механизмы дестабилизации эритроцитарных клеток в условиях

158
udk 616.155
wESTNIK sAMgu { eSTESTWENNONAU^NAQ SERIQ. 2002. 2(24).
mehanizmy destabilizacii
|ritrocitarnyh kletok w uslowiqh
laktoacidoza i dejstwiq nitrozotiolow1
c 2002 n.a. kLENOWA2
iZU^ENY MEHANIZMY DESTABILIZACII \RITROCITARNYH KLETOK PRI DEJSTWII NITROZOTIOLOW W USLOWIQH LAKTOACIDOZA. dEJSTWIE MOLO^NOJ KISLOTY (7,5
Mm/L ) I NITRITOW (2 Mm/L ) SOPROWOVDAETSQ ZNA^ITELXNOJ AKTIWACIEJ PROCESSOW AUTOOKISLENIQ GEMOGLOBINA, DEZINTEGRACIEJ MEMBRANY I POWREVDENIEM
KLETOK. dOBAWLENIE CISTEINA GIDROHLORIDA (2 Mm/L ) W INKUBACIONNU@ SMESX
NE SOPROWOVDAETSQ ULU^ENIEM POKAZATELEJ. tAKIM OBRAZOM, WWEDENIE TIOLOW
NA FONE DEJSTWIQ NITRITOW I LAKTOACIDOZA NE OKAZYWAET WYRAVENNOGO PROTEKTORNOGO DEJSTWIQ NA \RITROCITARNYE KLETKI.
wWEDENIE
sTABILXNOSTX POPULQCII \RITROCITARNYH KLETOK, OT KOTOROJ ZAWISIT KISLORODTRANSPORTNAQ, ADAPTIWNAQ I DRUGIE FUNKCII \TIH KLETOK, WO MNOGOM OPREDELQETSQ
USLOWIQMI IH FUNKCIONIROWANIQ. sOGLASNO POLU^ENNYM NAMI RANEE DANNYM, A TAKVE DANNYM DRUGIH ISSLEDOWATELEJ, IZBYTOK PROTONOW I RAZWIWA@]IJSQ PRI \TOM
\NERGODEFICIT, DEJSTWIE NITRIT-ANIONOW USKORQ@T PROCESSY AUTOOKISLENIQ GEMOGLOBINA, DESTRUKTIWNYE PROCESSY W MEMBRANAH KLETOK 1,2] I ZNA^ITELXNO UMENXA@T SROK \FFEKTIWNOJ METABOLI^ESKOJ VIZNI \RITROCITOW.
gIPOKSIQ, LAKTOACIDOZ, SNIVENIE \NERGETI^EKOGO POTENCIALA KLETOK SOPROWOVDA@T MNOGIE PATOLOGI^ESKIE PROCESSY I, W ^ASTNOSTI, SERDE^NO-SOSUDISTYE ZABOLEWANIQ. oSNOWNYMI PREPARATAMI, PRIMENQEMYMI DLQ KORREKCII IEMI^ESKIH SOSTOQNIJ, OSTA@TSQ NITROPREPARATY. kROME TOGO, W KA^ESTWE ANTIOKSIDANTOW ^ASTO
ISPOLXZU@TSQ DONORY SH-GRUPP. oDNAKO DEJSTWIE NITROZOTIOLOW USILIWAET DELATACIONNYJ \FFEKT NITRITOW 3], A SOHRANQETSQ LI PRI \TOM ANTIOKSIDANTNOE I STABILIZIRU@]EE DEJSTWIE TIOLOW NA MEMBRANY, OSTAETSQ NEQSNYM.
cELX@ DANNOGO ISSLEDOWANIQ STALO IZU^ENIE FUNKCIONALXNOGO SOSTOQNIQ \RITROCITARNYH KLETOK PRI DEJSTWII NITROZOTIOLOW W USLOWIQH LAKTOACIDOZA.
