2 486 196(13) C2

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
(19)
RU
(11)
2 486 196
(13)
C2
(51) МПК
C07K 14/525 (2006.01)
A61K 38/19 (2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
(12) ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21)(22) Заявка: 2010128602/10, 12.12.2008
(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
12.12.2008
(72) Автор(ы):
ФИШЕР Вернхард (AT),
ЛУКАС Рудольф (BE)
(43) Дата публикации заявки: 20.01.2012 Бюл. № 2
C 2
2 4 8 6 1 9 6
(85) Дата начала рассмотрения заявки PCT на
национальной фазе: 12.07.2010
(86) Заявка PCT:
AT 2008/000448 (12.12.2008)
R U
C 2
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: WO 0009149 A1, 24.02.2000. LUCAS R. ET
AL., Mapping the lectin-like activity of tumor
necrosis factor, Science, 1994, v.263, no.5148,
pp.814-817. WO 9006945 A1, 28.06.1990. EP
1452868 A2, 01.09.2004. HRIBAR M, ET AL.,
The lectin-like domain of tumor necrosis factoralpha increases membrane conductance in
microvascular endothelial cells and (см. прод.)
(54) ЦИКЛИЧЕСКИЙ БЕЛОК, НЕ СОДЕРЖАЩИЙ ОСТАТКОВ ЦИСТЕИНА
(87) Публикация заявки РСТ:
WO 2009/073909 (18.06.2009)
Адрес для переписки:
129090, Москва, ул. Б.Спасская, 25, стр.3,
ООО "Юридическая фирма Городисский и
Партнеры", пат.пов. Е.Е.Назиной, рег.№ 517
(57) Реферат:
Изобретение
относится
к
области
биотехнологии, а именно к полипептиду,
который активирует эпителиальные ионные
каналы. Предложенное изобретение можно
применять для изготовления лекарственного
средства для лечения заболеваний, связанных с
легочной
функцией,
например
отеков.
Предложенный
полипептид
представляет
собой аминокислотную последовательность
участка от валина Val(91) до глицина Gly(121)
человеческого зрелого фактора некроза
опухоли или его функционально активный
фрагмент с условием, что полипептид или его
фрагмент содержит, по меньшей мере,
аминокислотную последовательность участка
от
лизина
Lys(98)
до
глутаминовой
кислоты Glu(116), при этом цистеин Cys(101)
Ñòð.: 1
ru
2 4 8 6 1 9 6
(45) Опубликовано: 27.06.2013 Бюл. № 18
R U
(73) Патентообладатель(и):
АПЕПТИКО ФОРШУНГ УНД
ЭНТВИКЛУНГ ГМБХ (AT)
Приоритет(ы):
(30) Конвенционный приоритет:
12.12.2007 AT A2014/2007
заменен на глицин и образована амидная связь
между
аминогруппой
боковой
цепи
лизина Lys(98) и карбоксильной группой
боковой цепи глутаминовой кислоты Glu(116).
Предложенное
изобретение
позволяет
активировать ионные каналы эпителия и
улучшает легочную функцию. 4 з.п. ф-лы, 6
ил., 3 табл., 7 пр.
(56) (продолжение):
peritoneal macrophages, Eur J Immunol, 1999, v.29, no.10, pp.3105-3111. BRAUN С. ET AL., Dichotomal role
of TNF in experimental pulmonary edema reabsorption, J Immunol. 2005, v.175, no.5, pp.3402-3408. RU
2116799 C1, 10.08.1998.
R U
R U
2 4 8 6 1 9 6
C 2
C 2
2 4 8 6 1 9 6
Ñòð.: 2
RUSSIAN FEDERATION
(19)
RU
(11)
2 486 196
(13)
C2
(51) Int. Cl.
