RU 2 515 095 C1

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
(19)
RU
(11)
(13)
2 515 095
C1
(51) МПК
C12N 1/21 (2006.01)
C12P 13/08 (2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
(12) ОПИСАНИЕ
(21)(22) Заявка:
ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
2012149041/10, 19.11.2012
(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
19.11.2012
(45) Опубликовано: 10.05.2014 Бюл. № 13
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: RU 2244007 C2, 10.01.2005. Sally
(73) Патентообладатель(и):
Федеральное государственное унитарное
предприятие "Государственный научноисследовательский институт генетики и
селекции промышленных микроорганизмов"
(ФГУП "ГосНИИгенетика") (RU)
2 5 1 5 0 9 5
R U
(54) БАКТЕРИЯ РОДА ESCHERICHIA - ПРОДУЦЕНТ L-ТРЕОНИНА И СПОСОБ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА L-ТРЕОНИНА С ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
(57) Реферат:
Изобретение относится к биотехнологии и
fumA инактивирован. Изобретение позволяет
представляет собой способ микробиологического
получать L-треонин с высокой степенью
синтеза L-треонина с использованием бактерии,
эффективности. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 3 пр.
принадлежащей к роду Escherichia, в которой ген
Стр.: 1
C 1
C 1
Адрес для переписки:
117545, Москва, 1-й Дорожный пр-д, 1, ФГУП
"ГосНИИгенетика"
2 5 1 5 0 9 5
A.Woods et.al. Differential roles of the
Escherichia coli fumarases and fnr-dependent
expression of fumarase B and aspartase, FEMS
Microbiology Letters 48 (1987), p.219-224. US
5175107 A1, 29.12.1992. WO 03008607 A2,
30.01.2003
R U
Приоритет(ы):
(22) Дата подачи заявки: 19.11.2012
(72) Автор(ы):
Юзбашев Тигран Владимирович (RU),
Выборная Татьяна Владимировна (RU),
Ларина Анна Сергеевна (RU),
Гвилава Илиа Теймуразович (RU),
Воюшина Нина Евгеньевна (RU),
Мокрова Светлана Сергеевна (RU),
Юзбашева Евгения Юрьевна (RU),
Синеокий Сергей Павлович (RU)
RUSSIAN FEDERATION
(19)
RU
(11)
(13)
2 515 095
C1
(51) Int. Cl.
C12N 1/21 (2006.01)
C12P 13/08 (2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY
(12) ABSTRACT
(21)(22) Application:
OF INVENTION
2012149041/10, 19.11.2012
(24) Effective date for property rights:
19.11.2012
(45) Date of publication: 10.05.2014 Bull. № 13
R U
2 5 1 5 0 9 5
(54) BACTERIA OF ESCHERICHIA KIND - PRODUCER OF L-THREONINE AND METHOD OF
MICROBIOLOGICAL SYNTHESIS OF L-THREONINE WITH ITS USAGE
(57) Abstract:
FIELD: biotechnologies.
the gene fumA is inactivated.
SUBSTANCE: invention represents a method of
EFFECT: invention makes it possible to produce
microbiological synthesis of L-threonine with usage of
L-threonine with high extent of efficiency.
a bacteria that belongs to the Escherichia kind, in which
2 cl, 1 tbl, 3 ex
Стр.: 2
C 1
C 1
(73) Proprietor(s):
Federal'noe gosudarstvennoe unitarnoe
predprijatie "Gosudarstvennyj nauchnoissledovatel'skij institut genetiki i selektsii
promyshlennykh mikroorganizmov" (FGUP
"GosNIIgenetika") (RU)
2 5 1 5 0 9 5
Mail address:
117545, Moskva, 1-j Dorozhnyj pr-d, 1, FGUP
"GosNIIgenetika"
R U
Priority:
(22) Date of filing: 19.11.2012
(72) Inventor(s):
Juzbashev Tigran Vladimirovich (RU),
Vybornaja Tat'jana Vladimirovna (RU),
Larina Anna Sergeevna (RU),
Gvilava Ilia Tejmurazovich (RU),
Vojushina Nina Evgen'evna (RU),
Mokrova Svetlana Sergeevna (RU),
Juzbasheva Evgenija Jur'evna (RU),
Sineokij Sergej Pavlovich (RU)
RU 2 515 095 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в
частности к способу микробиологического синтеза L-треонина с использованием
бактерии рода Escherichia, в которой ген fumA инактивирован.
