учебно-методическое пособие молекулярной биологии
реклама
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «ЮЖНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» АКАДЕМИЯ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ КАРАПЕТЬЯН О.Ш., ВЕЧКАНОВ Е.М., СОРОКИНА И. А. УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ к проведению лабораторных работ и контроля самостоятельной работы студентов по МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ для студентов дневного и очно-заочного отделений Академии биологии и биотехнологии направление 060301 – Биология Ростов-на-Дону 2015 1 УДК 577.21 Рецензент: д.б.н., профессор кафедры генетики ЮФУ Шкурат Т.П. Одобрено на заседании учебно-методической комиссии кафедры биохимии и микробиологии. Печатается по постановлению редакционной комиссии по биологическим наукам Академии биологии и биотехнологии ЮФУ. К.б.н., ассистент кафедры биохимии и микробиологии Карапетьян О.Ш. К.б.н., доцент кафедры биохимии и микробиологии Вечканов Е.М. К.б.н., доцент кафедры биохимии и микробиологии Сорокина И.А. Учебно-методическое пособие к проведению лабораторных работ и контроля самостоятельной работы студентов по молекулярной биологии Академии биологии и биотехнологии ЮФУ. / О.Ш. Карапетьян, Е.М. Вечканов, И.А. Сорокина, Ростовна-Дону: Изд-во ЮФУ, 2015. 100с. Издание подготовлено при финансовой поддержке Министерства науки и образования РФ (грант «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы)» № 2.1.1/5628). Методические указания предназначены для проведения лабораторных работ и контроля самостоятельной работы студентов по общему курсу «Молекулярная биология». Для студентов дневной и очно-заочной форм обучения направления 060301-биология. 2 СОДЕРЖАНИЕ № модуля 1 2 3 Название модуля СТРОЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ. АНАТОМИЯ ГЕНОМА МЕХАНИЗМЫ РЕПЛИКАЦИИ И РЕПАРАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ. РЕКОМБИНАЦИЯ, РЕСТРИКЦИЯ И МОДИФИКАЦИЯ ДНК ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД. ТРАНСКРИПЦИЯ. БИОСИНТЕЗ БЕЛКА. Тема Стр Содержание модуля №1 4 Лабораторная работа № 1 «Выделение и фракционирование нуклеиновых кислот эукариот. Солевая экстракция ДНК» 6 Лабораторная работа № 2 «Определение концентрации и качества препаратов нуклеиновых кислот методом спектрофотометрии» 15 Домашняя контрольная работа к модулю №1 21 Темы докладов к модулю №1 22 Лабораторная работа № 3 «Полимеразная цепная реакция» 25 Лабораторная работа № 4 «Ферментативный гидролиз нуклеиновых кислот» Домашняя контрольная работа к модулю №2 55 64 Вопросы по теме модуля №2 65 Тема: «Определение первичной нуклеотидной последовательности ДНК (секвенирование по Сэнджеру)» 68 Лабораторная работа № 5 «Агарозный гель-электрофорез ДНК». 84 Тема «Масс-спектрометрия белков и нуклеиновых кислот». Домашняя контрольная работа к модулю №3 Вопросы по теме модуля №3 Список литературы 88 109 112 113 3 МОДУЛЬ 1. СТРОЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ. АНАТОМИЯ ГЕНОМА. Содержание модуля №1. Молекулярная биология в системе биологических наук. Связь молекулярной биологии с биохимией, биофизикой, цитологией, генетикой, микробиологией, вирусологией. Основные этапы возникновения и развития молекулярной биологии. Появление геномики и протеомики. Использование достижений молекулярной биологии в медицине и народном хозяйстве. Роль молекулярно - биологических исследований в возникновении биотехнологии, генодиагностики, генотерапии и геномной дактилоскопии, а также в изучении молекулярных основ эволюции, дифференцировки, биоразнообразия, развития и старения живых систем. Историческая справка. Центральная догма молекулярной биологии. Открытие ДНК Фридрихом Мишером. Эксперименты Эвери, Мак-Леода и МакКарти. Общая схем эксперимента Херши и Чейз. Открытие Эрвина Чаргаффа. Исследования Розалинд Франклин и Мориса Уилкинсона. Трехмерная модель ДНК Джеймса Уотсона и Фрэнсиса Крика. Молекулярная организация генетического материала биологических систем. Первичная структура нуклеиновых кислот. Структурные компоненты нуклеиновых кислот. Связь между нуклеотидами в полинуклеотидной цепи. Конформация комплементарности компонентов азотистых нуклеиновых оснований. кислот. Природа Сущность межплоскостных взаимодействий. Макромолекулярная структура нуклеиновых кислот и ее уровни. Понятие полиморфизма ДНК. Альтернативные формы двойной спирали ДНК. Характеристика и условия возникновения некоторых конформационных состояний ДНК: А-, В-, С-, D-, Z- и Е- формы. Физико – химические свойства нуклеиновых кислот. Денатурация и реассоциация нуклеиновых кислот. Гиперхромный эффект. Методы молекулярной гибридизации. Понятие молекулярных зондов. Блоттинг, его виды и практическое значение. 4 Пространственная организация РНК. Стабилизация вторичной структуры. Третичная структура однотяжевых РНК. Транспортная РНК. Особенности первичной структуры. Характеристика структуры «клеверный лист». Структура антикодоновой петли. Структурно – функциональная организация рибосомальных РНК. Матричные РНК. Специфика строения мРНК эукариот. 5' – и 3’ – нетранслируемые области. Гетерогенная ядерная РНК (гяРНК). U – РНК млекопитающих. Малые цитоплазматические РНК. Концепция «мир РНК». Роль различных РНК в основных молекулярно биологических процессах. Переход от РНК к ДНК – миру. Понятие генома, транскриптома, протеома и метаболома. Понятие гена. Гены домашнего хозяйства и гены роскоши. Содержание нуклеиновых кислот в геномах в филогенезе. Разнообразие форм ДНК. Биологическая роль искривления ДНК. Исключения из общего принципа возрастания генетического материала в расчете на геном с усложнением организации и их возможные причины. Парадокс С. Разнообразие структур нуклеиновых кислот в геномах вирусов и фагов. Типы генетического материала и механизм его репликации у различных вирусов. Стратегии бактериофагов. Случаи перекрывания генов. Структура генома ретровирусов. Жизненный цикл ретровирусов. Вироиды и вирусоиды. Геном прокариот. Структура бактериальной хромосомы. Суперспирализация. Топоизомеразы, их типы. Функции топоизомераз. Катенаны. Структура прокариотических генов. Бактериальные плазмиды. Структура генома эукариот. Хромосомы эукариот. Уровни компактизации хроматина. Эу- и гетерохроматин. Типы последовательностей в эукариотическом геноме. Основной и сателлитные компоненты. Классификация, структура и локализация сателлитных фракций. ДНК – фингерпринтинг. Уники и повторы в генетическом материале. Палиндромы, их разнообразие по структурам и функциям. Биологические функции разных классов повторяющихся последовательностей. Гипотеза «эгоистичности» избыточной геномной ДНК. Сущность концепции «альтруистической ДНК Патрушева (1997). Структура эукариотических генов. 5 ДНК цитоплазматических структур. ДНК митохондрий, особенности организации. Кинетопластная ДНК. Характеристика ДНК хлоропластов. Открытие мозаичной организации генов вирусов животных и др. эукариот. Экзоны и интроны, вариабельность их числа и размеров в разных генах. Понятие сплайсинга. Виды сплайсинга. Молекулярные механизмы сплайсинга. Понятие сплайсосомы. Мутации, ведущие к нарушению сплайсинга и их последствия. Функции интронов. Роль интрон – экзонной организации генов в эволюции геномов. Нестабильность генома. Элиминация и амплификация структур генетического материала. Инсерционные последовательности (IS – элементы) и транспозоны (Tn) в геномах прокариот. Способы транспозиции и ее последствия. Свойства транспозонов. Мигрирующие генетические элементы эукариот. Молекулярная организация подвижных генетических элементов, их виды и биологическое значение. Характеристика классических Tn эукариот: мобильные элементы, ограниченные инвертированные повторы (Р – элементы дрозофилы, Ас – элементы кукурузы), транспозоны Fb – семейства. Ретротранспозоны и их виды. Роль обратной транскрипции в транспозиции. Ретропозоны, особенности их интеграции в геном. Типы ретропозонов (псевдогены, короткие и длинные повторяющиеся элементы позвоночных). Понятие ретропозиции. Биологическая роль мигрирующих генетических элементов. Интегроны и генные кассеты. Лабораторная работа № 1. «Выделение и фракционирование нуклеиновых кислот эукариот» Процедура выделения ДНК из клеток и тканей часто является исходным (основным) этапом в исследовании живого организма на молекулярном уровне. Многие приложения, такие как амплификация, проведение обратной транскрипции, детектирование накопления продуктов амплификации методом ПЦР в реальном времени, клонирование, секвенирование, гибридизация, синтез 6 ДНК и т. д., не могут быть выполнены непосредственно на биологических образцах без предварительной очистки нуклеиновых кислот. Выделение (экстракция) нуклеиновых кислот определенными трудностями, связанными с эукариот особенностями сопряжено с молекулярной структуры ДНК и РНК, их функциями и внутриклеточной локализацией. Для выделения геномной ДНК клетку необходимо разрушить тем или иным способом, а ДНК очистить от других клеточных компонентов. Прежде всего, нужно отделить ДНК от белков, входящих в состав нуклеопротеидных комплексов хроматина. При этом важно защитить ДНК от действия нуклеаз и максимально сохранить ее целостность, поскольку длинные линейные молекулы ДНК при их изоляции из клетки неизбежно фрагментируются. Методы выделения ДНК условно делят на аналитические и препаративные, что зависит от количества требуемой ДНК. Эти методы различаются величиной навесок исходного материала, объемами растворов реагентов. Главное условие строгое соблюдение исходно установленных соотношений навесок и объемов реагентов. Выбор методики выделения ДНК зависит от поставленной задачи, времени анализа и степени очистки. Можно выделить ряд приоритетных требований, которые должны обеспечивать методы выделения ДНК или РНК: – лизис биологического материала; – селективную экстракцию (сорбцию); – концентрирование из больших объемов; – отделение компонентов, которые ингибируют ПЦР; – разделение ДНК и РНК; – высокий процент выхода; – возможность калибровки и положительного контроля; – отсутствие контаминации; – малые временные затраты; – возможность автоматизации. Методы выделения нуклеиновых кислот можно разделить по основным физическим и биохимическим признакам на следующие классы: – жидкофазные методы; – твердофазные методы. 7 Жидкофазные методы. Классические методы выделения. Классические методы выделения нуклеиновых кислот из сложных исходных образцов, таких как кровь или ткани, включают в себя лизис биологического материала детергентами или хаотропными агентами иногда в присутствии разрушающих белки ферментов. Для лизиса клеток и денатурации белков часто используется детергент додецилсульфат натрия. После этого этапа следуют несколько стадий, в которых используются органические растворители, такие как фенол и/или хлороформ или этанол. Некоторые методики для освобождения ДНК от белков хроматина предусматривают использование протеиназ. Полное отделение белков от нуклеиновых кислот может быть достигнуто добавлением перхлората натрия. Вместе с ДНК частично выделяется и РНК, от которой избавляются с помощью фермента РНКазы. В случае отделения РНК от ДНК необходимо селективное инкубирование с хлоридом лития или специфичное безнуклеазное изолирование с гуанидинхлоридом или гуанидинтиоцианатом, скомбинированное с фенольной экстракцией или этанольной преципитацией. вероятность деградации нуклеиновых Такие методы увеличивают кислот, потери образца или кросс- контаминации образцов, если несколько проб обрабатываются одновременно. При выделении РНК очень велик риск контаминации со стороны присутствующей в исходном образце ДНК. Стандартная методика получения чистого препарата основана на том, что ДНК является полярной молекулой и не растворяется в органических растворителях. Традиционно для выделения ДНК используется фенол-хлороформная экстракция. При перемешивании клеточного лизата и фенола формируются две фазы. ДНК находится в верхней (водной) фазе, а денатурированные белки — в нижней (органической) фазе. Однако этот метод ориентирован на работу с такими агрессивными веществами, как фенол и хлороформ, и присутствуют стадии центрифугирования и жидкостной экстракции, которые нельзя автоматизировать. Выделить ДНК из животных тканей значительно проще, чем из растительных, так как ее удельное содержание в животных клетках (0,25 % массы клетки, например, у млекопитающих) в среднем выше, чем в растительных (0,01-0,1 %). При классическом способе выделения ДНК из тканей растений важное значение имеет эффективное разрушение клеточных стенок. Часто приходится находить компромисс между размером ДНК и ее количественным выходом. Высвобождение 8 высокомолекулярной ДНК из растительных клеток – это только часть задачи, так как растительные экстракты содержат большие количества белков, полисахаридов, танинов и пигментов, которые в ряде случаев весьма трудно отделить от ДНК. Такие вещества, как гликоалкалоиды, танины, фенолы, ряд катионов тяжелых металлов способны ингибировать широко распространенные в практике молекулярной биологии, но весьма «прихотливые» к составу реакционной среды ферменты (рестриктазы, лигазы, ДНК-полимеразы). В таком случае использование экстрагированной ДНК становится невозможным. Поэтому очистка ДНК от низкомолекулярных соединений, которую производят путем переосаждения (перекристаллизации) нуклеиновой кислоты спиртом, является обязательным этапом (или несколькими этапами) выделения ДНК из растительных тканей. Известны методы, согласно которым можно выделить одновременно и ДНК, и РНК из одного источника. При этом используются сильные хаотропные агенты, такие как гуанидинтиоцианат и цезия трифлуороацетат для одновременного разрушения клеточных мембран и инактивации внутриклеточных рибонуклеаз (РНКаз). Лимитирующими факторами таких методик являются необходимость ультрацентрифугирования и большое время анализа (16–44 ч). Методы одновременного выделения ДНК и РНК, в которых не присутствует операция центрифугирования, имеют преимущество еще и потому, что фенол действует как эффективный депротеинизирующий агент, разрушающий клетки и денатурирующий белки [6, 15]. Для эффективного отделения высокомолекулярной ДНК от РНК сначала производится фенольная экстракция, а затем две фенолхлороформные экстракции для одновременного удаления белков и липидов из раствора, содержащего нуклеиновые кислоты. Препарат выделенной ДНК (учитывая вероятное присутствие, а нем ферментов, способных разрушать нуклеиновые кислоты, а также особенности молекулярной структуры ДНК) рекомендуется хранить в замороженном состоянии. Причем замораживание препарата следует проводить при температуре -56°С и ниже, чтобы он не сопровождался кристаллизацией и льдообразованием, что может стать причиной разрывов нитевидных молекул ДНК. Для таких целей можно использовать специальные низкотемпературные морозильные камеры - криогенераторы, криостаты или кельвинаторы. Препарат ДНК можно хранить и в бытовой морозильной камере (-18 С) при условии, что размораживание будет 9 проводиться нечасто. Другой способ - хранение ДНК в виде осадка в неводной среде, чаще всего под 70%-ным этанолом. Спиртовой осадок ДНК компактен и практически не подвержен механическому и ферментативному разрушениям, так как подавляющее большинство ферментов неактивно в спиртовом растворе. Количественная и качественная оценка образца полученной ДНК осуществляется при последующей стандартной процедуре электрофореза ДНК в агарозном геле путем визуального сравнения с образцами известной концентрации. Спектрофотометрическое определение дает более точную характеристику препарату ДНК Твердофазные методы: основные принципы. В твердофазных методах выделения нуклеиновых кислот используются следующие процессы и принципы: а) водородные связи с немодифицированной гидрофильной матрицей, обычно кварцем, в хаотропных условиях; б) ионообмен в водном растворе, обычно с использованием анионообменников; в) аффинность; г) механизмы исключения по размеру. Твердофазные системы, адсорбирующие нуклеиновые кислоты, — это частицы на основе кварца, стеклянные волокна, анионообменные носители, которые используются в хроматографических сепарационных колонках. Эти носители применяются для выделения высококонцентрированными или растворами очистки нуклеиновых хаотропных солей кислот (йодид с натрия, перхлорат натрия, гуанидин тиоцианата). Описано применение диатомовой земли в качестве сорбента, в этом случае связывание также происходит в присутствии хаотропной соли. Другие методы основаны на совместной детергенции с материалами, связывающими нуклеиновые кислоты, или на использовании твердого сорбента со связывающими нуклеиновые кислоты функциональными группами в сочетании с полиэтиленгликанами и солями в высокой концентрации. Известна группа методов пробоподготовки, основанная на использовании ионообменников типа Chelex, cорбирующих примеси, мешающие ПЦР. Однако эти методы в большинстве случаев не могут удалить все возможные примеси, поэтому их применение довольно ограничено. Твердофазные методы: метод на основе магнитной сепарации. Использование магнитных твердых носителей в биохимических и молекулярно 10 биологических процессах имеет много преимуществ по сравнению с немагнитными сепарационными методами. Обычно магнит прикладывается к стенке сосуда, содержащего образец, чтобы частицы агрегировали у стенки сосуда, а остаток образца можно было убрать. Таким способом можно отделять компоненты клеточного лизата, которые ингибируют ДНК-полимеразу и ПЦР-реакцию, например, полисахариды, фенольные компоненты, гумус. Для процесса выделения используются магнитные носители с иммобилизированными аффинными лигандами или изготовленные из биополимера, увеличивающего аффинность к нужной нуклеиновой кислоте. Магнитные носители имеются в продаже или могут быть изготовлены в лаборатории. Магнитные частицы производятся из различных синтетических полимеров, биополимеров, пористого стекла или на основе неорганических магнитных материалов, таких как оксид железа с модифицированной поверхностью. Особенно подходят для выделения суперпарамагнитные частицы, которые не взаимодействуют друг с другом в отсутствие магнитного поля. Эти частицы приобретают магнитный момент в сильном магнитном поле, но не сохраняют постоянного магнетизма, когда поле убирают. Если устранены магнитная агрегация и слипание частиц, то в течение реакции достигается суспензирование частиц и единообразная экстракция нуклеиновых кислот. Для автоматического выделения нуклеиновых кислот используются магнитные частицы со стеклянным покрытием. Нуклеиновая кислота связывается со стеклянной поверхностью, затем связанная с частицами она проходит ряд стадий экстракционного процесса: после серии отмывок в пробе остается нуклеиновая кислота, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации, его можно воспроизвести на роботизированных пипеттирующих рабочих станциях. Однако возможны потери продукта вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Валовые ДНК и РНК выделяются с помощью одних и тех же магнитных частиц. Чтобы отделить РНК от ДНК, РНК уничтожается до стадии сепарации ДНК. Наилучшим вариантом является добавление РНКазы или щелочи. Наоборот, 11 РНК может быть выделена при разрушении ДНК дезоксирибонуклеазой (ДНКазой). Некоторые автоматизированные приборы с использованием магнитных частиц уже применяются для подготовки образцов в лабораториях. В настоящее время разработан ряд приборов для выделения нуклеиновых кислот в автоматическом режиме (рисунок 1). Рис. 1.Этапы автоматического выделения НК при помощи системы MagPurix 12s. Выделение нуклеиновых кислот основано на методе разделения веществ при помощи магнитных шариков: ЗАДАЧА 1. Выделение и фракционирование нуклеиновых кислот эукариот классическими методами: солевая экстракция ДНК из животных организмов с ДДС –Na. Цель работы. Освоить высокосолевой метод выделения ДНК из животных объектов. Принцип метода. Основной принцип солевой экстракции – осаждение белков и липидов на кристаллах ДДС – Na (додецилсульфата натрия), выпадающих в условиях высокой ионной силы. Оборудование и материалы. 1. Микротермостат для микропробирок до 65°С. 3. Микроцентрифуга-вортекс для микропробирок до 10000 g. 4. Весы лабораторные на 0,01 - 10 г. 5. Стеклянные палочки для гомогенизации. 6. Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками. 7. Микропробирки вместимостью 1.5 мл (типа Эппендорф). 12 8. Перчатки латексные неопудренные. 9. Образец свежей животной или растительной ткани для выделения ДНК и РНК. 10. 96%-ный этанол **. 11. Вода дистиллированная. 12. Образец животных тканей массой 100 мг. 8. Лизирующий буфер (содержит 0,4 М NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8, 2 мМ ЭДТА-Na рН 8). 9. 6 М раствор NaCl*. 10. 20%-ный раствор ДДС-Na. 13.Деионнизованная вода. 16. Раствор протеиназы К (20 мг/мл, готовить на стерильной деионизованной воде)**. * - хранить при температуре 2 - 8°С ** - хранить при температуре -18°С Ход работы. 1. Навеску растительной или животной ткани (50-100 мг) помещают в пробирку Эппендорф и добавляют 400 мкл готового лизирующего буфера. Тщательно гомогенизируют биологический материал в лизирующем буфере в течение 20 сек., используя стеклянную палочку. 2. К полученному гомогенату добавляют 40 мкл 20% раствора ДДС – Na и 8 мкл раствора протеиназы К. 3. Содержимое пробирки перемешивают на вортексе в течение 15 сек. 4. Пробирку инкубируют в микротермостате при 65°С в течение 30 мин., периодически перемешивая содержимое. 5. По окончании инкубации в пробирку добавляют 300 мкл 6М NaCl. 6. Содержимое пробирки перемешивают на вортексе в течение 15 сек., затем пробирку центрифугируют 20 мин при 15000 об/мин. 7. Полученный супернатант переносят в чистую пробирку и добавляют равное количество холодного этилового спирта (-18°). 8. Пробирку помещают в морозильную камеру (-18°) на 15 мин. 13 6. После инкубации содержимое пробирки центрифугируют 20 мин. при 10000 об/мин. 9. Сунернатант полностью удаляют. Осадок высушивают в открытых пробирках при 65° С в течение 5-7 мин. 16. К высушенному осадку добавляют 500 мкл деионизованной воды и оставляют растворяться в течение суток при температуре - 70°С. Контрольные вопросы для подготовки к защите лабораторной работы: 1. Заполните таблицу: «Основные методы выделения ДНК»: Метод выделения Этапы выделения Преимущества Недостатки методы метода 2. Какой детергент используют для экстракции ДНК, каково его назначение? 3. Чем отличаются процессы экстракции ДНК из растительных и животных тканей? 4. Почему рН экстрагирующего буфера должен быть равен 8? 5. Для чего используют фенол и хлороформ? 6. Каковы основные этапы выделения и очистки нуклеиновых кислот при использовании методов сорбции? 7. Каково действие гуанидинтиоционата? 8. С какой целью применяется солевой буфер? 9. Какова роль суспензии ионообменников? 14 Лабораторная работа № 2. «Определение концентрации и качества препаратов нуклеиновых кислот методом спектрофотомерии» Довольно выделенной часто ДНК в количественную первом и качественную приближении дают при оценку препарату гель-электрофорезе, следующем, как правило, сразу за процедурой выделения. Для этого визуально сравнивают на соседних дорожках геля интенсивность свечения в ультрафиолете полученного образца концентрацию ДНК, с а образцом также известной степень ее концентрации. чистоты, можно Определить с помощью спектрофотометра, что точнее и быстрее. Для этого измеряют оптическую плотность раствора ДНК при длине волны 260 нм. Для расчета можно воспользоваться калькулятором на интернет-ресурсе MOLBIOL.RU (http://www.molbiol.ru) или других подобных порталах. Спектрофотометрия (абсорбционная) – физико-химический метод исследования растворов и твердых веществ, основанный на изучении спектров поглощения в ультрафиолетовой (200–400 нм), видимой (400–760 нм) и инфракрасной (>760 нм) областях спектра. Основная зависимость, изучаемая в спектрофотометрии – зависимость интенсивности поглощения падающего света от длины волны λ. В соответствии с законом Бугера–Ламберта–Бера оптическая плотность раствора прямо пропорциональна концентрации поглощающего вещества. Нуклеиновые кислоты (НК) поглощают УФ излучение в области 240–290 нм с максимумом при 260 нм. Хромофорами служат азотистые основания НК, особенно пиримидиновые. Пиримидины поглощают УФ свет примерно в 10–20 раз интенсивнее, чем хромофоры белковых молекул – триптофан, тирозин и фенилаланин. Оптическая плотность раствора нуклеиновых кислот при длине волны 260 нм, равная 1, соответствует 50 мкг/мл двухцепочечных ДНК и РНК, 40 мкг/мл одноцепочечных ДНК и РНК и 20 мкг/мл олигонуклеотидов. По известной оптической плотности раствора можно рассчитать концентрацию, мкг/мкл, по соответствующим формулам: для двух цепей полинуклеотидов: ∆А260 х разбавление х 50/1000; для одиночных цепей ДНК: ∆А260 х разбавление х 37/1000; 15 для одиночных цепей РНК: ∆А260 х разбавление х 40/1000; для олигонуклеотидов: ∆А260 х разбавление х 20/1000, где ∆А260 - разница оптических плотностей раствора нуклеиновых кислот и растворителя, которым практически всегда является стерильная деионизованная вода. ∆А260 деионизованной воды равна нулю, и этот ноль используют для установления «оптического нуля» спектрофотометра, работа которого основана на сравнении двух потоков света: один - через растворитель, другой - через раствор. Применение стерильной воды связано с тем, что присутствие в растворителе микрофлоры или ферментов, разрушающих нуклеиновые кислоты (ДНКазы, РНКазы), может привести к получению ошибочных результатов измерений. Разбавление исходных растворов требуется для получения результатов измерений, лежащих в пределах шкалы оптической плотности спектрофотометра, так как с этим связана точность расчета концентраций нуклеиновых кислот. Указанное соответствие, установленное эмпирически, приведено далее (табл. 1). Таблица 1. Точность расчета концентраций нуклеиновых кислот Значение ∆А260 Ошибка, % ~0,005 ~18 ~0,01 ~9 0,1-1,0 ~1,0 0,3-0,7 ~0,3 ˃2,5 Требуется большее разбавление Расчет концентрации олигонуклеотидных праймеров для ПЦР осложняется тем, что конечные данные нужно выразить в молярных, а не массовых единицах, т.