Развитие и применение метода ХПЯ для изучения спин

На правах рукописи
Кирютин Алексей Сергеевич
РАЗВИТИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ХПЯ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СПИНСЕЛЕКТИВНЫХ РЕАКЦИЙ РАДИКАЛОВ БИОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫХ
МОЛЕКУЛ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ
01.04.17 – химическая физика, в том числе физика горения и взрыва
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Новосибирск – 2009
Работа выполнена в Институте «Международный томографический центр» Сибирского
отделения Российской академии наук
Научный руководитель:
доктор физико-математических наук
Юрковская Александра Вадимовна
(Институт «Международный
томографический центр» СО РАН)
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор
Лешина Татьяна Викторовна
(Институт химической кинетики и горения
СО РАН)
доктор химических наук, профессор
Талзи Евгений Павлович
(Институт катализа им. Г.К. Борескова
СО РАН)
Ведущая организация
Институт химической физики
им. Н.Н. Семенова РАН
Защита состоится «17» июня 2009 г. в 16-30 на заседании диссертационного совета
Д 003.014.001 при Институте химической кинетики и горения СО РАН по адресу: 630090,
Новосибирск-90, ул. Институтская 3, ИХКГ СО РАН.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической кинетики и
горения СО РАН.
Автореферат разослан
«11» мая 2009 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор химических наук
Онищук А.А.
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Одной из фундаментальных задач химической физики является
установление
механизма
протекания
элементарного
акта
химических
реакций
для
последующего целенаправленного воздействия на химические процессы. С этой целью
изучаются свойства активных короткоживущих промежуточных частиц биологически важных
молекул – аминокислот и нуклеотидов. Метод химической поляризации ядер (ХПЯ) позволяет
исследовать процессы формирования и распада неравновесных ядерно-спиновых состояний
продуктов спин-коррелированных радикальных реакций по спектрам ЯМР. Актуальным
является
развитие
и
применение
высокочувствительных
импульсных
методов
магниторезонансной спектроскопии, основанных на явлении ХПЯ, что начали делать
относительно недавно и всего в нескольких лабораториях мира. Импульсный метод ХПЯ
позволяет разделить вклад от геминальных процессов и провести количественный
кинетический
анализ
радикальных
реакций
на
микросекундной
временной
шкале.
Установленная в работе линейная зависимость между сигналами в геминальных спектрах ХПЯ
и константами СТВ открывает путь для определения структуры очень короткоживущих
радикалов, регистрация которых традиционными методами ЭПР затруднена вследствие их
низкой стационарной концентрации. Получение кинетической информации о протекании
реакции восстановления радикалов нуклеотидов аминокислотами в широком диапазоне
значений рН как модельной реакции для «химического» пути быстрой и эффективной
репарации нуклеиновых кислот, защищающей их от повреждений, является актуальным.
Обычно для получения данных о подвижности частиц используют зависимость ядерной
релаксации от напряженности магнитного поля. При интерпретации не рассматривается спинспиновое взаимодействие, потому что данные получают при низком спектральном разрешении,
что является существенным недостатком. Развитие метода быстрого переключения поля с
высоким спектральным разрешением при регистрации позволяет выявить влияние скалярного
спин-спинового взаимодействия на релаксацию и ХПЯ в слабых магнитных полях.
Целями диссертационной работы являются:
1. Установление линейной зависимости между интенсивностями сигналов в геминальных
спектрах ХПЯ и константами сверхтонкого взаимодействия в радикалах с большим числом
магнитных ядер.
2. Применение метода ХПЯ для определения относительных констант СТВ с ядрами 1Н и 13С
в короткоживущих катион-радикалах триптофана и с ядрами 15N аденозин-5'-монофосфата.
3. Исследование реакции переноса электрона с аминокислот (триптофан, тирозин, метионин и
гистидин) на радикалы гаунозин-5'-монофосфата в широком диапазоне значений рН и
определение констант скоростей этой реакции.
3
4. Изучение влияния скалярных спин-спиновых взаимодействий на зависимость ядерной Т1релаксации от напряженности магнитного поля и когерентный перенос ХПЯ.
Методы исследования. Все экспериментальные данные получены методом ядерного
магнитного
резонанса
при
времяразрешенной
регистрации
сигналов
продуктов
фотохимических реакций, инициированных импульсным лазерным излучением.
Научная новизна работы. Впервые создана установка ХПЯ с временным разрешением
на базе ЯМР спектрометра с магнитным полем 14.1 Тл для регистрации сигналов ЯМР 1Н, 13С
и
15
N. При использовании новой установки была установлена линейная зависимость сигналов
геминальной ХПЯ от констант СТВ в многоспиновых радикальных парах и впервые
зарегистрированы геминальные спектры ХПЯ 13С и 15N. В работе впервые определены знаки и
относительные величины констант сверхтонкого взаимодействия для
катион-радикалах триптофана и
временным
разрешением
15
13
С в короткоживущих
N для катион-радикалов нуклеотида АМР. Методом ХПЯ с
была
изучена
реакция
восстановления
радикалов
GMP
аминокислотами в водных растворах и получены константы скорости этих реакций для
четырех различных радикалов GMP при рН от 1.3 до 13.3. Впервые продемонстрировано
влияние скалярного спин-спинового взаимодействия на зависимость ядерной релаксации от
напряженности внешнего магнитного поля и выявлен когерентный перенос ядерной
поляризации между скалярно-связанными ядрами на примере аденозин-5'-монофосфата.
Практическая ценность работы. Полученные результаты будут использованы для
дальнейших фундаментальных исследований в области спиновой химии в институтах МТЦ СО
РАН,
ИХКГ
СО
РАН,
Московском
государственном
университете,
Новосибирском
государственном университете, Институте химической физики им. Н.Н. Семенова РАН,
Казанском физико-техническом институте им. Е.К. Завойского РАН и в Институте химической
биологии и фундаментальной медицины СО РАН.
Автор защищает:
1.
Пропорциональную зависимость интенсивностей геминальной ХПЯ от констант СТВ в
радикалах с большим числом магнитных ядер, в которых ширина спектра ЭПР намного
больше, чем константа СТВ любого из ядер.
2.
Кинетику ХПЯ в трехкомпонентной системе, содержащей 2,2'-дипиридил, гуанозин-5'монофосфат и аминокислоту (триптофан или тирозин) в водных растворах при значениях
рН от 1.3 до 13.3.
3.
Влияние спин-спиновых взаимодействий на полевую зависимость ХПЯ и дисперсию Т1релаксации.
4
Личный вклад соискателя. Автор участвовал в разработке плана исследований, в
постановке задач диссертационной работы, обсуждении результатов, формулировке выводов и
подготовке публикаций по теме диссертационной работы. Основная часть экспериментальных
исследований выполнена лично автором. Часть экспериментов проведена совместно с к.х.н.