NAUK PROFESSOROM w.g. pODKOWKINYM.
a BIOHIMII saMaRSKOGO GOSUDARSTWENNOGO UNIWERSITETA,
1 pREDSTAWLENA DOKTOROM BIOLOGI^ESKIH
2 kLENOWA nATALXQ aNATOLXEWNA K FEDR
, a
443011, G.saMaRa, UL. aKAD. pAWLOWA, 1.
mEHANIZMY DESTABILIZACII \RITROCITARNYH KLETOK W USLOWIQH LAKTOACIDOZA
159
mATERIALY I METODY
dLQ ISSLEDOWANIJ ISPOLXZOWALASX CELXNAQ DONORSKAQ KROWX ILI FRAKCIQ ^ISTYH
\RITROCITOW (OTMYWKA 0,154 m RASTWOROM HLORISTOGO NATRIQ, Rn 7,2 W REVIME CENTRIFUGIROWANIQ 600 g, 10 MINUT PRI 4 s). sUSPENZI@ ^ISTYH \RITROCITOW POME]ALI
W SREDU rINGERA-lOKKA W OTNOENII 1:1. w CELXNU@ KROWX ILI SUSPENZI@ \RITROCITOW W SREDE rINGERA-lOKKA DOBAWLQLI MOLO^NU@ KISLOTU W KONE^NOJ KONCENTRACII
7,5 Mm/L NITRIT NATRIQ W KONE^NOJ KONCENTRACII 2 Mm/L CISTEIN GIDROHLORID
(ZABUFERENNYJ RASTWOR) W KONE^NOJ KONCENTRACII 2 Mm/L. oB_EM DOBAWOK NE PREWYAL 0,2% OT OB]EGO OB_EMA PROB S CELX@ SOHRANENIQ GEMATOKRITA. w KONTROLXNYE
PROBY DOBAWLQLI TE VE OB_EMY 0,154 m HLORISTOGO NATRIQ. iNKUBACI@ S DOBAWKAMI
PROWODILI PRI 37 s W ULXTRATERMOSTATE W TE^ENIE 20{30 MINUT PRI PERIODI^ESKOM
WSTRQHIWANII.
o FUNKCIONALXNOJ AKTIWNOSTI \RITROCITOW SUDILI PO SOOTNOENI@ FORM GEMOGLOBINA: DEZOKSIGEMOGLOBINA (dok nW) OKSIGEMOGLOBINA (ok nW) METGEMOGLOBINA
(mET nW) 4,5], SODERVANI@ MEMBRANOSWQZANNOGO GEMOGLOBINA (ms nW) 6], MEMBRANNOJ PRONICAEMOSTI KLETOK DLQ MO^EWINY (mp) 7], ANTIOKISLITELXNOJ AKTIWNOSTI
\RITROCITARNYH GEMOLIZATOW (aoa) 8], IZMENENI@ SODERVANIQ KALXCIQ W INKUBACIONNOJ SREDE. sODERVANIE KALXCIQ OPREDELQLI, ISPOLXZUQ STANDARTNYE NABORY
FIRMY Vital diagnostics (sANKT-pETERBURG).
rEZULXTATY I OBSUVDENIE
dEJSTWIE SOEDINENIJ, IME@]IH WOSSTANOWLENNYE TIOLOWYE GRUPPIROWKI, SWQZANO OBY^NO SO STABILIZACIEJ \RITROCITARNOJ KLETKI 9]. nAMI BYLI POLU^ENY DANNYE O ROSTE \LEKTRODIFFUZIONNOGO POTENCIALA MEMBRANY \RITROCITOW, SNIVENII
SKOROSTI PROCESSOW INICIIROWANNOGO pol PRI INKUBACII FRAKCII ^ISTYH \RITROCITOW S RAZOWOJ TERAPEWTI^ESKOJ DOZOJ UNITIOLA 10]. sTABILIZIRU@]EE DEJSTWIE
NA \RITROCITY OKAZYWAET I ZABUFERENNYJ RASTWOR CISTEINA GIDROHLORIDA (TABL.1).
|FFEKT SWQZAN S PODDERVANIEM OPTIMALXNYH SOOTNOENIJ WOSSTANOWLENNYH I OKIStABLICA 1
dEJSTWIE CISTEINA GIDROHLORIDA (2 Mm/L ) W USLOWIQH LAKTOACIDOZA (7,5 Mm/L )
NA \RITROCITY
pROBY
dok ok
mET ms
nW, % nW, % nW, % nW, %
1. kONTROLX, 49,55 48,56 1,90 6,01
0,19 0,14 0,09 0,30
n = 42
2. mOL. K-TA, 49,51 47,67 2,81 8,87
0,17 0,14* 0,06* 0,31*
n = 22
3. mOL. K-TA+ 49,62 48,10 2,28 6,91
CIS., n = 22 0,15 0,13 0,06 0,21
pRIME^ANIE.*
P <0,01 PO OTNOENI@ K KONTROL@
aoa,
U.E.
mp, % iZM. KONC.
