006740 Настоящее изобретение относится к способу ... сов, то есть измерения ферментов, упакованных в покрытых оболочкой вирусах....

006740
Настоящее изобретение относится к способу выделения ферментов из покрытых оболочкой вирусов, то есть измерения ферментов, упакованных в покрытых оболочкой вирусах. Этот способ особо разработан для биологических образцов, содержащих незащищенные ферменты в дополнение к покрытым
оболочкой вирусам.
Предшествующий уровень техники
С классическим примером проблем в этой области сталкиваются во время определения обратной
транскриптазы (ОТ, RT) ретровируса в клеточных экстрактах или жидкостях культуры клеток. Во время
обратной транскрипции ОТ продуцирует ДНК копию вирусной РНК. Общепринятый анализ ОТ активности осуществляют путем использования искусственной конструкции матрица-праймер и меченного тритием дезоксинуклеотид трифосфата в качестве нуклеотидного субстрата. Пара матрица/праймер поли(rА)/олиго(dТ) является наиболее эффективной и наиболее используемой комбинацией для определения обратной транскриптазы ВИЧ (вируса иммунодефицита человека), а также других ретровирусных
обратных транскриптаз (Baltimore-71, Lee et al-87). Давно понятно, что некоторые клеточные ДНК полимеризующие ферменты влияют на результаты системы анализа этого типа, делая их менее ясными, путем
продуцирования измеримых количеств продукта.
По меньшей мере девять различных типов ДНК полимераз были идентифицированы в эукариотических клетках. Считается, что полимераза α ответственна за репликацию ДНК во время клеточного деления, β рассматривается как основная полимераза, вовлеченная в репарацию ДНК, а λ ответственна за
синтез ДНК в митохондриях. Каждая из этих клеточных полимераз встечается в различных формах и с
различными связанными белками. Их ферментативные свойства варьируют как в зависимости от их молекулярной формы, так и от происхождения клеточного типа (для обзора см. Hubscher et al. 2000). В дополнение клетки могут содержать ферменты, полученные от инфицирующих вирусов или эндогенных
вирусных генов, которые кодируют вирусную ДНК полимеразу. Из клеточных ДНК полимераз ДНК полимераза а наименее склонна для использования рrА в качестве матрицы, однако существуют определенные молекулярные виды этого фермента, которые могут эффективно копировать рrА (Goulian &
Grimm 1990, Yoshida et al. 1981).
Действительно, различные полимеразы приводят к проблеме специфичности во время количественной оценки ретровирусной ОТ. В литературе может быть найдено много способов обойти эту проблему.
Наиболее очевидным подходом является отделение вируса от клеточных белков. Различные способы,
такие как центрифугирование или адсорбция вирионов к специфическим рецепторам или антителам, используют в этом контексте. Общей проблемой, встречающейся при очистке материала, содержащего
большие количества клеточных компонентов и небольшие количества вируса, является то, что совместная очистка небольших количеств клеточной полимеразы не может быть исключена. Более того, с практической точки зрения не является привлекательным обрабатывать большие количества образцов с помощью относительно затруднительных процедур разделения.
Другим подходом является разработка условий изозим-специфического ферментного анализа, которые более или менее исключают клеточную полимеразу, то есть λ полимеразу, из определения. Этого
можно достичь путем использования ингибиторов, альтернативных ионов металлов либо пар матрица/праймер. Например, известно, что поли(2'-О-метил-rС)nолиго(dG)12-18 является высоко специфичным
субстратом для ретровирусных обратных транскриптаз. Повышенная специфичность, достигнутая этим
типом способа, однако, обычно сопряжена с соответствующим уменьшением в скорости реакции, и вытекающим отсюда уменьшением в чувствительности обнаружения фермента, который намереваются мерить.
Авторы изобретения недавно разработали способ количественной оценки ОТ ВИЧ в плазме, отобранной у инфицированных персон. Этот способ основан на связывании вируса с гелем с помощью иммобилизованного ионобменника. Антитела и мешающие вещества удаляют путем промывки, а ферментативно активную ОТ выделяют путем лизиса иммобилизованного вируса с помощью не-ионного детергента (Gatu et al. 2000). Количество выделенной ОТ, наконец, количественно определяют с помощью чувствительного ОТ анализа, основанного на применении иммобилизованного рrА, с odT в качестве праймера. При обработке контрольной плазмы от здоровых доноров крови в этой системе авторы обнаружили
небольшие количества ОТ активности в очищенных фракциях.
Дополнительные исследования выявили, что неочищенная EDTA плазма от здоровых людей содержала относительно большие количества этой активности, которая также была обильна в экстрактах из
фракции лимфоцитов того же самого типа образцов. Некоторые характеристики этого неклассифицированного фермента указаны в табл. 1. Количество активности, выделяемой из системы разделения по настоящему изобретению после «иммобилизации вируса» было меньше, чем тысячная часть общей активности в плазме, но достаточно, чтобы серьезно затруднять определение небольших количеств ОТ ВИЧ.