с.н.с. Морозовой О.Б. при непосредственном участии автора.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены и обсуждались
на российских и международных конференциях и симпозиумах: XLI Международная научная
студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, Россия,
апрель 2003 г.), 69-70th Annual Meeting of the Deutsche Physikalische Gesellschaft (DPG) (Берлин,
Дрезден, Германия, 04-09 марта 2005 г., 27-31 марта 2006 г.), International Symposium on
Modern Problems of Chemical Physics (Казань, Россия, 31 октября – 04 ноября 2006 г.), Modern
Development of Magnetic Resonance (Казань, Россия, 24-29 сентября 2007 г.), 10th International
Symposium on Spin and Magnetic Field Effect in Chemistry and Related Phenomena (Венеция,
Италия, 18-21 июня 2007 г.), 11th Chianti Workshop on Magnetic Resonance “Methods for
biomolecular magnetic resonance” (Валамброса (Флоренция), Италия, 3-8 июня 2007 г.), The 5th
Conference on Field Cycling NMR Relaxometry (Турин, Италия, 30 мая – 3 июня 2007 г.), 6th
Asia Pacific EPR/ESR Symposium (Каирнс, Австралия, 13-18 июля 2008 г.), Central European
Conference on Photochemistry (Бад Хофгастайн, Австрия, 10–14 февраля 2008 г.), 49th
Experimental Nuclear Magnetic Resonance Conference (Асиломар, Калифорния, США, 9-14
Марта 2008 г.), Современные проблемы химической физики (Ереван, Армения, 21-24 октября
2008 г.)
Публикации. Материалы диссертации изложены в 5 статьях, а также в 15 тезисах
международных и российских конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов,
списка цитируемой литературы, включающего 169 наименований, и приложения. Работа
изложена на 160 страницах, содержит 84 рисунка и 19 таблиц.
5
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении отражена актуальность темы диссертации, сформулированы основные
цели работы и дано краткое описание структуры диссертации.
Первая глава посвящена обзору литературы. В первом разделе обсуждается роль
радикалов триптофана в процессах, протекающих в биологических системах. Особое внимание
уделено проблеме детектирования радикалов триптофана. Второй раздел посвящен недавно
обнаруженной неэнзиматической репарации ДНК и нуклеотидов по так называемому
«химическому пути» восстановительной репарации ДНК, который эффективно конкурирует с
относительно
медленными
ферментативными
процессами
для
защиты
генетической
информации. В третьем и четвертом разделе описываются основы метода химической
поляризации ядер (ХПЯ) с временным разрешением. Подробно описано формирование
неравновесной химической поляризации ядер по радикально-парному механизму. Приведены
примеры кинетических зависимостей ХПЯ при различных параметрах. Показано, как
проявляются эффекты ХПЯ в спектрах ЯМР и от чего зависит знак поляризации. В пятом
разделе представлен обзор фотохимических реакций с участием дипиридила, триптофана,
тирозина и гуанозин-5'-монофосфата. Рассмотрены известные на сегодняшний день
фотохимические свойства перечисленных реагентов. Представлены результаты проведенных
ранее кинетических экспериментов ХПЯ с участием триптофана, тирозина и гуанозин-5'монофосфата. Рассмотрено влияние реакции внутримолекулярного переноса электрона на
кинетику ХПЯ в дипептиде триптофан-тирозин.
Во второй главе описаны принципы работы и характеристики установок, на которых
были проведены эксперименты ХПЯ и эксперименты по изучению Т1-релаксации. Особое
внимание уделено созданной автором работы установки ХПЯ с временным разрешением 1 мкс
на базе ЯМР-спектрометра (B0 = 14.1 Тл, νH = 600 МГц). Данная установка позволяет
регистрировать спектры ХПЯ на ядрах 1Н,
13
С,
15
N с высоким спектральным и временным
разрешением. Описана установка с быстрым переключением магнитного поля, позволяющая
изучать эффекты ХПЯ и ядерную Т1-релаксацию в зависимости от магнитного поля в широком
диапазоне от 0.1 мТл до 7 Тл.
В третьей главе рассмотрена теоретическая модель, объясняющая линейную
зависимость геминальной ХПЯ от констант СТВ. Показано, что для многоспиновых
радикальных пар интенсивность ХПЯ (Pi) пропорциональна константам СТВ (ai). Это
соотношение выполняется в том случае, когда ширина спектра ЭПР или эффективная
константа СТВ всей радикальной пары намного больше, чем константа СТВ на любом
отдельно взятом ядре. Использование квантово-механического расчета ХПЯ по модели
6
Адриана в сильном магнитном поле показало, что увеличение числа ядер в радикальной паре
приводит к пропорциональности интенсивности ХПЯ от констант СТВ (рис. 1).
0.2
ХПЯ (Адриан), отн. ед.
ХПЯ (Адриан), отн. ед.
а)
0.2
0.1
0.0
N=3
ΔgB=5 Гс
2
R =0.53
-0.1
-0.2
-10 -8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
б)
0.1
0.0
N=4
ΔgB=5 Гс
2
R =0.91
-0.1
-0.2
-10 -8
10
-6
0.05
0.00
N=6
ΔgB=5 Гс
2
R =0.97
-0.05
-0.10
-10 -8
-2
0
2
4
6
8
10
г)
в)
ХПЯ (Адриан), отн. ед.
ХПЯ (Адриан), отн. ед.
0.10
-4
Константы СТВ, Гс
Константы СТВ, Гс
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
0.1
0.0
N=10
ΔgB=5 Гс
2
R =0.99
-0.1
-10 -8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
Константы СТВ, Гс
Константы СТВ, Гс
Рисунок 1. Зависимость расчетной интенсивности ХПЯ от констант СТВ при ΔgB = 5 Гс, Amax = 10 Гс а) N = 3, б)
N = 4, в) N = 6, г) N = 10.
Ограничения на использование пропорциональности Pi = Cai с целью определения
неизвестных констант СТВ из геминальных спектров ХПЯ получены на основании
теоретического моделирования.
•
Магнитное поле должно быть В0 ≥ 4.7 Тла
•
Разность g-факторов радикалов Δg ≥ 0.0002б
•
Максимальное значение константы СТВ Amax ≤ 15 Гс
•
Общее число магнитных ядер в радикальной паре N ≥ 12
При соблюдении всех условий, точность определения констант СТВ составит менее 0.5
Гс, а коэффициент определения R2 ≥ 0.99.
Примечания:
а
Выбор такого значения магнитного поля связан с существующими установками для
измерения ХПЯ, большая часть которых построена на базе спектрометров с магнитным полем выше или равным
4.7 Тл (νН=200 МГц).
б
Наблюдения, полученные в ходе данной работы показывают, что вероятность встречи
радикальной пары со значением Δg < 0.0002 крайне низкая.
Данное соотношение пропорциональности экспериментально проверено на модельных
системах с известными константами СТВ. В качестве модельной системы была выбрана
радикальная пара тирозина с 3,3',4,4'-тетракарбоксибензофеноном. Тушение триплетной
молекулы тетракарбоксибензофенона (TCBP) тирозином (TyrOH) при pH = 8.1 приводит к
7
образованию спин-коррелированной радикальной пары {TyrO• + TCBP •− } в триплетном
состоянии. Последующая рекомбинация синглетной пары дает поляризованные диамагнитные
продукты TyrOH и TCBP. На рисунке 2 (а) представлены эффекты ХПЯ для TyrOH и TCBP,
зарегистрированные после рекомбинации геминальной радикальной пары. Значительные
эффекты ХПЯ наблюдались для β-CH2 протонов, ароматических протонов H2, H3, H5, H6 в
тирозине и для протонов H2, H2', H5, H5', H6, H6' в TCBP. Из спектра ХПЯ были получены
интенсивности сигналов всех протонов (табл. 1).