Описание предшествующего уровня техники
Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены
методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, выделенных из
природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того,
чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.
Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например путем
трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США
4278765). Указанные методы основаны на повышении активности ферментов,
вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или уменьшении чувствительности целевого
фермента к обратному ингибированию продуцируемой L-аминокислотой (см., например,
патентную заявку Японии №56-18596 (1981), WO 95/16042 или патенты США 5661012
и 6040160).
Известны различные штаммы, использующиеся для производства L-треонина методом
ферментации. Это штаммы с увеличенными активностями ферментов, вовлеченных в
биосинтез L-треонина (патенты США 5175107; 5661012; 5705371; 5939307; Европейский
патент 219027), штаммы, устойчивые к некоторым химических реагентам, таким как
L-треонин и его аналоги (заявка РСТ 0114525А1, европейская заявка 301572А2, патент
США 5661012), штаммы, устойчивые к соединениям, таким как L-треонин и его аналоги
(международная заявка WO 0114525 А1, Европейский патент 301572А2, патент США
5376538), штаммы, в которых устранена чувствительность целевого фермента к
ингибированию продуцируемой аминокислотой или ее побочными продуктами по типу
обратной связи (патенты США 5175107 и 5661012), штаммы с инактивированными
ферментами системы деградации треонина (патенты США 5939307 и 6297031).
Известный штамм-продуцент L-треонина ВКПМ В-3996 (патенты США 5175107 и
5705371) является лучшим на сегодняшний день штаммом-продуцентом L-треонина.
Для создания штамма ВКПМ В-3996 несколько мутаций и плазмида, описанная ниже,
были введены в родительский штамм Е.coli K-12 (ВКПМ В-7). Мутантный ген thrA
(мутация thrA442) кодирует белок аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, который
устойчив к ингибированию треонином по типу обратной связи. Мутантный ген ilvA
(мутация ilvA442) кодирует белок треониндеаминазу, обладающую пониженной
активностью, которая выражается в пониженном уровне биосинтеза изолейцина и в
фенотипе с недостатком по изолейцину типа "leaky". В бактерии с мутацией ilvA442
транскрипция оперона thrABC не репрессируется изолейцином, что дает положительный
эффект на продукцию треонина. Инактивация гена tdh приводит к предотвращению
деградации треонина. В указанный штамм была введена генетическая детерминанта
ассимиляции сахарозы (гены scrKYABR). Для увеличения экспрессии генов,
контролирующих биосинтез треонина, в промежуточный штамм TDH6 была введена
плазмида pVIC40, содержащая мутантный треониновый оперон thrA442BC. Количество
треонина, накопленного в ходе ферментации этого штамма, достигало 85 г/л.
Ранее авторы настоящего изобретения получили исходя из E.coli K-12 мутант,
содержащий мутацию thrR (упоминаемый здесь и далее как rhtA23), придающую
устойчивость к высокой концентрации треонина и гомосерина на минимальной
питательной среде (Astaurova О.В. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 21, 611-616 (1985)).
Фенотипически мутация выражается в повышении продукции L-треонина (патент СССР
№974817), гомосерина и глутамата (Astaurova О.В. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 27,
Стр.: 3
RU 2 515 095 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
556-561,1991, Европейская патентная заявка 1013765А) соответствующим штаммомпродуцентом E.coli, таким как штамм ВКПМ-3996. Более того, авторы этого изобретения
показали, что ген rhtA расположен на 18-й минуте хромосомы E.coli, рядом с опероном
glnHPQ, кодирующим компоненты транспортной системы глутамина, и что ген rhtA
идентичен открытой рамке считывания ORF1 (ген ybiF, номера нуклеотидов с 764 по
1651 в последовательности с инвентарным номером ААА2218541 в GenBank, gi:440181),
расположенной между генами рехВ и ompX. Ген, экспрессирующий белок, кодируемый
ORF1, был назван геном rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine - устойчивость к
гомосерину и треонину). Кроме того, было установлено, что мутация rhtA23 является
заменой G на А в положении - 1 относительно старт кодона ATG (ABSTRACTS of 17 th
International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual
Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457; Европейская патентная заявка 1013765).