Описание изобретения
В настоящем изобретении предложено решение описанной выше проблемы специфичности, хотя
оно также в общем применимо для определения всех ферментов, содержащихся в покрытых оболочкой
вирусах. Примеры семейств покрытых оболочкой вирусов и некоторые человеческие виды в пределах
-1-
006740
этих семейств включают в себя Poxviridae, например вирус коровьей оспы и вирус натуральной оспы
(оспы человека), Iridoviridae, Herpesviridae, например вирус герпеса, вирус ветряной оспы, цитомегаловирус и вирус Эпштейна-Барр, Togaviridae, например вирус желтой лихорадки, вирус клещевого энцефалита, вирус коревой краснухи и вирус тропического энцефалита, Coronaviridae, например коронавирус
человека, Paramyxoviridae, например вирус парагриппа, вирус паротита, вирус кори и респираторносинцитиальный вирус, Rabdoviridae, например вирус везикулярного стоматита и вирус бешенства,
Filoviridae, например вирус Марбурга и вирус Эбола, Orthomyxoviridae, например вирусы гриппы А и В,
Bunyaviridae, например вирус Бвамба, вирус калифорнийского энцефалита, вирус флеботомной лихорадки и вирус Рифт-Валли, Arenaviridae, например ЛХМ (LCM) вирус (вирус лимфоцитарного хориоменингита), вирус Ласса и вирус Джуни, Hepnadnaviridae, например вирус гепатита В, и Retroviridae, например
HTLV (вирус Т-клеточной лимфомы человека) и ВИЧ (вирус иммунодефицита человека).
Способ по изобретению основан на применении белок-модифицирующего химического вещества
для разрушения активности незащищенных растворимых ферментов, то есть свободных ферментов и
ферментов, связанных, например, с белками, клеточными компонентами или органеллами, но не защищенных вирусной оболочкой. Способность химического вещества проникать через вирусную оболочку
связана с его гидрофобными свойствами. При условии, что вирусная оболочка защищает от воздействия
выбранного химического вещества, возможно удалить или альтернативно инактивировать реакционноспособное химическое вещество, лизировать вирион и количественно подсчитать активность высвобожденного вирусного фермента. Существует множество более или менее сайт-специфичных реагентов,
чтобы сделать возможной модификацию белка (для обзора см. Means & Feeney 1990).
Для способа по изобретению цистеин-модифицирующие вещества были отобраны в качестве белокмодифицирующих химических веществ для разрушения активности незащищенных ферментов. Чувствительность к N-этилмалеимиду была широко использована для классификации клеточных ДНК полимераз. Этот агент обычно добавляют непосредственно к реакционной смеси и эффективно «ингибируют»
все ДНК полимеразы млекопитающих за исключением ДНК полимеразы β. Количество цистеинов в консенсусной аминокислотной последовательности различных ретровирусных обратных транскриптаз варьирует значительно, то есть ВИЧ 1 ОТ имеет только 2, ВИЧ 2 имеет 3, вирус мышиной лейкемии (MULV)
имеет только 8, в то время как вирус миелобластомы/саркомы птиц имеет 12 цистеинов в (β субъединице. Таким образом, можно ожидать, что чувствительность вирусных ОТ к цистеиновой модификации
варьирует значительно. Были исследованы эффекты модификации цистеиновых остатков в обратных
транскриптазах ВИЧ, и по меньшей мере ДНК полимеразные активности обоих ВИЧ 1 и ВИЧ 2 ОТ были
достаточно устойчивы (Hizi et al. 1992). Однако, вряд ли это является верным для всех ВИЧ изолятов,
принимая во внимание огромную изменчивость, отмеченную среди различных штаммов ВИЧ.
Более конкретно, настоящее изобретение направлено на способ выделения ферментов из покрытых
оболочкой вирусов в биологическом образце, содержащем незащищенные ферменты и вирусы, включающий стадии, на которых
а) инкубируют биологический образец с цистеин-модифицирующим веществом, которое представляет собой водорастворимое нелипофильное вещество, для разрушения активности незащищенных ферментов с сохранением вирусной ферментативной активности в пределах оболочки вируса,
б1) удаляют частицы покрытого оболочкой вируса из инкубационной смеси, или
б2) инактивируют цистеин-модифицирующее вещество с помощью инактивирующего вещества,
сохраняющего вирусную оболочку от лизиса,
в) лизируют вирусную оболочку с помощью лизирующего буфера для высвобождения вирусных
ферментов, и
г) выделяют высвобожденный вирусный фермент из лизирующего буфера.
В воплощении способа по изобретению покрытые оболочкой вирусы выбирают из семейства Retroviridae, и особенно выбирают из лентивирусов, HTLV/BLV вирусов, ретровируса млекопитающих Dтипа и ретровируса млекопитающих С-типа.
В настоящем предпочтительном воплощении лентивирус представляет собой вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).
В другом воплощении выделенный вирусный фермент представляет собой обратную транскриптазу.
