065-0512 - Белорусская медицинская академия

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
УТВЕРЖДАЮ
Первый заместитель Министра
«КЛИНИЧЕСКАЯ И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
СОСТОЯНИИ ИНТОКСИКАЦИИ,
ВЫЗВАННЫХ КАННАБИНОИДАМИ»
инструкция по применению
Учреждение разработчик:
Государственное учреждение образования «Белорусская медицинская академия
последипломного образования»
Учреждение здравоохранения «Городской клинический наркологический
диспансер» г. Минска
Авторы:
доктор медицинских наук, профессор B.C. Камышников,
кандидат медицинских наук, доцент О.Р. Айзберг,
A.M. Чубуков, A.M. Турцевич, И.Д. Шилейко, Д.А. Статкевич
Минск 2012
Настоящая
инструкция
включает
алгоритм
диагностики
состояний,
вызванных употреблением продуктов переработки дикорастущей
конопли
(Cannabis Sativa). Действующим началом этих наркотических средств являются
каннабиноиды (фитоканнабиноиды) - группа биологически активных веществ,
близкой
к
стероидам
структуры,
основными
представителями
которых
являются дельта-8- и дельта-9-тетрагидроканнабинол (ТГК).
Наиболее распространенными формами для нелегального употребления
каннабиноидов являются:
- марихуана - высушенная и измельченная верхняя часть растения с листьями и
цветками, содержащая до 10 - 15% ТГК;
- гашиш
-
высушенная
смола,
выделяющаяся
из цветущих
верхушек
(содержание ТГК от 2 до 10%);
- гашишное масло - концентрированный экстракт растительного материала или
смолы (содержание ТГК от 10 до 60%).
Фитоканнабиноиды
являются
липофильными
соединениями,
биодоступность в зависимости от способа применения составляет от
их
10 до
60%. Биотрансформация дельта-9 ТГК осуществляется преимущественно в
печени путем
продукта -
быстрого окисления до конечного биологически неактивного
11-нор-9-карбокси-дельта-9-тетрагидроканнабиноловой
кислоты
(ТГК-СООН), которая является основным метаболитом ТГК. Для эффективного
выведения почками 75 - 80% гидроксилированных и карбоксилированных
метаболитов конъюгируются с глюкуроновой и серной кислотами, превращаясь
в более полярные растворимые в воде соединения. Такие
биотрансформации
вызывают
определенные
затруднения
при
особенности
выявлении
каннабиноидов в биологических жидкостях организма.
При
регулярном
употреблении
продуктов
Cannabis
происходит
накопление каннабиноидов, вследствие чего они обнаруживаются в моче
длительное
время
употреблении
это
от момента
время
последнего
составляет
употреблении - 2-6 недель.
2
3-5
приема.
суток,
При
при
спорадическом
систематическом
В организме человека обнаружено 2 типа каннабиноидных рецепторов СВ1 и СВ2. СВ2-рецепторы находятся в основном в клетках иммунной системы
(лимфоциты и макрофаги) и участвуют в регулировании различных иммунных
реакций.
Рецепторы
наибольшая
их
СВ1
плотность
находятся
была
в
центральной
обнаружена
в
нервной
мозжечке,
системе,
гиппокампе,
подкорковых ядрах и лобной коре. В небольшом количестве эти рецепторы
содержатся в селезенке, эндокринных железах, сердце. В организме человека
были найдены эндогенные лиганды каннабиноидных рецепторов - анандамиды.
С точки зрения химической структуры анандамиды не имеют ничего общего с
фитоканнабиноидами. К анандамидам относятся арахидонилэтиноламид, 2ариходонилглицерол,
гамма-линоленоилэтиноламид
и
некоторые
другие
вещества. Эндоканнабиноидная система обладает модулирующим эффектом на
другие нейротрансмиттерные системы - ГАМК, глутаматную и дофаминовую,
что объясняет психотропные эффекты каннабиса.
В настоящее время на нелегальном рынке широко распространяются
вещества, которые условно называют «синтетическими
Они обладают аналогичным с
действием,
но
имеют
иную
фитоканнабиноидами
химическую
каннабиноидами».
фармакологическим
структуру.
«Синтетические
каннабиноиды» в зависимости от химической структуры можно разделить на 5
групп:
1. Дибензопираны (HU-210)
2. Циклогексилфенолы (CP 47,497 и его гомологи)
3. Нафтоилиндолы (JWH-018, JWH-073, JWH-398)
4. Фенилацетилиндолы (JWH-250)
5. Олеамид.
Необходимо опшетить, что лабораторными
в
данной
инструкции,
«синтетические
обнаруживаются!