C07K 14/525 (2006.01)
A61K 38/19 (2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY
(12) ABSTRACT
OF INVENTION
(72) Inventor(s):
FIShER Vernkhard (AT),
LUKAS Rudol'f (BE)
(21)(22) Application: 2010128602/10, 12.12.2008
(24) Effective date for property rights:
12.12.2008
(43) Application published: 20.01.2012 Bull. 2
2 4 8 6 1 9 6
(45) Date of publication: 27.06.2013 Bull. 18
(85) Commencement of national phase: 12.07.2010
(86) PCT application:
AT 2008/000448 (12.12.2008)
2 4 8 6 1 9 6
R U
Mail address:
129090, Moskva, ul. B.Spasskaja, 25, str.3, OOO
"Juridicheskaja firma Gorodisskij i Partnery",
pat.pov. E.E.Nazinoj, reg.№ 517
(54) CYCLIC PROTEIN CONTAINING NO CYSTEINE RESIDUES
polypeptide or fragment thereof comprises at least an
amino acid sequence of a region from lysine Lys(98)
to glutamic acid Glu(116), wherein cysteine Cys(101)
is substituted by glycine, and an amide bond is
formed between an amino group of a side chain of
lysine Lys(98) and a carboxyl group of a side chain
of glutamic acid Glu(116).
EFFECT: presented invention enables activating
the epithelial ion channels and improves the
pulmonary function.
5 cl, 6 dwg, 3 tbl, 7 ex
Ñòð.: 3
en
C 2
C 2
(87) PCT publication:
WO 2009/073909 (18.06.2009)
(57) Abstract:
FIELD: medicine, pharmaceutics.
SUBSTANCE: invention refers to biotechnology,
namely to a polypeptide which activates the
epithelial ion channels. The presented invention can
be used for producing a drug preparation for diseases
related to pulmonary function, such as oedemas. The
presented polypeptide is an amino acid sequence of a
region from valine Val(91) to glycine Gly(121) of the
mature human tumour necrosis factor, or a
functionally active fragment thereof, provided the
R U
(73) Proprietor(s):
APEPTIKO FORShUNG UND EhNTVIKLUNG
GMBKh (AT)
Priority:
(30) Convention priority:
12.12.2007 AT A2014/2007
RU 2 486 196 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Настоящее изобретение относится к циклическому белку, не содержащему остатков
цистеина, который может применяться в качестве лекарственного средства, например,
для активации эпителиальных ионных каналов, для улучшения функции легких, а
также для лечения отеков, например легочных отеков.
Транспорт жидкости через клеточные слои и ткани в первую очередь основан на
осмотическом градиенте, который создается активным векторным транспортом
ионов, например транспортом натрия. Он осуществляется преимущественно по строго
регулируемым и жизненно важным ионным каналам, например по комплексу
эпителиального натриевого канала (ENaC). Вода пассивно следует по указанному
градиенту, в том числе через специальные водные каналы, например по водному
каналу аквапорину V. Известно, что в легочной ткани базолатерально на клетках Na+
/K+АТФ-азной помпы происходит векторный транспорт натрия в интерстициальное
пространство и в итоге транспорт ионов в лимфатические сосуды и кровеносные
сосуды. Таким образом, указанный транспорт является активным и происходит
независимо от транспульмонального давления и концентрации альвеолярных белков.
Отеком называют патологическое накопление жидкости в органе, например в
легком, а также в мозге или коже. Отек в легком называется легочным отеком. В
основе отека легких в большинстве случаев выявляют дисбаланс между
экстравазацией жидкости и ресорбцией жидкости. Очень часто нарушается также
проницаемость легочной ткани, поэтому увеличивается приток жидкости, и жидкость
накапливается в легочных альвеолах.
Такая патологическая проницаемость вследствие недостаточного обратного
транспорта жидкости из легочных альвеол в интерстициальное пространство играет
особую роль при синдроме острого повреждения легких (ALI), или при остром
респираторном дистресс-синдроме (ARDS), или при тяжелом остром респираторном
синдроме (SARS), при пневмонии и при полиорганной недостаточности. Вместе с тем,
патологическая проницаемость играет роль при других легочных заболеваниях,
например при респираторно-индуцированных легочных повреждениях,
трансплантации легких, легочных повреждениях, связанных с трансфузией, при
терапевтическом введении IL-2 или при астме.
