БИОХИМИЯ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АПОПТОЗА

Биохимия
БИОХИМИЯ
© М. В. Плосконос, 2013
УДК 612.616.2.08
М. В. Плосконос
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АПОПТОЗА СПЕРМАТОЗОИДОВ (Обзор литературы)
Астраханская государственная медицинская академия
Проведена классифицикация и дана оценка существующим методам, используемым для документации апоптоза сперматозоидов. Раскрыта сущность методов выявления изменений ДНК апоптотирующих сперматозоидов (методы SCSA, TUNEL и
Comet assay), сущность аннексинового метода, методов выявления изменения трансмембранного потенциала (Δψm) клеток,
определения активности каспаз и степени экспрессии белков – регуляторов апоптоза. Обсуждены достоинства и недостатки этих методов.
К л ю ч е в ы е с л о в а : апоптоз, сперматозоиды, фертильность
M.V. Ploskonos
The techniques to detect apoptosis of spermatozoids
The article presents the classification and evaluation of techniques applied in documentation of apoptosis of spermatozoids. The main
point of techniques detecting the changes in DNA of apoptosis spermatozoids (SCSA technique, TUNEL test and Comet assay) is
revealed. The annexin technique, the technique of detection of changes of cells transmembrane potential, the technique of detection
of activity of caspase and technique of detection the degree of expression of proteins-regulators of apoptosis are discussed too. The
advantages and shortcomings of these techniques are considered.
K e y w o r d s : apoptosis, spermatozoid, fertility
Важная роль в регуляции сперматогенеза принадлежит процессу программируемой гибели клетки – апоптозу, который может являться причиной нарушения
фертильности, а также низкого процента оплодотворения при выполнении вспомогательных репродуктивных
технологий (ВРТ). Процесс апоптоза сопровождается стадиеспецифическими изменениями морфологии
и биохимии клетки, что используют для его оценки.
Именно на особенностях протекания разных стадий
апоптоза (индукторный, эффекторный этап или этап
деградации) основаны методики его определения. Предпочтение тому или иному методу отдают в зависимости
от целей исследования (выявление ранней или поздней
стадии апоптоза, динамика развития, фармакологический скрининг и пр.), возможностей методического арсенала, технической базы лаборатории и в значительной
мере финансовых затрат. Чаще всего в исследованиях
как теоретического, так и прикладного плана возникает
потребность только в идентификации апоптотических
клеток, т. е. в документации апоптоза [7].
Методы выявления апоптотирующих сперматозоидов можно разделить на 3 группы: выявление морфологических изменений, свойственных апоптотирующей
клетке; выявление изменений ДНК в апоптотирующих
сперматозоидах; выявление структурно-биохимических
изменений вне ядерного аппарата клетки.
Д л я ко р р е с п о н д е н ц и и :
Плосконос Мария Вячеславовна, канд. биол. наук, проф. РАЕ, доц.
каф. общей и биоорганической химии
Адрес: 414000, Астрахань, ул. Бакинская, 121
Телефон: (8512)39-41-40
E-mail: [email protected]
В настоящее время в клинико-лабораторной практике и при проведении научных исследований применяют
разные способы документации апоптоза сперматозоидов. Одним из них является морфоструктурный анализ
исследуемых клеток [4]. При подсчете апоптотических
клеток с применением морфологического теста протекающий в сперматозоидах процесс апоптоза устанавливают по ультраструктурным изменениям ядерного аппарата, а именно учитывают такие проявления апоптоза,
как изменение плазматической мембраны, конденсация
ядерного хроматина по периферии ядра, образование
фрагментов ДНК с высокой молекулярной массой, образование апоптотических телец и др. [35, 39].
Апоптотический процесс сперматозоидов, однако,
имеет свои особенности, которые связаны с организацией ДНК и клетки в целом: это и специфический характер
организации хроматина, и очень малый объем цитоплазмы и др. В связи с этим к недостаткам метода относится
возникновение трудностей в определении и трактовке
признаков, свидетельствующих о протекании апоптоза в
сперматозоидах. Кроме того, морфологические и биохимические изменения при апоптозе происходят неодновременно [4]. Морфологические изменения становятся
видимыми только с началом необратимых изменений в
ядре и вне ядерного аппарата клетки. Изменения на ранних стадиях можно выявить только с помощью дополнительных биохимических лабораторных методик [6].
Наиболее оптимальным и перспективным методом
для оценки апоптоза сперматозоидов следует признать
цитофлюориметрический метод – проточную цитометрию (ПЦ) благодаря ее высокой информативности, статистической достоверности и доказательности результатов. ПЦ характеризуется объективностью показателей и
высокой производительностью (исследование от 1 тыс.
3
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 4, 2013
до 1 млн клеток в 1 c) [7, 28, 34], однако не каждая лаборатория имеет возможность проводить документацию
апоптоза клеток этим методом.
Для оценки апоптотических изменений сперматозоидов предложен ряд подходов, среди которых универсального алгоритма пока не выработано.