3
методами,
описанными
каннабиноиды»
не
1. НАЗНАЧЕНИЕ
Разработанная методика предназначена для клинической диагностики
состояния опьянения, вызванного злоупотреблением продуктами переработки
дикорастущей конопли (Cannabis Sativa), а также для идентификации в
биологических жидкостях организма человека каннабиноидов.
Основной целью разработки является диагностика факта употребления
продуктов переработки Cannabis, а также вызванных ими состояний опьянения
с использованием клинико-лабораторных методов исследования.
2. КЛИНИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
Продукты переработки Cannabis оказывают на организм стимулирующее
и
седативное
воздействие,
дополняемое
при
более
высоких
дозах
галлюциногенными эффектами. Интенсивность эффектов от приема продуктов
Cannabis зависит не только от содержания в них ТГК, но и от способов
употребления.
Основным
способом
является
курение.
Вдыхание
дыма
приводит к наиболее быстрой и эффективной абсорбции ТГК в легких.
Проявление воздействия ТГК при таком способе употребления начинается уже
через
считанные
минуты
продолжительность
пероральном
и
достигает
пика
через
5
-
30
наркотического эффекта составляет 2 — 4
приеме
каннабиноиды
абсорбируются
гораздо
мин,
а
часа. При
медленнее,
максимальный эффект развивается в течение 45 - 60 мин, а его длительность
составляет 4 - 6 часов.
2.1. Стадии наркотического опьянения
Проявления
опьянения
весьма
разнообразны
и зависят
от
дозы
поступившего в организм ТГК, индивидуальных особенностей организма,
способа введения наркотика и других факторов. Тем не менее, имеется ряд
клинических признаков, наиболее характерных для употребления продуктов
Cannabis.
4
Оценка клинической картины состояния опьянения имеет особую
важность в первые часы после курения, поскольку особенности распределения
и метаболизма
каннабиноидов
не позволяют детектировать
их в моче
лабораторными методами около 2 часов после употребления.
В клинике опьянения, вызванного курением каннабиса, выделяют четыре
последовательно протекающие стадии:
Клинические признаки
Тревога разной степени выраженности, повышенная
пугливость, расширение зрачков, покраснение лица,
дрожь в руках, сухость слизистых полости рта.
Эйфория. Возникают расстройства мышления: не
Вторая стадия
только
по
форме, но
и
по
содержанию.
Воспринимаются
и
перерабатываются
лишь
случайные внешние события, что свидетельствует о
сужении сознания. Отмечаются блеск глаз, учащение
пульса, подъем артериального давления, оживление
сухожильных
рефлексов,
шаткость
походки,
горизонтальный установочный нистагм.
Психотическое
состояние
со
спутанностью,
Третья стадия
бессвязностью мышления и отрывочным бредом.
Отмечается малоподвижность, отрешенность от
окружающего. Кожные покровы лица бледные,
усиливается потливость, снижается температура тела,
продолжает повышаться артериальное давление.
Вялость, слабость, бледность, заторможенность,
Четвертая стадия
(выход из гашишного апатичность; появляются повышенный аппетит и
постоянная жажда.
опьянения)
Стадия интоксикации
Первая стадия
2.2. Клинические признаки интоксикации
Состояние опьянения, вызванное каннабиноидами, включает комплекс
следующих поведенческих и сомато-вегетативных признаков:
5
Системы
организма
Общее воздействие
на организм
Нервная система
Сердечно­
сосудистая система
Психическая сфера
Клинические признаки каннабиноидной
интоксикации
Покраснение кожи лица, сменяющееся бледностью по
мере усиления степени интоксикации.
Расширение зрачков, блеск глаз.
Гиперемия конъюктивы.
Сухие слизистые оболочки.
Усиленная потливость.
Сниженная температура тела.
Дрожь в руках.
Оживление сухожильных рефлексов.
Шаткость походки.
Горизонтальный установочный нистагм.
Нарушение сложных координационных проб.
Невнятная речь.
Синусовая тахикардия.
Повышенное систолическое давление в положении лежа.
Сниженное систолическое давление в положении стоя.
Повышенная пугливость.
Релаксация/эйфория.
Тревога разной степени выраженности.
Галлюцинации/иллюзии.
2.3. Клинические признаки передозировки
При передозировке зрачки резко расширены, перестают реагировать на
свет. Отмечается гиперемия лица, сухость слизистых, хриплый голос; пульс
учащается до 100-120 уд/мин., повышается артериальное давление. Возникают
нарушения сознания в виде различной степени оглушенности. Может развиться
острый психоз, протекающий в форме делирия, сумеречного помрачения
сознания.
При
наличии
клинических
признаков
хотя
бы
одной
из
стадий
наркотического опьянения необходимо произвести отбор проб биологического
материала (крови или мочи) для химико-токсикологического исследования.