Фумараза (фумарат-гидратаза, L-малат-гидро-лиаза), фермент класса лиаз,
катализирующий обратимое присоединение воды к дианиону фумаровой кислоты с
образованием малата-дианиона яблочной кислоты. В E.coli активностью фумаразы
обладают три фермента, кодируемые генами fumA, fumB и fumC. Из них при аэробных
условиях культивирования, как например, в условиях продукции L-треонина, основанную
активность фумаразы обеспечивает фумараза, кодируемая геном fumA. Так, в аэробных
условиях инактивация гена fumA ведет к неспособности штамма E.coli расти на среде
с фумаратом в качестве единственного источника углерода (Guest JR, Roberts RE (1983).
"Cloning, mapping, and expression of the fumarase gene of Escherichia coli K-12." J Bacteriol
153 (2); 588-96). В штамме с инактивированным геном fumA, в зависимости от условий
культивирования, активность фумаразы может быть снижена или отсутствовать (Woods
SA, Guest JR (1987). "Differential roles of the Escherichia coli fumarases and fnr-dependent expression of fumarase В and aspartase." FEMS Microbiol Lett 48: 219-24). В настоящее время
нет сообщений, описывающих использование инактивации гена fumA для получения
L-треонина.
Описание изобретения
Задача настоящей группы изобретений - повышение продуктивности штаммов рода
Escherichia - продуцентов L-треонина и разработка способа микробиологического
синтеза L-треонина с использованием указанных штаммов.
Задача решена путем получения бактерии-продуцента L-треонина, принадлежащей
к роду Escherichia и модифицированной таким образом, что в ней инактивирован ген
фумаразы fumA, а также разработки способа микробиологического синтеза L-треонина
с использованием такой бактерии.
Более детально настоящее изобретение будет описано ниже.
1. Бактерия согласно настоящему изобретению.
Бактерия согласно настоящему изобретению - это бактерия-продуцент L-треонина
рода Escherichia, модифицированная таким образом, что активность фумаразы снижена
или отсутствует за счет инактивирования гена fumA.
Согласно настоящему изобретению «бактерия - продуцент L-треонина » означает
бактерию, обладающую способностью к накоплению L-треонина в питательной среде,
когда указанную бактерию выращивают в питательной среде. Способность к продукции
L-треонина может быть придана или улучшена путем селекции. Используемый здесь
термин «бактерия-продуцент L-треонина» также означает бактерию, которая способна
к продукции L-треонина и вызывает накопление L-треонина в ферментационной среде
в больших количествах по сравнению с природным или родительским штаммом E.coli,
Стр.: 4
RU 2 515 095 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
таким как штамм Е.coli K-12, и предпочтительно означает, что указанный
микроорганизм способен накапливать в среде L-треонин в количестве не менее чем 0.5
г/л, более предпочтительно не менее чем 1.0 г/л.
Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия
относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту
в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к
роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута
бактерия E.coli.
Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы
в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например,
бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть
включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.
Термин "активность фумаразы" обозначает активность по катализу реакции
превращения фумаровой кислоты в яблочную. Активность фумаразы может быть
измерена с помощью метода, описанного ранее (Guest JR, Roberts RE (1983). "Cloning,
mapping, and expression of the fumarase gene of Escherichia coli K-12." J Bacteriol 153(2);58896).