В еще одном воплощении способа по изобретению биологический образец представляет собой образец жидкости организма. Примером образца жидкости организма является образец крови, плазмы или
сыворотки.
В дополнительном воплощении способа по изобретению водорастворимое нелипофильное вещество выбрано из группы, состоящей из N-этилмалеимида, Тимеросала, пара-гидроксимеркуриобензоата,
5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты), 2-аминоэтила 2'-аминоэтантиолсульфоната, 2-нитро-5тиоцианобензойной кислоты и метила метан-тиосульфоната.
В еще одном воплощении инактивирующее вещество представляет собой мягкий восстанавливающий агент. Предпочтительно, мягкий восстанавливающий агент выбран из группы, состоящей из цис-2-
006740
теина, цистеамина, меркаптоянтарной кислоты и глутатиона.
Изобретение также направлено на набор для осуществления вышеописанного способа, содержащий
письменные и/или размещенные на носителе информации инструкции по выполнению способа и цистеин-модифицирующее вещество, и, необязательно, вирус-связывающий матрикс, либо вещество, инактивирующее цистеин-модифицирующее вещество с сохранением оболочки вируса от лизиса, и лизирующий буфер. Предпочтительно, цистеин-модифицирующее вещество выбрано из группы, состоящей из Nэтилмалеимида, Тимеросала, пара-гидроксимеркуриобензоата, 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты), 2-аминоэтила 2'-аминоэтан-тиолсульфоната, 2-нитро-5-тиоцианобензойной кислоты и метила метантиосульфоната; предпочтительно вирус-связывающий матрикс представляет собой анионобменный матрикс; инактивирующее вещество может быть выбрано из группы, состоящей из цистеина, цистеамина,
меркаптоянтарной кислоты и глутатиона; предпочтительно, лизирующий буфер представляет собой буфер, совместимый с ферментным анализом, включающий в себя детергент.
Изобретение будет далее проиллюстрировано общим описанием экспериментов, примерами и рисунками, однако следует понимать, что изобретение не ограничено раскрытыми воплощениями.
Общее описание экспериментов
Следующие процедуры предназначены для иллюстрации изобретения, без ограничения его использования. Два различных воплощения изобретения могут быть использованы для различных целей. Протокол I) преимущественно используют для образцов, содержащих антитела, блокирующие ферментативную активность (то есть плазма ВИЧ пациентов после сероконверсии), которые должны быть удалены
перед определением вирусной ферментативной активности. Стадию инактивации полимеразы в протоколе ниже осуществляют в отдельной инкубации. Это может также альтернативно быть сделано во время
той же стадии, когда вирион связывается с гелем. Это осуществляют либо путем добавления цистеинмодифицирующего вещества непосредственно к суспензионной смеси плазма/гель, либо путем первичного связывания вещества с гелем, а затем добавления образцов плазмы. Необходимая концентрация
вещества может варьировать в зависимости от процедуры. Протокол II) может быть использован для образцов, по существу свободных от мешающих факторов, таких как фермент-блокирующие антитела, например сывороток острой стадии ВИЧ.
I) Протокол для определения ретровирсусной ОТ из материала, который содержит ОТ блокирующие антитела, основанный на разрушении растворимых клеточных ферментов с последующим выделением вирусной ОТ с миниколонок.
1) Метят 5 мл пластиковые пробирки, которые будут использованы. Помещают их в камеру Нальгена. Добавляют 1 мл образца (например EDTA плазмы от ВИЧ инфицированных индивидуумов) в каждую меченую пробирку. Добавляют 100 мкл 66 мМ раствора 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты)
в забуференной воде, интенсивно перемешивают и инкубируют образцы в течение одного часа при комнатной температуре.
Активность свободных ферментов в плазме разрушается во время этой процедуры, в то время как
ферменты, содержащиеся внутри вирионов, остаются интактными. Вирионы могут затем быть очищены
от 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты), антител, блокирующих ферментативную активность, и
других веществ, которые могут мешать количественной оценке вирусной ОТ, с помощью нескольких
процедур разделения. Протокол ниже основан на применении Fractogel® EMD TMAE Hicap геля.
2) Тщательно суспендируют разделяющий гель и переносят 1500 мкл гелевой суспензии в каждую
предварительно обработанную пробирку для образца.
3) Инкубируют образцы с гелевой суспензией в течение одного часа при комнатной температуре с
помощью пробирок, лежащих на орбитальном шейкере.
4) Метят желаемое количество 15 мл пластиковых мини колонок для идентификации образцов, которые анализируют. Устанавливают колонки в промывочное устройство для колонок, например Supelco
Visiprep вакуумное устройство для твердофазной экстракции. Переносят содержимое в связывающих
пробирках в их соответствующие колонки. Перед переносом кратковременно интенсивно перемешивают
пробирку, чтобы равномерно распределить гель.