6
Окончательная
верификация диагноза опьянения проводится
в случае обнаружении
каннабиноидов
химико-токсикологическом
Последовательность
в биологических
жидкостях
при
исследовании!
этапов
клииико-лабораторной
диагностики
употребления каннабиноидов отражена в следующей схеме:
Клинический
осмотр
Отбор образцов.
Разделение на ал и квоты
отрицательный
результат
только
Предварительное
исследование
пммунохимнческнм
методом
положительный
результат
ферментативный
гидролиз
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
7
щелочной
гидролиз
3. ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
3.1. Анализируемые образцы
Кровь (не менее 20 мл) или плазму (не менее 5 мл), отбирают в сухую
чистую пробирку без добавления антикоагулянтов и консервантов.
Мочу (не менее 100 мл) собирают в чистую сухую пластиковую или
стеклянную посуду без консервантов. Для анализа следует применять только
прозрачные образцы, при
необходимости
мочу следует фильтровать или
центрифугировать. Примеси (отбеливатели или другие оксидирующие агенты),
попадающие в образцы мочи на
преаналитическом этапе, могут давать
ошибочные результаты тестирования.
3.2. Предварительное исследование
Методом
предварительного
анализа,
позволяющим
произвести
скрининговый поиск каннабиноидов, является иммунохроматографический - с
применением экспресс-тестов. При использовании тест-полосок присутствует
вероятность получения ложноположительного результата из-за наличия кроссреакций с некоторыми веществами иной химической структуры, поэтому для
исключения
ошибок при полоэ/сительном
обязательном
порядке
токсикологического
необходимо
или сомнительном
проведение
результате
подтверждающего
исследования другим, более специфичным
в
химико-
методом.
В случае отрицательного результата при исследовании с использованием
экспресс-тестов
дальнейший
анализ
проводить
нецелесообразно
из-за
достаточно высокой чувствительности иммунохимического метода.
3.3. Подготовка
проводится
для
стеклянной
исключения
посуды
к
возможной
лабораторному
сорбции
исследованию
каннабиноидов
и
их
метаболитов поверхностью стекла. Включает последовательное выполнение
следующих этапов:
8
1. Флакон БСС 25, экстракционную тубу на 12 мл и концентрационную
чашку промывают смесью хлороформ - этиловый спирт (1:1), после
высушивания заполняют «хромпиком» и выдерживают 30 минут.
2. «Хромпик»
вымывают
проточной
водой
без
применения
моющих
средств.
3. Посуду
ополаскивают
дистиллированной
водой
и
высушивают
в
сушильном шкафу.
4. Далее посуду промывают 5% раствором триметилхлорсилана (TMCS) в
толуоле, закрывают крышкой и помещают в сушильный шкаф на 30
минут при 80° С.
5. Охлаждают до комнатной температуры, не снимая крышки.
3.4. Проведение нробоподготовки
Более 75% метаболитов каннабиноидов находятся в моче в виде
конъюгатов
с глюкуроновой
кислотой
(моно- и диглюкуронидов).
Эти
конъюгаты являются устойчивыми соединениями, образованными при помощи
химических
связей,
предварительного
для
этапа
разрушения
которых
пробоподготовки
-
необходимо
гидролиза.
В
проведение
лабораторной
практике применяют два вида гидролиза: энзимный и щелочной.
3.4.1. Энзимный (ферментативный)
гидролиз позволяет разрушить простые
эфирные связи ТГК и гидроксилированных метаболитов с глюкуроновой
кислотой,
одновременно
разрушая
и сложноэфирную
связь
ТГК-СООН
глюкуронида.
В подготовленный флакон БСС 25 помещают 1 мл исследуемой мочи или
плазмы крови, добавляют 1 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,8, после чего
проверяют рН полученной смеси. В случае, если рН ниже значения 6,8, её
величину устанавливают добавлением 0,1 н. NaOH. К смеси добавляют 5000 U
|3-глюкуронидазы в 0,1 М фосфатном буфере с рН 6,8. Флакон закрывают
9
крышкой, осторожно перемешивают
и помещают в водяную баню или в
термостат при температуре 37° С на 16 часов. После проведения гидролиза
жидкость охлаждают. Выделение каннабиноидов
осуществляют жидкость-
жидкостной экстракцией.
*
ПРИМЕЧАНИЕ:
осторожное
перемешивание
необходимо
для
предотвращения
образования верхнего слоя пены, который мешает определению каннабиноидов в моче.
3.4.2. Щелочной
гидролиз
При щелочном гидролизе хорошо разрушается сложноэфирная связь
ТГК-СООН глюкуронида.
