Использование технологии полногеномного секвенирования

Желанкин Андрей Викторович
ФГБУ РКНПК им. Мясникова
НИИ Атеросклероза Сколково
НИИ Общей Патологии и Патофизиологии РАМН
Использование технологии полногеномного
секвенирования Roche/454 для выявления
генетических маркеров атеросклероза
Генетические маркеры атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний
Ядерный геном
Митохондриальный геном
Гены, полиморфизмы в которых ассоциированы с
атеросклерозом, инфарктом миокарда и ИБС:
A5178C – предрасположенность к острым инфарктам
миокарда
Хромосома 1: APOA2, CRP, FMN2, GALNT2, GJA5, SELE, TGFB2,
USF1, SORT1
A4401G, A4435G, A4295G – гипертония, наследуемая
по материнской линии
Хромосома 2: ADAM17, ADRA2B, APOB, CXCR4, CAPN10
4322dupC, A4300G, С3303T, A3260G, T9997C –
различные виды кардиомиопатии
Хромосома 3: ADIPO, AGTR1, CAV3, GPX1, PPARG, RARB, TGFBR2
Хромосома 4: ADD1, KDRC, PDGFRA, PDGF
Хромосома 6: EDN1, ENPP1, LPA, SOD2, SRF
Хромосома 7: CAV1, EGFR, ELN, GHRHR, KRIT1, LEP, NOS3, PDGFA,
PON1, PON3
Хромосома 8: ADAM9, ADRA1A, CYP11B2, LPL, NRG1, GATA4, HAS2
Хромосома 11: APOA4, APOA5, APOC3, INS, MYBPC3
Хромосома 17: ACE, HNF1B, ERBB2
С3256T, G12315A, G13513A – атеросклероз сонных
артерий
Митохондриальный геном человека
Гены митохондриальной ДНК человека, кодирующие белки
дыхательной цепи
Ген
Митохондриальная ДНК человека – кольцевая
молекула длиной 16 569 п.н.
Количество кодируемых генов: 37, из них:
13 белков дыхательной цепи митохондрий;
22 гена тРНК
2 гена рРНК
Регион гена
Кодируемый продукт
MT-ND1
3307..4262
Субъединица 1 NADH-дегидрогеназы
MT-ND2
4470..5511
Субъединица 2 NADH-дегидрогеназы
MT-CO1
5904..7445
Субъединица 1 цитохром-С оксидазы
MT-CO2
7586..8269
Субъединица 2 цитохром-С оксидазы
MT-ATP8
8366..8572
Субъединица 8 АТФ-синтазы
MT-ATP6
8527..9207
Субъединица 6 АТФ-синтазы
MT-CO3
9207..9990
Субъединица 3 цитохром-С оксидазы
MT-ND3
10059..10404
Субъединица 3 NADH-дегидрогеназы
MT-ND4L
10470..10766
Субъединица 4L NADH-дегидрогеназы
MT-ND4
10760..12137
Субъединица 4 NADH-дегидрогеназы
MT-ND5
12337..14148
Субъединица 5 NADH-дегидрогеназы
MT-ND6
14149..14673
Субъединица 6 NADH-дегидрогеназы
MT-CYTB
14747..15887
Цитохром B
Особенности митохондриального генома человека
•
•
•
Наследование по материнской линии
Компактное расположение генов и отсутствие интронов в кодирующем регионе
Отличие генетического кода от кода ядерного генома
В митохондриальном геноме используются 2 из 3 универсальных стоп-кодонов (UAA и UAG), а также 2 дополнительных кодона
(AGA, AGG) выступают как стоп-кодоны. Кроме того, UGA кодирует триптофан в митохондриальной ДНК, в то время как является
стоп-кодоном в ядерной. AUA в митохондрии кодирует метионин вместо изолейцина.
• Высокая степень мутабельности по сравнению с ядерным геномом вследствие прохождения в митохондриях
окислительного фосфорилирования
• Отсутствие гистонов и пониженная эффективность систем репарации
• Наличие явления гетероплазмии
Гетероплазмия митохондриального генома – это явление одновременного сосуществования мутантных и нормальных копий
митохондриальной ДНК в пределах клетки, ткани или организма в целом.
Уровень гетероплазмии по данной мутации – это отношение количества мутантных молекул мтДНК к количеству нормальных.
Уровень гетероплазмии может быть различным в разных тканях или клетках организма.