5) Когда все колонки заполнены, применяют вакуум и отсасывают гели насухо. Выключают вакуум
и начинают промывку путем заполнения каждой колонки 9 мл буфера А. Когда все колонки заполнены,
применяют вакуум и отсасывают гели насухо.
6) Повторяют стадию 5 три или более раз, давая в сумме четыре промывки. Отсасывают гели насухо после каждой промывки. После отсасывания гелей насухо после четвертой промывки, выключают
вакуум и переходят к стадии 7.
Стадия промывки удаляет несвязавшиеся ОТ блокирующие антитела и 5,5'-дитиобис-(2нитробензойную кислоту) из системы.
7) Добавляют ко всем сухим гелям 9 мл кондиционирующего буфера (В). Применяют вакуум и отсасывают гели насухо.
8) Повторяют стадию 7. Перед выключением вакуума проверяют, чтобы весь кондиционирующий
буфер (В) был удален из всех гелей.
9) Снимают верхнюю часть промывочного устройства для колонок. Устанавливают держатель для
-3-
006740
пробирок с меченными пробирками в чистый контейнер. Вновь устанавливают верхнюю часть устройства. Проверяют, чтобы небольшие трубки от каждой колонки вошли в соответствующие им пробирки.
10) Добавляют 300 мкл лизирующего буфера (С) в каждую колонку. Оставляют буфер стоять в колонке в течение 5 мин. Затем медленно применяют вакуум и отсасывают гели насухо. Это дает приблизительно 300 мкл вирусного лизата в каждой пробирке.
ОТ активность, выделенная в лизатах со стадии 10, по существу свободна от ОТ блокирующих антител и клеточной полимеразной активности, и может быть количественно определена с помощью чувствительного анализа ОТ активности, например Cavidi HS-kit Lenti RT, который основан на способе, описанном Ekstrand et al. 1996.
Замечание: ОТ ферменты, которые не чувствительны к цистеин-модифицирующим веществам, например ОТ ВИЧ 1 дикого типа, могут при желании быть проанализированы в присутствии вплоть до 5
мМ 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты).
Чувствительные ферменты, такие как MuLV ОТ и ОТ из некоторых устойчивых к терапии штаммов
ВИЧ 1, с другой стороны, требуют добавления сульфгидрильного восстанавливающего агента, например
цистеина или цистеамина, к лизирующему буферу.
II) Протокол для определения ОТ активности в образцах по существу свободных от ферментблокирующих антител, например в плазме острой стадии ВИЧ или супернатанте вирусной культуры,
основанный на инактивации растворимых клеточных ферментов, за чем следует инактивация 5,5'дитиобис-(2-нитробензойной кислоты).
1) 200 мкл образцы (например плазмы острой стадии ВИЧ) смешивают с 20 мкл 33 мМ 5,5'дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) в забуференной воде. Образцы инкубируют на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение одного часа.
2) Добавляют сульфгидрильный восстанавливающий агент, например 20 мкл 33 мМ цистеамина в
воде, и образцы инкубируют на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение еще 30 мин.
3) Готовят четырехкратные серийные разведения образцов в буфере, совместимом с ОТ анализом,
содержащем детергент, например тритон Х-100. Вирионы сейчас лизированы, и ОТ активность в каждом
разведении можно определить, используя чувствительный ОТ анализ, например Cavidi HS-kit Lenti RT.
4) Количество ОТ активности в исходном образце вычисляют из величин в диапазоне разведения, в
котором существует линейная взаимосвязь между разведением образца и количеством образованного
продукта.
Примеры
Материалы
Разделяющий гель: например Fractogel® EMD ТМАЕ или Fractogel® EMD ТМАЕ Hicap в 200 мМ
(2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоте) (MES) рН 5,4, 275 мМ иодид калия и гепарин 80 IU/мл.
Миниколонки, например Biorad Poly-Prep® (7311553).
Промывающее устройство для миниколонок, например Supelco Visiprep вакуумное устройство для
твердофазной экстракции.
Пластиковые пробирки, например 4,5 мл криогенные пробирки Nunc.
Цистеин-модифицирующий агент, например 66 мМ 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойная кислота) в воде, забуференной 0,4М трис(гидроксиметил)аминометаном (рН 6,8).
Мягкий сульфгидрильный восстанавливающий агент, например 33 мМ цистеамин в воде.
Буфер для промывки (А): 20 мМ MES рН 6,0, 500 мМ ацетат калия (KАс).
Кондиционирующий буфер (В): буфер, совместимый с ОТ анализом, например 10 мМ (N-(2гидроксиэтил-пиперазин-N'-(2-этансульфоновая кислота) (Hepes) рН 7,6, 25 мМ KАс, 20 мМ хлорид магния (MgCl2), 0,2 мМ этиленгликоль-бис(β-аминоэтиловый эфир) N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты
(EGTA), 2 мМ спермин и 0,5 мг/мл инактивированного теплом бычьего сывороточного альбумина.