• В подготовленный флакон БСС 25 помещают 5 мл исследуемой мочи или
плазмы, добавляют 1 мл метилового спирта и 0,5 мл насыщенного
раствора NaOH .
•
Флакон со смесью закрывают крышкой
и помещают в водяную баню,
нагревают при температуре 60° С в течение 10 минут. Охлаждают до
комнатной температуры, не снимая крышки.
•
После охлаждения выделение каннабиноидов осуществляют жидкостьжидкостной или твердофазной экстракцией.
ПРИМЕЧАНИЕ:
При
исследовании
меньших
используемых реактивов пропорционально
ВНИМАНИЕ!
количеств
мочи
или плазмы
количество
уменьшается.
Для проведения анализа методом газовой хроматографии с
масс-спектральным детектированием (ГХ/МС) параллельно с исследуемой
готовится контрольная положительная проба, для чего к интактной
(не
содержащей исследуемые вещества) пробе мочи или плазмы крови, добавляют
метанольный раствор одного из внутренних стандартов (ТГК, 11-ОН-ТГК или
ТГК-СООН с концентрацией 2 нг/мкл) из расчета
15 мкл стандарта на 1 мл
пробы, после чего проводят гидролиз по одной из вышеуказанных схем.
Для
параллельно
исследования
с
методом
исследуемой
тонкослойной
пробой
гидролизу
хроматографии
подвергается
(контрольная отрицательная) проба мочи или плазмы крови.
10
(ТСХ)
интактная
3.4.3. Жидкость-жидкостная
экстракция (ЖЖЭ)
Охлажденный гидролизат помещают в подготовленный флакон БСС 25.
подкисляют концентрированной НС1 до рН 2,0 - 3,0 по универсальном}'
индикатору. Прибавляют 5 мл смеси гексан - этилацетат в соотношении 7 : 1 .
Смесь интенсивно встряхивают на планетарном шейкере 10 мин при 12С
об./мин, после чего центрифугируют 3 мин при 3000 об./мин, затем отделяю!
фазу органического растворителя и переносят ее в концентрационную чашку.
Для достижения более эффективного концентрирования извлекаемых вещестЕ
экстракцию проводят дважды по описанной схеме, органические извлечения
объединяют* и далее упаривают досуха в токе теплого воздуха при температуре
не выше 50° С. Сухой остаток растворяют в этилацетате или хлороформе и
исследуют методом хроматографии в тонком слое сорбента.
*
ПРИМЕЧАНИЕ:
При отборе слоя органического
водной фазы в концентрационную
3.4.4. Твердофазная
извлечения
не допускается
попадание
чашку!
экстракция (ТФЭ)
Для ТФЭ используют образцы мочи после проведения
щелочного
гидролиза. Экстракция проводится с применением патронов с сорбентом
AccuBond .
11
Этапы ТФЭ:
• Подготовка
образца.
Охлажденный
гидролизат
подкисляют
уксусной
кислотой до рН 3,5 - 4,0 по универсальному индикатору.
• Подготовка
колонки. Перед началом работы проводят кондиционирование
сорбента, для чего через колонку (картридж) последовательно пропускают 6 мл
метанола и 6 мл 0,1н. НС1 под вакуумом, обеспечивающим скорость потока
жидкости около 2 мл/мин. Допустимо пропускание без применения вакуума
только
под
действием
силы
тяжести.
При
необходимости
используют
дополнительный резервуар объемом до 10 мл.
• Введение
образца. Подкисленный гидролизат пропускают через колонку под
вакуумом со скоростью около 1,5 мл/мин, но не выше 2 мл/мин.
11
• Промывка
колонки
(необходима
для
удаления
высокомолекулярных
соединений). Через колонку пропускают последовательно 3 мл воды, затем 3 мл
смеси ацетонитрила с 0,1н. раствором НС1 в соотношении 4 : 6, после чего 3 мл
гексана.
• Элюирование.
Через колонку под вакуумом со скоростью около 1,5 мл/мин, но
не выше 2 мл/мин пропускают 3 мл смеси этилацетат— гексан (1 : 1).
• Органическую фазу собирают в концентрационную чашку и выпаривают
досуха*. Сухой остаток исследуют различными аналитическими методами.
ПРИМЕЧАНИЕ:
разрушения
При выпаривании
не следует
допускать
перегревания
во
избежание
каннабиноидов!
3.5. Хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ)
3.5.1. Краткая характеристика
метода
Метод хроматографии в тонком слое сорбента основан на принципе
сорбции/десорбции веществ в закрепленном слое сорбента при их перемещении
подвижной жидкой фазой.