Методы, основанные на выявлении изменений ДНК
апоптотирующих сперматозоидов. Интернуклеосомная
деградация ДНК и фрагментация хроматина – специфические проявления апоптоза. Методологические подходы к характеристике изменений ДНК апоптотирующих
клеток можно разделить на 2 группы: идентификацию
разрывов ДНК и идентификацию клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК.
Изменения ДНК в сперматозоидах выявляют разными методами, включая тесты для оценки зрелости ядра
сперматозоидов, степени конденсации хроматина и тесты для непосредственного обнаружения повреждений
ДНК. Наиболее распространенными из них являются
TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick End Labeling), электрофорез ДНК индивидуальных, заключенных в агарозу
клеток, – Comet assay (single cell gel electrophoresis), тест
на структуру хроматина – метод SCSA (sperm chromatin
structure assay), которые позволяют определить степень
повреждения нитей ДНК в сперматозоидах, коррелирующую с мужской фертильностью как в естественных
условиях, так и во вспомогательной репродукции [10,
16, 20, 40, 50, 58]. Следует отметить, что различные методы, используемые для измерения количества разрывов
ДНК в сперматозоидах, дают сходные результаты, что не
оставляет сомнений в их достоверности [5].
Исследование структуры хроматина с помощью
окрашивания ДНК-флюорохромами. Окрашивание клеток флюоресцентными красителями, т. е. ДНК-флюорохромами, обладающими способностью избирательно
окрашивать двуспиральные нуклеиновые кислоты, является широко распространенным методом документации
апоптоза [4, 28]. Основное свойство ДНК-флюорохромов
– это стехиометрическое связывание: количество молекул связавшегося красителя строго пропорционально
количеству ДНК в клетке.
В настоящее время выбор ДНК-флюорохромов довольно велик. К ним относятся такие флюорохромы,
как группа фенантридинов и фенилиндолов: йодистый
пропидий (PI) и бромистый этидий; 6-диамино-2фенилиндол (DAPI); группа бензимидов (Hoescht 33342,
Hoescht 33358, Hoescht 33258); ряд антибиотиков:
7-аминоактиномицин D (7-AAD), митрамицин, хромамицин А3; акридоны (акридиновый оранжевый) и т. д.
[11, 20, 35, 50, 60]. Наиболее популярным красителем
для оценки апоптоза сперматозоидов является PI.
Окрашивание PI. PI не проникает через мембрану
живых клеток, но интенсивно окрашивает ДНК поврежденных клеток, апоптозных телец, фиксированных
клеток. Обработка апоптотирующих клеток преципитирующими фиксаторами (спирты, ацетон) и последующее отмывание клеток приводят к потере клетками
низкомолекулярных фрагментов ДНК. При окрашивании ДНК-флюорохромами такие клетки окрашиваются
слабее, чем нормальные, т. е. являются гипохромными
клетками.
Достоинствами метода являются простота и доступная стоимость, а также возможность хранения клеток,
что важно при выполнении серийных исследований. В
то же время метод имеет ряд ограничений и требует соблюдения определенных условий. Он позволяет выявить
апоптотирующие клетки, в которых уже произошла де-
4
градация ДНК, т. е. прошли относительно поздние стадии апоптоза [6]. В свою очередь чувствительность и
воспроизводимость метода в значительной мере зависят
от степени экстракции ДНК, т. е. от продолжительности
фиксации, числа отмывок клеток, молярности растворов и пр., поэтому необходимо строго соблюдать единообразные условия окрашивания. Специфичность метода
также невелика, так как в гипохромный пик могут попадать апоптозные тельца, фрагменты механически разрушенных клеток и ядер, хромосомы.
Окрашивание бромистым этидием. Полноценность
процесса компактизации хроматина сперматозоидов
можно оценить по методике О. А. Воробьевой и соавт.
[5] с помощью бромистого этидия с последующим анализом ядер методом ПЦ. Сперматозоиды выделяют из
семенной жидкости, в фосфатном буфере с помощью
тритона Х-100 разрушаются клеточные мембраны, образец делят на 2 части, в одну из которых добавляют гепарин и производят флюоресцентное окрашивание ДНК
бромистым этидием. Гистограмма распределения клеток
по способности связывать краситель до (в контроле) и
после обработки гепарином характеризует степень компактизации хроматина. В норме почти все клетки окрашиваются одинаково и имеют низкую интенсивность
флюоресценции, которая после воздействия гепарином
увеличивается в среднем в 2 раза. Повышение в эякуляте доли сперматозоидов с исходной интенсивностью
флюоресценции до 30% или же увеличение чувствительности клеток к воздействию гепарина оценивались
авторами как показатели нарушения процесса сперматогенеза [5].
Окрашивание Hoescht 33342. В соматических апоптотических клетках конденсированный хроматин определяют с помощью флюоресцентного красителя Hoescht
33342, который в апоптотических клетках ярче, чем в
живых. Исследование апоптоза в сперматозоидах с помощью такого метода несколько затруднено из-за того,
что упаковка хроматина в них и так достаточно плотная.
Некоторые авторы, однако, используют этот метод
для определения апоптоза в мужских половых клетках
[34, 45].