е. не мкг/мкл или нг/мкл, а и пкмоль/мкл. Можно точно рассчитать молярную массу каждого из используемых праймеров (для этого имеется ряд специальных компьютерных программ), но, как показывает практика, высокой точности здесь не требуется, вполне достаточно знать число нуклеотидов в праймере и получить соотношение пкмоль: нг из данных, представленных далее (табл.2): 16 Таблица 2. Соотношение пкмоль: нг для разного числа олигонуклеотидов Число звеньев олигонуклеотидов 100 нг соответствуют n пкмолям 15 20 16 18,87 17 17,54 18 16,67 19 15,87 20 14,93 24 12,50 27 11,11 30 10 Качество препарата нуклеиновой кислоты проще всего установить, сняв весь спектр поглощения ее раствора в ультрафиолетовой области (при условии, что полученный раствор бесцветен). Никаких значительных пиков поглощения, кроме пика, полученного при 260 нм, быть не должно, а сам пик при этом должен иметь классическую форму (рис. 2). Рис. 2. Спектры поглощения чистого и загрязненного белками н полисахаридами растворов ДНК: 1 – чистый раствор ДНК; 2 - загрязнении» раствор ДНК 17 Однако это неудобно, так как построение полного спектра поглощения процесс длительный и не может быть использован для массовых измерений. Как показывает практика, вполне достаточно сопоставить значения оптической плотности раствора нуклеиновых кислот, полученные в двух точках: при 260 и 280 нм, где растворы чистой ДНК или РНК поглощают очень мало, зато примеси становятся хорошо «заметными». В частности, водный раствор белка преимущественно поглощает именно при 280 нм, а, следовательно, при увеличении его доли в растворе нуклеиновой кислоты значение ∆А260/∆А280 уменьшается. Белковые примеси практически всегда присутствуют в препаратах высокомолекулярных нуклеиновых кислот, выделенных из природных объектов. Присутствие других примесей, смещающих значение ∆А260/∆А280 в сторону уменьшения ДНК, менее вероятно, но для повышения качества ДНК или РНК в таких препаратах рекомендуется произвести экстракцию примесей фенолом и хлороформом. ДНК и белок незначительно поглощают в области спектра с длиной волны менее 260 нм, но в растворе могут присутствовать и другие соединения, в том числе биогенного происхождения, например, полисахариды. Присутствие в растворе нуклеиновых кислот таких соединений можно выявить по смещению значения ∆А260/∆А280 от оптимального в сторону увеличения, однако избавиться от них полностью практически невозможно. Можно лишь свести их содержание к минимуму путем переосаждения ДНК или РНК из раствора в присутствии высокой концентрации солей (рекомендуется ацетат натрия, калия или аммония, хлорид лития). Таким образом, раствор нуклеиновых кислот считается чистым, т. е. не содержащим белков и других примесей в аналитически значимых количествах, при значениях величины ∆А260/∆А280 в эмпирически установленных пределах 1,8-1,9 для раствора РНК, 1,9-2 для раствора ДНК. Для ПЦР и секвестрования пригодны растворы ДНК со значениями ∆А260/∆А280 равными 1,6-2. Во всех остальных случаях лучше исследовать спектр поглощения более детально или определить параметры чистоты используемых растворов нуклеиновых кислот другими методами. 18 Задача 1. Определение концентрации и качества препаратов нуклеиновых кислот Цель работы. Освоить метод определения концентрации и степени чистоты растворов нуклеиновых кислот методом спектрофотометрии. Принцип метода. Метод основан на регистрации максимума светопоглощения нуклеиновыми кислотами при длине волны 260 нм, который обусловлен присутствием в них азотистых оснований. Оборудование и материалы. 1. Спектрофотометр с комплектом кварцевых кювет вместимостью 1 мл (длина оптического пути 1 см). 2. Растворы ДНК, РНК. олигонуклеотидов (можно использовать, например, препараты, полученные выделением нуклеиновых кислот из природных объектов; смеси олигонуклеотидных праймеров для ПЦР). 3. Коммерческие препараты высокомолекулярных ДНК и РНК. 4. Стерильная деионизованная вода. 1.1. Определение концентрации и качества препаратов геномной ДНК. Ход работы. 1. Для разведения образца геномной ДНК в 50 раз в чистую микропробирку вместимостью 1,5 мл вносят 20 мкл раствора ДНК, добавляют 980 мкл стерильной деионизованной воды и осторожно перемешивают. 2. Переносят спектрофотометра, разбавленный в другую раствор (контрольную) ДНК в кювету кварцевую вносят кювету стерильную деионизованную воду, использованную для разведения образца ДНК. 3. Производят измерение оптической плотности (поглощения, абсорбции) раствора ДНК против растворителя (воды) при 260 нм (∆А260). 4. Изменяют длину волны спектрофотометра на 280 нм и вновь производят измерение оптической плотности раствора ДНК (∆А280) 5. Рассчитывают концентрацию ДНК в растворе, мкг/мкл, по формуле: С = ∆А260 х разбавление х 50/1000. 6. Определяют чистоту препарата ДНК по формуле ∆А260/∆А280 и делают вывод о возможности использования препарата в дальнейшем. 19 1.2. Определение концентрации и качества препарата РНК. Ход работы. 1. В чистую микропробирку вместимостью 1,5мл вносят 50 мкл раствора РНК, добавляют 950 мкл стерильной деионизованной воды и осторожно перемешивают. 2. Переносят разбавленный раствор РНК в кварцевую кювету, в другую такую же кювету вносят стерильную деионизованную воду, использованную для разведения образца РНК. 3. Измеряют оптическую плотность раствора РНК в сравнении с растворителем (воды) при 260 нм (ДУ1260). 4. Рассчитывают концентрацию РНК в растворе, мкг/мкл, по формуле С = ∆А260 х разбавление х 40/1000. Контрольные вопросы для подготовки к защите лабораторной работы: 1. В чем принцип метода спектрофотометрического определения концентраций нуклеиновых кислот? 2. Есть ли отличие в поглощении растворов ДНК и РНК с одинаковой концентрацией? 3. Можно ли использовать для спектрофотометрии нуклеиновых кислот широко распространенные пластиковые кюветы? 4. Почему обязательно нужно использовать стерильную деионизованную воду для разведения растворов нуклеиновых кислот? 20 Домашняя контрольная работа к модулю №1. 1. Заполните таблицу «Строение нуклеиновых кислот»: Строение нуклеотидов ДНК азотистое основание пентоза нуклеозид нуклеотид Строение нуклеотидов РНК азотистое основание 2. Обсудите пентоза письменно, как нуклеозид каждый из этих нуклеотид экспериментов помог продемонстрировать, что именно ДНК, а не белки, содержит генетическую информацию. 3. Напишите фрагменты нуклеиновых кислот следующего состава: а) -dA-dT-dG-; б) –U-A-C-; в) укажите фофсфодиэфирные связи, компоненты нуклеотидов, 5’ и 3’-концы фрагментов. 21 4. Какие типы двойной спирали Вам известны? В чем функция полиморфизма ДНК (для каждого типа)? 5. Каким образом ДНК упакована в течение интерфазы эукариотической клетки? 6. Какое воздействие упаковка ДНК, вероятно, оказывает на экспрессию отдельных генов? 7. Что такое кариотип? Пользуясь рисунком опишите кариотип человека. Чем отличаются разные хромосомы? 8. Геном человека содержит приблизительно на 50000 меньше генов, чем было предсказано многими исследователями. Почему эти первоначальные оценки были столь высоки? 9. Обсудите письменно возможные функции межгенной составляющей генома человека. 10. Какие различия наблюдаются в плотности генов, в числе интронов и в содержании повторной ДНК при сравнении геномов прокариот и млекопитающих? 22 11. Генетические элементы, которые воспроизводятся внутри генома хозяина или наряду с ним, но не дают никакой выгоды хозяину, иногда называют «эгоистичной» ДНК. Обсудите письменно это понятие и, в частности, насколько оно имеет отношение к транспозонам. 12. Для чего нужны геномы органелл? 13. Заполните таблицу «Основные типы РНК эукариот, их строение и функции»: Количество нуклеотидов Тип РНК Особенности первичной структуры и конформации Функции мРНК тРНК рРНК мцРНК (малая цитоплазматическая) мякРНК (малая ядрышковая РНК) мяРНК (малая ядерная) 14. Фрагмент мРНК гена инсулина имеет следующее строение: УУУ ГУУ ГАУ ЦАА ЦАЦ УУА УГУ ГГГ УЦА ЦАЦ Определите соотношение (А+Т)/(Г+Ц) в молекуле ДНК, соответствующей данному фрагменту. 15. Какое количество нуклеотидов содержится в мРНК, кодирующей полипептид, молекулярная масса которого равна 27кДа, если молекулярная масса одной аминокислоты в белке составляет примерно 100Да? 16. РНК, выделенная из вируса табачной мозаики, содержит 20% цитозина. Можно ли рассчитать процентное содержание аденина в этой РНК? Темы докладов к модулю №1 1. Концепция «Мир РНК». 2. Происхождение вирусов и их роль в эволюции. 3. Структура и репликативный цикл вируса иммунодефицита человека. 4. Плазмиды и их роль в жизнедеятельности бактериальной клетки. 5. Горизонтальный перенос генов и его роль в эволюции. 6. Выделение ядерной ДНК из растительной клетки. 7. Методы выделения ДНК на основе магнитной сепарации. 23 МОДУЛЬ 2. МЕХАНИЗМЫ РЕПЛИКАЦИИ И РЕПАРАЦИИ ДНК. РЕКОМБИНАЦИЯ. РЕСТРИКЦИЯ И МОДИФИКАЦИЯ Содержание модуля №2. Репликация. Матричная функция ДНК при репликации. Экспериментальные доказательства полуконсервативного механизма репликации. Формы про- и эукариотических ДНК – полимераз, виды их активности. Понятие ник- трансляции. Работы Корнберга и Кернса по репликации. Понятие репликона. Основные принципы репликации. Тэта – механизм репликации, его этапы. Сигма – механизм репликации вирусных систем. Особенности репликации геномов РНК – содержащих вирусов. Ретровирусы. Обратная транскрипция и ее этапы. Реликация хромосомы E. coli. Строение праймосомы и реплисомы. Строение и функции ДНК-полимеразы III E. coli. Особенности терминации репликации у прокариот. Репликация хромосом у эукариот. Функции ДНК-полимераз эукариот. Причины невозможности полной репликации отстающей нити в линейных ДНК эукариот. Теломерные повторы. Теломераза. Цепная полимеразная реакция, ее механизм и прикладное значение. ПЦР в реальном времени. Репарация. Необходимость существования ДНК – репарирующих систем. Основные нарушения молекулярной структуры ДНК. Корректирующая функция ДНК - полимераз. Фоторепарация, ее молекулярный механизм. Эксцизионная репарация: стадии, ферментное обеспечение и биологическая роль. Индуцируемые системы репарации. SOS - репарация. Другие механизмы репарации ДНК. Рекомбинация. Типы рекомбинации. Механизм гомологической рекомбинации. Структуры Холидея. Взаимосвязь рекомбинации и репарации. Биологические функции гомологической рекомбинации. Специальные системы гомологической рекомбинации. Сайт – специфическая рекомбинация, ее молекулярный механизм и биологическое значение. Рестрикция и модификация ДНК. Ферменты рестрикции и модификации. Понятие систем рестрикции и модификации (RM – систем). Классификация и 24 свойства RM - систем. Характеристика 1-4 классов рестриктаз, их молекулярная организация и особенности действия. Использование рестриктаз в молекулярной биологии и биотехнологии. Метилазы. Роль метилирования ДНК у прокариот. Метилированные азотистые основания. Взаимосвязь процессов репарации и метилирования ДНК. Метилирование ДНК у эукариот, особенности и возможная биологическая роль. Метилирование цитозина как генератор мутаций. Лабораторная работа № 3. «Полимеразная цепная реакция». Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод амплификации (умножение числа копий) фрагментов нуклеиновых кислот in vitro, с помощью которого можно избирательно и быстро получить миллионы копий, определенных (целевых) нуклеотидных последовательностей. В отличие от клонирования, ПЦР осуществляется в пробирке и не предполагает использования живых клеток. Метод ПЦР основан на механизме репликации ДНК in vivo: двухцепочечная ДНК раскручивается (под действием высоких температур), дуплицируется и снова закручивается. Рис. 3. Американский биохимик К. Мюллис - Нобелевский лауреат 1993 года в области химии (совместно с М. Смитом) за изобретение полимеразной цепной реакции В 1971 г. Г. Корана с сотрудниками впервые описал способ репликации определенного участка ДНК с использованием двух искусственно синтезированных праймеров. Сам метод ПЦР был разработан К. Мюллисом в 1983 г. В начале использования метода после каждого цикла нагревания-охлаждения приходилось 25 добавлять в реакционную инактивировалась при смесь высокой ДНК-полимеразу, температуре. так как Процедура она быстро была очень неэффективной, требовала много времени и фермента. Затем метод существенно модифицировали за счет использования ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти организмы в ходе эволюции приспособились к жизни в горячей воде, и их ферменты наиболее эффективно функционируют при температуре выше 70°С. Принципы ПЦР с термостабильными полимеразами были изложены в 1988 г. компанией Cetus Corporation (Saiki et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a termostable DNA polymerase. Science, 1988, 239, 487-491). Этот метод, был назван выдающимся изобретением двадцатого века. Действительно, в комбинации с подходящими биоинформатическими источниками для дизайна и определения необходимых условий, этот метод позволяет быстро идентифицировать и анализировать ДНК. Он сделал доступными исследования клеточных и молекулярных процессов для тех, кто не работает в области молекулярной биологии. Внедрение его позволило ускорить реализацию программы «Геном человека», а также способствовало внедрению в практику клинической диагностики наследственных и паразитарных заболеваний высокоэффективных тестов нового поколения. Полимеразная цепная реакция позволяет получить амплификоны (фрагменты ДНК) длиной до нескольких тысяч пар нуклеотидов. Для увеличения длины ПЦР-продукта до 20-40 тыс. пар нуклеотидов применяют смесь различных полимераз, но все равно это значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Реакция ПЦР проводится в программируемом термостате (амплификаторе) приборе, который может проводить достаточно быстро охлаждение и нагревание пробирок (обычно с точностью не менее 0,1°С). Амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта» и последующего хранения. Для ПЦР в режиме реального времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшетов, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы. Для проведения полимеразной цепной реакции в реакционной смеси должны присутствовать следующие компоненты: 26 1) праймеры («прямой» и «обратный») - искусственно синтезированные олигонуклеотиды, фланкирующие участок амплификации (рис. 4). Праймеры имеют, как правило, размер от 15 до 30 п.н., и идентичны соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы; Рис. 4. Пример «прямого» и «обратного» праймеров. 2) термоустойчивая ДНК-полимераза - термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание 3'-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие. Одной из первых термостабильных ДНК-полимераз была Taq-полимераза (особенность полимеразы Taq в том, что в конце синтеза она присоединяет к 3'концу синтезируемой цепи лишний адениннуклеотид). Недостаток этой полимеразы заключается в том, что вероятность внесения ошибочного нуклеотида у неё достаточно высока, так как у этого фермента отсутствуют механизмы исправления ошибок (3'→5' экзонуклеазная активность). Сейчас применяют смеси различных термостабильных полимераз, чтобы добиться одновременно высокой скорости полимеризации и высокой точности копирования. Например, полимеразы Pfu и Pwo, выделенные из архей, обладают 3'→5' экзонуклеазной активностью, их 27 использование значительно уменьшает число мутаций в ДНК, но скорость их работы (процессивность) ниже, чем у Taq; 3) cмесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) - дезоксиаденозинтрифосфата (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфата (дТТФ) - «строительный материал», используемый термостабильной полимеразой для синтеза второй цепи ДНК. Конечная концентрация каждого дНТФ, как правило, 0,25 мМ; 4) 5-10 мМ трис-HCl буферный раствор рН 8-9 (обычно прилагается к любому коммерческому препарату ДНК-полимеразы и оптимизирован для нее). Высокое значение рН нужно из-за того, что при повышении температуры рН трис-буфера падает и при 72 °С составляет ~7,5. В состав буферного раствора для ДНКполимеразы входят также соли KCl, NaCl для обеспечения необходимой ионной силы раствора; 5) катионы Mg2+ как необходимый кофактор ДНК-полимеразы (используют раствор MgCl2 в конечной концентрации 1,5-3 мМ, оптимальную концентрацию подбирают экспериментально в соответствии с применяемым типом ДНКполимеразы и числом одновременно амплифицируемых продуктов). Увеличение концентрации Mg2+ оказывает очень резкое влияние на специфичность и эффективность ПЦР: увеличивается выход, но более высокими темпами уменьшается специфичность. Оптимум зависит от последовательностей матрицы и праймеров; 6) неионный детергент Tween20 для предотвращения адсорбции молекул ДНК-полимеразы на стенках реакционной посуды (как правило, пробирки из полиэтилена); 7) иногда дополнительно бычий сывороточный альбумин (БСА), ди- и олигосахариды для стабилизации ДНК-полимеразы, формамид (для повышения специфичности гибридизации праймеров с ДНК-матрицей) и др. 8) анализируемый образец - подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который микроорганизмов, копирования. может служащую При содержать мишенью отсутствии искомую для ДНК, например, последующего ДНК-мишени ДНК многократного специфический продукт амплификации не образуется. Цикл ПЦР (амплификация) включает три стадии: 28 1) денатурацию – расплетение двойной спирали и расхождение полинуклеотидных цепей. Для этого реакционную смесь нагревают до 94-96°С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул; 2) отжиг праймеров – гибридизацию праймеров и одноцепочечной ДНКмишени с образованием необходимых для двухцепочечных инициации дезоксирибонуклеотидтрифосфатов. ограничивают (фланкируют) комплексов синтеза Праймеры искомый ДНК «праймер-матрица», из подбирают фрагмент и мономеров так, что – они комплементарны противоположным цепям ДНК. Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа, означающим, что в двухцепочечной молекуле ДНК напротив аденина всегда находится тимин, а напротив гуанина - цитозин. Если это условие не соблюдено, то отжига праймеров не происходит. После отжига праймеров Taq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК с 3'-конца праймера. 3) полимеризацию (элонгацию цепи) – достраивание комплементарных цепей ДНК ферментом ДНК-полимеразой в направлении 5'→3' начиная от 3'-ОН концов присоединенных праймеров. То есть матричный синтез ДНК (рис. 5 и 6). Рис 5. График изменения температуры в пробирке в течение одного цикла полимеразной цепной реакции. 29 Рис 6. Схема первого цикла полимеразной цепной реакции. Каждая из этих стадий повторяется 25-40 раз, образуя циклы ПЦР. То есть ПЦР имеет циклический характер. В первом и частично во втором циклах образуются копии (ампликоны), не соответствующие границам амплифицируемого гена (все ампликоны в первом цикле и часть ампликонов во втором цикле получаются более протяженными в тех участках, где еще не произошло связывание второго, ограничивающего рост цепи праймера). Начиная с третьего цикла, длина ампликонов становится стандартной, т.е. соответствует числу пар нуклеотидов ДНК-матрицы между 3'-концами праймеров. Ампликоны накапливаются в 30 геометрической прогрессии. Процесс имеет цепной характер, так как синтезированные ампликоны в дальнейшем сами служат матрицей, на которой идет синтез. Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) при 100% эффективности теоретически возрастает в геометрической прогрессии по формуле Р = 2n, где Р - количество специфического продукта, а n число циклов реакции. Практически эффективность ПЦР меньше 100%, поэтому в действительности P = (1 + E)n, где P - количество продукта; Е - средняя эффективность цикла; а n - число циклов реакции. Следует заметить, что процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически падает. Это связано с так называемым «эффектом плато» (рис.7). Рис. 7. Динамика накопления продукта при полимеразной цепной реакции Термин «эффект плато» используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации, когда количество ампликонов достигает 0,3-1 пкмолей. В зависимости от условий и количества циклов реакции амплификации на момент достижения «эффекта плато» влияют: - утилизация субстратов (дНТФ и праймеров); - стабильность реагентов (дНТФ и фермента); - количество ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы; 31 - неспецифические продукты или праймер-димеры, конкурирующие за праймеры, дНТФ и полимеразу; - концентрация специфического продукта и неполная денатурация при высокой концентрации продуктов амплификации. Чем меньше начальная концентрация ДНК-мишени, тем выше риск выхода реакции на плато. Этот момент может наступить до того, как количество специфических продуктов амплификации будет достаточно, чтобы их можно было проанализировать. Избежать этого позволяют лишь хорошо оптимизированные тест-системы. Чтобы ПЦР прошла успешно, должна произойти гибридизация праймеров с нужной последовательностью-мишенью. Если эта последовательность слегка различается у разных индивидуумов или у микроорганизмов из разных изолятов (т.е. имеет место полиморфизм), может произойти ее неполное спаривание с амплимером и нарушение нормальной амплификации, что приведет к получению ложноотрицательного результата. Следует отметить: у человека большая часть геномных последовательностей консервативна и не различается у разных индивидуумов, а потому обычно в таких случаях для работы подходят одинаковые наборы «консервативных» праймеров. Подбор и оптимизация праймеров для ПЦР. Праймеры используют, как правило, попарно и подбирают их таким образом, чтобы они были комплементарны противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область, и ориентированы 3'-концами в направлении последовательности, которую необходимо амплифицировать, т. е. навстречу друг другу. Оптимизация праймеров для ПЦР сводится к их «дизайну» (выбору нуклеотидной последовательности) и определению оптимальной температуры для их отжига (связывание с ДНК-матрицей). Дизайн праймеров (т.е. выбор определенного участка на ДНК-матрице для связывания с праймером) по известной ДНК-матрице производится в соответствии c рекомендациями, приведенными ниже. Выбор участка на ДНК-матрице. Это один из самых важных шагов в планировании эксперимента. Необходимо, чтобы пара праймеров эффективно и специфично связывалась с искомой целевой последовательностью. Других вариантов связывания праймеров с ДНК-матрицей быть не должно, по крайней 32 мере для той ДНК, которую необходимо выделить из исследуемого материала (например, в пробах из крови человека будет присутствовать ДНК человека, возможно также ДНК некоторых микроорганизмов и простейших, но маловероятно присутствие геномной ДНК другого животного и тем более растения). Информацию о последовательности нуклеотидов целевого фрагмента (или только его концов) можно получить в базе данных международного генбанка (доступна на веб-сайте vwvw.ncbi.nlm.nih.gov). Длина целевого фрагмента должна быть в пределах 100-3000 п.