Лизирующий буфер (С): буфер, совместимый с ОТ анализом, включающий в себя детергент, например 1% трет-октофеноксиполиэтоксиэтанол (Triton Х-100), стабилизатор фермента, например 13
нг/мл олиго(dТ22), 0,025 мг/мл сульфата декстрана и те же самые компоненты, как в кондиционирующем
буфере (В). Сульфгидрильный восстанавливающий агент, например 0,2 мМ цистеамин, возможно добавляют, когда подвергают обработке вирусы с ОТ, которые чувствительны к SH окислению/модификации.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой диаграмму, которая показывает эффект преинкубации с тимеросалом на
активность различных полимераз в сыворотке/плазме. Рекомбинантная ОТ ВИЧ 1 дикого типа (■), рекомбинантная ОТ из ВИЧ 1 мутанта (Y181 С) (◊), ОТ вируса Джааксикта (▲), ОТ FIV (○), ОТ вируса
бычьей лейкемии (BLV) (♦), ОТ эндогенного ретровируса свиньи (PERV) (●) и образец плазмы от здорового донора крови (□).
На фиг. 2 представлены две диаграммы А и В выделения вирусной ОТ активности из FIV обостренной плазмы и селективное разрушение эндогенной ОТ активности. EDTA плазму с разрушенными лимфоцитами от здорового донора крови (левые колонки) и FIV, разбавленную в инактивированной плодной
сыворотке теленка, (правые колонки) инкубировали с: А) 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислотой) и
В) тимеросалом. Выделенные ОТ активности наносили на график по отношению к концентрации ве-4-
006740
ществ.
Фиг. 3 представляет собой диаграмму, которая показывает элиминирование полимеразной активности в образцах плазмы от здоровых доноров крови.
Фиг. 4 представляет собой диаграмму корреляции между ОТ ВИЧ, выделенной из человеческой
плазмы в соответствии с изобретением, и вирусной РНК, измеренной с помощью РНК ПЦР.
На фиг. 5 представлены диаграммы альтернативных протоколов обработки образцов плазмы от
ВИЧ инфицированных пациентов. Стадию инактивации полимеразы в протоколе I осуществляли: А) при
отдельной инкубации; В) во время той же самой стадии, когда вирион связывается с гелем; С) как в В),
но гель хранили с веществом; D) как в С), но гель промывали перед применением. Активность ОТ плазмы (♦), активность ОТ ВИЧ (●).
На фиг. 6 представлены диаграммы количественной оценки вирусной ОТ в образцах с высокой эндогенной ОТ активностью без очистки. EDTA плазма от здорового донора крови (A), FIV вирус в инактивированных FCS (В) и в клеточной культуральной среде (С).
Пример 1. Некоторые свойства ДНК полимеразы из человеческой плазмы
Исследовали эффект добавления указанных компонентов к ОТ реакционной смеси, лишенной
праймера (Cavidi HS-kit Lenti RT). EDTA плазму от двух здоровых доноров крови (1 мкл/анализ), рекомбинантную ОТ ВИЧ 1, либо ОТ FIV клеточного культурального происхождения использовали в качестве
фермента. Результаты представлены в табл. 1.
Активность полимеразы человеческой плазмы зависела от праймера, чувствительного к ингибированию ddNTP, комплементарного матрице, но не чувствительного к пирофосфатным аналогам.
Пример 2. Способность различных цистеин-модифицирующих агентов разрушать активность полимеразы человеческой плазмы
50 мкл образцы человеческой плазмы EDTA смешивали с 50 мкл образцами из серийного разведения каждого вещества. Образцы инкубировали в течение одного часа на орбитальном шейкере. Каждый
образец затем разбавляли двадцать раз и остаточную полимеразную активность измеряли с помощью
Cavidi® HS-kit Lenti RT. Полимеразную активность при каждой концентрации вещества пересчитывали в
процент от контроля, состоящий из плазмы, инкубируемой в отсутствии модифицирующего вещества,
наносили на график по отношению к концентрации вещества и концентрацию вещества, необходимую
для 50% уменьшения активности, определяли из графика.
Вирус ВИЧ в человеческой плазме, лишенной эндогенной ОТ активности обрабатывали 5 мМ указанного вещества, в соответствии с «Протоколом для определения ретровирусной ОТ из материала, который содержит ОТ блокирующие антитела». Выделение ОТ ВИЧ определяли с помощью Cavidi® HS-kit
Lenti RT. Результаты представлены в табл. 2.