На рисунке 2 (б) показана зависимость интенсивности ХПЯ от констант СТВ для данных
радикалов. Поскольку знак ХПЯ меняется при изменении знака Δg, то данные ХПЯ для TCBP
были помножены на -1. Это дает возможность одновременно проверить линейность для TyrOH
и
TCBP.
Зависимость
практически
идеально
описывается
Pi = Cai .
соотношением
Рассчитанная по методу наименьших квадратов прямая линия, показанная на рисунке 2 (б),
соответствует экспериментальным данным с коэффициентом корреляции 0.955.
протоны Tyr
протоны TCBP
β1-CH2 β2-CH2
H3,5
H5
H2 H6
(а)
8.0
7.8
7.6
7.4
7.2
7.0
6.8
6.6
3.2
3.0
2.8
Интенсивность ХПЯ, отн. ед.
H2,6
60
40
20
0
-20
-40
-0.8
2.6
Химический сдвиг, м.д.
(б)
-60
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Константы СТВ (ЭПР), мТл
Рисунок 2.
(а) Спектр 1H ХПЯ для TyrOH (5 мM) и TCBP (0.1 мM) при pH = 8.1 (200 МГц). Число накоплений: 128, τ=0,
длительность РЧ-импульса 3 мкс, что соответствует π/4-импульсу.
(б) Зависимость интенсивности 1H ХПЯ для протонов TyrOH и TCBP от констант СТВ. Результаты вычисления
для протонов TyrOH и TCPB показаны черными и белыми символами соответственно. Прямая линия – наилучший
расчет по функциям Pi = Cai и Pj = – Cbj
Таблица 1. Интенсивности ХПЯ протонов TCBP и TrpH, константы СТВ радикалов соответствующих
радикалов.
Ядро (молекула) Интегралы ХПЯ, отн. ед.а Константы СТВ, мТл (ХПЯ)б Константы СТВ, мТл (ЭПР)
Н2 (TCBP)
28.2±0.5
-0.183±0.003
-0.253
H6 (TCBP)
38.7±1
-0.251±0.006
-0.265
H5 (TCBP)
-12.5±1
0.081±0.006
0.0897
H2,6 (TyrOH)
20.7±1
0.134±0.006
0.15
H3,5 (TyrOH)
-100±1
-0.649±0.006
-0.615
β1-СН2 (TyrOH)
71.3±2
0.77
0.770±0.026в
β2-СН2 (TyrOH)
47.3±2
Примечание. a Значения нормированы на -100 для Н3,5. б Значения констант СТВ получены делением интегралов
ХПЯ на -154 (Н2(ТСВР); Н6(ТСВР); Н5(ТСВР)), 154 (Н2,6(TyrOH); Н3,5(TyrOH)) и на 77 (β1-СН2; β1-СН2) для
перевода в единицы мТл и учета числа эквивалентных ядер. в Для двух бета-протонов использовалось среднее
арифметическое значение.
8
Аналогичные эксперименты ХПЯ были проведены с тирозином, обогащенным
изотопами
15
N и
13
С. Впервые был получен геминальный
13
С ХПЯ-спектр полностью
обогащенного тирозина. Оказалось, что как и в случае протонов, интенсивности сигналов ХПЯ
для каждого углерода пропорциональны соответствующим константам СТВ в радикале
тирозина TyrO•.
Полученные экспериментальные результаты подтверждают теоретические предсказания,
что открывает возможность определения констант СТВ для короткоживущих радикалов с
помощью интегрирования сигналов в геминальном спектре ХПЯ. Таким образом, ХПЯ с
временным разрешением – высокочувствительный инструмент для количественного анализа
распределения спиновой плотности в короткоживущих радикалах, для которых зачастую
невозможно получить данные методом ЭПР.
Катион-радикал триптофана TrpH•+ образуется в реакции переноса электрона с
аминокислоты на триплетный краситель TD аналогично реакции с тирозином. В качестве
красителя использовали фламинмононуклеотид (FMN) и 2,2'-дипиридил (Dp). Формирование
ядерной поляризации происходит в ходе синглет-триплетной эволюции с последующей
рекомбинацией синглетной радикальной пары S[TrpH•+ D•–]:
TrpH + TD → T[TrpH•+…D•–] ↔ S[TrpH•+…D•–] → TrpH + D
Обнаруженная геминальная ХПЯ отражает магнитные свойства катион-радикала TrpH•+, а
не его депротонированную форму радикала Trp•, в котором отсутствует протон в положении
N1. Депротонирование TrpH•+ (pKa ≈ 4.3) при рН = 7÷9 должно проходить за более долгий
период по сравнению со временем жизни этого радикала в геминальной паре, которое в
CO
176 174
C8
C9
C2
C6
C5 C4
136 128 126 124 122 120 118
C7
112
Cα
C3
108 106
56
54 28
Cβ
26
δ, ppm
Рисунок 3. Вверху – геминальный 13С спектр ХПЯ (150.9 МГц), полностью обогащенного 13С, 15N L-триптофана
(С = 3мМ) c FMN (С = 0.3 мМ) в D2O при рН = 9.0. Во время накопления сигнала 13С включалось широкополосное
подавление сигналов протонов. Энергия лазера на выходе 100 мДж; длительность регистрирующего импульса 4
мкс; угол поворота 90°; 512 накоплений. Внизу – моделированный спектр 13С ХПЯ, полученный при
использовании параметров из таблицы 2.
9
низковязких растворах составляет около 10 нс. На рисунке 3 приведены экспериментально
полученный геминальный 13С спектр ЯМР L-триптофана в D2O, обогащенного изотопами 13С и
15
N, с широкополосным подавлением протонного резонанса [1H] и расчетный спектр ХПЯ. В
силу низкого природного содержания 13С (1.1%) сигналы ХПЯ от FMN отсутствуют.
Таблица 2. 13С константы СТВ для катион-радикала триптофана.
Углерод
Интегралы
Константы СТВ, мТл
Константы СТВ, мТл
Константы СТВ, мТл
ХПЯа
(ХПЯ)б
(DFT, в вакууме)
(DFT, в воде)
С2
19±4
-0.28±0.06
-0.280
-0.227
С3
-100±5
1.45±0.07
0.629
1.254
С4
-41±4
0.59±0.06
0.475
0.619
С5
24±4
-0.35±0.06
-0.233
-0.499
С6
-27±4
0.39±0.06
0.032
0.443
С7
11±4
-0.16±0.06
0.290
-0.182
С8
-7±4
0.10±0.06
-0.359
0.092
С9
43±5
-0.62±0.07
-0.545
-0.891
-45±4
0.65±0.06
0.008
0.025
Сα
28±4
-0.41±0.06
-0.357
-0.512
Сβ
CO
0±3
0±0.04
0.027
-0.045
Примечание. a Значения нормированы на -100 для С3. б Значения констант СТВ получены делением интегралов
ХПЯ на -69 для перевода в единицы мТл.