Окрашивание акридиновым оранжевым. Достоинства метода окрашивания флюорохромом акридиновым
оранжевым – простота, доступная стоимость, минимальные манипуляции с клетками. При тщательном выполнении, однотипных условиях окраски для всех проб
метод дает хорошо воспроизводимые результаты [28,
59]. Существенным недостатком метода при использовании проточной цитометрии является способность
акридинового оранжевого сорбироваться на стенках
проточной кюветы, что может привести к снижению
чувствительности цитометра. Работа с этим красителем
требует тщательных и многократных промывок прибора. На стадии расщепления ДНК на крупные фрагменты ее чувствительность к денатурации значительно
повышается. Точность полученных результатов зависит
от точности выполнения метода. Метод окрашивания
акридиновым оранжевым был адаптирован для исследования структуры хроматина сперматозоидов и получил
название SCSA.
Метод SCSA. Этот метод является одним из наиболее
распространенных методов исследования повреждения
ДНК сперматозоидов и признается наиболее удобным и
объективным [48]. Он заключается в окрашивании клеток акридиновым оранжевым после индуцированной
слабой кислотой или высокой температурой денатура-
БИОХИМИЯ
ции ДНК хроматина in situ. Клетки флюоресцируют зеленым при связывании красителя с нормальной двунитевой молекулой ДНК и красным при взаимодействии с
однонитевыми ДНК и РНК [5, 23, 38].
С использованием метода SCSA оценивают несколько параметров: индекс фрагментации ДНК – DFI (DNA
fragmentation index, %), или ИФ – процент сперматозоидов с наличием денатурированных вследствие их разрыва однонитчатых молекул ДНК; клетки с интенсивной
окрашиваемостью хроматина, HDS (high level of DNA
stainability, %) – процент сперматозоидов с незрелым
ядром и повышенной доступностью красителя к молекуле ДНК [5]. Благодаря тому что неконденсированный
хроматин более доступен для красителя, интенсивность
окрашивания ДНК зрелых сперматозоидов в 5 раз ниже,
чем круглых сперматид [26]. ИФ менее 30% классифицируется как низкий уровень ДНК фрагментации, ИФ
более 30% – как высокий уровень; HDS, менее 15% –
как низкое содержание незрелых сперматозоидов, HDS
более 15% – как высокий уровень незрелых сперматозоидов [10, 47]. Таким образом, метод SCSA регистрирует не только, а возможно и не столько, разрывы ДНК,
сколько степень плотности упаковки хроматина и экранировку ДНК белками хроматина от связывания красителя [5].
Метод SCSA адаптирован к ПЦ и в таком виде нашел
широкое использование в научных исследованиях и в
практике репродуктивных центров [10, 23]. Применение
для анализа техники ПЦ дает несомненные преимущества по сравнению с использованием световой микроскопии, заключающиеся в возможности объективно,
быстро и с высокой степенью точности оценить по нескольким параметрам большое число (десятки тысяч)
клеток, что приводит к высокой статистической достоверности результатов. Модификация метода SCSA на
препаратах после обработки клеток кислотой и последующего анализа с помощью флюоресцентного микроскопа оказалась менее удачной. При этом наблюдается
постепенное снижение интенсивности флюоресценции
в связи с длительностью проведения анализа, большой
долей клеток с промежуточным (желтым) окрашиванием и неравномерностью поглощения красителя клеткой,
распластанной на стекле [5].
М. Н. Тарасовой и соавт. [10] предложена запатентованная модификация метода SCSA, в соответствии с
которой состояние хроматина сперматозоидов оценивают, применяя метод ПЦ, на основании сравнения гистограмм распределения клеток до и после насильственной
деконденсации гепарином, определяя индекс подобия
кривых D/s (нормальное значение этого индекса в соответствии с патентом более 48,5 усл. ед.) [10].
В сравнении с показателями обычной спермограммы
степень фрагментации хроматина, оцениваемая с помощью SCSA, является более стабильным во времени
параметром, вследствие чего метод рекомендован для
оценки мужской фертильности как в рутинной практике, так и для проведения эпидемиологических исследований [1, 18].
Исследование фрагментации ДНК. TUNEL-метод.
TUNEL является современным методом, позволяющим
наиболее точно оценить сам факт фрагментации ДНК;
при этом появление характерных для апоптоза дискретных фрагментов находит отражение в виде пиков
флюоресцентного сигнала при цитофлюорометрической
оценке результатов. Интенсивность флюоресценции обратно пропорциональна величине фрагментов ДНК: при
полном расщеплении на фрагменты по 180–200 п. сиг-
нал будет наиболее ярким, так как количество разрывов
ДНК в этом случав максимальное [20, 31, 40, 43, 54].
TUNEL является количественным методом, при помощи
которого определяются апоптотические клетки на промежуточных и поздних стадиях апоптоза [6].