Термин "активность фумаразы снижена" означает, что указанная удельная активность
ниже, чем активность этого фермента в немодифицированном штамме, например
природном. Примеры такой модификации включают уменьшение количества молекул
фумаразы на бактериальную клетку, снижение специфической активности молекулы
фумаразы и так далее. Термин "активность фумаразы отсутствует" обозначает, что в
модифицированном штамме указанная активность не детектируется. Отсутствие
активности фумаразы является одним из примеров снижения указанной активности.
Кроме того, природным штаммом, используемым для сравнения, может быть, например,
штамм Escherichia coli K-12. Согласно настоящему изобретению, в результате снижения
или отсутствия внутриклеточной активности фумаразаы может быть повышено
количество накопленного L-треонина в среде.
Снижение активности фумаразы в бактериальной клетке может быть достигнуто за
счет ослабления экспрессии гена, кодирующего фумаразу.
В качестве гена, кодирующего фумаразу из Escherichia coli, известна нуклеотидная
последовательность гена fumA (номера нуклеотидов с 1686401 по 1684755 в
последовательности с инвентарным номером U00096.2 в базе данных GenBank). Ген
fumA расположен на хромосоме штамма E.coli K-12 между генами fumC и manA.
Следовательно, ген fumA может быть получен с помощью полимеразной цепной реакции
(ПЦР) (White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров,
синтезированных на основе нуклеотидной последовательности данного гена. Ген fumA
также имеет другие названия: EG10356, b1612, ECK1607. Гены, кодирующие фумаразу
в других микроорганизмах, могут быть получены сходным образом.
Термины "ген fumA инактивирован" означает, что целевой ген модифицирован таким
образом, что такой модифицированный ген кодирует мутантный белок со сниженной
активностью или что такой модифицированный ген кодирует полностью неактивный
белок. Также возможно, что естественная экспрессия модифицированного участка
ДНК невозможна из-за делеции целевого гена или его части, сдвига рамки считывания
данного гена или введения missense / nonsense мутации или модификации прилегающей
к гену областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию
гена, такие как промотор(ы), энхансер(ы), аттенуатор(ы), сайт(ы) связывания рибосомы
Стр.: 5
RU 2 515 095 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
и т.д.
Инактивация указанного гена может быть произведена традиционными методами,
такими как мутагенез с использованием УФ-излучения или обработка
нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-направленный
мутагенез, инактивации гена с помощью гомологичной рекомбинации или/и
инсерционно-делеционного мутагенеза (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:
12: 5978-83); (Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 664045), также называемого "Red-зависимая интеграция".
Методами получения плазмидной ДНК, разрезания и лигирования ДНК,
трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобные им могут
являться обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти
методы описаны, например, в книге Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular
Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Бактерия-продуцент L-треонина.
Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем инактивации
гена fumA в бактерии, наследственно обладающей способностью к продукции Lтреонина. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть
получена путем придания способности к продукции L-треонина бактерии, в которой
ген fumA уже инактивирован.
Примеры родительского штамма, используемого для получения бактерии-продуцента
L-треонина согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничены штаммами
-продуцентами треонина, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм E.coli
TDH-6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патенты США 5175107 и 5705371), штамм E.coli NRRL21593 (патент США 5939307), штамм E.coli FERM ВР-3756 (патент США 5474918),
штаммы E.coli FERM ВР-3519 и FERM ВР-3520 (патент США 5376538), штамм E.coli
MG442 (Гусятинер и др., Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы E.coli VL643 и VL2055
(Европейская патентная заявка ЕР1149911 А) и подобные им.
Штамм ВКПМ В-3996 является дефицитным по гену thrC, способен ассимилировать
глюкозу и содержит ген ilvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит
мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям
треонина и гомосерина. Штамм ВКПМ В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая
была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона
thrA442BC, включающего мутантный ген thrA. Этот мутантный ген thrA кодирует
аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, у которой существенно снижена
чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм ВКПМ
В-3996 депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков
(Россия, 113105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867.
Указанный штамм также депонирован во Всероссийской коллекции промышленных
микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с
инвентарным номером ВКПМ В-3996.
Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее
модифицирована для того, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких
следующих генов:
- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I,
устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;
- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;
- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;
- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок;
Стр.: 6
RU 2 515 095 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
- гена asd, кодирующего аспартат-Р-семиальдегиддегидрогеназу; и
- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу).
Последовательность гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу
I из E.coli, известна (номера нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности с
инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrA
расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами thrL и thrB.
Последовательность гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу из E.coli, известна (номера
нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности с инвентарным номером NC 000913.2
в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrB расположен на хромосоме штамма E.coli
K-12 между генами thrA и thrC. Последовательность гена thrC, кодирующего
треонинсинтазу из E.coli, известна (номера нуклеотидов с 3734 по 5020 в
последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi:
49175990). Ген thrC расположен на хромосоме штамма E.coli K-12 между геном thrB и
открытой рамкой считывания уааХ. Все три указанных гена функционируют как один
треониновый оперон.
Мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I,
устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи, так же, как и гены
thrB и thrC, может быть получен в виде единого оперона из хорошо известной плазмиды
pVIC40, которая представлена в штамме-продуценте E.coli ВКПМ В-3996. Плазмида
pVIC40 подробно описана в патенте США 5705371.
Ген rhtA расположен на 18-й минуте хромосомы E.coli рядом с опероном glnHPQ,
кодирующим компоненты транспортной системы глутамина, таким образом, ген rhtA
идентичен открытой рамке считывания ORF1 (ген ybiF, номера нуклеотидов с 764 по
1651 в последовательности с инвентарным номером ААА2218541 в GenBank, gi:440181),
расположенной между генами рехВ и оmрХ. Участок, экспрессирующий белок,
кодируемый ORFT, был назван геном rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine устойчивость к гомосерину и треонину). Кроме того, было установлено, что мутация
rhtA23 является заменой G на А в положении - 1 относительно старт кодона ATG (ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation
with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology,
San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No.457; Европейская патентная заявка
1013765).
Нуклеотидная последовательность гена asd из E.coli уже известна (номера нуклеотидов
с 3572511 по 3571408 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе
данных GenBank, gi: 16131307), и этот ген может быть получен с помощью ПЦР
(полимеразная цепная реакция; ссылка на White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с
использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной
последовательности указанного гена. Гены asd из других микроорганизмов могут быть
получены сходным способом.
Также нуклеотидная последовательность гена aspC из E.coli уже известна (номера
нуклеотидов с 983742 по 984932 в последовательности с инвентарным номером
NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi: 16128895), и этот ген может быть получен с
помощью ПЦР. Гены aspC из других микроорганизмов могут быть получены сходным
способом.
2. Способ согласно настоящему изобретению.
Способом согласно настоящему изобретению является способ микробиологического
синтеза L-треонина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему
изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-треонина в
Стр.: 7
RU 2 515 095 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
питательной среде.
Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-треонина
из культуральной или подобной ей жидкости могут быть осуществлены способом,
подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота
продуцируется с использованием бактерии.
Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической,
так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода,
азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество
питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода
относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные
органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого
микроорганизма могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве
источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие
как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные
источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат
микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат
калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид
кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин
и дрожжевой экстракт. При необходимости в среду также могут быть добавлены
дополнительные компоненты. Например, если микроорганизму для роста требуется
L-аминокислота (ауксотрофность по L-аминокислоте), в питательную среду может
быть добавлено необходимое количество указанной L-аминокислоты.
Выращивание осуществляют предпочтительно в аэробных условиях, таких как
перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при
температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН
среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды
регулируют аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями или
буферными растворами. Выращивание осуществляют в течение 1-5 дней.
Примеры.
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие
не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.
Пример 1. Конструирование штамма с инактивированным геном fumA.