Как результат повышенного накопления жидкости в ткани или органе, например в
легком, возникает препятствие или полное ограничение для необходимого газового
обмена. Поступление в кровь кислорода из воздуха отсутствует, таким образом, могут
возникать опасные для жизни повреждения органов по причине дефицита кислорода.
Не существует общепринятой стандартной терапии для лечения отека, связанного с
проницаемостью. Обычно у больных с отеком легких предпринимаются попытки
искусственного дыхания для гарантированного поступления кислорода в кровь и
таким образом к органам.
В патенте DE 3841759 рассматриваются отдельные пептиды, полученные из фактора
некроза опухоли (TNF).
Авторы Carswell et al. в Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3666, 1975 год, сообщали, что
обработанная эндотоксином сыворотка животных, предварительно инфицированных
штаммом микобактерий Кальметта-Герена (БЦЖ), вызывала геморрагической некроз
при различных опухолях у мышей. Эта активность была обусловлена фактором
некроза опухоли. TNF также проявляет цитостатическое или цитотоксическое
действие in vitro против ряда трансформированных клеточных линий, тогда как в
нормальных клеточных линиях человека и животных такого воздействия не
наблюдается (М. R. Ruff et al., Lymphokines, Vol. II, Academic Press Inc., New York, 1981,
Ñòð.: 4
DE
RU 2 486 196 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
pp. 235-275). В литературе описаны биохимические свойства и ген человеческого TNF
(D Pennica et al, Nature 312, 724, 1984; Aggarwal, B. B. et al, J. Biol. Chem. 260, 2334-2345,
1985; Nedwin, G.E. et al, Nucl. Acids Res. 13, 6361, 1985).
Из приведенных ниже данных можно получить следующую структуру белка
человеческого зрелого фактора некроза опухоли (TNF):
(NH2)Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln
Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu
Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly
Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr
Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys
Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu
Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala
Leu(COOH).
Дополнительно, описаны гены TNF коровы, кролика и мыши (Goeddel D.V. et al.,
Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 597, 1986).
Наряду с другими свойствами, цитотоксичность TNF играет основную роль в
воспалительных реакциях (J.W.Larrick et al, Pharmac. Res. Vol. 5, No. 3, 129-139, 1988). В
модели животных удалось продемонстрировать участие TNF при септическом
шоке (Torti F. M. et al, Science 229, 867-869, 1985) и при реакции трансплантат против
хозяина (Piguet, P.F. et al, J. Exp. Med. 166, 1280, 1987).
Авторы Lucas R. et al, Science (1994) Vol. 263. no. 5148, pp. 814-817 описывают пептид,
полученный из участка TNF от Ser(99) до Glu(116), который предложен для лечения
отеков. Указанный пептид также рассмотрен в публикации WO 00/09149. Вместе с тем,
для придания полезности этому пептиду согласно WO 00/09149 аминокислоту Pro в
положении (100) необходимо искусственно заменять на аминокислоту цистеин и Cys в
положении (101) заменять на аминокислоту глицин. Поскольку линейный пептид
от Ser(99) до Glu(116) не обладает эффектом согласно настоящему
изобретению (Hribar M. et al., Eur. J. Immunol. (1999), Vol.29, 3105-3111; Braun C., J.
Immunol. (2005), 175: 3402-3408; Fukuda N. et al. J. Physiol Lung Cell Mol. Physiol. (2001)
280: L1258-L1265), необходимо дополнительно заменять Glu в положении (116) на
аминокислоту цистеин.
Пептид, описанный в WO 00/09149, не подходит для изготовления лекарственных
средств по причине содержания двух цистеинов в положениях (100) и (116), которые,
как известно, редуцируются в растворе, при этом разрушается сульфидный мостик
между цистеинами и происходит дезинтеграция циклической структуры пептида,
вследствие чего пептид становится неэффективным.
Был неожиданно обнаружен циклический белок, не содержащий остатков цистеина,
который получен из зрелого фактора некроза опухоли (TNF) и проявляет интересные
биологические качества.