Используя соотношение
пропорциональности
между
константами СТВ, были определены относительные константы
интенсивностями ХПЯ
13
и
С СТВ короткоживущего
катион-радикала триптофана. При сравнении их с DFT-расчетами были получены значения
констант СТВ, приведенные в таблице 2. По-видимому, это первая экспериментальная
характеристика магнитных свойств свободного катион-радикала триптофана на момент
написания диссертационной работы (вне стабилизирующей среды белка). Отсутствие в
литературе до 2008 года данных об ЭПР-спектрах свободного катион-радикала триптофана
TrpH•+ (или его нейтральной формы Trp•) может объясняться многими факторами, приводящие
к уширению спектра и ослаблению сигнала.
Удостоверившись в высокой точности простого соотношения пропорциональности
между ХПЯ и константами СТВ, мы применили метод ХПЯ для характеризации распределения
спиновой плотности в радикале нуклеотида AMP. В этом радикале имеется только два
поляризуемых протона (H2 и H8), в то время как спиновая плотность в основном распределена
между ядрами азота. Следовательно, необходимо измерить константы СТВ для азота.
Поскольку основной изотоп азота
14
N является квадрупольным ядром, то для характеризации
распределения спиновой плотности в радикале мы использовали обогащенный изотопом
15
N
по всем положениях AMP. Насколько нам известно, это первые результаты по ХПЯ с
временным разрешением, полученные для ядер
изучалась только в стационарном варианте метода.
10
15
N. До настоящего времени
15
N ХПЯ
Реакция между AMP и фотовозбужденным 2-метилнафтохиноном (MeNQ), в водном
растворе приводит к формированию триплетной радикальной пары {AMP •+ + MeNQ•− } . В
результате обратного переноса электрона образуются поляризованные молекулы AMP и MeNQ.
«Темновой» спектр и спектр ХПЯ
15
N для AMP показаны на рисунке 4. Полученные
химические сдвиги соответствуют ранее опубликованным. Можно сделать вывод, что только
три ядра азота имеют значительную спиновую плотность, а именно: N1, N3 и N10, для которых
из спектра ХПЯ (рис. 4) было получено следующее соотношение интенсивностей поляризации:
PN1:PN3:PN10=0.25:1:2.07. В радикале АМР, помимо трех ядер азота, имеются протоны и атомы
дейтерия, поэтому число магнитных ядер достаточно велико для того, чтобы обеспечить
пропорциональность между ХПЯ и СТВ. В результате получаем следующее соотношение для
констант СТВ 15N: aN1:aN3:aN10=0.12:0.48:1.00.
N1
N7
N3
N10
N9
NH2
10
6
N
5
2
4
1
H
N
7
8
N
3
AMP
235
H
N
9
R
230
225
220
175
170
85
80
75
Химический сдвиг, ppm
Рисунок 4. 15N-ЯМР спектр (вверху) и спектр 15N-ХПЯ (внизу) для полностью 15N изотопно-обогащенного AMP
(С = 3.6 мM) с 2-метилнафтохиноном при pH = 7.9 (60.8 МГц). Число накоплений: 39000 (ЯМР), 8400 (ХПЯ); τ=0;
длительность РЧ-импульса 30 мкс, что соответствует π/2-импульсу.
В четвертой главе приведены результаты изучения реакции переноса электрона с
триптофана и тирозина на радикалы гуанозин-5'-монофосфата в широком диапазоне значений.
С целью изучения механизма химической репарации ДНК (РНК) была выбрана модельная
система, состоящая из трех компонентов: пуриновое основание (гуанозин-5’-монофосфат),
аминокислота
(N-ацетил-производная
тирозина
или
триптофана)
в
качестве
восстанавливающего агента для радикала гуанозина и краситель (2,2'-дипиридил) для
инициирования фотохимической реакции. Измерения кинетики ХПЯ проводились в ходе
11
обратимой фотореакции, сопровождаемой последовательным окислением и восстановлением
основания РНК – GMP. Целью исследования было выявить влияние рН на механизм
радикального восстановления, определить структуру образующихся интермедиатов и получить
детальную информацию об их реакционной способности в диапазоне значений рН от 1.3 до
13.3.
На рисунке 5 показан ароматический участок спектров ХПЯ, полученных в фотореакциях
DP с GMP, DP с Tyr и DP с обоими реагентами. Вертикальная шкала для спектров подобрана
таким образом, чтобы верхняя левая пара спектров имела одинаковую интенсивность сигнала
Н8 GMP, а правая – сигнала Н3,5 Tyr. Спектры, полученные при задержках 0 и 100 мкс, имеют
одинаковую вертикальную шкалу.
DP
H3,4
DP
H5
Tyr
H2,6
0 мкс
Tyr
H3,5
GMP
H8
100 мкс
8.0
7.5
δ, м.д.
7.0
8.0
7.5
δ, м.д.
7.0
8.0
7.5 7.0
δ, м.д.
Рисунок 5. Ароматический участок спектров ХПЯ 1H CIDNP, полученных в фотореакциях 2,2 ′ -дипиридила с
гуанозин-5′-монофосфатом (С = 23 мМ) (слева), N-ацетилтирозина (С = 35 мМ) (справа) и со смесью гуанозин-5′монофосфата (С = 20 мМ) и N-ацетилтирозина (С = 10 мМ) (в середине); pH = 7.5. Верхние спектры получены
сразу после лазерного импульса, нижние – через 100 мкс после лазерного импульса.
Сигналы в спектре ХПЯ наблюдались для протонов, не обменивающихся с водой, и
имеющих ненулевые константы СТВ в промежуточных радикалах. Знаки сигналов ХПЯ
соответствуют правилам Каптейна. В данном случае наблюдалась усиленная абсорбция для
Н3,4 и Н5 дипиридила, Н2,6 тирозина и эмиссия Н8 гуанозина и Н3,5 тирозина (усиленная
12
абсорбция также обнаружена для непоказанных β-СН2 протонов тирозина). При других
значениях рН наблюдались качественно те же спектры ХПЯ, что и в нейтральном растворе.
Различие состояло в рН-зависимых химических сдвигах протонов диамагнитных молекул, но
для радикальной стадии реакции это не принципиально.
В нейтральном растворе механизм тушения триплетного DP тирозином и гуанозином,
представляет собой перенос атома водорода. В результате формируются нейтральные
радикалы DPH•, TyrO• и G(-H)•. Кинетические зависимости ХПЯ, полученные для бинарных
растворов DP/GMP и DP/Tyr, показаны на рисунках 6 и 7 (символы z и { соответственно). В
обоих случаях вначале наблюдается рост поляризации, сформированной в бимолекулярных
реакциях в объеме, а затем спад до стационарного значения, зависящего от времени
релаксации ядер в радикалах. Вырожденный электронный обмен в этих условиях
неэффективен ни для тирозина, ни для гуанозина в соответствующих парах TyrO•/TyrOH и G(H)•/G, а вырожденный перенос атома водорода слишком медленный и не конкурирует с
бимолекулярной гибелью радикалов.