Штамм с делетированным геном fumA получают с помощью метода, исходно
разработанного Datsenko K.А. и Warmer B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12),
6640-6645), известного как "Red-зависимая интеграция". В соответствии с указанной
методикой синтезируют праймеры:
AACACCCGCCCAGAGCATAACCAAACCAGGCAGTAAGTGAGAGAACAATGCCGA
ATAA
ATACCTGTGACGG
и
AAAAAAACCGCCCCGAAGGGCGGCTCTGTTTATTTCACACAGCGGGTGCATGTA
GGCTGGAGCTGCTTCGCGCCCCGCCCTGCCACTCAT
, гомологичные как областям хромосомы, прилегающим к гену fumA, так и гену,
придающему устойчивость к антибиотику на плазмиде, используемой в качестве
матрицы. В качестве такой матрицы для ПЦР используют плазмиду pACYC184 (NBL
Gene Sciences Ltd., UK) (инвентарный номер X06403 в базе данных GenBank/EMBL).
Используют следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в
течение 3 мин; два первых цикла: 1 мин при 95°С, 30 с при 50°С, 40 с при 72°С; и
Стр.: 8
RU 2 515 095 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
последующие 25 циклов: 30 с при 95°С, 30 с при 54°С, 40 с при 72°С; и заключительная
полимеризация: 5 мин при 72°С. Полученный продукт ПЦР - фрагмент длиной 967 п.о.
очищают в агарозном геле и используют для электропорации в штамм E.coli MG1655
(АТСС 700926), содержащий плазмиду pKD46 с термочувствительным репликоном.
Плазмида pKD46 (Datsenko K.А. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:
6640-45) содержит фрагмент ДНК фага (инвентарный номер последовательности J02459
в базе данных GenBank) длиной 2,154 нуклеотида (31088-33241), а также содержит гены
Red гомологичной системы рекомбинации (β, γ, ехо гены) под контролем промотора
РаrаВ;, индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции
продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655.
Электрокомпетентные клетки получают следующим образом: ночную культуру
штамма E.coli MG1655 выращивают при 30°С в LB среде с добавкой ампициллина (100
мг/л), разводят в 100 раз при помощи 5 мл среды SOB (Sambrook et al, "Molecular Cloning
A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)),
содержащей ампициллин (100 мг/л) и L-арабинозу (1 мМ). Полученную культуру растят
с перемешиванием при 30°С до достижения OD600 0.6, после чего делают клетки
электрокомпетентными путем концентрации в 100 раз и трехкратного отмывания
ледяной деионизированной Н2О. Электропорацию проводят с использованием 70 мкл
клеток и 100 нг продукта ПЦР. После электропорации клетки инкубируют с 1 мл среды
SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1989)) при 37°C в течение 2.5 часов, после чего высевают на
чашки с L-агаром и выращивают при 37°С для отбора хлорамфениколустойчивых
рекомбинантов. Затем для удаления плазмиды pKD46 проводят 2 пассажа на L-aгape с
хлорамфениколом (30 мкг/мл) при 42°С и полученные колонии проверяют на
чувствительность к ампициллину.
Полученные мутанты с делетированным геном fumA и содержащие ген устойчивости
к хлорамфениколу проверяют с помощью ПЦР. Локус-специфичные праймеры:
AAAAGTGTGTAGGATATTGTTAC
и
ACTTTTAGCTCACTTATTATTTAC
используют для подтверждения наличия делеции с помощью ПЦР. Используют
следующий температурный профиль для ПЦР проверки: денатурация при 94°С в течение
3 мин; профиль для 30 циклов: 30 с при 94°С, 30 с при 54°С, 1 мин при 72°С;
заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продукта ПЦР, полученного в результате
реакции с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма fumA+MG1655, составляет 1827 п.о. Длина продукта ПЦР, полученного в результате
реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма, составляет
1071 п.о. В результате получен штамм MG1655 fumA::cat, несущий делецию гена fumA.
Пример 2. Клонирование гена aspA из E.coli.
Полная нуклеотидная последовательность штамма E.coli K-12 определена (Science,
277, 1453-1474, 1997). На основе приведенной нуклеотидной последовательности
синтезируют праймеры:
AAAGGTCTCAAGCTAAAAAGAAGGTTCACATGTCAAAC и
AAAGGATCCGTTACTGCTCACAAGAAAAAAGG.