кремниевая
В качестве сорбентов используются силикагели,
кислота, оксид алюминия и др., которые закрепляются
специальных
пластинах
(подложках),
изготавливаемых
из
на
стекла,
пластифицированной целлюлозы, алюминиевой фольги и политерефталата
(ПТФ). В слой сорбента дополнительно может быть введена флюоресцирующая
добавка. ТСХ
используется
для дополнительной
очистки
определяемых
веществ, их изолирования и обнаружения, а в модифицированном виде и для
подтверждающего исследования каннабиноидов.
3.5.2. Подготовительные
операции
Хроматографическое
разделение
(проявление
или
элюирование)
производят в герметично закрытых стеклянных камерах. Для обеспечения
герметичности
прилегания
крышки
шлиф
силиконовой смазкой или очищенным вазелином.
12
обрабатывают
вакуумной
Приготовление хроматографических систем. Отмеривание компонентов
смеси производится с помощью пипеток, мерных пробирок или цилиндров (не
менее 2-го класса точности). Смешивание компонентов осуществляют в
мерных
цилиндрах
хроматографической
или
камере
пробирках
со
шлифом.
{Перемешивание
в
недопустимо!).
Состав рекомендуемой смеси для хроматографического разделения:
гексан - изобутиловый спирт - ледяная уксусная кислота (18 : 1,8 : 0,2).
Приготовленную смесь растворителей переносят в хроматографическую
камеру, которую закрывают крышкой и насыщают парами растворителей не
менее 30 мин. Хроматографическая система может использоваться не более 4-х
- 5-ти раз.
Для исследования методом ТСХ используются извлечения, полученные
путем гидролиза с последующей жидкость-жидкостной или твердофазной
экстракцией.
Нанесение пробы. Сухой остаток, полученный из исследуемого образца
после
проведения пробоподготовки, растворяют в 100 мкл этилацетата или
хлороформа и наносят с помощью пастеровской пипетки на стартовую линию
хроматографической
пластины
в
одну
точку
несколькими
порциями,
высушивая каждую порцию в токе воздуха, на расстоянии не менее 10 мм от
нижнего края и не менее 15 мм от бокового края. Одновременно на пластину
наносят 10 мкг метчика гашиша или марихуаны в виде спиртового раствора.
Пластину высушивают до удаления запаха растворителей и помещают в
подготовленную хроматографическую камеру. Фронт растворителей не должен
подниматься выше 5 мм от верхнего края пластины.
После проявления пластину извлекают из камеры и высушивают в токе
воздуха до полного удаления запаха растворителей.
3.5.3. Идентификация
веществ
Пластину обрабатывают свежеприготовленным
0,1%-ным
раствором
прочного синего Б в 70%-м этиловом спирте с последующим напылением 1%13
го водного раствора NaOH. При этом в зоне метчика отмечают пятна,
окрашенные в красно-фиолетовый и оранжевый цвет с Rf от 0,3 до 0,7.
Идентификацию ТГК-СООН производят по наличию в зоне исследуемого
раствора пятна красно-фиолетового цвета, а также по соответствию его длины
пробега (Rf) в сравнении со стандартным веществом.
Предел обнаружения каннабиноидов методом хроматографии в тонком
слое составляет 40 мг/л.
3.6.
Газожидкостная
хроматография
с
масс-спектральным
детектированием (ГХ/МС)
3.6.1. Краткая характеристика
Метод
представляет
метода
собой
сочетание
газохроматографического
разделения веществ с последующим детектированием их масс-спектральных
характеристик. Газожидкостная хроматография основана на принципе сорбции
веществ неподвижной жидкой фазой и дальнейшей их десорбции потоком газаносителя. Неподвижная жидкая фаза наносится на твердый носитель (набивные
колонки) или на стенки тонкого стеклянного капилляра (капиллярные колонки).
Способ масс-спектрометрического детектирования основан на регистрации
ионизированных молекул веществ. При этом измеряется отношение массы
заряженных частиц материи к их заряду. Ионизация молекул анализируемого
вещества производится в вакууме или атмосфере газов. Для ионизации
применяются
различные
процессы
возбуждения
(электронный
удар,
химическая ионизация, полевая ионизация и др.), после чего ионы разделяют и
идентифицируют. Разделение ионов основано па их разных траекториях
движения
в
магнитном
либо
электростатическом
полях.
Регистрация
заряженных частиц производится с помощью фотоумножителей. Обработка
сигналов производится с помощью персонального компьютера (ПК).
14
3.6.2. Подготовительные
Исследуются
полученные
операции
извлечения
из
образцов
биологических
путем гидролиза с последующей
твердофазной
экстракцией.