•
Митохондриальная ДНК составляет не более 0,2 масс.% от общей массы выделяемой ДНК, но по
копийности в сотни раз превосходит ядерный геном
Принцип исследования
Цель исследования: поиск генетических маркеров атеросклероза в митохондриальном
геноме человека.
Возможности исследования полиморфизмов митохондриального генома с использованием системы GS Junior
Количество прочитываемых нуклеотидов за один запуск прибора
60-100 млн.
Минимальное количество прочтений за 1 запуск для Shotgun-библиотеки
100 000
Средняя длина прочтения
500 нуклеотидов
Количество анализируемых образцов за 1 запуск с использованием Shotgun-библиотеки
12
Минимальное теоретическое покрытие для одного митохондриального генома
250
Определение низких уровней гетероплазмии митохондриальных мутаций на GS Junior с достоверностью 99%
Выявляемый уровень гетероплазмии
Необходимое
количество прочтений
одного нуклеотида
1%
2%
3%
5%
25%
300 и более
150 и более
100 и более
60-100
30-50
Дизайн исследования
Обследование пациента
Взятие крови
Выделение ДНК
Амплификация (long-range PCR) полной митохондриальной ДНК с
использованием технологии Multiple Displacement Amplification
(Qiagen REPLI-g Mitochondrial Kit)
Оценка качества и измерение
концентрации продукта ПЦР
Создание Shotgun-библиотеки
Лигирование адаптеров
Связывание фрагментов с частицами
Эмульсионная ПЦР
454-Секвенирование с
использованием системы GS Junior
Эффективность секвенирования с помощью системы GS Junior
Выявление гетероплазмичных мутаций митохондриального генома
GS Reference Mapper Software
•
Сборка контигов из совокупности прочитанных
последовательностей (средняя длина
собираемых контигов 16 568 п.н.)
•
Картирование на референсную
последовательность (NC_012920.1)
•
Выявление полиморфизмов с указанием
процентных соотношений аллелей
Предварительные результаты анализа
Размер выборки: 30 чел (здоровые лица – 17 чел,
пациенты с увеличенной ТИМС и выраженными
атеросклеротическими бляшками – 13 чел)
Количество найденных мутаций
Процент от общего, %
Общее
1848
100
Гомоплазмичные
254
13,7
Гетероплазмичные (общее количество)
1594
86,3
Гетероплазмичные (менее 5%)
1046
56,6
Гетероплазмичные (5-10%)
316
17,1
Гетероплазмичные (10-50%)
197
10,7
Гетероплазмичные (50-91%)
35
1,9
Инсерции
443
24,0
Делеции
76
4,1
Замены
1332
72,1
Предварительные результаты анализа
Ген
Частота
гетероплазмичных
мутаций, %
Средний уровень гетероплазмии
по всем мутациям, %
Здоровые
лица
Пациенты с
увеличенной ТИМС
Ген
Частота
гетероплазмичных
мутаций, %
Средний уровень гетероплазмии
по всем мутациям, %
Здоровые
лица
Пациенты с
увеличенной ТИМС
MT-TF
0,048
0,00
3,00
MT-ATP6
0,201
18,70
11,30
MT-RNR1
0,056
1,47
3,27
MT-CO3
0,102
7,40
9,15
MT-TV
0,048
0,00
14,00
MT-ND3
0,125
11,50
18,88
MT-RNR2
0,062
3,96
4,72
MT-TR
0,048
0,00
8,00
MT-ND1
0,059
3,77
5,18
MT-ND4L
0,079
0,57
2,71
MT-TQ
0,048
0,00
1,00
MT-ND4
0,204
3,29
3,18
MT-TM
0,095
1,00
2,00
MT-TH
0,143
2,50
0,00
MT-ND2
0,134
7,89
2,34
MT-TS2
0,048
0,00
8,00
MT-TC
0,048
1,00
0,00
MT-TL2
0,469
10,63
0,50
MT-TY
0,048
5,00
0,00
MT-ND5
0,177
10,18
11,80
MT-CO1
0,032
1,87
7,87
MT-ND6
0,165
3,87
4,13
MT-TS1
0,095
0,00
3,50
MT-TE
0,190
0,75
1,00
MT-CO2
0,073
6,27
15,80
MT-CYB
0,105
5,73
3,19
MT-TK
0,143
16,00
8,00
MT-TT
0,143
11,00
0,00
MT-ATP8
0,258
8,63
10,38
MT-TP
0,048
0,00
2,00
Спасибо за внимание!