н., нижний предел обусловлен возможностью отделения амплифицированных фрагментов (ампликоны) от димеров праймеров и других неспсцифичсских фрагментов на электрофорезе, верхний предел - возможностями TaqДНК-полимеразы, не способной эффективно синтезировать фрагменты большей длины. Оптимальная длина и размер прймеров. Этот показатель определяется возможностью отжига праймера одновременно по всей его длине и находится между 16 и 25 нуклеотидами и в среднем составляет 18-20 нуклеотидов. Содержание ГЦ (GC), %. Это отношение числа нуклеотидов дГ и дЦ (суммарно) к общему числу нуклеотидов праймера. Необходимо подбирать последовательность праймера так, чтобы значение величины GC (%) находилось между 35 и 65 (некоторые источники предлагают 45-55) и было приблизительно одинаковым у праймеров, составляющих пару для ПЦР. Ни в коем случае не должно оказаться несколько (3 и более) оснований дГ и дЦ подряд на 3'-конце праймера: это сильно снижает его специфичность. В идеале все четыре нуклеотида должны быть более или менее равномерно распределены по всей длине праймера. Температура отжига (Тann°С). Это температура, при которой вероятность связывания праймера с ДНК-матрицей превосходит 70 %. Для пары праймеров она на 4 – 5°С (по некоторым источникам на 2-4°С) ниже температуры плавления (Тm°С) - температуры, при которой число связанных с ДНК и свободных олигонуклеотидов одинаково. Оптимальная температура отжига должна находиться в пределах 5070°С (хотя в некоторых случаях может быть и ниже) и не может различаться у праймеров, составляющих пару для ПЦР, более чем на 4 С. Рассчитать температуру плавления для подобранных праймеров (°С) можно по формулам: Тm = 2(АТ)+4(ГЦ) - для праймеров до 20 н.; 33 Тm = 69,3+0,41(% GC)-650/l, - для праймеров более 20 н., где l - длина праймера. Ориентировочную температуру отжига для каждой пары праймеров можно рассчитать, исходя из минимальной температуры плавления (на 2-4°С ниже), рассчитанной для каждого их двух праймеров, но точно ее установить можно только эмпирически по результатам серии ПЦР, проведенных с разной температурой отжига, начиная с расчетной и ниже с шагом 1-2°С. Вторичная структура праймеров и целевого фрагмента. Связывание праймеров с матрицей будет затруднено, если в месте связывания цепь ДНК может образовывать вторичные структуры - гомо-, гетеродимеры и петли. В связи с этим необходимо подбирать праймеры так, чтобы составляющие пару олигонуклеотиды не содержали в своем составе последовательности из 3 и более нуклеотидов подряд, комплементарных аналогичной последовательности этого же (гомодимер) или другого (гетеродимер) праймера, а также палиндромных последовательностей, являющихся причиной образования петель. Заранее предвидеть вторичную структуру целевого фрагмента (ампликон) практически невозможно, поэтому для его эффективной амплификации часто требуется испытать не одну, а две-четыре и более пар праймеров, пока не будет достигнут искомый результат. Все более широкое использование таких программ, как Oligo, Generunner и Genefisher, в дизайне праймеров делает выбор условий реакции гораздо более простым. Эти программы позволяют выбрать последовательности, задавать длину праймера, размер продукта, G+C-содержание и т.д., а последующий анализ обеспечивает выбор соответствующих последовательностей праймеров. Без помощи биоинформатики сегодня выбор и дизайн праймеров отнимает неоправданно много времени. Расчет количества праймеров для ПЦР-смеси. Производители, синтезирующие праймеры на заказ, как правило, указывают концентрацию праймера и полученном растворе, например 33 пкмоль/мкл или 33 мМ. Для приготовления реакционной смеси требуется, как правило, 5-10 пкмоль каждого из пары праймеров. Исходя из этой величины и концентрации праймера, определяют объем исходного раствора праймера, который необходимо добавить в реакционную смесь, по формуле: 34 Объем раствора праймера, мкл = Требуемое количество праймера,пкмоль Концентрация праймера,пмоль/мкл При этом нет необходимости оперировать с очень малыми объемами (1 мкл и менее) раствора праймеров и других компонентов реакционной смеси для ПЦР, поскольку это практически невозможно реализовать. Объем исходного раствора праймеров рассчитывают и добавляют к суммарному объему реакционной смеси, приготовленному для 10 и более реакций, или разбавляют исходный раствор стерильной деионизованной водой до требуемой концентрации и смешивают оба праймера в одной пробирке (только аликвоты, а не весь объем исходных растворов праймеров!). Приготовление реакционной смеси и проведение ПЦР. В последние 1015 лет для ПЦР широко применяют готовые к употреблению смеси, включающие все необходимые компоненты, кроме праймеров (но, например, наиболее широко употребимые ПЦР- смеси для обнаружения ДНК патогенной микрофлоры содержат также и праймеры) и ДНК-матрицы, жидкие или лиофилизированные. Для упрощения процедуры приготовления реакционной смеси для ПЦР созданы специальные наборы реагентов для амплификации, включающие все необходимые компоненты, в том числе ДНК-полимеразу, которые уже смешаны в нужных пропорциях. В реакционную смесь для ПЦР требуется добавить лишь ДНКматрицу и праймеры (в некоторых случаях праймеры также могут входить в состав наборов), что существенно экономит рабочее время и снижает вероятность ошибок и контаминации. Известно, что чувствительность ПЦР может достигать теоретически возможного предела (единичная молекула ДНК-матрицы). Это позволяет выявлять целевой фрагмент, используя микроскопически малые количества исходного материала. Однако у этой полезной особенности ПЦР есть и оборотная сторона высокая степень опасности получения ложноположитсльных результатов из-за контаминации, т. е. загрязнения реакционной смеси посторонней ДНК-матрицей или амплифицированными фрагментами (ампликонами). Основные причины получения ложноположительных результатов при постановке ПЦР таковы: - перекрестная контаминация от пробы к пробе (например, в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси); 35 - контаминация рекомбинантными плазмидами, содержащими копии клонированной последовательности целевого фрагмента (эти плазмиды чаще всего используются в качестве положительного контроля ПЦР); - контаминация ложноположительных ампликонами результатов, - так наиболее как в частая процессе ПЦР причина ампликоны накапливаются в больших количествах и очень легко переносятся с аэрозолями, через приборы, инструменты, одежду и т.д. Необходимо контроля и постоянно периодически положительные осуществлять применять контрольные собственные виды зашифрованные образцы для оценки лабораторного отрицательные специфичности и и чувствительности ПЦР-генодиагностических исследований. Неуклонно выполняя эти требования и выполняя в каждой ПЦР отрицательный контроль разных типов (на процедуру обратной транскрипции, буферный раствор, праймеры), можно практически исключить ложноположительные результаты ПЦР. Очень важен для правильной интерпретации результатов выбор способов контроля. Положительный и отрицательный контроль должен быть хорошо охарактеризован. Часто используют ДНК из клеточных линий, заведомо содержащих или не содержащих последовательность-мишень. В каждом анализе нужны как минимум три вида контроля: 1) положительный контроль (образец заведомо содержит последовательностьмишень). Положительный контроль позволяет удостовериться, что все компоненты, входящие в состав реакционной смеси, обеспечивают нормальное прохождение реакции. Для этого используют препарат ДНК, содержащий сайты для отжига праймеров: например, ДНК искомого микроорганизма или клонированные специфические участки его генома. Неспецифические ампликоны отличаются по размеру от ампликонов, образуемых в результате амплификации с контрольным препаратом ДНК. Они могут быть как большего, так и меньшего размера по сравнению с положительным контролем. В худшем случае их размеры могут совпадать и читаются в электрофорезе как положительные; 2) отрицательный контроль (образец заведомо не содержит последовательность-мишень); 36 3) бланк-контроль (реакционная смесь, в которой присутствуют все компоненты за исключением ДНК; бланк-контроль является индикатором загрязнений). Для контроля специфичности образуемого продукта амплификации можно использовать гибридизационные зонды, меченые флюоресцентными метками или радиоактивными изотопами и взаимодействующими с ДНК в соответствии с теми же принципами, что и праймеры. Препарат ДНК, подготовленный к ПЦР из биологического материала, может содержать примеси ингибиторов, заметно снижающих эффективность реакции, а в некоторых случаях, приводящих к отсутствию специфических ампликонов даже при наличии искомого возбудителя. Поэтому становится необходимым контролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью. Для этой цели в каждую пробирку добавляют дополнительный, так называемый внутренний контроль. Он представляет собой любой препарат ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма. Для инфекционных тест-систем иногда используют, например, β-глобиновый ген, к концам которого с помощью генноинженерных манипуляций «пришивают» участки ДНК, гомологичные праймерам, входящим в состав тест-системы. При отсутствии полосы внутреннего контроля и специфической полосы ДНК результат следует считать недостоверным. В этом случае для данного исследуемого образца рекомендуется перевыделить ДНК. Если внутренний контроль внести в реакционную смесь, то он станет такой же мишенью для отжига праймеров, как и ДНК искомого возбудителя инфекции. Размер продукта амплификации внутреннего контроля подбирают таким образом, чтобы он отличался от специфических ампликонов в 2 и более раз. В результате, если внести ДНК внутреннего контроля в реакционную смесь вместе с испытуемым образцом, то независимо от наличия микроорганизма в биологическом образце, внутренний контроль станет причиной образования ампликонов, отличающихся по размеру от специфических ампликонов, получаемых после постановки ПЦР в присутствии специфической ДНК микроорганизма. Наличие ампликонов внутреннего контроля в реакционной смеси будет свидетельством нормального прохождения реакции амплификации и отсутствия ингибиторов. Если ампликоны нужного размера не образовались, но не образовались также и ампликоны внутреннего контроля, 37 можно сделать вывод о возникшей проблеме при прохождении ПЦР как следствие наличия в анализируемом образце нежелательных примесей, от которых следует избавиться, либо технологических нарушениях. В любом случае результат реакции следует признать недостоверным. Важно отметить, что если в реакционной смеси находится нужная ДНК, то эффективность ее амплификации может заметно снижаться из-за конкуренции за праймеры с ДНК внутреннего контроля. Это особенно заметно при низких концентрациях ДНК в испытуемом образце и может приводить к ложноотрицательным результатам. Поэтому концентрация внутреннего контроля должна быть такой, чтобы не составлять конкуренции для амплификации даже единичных искомых молекул ДНК. При этом следует быть готовым к тому, что количество образцов, в которых внутренний контроль не будет срабатывать, и, следовательно, подлежащих перестановке, будет изменяться пропорционально используемому методу пробоподготовки, в соответствии с качеством получаемого препарата ДНК. Детекция результатов ПЦР. Для анализа ПЦР-амплифицированной ДНК существуют разные методы: гель-электрофорез, дот-блот-гибридизация и блотгибридизация по Саузерну. С их помощью можно анализировать большинство ПЦР-продуктов, но абсолютно точные результаты получают только при секвенировании. Далее в главах будет описана модификация ПЦР - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени, в которой детекция возрастания количества ПЦР-продуктов осуществляется непосредственно в пробирке при прохождении реакции (см. ниже). Присутствие специфического ПЦР-продукта (амплификона) в подавляющем большинстве случаев детектируют электрофоретическим разделением ПЦРамплификационной смеси на окрашенных бромистым этидием агарозном или полиакриламидном гелях. Для такого выявления необходимо не менее 20 нг ДНК. Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждается ее положением (размерами) по отношению к маркерным фрагментам и ДНК-стандарту. Дополнительные доказательства специфичности амплификона получают путем расщепления гибридизации специфическими со рестриктазными специфическим ферментами радиоактивным или или путем флуоресцентным олигонуклеотидным зондом. 38 Метод гибридизации ПЦР-амплифицированной ДНК (по Саузерну) позволяет идентифицировать полосы в геле, наблюдаемые после электрофореза амплифицированной ДНК. Для гибридизации используются как изотопно, так и неизотопно меченые зонды. Дот-блот-гибридизация дает простой ответ по типу «да-нет» и особенно полезна в тех случаях, когда проводится анализ большого числа образцов. Прямое секвенирование амплифицированной ДНК - также высоконадежный метод доказательства ее специфичности, но применяется в основном для определения точечных мутаций генов. В последние годы для детекции и одновременно количественной оценки амплифицированной ДНК все больше начинают применять гибридизационноферментный метод на микропланшетах. Но существуют и другие варианты: используются олигонуклеотидный зонд, его метят дигоксигенином или флуоресцеином с последующим проявлением моноклональными антителами к дигоксигенину или флуоресцеину; меченные ферментами моноклональные антитела к двухцепочечной ДНК; зонд, меченный рутением (электрохемилюминесцентный метод). Весьма перспективна для количественных детекций амплификонов на гель-электрофореграммах миниатюрная видеокамера, передающая на экран монитора интенсивность флуоресценции полос ДНКамплификонов, что позволяет одновременно получить соотношение полос ДНКстандарта и ДНК-амплификонов исследуемого гена. Результат ПЦР можно квалифицировать как положительный или отрицательный в зависимости от того, обнаружена в образце интересующая вас последовательность-мишень или нет. Однако нарушение нормального хода амплификации, недостаточная чувствительность метода и непредвиденный полиморфизм последовательности-мишени в области связывания праймеров или гибридизационного зонда порой обусловливают ложноотрицательный результат. При загрязнении образцов и случайной гомологии между зондом, праймерами и последовательностью, сходной с мишенью, получаются ложноположительные результаты. Устройство ПЦР – лаборатории. ПЦР-лаборатория должна быть разделена на три зоны - по числу технологических операций: -зона подготовки реакционной смеси («чистая» зона); 39 -зона пробоподготовки; -зона детекции. Все три зоны должны быть изолированными комнатами, снабженными предбоксниками. Полезно иметь устройство фильтрации воздуха. Если первую и вторую зоны в крайнем случае допускается объединить (при наличии двух других зон (другой этаж, другое здание) и иметь не связанную с другими зонами систему вентиляции. Это является одним из наиболее категорических требований при организации ПЦР-лаборатории. Кроме того, желательно предусмотреть отдельные помещения для переодевания и хранения верхней одежды, приема пищи, складское помещение для лабораторных материалов. Все производственные комнаты должны быть снабжены коротковолновыми ультрафиолетовыми лампами. Перемещение пробирок, штативов и пр. должно производиться только в направлении из «чистой» зоны в зоны пробоподготовки и детекции. Клинический материал, поступивший в лабораторию, должен быть как можно быстрее обработан в комнате пробоподготовки. В эту же комнату должны поступать пробирки с реакционной смесью из «чистой» зоны для внесения в них препаратов ДНК. После этого пробирки помещают в амплификатор и, по окончании термоциклирования, не открывая крышек, переносят в зону детекции. Все операции (пробоподготовка, подготовка реакционной смеси, электрофорез) должны выполнять разные люди. Для обработки клинических образцов должны быть установлены ламинарные шкафы, обеспечивающие вертикальный поток воздуха для безопасности персонала при работе с инфекционным материалом, а также предусматривающие возможность работы без ламинарного потока и длительную экспозицию облучения внутренних поверхностей ультрафиолетовым светом. Подготовку реакционной смеси следует проводить в ПЦР-боксе, снабженном электрическими розетками, лампами дневного и ультрафиолетового света. Инактивацию биологического материала проводят в автоклаве в течение 1 часа при 1,5 атм. Допускается использование настольных автоклавов. Запрещается внесение пробирок с положительными контролями или клиническими образцами как до, так и после обработки, в комнату подготовки реакционной смеси («чистую» зону). 40 Все производственные комнаты должны быть снабжены необходимым оборудованием и расходными материалами, в том числе халатами, закрепленными за соответствующими помещениями. Модификации метода ПЦР. В настоящее время разработано множество вариантов ПЦР. Ниже приведено описание некоторых модификаций метода ПЦР. Мультиплексная ПЦР. Полимеразная цепная реакция, при которой в одной реакции участвуют более одного набора праймеров. В результате с одной матрицы может быть одновременно получено несколько продуктов ПЦР. Температура отжига для каждого из набора праймеров должна быть оптимизирована, а длина ампликонов с каждой пары праймеров должна достаточно различаться, чтобы сформировать отдельные полосы при визуализации путем электрофореза. Мультиплексная ПЦР применяется во многих приложениях анализа ДНК, включая анализ делеций, мутаций и полиморфизмов, а также ПЦР с обратной транскрипцией. Часто применяется в процедурах генотипирования, при которых требуется одновременный анализ многих маркеров, при детектировании патогенов или в анализе микросателлитов. Однако, так как используется несколько пар праймеров, необходима оптимизация для получения достоверных и воспроизводимых результатов. Вложенная ПЦР (гнездовая, «вложенная», англ. nested PCR). В данной модификации метода ПЦР. В ходе второго раунда полимеразной цепной реакции используют две пары праймеров и проводят два раунда реакции, в ходе которого праймеры расположены внутри по отношению к использованным в первом раунде, а первый продукт ПЦР используется как новая матрица. ПЦР представляет собой мощный инструмент для амплификации небольших количество ДНК из сложных смесей. Однако, если нужная матрица имеет малую концентрацию в смеси ДНКфрагментов, требуется проводить много циклов амплификации и использовать праймеры, которые могут связаться с другими локусами. Это зачастую приводит к амплификации посторонних или неверных последовательностей. Использование второго набора праймеров (вложенные праймеры), отжигающихся внутри первого продукта ПЦР, позволяет проводить дальнейшую амплификацию с образованием более короткого продукта, с более высокой чувствительностью и без потерь специфичности. Таким образом, любые нежелательные последовательности ДНК, 41 амплифицированные в ходе первого раунда ПЦР, имеют меньше шансов амплифицироваться во втором раунде. Случайная полимеразная ПЦР. Модификация ПЦР, которая позволяет осуществить амплификацию случайных последовательностей (с неопределенной структурой) с матрицы, сложных смесей ДНК или целых клеток. Существует несколько вариантов проведения случайной ПЦР: с единственным случайным праймером (происходит линейное накопление продукта) или ПЦР при нормальных условиях (экспоненциально). Обычный вариант случайной ПЦР – амплификация с праймером, часть которого имеет определенную последовательность, а другая часть – вырожденную. Включение вырожденных районов в последовательность праймера делает возможным его отжиг на множестве сайтов связывания в целевой матрице (или матрицах). Вырожденные праймеры образуют продукты ПЦР с различной длиной и последовательностью, покрывающей значительную часть целевой ДНК. Часто используется для амплификации, преобладающей ДНК или вставочных последовательностей, последовательность и длина которых неизвестна. Менее распространенный вариант случайной ПЦР, когда реакцию проводят при низких температурах (например, 30°С). При этом праймеры отжигаются на матрице неверно, приводя к амплификации продуктов случайной ПЦР. ПЦР с «горячим» стартом (англ. hot-start PCR). Модификация ПЦР, суть которой состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров. Для этого полимеразная активность фермента в момент постановки ПЦР блокируется антителами или имитирующими антитела небольшими молекулами типа Affibody до наступления первой денатурации (проводится при 95 °C в течение 10 минут). Кроме того, для предотвращения преждевременного взаимодействия фермента с компонентами реакционной смеси и, как следствие, образования неспецифических продуктов реакции до момента полного прогрева, используется легкоплавкий парафин или специальные масла, отделяющие полимеразу от реакционной смеси. В зависимости от ГЦ-состава и размера, праймеры имеют определенную температуру плавления, при которой образование водородных связей нестабильно. Если температура системы превышает температуру плавления, праймер не в состоянии удерживаться на цепи ДНК и денатурирует. При соблюдении оптимальных условий, то есть температуры отжига, 42 близкой к температуре плавления, праймер образует двуцепочечную молекулу только при условии его полной комплементарности и таким образом обеспечивает специфичность реакции. Даже если неспецифический отжиг произошел до начала температурного циклирования, в отсутствии фермента элонгации не происходит, а при нагревании комплексы праймер-ДНК денатурируют, поэтому неспецифические продукты не образуются. В дальнейшем температура в пробирке не опускается ниже температуры плавления, что обеспечивает образование специфического продукта амплификации. Таким образом, ПЦР с «горячим» стартом позволяет минимизировать вероятность образования неспецифических продуктов ПЦР и возможность получения ложноположительных результатов анализа. ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР или РНК-ПЦР). Инструмент, который позволяет осуществить амплификацию небольшого количества матрицы РНК. ОТ-ПЦР представляет собой двустадийный процесс. На первой стадии происходит копирование РНК обратной транскриптазой с образованием комплементарной ДНК. Существуют термостабильные обратные транскриптазы (например, обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц), которые могут быть использованы в ПЦР. На второй стадии одноцепочечная комплементарная ДНК экспоненциально амплифицируется термостабильной ДНК-полимеразой в ходе полимеразной цепной реакции с образованием большого количества ДНК для дальнейшего анализа. Возможно также модифицировать протокол, включив использование заякоренных праймеров с олиго(dT)-модифицированным праймером. Это позволяет осуществить транскрипцию и амплификацию с 3ʼ-конца поли(А)-«хвоста». Так как синтезирующийся пул ДНК образуется на основе исходной последовательности РНК, есть возможность секвенировать ДНК после клонирования, тем самым определяя последовательность исходной РНК. ОТ-ПЦР находит широкое применение в молекулярной биологии и клинических исследованиях, где ее можно применять для детектирования инфекциоонных агентов. генетических маркеров, а также опосредованно для выявления белков в малом количестве. ПЦР с анализом результатов «по конечной точке» (англ. End-point PCR). Это модификация метода ПЦР, которая позволяет учитывать результаты реакции по наличию флуоресценции после амплификации, не открывая пробирки. 43 Таким образом, решается одна из основных проблем ПЦР – проблема контаминации ампликонами. Одним из таких вариантов является метод «FLASH» (FLuorescent Amplification-based гибридизации в процессе Specific Hybridization амплификации с – специфическая ДНК-зондами, меченными флуорофорами). Ключевым элементом метода «FLASH» является использование гибридизационных олигонуклеотидных зондов, меченных молекулами флуорофора и «темнового» гасителя. Зонды добавляют в реакционную смесь наряду с праймерами и остальными компонентами реакции. Поскольку в структуре зонда флуорофор и гаситель находятся в непосредственной близости друг от друга, то перед началом реакции флуоресценция отсутствует. Во время реакции зонды гибридизуются с ДНК-мишенью, на стадии элонгации Taq-полимераза разрушает зонд благодаря 5'-экзонуклеазной активности и флуорофор оказывается свободным от гасителя. Таким образом, количество разрушенных зондов и, соответственно, уровень флуоресценции оказываются пропорциональными количеству образовавшихся ампликонов. Следует отметить, что регистрация флуоресценции происходит с помощью детектора флуоресценции после окончания реакции, поэтому метод не является количественным. ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ, англ. Real-Time PCR, RT-PCR). Этот метод был разработан в связи с тем, что ОТ-ПЦР является только полуколичественной методикой. Полимеразная цепная реакция представляет собой наиболее чувствительный метод детектирования РНК и может быть использована для различения сходных мРНК. ПЦР в реальном времени основана на измерении уровня флуоресценции в ходе реакции, что отражает продукцию ампликона в каждом цикле ПЦР в реальном времени вместо оценки количества продукта по окончании реакции, как это происходит в других модификациях ПЦР. Однако, ПЦР-РВ не определяет размер ампликона. ПЦР-РВ основана на детектировании и количественно определении флуресцентного репортера; интенсивность флуоресцентного сигнала возрастает с увеличением содержания продукта ПЦР в реакционной системе. Количественно определяя эмиссию флуоресценции в каждом цикле, можно следить за ходом ПЦР в фазе экспоненциального роста, когда первое достверное увеличение содержания продукта коррелирует с начальным количеством матрицы. Чем выше начальное количество матрицы, тем быстрее начнется возрастание интенсивности 44 флуоесценции. Существует два основных подхода к детекции результатов ПЦР в реальном времени: с помощью интеркалирующих красителей и на основе флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов. Низкоспецифичная детекция результатов ПЦР-РВ с помощью интеркалирующих красителей возможна за счет увеличения флуоресценции интеркалирующего красителя при образовании комплекса с двуцепочечной ДНК. Самый популярный краситель на сегодняшний день - SYBR Green I. Это чувствительный флуоресцентный индикатор двухцепочечной ДНК. Максимум флуоресценции в комплексе с ДНК составляет 521 нм, максимум возбуждения - 497 нм (второй максимум около 254 нм). Хорошо возбуждается стандартным 488-нм лазером. Квантовый выход флуоресценции около 0.8 (что в 5 раз превышает квантовый выход комплекса этидий-ДНК) (рис. 8). Рис. 8. Связывание красителя (SYBR Green I) с ДНК. (А) Находясь в свободном виде в растворе, краситель не флуоресцирует. (Б) При связывании с мишенью - молекулой ДНК, краситель начинает флуоресцировать. Более высокой специфичности детекции результатов ПЦР в режиме реального времени можно достигнуть за счет наличия в реакционной смеси дополнительного олигонуклеотида - гибридизационного зонда. Такой зонд "отжигается" (комплементарно соединяется с ДНК) на участке ампликона между прямым и обратным праймером. На разных концах зонда расположены флуорофор и гаситель 45 флуоресценции этого красителя (по аналогии с «FLASH» методом). Когда флуорофор и гаситель связаны с олигонуклеотидным зондом, наблюдается лишь незначительная флуоресцентная эмиссия. Во время процесса амплификации за счет 5ʼ-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы флуоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с гасителем и генерирует флуоресцентный сигнал, усиливающийся в реальном времени пропорционально накоплению амплификата. Таким образом, в случае если используемые праймеры "отожгутся" на неспецифических участках с образованием в ходе ПЦР-РВ "нецелевого" продукта, то его последовательность не будет иметь участок, комплементарный гибридизационному зонду и, соответственно, "нецелевые" ампликоны не будут регистрироваться как целевые. При этом для такого варианта ПЦР-РВ можно одновременно использовать несколько видов флуорофоров и гасителей их флуоресценции (с неперекрывающими спектрами излучения). Это позволяет осуществлять мультиплексную ПЦР в реальном времени. В ПЦР-РВ используются различные типы флуоресцентных зондов или праймеров, включая TaqMan-зонд, молекулярные маяки и Scorpion-зонд. Каждый из них основан на использовании олигонуклеотида (рис. 9). Рис. 9. Принцип ПЦР в режиме реального времени. Детекция накопления ампликонов происходит при помощи олигонуклеотидного зонда, гибридизующегося с участком мишени между праймерами. Зонд несет на себе флуорофор (F) и блокирующий флуоресценцию гаситель (Q), расположенный рядом с ним. В ходе синтеза комплиментарной цепи полимераза расщепляет зонд, в результате чего возникает флуоресценция 46 Для анализа в режиме «реального времени» используют специальные ДНКамплификаторы с оптическим блоком, позволяющие детектировать флуоресценцию внутри реакционной пробирки в ходе реакции. При амплификации образца детектируемый флуоресцентный сигнал может состоять из трех последовательных участков: 1 – базовая линия (сигнал не превышает предела детектирования прибора); 2 – экспоненциальная амплификация; 3 – плато. Сигнал флуоресценции в ходе ПЦР возрастает пропорционально количеству продукта амплификации. Мониторинг сигнала позволяет построить кинетическую кривую реакции, при этом, момент заметного увеличения сигнала и отрыва его от фонового – так называемый пороговый цикл – зависит от исходного количества ДНК-мишени. Чем больше количество ДНК в образце, тем раньше наблюдается начало роста сигнала флуоресценции и тем меньше пороговый цикл. Главным преимуществом детекции результатов ПЦР в режиме «реального времени» является возможность проведения количественного анализа. При количественном исследовании образцов каждая серия экспериментов сопровождается постановкой амплификации с контрольными образцами, в которых заведомо известно количество копий ДНК (калибровочные образцы). Сравнение кинетики накопления продуктов амплификации в экспериментальных и контрольных образцах позволяет оценить концентрацию ДНК в диапазоне разведений контрольных препаратов ДНК. Следует отметить, что для выполнения количественного ПЦР-анализа рекомендуется использование препаратов ДНК с высокой степенью очистки, так как присутствие нежелательных примесей (ингибиторов) снижает эффективность амплификации исследуемой и контрольной ДНК. Для контроля точности количественного анализа используют калиброванные внутренние контроли. Часто ПЦР в реальном времени комбинируют с ОТ-ПЦР для измерения малых количеств мРНК, что позволяет получать количественную информацию о содержании искомой мРНК в клетке и судить об уровне экспрессии гена в отдельной клетке или ткани. Отличительными чертами ПЦР-РВ являются не только возможность количественного определения ДНК/РНК в исследуемом материале, но и отсутствие стадии электрофореза, что позволяет минимизировать риск контаминации продуктами ПЦР и таким образом резко уменьшить число ложноположительных результатов. Также менее строгие требования 47 предъявляются к организации ПЦР-лаборатории, становятся возможны автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Кроме того, возможны и другие варианты ПЦР, получившие наибольшее распространение в научно-исследовательских лабораториях, например: - ПЦР «инвертированная» – используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для этого проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов; - асимметричная ПЦР – проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. Сама ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке. - метод молекулярных колоний – данная модификация основана на использовании акриламидного геля, который до начала ПЦР полимеризуют со всеми ее компонентами на поверхности. В процессе реакции в точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний. - ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) – вариант ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч и более оснований). Для реализации данного подхода используют смесь двух полимераз, одна из которых – Taq-полимераза с высокой процессивностью (способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая – ДНК-полимераза с 3'-5' экзонуклеазной корректирования активностью ошибок, (Pfu-полимераза). внесённых Она необходима Taq-полимеразой, при для этом некомплементарные нуклеотиды удаляются с помощью Pfu-полимеразы. - групп-специфическая ПЦР (англ. group-specific PCR) – ПЦР с использованием консервативных праймеров к последовательностям ДНК для родственных групп внутри одного или между разными видами. Например, подбор универсальных праймеров к рибосомальным 18S и 26S генам для амплификации видоспецифического межгенного спейсера: последовательность генов 18S и 26S 48 консервативна между видами, поэтому ПЦР между этими генами будет проходить для всех исследуемых видов. - ступенчатая ПЦР (англ. touchdown PCR) — с помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров. Первые циклы проводят при температуре выше оптимальной температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру отжига постепенно снижают до оптимальной. Это делается для того, чтобы праймер гибридизовался с комплементарной цепью всей своей длиной; тогда как при оптимальной температуре отжига, праймер частично гибридизуется с комплементарной цепью. Частичная гибридизация праймера на геномной ДНК приводит к неспецифической амплификации, если участков связывания для праймера достаточно много. В большинстве случаев, первые десять ПЦР циклов, можно проводить при температуре отжига в 72-75°С, а затем сразу снизить до оптимальной, например, до 60-65°С. Преимущества ПЦР перед другими методами. К преимуществам полимеразной цепной реакции можно отнести следующее: 1) метод прямой и позволяет достичь предельно возможной чувствительности (от нескольких копий до одного возбудителя в пробе); 2) специфичность метода приближается к 100%; 3) для ПЦР-анализа пригоден любой материал, в том числе и гистологические препараты; 4) метод позволяет определять число копий возбудителя в пробе и тем самым наблюдать динамику. Правда здесь стоит учитывать некоторые моменты, как-то, что амплификации может подвергаться ДНК как живого, так и погибшего микроорганизма и возможность перекрестной реакции (подбор праймеров происходит на основе существующих знаний о геноме данного и сходных микроорганизмов. Теоретически существует возможность присутствия такого же фрагмента и у других микроорганизмов, геном которых в настоящее время не расшифрован, и которые не были протестированы на возможность перекрестной реакции. Присутствие в пробе таких микроорганизмов может привести к ложноположительному результату анализа); 5) исследуемый материала может быть дезинфицирован химической или термической обработкой в момент его забора, и, следовательно, исключается возможность инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР; 49 6) метод прост в исполнении, возможна его полная автоматизация; 7) результаты получают через несколько часов, то есть в течение одного рабочего дня. Практическое применение метода ПЦР. Перспективы развития метода. Метод ПЦР широко используется в следующих отраслях: 1) медицина, система санитарно-эпидемиологического контроля: диагностика инфекций (особо опасные и социально значимые инфекции, эпидемические инфекции, гемотрансмиссивные инфекции, оппортунистические инфекции, TORCH-инфекции, исследование биоценозов); диагностика иммунных патологий; генетические исследования наследственных заболеваний; определение ГМИ пищевых продуктов; 2) ветеринария и растениеводство: инфекционные заболевания; определение видовой принадлежности; 3) наука: генная инженерия, микробиология, генетика и др. 4) промышленность: определение биологического загрязнения (санитарный контроль); 5) судебная медицина: идентификация личности. ПЦР – один из мощнейших инструментов исследования нуклеиновых кислот. Рассмотрим примеры, демонстрирующие возможности ПЦР и широкий спектр решаемых с его помощью научных и практических задач. Метод ПЦР позволил проанализировать наличие последовательностей вирусов папилломы человека в срезах биоптатов новообразований шейки матки человека, залитых парафином и хранившихся в течение 40 лет. Более того, используя ПЦР, удалось амплифицировать и клонировать фрагменты митохондриальной ДНК из ископаемых останков мозга человека возраста 7 тысяч лет! Именно с помощью ПЦР были идентифицированы костные останки российского императора Николая II и членов его семьи, пролежавшие в земле 73 года. Метод ПЦР обеспечивает уникальную возможность тонкого генетического анализа и изучения хромосомной рекомбинации, ДНК-полиморфизма и др. Метод анализа сперматозоидов сразу нашел практическое применение в судебной медицине, так как HLA-типирование гаплоидных клеток позволяет определять отцовство или выявлять преступника (комплекс HLA представляет 50 собой набор генов главного комплекса гистосовместимости человека; локусы комплекса HLA - наиболее полиморфные из всех известных у высших позвоночных: в пределах вида в каждом локусе существует необычайно большое число разных аллелей). Интересным выявление приложением чужеродных полимеразной генетических цепной структур, реакции встроенных является в заранее определенный район генома изучаемых клеток или вирусов. Появление метода ПЦР значительно упростило процедуру точного извлечения из состава молекул ДНК известных нуклеотидных последовательностей и встройки их в молекулярные векторы. Таким образом, амплификация последовательностей ДНК in vitro находит широкое применение как в экспериментах по клонированию в составе молекулярных векторов, так и для прямого анализа вариантных состояний генов. Особое значение рассмотренный методический подход имеет при разработке простых тест-систем для выявления в организме нуклеиновых кислот инфекционных агентов. Многочисленные фирмы производят тест-системы для идентификации методом ПЦР (или ОТ-ПЦР) практически всех известных микроорганизмов, вызывающих заболевания человека и животных. В частности, этот подход используют для ранней диагностики наличия в организме вируса иммунодефицита человека, что не удается осуществить другими методами. Таким образом, в настоящее время ПЦР диагностика генетического материала особенно актуальна, открывая новые перспективы для медицинской диагностики, как мощный и эффективный диагностический инструмент, позволяющий быстро и точно найти возбудителей множества инфекций. ПЦР анализ стал для ряда заболеваний «золотым стандартом», который проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод имеет большое значение для мониторинга и оценки эффективности терапии, особенно при вирусных заболеваниях. ПЦР диагностика открывает фантастические возможности анализа генома человека - выявляя предрасположенность дефектные к гены, определяющие сердечнососудистым, наследственную онкологическим, нейродегенеративным заболеваниям, заболеваниям, связанным с нарушением обмена веществ. 51 Несмотря на то, что уже сейчас техника выполнения процедур ПЦРдиагностики довольно проста, большая востребованность метода на рынке ведет к еще большему усовершенствованию метода. В этой связи можно сформулировать основные направления развития ПЦРдиагностики в ближайшем будущем: - повышение общей надежности метода; - дальнейшее упрощение процедуры анализа; - сокращение времени исследования; - широкое внедрение количественной ПЦР. В свою очередь, эти тенденции будут реализованы за счет использования флуоресцентных методов детекции продуктов амплификации, автоматизации и применения компьютерных методов регистрации и трактовки результатов исследования. В заключении можно сказать, что на сегодняшний день метод ПЦР имеет огромное научное и прикладное значение и с его помощью реализуются масштабные исследования в области медицины и биологии. Технология ПЦР совершила гигантский рывок и стала неотъемлемой частью рутинной лабораторной практики, продолжая при этом совершенствоваться и развиваться. Задача 1. Постановка полимеразной цепной реакции Цель работы. Ознакомиться с методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Принцип метода*. Специфическая амплификация ДНК с помощью полимеразы, осуществляющей избирательный синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух праймеров (затравок) *- принцип метода был разработан Кэри Мюллисом (фирма “Cetus”, США) в 1983г. Оборудование и материалы. 1. Термоциклер (ДНК-амплификатор). 2. Микроцентрифуга-вортекс (до 2000 g). 3. Термостат твердотельный с функцией охлаждения для микропробирок вместимостью 0,5-1,5 мл. 52 4. УФ-бокс. 5. Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками. 7. Набор реагентов для амплификации ДНК: микропробирки, содержащие лиофилизированную амплификационную смесь «ПЦР-ядро»; ПЦР-растворитель; смесь праймеров готовят самостоятельно или она входит в состав смеси; положительный контроль (раствор стандартной ДНК) подбирается самостоятельно или входит в состав смеси; масло минеральное. 8. Растворы ДНК-матрицы (образцы ДНК, выделенные из прокариот или эукариот). 9. Вода дистиллированная. 10. Перчатки резиновые или латексные, неопудренные. Ход работы. Внимание! Все манипуляции производить только в перчатках! Наконечники для автоматического дозатора необходимо использовать однократно! 1. Извлекают из пакета необходимое количество пробирок ПЦР-ядро (оно равно числу анализируемых проб плюс положительный и отрицательный контроль), размещают их в штативе и маркируют. Обратите внимание, на дне каждой пробирки находится лиофилизированная смесь, которая затем должна быть полностью растворена. Положительным контролем (К+) служит раствор, образуемый стандартной ДНК (см. далее). Отрицательный контроль (К-) - ТЕ-буфер из комплекта, использованного для выделения ДНК. 2. Добавляют в каждую пробирку ПЦР-ядро по 10 мкл ПЦР- растворителя. 3. Добавляют в каждую пробирку ПЦР-ядро 5 мкл смеси прямого и обратного праймеров. Аналогично приготовить положительный контроль, используя раствор ДНК (20- 50 нг/мкл), выделенной из растительной или животной ткани любым из приведенных ранее способов. 4. Содержимое пробирок перемешивают, встряхивая на вортексе, до полного растворения сухих компонентов смеси. Обычно для этого требуется 5-10 мин. 5. Добавляют в пробирки с амплификационной смесью: • в пробирку с маркировкой К- (отрицательный контроль) - 5 мкл ТЕ- буфера из комплекта, использованного для выделения ДНК; 53 • в пробирки с маркировкой № ... (исследуемые образцы) - по 5 мкл пробы соответствующей ДНК-матрицы; • в пробирку с маркировкой К+ (положительный контроль) - 5 мкл раствора стандартной ДНК. 6. Содержимое всех пробирок еще раз аккуратно перемешивают. 7. Во все пробирки добавляют по 20-25 мкл (две капли) минерального масла, пробирки плотно закрывают крышечками. 8. Пробирки центрифугируют 5-7 с при 2000 g. При этом отдельные капли ПЦР-смеси, оказавшиеся при ее перемешивании на стенках и крышке пробирки, должны быть сброшены на дно, а сверху ровно наслоено минеральное масло. 9. Пробирки с готовой ПЦР-смесью помешают в амплификатор и запускают программу амплификации (контроль температуры в термоблоке амплификатора должен осуществляться в режиме активного реагирования температуры): 94°С - 3 мин; 35 циклов, включающих: 94°С (денатурация) - 40 с, 58 °С (отжиг праймеров) - 30 с, 72°С (элонгация) - 40 с; 72°С- 4 мин. 10. По окончании амплификации пробирки извлекают из амплификатора, помещают в штатив и переносят в зону для электрофореза продуктов ПЦР. ПЦР-продукты (ампликоны) можно использовать в других практических работах и хранить в течение 1-2 нед при - 18°С. 11. Детекцию результатов ПЦР производят с помощью электрофореза в агарозном геле (практическая работа № 5). 12. Полученные результаты регистрируют визуально или с помощью видеосистемы. Контрольные вопросы для подготовки к защите лабораторной работы: 1. Каков принцип метода ПЦР? 2. Из каких этапов состоит цикл ПЦР? 3. Из каких компонентов состоит реакционная смесь? 54 4. Каковы основные причины получения ложноположительных результатов при проведении ПЦР? 5. Какие контроли и с какой целью используют при постановке ПЦР? 6. В какой очередности осуществляют внесение образцов и контролей в ПЦРсмесь? 7. Каково устройство ПЦР-лаборатории? 8. Каково практическое применение метода ПЦР? 9. В чем преимущества и недостатки метода ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний? Лабораторная работа № 4. «Ферментативный гидролиз нуклеиновых кислот». Ферменты, катализирующие деградацию нуклеиновых кислот путем разрыва межнуклеотидных фосфодиэфирных связей (нуклеазы), присутствуют во всех живых организмах. Некоторые из них - РНКазы - активны исключительно по отношению к РНК, другие - ДНКазы - действуют на ДНК. Отдельная группа (так называемые неспецифические нуклеазы) проявляет активность в отношении как РНК, так и ДНК1. Принципы, используемые для классификации нуклеаз, связаны с тремя их главными свойствами. Первое - это субстратная специфичность. Указанный критерий позволяет дискриминировать ферменты по их способности узнавать в виде субстратов либо РНК, либо ДНК, либо обе нуклеиновые кислоты. Вторым свойством является способ атаки субстрата. Этот критерий позволяет различать эндонуклеазы - ферменты, расщепляющие связи внутри полимерной цепи, от экзонуклеаз, последовательно отщепляющих нуклеотиды с одного из концов цепи. Фермент, который узнает специфическую последовательность нуклеотидов в двуцепочечной ДНК и расщепляет сахарофосфатный остов каждой цепи дуплекса 1 Родственными нуклеазам являются фосфомоноэстеразы (фосфатазы) - ферменты, которые действуют на мононуклеотиды и олигонуклеотиды, содержащие концевые фосфатные группы, освобождая при этом неорганический фосфат. К специфическим фосфомоноэстеразам относятся также нуклеотидазы, катализирующие гидролитическое расщепление нуклеозидмонофосфатов на нуклеозид и фосфорную кислоту. Широкое распространение в природе нуклеаз и фосфатаз говорит о важной, хотя и далеко еще не окончательно понятой биологической роли, которую играют эти ферменты в живых организмах. 55 в определенном месте, называют также ферментом рестрикции (перев. с англ. restriction -ограничение). Следует отметить, что некоторые экзонуклеазы (например, фермент, выделяемый из змеиного яда) в литературе называют фосфодиэстеразами. Однако, поскольку и эндонуклеазы являются фосфодиэстеразами, некорректно применять этот термин только к некоторым из них, а именно к экзонуклеазам. С третьим свойством связан способ разрыва фосфодиэфирной связи - гидролиз связи между 5'-ОН-группой и фосфатом или связи между 3'-ОН-группой и фосфатом с образованием продуктов, несущих соответственно 3'- или 5'-концевые фосфатные группы. Для характеристики действия нуклеаз привлекаются и другие критерии. Среди них: а) отношение к вторичной структуре субстрата. По этому признаку ДНКазы разделяются на ферменты, расщепляющие двухцепочечную, одноцепочечную или обе указанные формы ДНК; б) способность расщеплять ДНК по одно- или двуударному механизму, разрывая обе цепи полимера в одном и том же участке или производя беспорядочные одиночные разрывы; в) специфичность к азотистым основаниям у гидролизуемой фосфодиэфирной связи. Этот критерий, панкреатической РНКазы введенный к после участкам РНК, обнаружения содержащим специфичности пиримидины, оправдывает себя по отношению к некоторым РНКазам и особенно рестрикционным эндодезоксирибонуклеазам; г) специфичность к определенным нуклеотидным последовательностям (так называемые рестриктазы). Рис. 10. Классификация нуклеаз по способу атаки субстрата. 56 На рис. 10 представлена несколько упрощенная классификационная схема нуклеаз. Следует отметить, что рассмотренная классификация нуклеаз на практике часто выявляет свою относительность. Например, имеется несколько ферментов, которые могут выступать и как эндо-, и как экзонуклеазы. Кроме того, недавно было показано, что некоторые бактериальные и дрожжевые ДНКазы имеют и хеликазную активность. При этом дрожжевой фермент проявляет еще и ДНК-зависимую АТФазную активность. Некоторые РНКазы, например РНКаза Н, расщепляют РНК исключительно в составе гибрида с комплементарной цепочкой ДНК. Говоря о роли нуклеаз в клетке, прежде всего, следует отметить, что в клетках не только происходит синтез молекул ДНК и РНК, но и наблюдается их специфическая деградация при помощи довольно широкого спектра нуклеаз. Так, эндонуклеаза V Escherichia coli репарирует повреждения в одно- и двухнитевой ДНК, а эндонуклеаза Vsr инициирует репарацию T/G-ошибок спаривания. Участие экзонуклеаз в репарации ошибочно спаренных оснований показано также для Saccharomyces cerevisiae и вируса гриппа. Показана роль нуклеаз у E. coli для поддержания структуры хромосом путем расщепления шпилечных структур, которые появляются в некоторых реакциях рекомбинации и мешают движению репликативной вилки. 3'-Экзонуклеазная активность у E. coli играет важную роль, обеспечивая образование брешей во время репарации межнитевых сшивок и повреждений в противолежащих нитях ДНК. Поэтому не является случайным то, что снижение активности экзонуклеазы Bacillus subtilis в результате мутации повышает чувствительность клеток к УФ-облучению. Некоторые из нуклеаз выполняют несколько функций. Например, нуклеаза Mre11 Sacch. cerevisiae принимает участие в репарации и рекомбинации ДНК, а также в поддержании размера теломер. Важная роль нуклеаз показана в так называемой запрограммированной гибели клеток (апоптозе) высших эукариот, в процессе которой происходит деградация ядерной ДНК под действием нескольких нуклеаз, находящихся под различной регуляцией. Аналогичная роль обнаружена недавно и для некоторых нуклеаз Str. antibioticus, которые участвуют в гибели клеток в процессе дифференцировки и споруляции мицелия. Мембрансвязанная нуклеаза Bac. 57 subtilis принимает основное участие в деградации ДНК в процессе гибели клеток, вызванной температурным шоком. Интересное последовательное действие нуклеаз показано при деградации мРНК у эукариот. Так, на первой стадии специфическая нуклеаза проводит удаление полиаденилатного участка на 3'-конце молекулы мРНК, после чего специфическая фосфодиэстераза удаляет кэп на ее 5'-конце и, наконец, 5'→3'-экзонуклеаза полностью деградирует РНК до мононуклеотидов. Некоторые внеклеточные нуклеазы защищают клетки бактерий от проникновения чужеродного генетического материала. Другие могут быть вирулентными факторами у патогенных бактерий и вирусов. РНКазы, специфичные к субстратам poly(U) и ро1у(С), играют важную роль в процессинге РНК и терминации транскрипции у бактерий и дрожжей. Среди причин, привлекающих внимание многих исследователей к изучению нуклеаз, следует указать на перспективность использования этих ферментов: а) при получении нуклеотидов и нуклеозидов; б) в качестве противовирусных препаратов в медицине и сельском хозяйстве. В России разработан способ выращивания безвирусного картофеля методом апикальной меристемы с использованием бактериальных нуклеаз. Помимо антивирусной активности, эти нуклеазы обладают ростстимулирующим действием, что способствует увеличению числа прижившихся меристем, увеличению длины ростков картофеля в 2-3 раза, увеличению числа и массы клубней; в) в качестве инструментов в исследовании структуры ДНК, создании рекомбинантных молекул, изучении генетического материала, в том числе геномной дактилоскопии; г) для удаления примесей РНК из препаратов ДНК и, наоборот, для решения обратной задачи; д) для уменьшения содержания нуклеиновых кислот в препаратах белков одноклеточных, предназначенных для пищевых и кормовых целей; е) для использования в качестве объектов изучения структурно-функциональных связей в химии белка; ж) для стимуляции роста микроорганизмов и растений, а также активации биосинтеза различных продуктов в микробиологической промышленности. Так, установлена способность микродоз РНКазы (биназы) ускорять образование биомассы лактобацилл и повышать их адгезивные свойства; з) для активации реакций клеточного и гуморального иммунитета. 