Пример 3. Эффект инкубации с тимеросалом на различные полимеразы в сыворотке/плазме
Рекомбинантную ОТ дикого типа ВИЧ 1 (■), рекомбинантную ОТ из ВИЧ 1 мутанта, устойчивого к
Невирапину, (Y181 С) (◊), ОТ вируса Джааксикта (JSV) из рака легкого овцы (▲), ОТ вируса кошачьей
лейкемии (FIV) (○), ОТ вируса бычьей лейкемии (BLV) (♦) и ОТ эндогенного ретровируса свиньи
(PERV) (●), полученные из клеточной культуры, разбавляли в инактивированной теплом плодной сыворотке теленка. Различные препараты вирусного фермента и образец EDTA плазмы от здорового донора
крови (□) инкубировали с указанной концентрацией тимеросала при комнатной температуре (22°С) в
течение 60 мин. Все образцы разбавляли 100-кратно в буфере, совместимом с ОТ анализом, и затем определяли остаточную ОТ активность в каждом образце. Использовали три ОТ анализа, каждый адаптирован к измеряемому типу ОТ: ВИЧ 1, JSV и FIV обратные транскриптазы измеряли с помощью Cavidi®
HS-kit Lenti RT. BLV ОТ с помощью Cavidi® HS-kit HTLV RT и ОТ PERV и человеческой плазмы с помощью Cavidi® HS-kit Mn2+ RT. Результаты представлены в диаграмме на фиг. 1.
Семь исследованных ферментов показали сильно различную чувствительность к обработке тимеросалом. ОТ ВИЧ 1 Y181C мутанта и ОТ FIV были наиболее чувствительными ферментами. Концентрация
тимеросала, необходимая для значительного разрушения фермента, увеличивалась среди ОТ человеческой плазмы, BLV ОТ и PERV ОТ. Два фермента, ОТ ВИЧ 1 дикого типа и JSV ОТ, были полностью резистентны.
Пример 4. Выделение вирусной ОТ активности из FIV обостренной плазмы и селективное разрушение эндогенной ОТ активности.
EDTA плазму с разрушенными лимфоцитами от здорового донора крови и FIV, разбавленную в
инактивированной плодной сыворотке теленка (в целом лишенную плазматической ОТ активности) инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с указанной концентрацией А) 5,5'-дитиобис-(2нитробензойной кислоты), В) тимеросала. Образцы разделяли в соответствии с «Протоколом для определения ретровирусной ОТ из материала, который содержит ОТ блокирующие антитела». Выделенные ОТ
активности определяли с помощью ОТ анализа (Cavidi HS-kit Lenti RT). Каждую активность пересчитывали в процент от идентично обработанного контроля, состоящего из того же самого препарата, инкубируемого без какого-либо сульфгидрильного реакционноспособного вещества. Выделение FIV ОТ из этого контроля составило 74% от активности в исходном образце, соответствующее значение для ОТ человеческой плазмы составило 0,015%, см. фиг. 2, где левые колонки представляют собой плазму доноров
-5-
006740
крови, а правые колонки представляют собой вирус FIV в плодной сыворотке теленка.
Инкубация с 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислотой) в концентрациях выше 0,4 мМ полностью
элиминировала ОТ активность человеческой плазмы без уменьшения выделения ОТ, связанной с FIV
вирионом.
Более высокие концентрации Тимеросала (> 3 мМ) были необходимы для достижения подобного
эффекта на плазматическую ОТ. Тимеросал в этом диапазоне концентраций значительно уменьшал выделение FIV ОТ.
Пример 5. Элиминирование полимеразной активности в образцах плазмы от здоровых доноров крови.
Два дупликатных набора 1 мл образцов плазмы EDTA от 21 здорового донора крови обрабатывали
в соответствии с «Протоколом для определения ретровирусной ОТ из материала, который содержит ОТ
блокирующие антитела». Обработку 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислотой) (стадия А) опускали для
одного набора образцов и включали для другого. Количество ОТ активности, выделенной из каждого
образца, определяли с использованием ночного ОТ анализа, с использованием Cavidi® HS-kit Lenti RT.
См. фиг. 3, где группы с левой стороны показывают необработанные образцы, приготовленные в соответствии с протоколом. Группы с правой стороны представляют собой те же самые образцы, приготовленные после обработки. Разделение контролей, например разделение буфера для нанесения образца дало величины между 262 и 1100 rfu/час. Диапазон определения флуориметра был вплоть до приблизительно 1800000 rfu.
Пример 6. Корреляция между ВИЧ ОТ активностью, выделенной из человеческой плазмы, по изобретению и вирусной РНК, измеренной с помощью ПЦР РНК
1 мл образцы плазмы EDTA от ВИЧ инфицированных индивидуумов обрабатывали в соответствии
с «Протоколом для определения ретровирусной ОТ из материала, который содержит ОТ блокирующие
антитела» и количество ОТ активности, выделенной из каждого образца, определяли в ночном ОТ анализе, с использованием Cavidi® HS-kit Lenti RT. Полученные ОТ активности пересчитывали в рg ВИЧ 1 ОТ
в соответствии со стандартной кривой. Количество ВИЧ 1 РНК в каждом образце измеряли с помощью
стандартной ВИЧ 1 РНК ПЦР (Roche, Amplicore). График, приведенный на фиг. 4, ограничен образцами
с величиной ПЦР > 500 копий/мл.
Строгая корреляция была обнаружена между количеством плазматической ОТ, выделенной в соответствии с изобретением, и количеством ВИЧ РНК, измеренной с помощью ПЦР (r=0,93; n=33; p <<
0,001).