GEMOLIZA Ca2+ ,
MKm/MIN
0,092
45,00
3,83
0,004 1,55 0,25
0,049
60,99
7,70
0,003* 1,95* 0,38*
0,078
53,31
5,83
0,004* 1,44* 0,26*
160
n.a. kLENOWA
LENNYH SULXFGIDRILXNYH GRUPPIROWOK BELKOW I SOSTOQNIQ GEMOGLOBINA. lAKTOACIDOZ W KONCENTRACII MOLO^NOJ KISLOTY, SOOTWETSTWU@]EJ WYHODU KLETOK NA ANA\ROBNYJ TIP OKISLITELXNYH PROCESSOW 11], OKAZYWAET ZNA^ITELXNOE POWREVDA@]EE
WOZDEJSTWIE NA \RITROCITARNYE KLETKI: NABL@DAETSQ USKORENIE PROCESSOW METGEMOGLOBINOBRAZOWANIQ, UMENXENIE SRODSTWA GEMOGLOBINA K KISLORODU I UWELI^IWAETSQ
DOLQ MEMBRANOSWQZANNOGO GEMOGLOBINA (TABL.1). tORMOVENIE GLIKOLITI^ESKIH PROCESSOW, STIMULQCIQ PROIZODSTWA 2,3 dfg W USLOWIQH LAKTOACIDOZA PRIWODIT K DESTABILIZACII MEMBRAN KLETKI I LAWINOOBRAZNOMU NARASTANI@ POWREVDENIJ, USKORQ@]IH EE STARENIE I GIBELX. dEJSTWIE CISTEINA NA FONE LAKTOACIDOZA UMENXAET
POWREVDA@]EE WOZDEJSTWIE ZAKISLENIQ I \NERGODEFICITA, WYZWANNOGO IZBYTKOM MOLO^NOJ KISLOTY (TABL.1).
sNIVENIE POWREVDA@]EGO WOZDEJSTWIQ LAKTOACIDOZA OBUSLOWLENO TORMOVENIEM
PROCESSOW AUTOOKISLENIQ GEMOGLOBINA I pol ZA S^ET STABILIZACII METGEMOGLOBINREDUKTAZNOJ SISTEMY \RITROCITOW I WOSSTANOWLENIQ OPTIMALXNYH KATALITI^ESKIH
SPOSOBNOSTEJ SISTEMY SUPEROKSIDDISMUTAZA-KATALAZA, O ^EM SWIDETELXSTWUET SNIVENIE SODERVANIQ METGEMOGLOBINA I MEMBRANOSWQZANNOGO GEMOGLOBINA, A TAKVE UMENXENIE STEPENI GEMOLIZA POD DEJSTWIEM IZOMOLQRNOJ KONCENTRACII MO^EWINY. pRONICAEMOSTX MEMBRAN \RITROCITOW DLQ MO^EWINY OPREDELQETSQ NALI^IEM POR I DEFEKTOW W MEMBRANE, OBUSLOWLIWA@]IH USKORENIE PRONIKNOWENIQ MO^EWINY W KLETKU
I GEMOLIZ 12].