Извлечение
концентрационной чашке, к сухому остатку
диметилсульфоксида
гидроксида
и
40
мкл
жидкость-жидкостной
выпаривают
или
досуха
в
добавляют 180 мкл безводного
25%-го
в метаноле. Пипеткой
жидкостей,
раствора
перемешивают
тетраметиламмония
содержимое
чашки
с
нанесением его на стенки. Через 2 минуты добавляют 40 мкл йодметана и смесь
переносят в подготовленную экстракционную тубу на 12 мл. Выдерживают 20
минут при комнатной температуре, после чего добавляют 4 мл гексана и
экстрагируют на планетарном шейкере при 120 об./мин в течение 10 минут
однократно.
Гексановый
экстракт
отделяют
в
подготовленную
концентрационную чашку и упаривают досуха в токе теплого воздуха.
Полученный сухой остаток растворяют в 105 мкл этилацетата, смывая по
стенкам чашки. Аликвоту извлечения (100 мкл) переносят в виалу, которую
закрывают
крышкой
и
помещают
в
автоматический
пробоотборник
хроматографа, оснащенного масс-спектрометрическим детектором.
3.6.3. Условия разделения
Капиллярная кварцевая колонка
диаметр
0,25
мм,
толщина
DB-5 MS, длина 30 м, внутренний
фазной
пленки
0,25
мкм
(5%
фенилметилполисилоксана).
Газ носитель - гелий, давление на входе в колонку 3 пси; скорость газа
через систему очистки 15 мл/мин в течении 2 мин; скорость в системе
регулирующего клапана 19,6 мл/мин; скорость потока газа через колонку 1,0
мл/мин.
Ввод пробы в автоматическом режиме; объем пробы 1мкл, режим ввода с
разделением потока 1:4.
Температура инжектора 250° С, температура колонки изменяется Е
программируемом режиме: начальная температура 75° С поддерживается
15
постоянно 2 мин, далее увеличивается со скоростью 15 град/мин до 280° С и
поддерживается постоянной в течении 15 мин. Длительность исследования 30,67 мин.
Температура интерфейса 280° С, температура квадруполя
150° С,
температура масс-детектора 230° С.
3.6.4. Схема анализа:
Перед
проведением
исследования
пробы
анализируемого
вещества
необходимо:
1. Проверить «остаточную память» колонки, для чего производится
анализ растворителя, используемого для растворения сухого остатка.
2. Проверить
стабильности
детектирующей
системы,
реконструирующего
Повторить
параметров
для
раствора,
исследование
хроматографической
чего
производится
содержащего
2-3
раза
с
внутренний
целью
и
анализ
стандарт.
определения
воспроизводимости времени удерживания и площади пика внутреннего
стандарта.
3. Произвести анализ холостой
пробы с целью выявления эндогенных
соединений.
Запись хроматограммы начинается с 4-й мин после ввода пробы.
Регистрацию производят в режимах Total Ion и Spectrum.
Детектирование
ионов проводят при энергии электронной ионизации
70эВ, режим сканирования ионов от 1,6-800 а.е.м., скорость сканирования 5200 а.е.м./с, с шагом 0,1 а.е.м.
Хроматограмму
анализируемой
пробы
обрабатывают
с
помощью
специализированной компьютерной программы, оснащенной библиотеками
масс-спектров PMW Тох 3, Wiley7, NIST 05, Structures NIST 05, Palisade
Complete 600K.
16
3.6.5 Оценка
результатов
Идентификацию
обнаруженных
веществ
проводят
сравнивая
с
библиотечными данными времена удерживания характеристических ионов
исследуемых
веществ
биологического
достоверностью
в анализируемой
материала.
более
При
75%,
аликвоте
наличии
дается
извлечения
характеристических
заключение
об
из
пробы
ионов
с
обнаружении
каннабиноидов.
Предел обнаружения каннабиноидов методом газовой хромато-массспектрометрии - 5,0 нг/мл (мкг/л).
4. ОБОРУДОВАНИЕ И М А Т Е Р И А Л Ы
4.1. Средства измерения и вспомогательные
устройства
- Баня водяная с регулировкой температуры;
- Вакуумный насос KNF 022AN/18 или аналогичный;
- Весы лабораторные аналитические с погрешностью взвешивания ±0,0001 г;
- Весы лабораторные с погрешностью взвешивания ±0,01 г;
- Виалы с завинчивающимся колпачком на 2 мл;
- Воронки конические, диаметром 5 см;
- Вставки в виалу, стеклянные на 100 мкл, 500 мкл.