Зрелый фактор некроза опухоли (TNF), используемый в настоящем изобретении,
предпочтительно является человеческим зрелым фактором некроза опухоли.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к белку, который выбирают из
аминокислотной последовательности участка от валина Val(91) до глицина Gly(121)
или из его фрагмента, от зрелого человеческого фактора некроза опухоли, с условием,
что белок содержит, по меньшей мере, аминокислотную последовательность участка
от лизина Lys(98) до глутаминовой кислоты Glu(116), при этом цистеин Cys(101)
заменен на глицин и амидная связь образована между аминогруппой боковой цепи
лизина Lys(98) и карбоксильной группой боковой цепи глутаминовой кислоты Glu(116).
Ñòð.: 5
RU 2 486 196 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Белок, рассматриваемый в настоящем изобретении, обозначается здесь также как
“белок согласно (по) настоящему изобретению”.
Согласно настоящему изобретению особенно подходящими белками являются
белки со следующими аминокислотными последовательностями:
SEQ ID NO:1
(NH2)Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala-Ile-Lys-Ser-Pro-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-GluAla-Lys-Pro-Trp-Tyr-Glu-Pro-Ile-Tyr-Leu-Gly(COOH), в которых образована амидная
связь между аминогруппой боковой цепи лизина Lys(8) и карбоксильной группой
боковой цепи глутаминовой кислоты Glu(26), и
SEQ ID NO:2
(NH2)Lys-Ser-Pro-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-TyrGlu(COOH), в которых образована амидная связь между аминогруппой боковой цепи
лизина Lys(1) и карбоксильной группой боковой цепи глутаминовой кислоты Glu(19).
Белок согласно настоящему изобретению можно изготовлять подходящим
способом, например аналогично известным способам или способу, описанному в
настоящем изобретении, например химическим синтезом посредством химии пептидов
или микробиологических способов. Вставление амидной связи между свободной
аминогруппой и свободной карбоксильной группой может также происходить
подходящим способом, например, сходным с общепринятым способом, или согласно
настоящему описанию.
Белок согласно настоящему изобретению может существовать в свободной форме
или в форме соли, например в форме кислотно-аддитивной соли, например соли
уксусной кислоты или трифторуксусной кислоты, и в дополнительном аспекте
настоящее изобретение относится к белку согласно настоящему изобретению в форме
соли.
Было обнаружено, что белок согласно настоящему изобретению проявляет
интересную биологическую активность и поэтому может применяться в качестве
лекарственного средства.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к белку согласно
настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства,
например, к применению белка согласно настоящему изобретению в качестве
лекарственного средства.
Например, в биологических исследованиях человеческих клеток показано, что
белок согласно настоящему изобретению, а также в отличие от человеческого TNF,
практически не проявляет каких-либо воспалительных или токсичных свойств. Для
исследования человеческие иммунные клетки крови смешивали с белком согласно
настоящему изобретению в малой концентрации и инкубировали по общепринятой
лабораторной методике. Следующим этапом маркерные белки воспаления определяли
в бесклеточной культуральной среде посредством общепринятых способов. Несмотря
на добавление белка согласно настоящему изобретению, например белка с
аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, было
невозможно обнаружить такие белки воспаления, как, например, маркер воспаления
интерлейкин-6 (IL-6).
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу
профилактики воспалений, например, к предотвращению образования маркеров
воспаления, таких как IL-6, при терапевтическом применении белков, полученных из
фактора некроза опухоли, например из человеческого фактора некроза опухоли, и
указанный способ отличается применением белка согласно настоящему изобретению.
Ñòð.: 6
RU 2 486 196 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Дополнительно, общепринятым лабораторным способом является обнаружение
активации ионных каналов посредством пэтч-кламп методики фиксации потенциала,
который описан, например, в публикации Clunes M.T. et al., J. Physiol. Vol 557, Number
3, 809-819 (June 15, 2004). Для исследования фиксации потенциала ионных каналов
стеклянную пипетку тонко вытягивают и наполняют нейтральным буферным
раствором. Стеклянную пипетку (пэтч-кламп пипетка) осторожно вдавливают в
интактную эпителиальную клетку. В нижней части пипетки находится фрагмент
мембраны. Таким образом, возникает электрическое сопротивление между
внутренним содержимым пипетки и внешним раствором. Электрод, который соединен
с высокочувствительным усилителем, погружен в раствор пипетки.