В трехкомпонентной смеси кинетика ХПЯ как тирозина, так и GMP зависит от
эффективности реакции переноса электрона и от начального соотношения концентраций
реагентов. Реакция переноса электрона G (− H ) • + TyrOH → G (− H ) + TyrOH • происходит
независимо от спинового состояния реагентов и переводит радикал GMP в диамагнитное
состояние. Поскольку поляризация вышедших из клетки радикалов противоположна по знаку
геминальной, реакция переноса электрона приводит к компенсации ХПЯ для GMP. Это
проявляется в виде спада кинетики ХПЯ, скорость которого возрастает с увеличением
концентрации донора электрона (тирозина). Для тирозина реакция переноса электрона служит
дополнительным источником неполяризованных радикалов, которые приобретают ядерную
поляризацию в бимолекулярной реакции гибели с радикалами DP. В связи с этим стационарное
значение ХПЯ по отношению к геминальной поляризации для тирозина выше в присутствии
GMP.
Увеличение концентрации тирозина ускоряет спад кинетики ХПЯ для гуанозина. В
данных
экспериментальных
условиях
этот
спад
может
быть
описан
как
псевдомономолекулярный. Для тирозина изменение величины ХПЯ по отношению к
начальному значению определяется не только скоростью реакции переноса электрона, но и
начальным соотношением радикалов тирозина и гуанозина, возникших в результате реакции
тушения. Чем больше начальная доля радикалов GMP, тем более высокая концентрация
радикалов тирозина может быть получена в результате реакции переноса электрона. В
предельном случае, если бы начальная концентрация радикалов тирозина была нулевой и
источником радикалов тирозина была бы только реакция переноса электрона, то наблюдался
13
бы рост ХПЯ тирозина от нуля до некоторого стационарного значения. Набор кинетических
данных для рН = 7.5 был получен при различных концентрациях GMP и тирозина. Масштаб
вертикальной шкалы кинетики ХПЯ тирозина выбран следующим образом: первая
экспериментальная точка кинетики с самой низкой концентрацией тирозина принята за
единицу. Видно, что, несмотря на более чем пятикратное различие начальных значений ХПЯ,
стационарные значения отличаются менее чем в два раза.
15.0
ХПЯ, усл. ед.
ХПЯ, усл. ед.
1.5
1.0
0.5
0
10
20
30
100
10.0
5.0
0
10
Время, мкс
30
100
Время, мкс
Рисунок 6. Кинетика ХПЯ протона H8 гуанозин-5 ′ монофосфата, полученная при рН = 7.5: 17 мМ GMP
(z); 22 мМ GMP с 2.5 мM Tyr (Ä); 20 мM GMP с 10
мM Tyr (U). Сплошные линии – результаты
численного моделирования.
Моделирование
20
Рисунок 7. Кинетика ХПЯ протонов H3,5 Nацетилтирозина, полученная при рН = 7.5: 35 мM Tyr
(○); 17 мM GMP с 20 мM Tyr („), 20 мM GMP с 10
мM Tyr (U), 21 мM GMP с 5 мM Tyr (¡), 22 мM GMP
с 2.5 мM Tyr (Ä). Сплошные линии – результаты
численного моделирования.
экспериментальных
кинетических
зависимостей
системой
дифференциальных уравнений позволило определить константу скорость реакции переноса
электрона с тирозина на радикал гаунозин-5'-монофосфата. В данном случае при рН = 7.5
значение составило ke = 6.0±107 М-1c-1.
Аналогичные измерения были проведены при других значения рН и с другой
аминокислотой
–
триптофаном.
Обобщенные
результаты
проведенных
исследований
приведены в таблице 3.
Таким образом, в качестве модели химической репарации ДНК путем быстрого
заполнения электронной вакансии основания нуклеиновой кислоты из протеинового
окружения была выбрана реакционная система, включающая фотохимическое окисление
основания РНК гуанозина-5'-монофосфата в присутствии ароматической аминокислоты
(тирозина или триптофана). Преимуществом используемого при этом метода химической
14
Таблица 3. Данные о частицах, участвующих в реакции переноса электрона между радикалами гуанозин-5'монофосфата и аминокислотами, и константы скорости этой реакции, ke.
рН
Радикал Тирозин
гуанозина
GH++•
1.3
+•
2.9
TyrOH
G
7.5
11.3
13.3
G(-H)
(7.1±3.0)×108
(6.0±1.0)×107
•
G(-2H)−•
pH
ke, M-1c-1
8
TyrO−
1.3
2.9
7.5
(1.6±0.4)×10
11.0
<6×106
13.3
Радикал Триптофан
гуанозина
GH++•
+•
G
G(-H)•
TrpH
G(-2H)−•
ke, M-1c-1
(1.0±0.3)×109
(2.6±0.4)×108
(1.2±0.3)×107
поляризации ядер с временным разрешением состоит в возможности разделения вкладов от
геминальных радикальных пар и радикальных пар в объеме, что позволяет проследить
кинетику радикальных превращений. Полученные кинетические данные для реакции переноса
электрона между радикалами GMP, образованными фотохимически, и аминокислотами имели
сильную зависимость от степени протонирования реагентов. Детальное кинетическое изучение
четырех форм радикальных интермедиатов гуанозина-5'-монофосфата, участвующих в реакции
восстановления путем переноса электрона с аминокислот, оказалось возможным благодаря
значительному усилению сигналов ЯМР за счет эффектов ХПЯ в реакциях триплетновозбужденного дипиридила с GMP и аминокислотами. Для обеих аминокислот полученные
нами данные показали, что различные формы радикала GMP, а именно: GH++• (pH = 1.3), G+•
(pH = 2.9), G(-H)• (pH = 7.5, 11.0, 11.3) и G(-2H)−• (pH = 13.3), характеризуются разными
окислительными свойствами. Значение константы скорости окислительно-восстановительной
реакции составило от (1.0±0.3)×109 M-1с-1, полученной для G+• или GH++• с триптофаном, до
величины меньше 6.0×106 M-1с-1 для реакции восстановления радикала G(-2H)−• тирозином.
Общим свойством изучаемой реакции переноса электрона явилось то, что эффективность этой
реакции была выше в кислотной среде; также как и в случае триптофана.
Помимо рассматриваемых аминокислот эффективность восстановительного переноса
электрона на радикал гуанозина была проверена для метионина и N-ацетилгистидина, в
фотореакциях которых также наблюдаются значительные эффекты ХПЯ. Влияние добавления
этих аминокислот на кинетику ХПЯ не обнаружено вплоть до концентрации 40 мМ. Это
согласуется с данными по восстановлению радикала гуанозина в ДНК-плазмиде производными
метионина, константа скорости которого составила 105 M-1с-1. Восстановление производными
гистидина не наблюдалось.