Хромосомную ДНК штамма E.coli MG1655 получают стандартным методом. ПЦР
осуществляют в следующих условиях: 40 секунд при 95°С, 40 секунд при 55°С, 40 секунд
при 72°С, 30 циклов с использованием Taq-полимеразы (Fermentas). Полученный
Стр.: 9
RU 2 515 095 C1
5
10
15
20
фрагмент ДНК размером 1542 п.о., содержащий ген aspA, обрабатывают рестриктазами
BamHI и Есо31I и вводят в многокопийный вектор pUC19 (Fermentas), который
предварительно обрабатывают рестриктазами BamHI и HindIII. Таким образом получают
плазмиду pUC-aspA.
Пример 3. Продукция L-треонина штаммом E.coli B-3996MumA.
Для проверки эффекта делеции гена fumA на продукцию треонина фрагмент ДНК
из хромосомы описанного выше штамма E.coli MG1655 fumA::cat переносят в штаммпродуцент треонина E.coli ВКПМ В-3996 (ближайший аналог) при помощи трансдукции
фага PI (Miller J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press,
Plainview, NY).
Оба штамма - родительский ВКПМ В-3996 и полученный B-3996AfumA
трансформируют плазмидой pUC-aspA. Стимулирующее влияние экспрессии гена aspA
на продукцию L-треонина показано ранее (международная заявка WO03008607).
Трансформанты выращивают в течение 18-24 часов при 32°С на чашках с L-агаром,
содержащих ампициллин (100 мг/л). Для получения посевной культуры каждый из
штаммов растят на роторной качалке (250 об/мин) при 32°С в течение 18 часов в
пробирках 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 2% сахарозы. Затем в
ферментационную среду вносят 0.21 мл (10%) посевного материала. Ферментацию
проводят в 2 мл минимальной ферментационной среды в пробирках 20×200 мм. Клетки
культивируют в течение 24 часа при 32°С на роторной качалке - 250 об/мин.
Состав ферментационной среды (мас.%):
Глюкоза
2.0
(NH4)2SO4
25
2.2
NaCl
0.08
KН2РO
4 0.2
MgSO4·7H2O
0.08
FeSO4·7H2O
0.002
MnSO4·5H2O
0.002
Тиамин HCl
0.00002
Дрожжевой экстракт
30
СаСО3
3.0
Вода
35
40
0.1
остальное
Глюкозу и сульфат марганца стерилизуют отдельно. СаСО3 стерилизуют сухим
жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0. Антибиотик ампициллин (100
мг/л) добавляют в среду после стерилизации.
После выращивания количество накопленного в среде L-треонина определяют с
помощью бумажной хроматографии, при этом используют следующий состав подвижной
фазы: бутанол:уксусная кислота:вода=4:1:1 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне
используют для визуализации. Пятна, содержащие L-треонина, вырезают, L-треонин
элюируют 0.5% водным раствором CdCl2, после чего количество L-треонина оценивают
спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм.
Результаты пяти независимых пробирочных ферментации приведены в Таблице 1.
Таблица 1
45
Штамм
Продукция треонина, г/л
ВКПМ В-3996/pUC-aspA
6,5±0.5
B-3996ΔfumA/pUC-aspA
7,2±0.3
Как видно из Таблицы 1, штамм B-3996ΔfumA/pUC-aspA, содержащий делецию гена
fumA накапливает большее количество L-треонина по сравнению с контрольным
Стр.: 10
RU 2 515 095 C1
штаммом ВКПМ В-3996/pUC-aspA.
5
Формула изобретения
1. Бактерия-продуцент L-треонина, принадлежащая к роду Escherichia, отличающаяся
тем, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что в ней инактивирован
ген фумаразы fumA.
2. Способ микробиологического синтеза L-треонина путем культивирования бактерии
по п.1.
10
15
20
25
30
35
40
45
Стр.: 11