 - 30 - 016155 - 31 - 016155 - 32 - 016155 - 33 - 016155 - 34 - 016155 - 35 - 016155 - 36 - 016155 - 37 - 016155 - 38 - 016155 - 39 - 016155 - 40 - 016155 - 41 - 016155 - 42 - 016155 - 43 - 016155 - 44 - 016155 - 45 - 016155 - 46 - 016155 - 47 - 016155 - 48 - 016155 - 49 - 016155 - 50 - 016155 - 51 - 016155 - 52 - 016155 - 53 - 016155 - 54 - 016155 - 55 - 016155 - 56 - 016155 - 57 - 016155 - 58 - 016155 - 59 - 016155 - 60 - 016155 - 61 - 016155 - 62 - 016155 - 63 - 016155 - 64 - 016155 - 65 - 016155 Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2 - 66 -