Суть метода заключается в выявлении разрывов ДНК
в апоптотирующих клетках, обработанных "сшивающими" фиксаторами. Для этого к 3’-ОН концевым фрагментам разрывов ДНК (DNA strand breaks) с помощью фермента терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы
(TdT) присоединяется модифицированный нуклеотид
(например, BrdUTP), который далее визуализируется с
помощью МКА, конъюгированных с флюорохромом [4,
13, 17]. В качестве флюорохрома обычно используется
флюоресцеин dUTP для мечения фрагментов ДНК после
фиксации клеток и обработки их тритоном Х-100 [15,
55]. Интенсивность люминесценции пропорциональна
числу встроенных dUTP и соответственно числу разрывов в ДНК. Использование TUNEL в комбинации с ПЦ
значительно упрощает методику и позволяет проводить
исследование спермального хроматина в большом количестве клеток, тем самым обеспечивая высокую воспроизводимость метода [1].
В клинических работах было показано, что благодаря
высокой специфичности и воспроизводимости TUNEL
может успешно применяться для оценки степени фрагментации спермальной ДНК; полученные результаты
коррелируют как с показателями мужской фертильности
[49], так и с результатами лечения бесплодия с использованием программ ВРТ [1, 17, 30]. Пациенты, у которых
обнаруживают более 10% TUNEL-позитивных сперматозоидов, имеют сниженную результативность ЭКО [5,
16, 47].
TUNEL – наиболее надежный и достоверный (аналитический) метод документации апоптоза. Он весьма
специфичен; так, при использовании метода ПЦ некротические клетки и клетки, содержащие крупные
фрагменты разрушенной ДНК (вследствие воздействия
повреждающих ДНК химических соединений или физических факторов), не имеют характерной цитофлюорометрической картины. Вместе с тем этот метод достаточно трудоемок, хотя при качественном приготовлении
реагентов, определенном навыке исполнителя он хорошо воспроизводим и может использоваться в серийных
клинических исследованиях. В настоящее время для
использования указанного метода разные фирмы выпускают как отдельные реагенты, так и полные наборы реактивов (Kit), рассчитанные на то или иное количество
определений.
Электрофоретические методы (Comet Assay). Эндонуклеазное межнуклеосомное расщепление ДНК на
фрагменты, происходящее в ходе апоптоза в соматических клетках, выявляется электрофоретически в образцах выделенной из клеток ДНК с окрашиванием бромистым этидием (DNA ladder assay) [4]. Характерный для
большинства апоптотических клеток рисунок фрагментов ДНК ("лестница") для сперматозоидов не выявляется, однако высоко- и низкомолекулярные фракции ДНК
могут быть идентифицированы электрофоретически
[47].
Гелевый электрофорез на единичных клетках, получивший название "Comet Assay", в настоящее время
нашел применение для анализа степени фрагментации
спермальной ДНК [9, 21, 33].
Клетки, находящиеся в геле агарозы, подвергаются воздействию определенной комбинации реагентов
с целью разрушения мембран и экстракции гистонов и
5
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 4, 2013
протаминов. Под влиянием электрического поля происходит миграция фрагментов ДНК, не связанных с
ядерным матриксом, к положительному электроду. При
окраске ДНК-специфическими красителями создается
эффект "кометы", где длина хвоста "кометы" и интенсивность сигнала отражают степень фрагментации ДНК
[1]. Таким образом, название "Comet" связано с тем, что
окрашенные клетки после такой процедуры имеют форму кометы, ядро которой составлено основной массой
высокомолекулярной ядерной ДНК, а хвост "кометы"
представляет собой фракцию относительно низкомолекулярной ДНК, образовавшейся в результате появления
разрывов в высокомолекулярной хромосомной ДНК
[58]. Существуют 2 модификации метода – нейтральная
и щелочная. В первом случае регистрируются разрывы
только обеих нитей ДНК, во втором случае видны разрывы и одной, и двух нитей.
Comet является одним из наиболее чувствительных
методов оценки повреждения ДНК. Одним из его недостатков является недостаточная стандартизованность
протоколов исследования. Кроме того, щелочная методика показывает большое количество "комет" во всех
клетках, возможно вследствие присутствия в сперматозоидах областей, неустойчивых в щелочной среде, что
затрудняет идентификацию эндогенных и индуцированных повреждений ДНК. Тем не менее в клинических исследованиях показана эффективность Comet как метода
оценки функции сперматозоидов и мужской фертильности, а также его способность прогнозировать исходы
ВРТ [1, 52].
Проведены специальные исследования, посвященные сопоставлению различных методов оценки целостности ДНК. Показано, что результаты Comet-анализа
коррелируют с результатами TUNEL и SCSA [21, 25].
Тем не менее мнения исследователей как о диагностической значимости тех или иных методов оценки состояния спермального хроматина, так и о влиянии степени
фрагментации ДНК на репродуктивный потенциал сперматозоидов и исходы программ ВРТ противоречивы, что
диктует необходимость расширения исследований в этом
направлении [1, 56, 57]. Причинами, по которым экспертная группа ВОЗ еще не включает тесты на состояние
хроматина сперматозоидов в рекомендации по клиническому лабораторному анализу эякулята, являются "технические сложности метода, отсутствие понимания биологических механизмов, лежащих в основе анализируемого
параметра, а также стандартизированной методологии и
общепринятого протокола" [42]. Это свидетельствует о
необходимости проведения дальнейших исследований,
направленных на совершенствование указанных методик
и определение клинической значимости выявленных изменений [1].