58 Система рестрикции-модификации бактерий (так называемая R-M система от англ. restriction modification system). Обычно термин относят к системе, обладающей двумя ферментативными активностями, характерными для эндонуклеазы рестрикции и метилтрансферазы. Общепринято, что такие системы в норме используются бактериями (и, вероятно, другими прокариотами) для защиты от вирусов, плазмид и других чужеродных ДНК. Эндонуклеазы рестрикции узнают и расщепляют поступающую извне ДНК. Собственнная ДНК клетки не расщепляется, поскольку узнаваемые эндонуклеазами рестрикции последовательности метилируются ДНК-метилтрансферазами и таким образом оказываются защищенными от гидролиза. Существует четыре типа RM-систем. Они были названы в порядке открытия, хотя RMсистема типа II наиболее распространена. Ферменты RM-системы типа I состоят из субъединицс метилтрансферазной активностью, субъединицы представляющей собой эндонуклеазу рестрикции, и субъединицы опрделеяющей специфичность узнавания нуклеотидной последовательности (кодируются тремя различными генами). Ферменты RM-системы типа II кодируются двумя генами; это два разных фермента – эндонуклеаза рестрикции и метилтрансфераза. Ферменты RM-системы типа III также кодируются двумя генами. Один из них отвечает за синтез метилтрансферазы, образовыввать комплекс которая с может функционировать субъединицей, представляющей самостоятельно собой или эндонуклеазу рестрикции. Ферменты RM-системы IV функционируют автономно и расщепляют метилированную ДНК (см. табл. 3). Эндонуклеазы рестрикции II типа широко используют в работах по генной инженерии, в частности по картированию геномов, клонированию, определению нуклеотидных последовательностей (секвенированию). Рестрикционное картирование заключается в анализе фрагментов рестрикции2, полученных расщеплением ДНК несколькими ферментами индивидуально и в комбинации. В сочетании с простым сравнением рестрикционных фрагментов часто используются некоторые дополнительные подходы, например, введение радиоактивно меченой фосфатной группы в конец молекулы ДНК. В этом случае можно определить положение сайта рестрикции от конца исходной молекулы ДНК. Чем больше длина наблюдаемого фрагмента, тем дальше сайт рестрикции расположен от радиоактивно меченного конца исходной ДНК. Обычно для составления рестрикционной карты требуется биоинформационный анализ длины фрагментов рестрикции. 2 Фрагмент рестрикции – продукт расщепления двуцепочечной ДНК соответствующей рестриктазой. Эти фрагменты могут быть разделены по размеру методом гель-электрофореза. Размеры каждого фрагмента можно определить путем сравнения с положением в геле фрагментов известного размера. 59 Таблица 3. Характеристика эндонуклеаз рестрикции прокариот. Тип рестриктаз I (29%) II (45%) III (8%) IV (18%) Общая характеристика типа Сайт рестрикции Примеры Состоят их трех субъединиц – HsdS, HsdR, HsdM. Они ответственны за узнавание нуклеотидной последовательности, гидролиз и ее метилирование соответственно. Четвертичная структура активной эндонуклеазы имеет вид HsdS2HsdR2HsdM2. Для эффективного катализа необходимы АТФ, Mg2+, Sаденозин-L-метионин. Ди- и тетрамерные белки, которые функционируют независимо от метилтрансфераз. Кофактор Mg2+ Обычно взаимодействуют с двумя асимметричными участками, разделенными произвольной нуклеотидной последовательностью, транслоцируют ДНК и расщепляют ее в случайном мести, которое может находится на расстоянии 1000 п.н. и более от участка узнавания. Состоят из двух субъединиц – Mod (ответственна за узнавание и модификацию ДНК) и Res (отвечает за расщепление ДНК). В активном состоянии ферменты имеют стехиометрию Mod2Res2. Для функционирования требуется АТФ и Mg2+. Sаденозин-L-метионин также стимулирует их действие. Наиболее изучен фермент MrcBC, который состоит из двух субъединиц (B и C), ответственных за узнавание и гидролиз ДНК. Для расщепления ферменту требуются ГТФ и Mg2+. Взаимодействуют с двумя асимметричными участками узнавания, транслоцируют ДНК и расщепляют ее на расстоянии примерно 25 п.н. от одного из участков узнавания. EcoKP1I, EcoP15I Узнают и расщепляют метилированную ДНК. В молекуле ДНК MrcBC узнает как минимум два динуклеотида – dA и dG, за которыми следует метилированный остаток dC; при этом расстояние между ними может составлять от 40 до 3000 п.н. MrcBC3 EcoKI, EcoR1241 EcoAI, Обычно узнают достаточно короткие (4-8 п.н.) специфические (очень часто палиндромные) последовательности ДНК. Расщепляют связи в определенных положениях внутри участка узнавания или за его пределами с образованием тупых или липких концов. 3 Аббревиатура названия каждого фермента является производной от бинарного названия микроорганизма, содержащего данную метилазно-рестриктазную систему. Составляют по правилу: к первой прописной букве названия рода добавляют две первые строчные буквы вида: Streptomyces albus - Sal, Escherichia coli – Eco. В случае необходимости добавляют обозначение серотипа или штамма, например, Есо B. Различные системы рестрикции - модификации, кодируемые одной бактериальной клеткой, обозначают римскими цифрами: Hind II, Hind I, Hind III (Haemophilus influenzae). Рестриктазы обозначают буквой R (R Hind III), метилазы - М (М Hind III). 60 За единицу активности рестриктазы принимают количество фермента, способное за 1 ч в оптимальных для него условиях полностью гидролизовать 1 мкг ДНК фага λ. Для проведения успешной рестрикции необходимо соблюдать ряд условий, которые приведены в табл. 4. Таблица 4. Условия рестрикции. Фактор Рестриктаза Буферный раствор ДНК Объем смеси Требование 1. Тип - в зависимости от цели работы. При выборе необходимо знать, есть ли в используемой ДНК сайт или сайты узнавания для данной рсстриктазы 2. Количество - в зависимости от количества ДНК (1 ед. акт. фермента на 1 мкг ДНК). Для большей эффективности лучше использовать двухили трехкратный избыток фермента. Состав: 1) трис-HCl буферный раствор для поддержания рН (около 7,5); 2) MgCl2 (ионы магния являются единственным кофактором рестриктаз класса II); 3) дитиотрейтол или 2меркаптоэтанол для стабилизации фермента с добавлением бычьего сывороточного альбумина (БСД) как стабилизатора; 4) NaCl (или KCl) для создания необходимой ионной силы реакционной смеси От 1 до 10 мкг, поскольку большие количества ДНК увеличивают вязкость раствора, что приводит к ингибированию реакции Oт 10 до 50 мкл Температура 37°С для рестриктаз Время От 1 до 5 ч Дополнительная информация Для выявления сайтов используют генетические карты или секвенированные последовательности ДНК. Большой избыток активности рестриктазы или объема ее раствора, взятого на реакцию (более 1/10 конечного объема), может привести к уменьшению специфичности работы фермента Для различных рестриктаз требуются определенные концентрации компонентов. Однако для удобства работы большинство ферментов было объединено в 4—5 групп и для каждой из них ДНК должна быть очищена от реагентов, используемых полисахаридов и РНК Для уменьшения испарения и поддержания постоянного объема реакционной смеси добавляют вазелиновое масло большинства 25°С (для SmaI), 65°С (для рестриктаз из термофильных бактерий – BstBI, TaqI и др.) Реакцию можно остановить с помощью ЭДТА-Na 61 Задача 1. Рестрикционный анализ ДНК. Цель работы. Ознакомиться с методом рестрикционного анализа ДНК. Принцип метода. Расщепление молекулы ДНК на фрагменты осуществляется за счет действия рестриктазы II типа – EcoRI. Оборудование и материалы. 1. Микроцентрифуга высокоскоростная до 10000g. 2. Микроцентрифуга-вортекс до 2000g. 3. Термостат твердотельный для микропробирок вместимостью 0,5—1,5 мл. 4. Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками. 5. Микропробирки вместимостью 0,5 мл. 6. Термостат твердотельный с функцией охлаждения для микропробирок вместимостью до 1,5 мл. 7. Рестриктаза EcoRI и буферный раствор для нее. 8. Раствор плазмидной ДНК (pGEM3Z) и ДНК фагаλ. 9. Вода стерильная деионизованная. Ход работы. 1. Смесь для рестрикции (общий объем — 40 мкл) готовят в микропробирке вместимостью 0,5 мл, поместив ее и все исходные компоненты в термостат с функцией охлаждения при 4°С: 10х буфер для рестриктазы EcoRI — 6 мкл; рестриктаза EcoRI (10 ед.) — 2 мкл; вода стерильная деионизовапная — 32 мкл. Вышеперечисленные компоненты смешивают в указанных количествах, с помощью автоматического дозатора отбирают по 20 мкл смеси и переносят в две чистые микропробирки вместимостью 0,5 мл. Внимание! При смешивании необходимо проводить смену наконечников после каждого раствора. В пробирку 1 (промаркировав ее) добавляют 10 мкл раствора ДНК фага λ в концентрации 0,4 мкг/мкл, а в пробирку 2 (промаркировав ее) — 10мкл раствора плазмидной ДНК (pGEM3Z) в концентрации 0,4 мкг/мкл. 62 2. Смеси в двух пробирках очень осторожно перемешивают с использованием дозатора с наконечником, добавляют 10 мкл минерального масла, центрифугируют 5 с при 2000 g и выдерживают в термостате 1 ч при 37 °С. 3. Через 5, 20, 40 мин и по истечении 1 ч от начала рестрикции из пробирки 2 отбирают пробы по 5 мкл и переносят в чистые микропробирки вместимостью 0,5 мл, маркируя их при этом. 4. Каждую из отобранных проб сразу же смешивают с 5 мкл краски-лидера (из набора для электрофореза), помещают в термостат с функцией охлаждения при 4°С и оставляют до тех пор, пока не будет отобрана последняя проба. 5. Четыре содержащие гидролизованную ДНК пробы, отобранные из пробирки 2, а также пробу из пробирки 1 (аналогично смешанную с краской-лидером) вносят в лунки пластины агарозного геля и подвергают электрофорезу для исследования динамики рестрикции (см. далее). Контрольные вопросы для подготовки к защите лабораторной работы: 1. Какие ферменты принято называть нуклеазами и каковы особенности их катализа? 2.Какие функции могут выполнять нуклеазы внутри клетки? 3. В чем состоит перспективность использования нуклеаз в молекулярногенетических исследованиях? 4. Какова функция RM-систем в прокариотической клетке? 5. Почему в генетической инженерии применяются только рестриктазы второго типа? В чем особенность их катализа? 6. Какие основные условия необходимо соблюдать при проведении рестрикционного анализа? 63 Домашняя контрольная работа к модулю №2. 1. Опишите механизм репликации катящегося кольца. 2. Обсудите механизм, при помощи которого смежные фрагменты Оказаки соединяются в ходе репликации отстающей нити ДНК у E. coli. 3. Фермент ДНК - полимераза I принимает участие в репликации ДНК: а) имеет ли этот фермент иную активность, кроме ДНК-полимеразной? б) как работает этот фермент in vivo? в) важна ли активность ДНК-полимеразы I для клеток E. coli? Почему? 4. Почему в ходе последовательных кругов репликации ДНК у эукариот концы линейных хромосом становятся короче? 5. Каковы механизмы возникновения мутаций в геноме? 6. Как могут мутации в некодирующих последовательностях ДНК пагубно повлиять на экспрессию генома? 7. Обсудите письменно потенциальное воздействие различных типов мутаций, изображенных на рисунке: 8. Каково название фермента, который удаляет поврежденное основание из молекулы ДНК? Какой способ употребляется для репарации ДНК после удаления основания? 64 9. Какова роль рекомбинации в эволюции генома? Темы докладов к модулю №2 1. ПЦР в реальном времени. Современные тенденции развития метода. 2. ПЦР с обратной транскрипцией. 3. ПЦР как метод диагностики инфекционных заболеваний. 4. Устройство ПЦР лаборатории. 5. Метод ПЦР в судебно-медицинской экспертизе. 6. Молекулярные маркеры в генетических исследования. 65 МОДУЛЬ 3. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД. ТРАНСКРИПЦИЯ. БИОСИНТЕЗ БЕЛКА. Содержание модуля №3. Общая схема биосинтеза белка. Генетический код. Расшифровка кода. Общие свойства кода. Эксперименты, приведшие к их открытию. Разнообразие функций нуклеотидов в кодонах. Универсальность генетического кода и примеры исключений. Митохондриальный код. Случаи перекрытия генов. Помехоустойчивость генетического кода. Проблемы происхождения и эволюции кода. Транскрипция. Транскриптоны про – и эукариот. Характеристика РНК полимеразы про – и эукариот. Промоторы, их особенности для разных РНК – полимераз. Нуклеотидные последовательности промоторов прокариот. Блок Прибнова. Цикл комплекса. транскрипции. Инициация. Стадии Понятие транскрипции. абортивной Образование инициации. «закрытого» Характеристика элогации. Процессинг первичных транскриптов. Процессинг рРНК и тРНК в клетках бактерий. Схема сплайсинга экзонов при образовании зрелой мРНК эукариот и модификация 5`и 3`- концов. Молекулярная Аминоацил – организация тРНК – тРНК. синтетазы, Открытие особенности их и структура тРНК. функционирования. Взаимодействие аминокислот с тРНК. Адапторная гипотеза и ее доказательства. Специфичность аминоацилирования тРНК. Сущность гипотезы нестрогого соответствия при кодон - антикодоновом спаривании Ф. Крика (гипотеза «качания»). Структурная организация рибосом. Локализация рибосом в клетках прои эукариот. Прокариотический и эукариотический типы рибосом (морфология, внешний вид и субъединичная организация). Характеристика рибосомальных белков и рРНК. Взаиморасположение рибосомальных белков и рРНК в пространстве. Структурные превращения рибосом. Функциональные активности (функции связывания, катализа, транслокации) и функциональные участки 66 рибосомы. Последовательное считывание мРНК рибосомами. Понятие полирибосом. Трансляция и ее основные стадии. Условия трансляции. Ферменты (факторы) трансляции про – и эукариот. Последовательность событий в процессе инициации. Узнавание инициирующего кодона. Элонгация. Рабочий цикл рибосомы и его основные этапы. Энергетика реакции транспептидации. Молекулярный механизм транслокации. Терминация трансляции. Кодоны терминации. Последовательность событий при терминации. Особенности трансляции в про- и эукариотических системах. Энергетика биосинтеза белка. Посттрансляционные модификации белков. Образование пространственной организации белковых молекул. Вклад рибосомы в сворачивание белка. Регуляция биосинтеза белка. Необходимость регуляции биосинтеза белка. Экспериментальные доказательства регуляции. Множественность систем регуляции. Регуляция транскрипции у прокариот. Репрессоры. Положительная регуляция. Гипотеза оперона Ф. Жакоба и Ж. Моно. Аттенюаторы, механизм их участия в регуляции транскрипции. Регуляторные элементы и регуляция транскрипции у эукариот. Цис- и трансрегуляция. Регуляция транскрипции генов рРНК РНК-полимеразой 1. Механизм регуляции транскрипции генов РНК – полимеразой 2. Регуляторные «мотивы» в промоторной области. Энхансеры и взаимодействующие с ними белки. Регуляция работы РНК – полимеразы 3. Сайленсеры и адапторные элементы в регуляции транскрипции. 67 Тема «Определение первичной нуклеотидной последовательности ДНК (секвенирование по Сэнджеру)». Расшифровку нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот в отечественной литературе принято называть секвенированием (от англ. sequencing – определение последовательности). Секвенирование является одним из центральных методов молекулярной биологии. Хотя в настоящее время можно с достаточной степенью надежности получать информацию о последовательности аминокислот, часто удобнее и быстрее анализировать ДНК. Знание точного использования кодонов, информация относительно мутаций и полиморфизмов, идентификация регуляторных последовательностей, контролирующих ген, - все это возможно также только при анализе последовательности ДНК. Для определения нуклеотидной последовательности разработаны два подхода: один, основанный на ферментативном методе, часто называют секвениронанием по Сэнджеру, и химический метод Максама-Гилберта. В настоящее время секвенирование по Сэнджеру является довольно популярным методом - для него в распоряжении имеются многочисленные коммерческие наборы. Секвенирование по Сэнджеру (секвенирование ДНК с обрывом цепи)4. Данный метод секвенирования ДНК был предложен Ф. Сэнджером и Д. Коулсоном в 1975 г. (рис. 11). Рис 11 Фредерик Сэнджер – английский биохимик, дважды лауреат Нобелевской премии по химии: за определение инсулина аминокислотной (1955 г.) и за последовательности разработку метода секвенирования ДНК (1980 г.) 4 В данном разделе описана современная модификация метода Сэнджера, используемая в большинстве автоматических секвенаторов 68 За время, прошедшее со дня разработки метода ферментативного секвенирования по Сэнджеру с помощью дидезокситерминаторов, он претерпел многочисленные модификации и всевозможные улучшения. В той или иной степени, изменениям подверглись почти все составляющие этого процесса. Одним из условий для определения последовательности ДНК по Сэнджеру является то, что секвенируемая ДНК должна быть именно в одноцепочечной форме. Секвенирование ДНК с обрывом цепи основано на том принципе, что молекулы однонитевой ДНК, которые отличаются друг от друга по длине только на один нуклеотид, могут быть разделены между собой посредством электрофореза в полиакриламидном геле. Это означает, что возможно разрешать семейство молекул, представляющее весь диапазон длин от 10 до 1500 нуклеотидов, в виде ряда полос в плоском или капиллярном геле. Для проведения секвенирования с обрывом цепи необходимы следующие основные компоненты: 1) матрица – однонитевая версия молекулы ДНК, соответствующая исследуемому участку генома. Она может быть получена несколькими способами: - ДНК может быть клонирована в плазмидном векторе. Получающаяся ДНК будет двунитевой и, таким образом, не может быть непосредственно использована в секвенировании. Для этого она должна быть преобразована в однонитевую ДНК посредством денатурации щелочью или кипячением. Этот метод получения матричной ДНК для севенирования стал общепринятым – в значительной степени благодаря тому, что клонирование в плазмидном векторе является стандартной процедурой. Недостаток его состоит в сложности приготовления плазмидной ДНК, не загрязненной малыми количествами бактериальных ДНКи РНК, которые могут оказаться соответственно ложными матрицами или затравками в эксперименте по секвенированию; - ДНК может быть клонирована в векторе на бактериофаге М13. Векторы, основанные на бактериофаге М13, специально разработаны для производства однонитевых матриц для секвенирования ДНК. Бактериофаг М13 имеет геном из однонитевой ДНК, который после инфицирования бактерии Escherichia coli преобразуется в двунитевую репликативную форму (рис. 12). 69 Рис 12. Получение однонитевой ДНК путем клонирования на бактериофаге М13. Репликативная форма копируется до тех пор, пока в клетке не будут присутствовать более 100 молекул, и когда клетка делится, число копий в новых клетках поддерживается за счет последующей репликации. В то же время зараженные клетки непрерывно выделяют новые частица фага М13 – приблизительно1000 за одно поколение, - причем эти фаги содержат однонитевую версию генома. Клонирующие векторы, основанные на векторах М13, представляют собой двунитевые молекулы ДНК, эквивалентные репликативной форме генома бактериофага М13. Ими можно манипулировать в точности таким же образом, что и плазмидным клонирующим вектором. Различие состоит в том, что клетки, которые были подвергнуты трансфекции рекомбинантным вектором М13, выделяют фаговые частицы, содержащие однонитевую ДНК, причем эта ДНК включает в себя векторную молекулу плюс любую дополнительную ДНК для секвенирования с обрывом цепи. Единственный недостаток при клонировании в векторе на фаге М13 заключается в том, что фрагменты ДНК длиннее приблизительно 3 тыс. п.н. претерпевают удаления и перестройки, так что такая схема может быть применима только с короткими частями ДНК; - ДНК может быть клонирована в фагмиде. Это плазмидный клонирующий вектор, который содержит в дополнение к своей плазмидной области инициации 70 данную область от фага М13 или любого другого бактериофага с геномом из однонитевой ДНК. Если клетка E. coli содержит и фагмиду, и репликативную форму фага-помощника, причем последний несет гены ферментов репликации фага и белков капсида, то область инициации фага в фагмиде становится активированной, что приводит к синтезу фаговых частиц, содержащих однонитевую версию этой фагмиды. Двунитевая плазмидная ДНК тем самым преобразуется в однонитевую матричную ДНК для секвенирования ДНК. Эта система избегает неустойчивости клониварония в векторе на фаге М13 и может быть использована с фрагментами длиной до 10 тыс. п.н. и более. - ДНК может быть клонирована с помощью ПЦР. Появление ПЦР обеспечило возможность не только амплификации любой геномной области или кДНК, но также очень быстрое получение соответствующих нуклеотидных последовательностей. Это привело ко взрыву в накоплении информации о последовательностях ДНК и дало сильный толчок для открытия генов и возникновения геномного картирования. 2) праймер – короткий олигонуклеотид, комплементарный последовательности, расположенной рядом с 5'-концом ДНК в векторе М13 или в ампликоне. Олигонуклеотид затем действует как затравка для синтеза второй цепи ДНК, катализируемого ДНК-полимеразой. Затравка необходима, потому что направляемые матрицей ДНК-полимеразы не могут начать синтез ДНК на молекуле, которая является полностью однонитевой: на ней должна быть короткая двунитевая область, которая может предоставить свой 3'-конец для добавления ферментом новых нуклеотидов. Затравка играет ключевую роль также и в определении области матричной молекулы, которая будет секвенирована. Для большинства экспериментов секвенирования используется «универсальная» затравка, то есть такая, которая является комплементарной части векторной ДНК, непосредственно смежной с точкой, к которой лигирована новая ДНК. Поэтому одна и та же универсальная затравка может дать последовательность любой части ДНК, которая была лигирована в вектор (рис. 13). 71 Рис. 13. Затравки разного типа для секвенирования с обрывом цепи. а) Универсальная затравка отжигается к векторной ДНК, прилегающей к позиции, в которой вставлена новая ДНК. Поэтому одиночная универсальная затравка может использоваться для секвенирования любой вставки ДНК, но обеспечивает только последовательность одного конца вставки. б) Один из способов получения более длинной последовательности – выполнить серию экспериментов с обрывом цепи, каждый с новой, отличной от других, внутренней затравкой, отжигаемой ко внутренним позициям вставки ДНК. 3) ДНК-полимераза – фермент, способный продолжать затравку, отожженную к однонитевой молекуле ДНК. Не все полимеразы делают это таким образом, который был бы пригоден для секвенирования ДНК. Фермент для секвенирования должен удовлетворять в особенности трем следующим критериям: - высокая обрабатывающая способность (процессивность). Эта характеристика относится к длине полинуклеотида, который синтезируется полимеразой прежде, чем она заканчивает синтез в силу естественных причин. Подходящая для секвенирования полимераза должна иметь высокую процессивность, - так чтобы она не отделялась от матрицы до включения в новую нить дидезоксинуклеотида; -незначительное или нулевое действие экзонуклеазы 5'→3'. Большинство ДНК-полимераз обладают также действием экзонуклеаз, следовательно, наряду с синтезом полинуклеотидов ДНК, они могут также и расщеплять их. В секвенировании ДНК это является недостатком, потому что удаление нуклеотидов 72 с 5'-концов новосинтезируемых нитей изменяет длины этих нитей, делая невозможным достоверное определение последовательности; - пренебрежимо малое или нулевое действие экзонуклеазы 3'→5'. Также желательно, чтобы полимераза не удаляла дидезоксинуклеотид на коне законченной нити. Если это случается, то такая нить может быть продолжена далее. В конечном результате в реакционной смеси будет содержаться небольшое число коротких нитей, и последовательность вблизи от затравки будет нечитабельна. Эти требования строгие и полностью не выполняются никакой встречающейся в природе ДНК-полимеразой. Вместо них обычно применяются искусственно видоизмененные ферменты. Первым из таких ферментов была разработана полимераза Кленова, которая является версией ДНК-полимеразы I (Pol I) из Е. coli, у которой было устранено действие экзонуклеазы 5'→3', присущее стандартному ферменту, или путем расщепления соответствующей части белка, или средствами генной инженерии. Полимераза Кленова обладает относительно низкой процессивностью, что ограничивает длину последовательности, которая может быть получена в одном эксперименте, приблизительно до 250 п.н., и приводит к получению в реакции секвенирования неспецифических продуктов – нитей, которые были обработаны естественным образом, а не из-за включения в них дидезоксинуклеотида. Поэтому фрагмент Кленова был заменен видоизмененной версией ДНК-полимеразы, кодируемой бактериофагом Т7 (этот фермент известен под торговым названием «секвеназа»). Секвеназа имеет высокую процессивность, не проявляет действие экзонуклеазы и обладает прочими желательными свойствами, такими как высокая скорость протекания реакции. 4) cмесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) - дезоксиаденозинтрифосфата (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфата (дТТФ) - «строительный материал», используемый полимеразой для синтеза второй цепи ДНК; 5) четыре типа дидезоксинуклеотидтрифосфатов (ддНТФ – ддАТФ, ддЦТФ, ддГТФ, ддТТФ), каждый из которых бывает помечен отличной от других флуоресцентной меткой. При автоматическом секвенировании к флуоресцентным меткам (флуорофорам) предъявляют ряд требований: во-первых, они должны иметь высокий квантовый выход при флуоресценции, обеспечивающий в приборах разного типа детекцию очень малых количеств ДНК; во-вторых, у флуорофоров, 73 используемых для мечения разных азотистых оснований с их последующей детекцией в одной дорожке секвенирующего геля или в одном капилляре, должны быть неперекрывающиеся или незначительно перекрывающиеся спектры эмиссии; в-третьих, желательно, чтобы флуоресцентные красители, используемые для разных нуклеотидов, не различались существенно по своему влиянию на электрофоретическую подвижность меченых ими фрагментов ДНК. И так, исходным материалом для эксперимента секвенирования с обрывом цепи служит препарат из идентичных однонитевых молекул ДНК. Первый шаготжиг короткого олигонуклеотида к одной и той же позиции на каждой из этих молекул. Реакция синтеза нити, катализируемая ДНК-полимеразой и требующая в качестве субстратов четырех дНТФ, обычно продолжается до той стадии, пока не будут полимеризованы несколько тысяч нуклеотидов. В эксперименте секвенирования с обрывом цепи этого не происходит, потому что, наряду с четырмя дНТФ, к реакции в небольших количествах добавляются четыре меченых ддНТФ (рис. 14 и 15). Рис.14. Секвенирование с обрывом цепи. 74 а) Секвенирование с обрывом цепи состоит в синтезе новых нитей ДНК, которые являются комплементарными однонитевой матрице. б) Синтез нити не продолжается неопределенно долго, потому что реакционная смесь содержит маленькие количества каждого из четырех дидезоксинуклеотидов, которые блокируют дальнейшую элонгацию. в) Включение в цепь ддАТФ дает цепи, которые оборваны напротив нуклеотидов Тв матрице. Это производит семейство «А» оборванных молекул. Включение других дидезоксинуклеотидов производит семейства «Ц», «Г» и «Т» Рис. 15. Чтение последовательности, полученной в результате эксперимента с обрывом цепи. а) Каждый дидезоксинуклеотид помечен своим флуофором. б) Распечатка результатов секвенирования. Последовательность представлена рядом пиков, по одному для каждой нуклеотидной позиции. В этом примере зеленый пик соответствует «А», синий – «Ц», коричневый – «Г» и красный – «Т». 75 Фермент полимераза не делает различий между дезокси- и дидезоксинуклеотидами, и, будучи включен в цепь, дидезоксинуклеотид блокирует дальнейшую элонгацию нити, потому что у него отсутствует 3'-гидроксильная группа, необходимая для образования связи со следующим нуклеотидом. Поскольку в реакционной смеси присутствуют также и нормальные дезоксинуклеотиды, и притом в больших количествах, чем дидезоксинуклеотиды, синтез нити не всегда заканчивается поблизости от затравки: фактически несколько сотен нуклеотидов могут полимеризоваться прежде, чем дидезоксинуклеотид будет наконец включен в цепь. В результате образуется набор новых молекул различной длины, и каждая из них заканчивается дидезоксинуклеотидом, тип которого указывает на нуклеотид – А, Ц, Т или Г,- который присутствует в той же позиции в матричной ДНК. Чтобы определить последовательность ДНК, все, что нужно сделать, - это опознать дидезоксинуклеотид в конце каждой молекулы с оборванной цепью. Именно здесь в игру вступает полиакриламидный гель. Смесь ДНК загружают в лунку полиакриламидного плоского геля или в трубку капиллярной гелевой системы и проводят электрофорез с целью разделения молекул по их длине. После разделения молекулы продвигаются мимо датчика флюоресценции, способного различать метки, прикрепленные к дидезоксинуклеотидам. Таким образом, датчик определяет, каким нуклеотидом заканчивается каждая проходящая мимо него молекула: А, Ц, Т или Г. Последовательность может быть распечатана для изучения оператором или введена непосредственно в запоминающее устройство для последующего анализа. Автоматические секвенаторы с многочисленными работающими параллельно капиллярами могут считывать до 96 различных последовательностей за двухчасовой период; это означает, что при среднем числе 750 п.н. за отдельный эксперимент 864 тыс п.н. информации может быть получено на одну машину за один день. Для этого, конечно, требуется круглосуточная техническая поддержка, в идеале с помощью робототехнических устройств, применяемых для приготовления реакций секвенирования и загрузки продуктов реакции в секвенаторы. Если такой промышленный подход может быть поставлен «на конвейер» и поддерживаться в потоке, то данные, необходимые для секвенирования полного генома, могут быть собраны в течение нескольких недель. 76 Контрольные вопросы для подготовки 1. Какой принцип лежит в основе секвенирования по методу Сэнджера? 2. Какие компоненты необходимы для проведения секвенирования с обрывом цепи? 3. Какую функцию выполняют дидезоксинуклеотидтрифосфаты в методе секвенирования по Сэнджеру? Как осуществляется визуализация результатов эксперимента? 4. В каких случаях методов секвенирования с обрывом цепи не применим и требуется использование других подходов? 5. Какие альтернативные методы секвенирования вам известны? 6. В чем принцип секвенирования по Максаму-Гилберту? Каковы преимущества и недостатки метода? Лабораторная работа №5. «Электрофорез ДНК в агарозном геле». Электрофорез – один из наиболее распространенных методов молекулярной биологии и биохимии, используемый для разделения биологических полимерных молекул, таких как нуклеиновые кислоты и белки, а также их фрагментов. Электрофорез основан на физическом явлении, при котором молекулы, несущие различный заряд двигаются под действием приложенного электрического поля с разной скоростью, в результате чего происходит их разделение из исходной смеси. Помимо этого, на скорость движения молекул влияет их размер и пространственная структура, так как электрофоретическое разделение происходит в гелях имеющих жесткую пространственную матрицу. Впервые данный подход был применен шведским химиком Арне Тизелиусом в 1930-х годах для разделения белков сыворотки крови, а уже в 1948-м году, эта работа была отмечена Нобелевской премией. С тех пор электрофорез успешно применяется для разделения почти всех известных органических и неорганических соединений. На протяжении многих лет электрофорез является основным методом разделения белков и нуклеиновых кислот, оставаясь одним из самых чувствительных методов. К примеру, при секвенировании ДНК требуется разделять длинные цепочки полинуклеотидов, содержащих от 200 до 500 пар 77 оснований и отличающихся на один нуклеотид. Ни один другой экспериментальный подход не обладает достаточной разрешающий способностью, чтобы справиться с этой задачей. Наиболее популярны следующие два виды электрофореза: 1) вертикальный электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) наиболее часто используется для разделения белков и, реже, нуклеиновых кислот. Выделяют «нативный» электрофорез в ПААГ (при котором молекулы в процессе разделения остаются в нативном состоянии) и денатурирующий электрофорез в ПААГ, перед которым молекулы подвергаются денатурации с помощью сильного ионного детергента. Электрофорез белков по Лэммли (англ. Laemmli) является типичным случаем денатурирующего электрофореза в ПААГ. Для денатурации белковых молекул здесь используется смесь меркаптоэтанола и додецилсульфата натрия; 2) горизонтальный электрофорез в агарозном геле используется для разделения ДНК и РНК. Для проведения горизонтального электрофореза используют пластину агарозного геля необходимой концентрации с добавлением специального красителя ДНК, например, бромида этидия. Агароза применяется потому, что анализируемые объекты ДНК чаще всего значительно крупнее белков, поэтому они не способны входить в полиакриламидный гель – для них требуется агарозный гель, имеющий поры большого размера. В составе всех нуклеиновых кислот присутствуют химические группы, обладающие в водном растворе электрическим зарядом. Величина общего заряда такой молекулы определяется количеством заряженных групп, их природой, а также кислотностью раствора (рН). Так в нуклеиновых кислотах в широком диапазоне рН на каждую фосфатную группу приходится заряд -1. Отрицательно заряженные молекулы нуклеиновых кислот движутся в приложенном к агарозному гелю электрическом поле к положительно заряженному аноду. Различная скорость движения молекул нуклеиновых кислот обусловлена тем, что крупные молекулы мигрируют в агарозном геле медленнее, чем небольшие. Электрофорез в ПААГ характеризуется высокой разрешающей способностью. Кроме того, акриламид является токсичным веществом. Приготовить ПААГ значительно сложнее, чем агарозный гель. В связи с этим в работе с ДНК преимущественно используют метод горизонтального электрофореза в агарозном геле. 78 На скорость движения ДНК в геле в процессе электрофореза влияют несколько факторов. Скорость движения молекулы в поле единичной напряженности называется электрофоретической подвижностью и является важной характеристикой вещества. Когда биологический образец, такой как ДНК, смешивается в буферном растворе и наносится на гель, две переменные, от которых зависит разделение макромолекул, - это заряд и масса, - действуют одновременно. Электрический заряд от одного электрода отталкивает молекулы, в то время как другой электрод одновременно притягивает молекулы. Силы трения материала, образующего гель, действуют как «молекулярное сито», разделяя молекулы по размеру. В процессе электрофореза макромолекулы вынуждены перемещаться через поры, и скорость их движения через электрическое поле зависит от следующих параметров: - напряженность электрического поля; - размер и форма молекул; - относительная гидрофобность образца; - ионная сила и температура буфера, в котором движутся молекулы. Существует также сопротивление трения, которое замедляет движение заряженных молекул. Эта сила трения является функцией от следующих параметров: - гидродинамический размер молекулы; - форма молекулы; - размер пор среды, в которой происходит электрофорез; - вязкость буфера. Особенности агарозного геля. Агароза – это особо чистая фракция природного линейного полисахарида агара, который получают из морских красных водорослей (Gracilaria, чередующихся Gelidium, остатков Ahnfeltia). Агароза β-D-галактопиранозы и состоит из строго 3,6-ангидридо-α-1- галактопиранозы, объединённых 1→4 связью. Молекулярная масса ее составляет 104-105. Гелеобразование идет путем связывания в пространственную сетку пучков нитей за счет водородных связей между ними. Некоторые виды агарозы образуют прочные гели уже при концентрации 0,3%. При температурах 84-96o (а у специальных типов – уже при 70o) раствор агарозы переходит в прозрачную жидкость – «плавится». Растворы агарозы 79 характеризуются ярко выраженным гистерезисом: они затвердевают, образуя гель, при значительно более низких температурах (36-42o). Агарозный гель - пористая структура, причем увеличение концентрации агарозы в геле приводит к уменьшению размеров его пор. Это позволяет при помощи геля с разной концентрацией агарозы разделять линейные молекулы ДНК в широком диапазоне их размеров, вплоть до 60 тыс. пар нуклеотидов (п. н.). Существует зависимость длины разделяемых фрагментов ДНК от фрагментов ДНК от концентрации агарозы в геле (табл. 5). Таблица 5. Зависимость длины разделяемых концентрации агарозы в геле Концентрация агарозы, % 0,3 0,5 0,6 5-60 1-30 1-20 Длина фрагментов ДНК, тыс. п.н. 0,7 0,8 0,8- 0,6- 12 10 0,9 0,5-8 1 1,2 0,5- 0,4- 7 6 1,5 0,2-3 2,0 0,12 Разделение в агарозных гелях происходит быстро, но с ограниченным разрешением, так как полосы, образующиеся в агарозных гелях, имеют тенденцию размываться/диффундировать и распространяться в стороны. Это является результатом большого размера пор и не может быть предотвращено. Заряд молекулы. Поскольку каждый из нуклеотидов молекулы ДНК несет остаток ортофосфорной кислоты со свободной гидроксильной группой, в нейтральной и особенно в слабощелочной среде молекула ДНК приобретает отрицательный заряд и способность перемещаться в электрическом поле в направлении от катода (отрицательный электрод) к аноду (положительный электрод). Электрофоретическая подвижность молекулы ДНК существенно снижается с увеличением се длины. Буфер для электрофореза. На электрофоретическую подвижность ДНК воздействуют состав и ионная сила буфера для электрофореза. В отсутствии ионов, электропроводимость минимальна, и перемещение ДНК происходит медленно, если вообще происходит. В буфере с высокой ионной силой электропроводность 80 очень эффективна, и образуется значительное количество тепла. В худшем случае, гель расплавляется и ДНК денатурирует. Существует несколько буферов для электрофореза нативной двухцепочечной ДНК. Они содержат ЭДТА (рН 8.0) и трис-ацетат (TAE), трис-борат (TBE) или трисфосфат (TPE) в концентрации приблизительно 50мМ (рН 7.5-7.8). Буферы для электрофореза обычно готовят в виде концентрированных растворов и хранят при комнатной температуре. Маркерная ДНК. При заданном напряжении, концентрации агарозного геля и буфера, расстояние перемещения зависит от молекулярного веса исходного материала. Поэтому, маркерная ДНК известного размера должна наноситься на дорожки и с левого, и с правого края геля. Маркер обычно содержит определенный набор известных сегментов ДНК, которые облегчают определение размера исследуемой ДНК, если какое-либо систематическое искривление геля возникает во время электрофореза. Буфер для нанесения. Образцы ДНК, которые будут наноситься на агарозный гель, сначала смешивают с буфером для нанесения, обычно содержащим воду, сахарозу и краситель (например, ксиленоцианол, бромфеноловый синий, бромкрезол зеленый и другие). Максимальное количество ДНК, которое может быть нанесено, зависит от числа фрагментов. Минимальное количество ДНК, которое может быть выявлено на снимках геля, окрашенного бромистым этидием, составляет около 2 нг в полосе, шириной 0,5 см. Если в полосе такой ширины находится более 500 нг ДНК, значит дорожка перегружена, что приводит к размыванию полосы. Буфер для нанесения используется для трех целей: - увеличение плотности образца для обеспечения попадания ДНК в лунку; - добавление красителя к образцу, чтобы облегчить процесс нанесения; - добавление к образцу такого красителя, который в электрическом поле будет двигаться в сторону анода на предсказуемое расстояние. Напряженность электрического поля. На скорость движения заряженных молекул ДНК в геле влияет напряженность электрического поля, определяемая напряжением постоянного электрического поля, подаваемого на электроды. Данные, приведенные на рисунке 16, свидетельствуют о наличии обратно пропорциональной зависимости между длиной пробега ДНК в геле и напряженностью электрического поля. Число полученных электрофореграмм 81 различно, поэтому разделение фрагментов ДНК для аналитических целей (только с целью детекции ДНК) с максимальным разрешением рекомендуют проводить при напряжении 10-15 В/см, а для препаративных (если ДНК будет в дальнейшем выделена из геля и использована, например, для клонирования) - при ~5 В/см. Линейные молекулы ДНК одного размера движутся в геле с одинаковой скоростью. Однако подвижность суперспирализованных и кольцевых молекул ДНК отличается от подвижности линейных молекул того же размера. Таким образом, методом электрофореза можно фракционировать три формы молекул ДНК бактерий: • суперспирализованную (нативная молекула, стабилизированная белками); • кольцевую; • линейную (расщепленная рестриктазой кольцевая молекула). Разделение трех типов молекул ДНК в одном геле выглядит следующим образом (по подвижности от катода к аноду): (-) Катод Кольцевая молекула ДНК Линейная молекула ДНК Суперспирализованная молекула ДНК (+) Анод Рис. 16. Скорость движения линейных молекул ДНК п зависимости от величины напряженности электрического поля. Светлые зоны - мигрирующие в геле молекулы ДНК разного размера 82 При постановке электрофореза можно определить размер (молекулярную массу) только линейной ДНК. Для этого в одну из лунок геля наносят стандарт, в качестве которого используют специальные маркеры молекулярной массы (смесь фрагментов ДНК с известными значениями молекулярных масс). Для визуализации результатов электрофореза используют краситель бромид этидия, который вносят в процессе приготовления геля. Данное вещество встраивается (интеркалирует) в молекулы ДНК плоскими ароматическими группами. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 ч, гель помещают на светофильтр трансиллюминатора, пропускающего свет в диапазоне 254-400 нм. Краситель начинает флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм), при этом становится видна ДНК. Внимание! Используемый в качестве красителя бромид этидия является мутагенным веществом. При работе с ним необходимо использовать резиновые или латексные перчатки. Помимо бромистого этидия применяют и другие красители. Среди них следует отметить DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол 2HCl), акридиновый желтый и др. Каждый из них обладает своим преимуществом. Сравнительно недавно на рынке появились новые красители. Среди них GelRedTM - является чувствительным, стабильным и безопасным для окружающей среды флуоресцентным красителем для нуклеиновых кислот, созданным на замену высокотоксичного бромистого этидия (EtBr) для окрашивания дцДНК, оцДНК или РНК в агарозном и полиакриламидном гелях. GelRedTM и EtBr имеют фактически одинаковый спектр, поэтому вы можете просто заменить EtBr красителем GelRedTM не меняя имеющуюся у вас систему детекции. Кроме того, GelRedTM является более чувствительным, чем EtBr. Электрофорез в агарозе может быть использован как препаративный метод для выделения ДНК. Интересующие полосы ДНК можно вырезать из геля и выделить ДНК: электроэлюцией; при размягчении кусочка геля в буфере и последующим центрифугированием, собирают супернатант; если используется легкоплавкая агароза – расплавлением кусочка геля и разведением его буфером. В каждом случае ДНК в итоге извлекают из супернатанта переосаждением из этанола. 83 Задача 1. Анализ ДНК методом электрофореза в агарозном геле. Цель работы. Ознакомиться с методом горизонтального электрофореза ДНК в агарозном геле. Принцип метода. Метод основан на миграции заряженной молекулы ДНК под действием электрического поля. Оборудование и материалы. 1. Прибор для горизонтального электрофореза. 2. Источник постоянного тока. 3. Электрическая плитка или СВЧ-печь. 4. Гель документирующая видеосистема. 5. Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками. 6. Колба мерная вместимостью 1 л. 7. Колба коническая вместимостью 0,5 л. 8. Цилиндр мерный вместимостью 250 мл. 9. Кристаллизатор. 10. Набор реагентов для электрофореза включает: смесь для приготовления электродного буфера; навеску агарозы; раствор бромида этидия; раствор краскилидера (бромфеноловый синий). 11. Проба исследуемой ДНК. 12. ДИК-маркер молекулярных масс. 13. Перчатки резиновые или латексные неопудренные. 14. Теплоизолирующая рукавица. 15. Вода дистиллированная. Ход работы. Приготовление рабочего буферного раствора для электрофореза. Содержимое пакета «Буфер для электрофореза» полностью переносят в мерную колбу, растворяют в 600-800 мл дистиллированной воды (для более быстрого растворения следует подогреть раствор до 40-45°С при постоянном помешивании) и доводят объем полученного раствора до 1 л дистиллированной водой. Подготовка прибора для электрофореза к работе (рис. 17, 18). Пользуясь встроенными уровнями и винтовыми ножками, прибор устанавливают строго горизонтально. В рабочую камеру наливают буфер для электрофореза. Для 84 формирования гелевой пластины собирают кювету, в нее помещают аппликатор (гребенку) для формирования лунок в толще геля. Регулируемую высоту аппликатора выставляют таким образом, чтобы расстояние от дна кюветы до каждого из зубцов составляло 1-2 мм. В зависимости от числа анализируемых проб одновременно можно установить одну, две или три гребенки. Приготовление агарозного геля. Навеску агарозы, необходимую для приготовления 1%-ного геля, полностью переносят в коническую стеклянную колбу вместимостью 250-500 мл, добавляют 150 мл рабочего раствора буфера для электрофореза и перемешивают. Суспензию агарозы в колбе доводят до кипения в СВЧ-печи или на электроплитке, периодически помешивая (колбу держать, только надев на руку теплоизолирующую рукавицу). Продолжают нагревание до тех пор, пока содержимое колбы не станет совершенно прозрачным (обычно еще 1 мин). Расплав охлаждают до 55-60°С, добавляют 10мкл раствора бромида этидия, перемешивают (работу проводят в латексных или резиновых перчатках) и наливают на столик для заливки геля, не допуская образования воздушных пузырьков, так, чтобы толщина слоя была не менее 5 мм, а зубцы гребенок были погружены в гель не менее чем на 4 мм. Гель полностью застывает через 15-20 мин. Столик с готовым агарозным гелем и гребенками переносят в камеру для электрофореза, в которую наливают рабочий раствор буфера для электрофореза так, чтобы покрыть гелевую пластину слоем в 2-3 мм. Извлекают гребенки из агарозного геля легким и плавным движением вверх, стараясь не повредить образовавшиеся лунки. Проведение электрофореза. В лунки застывшего агарозного геля (под слой буфера!) осторожно вносят по 3 мкл раствора исследуемых образцов ДНК. В соседнюю лунку геля вносят 3 мкл маркера молекулярных масс фрагментов ДНК. В одну или две (по краям пластины геля) свободные лунки вносят 2-3 мкл краскилидера. Закрывают крышку прибора для электрофореза и подключают его к источнику постоянного тока, строго соблюдая полярность электродов и учитывая, что движение фрагментов ДИК происходит в направлении от катода к аноду (от «минуса» к «плюсу»). На вольтметре источника постоянного тока устанавливают напряжение 120-150 В. В таком режиме процесс электрофореза продолжают около 30 мин, ориентируясь на фронт пробега краски-лидера (приблизительно на 3 см). По окончании электрофореза источник напряжения отключают, снимают крышку 85 прибора, пластину агарозного геля осторожно переносят на светофильтр (просмотровый столик) УФ-трансиллюминатора для детекции (работу проводят в перчатках!). Включают трансиллюминатор. Зоны ДНК, окрашенные бромидом этидия, светятся при УФ-облучении. Внимание! Во избежание повреждения сетчатки глаз ультрафиолетовым излучением наблюдать зоны ДНК следует только через защитное стекло из комплекта трансиллюминатора или защитные (стеклянные) очки. Полученные результаты регистрируют визуально или с использованием гельдокументирующей видеосистемы, пользуясь инструкцией к ней. Рис. 17. Основные элементы установки для проведения горизонтального электрофореза в агарозном геле.5 5 Форезная камера представляет собой ёмкость для электродного буфера с двумя электродам по краям. В пространство между электродами помещается гель, который может быть залит непосредственно в камере при помощи двух металлических заглушек (которые удаляются из камеры перед началом электрофореза), либо отдельно в лотке для геля. Лоток для геля пропускает УФ-излучение с длиной волны больше 300 нм что позволяет использовать о для освещения геля ультрафиолетом при окрашивании ДНК бромистым этидием. Гребёнка служит для формирования лунок в геле; она помещается в ещё не застывший гель во время его заливки, располагаясь на 1-1.5 мм выше нижнего края геля, и удаляется из него после полного застывания. Для размещения гребёнок фиксированной высоты в камере на лотке предусмотрены специальные пазы. Перед началом эксперимента камера должна быть установлена в горизонтальное положение при помощи уровня и своих регулировочных опор. 86 Рис. 7. Лоток и подставка для заливки геля6. Контрольные вопросы для подготовки к защите лабораторной работы: 1. Каков механизм действия ферментов рестрикции ДНК? 2. Классификация нуклеаз и их биологическая роль. 3. Какие реакции осуществляют фосфатазы и нуклеотидазы? 4. Какова функция рестриктаз в клетках бактерий? 5. Каковы принципы деления рестриктаз на классы? 6. Что такое сайт рестрикции? 7. Какие сайты рестрикции узнают рестриктазы II класса? 8. По какому принципу делят II класс на подклассы? 9. Каковы основные условия проведения рестрикции? 10. Какой показатель принимают за единицу активности рестриктазы? 11. Какой принцип лежит в основе метода электрофореза? 12. Какая масса агарозы необходима для приготовления 150 мл 2.5%-ного геля? 13. Какой концентрации агарозный гель нужно использовать для разделения методом электрофореза фрагментов ДНК размером 350 и 150 п.н.? Лоток устанавливается на горизонтальную подставку и фиксируется при помощи зажимающего винта между резиновыми стенками держателя. Гребёнка устанавливается перед заливкой геля в специальные пазы, расположенные по краям лотка. После полного застывания геля гребёнка аккуратно удаляется, а лоток высвобождается из держателя и переносится вместе с лотком в форезную камеру, где заливается электродным буфером. После окончания фореза гель может помещаться в трансиллюминатор вместе с лотком. 6 87 14. В каком направлении и почему движутся молекулы ДНК при проведении электрофореза? 15. От каких факторов зависит скорость движения молекул ДНК в агарозном геле в процессе электрофореза? 16. Почему нужно избегать образования в геле пузырьков воздуха? 17. За счет чего происходит визуализация ДНК в геле? 18. Каким образом можно контролировать движение молекул ДНК в геле во время электрофореза? 