tAKIM OBRAZOM, ^EM WYE NATIWNOSTX MEMBRANY, TEM MENXE SKOROSTX GEMOLITI^ESKOGO PROCESSA W PRISUTSTWII MO^EWINY. dEJSTWIE CISTEINA HARAKTERIZUETSQ
TAKVE POWYENIEM ANTIOKISLITELXNOJ AKTIWNOSTI \RITROCITARNYH GEMOLIZATOW,
KOTORAQ OPREDELQLASX KAK KONSTANTA INGIBIROWANIQ SKOROSTI PROCESSA OKISLENIQ 2,6
DIHLORFENOLINDOFENOLA DWUHWALENTNYM VELEZOM. pOLU^ENNYE DANNYE POZWOLQ@T
SDELATX WYWOD OB UMENXENII SKOROSTI PROCESSOW DESTABILIZACII \RITROCITARNYH
KLETOK W USLOWIQH LAKTOACIDOZA S POMO]X@ DONORA SH-GRUPP CISTEINGIDROHLORIDA.
dEJSTWIE CISTEINA W \KWIMOLQRNOJ KONCENTRACII S NITRITOM NATRIQ (NITROZOTIOLOW) HARAKTERIZUETSQ PO SRAWNENI@ S DEJSTWIEM SAMOGO CISTEINA ZNA^ITELXNYM
ROSTOM SKOROSTI METGEMOGLOBINOBRAZOWANIQ I UWELI^ENIEM PROCENTA VESTKOSWQZANNOGO S MEMBRANOJ BELKA (TABL.2). pRI \TOM RASTET KOLI^ESTWO KLETOK, GEMOLIZIROWANNYH POD DEJSTWIEM IZOMOLQRNOJ KONCENTRACII MO^EWINY, I UMENXAETSQ aoa
\RITROCITARNYH GEMOLIZATOW (TABL.2). w USLOWIQH DEJSTWIQ NITRITANIONOW NABL@DAETSQ ZAMETNOE SNIVENIE SKOROSTI POGLO]ENIQ Ca2+ \RITROCITAMI, TAK KAK KONCENTRACIQ KALXCIQ W INKUBACIONNOJ SREDE IZMENQETSQ MALO, ^TO MOVET BYTX OBUSLOWLENO INGIBIROWANIEM FOSFOLIPAZ I AKTIWACIEJ Ca2+-atf-ZY MEMBRANY \RITROCITOW.
dEJSTWIE NITROZOTIOLOW HARAKTERIZUETSQ ZNA^ITELXNYM ROSTOM SKOROSTI METGEMOGLOBINOBRAZOWANIQ, UWELI^ENIEM DOLI MEMBRANOSWQZANNOGO BELKA, POWYENIEM
MEMBRANNOJ PRONICAEMOSTI KLETOK DLQ MO^EWINY I UMENXENIEM aoa \RITROCITOW.
nABL@DAETSQ TAKVE SNIVENIE SKOROSTI POGLO]ENIQ KALXCIQ \RITROCITAMI, WEROQTNO, ZA S^ET UGNETENIQ Ca2+ -ZAWISIMYH PROCESSOW NITRITAMI. uMENXENIE WHODA
KALXCIQ W \RITROCIT MOVET SOPROWOVDATXSQ UHUDENIEM DEFORMIRUEMOSTI KLETOK
IZ-ZA NARUENIQ DEFOSFORILIROWANIQ SPEKTRINA.
w USLOWIQH LAKTOACIDOZA MY NABL@DALI W CELOM POTENCIIRU@]EE POWREVDENIQ
WOZDEJSTWIE NITROZOTIOLOW NA \RITROCITARNYE KLETKI. nABL@DAETSQ WYSOKOE SODERVANIE METGEMOGLOBINA W KLETKAH, UWELI^ENIE DOLI VESTKOSWQZANNOGO GEMOGLOBINA
(NAIBOLXIJ PROCENT IZ WSEH WOZDEJSTWIJ).
sNIVENIE aoa \RITROCITARNYH GEMOLIZATOW, ROST MEMBRANNOJ PRONICAEMOSTI
161
mEHANIZMY DESTABILIZACII \RITROCITARNYH KLETOK W USLOWIQH LAKTOACIDOZA
dEJSTWIE NITROZOTIOLOW W USLOWIQH LAKTOACIDOZA (7,5 Mm )
pROBY
1. cIS., 2 Mm/L,
n = 20
2. cIS.,2 Mm/L
+NaNO2 2 Mm/L
n = 20
3. mOL. K-TA +
Na NO2 ,
n = 22
4. mOL. K-TA +
CIS. + Na NO2 ,
n = 20
tABLICA 2
dok ok
nW,% nW,%
mET
nW,%
ms
nW, %
49,54
49,01
1,45
4,37
48,39
48,37
3,24
7,68
48,60
47,65
3,75
14,05
0,020
73,44
3,71
48,63
47,50
3,87
13,42
0,021
68,22
4,65
0,11 0,13 0,06 0,36
0,15* 0,09* 0,09* 0,27*
aoa, mp,% iZM. KONC.