К удивлению обнаружено, что белок согласно настоящему изобретению, например
белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2,
который согласно описанию настоящего изобретения циклизирован посредством
амидной связи, способен активировать эпителиальные ионные каналы, что
доказывается изменением амплитуды электрического сигнала. Вследствие того, что
белок согласно настоящему изобретению не содержит остатки цистеина или
сульфидный мостик, такой белок не может быть редуцированным.
Для создания модели острого легочного повреждения и для образования отека
легких по общепринятой лабораторной методике неоднократно орошали легкие
подопытных животных, например мышей или крыс, подкисленным солевым
раствором (например, согласно методике Isik F. et al., Eur J. Cardiothorac Surg (2005);
28: 301-305). В результате возникало снижение легочной функции. При введении белка
согласно настоящему изобретению, например белка с аминокислотной
последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, который, согласно настоящему
описанию, циклизирован амидной связью, путем распыления или в виде водного
раствора в легкие подопытных животных наступало отчетливое улучшение легочной
функции в течение от 3 до 5 часов, на что указывало повышение содержания
кислорода в артериальной крови.
Таким образом, белок согласно настоящему изобретению можно применять для
лечения отеков, например легочных отеков.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к белку согласно настоящему
изобретению для лечения заболеваний, связанных с легочной функцией, например, к
применению белка согласно настоящему изобретению для производства
лекарственного средства для лечения заболеваний, связанных с легочной функцией.
Лечение заболеваний, связанных с легочной функцией, включает в себя, например,
активацию эпителиальных ионных каналов, улучшение легочной функции и/или
лечение отеков, например легочных отеков,
лечение:
- синдрома острого легочного повреждения (ALI),
- острого респираторного дистресс-синдрома (ARDS),
- тяжелого острого респираторного синдрома (SARS),
- пневмонии,
- в случае полиорганной недостаточности,
- при легочных повреждениях вследствие искусственного дыхания, трансплантации
легких, при легочных повреждениях, связанных с трансфузией, терапевтическом
введении IL-2 или при астме,
например, активацию эпителиальных ионных каналов, улучшение легочной
функции и/или лечение отеков, например легочных отеков.
Ñòð.: 7
RU 2 486 196 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболеваний,
связанных с легочной функцией, который отличается тем, что достаточное количество
белка согласно настоящему изобретению вводят нуждающемуся в таком лечении
пациенту.
В понятие «пациент», используемое в настоящем изобретении, включены
млекопитающие, например человек.
Белок согласно настоящему изобретению можно вводить в виде фармацевтического
препарата.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическому
препарату, который отличается содержанием белка согласно настоящему
изобретению, например, в комбинации по меньшей мере с одним фармацевтически
приемлемым адъювантом, например, носителем или разбавитель, с таким как
наполнители, связующие средства, средства улучшения текучести, лубриканты,
ароматизаторы, сахар или подслащивающие средства, субстанции отдушки,
консерванты, стабилизирующие субстанции, увлажняющие средства, эмульгаторы,
солюбилизаторы, соли для регуляции осмотического давления и/или буферные агенты
(смеси).
Подходящее количество белка согласно настоящему изобретению для лечения
заболеваний будет безусловно в большой степени зависеть от разных параметров,
например от химической природы и фармакокинетики используемого белка,
индивидуальных особенностей пациента, вида заболевания, которое лечат, от способа
применения, при этом эффективная ежедневная доза для крупных млекопитающих
будет включать в себя количества, например, от 0,0001 г до 1,5 г, например от 0,001
мг/кг веса тела примерно до 20 мг/кг веса тела.
Введение можно осуществлять легочным или парентеральным путем и
предпочтительно применяют парентеральный путь.
Фармацевтический препарат согласно настоящему изобретению можно
производить подходящим способом, например, аналогично общеизвестному способу,
например, способами смешивания, гранулирования, покрытия, растворения,
лиофилизации.