Методы, основанные на выявлении структурнобиохимических изменений, происходящих вне ядерного
аппарата сперматозоидов. Существует ряд методов,
с помощью которых можно выявить изменения в цитоплазме и клеточной мембране сперматозоидов, происходящие при апоптозе: идентификация характерных
для апоптоза изменений архитектоники мембран клеток
– экстернализация фосфатидилсерина (аннексиновый
метод); характеристика состояния митохондрий – изменение трансмембранного потенциала (Δψm); определение активности инициирующих и эффекторных каспаз;
определение степени экспрессии белков–регуляторов
апоптоза (Bcl и др.).
Следует подчеркнуть, что выявление экспрессии рецептора апоптогенного сигнала на клетках – FasR – не яв-
6
ляется доказательством апоптоза, а свидетельствует лишь
о потенциальной готовности клетки к Fas-зависимому
апоптозу [4]. Определение FasR и FasL на сперматозоидах, а также концентрации их растворимых форм sFas и
sFasL в спермоплазме проводят при наличии соответствующих MKA методом ПЦ, с помощью иммуноферментного анализа или вестерн-блот-анализа [2, 3, 27, 37, 44].
Определение изменений архитектоники мембран
клеток (экстернализация фосфатидилсерина) путем
окрашивания конъюгатом аннексина V с флюорохромом
и PJ. Окрашивание сперматозоидов конъюгированным с
флюорохромом (чаще всего FITC) аннексином V (AnVFITC) и PI является одним из наиболее удобных, информативных, имеющих оптимальное соотношение цена/
качество и широко используемых методов документации апоптоза сперматозоидов.
Одно из самых ранних биохимических изменений,
происходящих в клетке, подвергшейся апоптозу, это нарушение симметрии клеточной мембраны и перемещение
фосфатидилсерина (ФС) на ее внешнюю сторону (экстернализация) [4, 43]. Аннексин V – кальцийзависимый
белок (35–36 кД), обладающий высокой аффинностью к
ФС. Он способен специфически связываться с отрицательно заряженным ФС и позволяет детектировать его
экстернализацию на внешнюю сторону плазматической
мембраны сперматозоидов при апоптозе [28, 35, 54, 59].
В свою очередь конъюгат аннексина V и FITC позволяет
выявить апоптотирующие сперматозоиды с использованием метода ПЦ или флюоресцентной микроскопии.
Существует, однако, вероятность того, что окрасятся и
клетки, находящиеся в состоянии некроза, так как AnVFITC может проникнуть в некротические клетки через
разрывы мембраны и окрасить ее внутренний слой. Дополнительное окрашивание сперматозоидов катионным
красителем PI, который проникает только в погибшие
клетки через поврежденную при некрозе мембрану, как
раз и позволяет идентифицировать клетки, находящиеся
в разных стадиях апоптоза, а также отделить некротические клетки от нормальных живых и апоптотических
[6, 38].
Живые клетки не связывают аннексин V и непроницаемы для катионных красителей. Потеря мембранной
асимметрии в динамике развития апоптоза соответствует начальным этапам фрагментации ДНК и конденсации хроматина (ранний апоптоз) и предшествует потере
проницаемости мембраны для катионных красителей.
На этой стадии апоптотирующие клетки связывают аннексин V, но, как и живые клетки, непроницаемы для
катионных красителей. Поздняя фаза апоптоза – формирование апоптозных телец – сопровождается не только
формированием мембранной асимметрии, но и резким
возрастанием проницаемости мембраны для катионных
красителей. Клетки, находящиеся в позднем апоптозе, и
частично некротические клетки связывают AnV-FIТС и
непроницаемы для PI. Некротические клетки не связывают AnV-FIТС, но проницаемы для PI [52].
Зная число окрашенных апоптотических и некротических клеток, можно рассчитать апоптотический
индекс: соотношение апоптотических и живых сперматозоидов [14]. Апоптотическими являются около 20%
эякуляторных сперматозоидов по оценкам, полученным
путем определения с помощью аннексина [60].
Исследования, в которых проводили анализ с использованием аннексина и методов детекции разрывов
в ДНК, таких, например, как TUNEL, доказывают наличие корреляции экстернализации ФС и разрывов в ДНК
в сперматозоидах [14].
БИОХИМИЯ
Существенным преимуществом метода окрашивания
сперматозоидов комбинацией AnV-FIТС и PI является
минимальное число манипуляций, повреждающих клетки. При использовании метода в клинической практике
необходимо соблюдение однообразных условий постановки реакции, так как от этого в значительной мере
зависит воспроизводимость метода. Для получения надежных результатов следует строго соблюдать одинаковые интервалы от момента взятия спермы до получения
отмытых сперматозоидов, окрашивания и анализа. Это
связано с тем, что сперматозоиды могут отвечать инициацией апоптоза или некрозом при длительной инкубации
в неоптимальной для выживания среде, при воздействии
факторов, повреждающих клеточную мембрану, и пр.,
что приведет к нарастанию содержания апоптотирующих
и некротических сперматозоидов. Необходимо также
строго соблюдать температурный режим окрашивания и
концентрацию реагентов. В настоящее время существует
множество наборов, содержащих готовые реагенты. Использование коммерческих наборов, безусловно, упрощает работу, но увеличивает стоимость метода.