U.E. GEMOLIZA Ca2+ ,
MKm/MIN
0,135
35,42
2,29
0,004 1,48 0,31
0,043
59,18
1,21
0,003* 2,10* 0,28*
0,18 0,15* 0,07* 0,46* 0,004* 1,05** 0,22**
0,21 0,11** 0,15** 0,36** 0,003** 2,17** 0,15**
* P <0,01 PO OTNOENI@ K PROBE S CISTEINOM
** P <0,01 PO OTNOENI@ K PROBE: CISTEIN + Na NO2
TAKVE SWIDETELXSTWUET O WOZRASTANII POWREVDA@]EGO WOZDEJSTWIQ LAKTATA W PRISUTSTWII NITROZOTIOLOW. pRI^EM W \TIH USLOWIQH UWELI^IWAETSQ I WHOD KALXCIQ
W \RITROCIT I PREWYAET SKOROSTX POGLO]ENIQ EGO W KONTROLE NA 21%. wWEDENIE
CISTEINA W INKUBACIONNU@ SMESX W USLOWIQH DEJSTWIQ Na NO2 I MOLO^NOJ KISLOTY
NE SOPROWOVDAETSQ ULU^ENIEM IZU^ENNYH POKAZATELEJ: NE NABL@DAETSQ SNIVENIQ
SKOROSTI METGEMOGLOBINOBRAZOWANIQ, ZNA^ITELXNYM OSTAETSQ PROCENT MEMBRANOSWQZANNOGO GEMOGLOBINA, NIZKOJ | ANTIOKISLITELXNAQ AKTIWNOSTX \RITROCITARNYH GEMOLIZATOW I WYSOKOJ | MEMBRANNAQ PRONICAEMOSTX, NE ULU^AETSQ I TE^ENIE KALXCIJZAWISIMYH PROCESSOW.
tAKIM OBRAZOM, DEJSTWIE NITROZOTIOLOW NA FONE LAKTOACIDOZA NE OSLABLQET POWREVDA@]EE DEJSTWIE IZBYTKA PROTONOW I NITRITANIONOW NA \RITROCITARNYE KLETKI I MOVET PRIWESTI K UHUDENI@ CIRKULIRU@]EJ POPULQCII KLETOK. sOGLASNO
\TOMU PRIMENENIE TIOLOWYH SOEDINENIJ W KA^ESTWE ANTIOKSIDANTOW W SO^ETANII S
LE^ENIEM NITROPREPARATAMI MOVET OKAZATX POWREVDA@]EE WOZDEJSTWIE NA KISLORODTRANSPORTNU@ FUNKCI@ \RITROCITOW I SNIZITX \FFEKTIWNOSTX LE^ENIQ.
lITERATURA
1] kLENOWA n.a. pRIMENENIE LAKTATNOJ MODELI GIPOKSI^ESKOGO SOSTOQNIQ DLQ IZU^ENIQ WLIQNIQ LEKARSTWENNYH PREPARATOW NA FUNKCIONALXNOE SOSTOQNIE \RITROCITOW// w KN.: mODELIROWANIE W MEDICINSKIH I BIOLOGI^ESKIH ISSLEDOWANIQH.
sAMARA: iZD-WO sAM. GOS. MED. UN-TA, 1999. s. 87{90.
2] wERE]AGINA w.l., mAEWSKIJ e.i. aNALIZ WYHODA KALIQ IZ \RITROCITOW PRI FIZI^ESKOJ NAGRUZKE I MODELIROWANIE LAKTATNOGO ACIDOZA// pAT. FIZIOL. I \KPER.
TER. 1980. 5. s. 42{52.