Пример 7. Альтернативный протокол для обработки образцов плазмы от ВИЧ инфицированных пациентов
Стадию инактивации полимеразы в «Протоколе для определения ретровирусной ОТ из материала,
который содержит ОТ блокирующие антитела» осуществляли четырьмя путями: А) в отдельной инкубации плазмы и вещества; В) в той же самой инкубации, когда вирион связывается с гелем; С) вещество
включали в гелевую суспензию во время хранения и предварительно обработанный гель использовали
для выделения ОТ; D) вещество сначала связывалось с гелем, несвязавшееся вещество удаляли путем
промывки и обработанный гель использовали в соответствии с протоколом. Результаты представлены на
фиг. 5. Активность плазматической ОТ (♦), активность ВИЧ ОТ (●).
Было обнаружено, что все четыре альтернативы полезны, то есть активность плазматической ОТ
была инактивирована без влияния на активность ВИЧ ОТ, хотя количество вещества, необходимое для
количественного элиминирования полимеразной активности человеческой плазмы, варьировало.
Пример 8. Восстановление плазматической полимеразной активности после обработки различными
цистеин-модифицирующими агентами
Набор образцов человеческой плазмы (60% плазма в воде) сначала инкубировали с 3 мМ указанного цистеин-модифицирующего вещества или воды (в качестве контроля) при комнатной температуре в
течение 1 ч.
Серийные разведения пяти потенциально реакционноспособных веществ затем добавляли и образцы инкубировали в течение еще одного часа. Каждый образец был в конечном итоге разбавлен 1:20 и
остаточную активность ОТ определяли с помощью Cavidi® HS-kit Lenti RT. Общее уменьшение в концентрации вещества между инкубацией образца и ОТ анализом составило 200 раз. Выделенные ОТ активности пересчитывали в процент от активности контроля, состоящего из плазмы, инкубируемой в отсутствии добавлений во время обоих стадий инкубации. Результаты перечислены в табл. 3.
Все три протестированных цистеин-модифицирующих агента обладали способностью полностью
инактивировать плазматическую ОТ активность. Существовало, однако, четкое различие в условиях,
необходимых для реактивации полимеразной активности, которая обработана различными агентами.
Фермент, обработанный Тимеросалом, был довольно легко реактивирован, в то время как фермент, обработанный 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислотой) или Хлорамином Т, нуждался для активации в
тиолах с низкой молекулярной массой с сильными восстанавливающими свойствами.
Из табл. 3 также очевидно, что существенно не использовать слишком сильные антагонистические
-6-
006740
вещества для инактивации полимеразного модифицирующего агента. Существует риск реактивировать
плазматическую полимеразу!
Пример 9. Количественная оценка вирусной ОТ в образцах с высокой эндогенной ОТ активностью
без очистки
A) EDTA плазму от здорового донора крови, В) FIV вирус, разбавленный в инактивированной FCS
(лишенной ОТ активности), либо С) в минимальной питательной среде Дульбекко с 5% FCS разбавляли
1:1 и инкубировали с указанной концентрацией 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) в течение
одного часа при комнатной температуре (20°С). Каждый образец затем серийно разводили в четырехкратных стадиях в кондиционирующем буфере (В). Цистеамин в конечной концентрации 20 мМ затем
добавляли ко всем образцам и этот набор инкубировали в течение еще одного часа при комнатной температуре. ОТ активность каждого образца затем определяли с помощью Cavidi® HS-kit Lenti RT. 15 мкл
каждого образца добавляли к 135 мкл реакционной смеси, давая конечную концентрацию цистеамина в
анализе 2 мМ. ОТ активность, выделенная при трех первых разбавлениях, соответствующих 7,5; 1,9 и 0,5
мкл образца на ОТ анализ, была пересчитана в процент от контроля, инкубируемого в отсутствии вещества и нанесена на график против концентрации вещества, см. фиг. 6.
Полимеразная активность человеческой плазмы была элиминирована после инкубации с концентрациями 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) выше 0,47 мМ. На выделение ОТ FIV вируса инкубация с концентрациями вещества ниже 1,88 мМ вредно не влияла. ОТ FIV могла быть таким образом
измерена селективно в неочищенных образцах после инкубации с 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислотой) в диапазоне концентраций около 2 мМ.
Таблица 1. Некоторые характеристики неидентифицированной ОТ активности из человеческой
плазмы
Таблица 2. Вещества со способностью разрушать ОТ активность человеческой плазмы
-7-
006740
Таблица 3. Восстановление плазменной полимеразной активности после обработки цистеинмодифицирующими агентами
Ссылки:
Baltimore D., Smoler D. (1971) Primer requirement and template specificity of the DNA polymerase of
RNA tumor viruses. PNAS 68, 1507-11.
Ekstrand D.H.L., Awad R.J-K., Kallander C.F.R. and Gronowitz J.S. (1996) A sensitive assay for the detection and quantification of RT activity, based on the use of carrier bound template and non-radioactive product
detection, with special reference to HIV isolation. Biotechnology and Applied Biochemistry. 23, 95-105.