19. На каких этапах проведения электрофореза необходимо работать в перчатках и почему? Тема «Масс-спектрометрия белков и нуклеиновых кислот». Масс-спектрометрия - это метод анализа, суть которого состоит в превращении молекул анализируемого образца в газообразные ионы с последующим разделением в масс-спектрометре на основании отношения массы к заряду (m/e) и детекцией. Масс-спектр - это график, отражающий относительное количество ионов при каждом значении m/e. Масс-спектрометрия позволяет находить точное значение относительной молекулярной массы каждой ионизованной молекулы, а также во многих случаях и детали ее структуры. Нобелевская премия в области химии в 2002 году двум масс-спектрометристам Джону Фенну и Коичи Танаке явилась признанием достижений масс- спектрометрии, которыми ознаменовалось последнее десятилетие прошлого века, в частности, и благодаря вкладу этих ученых. Важнейшим результатом этих лет стал прорыв масс-спектрометрии в область исследований термически лабильных, нелетучих, полярных и высокомолекулярных соединений, включая самые разные биологические полимеры (белки и пептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы) и даже целые микроорганизмы. Современная масс-спектрометрия характеризуется непревзойденной чувствительностью, экспрессностью, информативностью. Очень высок уровень автоматизации. В чем же основные достоинства метода? Масс-спектрометрия позволяет устанавливать молекулярную массу соединения. Поскольку эта величина является уникальной характеристикой вещества, метод позволяет успешно работать с соединениями любой природы и 88 сложности, от химических элементов до сложнейших биополимеров. Рекорд измеренной молекулярной массы составляет 110000000 Дальтон. Измерив точное значение массы (масс-спектрометрия высокого разрешения), можно установить элементный состав соединения, даже не выделяя его из смеси. Перейдем к последовательному рассмотрению масс-спектральной аппаратуры. Масс-спектрометр - это устройство, позволяющее разделить пучок заряженных частиц с помощью электрического и магнитного поля на фракции с одинаковым отношением массы к заряду (m/e) и определить массу иона. Первый такой прибор построил Д.Д. Томпсон в 1907 году, второй — Ф. Астон. На приборе Астона был впервые определен изотопный состав большинства элементов Периодической системы и продемонстрировано, что масс-спектрометр является уникальным прибором для определения атомных и молекулярных масс. Основные принципы работы любого масс-спектрометра следующие: • образование ионов в газовой фазе; • ускорение ионов в электрическом поле до определенной скорости; • разделение ионов в масс-анализаторе; • детекция частиц с определенным значением отношения m/e. Для калибровки приборов используют стандартные вещества с точно известными значениями относительной молекулярной проводятся по углеродной шкале, причем масса углерода 12С массы. Измерения принимается равной 12000000. Такой уровень точности достигается в приборах высокого разрешения с двойной фокусировкой и в масс-спектрометрах с преобразованием Фурье. Основной узел масс-спектрометра — масс-анализатор (рис. 18), где под действием электрического и магнитного поля происходит процесс разделения пучка ионов на фракции с одинаковым отношением массы к заряду (m/e). Поскольку анализировать можно только заряженные пучки, а в большинстве случаев нужно исследовать нейтральные частицы, необходимо превратить их в ионы. Для этого служит ионный источник, в котором нейтральные частицы подвергаются ионизации. Существует большое количество методов ионизации, на некоторых из которых мы остановимся далее. Наконец, еще одна обязательная деталь — детектор (регистрирующее устройство), с помощью которого можно определить количество ионов с данным m/e. В современном приборе регистрирующее устройство 89 непосредственно связано с компьютером, который производит обработку результатов и управляет экспериментом. Масс-спектрометр — вакуумный прибор, снабженный специальной системой откачки. В масс-анализаторе заряженные частицы должны проходить расстояние в несколько метров, не сталкиваясь с молекулами остаточных газов. Для этого требуется вакуум ≤10-5 Па. На лучших моделях современных приборов достигается разрежение ≤10-7 Па. Масс-анализаторы принято делить на статические и динамические. Статические приборы используют постоянное, а динамические — переменное электрическое и магнитное поле. Рис. 18 Основные блоки масс-спектрометра Таким образом, все масс-спектрометры устроены по одинаковой схеме (рис. 12). В нее входят следующие элементы: - система создания глубокого вакуума. Это может быть турбомолекулярный насос, диффузный насос и поворотно-лопастной насос; - система ввода образца: сюда относятся подложка для образца; система для высокоэффективной жидкостной хроматографии, газовой хроматографии или капиллярного электрофореза; система прямого ввода образца; камера электронного удара или прямой химической ионизации; - источник ионизации (для перевода молекул в газообразное состояние). Это может быть ионизация электроспреем (electrospray ionisation, ESI), матричноактивированная лазерная десорбция/ионизация (matrix-assisted laser desorption/ionisation, MALDI), бомбардировка быстрыми атомами (fast atom bombardment, FAB), электронный удар или прямая химическая ионизация; - масс-филътр/масс-анализатор. Например, это может быть времяпролетный (TOF, time-of-flight) масс-спектрометр (вариант прибора, в котором 90 осуществляется точное определение времени, необходимого ионам с разной массой для прохождения определенной дистанции); - детектор. Это может быть электронный умножитель, детектор с микроканальной пленкой или матричный детектор. Основные принципы работы масс-спектрометра и его характеристики удобно проиллюстрировать на простейшем масс-спектрометре с магнитным анализатором секторного типа (рис. 13), созданном еще в довоенные годы А.Дж. Демпстером. Пучок ионов из ионизационной камеры проходит постоянную разность потенциалов U = 3—5 кВ и попадает в однородное магнитное поле напряженности H. Здесь на него действует сила Лоренца F = e[H • v], где e — заряд частицы, v — ее скорость. Все ионы одинакового заряда приобретают одинаковую кинетическую энергию Екин = U • e, и их скорость связана с массой известным соотношением v= (2U • e / m)1/2. Сила Лоренца заставляет ион отклоняться от прямолинейного движения и выводит его на круговую орбиту радиуса r: e • vH = m • v2/r. Подставляя значение v, получаем: r = 1/H(2m • U/ e)1/2. Рис. 19. Фокусное действие секторного поля: 1- источник ионов; 2- секторное магнитное поле; 3 – детектор; φ – угол расходимости ионного пучка с одинаковым массовым числом Таким образом, частицы с различными m/e по-разному отклонятся в магнитном поле и окажутся в разных точках детектора. Если детектор — фотопластина, мы получим на фотографии масс-спектр пучка ионов. В большинстве масс-спектрометров используют другой прием: радиус r оставляют постоянным, а сканирование по массам производят изменяя H. Фокусирующее действие секторного магнитного поля проиллюстрировано на рис. 19. Как видно из рис. 19, фокусировка осуществляется по углу, то есть ионы, имеющие одинаковое значение m/e, но входящие под разными углами в магнитное поле, после прохождения этого поля снова собираются в одну точку. На практике происходит некоторое уширение 91 изображения, и последнее получило название "сферическая аберрация". Хроматическая аберрация связана с разбросом ионов по энергии. Приборы, в которых осуществляется фокусировка ионов как по углу, так и по энергии (скорости), называются приборами с двойной фокусировкой. Эти приборы по техническим характеристикам существенно превосходят приборы с одной фокусировкой. Основными характеристиками масс-спектрометров являются диапазон измеряемых масс и разрешающая способность (разрешение). Разрешающая способность 1000 означает, что сигналы, отвечающие m/e, равные 1000 и 1001, будут фиксироваться отдельно на регистрирующем устройстве, и их перекрывание не будет превышать 10% от полусуммы их интенсивностей (уровень фона). В некоторых случаях разрешение указывается для 50% уровня фона. В наиболее распространенных и относительно дешевых статических приборах диапазон измеряемых масс лежит в интервале 500—1500 атомных единиц массы, а разрешение — в интервале 200—800. Более дорогие статические масс-спектрометры с двойной фокусировкой имеют разрешающую способность до нескольких тысяч и диапазон измеряемых масс, превышающий 10000 а.е.м. В последние десятилетия широкое применение нашли времяпролетные масс-спектрометры и приборы ион-циклотронного резонанса. Во времяпролетном масс-спектрометре пучок ионов, пройдя ускоряющую разность потенциалов (несколько киловольт), летит в бесполевом пространстве к детектору. Под действием одинакового ускоряющего напряжения ионы с разным m/e приобретают разную скорость и регистрируются в разное время. Таким образом, происходит разделение по отношению массы к заряду. Времяпролетные масс-спектрометры работают в импульсном режиме, длительность импульса около 10-4 с. Они незаменимы при исследовании процессов, быстро протекающих во времени. В лучших образцах диапазон измеряемых масс и разрешающая способность достигают нескольких тысяч. Именно на времяпролетном масс-спектрометре удалось впервые зарегистрировать фуллерены, полученные при лазерном испарении графита. Приборы ион-циклотронного резонанса имеют рекордно высокую разрешающую способность, достигающую нескольких миллионов. В этих приборах ионы дрейфуют из ионного источника в резонансную полость под действием 92 постоянного магнитного H и электрического E полей, направленных перпендикулярно друг к другу. Траектория движения — циклоида, являющаяся результатом равномерного прямолинейного движения и движения по окружности с циклотронной частотой (угловой скоростью) ω= eH/m. В резонансной полости ионный пучок попадает под действие поляризованного радиочастотного поля частоты v. При равенстве ω/2π = v наступает резонанс, происходит поглощение энергии поля ионами. При постоянной v, меняя H, можно достичь резонанса последовательно по различным m/e. Из изложенного легко видеть, что современные масс-спектрометры позволяют определять массы тяжелых молекул вплоть до сотен а.е.м. с точностью до одной массовой единицы. Но здесь следует заметить, что массспектрометр работает только с заряженными частицами и определяет именно их массы. Нас же интересует масса самих молекул, поэтому необходимым промежуточным звеном является ионизация молекул. Рассмотрим существующие методы ионизации и проанализируем возможность их применения для ионизации труднолетучих и термически нестойких (нелетучих) соединений. Наиболее широко применяется до настоящего времени метод электронного удара. Ионизация происходит при столкновении пучка электронов с энергией 40— 80 эВ с молекулами исследуемого вещества. Время взаимодействия электрона с молекулой порядка 10-18 с, и в результате образуется молекулярный положительный ион, а избыточная кинетическая энергия уносится двумя электронами. Если время жизни образующегося молекулярного иона меньше 10-6 с, то он не достигает регистрирующего устройства и отсутствует в масс-спектре. В этом случае фиксируются лишь продукты распада молекулярного иона, время жизни которых превышает 10-6 с. Этот процесс называется фрагментацией, а продукты распада — фрагментарными или осколочными ионами. Ионизация электронным ударом широко применятся для анализа метаболитов, загрязняющих веществ и фармацевтических препаратов, например, при тестировании лекарственных средств. Широкое использование масс-спектрометрии в исследовании структуры и функции биологически активных макромолекул, в том числе молекул нуклеиновых кислот и белков, стало возможным благодаря технологическому прорыву, случившемуся в 80-х годах прошлого века. В это время были разработаны новые 93 методы ионизации, в частности, "электроспрей" и матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация. Создание двух методов ионизации — ионизации электроспреем (electrospray ionisation, ESI) и матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (matrix-assisted laser desorption/ionisation, MALDI) — позволило определять молекулярные массы как высокомолекулярных веществ, так и небольших молекул, и привело к тому, что масс-спектрометрия теперь может применяться для анализа практически любых биологических молекул. На сегодняшний день MALDI и электроспрей являются альтернативными способами ионизации биомолекул, имеющими свои достоинства и ограничения. Принципиальное различие этих методов заключается в образовании преимущественно однозарядных ионов вещества при MALDI и многозарядных - при электроспрей-ионизации (рис. 20). За счет образования многозарядных ионов электроспрей ионизация позволяет проводить анализ более крупных молекул (зарегистрированный рекорд составляет 100000 кДа), чем MALDI, но при этом интерпретация результатов исследования несколько сложнее и требует специальной математической обработки (деконволюции). При электроспрей-ионизации образование ионов достигается путем непрерывного распыления раствора образца в процессе прохождения через капилляр, на который подается высокое электрическое напряжение (2.5 – 4 кВ). На выходе образуется совокупность микрокапель раствора, обладающих высоким поверхностным зарядом. Пучок заряженных микрокапель, уменьшающихся в размере за счет потери молекул растворителя, движется к противоэлектроду, имеющему потенциал Земли. Достигая критического размера, при котором силы поверхностного натяжения не могут противостоять силам кулоновского отталкивания (предел Релея), капли "взрываются" с образованием более мелких капель. Этот процесс повторяется, и в итоге, после нескольких серий фрагментации, возникают капли, содержащие всего одну заряженную частицу вещества. Образовавшиеся многозарядные ионы в дальнейшем улавливаются анализатором. 94 Рис. 20. Принципиальные схемы образования заряженных частиц при электроспрей ионизации (а) и MALDI (б). Принцип MALDI основан на десорбции аналита вместе с летучим органическим веществом - матрицей - под действием коротких, но мощных лазерных импульсов. Правильный выбор вещества матрицы и подбор оптимального соотношения аналит/матрица обусловливает чувствительность метода, определяемую эффективностью перевода аналита в газообразную фазу. Как правило, матрица - это низкомолекулярное, полярное, легко поддающееся ионизации органическое вещество, способное образовывать кристаллоиды в присутствии аналита и инертное по отношению к нему. Если большие нелетучие молекулы аналита изолированы друг от друга в матрице, то их можно выбить из окружения без разрушения, в виде ионов, частично с захватом молекул матрицы, то есть с образованием квазимолекулярных ионов. В настоящее время предложены разнообразные органические соединения, используемые в качестве матрицы, однако большинство из них пригодны для анализа белковых молекул, тогда как проблема анализа олигонуклеотидов долгое время оставалась не решенной. При MALDI-масс-спектрометрии эффективность регистрации ионов зависит от многих параметров, таких, как способ приготовления и очистки образца; количественное соотношение матрицы и анализируемого вещества и правильный 95 выбор материала подложки. Кроме того, мощность лазерного излучения, выбор "горячей точки" на образце, давление в области ионизации также являются важными условиями получения устойчивого сигнала. Для масс-спектрометров с электроспрейным ионным источником наиболее часто используемыми анализаторами являются ионные ловушки, позволяющие сфокусировать хаотично образующиеся ионы. Принцип действия таких анализаторов основан на изменении траектории движения заряженных частиц в статическом электрическом поле, создаваемом электродами внутри ловушки. Произвольное изменение электростатического напряжения позволяет управлять движением ионов, улавливая их и направляя на детектор. Исходя из формы и расположения электродов, различают линейные ионные ловушки, квадруполи (квадруполь представляет собой четыре параллельно и симметрично расположенных монополя (электроды круглого сечения)) и орбитальные ловушки, в которых ионы, попадающие в поле, начинают двигаться по стабильным циклическим траекториям, концентрируясь вдоль центральной оси. Ионные ловушки позволяют, варьируя напряжение и частоту модуляции, удерживать ионы с определенным m/e и получать спектры их фрагментов. При этом возможен ряд последовательных фрагментаций иона. Применение ионных ловушек в качестве масс- анализаторов позволяет обеспечить высокую точность измерения масс (до 2 м.д. при использовании внутренней калибровки) при хорошем разрешении масс-спектров (до 100000), что является безусловным требованием осуществления качественных исследований. На сегодняшний день сочетание квадруполя с электроспрейным источником ионов является одним из инструментов, наиболее часто применяемых в биохимии и протеомике в связи с исследованием и идентификацией молекул биополимеров пептидов, протеинов и полинуклеотидов, а также других сложных органических и неорганических молекул. В современных масс-спектрометрах, сочетающих MALDI или электроспрейионизацию с различными техническими средствами управления ионным пучком (TOF-анализатор, ионные ловушки), наиболее распространенным детектором заряженных частиц служат микроканальные пластины, представляющие собой сборку большого (несколько миллионов) количества канальных электронных умножителей. 96 В масс-спектрометрах ионно-циклотронного резонанса с Фурье- преобразованием сигнала (Fourier transfrom ion cyclotron resonance - FTICR MS, Fourier transform mass spectrometr FTICR) реализован принцип пространственного и временного разделения ионов с различными значениями отношения массы к заряду в магнитном поле. В этом случае ионы "запираются" в мощный (до 15 тесла) секторный сверхпроводящий активно экранированный магнит, где вращаются под действием силы Лоренца с частотой, зависящей от величины m/e. Два сектора магнита, играющих роль детектора, используются для снятия токов, наведенных пролетающими мимо них ионами. Сложный частотный сигнал, образуемый множеством ионов Преобразование с Фурье разными m/e, выделяет подвергается каждую Фурье-преобразованию. индивидуальную частоту и пересчитывает ее в величину отношения массы к заряду. Конфигурация массспектрометра FTICR с электроспрейным источником ионов обладает сверхвысоким разрешением (до 10000000) и точностью измерения масс ~ 1 м.д.). Массанализаторы этого класса сейчас считаются самыми точными и чувствительными на рынке масс-спектрометрического оборудования. Развитие рынка масс-спектрометрического оборудования, совершенствование их технических характеристик, упрощение процедур обслуживания и эксплуатации приборов способствует распространению масс-спектрометрии в различных областях науки и техники: химии, физики, биологии, экологии и т.д. Тем не менее в медицинской диагностике сфера практического применения масс- спектрометрических детекторов до недавнего времени оставалась крайне узкой и ограничивалась областями контроля качества Масс-спектрометрия нуклеиновых кислот. Исторически именно массспектрометрия НК одной из первых нашла практическое применение в медицинской диагностике. При использовании общего приборного парка, массспектрометрические подходы к анализу НК имеют свои особенности по сравнению с исследованием белковых молекул. В первую очередь это касается применяемых при MALDI-масс-спектрометрии матриц. Типичная матрица для MALDI - это ароматическая кислота, которая эффективно адсорбирует энергию лазера (табл. 6). 97 Таблица 6. Некоторые матрицы для MALDI-NJF-спектрометрии нуклеиновых кислот. Наименование вещества Особенности применения 3-Гидроксипиколиновая кислота Применима для олигонуклеотидов длиной более 10 нт, меньше подходит для более коротких нуклеотидов в силу образования комплексов с ДНК матрицей 3-Метокси-4-гидроксикоричная Одна из первых матриц для ДНК. (феруловая кислота) Сейчас редко используется на прктике, преимущественно для олигонуклеотидов массой более 3500 Да α-Циано-4-гидроскикоричная кислота Используется для анализа протеиннуклеотидных модифицированных нейстрально кислот, и коротких заряженных олигонуклеотидов Помимо основного матричного вещества, для улучшения качества массспектров применяют различные добавки, в частности ацетат или цитрат аммония, для уменьшения образования комплексов (аддуктов) между молекулами НК и ионами щелочных металлов (Na+, к+) и фукозу - для повышения гомогенности получаемых кристаллов, что существенно упрощает процедуру снятия массспектров в автоматическом режиме. В масс-спектрометрии с электроспрей-ионизацией ведущую роль играют компоненты раствора, в котором аналит - НК образует многозарядные ионы. Обычно это смесь воды и летучего органического растворителя (метанол, ацетонитрил), легко испаряющегося при высоких температурах. Так же, как при MALDI, молекулы НК при электроспрей-ионизации склонны к присоединению ионов Na+ или К+ и формированию аддуктов. Добавление в раствор для массспектрометрического исследования гидрохлорида аммония или триэтиламина 98 позволяет блокировать образование аддуктов при снятии масс- спектров отрицательно заряженных ионов. Вообще, при масс-спектрометрии с электроспрейионизацией регистрация отрицательных ионов дает большую чувствительность в исследовании НК, чем детекция положительных ионов, используемая главным образом для анализа белков. Основным требованием при осуществлении масс-спектрометрического анализа НК (ДНК и РНК), независимо от способа ионизации - электроспрейионизация или MALDI, является высокая химическая чистота исследуемого соединения. Примеси веществ, часто используемых при проведении молекулярнобиологических реакций in vitro, таких, как ДДС-Na, глицерин, Твин, ЭДТА, хлорид магния и ряд других, существенно влияют на процессы ионизации, приводя к снижению чувствительности масс-спектрометрического исследования. Особенно чувствителен к примесям метод электроспрей-ионизации - присутствие посторонних молекул сказывается на ионизации анализируемого вещества за счет изменения силы поверхностного натяжения капли, а также приводит к образованию аддуктов, что затрудняет и без того сложную процедуру окончательной обработки данных. При MALDI, в силу необходимости сокристаллизации аналита с веществом матрицы, любые дополнительные вещества, содержащиеся в анализируемом объекте, попавшие туда либо в ходе проведения предварительных биохимических реакций, либо из паров воздуха, из лабораторного пластика и т.д., приводят к нарушению образования правильной кристаллической решетки, что отрицательно сказывается на эффективности ионизации макромолекул. Существует множество методов очистки НК, предназначенных для массспектрометрии, общая задача которых - избавиться от химических примесей: это переосаждение спиртом и различные виды хроматографии, позволяющие элиминировать из раствора ионы Na+, К+. Масс-спектрометрия НК имеет общие закономерности, но масс-спектрометрия одноцепочечных молекул ДНК (олигонуклеотидов), двухцепочечных молекул ДНК и РНК имеет свои индивидуальные особенности. Как правило, молекулы РНК более стабильны при масс-спектрометрии, чем молекулы ДНК, от которых в процессе ионизации могут отщепляться пуриновые основания. Процессы депуринизации происходят как при MALDI-, так и при 99 электроспрей-ионизации - в первом случае за счет электромагнитной энергии, во втором - за счет тепловой. Одним из способов решения этой проблемы является применение в биохимических реакциях, предшествующих масс- спектрометрическому исследованию, 7-диазапуринов, придающих дополнительную "прочность" молекуле НК. На первый взгляд, электроспрей-ионизация должна позволять исследовать более протяженный молекулы, MALDI, однако, диапазон, внутри которого мол. массы нуклеиновых кислот могут быть измерен с достаточной точностью, для обоих методов приблизительно одинаков – до 100 кДа, с оптимум в районе 10 кДа для MALDI и 10 кДа –для электроспрей ионизации. Заканчивая иллюстрацию возможностей масс- спектрометрических методов анализа образцов, следует отдельно упомянуть о масс-спектрометрическом секвенировании de novo. Этот подход реализован за счет тандемной массспектрометрии (MS/MS), когда молекулярные ионы подвергаются двойному последовательному масс-спектрометрическому анализу. Тандемная масс- спектрометрия используется для структурного анализа и идентификации веществ в составе смесей. Методика МС-МС состоит из следующих операций: - разделение в первой МС-ступени первичных, или "родительских", ионов и селекция ионов с единственным значением отношения массы к заряду (m/е). - фрагментация этих ионов с образованием разнообразных структурно значимых ионных фрагментов, называемых вторичными, или "дочерними", ионами. - масс-анализ дочерних ионов. Для НК разрывы образуются по фосфодиэфирным связям, что приводит к образованию набора продуктов деградации, отличающихся друг от друга по массе (лестница). Впервые возможность de novo-секвенирования непротяженных (до 10 нт) молекул ДНК была продемонстрирована в работах с применением тандемного масс-спектрометра, оснащенного ионной ловушкой и электроспрейным источником ионов. Следует отметить, что такой способ определения нуклеотидной последовательности не применим для молекул РНК из-за малой разницы между молекулярной массой урацила и цитозина (1 Да). Применение масс-спектрометрии нуклеиновых кислот: 100 - контроль качества при химическом синтезе олигонуклеотидов, в частности обнаружение примеси олигонуклеотидов с недостающими звеньями (N1, N2 и т.