162
n.a. kLENOWA
3] bUSYGINA o.g., gRIGORXEW n.b., sEWERINA i.s. rOLX SH-GRUPP GUANIDINOTIOLOW
| NOWYH SUBSTRATOW NO-SINTETAZY | W STIMULQCII AKTIWNOSTI GUANILATCIKLAZY// bIOHIMIQ. 1996. t. 61. 1. s. 119{125.
4] zAWODNIK i.b., lAPINA e.a. pROCESY OKISLENIQ GEMOGLOBINA ^ELOWEKA// bIOHIMIQ. 1996. t. 61. 1. s. 42{48.
5] aTAULLAHANOW f.i., wETWICKIJ w.m., vABOTINSKIJ a.m. I DR. sTACIONARNAQ
ZAWISIMOSTX SKOROSTI WOSSTANOWLENIQ METGEMOGLOBINA OT EGO KONCENTRACII W
INTAKTNYH \RITROCITAH ^ELOWEKA// bIOHIMIQ. 1984. t. 49. 2. s. 193{197.
6] tOKTAMYSOWA z.s., bIRVANOWA n.h. o MEMBRANOSWQZANNOM GEMOGLOBINE// bIOFIZIKA. 1990. t. 35. 6. s. 1019{1020.
7] kADYWKINA z.m., kOLMAKOW w.n., rAD^ENKO w.g. pRONICAEMOSTX \RITROCITARNYH MEMBRAN U BOLXNYH S HRONI^ESKIMI ZABOLEWANIQMI PE^ENI// kLINI^ESKAQ
MEDICINA. 1987. 8. s. 157{159.
8] sESENOW w.l., qRO a.m. oPREDELENIE ANTIOKISLITELXNOJ AKTIWNOSTI BIOLOGI^ESKOGO MATERIALA// uKR. BIOHIM. VURN. 1985. 3. s. 50{52.
9] kAZENNOW a.m., mASLOWA m.n. sTRUKTURNO-BIOHIMI^ESKIE SWOJSTWA MEMBRANY
BEZ_QDERNYH \RITROCITOW// fIZIOL. VURN. IM. sE^ENOWA. 1987. t. 73. 12.
s. 1587{1598.
10] kLENOWA n.a., wASILXEWA i.f. mEHANIZM WOZDEJSTWIQ UNITIOLA NA MEMBRANY
\RITROCITOW BOLXNYH, PERENESIH INFARKT MIOKARDA// w KN.: sOWERENSTWOWANIE DIAGNOSTIKI I OPTIMIZACIQ LE^ENIQ W KARDIOLOGII. kUJBYEW: iZD-WO
kUJB. GOS. MED. IN-TA, 1989. s. 78{84.
11] fLORQ w.g., mARKOW w.`. aNA\ROBNYJ POROG: FIZIOLOGI^ESKOE ZNA^ENIE I METODY OPREDELENIQ// kARDIOLOGIQ. 1993. 5. s. 40{46.
12] pUKARX n.s. tEORIQ I PRAKTIKA KRIOGENNOGO SUBLIMACIONNOGO KONSERWIROWANIQ. kIEW: nAUKOWA DUMKA, 1984.
MECHANISMS OF ERYTHROCYTE DESTABILIZATIONS
OF LACTACIDOSE AND NITROTHYOLS ACTION3
c 2002 N.A. Klenova4
The mechanisms of red blood cells destabilization are investigated under nitrosothyols action in conditions of Lactacidose. The action of a dairy acid (7,5
mM ) and nitrits (2 mM ) is accompanied by signicant activation of hemoglobin
autooxdation, membranes desintegration and cells damage. The addition of cestein
hydroxychlorid (2 mM ) in incubative mix is not accompanied by improvement of
parameters. Thus, the introduction of thyols does not render expressed protective
inuence on erythrocytes on a background of nitrits action and Lactacidose.
pOSTUPILA W REDAKCI@ 25/III/2002
W OKON^ATELXNOM WARIANTE | 25/IV/2002.
Communicated by Dr. Sci. (Biology) Prof. V.G. Podkovkin.
Klenova Nataliya Anatolievna, Dept. of Biochemistry, Samara State University, Samara, 443011,
Russia.
3
4