Определение трансмембранного потенциала митохондрий (Δψm) с помощью митохондриальных флюоресцентных зондов. Ранние стадии апоптоза сопровождаются потерей митохондриями способности к поддержанию
мембранного потенциала, что связано с подавлением
антиоксидантных функций ингибирующих апоптоз
белков семейства Всl2. В результате уменьшения трансмембранного потенциала и образования пор проапоптогенные факторы (например, цитохром с) поступают в
цитоплазму, где инициируют каскад каспаз [8].
Методы, основанные на оценке Δψm сперматозоидов,
заключаются в применении липофильных флюоресцентных красителей, чувствительных к мембранному
потенциалу митохондрий и легко проникающих через
мембраны клеток [41].
Красители (их называют митохондриальными флюоресцентными зондами) аккумулируются в митохондриях,
связываются с внутренней митохондриальной мембраной
и при этом образуют интенсивно флюоресцирующие комплексы. При снижении ΔΨm накопление красителя уменьшается, равно как и интенсивность его свечения. Определение проницаемости мембраны митохондрий окрашиванием липофильными красителями позволяет определить
митохондриальные изменения на ранних стадиях апоптоза, предшествующие ядерным изменениям [6].
К красителям, которые используются для оценки митохондриального потенциала, относятся 3,3’дигексилоксакарбоцианина йодид – DiOC6(3) [34–36],
carbocyanin DiOC2, DilC1, родамин 123 – Rh123 [24, 29],
тетраметилродамин (TMRE) и др. [4]. В последнее время все чаще используется краситель 5,5’,6,6’-тетрахлор1,1’,3,3’-тетраэтилбензимидазолкарбоцианина йодид –
JC-1 [12, 21]. JC-1 характеризуется наибольшей тропностью к митохондриям, поэтому при его использовании
снижается уровень неспецифического окрашивания.
Исследованию Δψm, вовлеченного в апоптоз в сперматозоидах, посвящено немного исследований [21, 34,
36, 41]. По данным литературы [34], сперматозоиды с
высоким уровнем митохондриального потенциала имели низкий уровень фрагментации ДНК.
Определение Δψm митохондрий – простой и надежный
метод документации раннего апоптоза сперматозоидов,
пригодный как для научных, так и для серийных клинических исследований. При использовании указанного
метода число манипуляций с клетками невелико, однако
при окрашивании с увеличением времени экспозиции
пробы возможно изменение энергетического потенциала сперматозоида, интенсивности свободнорадикальных
процессов, что может привести к сдвигу установленных
параметров флюоресценции контрольных клеток. Метод
достаточно чувствителен к качеству реагентов.
При использовании DiOC6(3) и ряда других красителей подобного типа возникают проблемы с неспецифическим окрашиванием; интенсивность флюоресценции
в этом случае будет ниже, чем при взаимодействии с
митохондриальной мембраной. Это нередко затрудняет
идентификацию апоптоза. При использовании JC-1 проблемы селективности окрашивания исчезают, именно
поэтому JС-1 входит в состав большинства коммерческих наборов для определения Δψm митохондрий [12].
Определение активности каспаз. Каскад инициирующих и эффекторных каспаз и повышение их активности
являются характерной чертой и основным "инструментом" реализации апоптоза в клетках [11, 46]. Экспрессия
неактивных и активных форм каспаз в сперматозоидах в
некоторых исследованиях оценивают с помощью вестернблота [34, 53]. Этот метод, безусловно, точен и информативен, однако трудоемок и сложно выполним в серийных
исследованиях. Активность каспаз в сперматозоидах определяют главным образом с помощью иммуннофлюоресцентного метода [19, 61]. Активный прогресс в области
создания реагентов и технологий позволяет в настоящее
время оценивать активность каспаз (или их экспрессию в
сперматозоидах) с помощью ПЦ, что находит все большее
применение в исследованиях [35, 36, 41].
Если в исследовании не ставится задачи изучить сам
процесс апоптоза в клетке, то для документации апоптоза наиболее целесообразно оценивать активность
каспазы-3. Существует 2 подхода.
Первый подход заключается в стандартной процедуре окрашивания активной формы каспазы-3. Для
этого используют MКА или поликлональные антитела
к активной форме каспазы-3, конъюгированные с флюорохромами (например, FITC). В этих целях применяют
антитела разных производителей. Окрашивание производят по стандартной методике окрашивания внутриклеточных антигенов.
Второй подход состоит в использовании конъюгированных флюорохромами проникающих через мембрану
сперматозоидов селективных необратимых ингибиторов
каспаз FLICA (fluorescein labeled inhibitor of caspase), которые образуют комплекс с ферментом [22]. Для идентификации каспазы служит конъюгат FITC-VAD-fmk (ValAla–Asp-fluoromethylketone; разные производители).