- Газовая арматура (трубопроводы, редуктор, скобы, штуцера, хомуты и
др-);
- Газовый хроматограф с масс-детектором;
- Дозатор пипеточный с переменным объемом 2 - 2 0 мкл;
- Дозатор пипеточный с переменным объемом 20-200 мкл;
- Камеры хроматографические стеклянные объемом 500 мл;
- Колба коническая из термостойкого стекла объемом 1000 мл;
- Колба мерная 2а-1000-2 по ГОСТ 1770-74;
17
- Колба мерная 2а-100-2 по ГОСТ 1770-74;
- Колба мерная 2а-25-2 по ГОСТ 1770-74;
- Миксер ротационный;
- Пипетка градуированная 2-1-2-5 по ГОСТ 29227-91;
- Пипетка пастеровская;
- Пробирка мерная объемом 10 мл со шлифом и притертой пробкой;
- рН-метр лабораторный;
- Секундомер по ГОСТ 5072-79;
- Стаканы по ГОСТ 23932-90;
- Станция
управления
и
сбора
хроматографических
данных
на базе
компьютера Pentium 5;
- Флаконы экстракционные БСС 25;
- Флаконы экстракционные объемом 12 мл;
- Холодильник-морозильник по ГОСТ 16317-95;
- Центрифуга лабораторная типа СМ 6 с бакет-ротором диаметром 180 мм;
- Цилиндр 1-100-2 по ГОСТ 1770-74;
- Цилиндр 1-50-2 по ГОСТ 1770-74;
- Цилиндр 1-10-2 по ГОСТ 1770-74;
- Чашка выпарительная, фарфоровая №3;
- Чашка концентрационная, стеклянная, объемом 10 мл;
- Шейкер планетарный;
- Шпатель по ГОСТ 9147-80.
4.2. Реактивы и материалы
-
Ацетоиитрил, х.ч.;
- (3-глюкуронидаза;
- Гексан, х.ч.;
- Гелий газообразный (сжиженный) очищенный марки «А»;
- Диметилсульфоксид безводный, х.ч.;
18
- Дихлорметан (хлороформ), х.ч.;
- Йодометан стабилизированный;
- Калий двухромовокислый, х.ч.;
- Калий фосфорнокислый однозамещенный безводный, х.ч.;
- Кислота серная концентрированная, х.ч.;
- Кислота соляная концентрированная, х.ч.;
- Кислота уксусная ледяная, х.ч.;
- Натрия гидроокись, х.ч.;
- Натрий фосфорнокислый двузамещенный двухводный, х.ч.;
- Пластины хроматографические, тип сорбента - силикагель зернением 8 12 мкм, толщина слоя 100 мкм;
- Соль прочный синий Б, ч.;
- Спирт изобутиловый, х.ч.;
- Спирт метиловый, х.ч.;
- Спирт этиловый ректифицированный зерновой для медицинских целей,
95 - 96 %;
- Тест-полоски на основе моноклональных антител;
- Тетраметиламмония гидроксид, 25%-ный раствор в метаноле, х.ч.;
- Триметилхлорсилан (TMCS);
- Уксусно-этиловый эфир (этилацетат), х.ч.;
- Фильтры беззольные d = 9 см «синяя лента».
4.3. Стандартные вещества сравнения
ТГК, Р > 99 %,
11-ОН-ТГК,Р>99%,
11 -ТГК-СООН, Р > 99 %.
19
5. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАКТИВОВ
5.1. Приготовление «хромпика».
Взвешивают 50 г калия двухромовокислого (с точностью 0,01 г) и
переносят в коническую колбу из термостойкого стекла, прибавляют 200
мл дистиллированной воды и перемешивают до полного растворения;
малыми порциями (~ 20 мл) добавляют 500 мл концентрированной
серной кислоты при охлаждении и периодическом перемешивании.
5.2. Приготовление 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,8 - 7,0.
Взвешивают (с точностью 0,01 г) 3,63 г калия фосфорнокислого
однозамещенного безводного и 7,13 г натрия фосфорнокислого
двузамещенного двухводного. Навески переносят в мерную колбу
объемом 1000 мл, растворяют в небольшом объеме дистиллированной
воды, доводят до метки и перемешивают.
5.3. Приготовление 0,1 и. раствора соляной кислоты.
Отмеривают 8,5 мл концентрированной соляной кислоты (плотность
1,19), помещают в мерную колбу на 1000 и разбавляют водой до метки,
после чего перемешивают.
5.4. Насыщенный раствор гидроокиси натрия.
Взвешивают 70 г (с точностью 0,01 г) гидроокиси натрия, переносят в
коническую колбу емкостью 100 мл и добавляют при перемешивании 50
мл дистиллированной воды, нагретой до 50° С, перемешивают до полного
растворения; после охлаждения раствор фильтруют через складчатый
бумажный фильтр («синяя лента»). Раствор хранится в склянке из
темного стекла с притертой пробкой.