Описание фигур
На фигуре 1A показана высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)
белка с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1. Единицы: ось y:
поглощение в единицах поглощения оптической плотности mAU; ось x: время в
минутах.
Фигура 1B показывает ВЭЖХ белка с аминокислотной последовательностью SEQ
ID NO:2. Единицы: ось y: поглощение в mAU; ось x: время в минутах.
Фигура 2A показывает активацию натриевых ионных каналов с помощью белка с
аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1. Единицы: ось y: количество;
ось x: амплитуда в пА.
Фигура 2B. Показывает активацию натриевых ионных каналов с помощью белка с
аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2. Единицы: ось y: количество;
ось x: амплитуда в пА.
Фигура 3A. Показывает повышение содержания кислорода в артериальной крови
после введения белка с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1. Единицы:
ось y: содержание кислорода в %; ось x: время измерения в минутах.
Фигура 3B. Показывает повышение содержания кислорода в артериальной крови
после введения белка с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2. Единицы:
Ñòð.: 8
RU 2 486 196 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ось y: содержание кислорода в %; ось x: время измерения в минутах.
Пример 1
Синтез белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, в
котором образована амидная связь между аминогруппой боковой цепи лизина Lys(8)
и карбоксильной группой боковой цепи глутаминовой кислоты Glu(26)
Белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 синтезировали
посредством Fmoc-твердофазного синтеза полностью автоматическим способом со
следующими этапами:
Этап
Процесс
1
связывание аминокислот
Продукт
связывание пептида (белка) с твердой фазой
2
отделение от твердой фазы
пептид (белок) в растворе
3
очистка
очищенный пептид (белок) в виде соли трифторуксусной
кислоты ТФК
4
очистка/обмен солями
очищенный пептид (белок) в виде соли уксусной кислоты
5
аналитический анализ
очищенный пептид (белок)
Циклизацию проводили путем связывания эпсилон-аминогруппы лизина
(положение 8) с гамма-карбоксильной группой глутаминовой кислоты (положение 26)
с образованием амидной связи. Это происходит, например, вследствие превращения
гамма-карбоксильной группы глутаминовой группы в активный сложный эфир
посредством дициклогексилкарбодиимида (DCC), активный сложный эфир которого
затем спонтанно реагирует с эпсилон-аминогруппой лизина с образованием в белке
замкнутого кольца.
Затем белок анализировали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ, при этом был
получен результат, показанный на фигуре 1A.
Пример 2
Синтез белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, в
котором образована амидная связь между аминогруппой боковой цепи лизина Lys(1)
и карбоксильной группой боковой цепи глутаминовой кислоты Glu(19)
Белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2 синтезировали
полностью автоматическим способом посредством Fmoc-твердофазного синтеза в
следующих этапах:
Этап
Процесс
1
связывание аминокислот
Продукт
связывание пептида (белка) с твердой фазой
2
отделение от твердой фазы
пептид (белок) в растворе
3
очистка
очищенный пептид (белок) в виде соли трифторуксусной
кислоты ТФК
4
очистка/обмен солями/ окислительная циклизация
очищенный пептид (белок) в виде соли уксусной кислоты
5
аналитический анализ
очищенный пептид (белок)
Циклизацию проводили путем связывания эпсилон-аминогруппы лизина
(положение 1) с гамма-карбоксильной группой глутаминовой кислоты (положение 19)
с образованием амидной связи. Это происходит, например, вследствие превращения
гамма-карбоксильной группы глутаминовой группы в активный сложный эфир
посредством дициклогексилкарбодиимида (DCC), активный сложный эфир которого
затем спонтанно реагирует с эпсилон-аминогруппой лизина с образованием в белке
замкнутого кольца.
Затем белок анализировали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ, при этом был
получен результат, показанный на фигуре 1В.
Пример 3
Ñòð.: 9
RU 2 486 196 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Клеточная культура
Электрофизиологические эксперименты проводились с человеческими
клетками H441. Клетки H441 представляют собой человеческие клетки легочного
эпителия, которые участвуют в диффузии воды и электролитов в легких.