При использовании FITC-VAD-fmk возможно докрашивание сперматозоидов йодистым пропидием [34–36].
Определение экспрессии белков–регуляторов апоптоза (Вcl2). Одно из ключевых событий при апоптозе
– повреждение митохондрий с повышением проницаемости митохондриальных мембран. Митохондрия содержит "коктейль" про- и антиапоптотических белков,
высвобождение которых в цитоплазму клетки приводит
к реализации апоптоза или ингибирует его. В настоящее
время известно около 20 различных белков, которые
являются продуктами генов семейства Всl2. Среди них
выделяют антиапоптотические белки, или супрессоры
апоптоза (bcl2, bcl-XL и др.), и проапоптотические белки, или индукторы апоптоза (bax, bak, bok, bik и др.).
Именно равновесие между этими белками определяет
"судьбу" клетки [8].
Оценка экспрессии белков–регуляторов апоптоза в
сперматозоидах, соотношения между про- и антиапоптогенными белками является информативным подходом
7
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 4, 2013
к анализу их реактивности и ее нарушений. Определение уровня таких белков, в частности семейства Bcl,
применяется для исследования инициации апоптотического состояния сперматозоидов [20].
Для анализа экспрессии белков–регуляторов апоптоза используются иммуногистохимические методы [32],
вестерн-блот-анализ, что усложняет работу и делает ее
трудновыполнимой в условиях клинических лабораторий. В настоящее время большинство ведущих производителей реагентов выпускает конъюгированные с
флюорохромами распознающие регуляторные белки
МКА, пригодные для ПЦ. Окрашивание производят по
стандартной методике окрашивания внутриклеточных
антигенов.
Белок Всl2 (25 кД) содержится, в частности, на наружной митохондриальной мембране сперматозоидов
и относится к эндогенным факторам защиты клеток от
апоптоза [4, 32]. Оценка экспрессии Всl2, соотношение
между каспазой-3 и антиапоптогенным белком Bcl-XL,
между про- и антиапоптогенными белками (например,
анализ соотношения Вах/Всl2 или Bax/Bcl-XL) может
иметь диагностическую и прогностическую значимость
при различных патологиях [19].
Таким образом, для документации апоптоза сперматозоидов приходится использовать разные методы и
традиционные молекулярно-биологические подходы.
Морфологические изменения при апоптозе являются
проявлениями происходящих в апоптотических сперматозоидах биохимических процессов. Следует подчеркнуть, однако, что ни один из известных критериев или
морфологических и биохимических признаков, а также
ни один из методов определения не является единственным в своем роде при спецификации указанного вида
гибели клетки.
Л И Т Е РА Т У РА
1. Абубакиров А. Н. Урология. 2009; 3: 86–91.
2. Барышников А. Ю., Тоневицкий А. Г. Моноклональные антитела
в лаборатории и клинике. М.: Медицина; 1997.
3. Барышников А. Ю., Шишкин Ю. В. Иммунологические проблемы апоптоза. М.: Эдиториал УРСС; 2002.
4. Бойчук С. В., Мустафин И. Г., Фассахов Р. С. Казанский медицинский журнал. 2000; 3: 217–22.
5. Воробьева О. А., Воскресенская А. В., Одинцов А. А. и др. Проблемы репродукции. 2005; 6: 56–62.
6. Казначеев К. С. Гематология и трансфузиология. 1999; 1: 40–3.
7. Колышкин В. М., Ночевный В. Т., Новохатский А. С. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2005; 6: 99–105.
8. Мойбенко А. А., Досенко В. Е., Нагибин B. C. Патологическая
физиология и экспериментальная терапия. 2005; 3: 17–26.
9. Сорочинская У. Б., Михайленко В. М. Онкология. 2008; 10 (3):
303–9.
10. Тарасова М. Н., Чистякова Г. Н., Ремизова И. И. и др. Проблемы
репродукции. 2008; 5: 52–5.
11. Almeida С., Cardoso М., Sousa М. Hum. Reprod. 2005; 20 (5):
1307–13.
12. Andrade A., Arruda R., Celeghini E. et al. Reprod. Dom. Anim. 2007;
42: 190–4.
13. Anzar M., He L., Buhr M. M. et al. Biol. Reprod. 2002; 66: 354–60.
14. Barroso G., Morshedi M., Oehninger S. Hum. Reprod. 2000; 15 (6):
1338–44.
15. Bebchlaib M., Braun V., Lornage J. et al. Hum. Reprod. 2003; 18 (5):
1023–8.
16. Вое-Hansen G. B., Morris I. D., Ersboll A. K. et al. Theriogenology.
2005; 63 (6): 1789–802.
17. Borini A. et al. Hum. Reprod. 2006; 21: 2876–81.
18. Bungum M. et al. Hum. Reprod. 2004; 19: 1401–8.
19. Cayli S., Sakkas D., Vigue L. et al. Mol. Hum Reprod. 2004; 10 (5):
365–72.
8
20. Chen C.-H., Lee S.-S., Chen D.-H. et al. J. Androl. 2004; 25 (3):
348–53.