д.). Помимо возможности регистрации ошибок, происходящих в ходе элонгации цепочки - разработка системы идентификации бактерий, вирусов и грибов, основанную на анализе нуклеотидного состава фрагментов геномной ДНК (в частности, генов rrs, rrl, rроВ для бактерий) и получившую название TIGER (Triangulation Identification for the Genetic Evaluation of Risks). Принцип метода заключается в регистрации точной массы каждой из двух комплементарных цепей ДНК с последующей математической обработкой данных. Сегодня предложенная схема успешно реализована для идентификации респираторных патогенов: Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pyogenes; S. pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Staphylococcus aureus, St. epidermidis, молекулярного типирования бактерий рода Acinetobacter, а также для мониторинга лекарственной устойчивости к метициллину и ванкомицину изолятов St. aureus. - исследование двухцепочечных ДНК размером более 100 п.о. при микросателлитном анализе геномной ДНК человека. - оценка нуклеотидных полиморфизмов в геноме человека, бактерий и вирусов, идентификация и характеристика клинически значимых микроорганизмов. Генотипирование однонуклеотидных полиморфизмов (англ. Single nucleotide polymorphism, SNP) является одной из самых распространённых задач современной молекулярной генетики, и связанной с ней клиникодианостической лабораторий диагностикой. генотипирование Для SNP современных позволяет клинико-дианостических предоставлять пациенту информацию о предрасположенности к наиболее распространённым заболеваниям: • патологии свертываемости крови (тромбозы) • невынашивание беременности и патология плода (например, SNP ферментов метаболизма фолатов) • онкологические заболевания (рак груди, простаты, яичников, толстой кишки, легких) • индивидуальная реакция к некоторым лекарственным препаратам (варфарин, препараты химиотерапии) 101 • болезни обмена • нарушение липидного обмена • диабет и ожирение • алкоголизм Генотипирование с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии – эффективная и высокопроизводительная технология, позволяющая быстро и относительно недорого идентифицировать единичные нуклеотидные полиморфизмы (SNP). Метод представляет собой сочетание реакции минисеквенирования ДНК и масс-спектрометрического позволяет достигнуть анализа высокой производительностью и продуктов точности низкой этой реакции. анализа себестоимостью в Такой подход сочетании расходных с высокой материалов. Принципиальным преимуществом способа является высокая чувствительность определения генотипов даже при использовании малых количеств ДНК и ее деградации. Масс-спектрометрические методы изучения белков. Именно благодаря проникновению масс-спектрометрии в область исследования этих важнейших природных соединений в середине 90-х годов прошлого века возникло новое научное направление, названное протеомикой. Протеомика занимается исследованием белкового комплекса всего организма как единого целого различают множество направлений в протеомных исследованиях. Вот некоторые из них. – субклеточная протеомика: локализация местонахождения белков в живой клетке. – функциональная протеомика: определение функций белков и исследование межбелковых взаимодействий. – количественная дифференциация белков: определение разницы в экспрессии белков как реакции на изменение внешних условий, патологию или блокаду выбранного гена. – определение маркеров болезней: выявление белков, измененный уровень экспрессии которых может послужить средством ранней, доклинической диагностики заболеваний. – определение "белков-мишеней: определение белков, целевое воздействие на которые фармацевтическими средствами может скорректировать течение болезней. 102 Каждое из этих направлений чрезвычайно важно, как для получения фундаментального знания о природе жизни, так и для практических задач медицины и фармакологии. При проведении исследований в этих направлениях масс-спектрометрия стала одним из наиболее универсальных инструментов при анализе сложных биологических проб, позволяющих успешно решать следующие типовые задачи биологической химии: - идентификация белков; - восстановление первичной аминокислотной последовательности белка; - выявление посттрансляционных модификаций; В протеомике исследуемыми объектами являются ткани и культуры клеток, содержащие чрезвычайно сложные смеси белков в большом диапазоне концентраций (6–9 порядков). Анализ таких сложных смесей стал возможен в результате развития высокоразрешающих методов разделения, таких как аффинное обогащение, ДДС-Na и 2D гель-электрофорез и др. Далее полученный белковый материал готовится для масс-спектрометрического анализа. При масс-спектрометрическом анализе белков различают два подхода: – "top-down": получение информации на основе масс-спектрометрического анализа целых, неповрежденных белковых молекул; – "bottom-up": восстановление информации о белках за счет анализа отдельных пептидов этих белков. Подход top-down используется редко и для специфических задач. Причиной этого служит недостаточная селективность подхода, поскольку для каждой массы белка можно подобрать множество белков-кандидатов с такой массой. Наиболее широко распространенным вариантом анализа белков стал подход «bottom-up». Он представляет собой предварительное биохимическое расщепление белка (или крупного полипептида) на более мелкие пептиды, очистку полученного образца от низкомолекулярных примесей и масс-спектрометрический анализ смеси, как правило, методом, сочетающим высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и тандемную масс-спектрометрию (МС/МС). Чаще всего для пробоподготовки в данном варианте масс-спектрометрии используется трипсин. Этот фермент расщепляет белки по связи Lys – X и Arg – X (где X — любая аминокислота). В результате триптического гидролиза (трипсинолиза) получается набор пептидов массой 500–4000 дальтон (триптических пептидов). В некоторых 103 случаях используются и другие агенты избирательного гидролиза. Структурную информацию получают из тандемного масс-спектра пептидов в газовой фазе. Тандемная масс-спектрометрия (MS/MS) проводится на приборе, который объединяет несколько анализаторов, позволяющих последовательно изолировать один пептид, стабилизировать ионы, составляющие его и идентифицировать фрагменты. С помощью тандемной масс-спектрометрии можно определять всего несколько зептомолей (10-21 М) вещества. Известно, что пептиды и белки относятся к классу термолабильных, нелетучих соединений. Масс-спектрометрический анализ данных соединений (как и в случае и нуклеиновыми кислотами) требует применения мягких методов ионизации молекул, позволяющих перевести молекулы в газовую фазу без разрушения ковалентных связей. Поэтому в масс-спектрометрии белков применяются два основных метода ионизации ESI и MALDI. На практике исследователям крайне редко приходится работать с исходными масс-спектрометрическими данными. Обработка исходных данных масс- спектрометра -это задача программного обеспечения первичной обработки спектров. При этом автоматически генерируются варианты аминокислотной последовательности (сиквенса) всех пептидов, молекулярные ионы которых детектируются в процессе эксперимента. Для идентификации белков средствами МС-анализа стандартом является методика, получившая в научной литературе название peptide mass fingerprinting, PMF. Данная методика основана на том, что набор продуктов ферментативного гидролиза — пептидов — уникален для каждого белка подобно отпечаткам пальцев человека. Суть метода состоит в том, что для каждого белка с известной последовательностью рассчитываются массы пептидов — продуктов теоретического ферментативного гидролиза с учетом указанного пользователем числа пропущенных сайтов гидролиза и возможных модификаций. Далее фактический масс-спектр продуктов гидролиза определяемого белка сравнивается со всеми теоретическими спектрами белков и выявляется белок, у которого степень соответствия наивысшая. Процедура расчета степени соответствия должна учитывать такие априорные данные, как число обнаруженных в масс-спектре пептидов, точность определения масс пептидов, массу белка и т. д. Пользователю выдается список белков по мере убывания степени соответствия. 104 Для решения этой задачи разработан ряд систем программного обеспеченья, таких как Mascot, Sequest, X Tandem и многие другие. Соответствие может быть найдено не для всех пептидов из-за существования непредвиденных посттрансляционных модификаций, различных вариантов сплайсинга и полиморфизмов. В случаях, когда соответствия не могут быть получены, можно спектрометрии использовать для более фрагментации жесткие методы пептидов и тандемной вычисления массмасс фрагментированных ионов. Очевидно, что описанный выше метод успешно функционирует только при анализе белков и пептидов известной структуры. Если геном организма не расшифрован полностью, то применение этого подхода невозможно. Однако массспектрометрия позволяет устанавливать последовательности аминокислот и для не описанных ранее полипептидов (белков). Такой вариант анализа получил название «de novo секвенирование» (по аналогии с нуклеиновыми кислотами). Масс-спектрометрическое de novo секвенирование проводят на основе тандемного масс-спектра (MC/MC) интересующего пептида. Обычно такой спектр получают при фрагментации протонированных молекул пептидов. Существует большое количество методов стимулирования разрывов пептидной цепи. Чаще других используется диссоциация, активированная соударениями (ДАС), когда серии фрагментов ионов образуются при разрывах различных связей в протонированных молекулах исходных пептидов, образовавшихся в ионном источнике. На схеме представлены типы ионов, образующихся в результате фрагментации протонированных молекул пептидов. При разрывах различных химических связей пептидной цепи образуются серии ионов, которые классифицируются в зависимости от того, на каком конце пептида остается положительный заряд. В ионах a, b, c заряд сохраняется на фрагментах, содержащих N-конец исходного пептида, тогда как в x-, y-, z-ионах - га фрагментах, включающих С-конец (рис. 21). 105 Рис. 21. Образование серии ионов при тандемной масс-спектрометрии. Метод леддерного (от англ. ladder — лестница) секвенирования (или ступенчатого) представляет собой энзиматический гидролиз амидных связей исходного пептида с масс-спектрометрическим определением всей совокупности продуктов реакции. Детектируются лэддеры пептида, содержащие на одну, две, три и т.д. концевых аминокислот меньше, чем исходный пептид. Таким образом, по разнице в массах лэддеров устанавливается последовательность звеньев в пептиде. Отщепление аминокислоты происходит за счет ферментативного гидролиза. Поэтому разница в массах лэддеров всегда соответствует массе аминокислотного остатка. В случае амидированного по С-концу пептида, разница в массах двух наиболее тяжелых ионов на единицу меньше массы первого аминокислотного остатка. В качестве ферментов для отщепления аминокислот используют карбоксипептидазу Y (CPY), карбоксипептидазу P (CPP) или смесь этих неспецифических энзимов CPY/CPP, дающих разрывы с С-конца пептида. Для отщепления N-концевых аминокислот применяется аминопептидаза М (АРМ). Для леддерного секвенирования обычно используют MALDI, поскольку при такой ионизации образца образуются однозарядные ионы (рис. 16). Рис. 22. Пример масс-спектра MALDI при лэддерном секвенировании: MALDI-спектр исходного пептида результаты лэддерного секвенирования использовании (а), при CPP/СЗН (б), леддеры при реакции с АРМ(в). 106 Метод ступенчатого секвенирования применяется в анализе MALDI-TOF, имеющем высокий уровень чувствительности и позволяющем анализировать смеси пептидов. Масс-спектрометрическое секвенирование пептидов обладает множеством достоинств. В первую очередь, это непревзойденная чувствительность возможно проведение анализа вплоть до атто- и зептомольных (10 концентраций анализируемого наноэлектрораспыление). вещества Даже –18 –10 –21 молей) (микроэлектрораспыление используемые в и рутинных масс-спектрометрических экспериментах фемтомолярные количества пептидов на порядки меньше требуемого для проведения секвенирования по Эдману. Вовторых, применимость этого метода для изучения посттрансляционных модификаций также является неоспоримым преимуществом перед классическими биохимическими методами. Помимо этого, объединение масс-спектрометра с жидкостным хроматографом позволяет избежать многоступенчатой очистки пептидов: даже при неполном ВЭЖХ разделении анализируемой смеси можно выделять ионы, характеризующие молекулярную массу интересующих компонентов, и получать информацию об их структуре, используя тандемную масс-спектрометрию. Методы масс-спектрометрии часто используются для выяснения того, с какими белками взаимодействует тот или иной изучаемый белок. Взаимодействующие между собой белки можно выделить целым рядом способов, в том числе методами иммунопреципитации меченых белков после трансфекции клеток, аффинной хроматографии и др., например, метод ESI-TOF позволил точно определить молекулярные массы крупных биополимеров, таких как белки с массой >400 кДа, а также вирусных частиц размером 40 • 106 Да (40 МДа). Гибридный массспектрометр ESI-TOF позволил провести анализ икосаэдрического вируса с массой 6,5 • 106 Да, в котором однонитевая РНК заключена в гомогенную белковую оболочку, а также палочковидного РНК-вируса с массой 40,5 • 106 Да. В вышеприведенных случаях анализ протеома подразумевает осуществление следующих шагов: - проведение одномерного или двумерного электрофореза в геле; - окрашивание геля; - сканирование с целью выявления интересующих полос; 107 - вырезание полос из геля; - экстракция и расщепление белков; - анализ масс образовавшихся пептидов; - поиск по базам данных. Таким образом, самые разнообразные методы масс-спектрометрии активно используются в протеомных исследованиях. Современная масс-спектрометрия способна быстро, надежно и эффективно устанавливать последовательность аминокислотных звеньев в цепи полипептидов. На сегодняшний день она по многим параметрам предпочтительна по сравнению с классическими биохимическими методами секвенирования. Тем не менее, во многих случаях химическая дериватизация или энзиматическое расщепление могут принести значимую пользу при установлении первичной аминокислотной последовательности масс-спектрометрическими методами. Сегодня масс-спектрометрия представляет собой фундаментальную и прикладную физико-химическую науку, в задачи которой входит получение и накопление знаний о составе веществ, их структуре, физико-химических свойствах, а также происходящих с ними процессах. При этом масс-спектрометрия, как метод детекции, не только прочно вошла в методический арсенал научных подразделений, но и нашла применение для решения сугубо практических задач, связанных с клинически значимыми исследованиями в области генетики человека, микроорганизмов и вирусов. Контрольные вопросы для подготовки: 1. Дайте определение методу масс-спесктрометрии? 2. Каковы общие принципы работы масс-спектрометров? Из каких блоков состоят данные приборы? 3. Какие методы мягкой ионизации Вам известны? Опишите их особенности. 4. В чем особенности масс-спектрометрии нуклеиновых кислот? 5. Какие задачи позволяет решать масс-спектрометрия нуклеиновых кислот? 6. Какова роль масс-спектрометрии в протеомике? 7. Какие подходы существуют к масс-спектрометрии белков? Охарактеризуйте каждый из них. 8. Что означает метод PMF& 108 9. Каким образом осуществляется определение аминокислотной последовательности неизвестных белков? Домашняя контрольная работа №3. Часть 1. 1.1. Опишите типы связей и взаимодействий, которые происходят между белками и молекулами ДНК. 1.2. Назовите фундаментальные различия между управлением транскрипцией у бактерий и эквивалентными событиями у эукариот. 1.3. Что случилось, если бы компоненты -10 и -35 промотора E. coli были бы сдвинуты или раздвинуты друг относительно друга? Обоснуйте свой ответ. 1.4. На рисунке показаны два механизма, которыми РНК-полимераза может прикрепиться к своему промотору. Определите, какой механизм используется бактериальной РНК-полимеразой, а который – РНК-полимеразой II эукариот. 1.5. Почему в организмах эукариот отсутствует аттенюация? 1.6. Почему деградация РНК играет важную роль в регулировании экспрессии генома? 1.7. Каковы обычные модификации транскриптов кодирующих белок генов у эукариот? 109 1.8. Обсудите механизм терминации транскрипции на внутреннем терминаторе у бактерий. 1.9. Обсудите шаги удаления, изображенного на рисунке интрона. 1.10. Назовите этот путь и обсудите процессы, представленные на рисунке. 110 Часть 2. 2.1. Кратко опишите двухэтапную реакцию присоединения аминокислоты к молекуле тРНК. 2.2. Что произойдёт, если аминоацил-тРНК-синтетаза ошибочно присоединит неправильную аминокислоту к молекуле тРНК (например, аминоацилирует тРНК валина изолейцином)? 2.3. Каковы две активные роли рибосом в процессе синтеза белка? 2.4. Перечислите молекулы, входящие в состав предынициаторного комплекса, который собирается во время первого шага инициации трансляции у эукариот. 2.5. Какую роль приписывают поли-А хвосту, участвующему в инициации трансляции у эукариот? 2.6. В какой позиции антикодона тРНК иногда располагается инозин? Если инозин присутствует, то какова его функция? 2.7. Обсудите, как именно активность белка зависит от событий, происходящих после трансляции. 111 2.8. Кратко перечислите различия между дифференцировкой и развитием и опишите основу этих отличий. 2.9. Рассмотрите вопрос о влиянии передачи сигналов через вторичные посредники на регулирование активности генома. Темы докладов к модулю №3 1. Принцип секвенирования нуклеиновых кислот с помощью методы Максама – Гилберта. 2. Пиросеквенирование. 3. Современные методы секвенирования ДНК. Секвенирование следующего поколения (NGS). 4. Базы данных нуклеотидных последовательностей. 5. Проект геном человека. Перспективы полногеномного секвенирования. 6. Пульс-электрофорез. 7. Капиллярный электрофорез. 112 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Основная литература 1. Нельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера: в 3 т. Т. 3. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2015. – 694 с. 2. Льюин Б. Гены / Б. Льюин; пер. 9-го англ. изд. — М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2012. —896 с.: цв. ил. — (Лучший зарубежный учебник). 3. Браун Т.А. Геномы. – М.- Ижевск: Институт компьютерных технологий, 2011. – 944 с. 4. Бокуть С.Б., Герасимович Н.В., Милютин А.А. Молекулярная биология. Минск: Вышейшая школа, 2005. – С. 392-437. 5. Коничев А.С., Севастьянова Г.А. Молекулярная биология, М.: Академия, 2003. – С. 251-392. Дополнительная литература 1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. И др. Молекулярная биология клетки. М., Мир, 1994. – 386 с. 2. Антонова С.О., Корнева Н.А., Белов Ю.В., Курочкин В.Е. Эффективные методы выделения нуклеиновых кислот для проведения анализов в молекулярной биологии (обзор) // Научное приборостроение, 2010. - Т. 20, № 1. - С. 3-9. 3. Аппель Б., Бенеке Б.-И., Бенесон Я и др. Нуклеиновые кислоты: От А до Я. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2013. – 413 с.: ил. 4. Артеменко К.А., Самгина Т.Ю., Лебедев А.Т. Масс-спектрометрическое de novo секвенирование пептидов // Масс-спектрометрия, 2006. - Т. 3, № 4. - С. 225-254. 5. Белясова Н.А. Биохимия и молекулярная биология. Минск, Книжный дом, 2004. – 409 с. 6. Бонецкий А.А., Таирова М.М., Кутукеев Т.С., Филипченко А.И., Уголбаева А.С. Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) в клинической практике. Методические рекомендации. – Бишкек, 2000. – 12 с. 7. Великов В.А. Молекулярная биология. Практическое руководство: Учеб. пособие для студ. биол. фак. и фак. нано- и биомед. технол., обуч-ся по напр. «Биология (020400)», «Биология-пед. (050100)», «Биотехнические системы и 113 технологии (200100)», «Медицинская физика (011200)» и по спец. «Биоинженерия и биоинформатика (020501)». – Саратов: Издательство «Саратовский источник», 2013. – 84 с.: ил. 8. Веренчиков А.Н., Краснов Н.В., Галль Л.Н. Тандемные масс-спектрометры в биохимии // Научное приборостроение, 2004. - Т. 14, № 2. - С. 4-23. 9. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 2002. – 589 с. 10. Зинченко А.И. Практикум по биотехнологии. Соединения нуклеиновой природы: учебно-методическое пособие. – Минск: МГЭУ им. А.Д. Сахарова, 2009. – 84 c. 11. Зорина В.В. Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР). Методическое пособие. – М.: ДНК-Технология, 2012. – 80 с. 12. Иванов М.К., Порываев В.Д., Кандрушин Е.В. Особенности количественного анализа методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // Новости «Вектор-Бест», 2008. - Т.50, № 4. – С. 12-16. 13. Ильина Е.Н., Говорун В.М. Масс-спектрометрия нуклеиновых кислот в молекулярной медицине // Биоорганическая химия, 2009. – Т.36, №2. – С 149164. 14. Каталог Zinexts v 0.2 от 03.10.2013 SkyGen LLC, http://www.skygen.com/upload/iblock/6ce/6cee26616a656f908eb6cbb5ce4af6b6.p df 15. Кверчи М., Джермини М., Ван ден Эде Г. Обучающие курсы по теме: «Анализ образцов пищевых модифицированных продуктов организмов. на – присутствие Практическое генетически руководство». – Люксенбург: Бюро официальных изданий ЕЭС, 2007. – 252 с. 16. Ковальчука Л.В., Игнатьевой Г.А., Ганковской Л.В. Иммунология: практикум: учеб. пособие. – М.: ГЭОТАР-Медина, 2010. – 176 с.: ил. 17. Коничев А.С., Цветков И.Л., Попов А.П. и др. Практикум по молекулярной биологии. - М.: КолосС, 2012. – 151с.: ил. 18. Краснов Н.В., Лютвинский Я.И., Подольская Е.П. Масс-спектрометрия с мягкими методами ионизации в протеомном анализе (обзор) // Научное приборостроение, 2010. – Т.20, №4. – с. 5-20. 114 19. Краснов Я.М., Гусева Н.П., Шарапова Н.А., Черкасов А.В. Современные методы секвенирования ДНК (обзор) // Проблемы особо опасных инфекций, 2014. - Вып. 2. – Стр. 73-79. 20. Лаптинов И.А., Болдырева М.Н. ПЦР-диагностика в России: современное состояние и перспективы развития. – М.: НПФ ДНК-технология, 2005. – 5 с. 21. Лебедев А.Т. Масс-спектрометрия в токсикологических исследованиях // Токсикологический вестник, 2010. - №4. - С. 2-13. 22. Максимова Н.П. Молекулярная генетика: сборник заданий и тестов: учебн. пособие. – Минск: БГУ, 2003. – 86 с. 23. Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот. Под ред. А.С. Спирина – М.: Высшая школа, 1990, 352 с. 24. Мушкамбаров Н.П., Кузнецов М.А. Молекулярная биология, 2003. – 535 с. 25. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. М.: Наука, 2000. – 527 с. 26. Поляничко А. М. Электрофорез в агарозном геле: Учебно-метод. пособие. – СПб., 2007. – 42 с. 27. Примоуз С., Тваймен Р. Геномика: Роль в медицине. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2008. – 277 с.: ил. 28. Протасова М.С., Решетов Д.А. Методическое пособие к практикуму «Новые геномные подходы для идентификации генетических факторов старения». Москва: Цифровичок, 2013 г. – 42 с. 29. Ребриков Д.В. ПЦР в реальном времени. 2-е изд., испр. – М.: БИНОМ, 2009. – 221 с. 30. Сидоров Л.Н. Масс-спектрометрия и определение массы больших молекул // Соросовский образовательный журнал, 2010 – Т.6, №11. - С. 41-45. 31. Сингер М., Берг П. Гены и геномы, М.: Мир, 1999, Т.1. – С. 227-314. 32. Сингер М., Берг П. Гены и геномы, М.: Мир, 1999, Т.2. – С. 195-363. 33. Теоретические основы полимеразной цепной реакции. Методическое пособие. – М.: НПФ ДНК-технология, 1998. – 30 с. 34. Уилсон К., Уолкер Дж. Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии. – М.: Издательство: Бином, 2013. – 848 с.: ил. 35. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия: учеб.-справ. пособие – 2-е изд, испр. и доп. – Новосиб.: Сиб. унив. из-во, 2004. – 496 с. 115 36. Aljanabi S.M., Martinez I. Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques // Nucleic Acids Research, 1997. – V. 25, № 22. – P 4692-4693. 37. Arya M., Shergill I.S., Williamson M., Gommersall L., Arya N., Patel H.R. Basic principles of real-time quantitative PCR // Expert Rev. Mol. Diagn., 2005. – V. 5, № 2. – P. 209-219. 38. Azam W. et al. Polymerase Chain Reactiom and its application. Review Aricle // https://www.academia.edu/5695176/Polymerase_Chain_Reactiom 39. http://enc.sci-lib.com/article0001401.html. Дата обращения 11.01.2015. 40. http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/manual%20RUS/UM%20RusS5.pdf. Дата обращения 03.11.2014. 41. http://molbiol.ru/. Дата обращения 11.01.2015. 42. http://www.helicon.ru/service/articles/detail.php?IBLOCK_ID=9&ELEMENT_I D=4283. Дата обращения 03.11.2014. 43. http://www.ibmc.msk.ru/content/Education/w-o_pass/MMoB/18c.pdf. Дата обращения 03.11.2014. 44. Jain K., Mehendiratta M., Bansal D. Polymerase chain reaction: A powerful diagnostic and research tool // 45. Rahman M.T., Uddin M.S., Sultana R., Moue A., Setu M. Polymerase Chain Reaction (PCR): A Short Review // Anwer Khan Modern Medical College Journal, 2013. – V. 4,№ 1. – P. 30-36. 46. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.T. et al. Primer directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science, 1988. V. 239. – P. 487–491. 116