Gatu T, Gronowitz J.S., Kallander C, Malmsten A., Petterson I. (2000) Methods of concentrating and recovering a viral enzyme activity from biological samples. PCT/SE01/00617, поданная 22 марта 2001.
Goulian M., Grimm SL. (1990) Three cytoplasmic DNA polymerases that utilize poly(rA).oligo(dT). Biochem Biophys Res Commun. 170: 627-34.
Hizi A., Shaharabany M., Tal R., Hughes. (1992) The effects of cysteine mutations on the reverse transcriptases of human immunodeficiency virus types 1 and 2. J. Biol Chem. 267:1293-7.
Hubscher U., Nasheuer H. P, Syvaoja J.E. (2000) Eukaryotic DNA polymerases, a growing family. Trends
Biochem Sci. 25:143-7. Review.
Lee M., Sano K., Morales F.E., and D.T. Imagawa. (1987) Sensitive reverse transcriptase assay to detect
and quantitate human immunodeficiency virus. J. Clin. Microbiol. 25:1717-21.
Means G. E, Feeney R. E. (1990) Chemical modifications of proteins: history and applications. Bioconjug
Chem. 1(1):2-12.
Yoshida S., Masaki S., Koiwai O. (1981) Further characterization of a poly(rA) oligo(dT)-dependent activity of multiple DNA polymerase alpha from calf thymus. Biochim. Biophys. Acta. 654:194-200.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ выделения ферментов из покрытых оболочкой вирусов в биологическом образце, содержащем незащищенные ферменты и вирусы, включающий стадии, на которых
а) инкубируют биологический образец с цистеин-модифицирующим веществом, которое представляет собой водорастворимое нелипофильное вещество, для разрушения активности незащищенных ферментов с сохранением вирусной ферментативной активности в пределах оболочки вируса,
б1) удаляют частицы покрытого оболочкой вируса из инкубационной смеси, или
б2) инактивируют цистеин-модифицирующее вещество с помощью инактивирующего вещества,
сохраняющего вирусную оболочку от лизиса,
в) лизируют вирусную оболочку с помощью лизирующего буфера для высвобождения вирусных
ферментов, и
г) выделяют высвобожденный вирусный фермент из лизирующего буфера.
2. Способ по п.1, где покрытые оболочкой вирусы выбирают из семейства Retroviridae.
3. Способ по п.2, где вирус выбирают из лентивирусов, HTLV/BLV вирусов, ретровируса млекопитающих D-типа и ретровируса млекопитающих С-типа.
4. Способ по п.3, где лентивирус представляет собой вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).
5. Способ по любому из пп.1-4, где выделенный вирусный фермент представляет собой обратную
транскриптазу.
6. Способ по любому из пп.1-5, где биологический образец представляет собой образец жидкости
организма.
7. Способ по п.6, где образец жидкости организма представляет собой образец крови, плазмы или
сыворотки.
-8-
006740
8. Способ по любому из пп.1-7, где водорастворимое нелипофильное вещество выбрано из группы,
состоящей из N-этилмалеимида, Тимеросала, пара-гидроксимеркуриобензоата, 5,5'-дитиобис-(2нитробензойной кислоты), 2-аминоэтила 2'-аминоэтантиолсульфоната, 2-нитро-5-тиоцианобензойной
кислоты и метила метан-тиосульфоната.
9. Способ по любому из пп.1-8, где инактивирующее вещество представляет собой мягкий восстанавливающий агент.
10. Способ по п.9, где мягкий восстанавливающий агент выбран из группы, состоящей из цистеина,
цистеамина, меркаптоянтарной кислоты и глутатиона.
11. Набор для осуществления способа по любому из пп.1-10, содержащий письменные и/или размещенные на носителе информации инструкции по выполнению способа и цистеин-модифицирующее
вещество, и, необязательно, вирус-связывающий матрикс, либо вещество, инактивирующее цистеинмодифицирующее вещество с сохранением оболочки вируса от лизиса, и лизирующий буфер.
12. Набор по п.11, где цистеин-модифицирующее вещество выбрано из группы, состоящей из Nэтилмалеимида, Тимеросала, пара-гидроксимеркуриобензоата, 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты), 2-аминоэтила 2'-аминоэтантиолсульфоната, 2-нитро-5-тиоцианобензойной кислоты и метила метантиосульфоната,
вирус-связывающий матрикс представляет собой анионобменный матрикс,
инактивирующее вещество выбрано из группы, состоящей из цистеина, цистеамина, меркаптоянтарной кислоты и глутатиона, и
лизирующий буфер представляет собой буфер, совместимый с ферментным анализом, включающий
в себя детергент.
Фиг. 1
Фиг. 2
-9-
006740
Фиг. 3
Фиг. 4
- 10 -
006740
Фиг. 5
Фиг. 6
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 11 -