21. Donnelly E. T., O’Connell M., McClure N. et al. Hum. Reprod. 2000;
15 (7): 1552–61.
22. Ekert P. G., Silke J., Vaux D. L. Cell Death Differ. 1999; 6: 1081–6.
23. Erenpreiss J., Jepson К., Giwercman A. et al. Hum. Reprod. 2004; 19
(10): 2277–82.
24. Evenson D. P., Darzynkiewicz Z., Melamed M. R. J. Histochem.
Cytochem. 1982; 30 (3): 279–80.
25. Evenson D. P., Jost L. K., Marshall D. et al. Hum. Reprod. 1999; 14
(4): 1039–49.
26. Evenson D. P., Larson K. L., Jost L. K. J. Androl. 2002; 23: 25–43.
27. Fujisawa M., Ishikawa Т. J. Urol. 2003; 170: 2363–5.
28. Gadella B. M., Harrison R. A. P. Biol. Reprod. 2002; 67: 340–50.
29. Garner D., Johnson L. Biol. Reprod. 1995; 53: 276–84.
30. Henkel R., Kierspel E., Hajimohammad M. et al. Reprod. Biomed.
Online. 2003; 7: 477–84.
31. Ji G., Gu А., Hu F. et al. Hum. Reprod. 2009; 24 (10): 2439–46.
32. Kucera E., Konig F., Tangl S. et al. Hum. Reprod. 2001; 16 (6):
1286–90.
33. Lewis S. E. et al. Hum. Reprod. 2004; 19: 1385–94.
34. Marchetti C., Gallego M.-A., Deffossez A. et al. Hum. Reprod. 2004;
19 (5): 1127–34.
35. Martin G., Sabido О., Durand P. et al. Biol. Reprod. 2004; 71: 28–
37.
36. Martin G., Sabido Q., Durand P. et al. Hum. Reprod. 2005; 20 (12):
3459–68.
37. McVicar С. М., McClure N., Williamson K. et al. Fertil. Steril. 2004;
81 (Suppl. 1): 767–74.
38. Moustafa M. H., Sharma R. K., Thornton J. et al. Hum. Reprod.
2004; 9 (1): 129–38.
39. Muratori M., Piomboni P., Baldi E. et al. J. Androl. 2000; 21: 903–
12.
40. Muratori M., Marchiani S., Tamburrino L. et al. Hum. Reprod. 2008;
23 (5): 1035–43.
41. Paasch U., Sharma R., Gupta A. et al. Biol. Reprod. 2004; 71: 1828–
37.
42. Perreault S. D., Aitken R. J., Baker H. W. et al. Adv. Exp. Med. Biol.
2003; 518: 253–68.
43. Ramos L., Wetzels A. M. M. Hum. Reprod. 2001; 16 (8): 1703–7.
44. Riccioli A., Secco V. Dal., Cesaris P. De. et al. Hum. Reprod. 2005;
20 (10): 2814–20.
45. Rowland S. C., Jacobson J. D., Patton W. C. et al. Am. J. Obstet.
Gynecol. 2003; 188 (5): 1156–7.
46. Said Т. М., Paasch U., Glander H. J. et al. Hum. Reprod. Update.
2004; 10 (1): 39–51.
47. Schlegel P. N., Paduch D. A. Fertil. Steril. 2005; 84 (4): 854–9.
48. Seli E., Sakkas D. Hum. Reprod. Update. 2005; 11 (4): 337–49.
49. Sergerie M., Laforest G., Bujan L. et al. Hum. Reprod. 2005; 20 (12):
3446–51.
50. Shen H.-M., Ong С. N. Free Radic. Biol. Med. 2000; 28: 529–36.
51. Sion В., Janny L., Boucher D. et al. Int. J. Androl. 2004; 27: 108–
14.
52. Tarozzi N., Bizzaro D., Flamigni C. et al. Reprod. BioMed. Online.
2007; 14: 746–57.
53. Taylor S. L., Weng S. L., Fox P. et al. Mol. Hum. Reprod. 2004; 10
(11): 825–34.
54. Tesarik J., Greco E., Mendoza С. Hum. Reprod. 2001; 16 (12):
2640–5.
55. Tesarik J., Greco E., Mendoza С. Hum. Reprod. 2004; 19 (3):
611–5.
56. Tesarik J., Mendoza-Tesarik R., Mendoza C. Reprod. BioMed.
Online. 2006; 12: 715–21.
57. Tomlinson M. J., Moffatt O., Manicardi G. C. et al. Hum. Reprod.
2001; 16 (10): 2160–5.
58. Tomsu M., Sharma V., Miller D. Hum. Reprod. 2002; 17 (7): 1856–62.
59. Vries K. J., Wiedmer Т., Sims P. J. et al. Biol. Reprod. 2003; 68:
2122–34.
60. Wang X., Sharma R. K., Sikka S. C. et al. Fertil. Steril. 2003; 80 (3):
531–5.
61 Weil M., Jacobson M. D., Raff M. C. et al. J. Cell Sci. 1998; 111:
2707–15.
Поступила 28.11.12