5.5. Приготовление 0,1 н. раствора гидроокиси натрия.
Взвешивают 4,5 г (с точностью 0,01 г) гидроокиси натрия, переносят в
коническую колбу емкостью 100 мл с притертой пробкой и добавляют
при перемешивании 5 мл дистиллированной воды. Колбу закрывают
пробкой и оставляют до следующего дня. Прозрачную жидкость сливают
с осадка, переносят в мерную колбу объемом 1000 мл, разводят
дистиллированной водой до метки и перемешивают. Раствор хранится в
склянке с притертой пробкой.
5.6. Приготовление 1 %-ного раствора гидроокиси натрия.
Взвешивают 1,0 г (с точностью 0,01 г) гидроокиси натрия, переносят в
коническую колбу на 100 мл и растворяют в небольшом объеме
дистиллированной воды (~ 50 мл), после растворения объем доводят
водой до 100 мл. Раствору дают отстояться и надосадочную жидкость
сливают. Раствор хранится в склянке с притертой пробкой.
20
5.7. Приготовление 5 %-ного раствора тримстилхлорсилана (TMCS) в
толуоле.
Взвешивают 5,0 г (с точностью 0,01 г) триметилхлорсилана, переносят в
мерную колбу объемом 100 мл и разводят толуолом до метки,
перемешивают. Раствор хранится в склянке с притертой пробкой при
температуре не выше + 8° С.
5.8. Приготовление 70 %-ного раствора этилового спирта.
Отмеривают 737 мл этилового спирта 95 - 96 %, помещают в коническую
колбу и добавляют 288 мл дистиллированной воды, перемешивают.
Количество компонентов рассчитано на приготовление раствора при
температуре 20° С.
5.9. Приготовление 0,1 %-ного раствора соли прочного синего Б в 70 %ном этаноле.
Взвешивают 0,01 г (с точностью 0,0001 г) соли прочного синего Б,
помешают в мерную пробирку объемом 10 мл со шлифом и добавляют
70%-ный раствор этанола до 10 мл, перемешивают до полного
растворения. Используют свежеприготовленный раствор.
5.10. Приготовление растворов внутреннего стандарта в метаноле.
Взвешивают 0,002 г (с точностью 0,0001 г) ТГК, 11-ОН-ТГК или ТГКСООН, помещают в мерную колбу на 100 мл со шлифом и добавляют
метиловый спирт «для хроматографии» до половины объема,
перемешивают, доводят метиловым спиртом до метки, перемешивают.
Раствор хранится в склянке с притертой пробкой при температуре не
выше + 8° С.
21
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ЭТАПОВ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЙ ИНТОКСИКАЦИИ,
ВЫЗВАННЫХ УПОТРЕБЛЕНИЕМ КАННАБИНОИДОВ
1. Оценка клинических признаков интоксикации
Стадия интоксикации
Клинические признаки
Тревога разной степени выраженности, повышенная
пугливость, расширение зрачков, покраснение лица, дрожь в
руках, сухость слизистых полости рта.
Эйфория. Возникают расстройства мышления: не только по
Вторая стадия
форме, но и по содержанию. Воспринимаются и
перерабатываются лишь случайные внешние события, что
свидетельствует о сужении сознания. Отмечаются блеск глаз,
учащение пульса, подъем артериального давления, оживление
сухожильных рефлексов, шаткость походки, горизонтальный
установочный нистагм.
Психотическое состояние со спутанностью, бессвязностью
Третья стадия
мышления
и
отрывочным
бредом.
Отмечается
малоподвижность, отрешенность от окружающего. Кожные
покровы лица бледные, усиливается потливость, снижается
температура тела, продолжает повышаться артериальное
давление.
Вялость, слабость, бледность, заторможенность, апатичность;
Четвертая стадия
(выход
го
гашишного появляются повышенный аппетит и постоянная жажда.
опьянения)
Первая стадия
2. Этапы лабораторного химико-токсикологического исследования
Отбор образцов.
Разделение на алнквоты
отрицательный
результат
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Предварительное
исследование
иммунохимическим
методом
положительный
результат
ферментативный
гидролиз
I
щелочной
гидролиз
I
И
Показатели диагностической чувствительности, специфичности,
эффективности, предсказательной ценности отрицательного и
положительного результатов методов исследования
каннабиноидов
дч, %
дс, %
дэ, %
ПЦ+, %
ПЦ-, %
ИХ
98
93
96
94
98
тех
гх/мс
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
Методы
ДЧ - диагностическая
чувствительность
ДС - диагностическая
специфичность
ДЭ - диагностическая
эффективность
(ПЦ+) - предсказательная ценность положительного
(ПЦ-) - предсказательная ценность отрицательного
результата
результата