Пятая глава диссертационной работы посвящена изучению влияния скалярных спинспиновых взаимодействий на динамику ядерной поляризации и дисперсию Т1-релаксации в
произвольном магнитном поле. В первом разделе пятой главы была изучена зависимость
15
индивидуальных времен Т1-релаксации протонов AMP и GMP от магнитного поля в широком
диапазоне значений напряженности от 0.1 мТл до 7 Тл с шагом 0.1 мТл. В силу того, что АМР
и GMP – небольшие молекулы, их молекулярное движение является быстрым во всем
диапазоне магнитных полей до 7 Тл. Экспериментально полученная зависимость времен
релаксации
протонов
обусловлена
влиянием
внутримолекулярного
спин-спинового
взаимодействия.
На рисунке 8 показана дисперсия
9
7
T1 / c
Т1-релаксации ароматических протонов
AMPH8
AMPH2
GMPH8
8
AMP и GMP. Несмотря на то, что в
6
молекуле
АМР
5
протонов
Н2
4
отличаются (примерно в 3 раза), в слабых
3
полях (менее 30 мТл) их намагниченность
2
приходит к равновесию с одинаковыми
1
временами релаксации. Это связано со
0
спин-спиновым взаимодействием между
0.1
1
10
100
1000
10000
Магнитное поле, мТл
Рисунок 8. Дисперсия релаксации ароматических протонов
AMP (круги относятся к протону Н2, квадраты – к протону
Н8) и GMP (треугольники – к протону Н8). Линиями
показаны расчетные зависимости: сплошные линии –
модель двухспиновой системы (Н2 и Н8 для АМР, H8 и H1'
для GMP); пунктирные линии – модель трехспиновой
системы (H8, H2 и H1'). Расчеты выполнялись с учетом
полного оператора релаксации.
экспериментальными
данными,
предсказывая
времена
и
Н8
релаксации
очень
сильно
двумя протонами, которое приводит к
сильной связи этих протонов в данном
диапазоне магнитных полей (<30 мТл).
Результаты
проведенного
численного
моделирования этой системы (рис. 8,
сплошные линии) хорошо согласуются с
переход
от
релаксации
протонов
с
индивидуальными Т1 к релаксации с общим Т1 в тех же магнитных полях.
Для молекулы GMP, которая имеет только один ароматический протон Н8, кривая
дисперсии Т1-релаксации качественно выглядит по-другому (рис. 8). Значение Т1 для протона
Н8 молекулы GMP плавно уменьшается в слабых магнитных полях, хотя для молекулы АМР
время релаксации соответствующего протона Н8 сначала увеличивается, а затем уменьшается.
Такое поведение дисперсии релаксации Н8 молекулы GMP мы объясняем спин-спиновым
взаимодействием между протонами Н8 и Н1'. Поскольку в этой системе нет ядерных спинов,
релаксирующих дольше, чем спин Н8, то его релаксация только укорачивается за счет сильной
связи с протонами рибозы в слабых магнитных полях.
Результаты измерений кинетики поляризации ароматических протонов АМР показаны на
рисунке 9. В первом случае (а) перед переключением магнитного поля BR→Bint = 0.1 мТл
спиновая система находилась в термодинамическом равновесии в магнитном поле BR = 7 Тл.
16
При нулевой задержке (τ = 0) поляризация обоих протонов практически одинаковая (рис. 9 (а)).
Во втором случае применялся неселективный радиочастотный импульс длительностью 180°,
инвертирующий населенности всех спинов. Затем в этом же поле (BR = 7 Тл) следовала
задержка τ W = T 1H 2 ln 2 , при которой поляризация протона Н2 обращалась в нуль, а
поляризация протона Н8, релаксирующего быстрее, восстанавливалась в абсорбцию. Такая
комбинация импульса и задержки привела к различным начальным поляризациям протонов Н2
и Н8 при измерении кинетики релаксации (рис. 9 (б)).
Поляризация, отн. ед.
AMP H8
AMP H2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
Поляризация, отн. ед.
б
а
0,2
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
Разность, отн. ед.
Разность, отн. ед.
0,0
AMP H8
AMP H2
1,0
0,1
0,0
-0,1
-0,2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
Время, с
0,2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
0,1
0,0
-0,1
-0,2
Время, с
Рисунок 9. Кинетика релаксации поляризации протонов Н2 и Н8 в магнитном поле 0.1 мТл. Первый случай (а)
соответствует равновесной спиновой системе в магнитном поле 7 Тл при задержке τ = 0 (одинаковые начальные
поляризации обоих протонов при нулевой задержке), второй случай (б) – спиновая система в начальный момент
времени τ = 0 в поле 7 Тл не находилась в термодинамическом равновесии (начальные поляризации на протонах
Н2 и Н8 существенно отличались). Сплошные линии показывают экспоненциальную компоненту (верхние
графики) и осцилляторную (нижние графики).
В обоих случаях экспериментальные данные описывались экспоненциальной функцией,
умноженной на осцилляторную часть: M i = Ai exp(−t / T1i )(1 + B i sin( 2πν 23t + ϕ 0i )) + C i (рис. 9). В
первом случае (а) отклонения от экспоненциальной функции очень малы, в то время как в
случае (б) они уже значительны. Частота биений соответствует расщеплению состояний
двухспиновой системы с Iz = 0. Она была рассчитана на основании константы JH2-H8 и разницы
ларморовских частот прецессии δν = |νH2−νH8|: ν 23 = ( J H 2−H 8 ) 2 + (δν ) 2 . В выбранном поле
17
(Bint=0.1 мТл) частота составляет ν23≈JH2-H8=0.24 Гц, что меньше, чем разрешение спектров
ЯМР в рассматриваемом случае. Осцилляции сигналов протонов Н2 и Н8 имеют
противоположную фазу, что свидетельствует о когерентном перераспределении поляризации в
процессе Т1-релаксации сильно связанной системы. Несмотря на то, что в момент времени τ =
0 когерентность отсутствует, она образуется позже из-за различия населенностей собственных
состояний. В случае (б) в момент времени τ = 0 присутствует ненулевая когерентность. Таким
образом, на основании полученных результатов можно сделать вывод, что релаксация
населенностей и когерентностей связана при условии J ijT 1i ≈ 1 .
Второй
раздел
пятой
главы
посвящен
изучению
влияния
спин-спинового
взаимодействия на ХПЯ. При изучении зависимости ХПЯ пуриновых нуклеотидов от
магнитного поля в слабых магнитных полях (B<<100 мТл) наблюдалась поляризация протона
Н2 молекулы АМР, который не был поляризован в сильном магнитном поле. В сильных
магнитных полях все спины поляризуются в соответствии с их константами СТВ в
радикальном состоянии. В частности, отсутствие геминальной поляризации на ядре в сильном
магнитном поле (в случае АМР это Н2), указывает на малое значение константы СТВ в
радикальном состоянии с этим ядром. Вопреки этому утверждению, некоторые спектры ХПЯ
для АМР, полученные в слабом магнитном поле (рис. 11, спектр 3), не отражают
распределение спиновой плотности в радикалах, что указывает на то, что ядро Н2
поляризуется не напрямую.