Клетки H441 получали в Коллекции тканевых культур США (American Tissue Culture
Collection) и культивировали в общепринятых флаконах для клеточных культур в
среде RPMI 1640 (Invitrogen). Эта культуральная клеточная среда дополнительно
содержала 4,5 г/л глюкозы, 1% пенициллина/стрептомицина и 5% эмбриональной
телячьей сыворотки.
Для локальной фиксации потенциала клетки переносили на малые стеклянные
чашки.
Пример 4
Активация ионных каналов человеческих эпителиальных клеток с помощью
белков, содержащих аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2
Макроскопические потоки и одноканальные потоки отводились от клеток H441 в
конфигурации "целая клетка" и "прикрепленная клетка" по методике пэтчкламп (Hamill et al, Pflugers Arch. 1981, 391 (2):85-100, (1981)).
Для измерения отдельных ионных каналов белки растворяли в растворе, состоящем
из 135 мМ Na-глюконата, 15 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 2 мМ CaCl2, 5 мМ
глюкозы, 10 мМ Hepes, с уровнем pH 7,4 и заполняли пэтч-пипетку. Потенциал
клеточной мембраны деполяризовали до 0 мВ с помощью деполяризующего
раствора 140 мМ KCl, 15 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 10 мм Hepes, с уровнем pH 7,4. Во
время измерений устанавливали напряжение (пэтч) -100 В.
Указанный протокол выполняли путем добавления белков, содержащих
аминокислотные последовательностями SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, а также
ингибитор натриевого канала амилорид. Полученные таким образом электрические
отведения регистрировали и анализировали с помощью программы PCLAMP 6.0.
Результаты, показывающие активацию натриевых ионных каналов с помощью
белков с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2,
приведены на фигуре 2A и фигуре 2B.
Пример 5
Экспериментальное изучение отека легких на животных
Самцам крыс породы Wistar (весом от 250 г до 350 г) проводили анестезию
ромпуном (Rompun®) (0,02 мл/100 г) и кетаветом (Ketavet®) (0,1 мл/100 г). Вдох и
выдох происходил с частотой 72 цикла/мин, при продолжительности вдоха 0,2 с и
продолжительности выдоха от 0,5 с. Температура тела составляла в среднем от 37°C
до 39°C. В нормальном состоянии PaO2 (артериальное парциальное давление
кислорода) составляло от 500 до 550 мм ртутного столба.
Для создания модели острого легочного повреждения и для образования отека
легких от 7 до 9 раз орошали легкие подкисленным солевым раствором (уровень pH 5).
Через один час вводили интратрахеально, путем распыления (при максимальном
объеме введения 0,5 мл) белки с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1
или SEQ ID NO:2, растворенные в стерильном солевом растворе.
С интервалом 60 минут у животных забирали артериальную кровь (0,1 мл) и
определяли содержание кислорода в % к средним значениям.
После введения белка с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ
ID NO:2 повышалось содержание кислорода в крови, что очевидно из фигуры 3A или
фигуры 3B, также смотри пример 6.
Ñòð.: 10
RU 2 486 196 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
Пример 6
Улучшение легочной функции с помощью белков с аминокислотными
последовательностями SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2
Доказательство активирующего действия на легочную функцию белка согласно
настоящему изобретению, например белка с аминокислотной
последовательностью SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, получали
посредством экспериментальных исследований на животных, у которых индуцировали
отек легких. Схема эксперимента описана в примере 5.
Для интратрахеальной ингаляции растворяли 125 мкг белка в 150 мМ солевого
раствора с уровнем pH 7,3. Содержание кислорода в артериальной крови измеряли
непосредственно перед орошением легких, через 60 минут после орошения легких и
через 180 минут после орошения легких. Содержание кислорода непосредственно
перед орошением легких составляло 100%. Через 60 минут соответственно после
последнего орошения легких содержание кислорода в крови составляло в среднем
только 20%. В течение 3 часов процентное содержание кислорода повышалось до:
62% при введении белка с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 и
75% при введении белка с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2.
Без применения белка в течение 180 минут после орошения легких не выявлено
улучшения легочной функции (содержание кислорода 20%).
Результаты представлены
- на фигуре 3A для белка с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1,
- на фигуре 3B для белка с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2.