Эксперименты
по
переносу
ХПЯ
в
Магнитное поле, B(t)
варьируемом магнитном поле выполнялись на
установке в Институте экспериментальной физики
Свободного университета Берлина. Измерения
проводили согласно диаграмме, показанной на
рисунке 10. Образец облучали эксимерным лазером
(XeCl, 308 нм) в течение времени τL (этап 1) с
Поляризация, M(t)
частотами от 1 до 50 Гц и энергией импульса до
150
мДж
через
гибкий
световод.
Варьируя
задержку τW в слабом магнитном поле, получали
эволюцию неравновесной поляризации во времени.
Типичные времена переноса датчика с образцом в
поле детектирования (7 Тл) составляли от 300 мс до
Время, t
Рисунок 10. Схема проведения измерений по
переносу поляризации.
1с (этап 3). Регистрацию спектров ЯМР (этап 4)
проводили
18
приложением
РЧ-импульса
и
накоплением спада свободной индукции с последующим Фурье-преобразованием. Спектр
ХПЯ получали вычитанием «темнового» спектра ЯМР из спектра ЯМР, полученного при
лазерном облучении и при сохранении всех остальных параметров.
В экспериментах первого типа при фиксированном времени облучения τL (предполагая,
что когерентности не усредняются за достаточно короткое время τL) варьировали время
ожидания в поле 1 мТл (рис. 11 (а)). При малых значениях τW интенсивность ХПЯ на протоне
Н8 гораздо выше, чем на протоне Н2. Тем не менее, при длительных задержках τW поляризация
на Н2 возрастает, а спустя одну секунду становится даже больше, чем на Н8. Оба значения,
I1z
Iz
и
I 2z
Iz
, осциллируют около значения
I z / 2 , где
I z = I1 z + I 2 z . В
магнитном поле 1 мТл справедливо ν23>>δν и частота колебаний ν23=J. Несмотря на быструю
релаксацию, из-за которой биения закончились после 2.5 с, нам удалось определить частоту
колебаний (0.24 Гц) и оценить константу спин-спинового взаимодействия между Н2 и Н8 в
0.24 Гц.
1.0
(а)
<I1z>, <I2z>
0.8
H8
0.6
H2
1
0.4
0.2
2
0.0
0
1
2
τW, c
3
4
1.0
(б)
<I1z>, <I2z>
0.8
3
0.6
8.3
0.4
8.2
8.1
Химический сдвиг, ppm
0.2
0.0
0
1
2
τL, c
3
4
Рисунок 11. Кинетики переноса ХПЯ между протонами Н2 и Н8 молекулы АМР (а) в зависимости от времени
ожидания τW в поле Bpol = 1 мТл при фиксированном времени облучения τL = 0.2 с; (б) в зависимости от времени
облучения τL при фиксированном времени ожидания τW = 0. Символы соответствуют: (●) поляризации протонов
Н8, (○) поляризации протонов Н2. ХПЯ формируется в фотореакциях АМР с Dp-d8. Справа показаны: ЯМРспектр в магнитном поле 7 Тл (спектр 1), ХПЯ-спектры при Bpol = 7 Тл (спектр 2) и при Bpol = 1 мТл (спектр 3),
полученные при τL = 0.2 с, τW = 0 и τtr = 0.3 c. Интенсивности ХПЯ нормированы на суммарную поляризацию в
начальный момент времени.
19
В экспериментах второго типа было зафиксировано время τW = 0 и регистрировали
интенсивность ХПЯ на обоих протонах как функцию времени облучения τL (рис. 11 (а)). Для
того, чтобы число фотонов при разных значениях τL было постоянно, варьировали частоту
вспышек лазера. Как и в предыдущем случае, при коротких временах τL поляризация на
протоне Н8 значительно больше чем, на Н2. При больших временах облучения поляризация на
Н8 спадает, а на Н2 – растет. После двух секунд облучения поляризация на протонах Н8 и Н2
выравнивается,
то
есть
наблюдается
полное
перераспределение
ХПЯ.
Время
перераспределения согласуется с вышеописанным условием τLJ ~ 1 при J = 0.24 Гц.
Обе экспериментальные зависимости находятся в полном соответствии с теоретическими
расчетами. Видно, что при коротких задержках протон Н2 поляризован незначительно, но
накапливает поляризацию, перенесенную с протона Н8 при длинных задержках или длинных
временах облучения. Наблюдение биений в экспериментах при варьировании τW позволило
сделать вывод, что перенос ХПЯ происходит когерентно за счет сильной связи спинов в
слабом магнитном поле. Следует отметить, что для такого малого значения J = 0.24 Гц
изменение магнитного поля от 1 мТл до 7 Тл происходит неадиабатически. В проведенных
экспериментах не удалось достичь режима адиабатического переключения магнитного поля
из-за короткой продольной релаксации протонов Н2 и Н8 в слабом магнитном поле (Т1≈2.5 с)
(рис. 8).
Приложение содержит экспериментально полученные и моделированные спектры ЯМР
1
( Н,
13
С) высокого разрешения исследуемых соединений (триптофан, тирозин, аденозин-5'-
монофосфат, гуанозин-5'-монофосфат). В таблицах приведены значения химических сдвигов и
констант спин-спинового взаимодействия, определенных из спектров ЯМР. Эти значения
использовались при моделировании спектров ХПЯ (1Н,
13
С) и зависимости Т1-релаксации
протонов пуриновых нуклеотидов от напряженности магнитного поля.
20
ВЫВОДЫ.
1. Создана установка и отработана методика для регистрации ХПЯ магнитных ядер (1H,
15
13
C,
N) с микросекундным временным разрешением на базе ЯМР-спектрометра (B0 = 14.1 Тл)
и импульсного лазера (Nd:YAG).
2. Установлено, что в многоядерных радикальных парах, для которых ширина спектра ЭПР
больше, чем константа СТВ для любого из ядер, интенсивности сигналов в геминальных
спектрах ХПЯ в сильном магнитном поле прямо пропорциональны величинам констант
СТВ в радикалах.
3. Впервые зарегистрированы геминальные спектры
аденозин-5'-монофосфата,
на
основании
13
анализа
С ХПЯ L-триптофана и
которых
определены
15
N ХПЯ
знаки
и
относительные величины констант сверхтонкого взаимодействия в катион-радикалах
триптофана и нуклеотида.
4. Изучена реакция переноса электрона с триптофана и тирозина на радикалы гаунозин-5'монофосфата при рН водных растворов от 1.3 до 13.3. Установлено, что в кислотных
растворах перенос электрона протекает значительно быстрее, чем в щелочных растворах.
При одинаковых условиях триптофан является более эффективным восстанавливающим
агентом, чем тирозин.
5. Изучена релаксационная дисперсия протонов пуриновых нуклеотидов (АМР и GMP) в
диапазоне магнитных полей от 0.1 мТл до 7 Тл. Показано, что на зависимость Т1релаксации от магнитного поля влияет спин-спиновое взаимодействие. Установлено, что
следствием сильной связи спинов Н2 и Н8 в молекуле АМР является когерентное
перераспределение неравновесной поляризации и неэкспоненциальная кинетика Т1релаксации протонов АМР.
21
Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:
1. Transfer of CIDNP among coupled spins at low magnetic field / Ivanov K. L., Miesel K.,
Yurkovskaya A. V., Korchak S. E., Kiryutin A. S., Vieth H. M. // Applied Magnetic Resonance. 2006. - Т. 30. - №3-4. - pp. 513-534.
2.
1
H and 13C Hyperfine Coupling Constants of the Tryptophanyl Cation Radical in Aqueous
Solution from Microsecond Time-Resolved CIDNP / Kiryutin A. S., Morozova O. B., Kuhn L. T.,
Yurkovskaya A. V., Hore P. J. // Journal of Physical Chemistry B. - 2007. - Т. 111. - №38. - pp.
11221-11227.
3. Electron Transfer between Guanosine Radical and Amino Acids in Aqueous Solution. 1.
Reduction of Guanosine Radical by Tyrosine / Morozova O. B., Kiryutin A. S., Sagdeev R. Z.,
Yurkovskaya A. V. // Journal of Physical Chemistry B. - 2007. - Т. 111. - №25. - pp. 7439-7448.
4. Electron Transfer between Guanosine Radicals and Amino Acids in Aqueous Solution. II.
Reduction of Guanosine Radicals by Tryptophan / Morozova O. B., Kiryutin A. S., Yurkovskaya
A. V. // Journal of Physical Chemistry B. - 2008. - Т. 112. - №9. - pp. 2747-2754.
5. High-resolution study of nuclear magnetic relaxation dispersion of purine nucleotides: Effects of
spin-spin coupling / Kiryutin A., Ivanov K., Yurkovskaya A., Vieth H.-M. // Solid State Nuclear
Magnetic Resonance. - 2008. - Т. 34. - №1-2. - pp. 142-149.
6. Study of tryptophan radicals by CIDNP method / Kiryutin A. S. // 41st Undergraduate and
Graduate International Science Conference “Student and Scientific and Technical Progress” /
Novosibirsk, Russia, 04.2003. - p. 34.
7. Short-lived radicals of purine bases in aqueous solution: reactivity and characterization by
magnetic resonance / Kiryutin A. S., Morozova O., Yurkovskaya A., Vieth H.-M. // 70th Annual
Meeting of the Deutsche Physikalische Gesellschaft (DPG) / Berlin, Germany, 04-09.03.2005.
CPP 30.12.
8. Characterization of Short-lived Radicals of Purine Bases in Aqueous Solution by Magnetic
Resonance / Kiryutin A. S., Ivanov K. L., Vieth H.-M. // 69th Annual Meeting of the Deutsche
Physikalische Gesellschaft (DPG) / Dresden, Germany, 27-31.03.2006. CPP 12.28.
9. Dynamic Polarization and Relaxation in Systems of Coupled Nuclear Spins / Kiryutin A. S.,
Korchak S. E., Ivanov K. L., Vieth H.-M., Yurkovskaya A. V. // International Symposium on
Modern Problems of Chemical Physics / Kazan, Russia, 31.10-04.11.2006.
10. Coherent transfer of CIDNP in biologically important molecules at low magnetic field / Miesel K.,
Ivanov K. L., Yurkovskaya A. V., Korchak S. E., Kiryutin A. S., Vieth H.-M. // XXII
International conference on magnetic resonance of biological system (ICMRBS) / Goettingen,
Germany, 20-25.08.2006. - S. 212.
11. Influence of the Spin-Spin Couplings on T1 Relaxation Dispersion / Ivanov K. L., Yurkovskaya A.
V., Korchak S. E., Kiryutin A. S., Miesel K., Vieth H.-M. // Modern Development of Magnetic
Resonance / Kazan, Russia, 24-29.09.2007. - p. 30.
22
12. 1H and 13C hyperfine coupling constants of the tryptophanyl cation radical in aqueous solution
from microsecond time-resolved CIDNP / Kiryutin A. S., Morozova O. B., Kuhn L. T.,
Yurkovskaya A. V., Hore P. J. // 10th International Symposium on Spin and Magnetic Field Effect
in Chemistry and Related Phenomena / S. Servolo, Venice, Italy, 18.06-21.06.2007. - p. 64.
13. Coherent transfer of hyper-polarization due to strong coupling of spins / Miesel K., Ivanov K. L.,
Yurkovskaya A. V., Korchak S. E., Kiryutin A. S., Vieth H.-M. // 11th Chianti Workshop on
Magnetic Resonance “Methods for biomolecular magnetic resonance” / Vallombrosa (Florence),
Italy, 03-08.06.2007. - p. 88.
14. Influence of spin-spin couplings on longitudinal relaxation dispersion / Miesel K., Ivanov K. L.,
Yurkovskaya A. V., Korchak S. E., Kiryutin A. S., Vieth H.-M. // The 5th Conference on Field
Cycling NMR Relaxometry / Torino, Italy, 30.05-03.06.2007. - O15.
15. Re-distribution of hyperpolarization infield cycling NMR experiments with high resolution
detection / Yurkovskaya A. V., Ivanov K. L., Korchak S. E., Kiryutin A. S., Vieth H.-M. // The
5th Conference on Field Cycling NMR Relaxometry / Torino, Italy, 30.05-03.06.2007. - O2.
16. Electron transfer between guanosine radical and amino acids in aqueous solution: TR-CIDNP
study / Yurkovskaya A. V., Morozova O. B., Kiryutin A. S., Vieth H. M. // 10th International
Symposium on Spin and Magnetic Field Effect in Chemistry and Related Phenomena / S.Servolo,
Venice, Italy, 18-21.06.2007. - p. 5.
17. Determination of EPR Parameters of Adenosine- and Guanosine-monophosphate Radicals from
CIDNP Field Dependence / Kiryutin A. S., Ivanov K. L., Morozova O. B., Zimmermann H.,
Yurkovskaya A. V., Vieth H.-M. // 6th Asia Pacific EPR/ESR Symposium / Cairns, Australia, 1318.07.2008. - P_11.
18. Modelling of fast DNA repair by reductive electron transfer from amino acids to GMP radicals.
Time resolved photo-CIDNP study at variable pH / Yurkovskaya A. V., Morozova O. B.,
Kiryutin A. S. // Central European Conference on Photochemistry / Bad Hofgastein, Austria, 10-
14.02.2008. - O26.
19. Modelling Fast DNA Repair by Electron Transfer between Guanosine Radical and Aminoacids: A
Microsecond Time-Resolved Photo-CIDNP Study / Yurkovskaya A. V., Morozova O. B.,
Kiryutin A. S., Vieth H.-M. // 49th Experimental Nuclear Magnetic Resonance Conference /
Asilomar Conference Center, Pacific Grove, CA, USA. - p. 52.
20. Перенос электрона между радикалом гуанозина и аминокислотами: исследование методом
ХПЯ с временным разрешением / Юрковская А. В., Морозова О. Б., Кирютин А. С., Фит
Х.-М., Сагдеев Р. З. // Современные проблемы химической физики / Ереван, Армения, 2124.10.2008. - С. 35-36.
23