Пример 7
Определение параметров воспаления
Свежая человеческая кровь обладает высокочувствительной реакцией, кроме всего
прочего, на провоспалительные молекулы с высвобождением маркера воспаления
интерлейкина-6 (IL-6). Для выявления провоспалительной реакции инкубировали
образцы свежей человеческой крови со следующей концентрацией белка, содержащего
аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 от 1 нг/мл до 10 мкг/мл. После
инкубации в течение 24 часов при 37°C проводили количественное определение в
растворе маркера воспаления интерлейкина-6 посредством твердофазного
иммуноферментного анализа ELISA. Липополисахариды (ЛПС) служили
положительным контролем (в концентрации 3 нг/мл и 100 нг/мл).
При этом в результате были получены указанные в таблице 1 данные, которые
показывают влияние пептида (белка) с аминокислотной последовательностью SEQ ID
NO:2 по сравнению с ЛПС на высвобождение из клеток крови маркера воспаления
интерлейкина-6:
Таблица 1
45
Относительная концентрация белка
и липополисахаридов
соответственно
без добавления белка (показатели
нормальной крови)
50
Белок с SEQ ID NO:2
Положительный контроль ЛПС
Концентрация интерлейкина-6 (пг/мл), (среднее значение трех измерений)
менее 0,5
менее 0,5
10 мкг/мл
менее 0,5
195,640
1 мкг/мл
менее 0,5
108,370
3 нг/мл
менее 0,5
34,867
1 нг/мл
менее 0,5
не определено
Результаты измерения в таблице 1 показывают, что при инкубации человеческих
иммунных клеток в свежей крови с белком с аминокислотной
Ñòð.: 11
RU 2 486 196 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
последовательностью SEQ ID NO:2 практически не высвобождается какой-либо
маркер воспаления IL-6 и таким образом реакция воспаления не возникает. Напротив,
инкубация с ЛПС в качестве положительного контроля вызывает мощное
высвобождение маркера воспаления интерлейкина-6.
Формула изобретения
1. Полипептид, активирующий эпителиальные ионные каналы и выбранный из
аминокислотной последовательности участка от валина Val(91) до глицина Gly(121)
человеческого зрелого фактора некроза опухоли, или его функционально активный
фрагмент, с условием, что полипептид или его фрагмент содержит, по меньшей мере,
аминокислотную последовательность участка от лизина Lys(98) до глутаминовой
кислоты Glu(116), при этом цистеин Cys(101) заменен на глицин и образована амидная
связь между аминогруппой боковой цепи лизина Lys(98) и карбоксильной группой
боковой цепи глутаминовой кислоты Glu(116), и где структура полипептида
человеческого зрелого фактора некроза опухоли (TNF) содержит следующую
аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3:
(NH2)Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gin
Ala Glu Gly Gln Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu
Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly
Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr
Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala
Lys Pro Trp Tyr GluProIle Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala
Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala
Leu(COOH).
2. Полипептид по п.1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID
NO:1 (NH2)Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala-Ile-Lys-Ser-Pro-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-AlaGlu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Glu-Pro-Ile-Tyr-Leu-Gly(COOH), в котором образована амидная
связь между аминогруппой боковой цепи лизина Lys(8) и карбоксильной группой
боковой цепи глутаминовой кислоты Glu(26).
3. Полипептид по п.1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID
NO:2 (NH2)Lys-Ser-Pro-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-TyrGlu(COOH), в котором образована амидная связь между аминогруппой боковой цепи
лизина Lys(l) и карбоксильной группой боковой цепи глутаминовой кислоты Glu(19).
4. Полипептид по любому из пп.1-3 для применения в качестве лекарственного
средства.
5. Полипептид по любому из пп.1-3 для лечения отека легких.
45
50
Ñòð.: 12
CL
RU 2 486 196 C2
Ñòð.: 13
DR
RU 2 486 196 C2
Ñòð.: 14
RU 2 486 196 C2
Ñòð.: 15
RU 2 486 196 C2
Ñòð.: 16
RU 2 486 196 C2
Ñòð.: 17