Участие липидов и жирных кислот в формировании и
реклама
МОСКОВСКИЙ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ (Государственный университет) ФАКУЛЬТЕТ ОБЩЕЙ И ПРИКЛАДНОЙ ФИЗИКИ кафедра физики и технологии наноструктур лаборатория структуры и функций биологических мембран НИИ ФХБ им. Белозерского На правах рукописи УДК 577.352.4 Нестеров Семѐн Валерьевич УЧАСТИЕ ЛИПИДОВ И ЖИРНЫХ КИСЛОТ В ФОРМИРОВАНИИ И ФУНКЦИОНИРОВАНИИ СУПЕРКОМПЛЕКСА ФОСФОРИЛИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ МИТОХОНДРИЙ. Магистерская диссертация Направление подготовки 010900 «Прикладные математика и физика» Магистерская программа 010981 «Молекулярные биология и биофизика» Заведующий кафедрой __________________ Лебедев В.В. Научный руководитель __________________ Ягужинский Л.С. Студент __________________ Нестеров С.В. г. Долгопрудный 2014. Оглавление Введение .........................................................................................................................................3 Обзор литературы ..........................................................................................................................4 Общие сведения .........................................................................................................................4 Суперкомплексы ........................................................................................................................5 Обнаружение сжатых крист .....................................................................................................7 Роль липидов в формировании белковых суперкомплексов в мембране митохондрий ....9 Липидные рафты......................................................................................................................10 Вязкость аннулярного липида ................................................................................................11 Поверхностный слой воды .....................................................................................................12 Фракция неравновесно связанных ионов водорода .............................................................13 Материалы и методы ...................................................................................................................15 Выделение митохондрий ........................................................................................................15 Принятые обозначения ...........................................................................................................15 Измерение степени эксимеризации пирена ..........................................................................15 Измерение скоростей дыхания и параметра АДФ/О ...........................................................16 Учѐт изменений митохондрий со временем, прошедшим после выделения .....................17 Построение графиков Аррениуса ..........................................................................................17 Разобщающий эффект жирных кислот. .................................................................................18 I. Результаты. Теоретическая часть .......................................................................................20 Аннулярные липиды ...............................................................................................................20 Совпадение локализации пирена и триптофана в липидном бислое .........................20 Температурная зависимость изменения наблюдаемой вязкости аннулярного липида в митохондриальных мембранах в условиях образования суперкомплекса. ............21 Модельная система. Эффект образования кластеров с повышенной концентрацией пирена ...............................................................................................................................23 Образование «чистой» фракции аннулярного липида в митохондриях при гипотонических условиях. ..............................................................................................25 К теории механизма образования суперкомплекса в митохондриях. ................................25 1 О возможности функционирования рафтозависимого механизма образования суперкомплекса в митохондриях ...................................................................................25 О конкретных механизмах влияния низкой тоничности на процесс формирования рафтов ...............................................................................................................................26 О возможных конерктных механизмах участия рафтов в формировании суперкомплекса ................................................................................................................27 II. Результаты. Экспериментальная часть ..............................................................................28 Температурная зависимость скоростей дыхания и эффективности фосфорилирования в режиме суперкомплекса..........................................................................................................28 Обнаружение двух режимов работы фосфорилирующей системы в состоянии суперкомплекса. ...............................................................................................................28 Сравнительное изучение эффективности работы фосфорилирующей системы митохондрий при разных состояниях мембраны. ........................................................30 Выяснение различий двух режимов работы митохондрий .................................................31 Температурная зависимость разобщающего эффекта жирных кислот ..............................32 Соотношение транслокатора нуклеотидов и глутаматного переносчика в разобщающем эффекте ЖК в условиях образования суперкомплекса .......................................................33 Глутамат-зависимая составляющая разобщающего эффекта ЖК слабо проявляется при физиологических температурах. .............................................................................33 Глутаматный переносчик не взаимодействует с эндогенными ЖК и не участвует в разобщении во время синтеза АТФ в условиях образования суперкомплекса. ........33 Конкуренция АТФ-синтазы и жирных кислот за поверхностный протон ........................34 Выводы .........................................................................................................................................36 Литература ...................................................................................................................................37 2 Введение Настоящая работа посвящена изучению механизма функционирования системы окислительного фосфорилирования митохондрий. Известно, что мультиферментные системы клетки могут работать в двух качественно различных состояниях – в диссоциированном, когда ферменты работают независимо друг от друга, и в состоянии суперкомплекса, когда ферменты тесно контактируют друг с другом. При образовании суперкомплекса промежуточные продукты-субстраты не выбрасываются в объем водной фазы, а передаются по метаболической цепи от фермента к ферменту. Ранее удалось обнаружить существование двух структурных состояний мембран митохондрий, переход между которыми контролируется системой осморегуляции. Кинетические параметры системы сопряжения дыхания и фосфорилирования в гипотонии соответствуют модели мультиферментного суперкомплекса. Цель данной работы исследовать влияние параметров среды, в которой находится суперкомплекс на его функционирование и образование. Основные задачи, решаемые в работе: 1)изучение роли аннулярных липидов в образовании суперкомплекса. 2)изучение зависимости параметров фосфорилирования и скорости дыхания митохондрий от температуры среды. 3)исследование деталей механизма разобщающего действия жирных кислот в режиме суперкомплекса Ранее в нашей лаборатории были обнаружены структурные переходы белков и граничных липидов в мембране митохондрий в гипотонической среде. Однако до настоящего времени, наблюдаемая в этих условиях аномальная температурная зависимость вязкости аннулярных липидов оставалась необъяснѐнной. Подробное рассмотрение этого феномена проведено в данной работе. Помимо этого, был проведѐн анализ литературы по изучению поверхностного слоя воды, аннулярных липидов и их взаимодействия с белками. На основании литературы и полученных данных, была предложена модель, объясняющая структурные и функциональные преобразования в митохондриях под действием давления и температуры. 3 Обзор литературы Общие сведения Одной из основных функций митохондрий является окислительное фосфорилирование. Фосфорилирующая система состоит из двух взаимосвязанных компонент, имеющих различные функции: дыхательной цепи, отвечающей за создание электрохимического потенциала на мембране и АТФ-синтазы, осуществляющей синтез АТФ. В настоящее время общепризнанной является хемиосмотическая теория сопряжения дыхания и фосфорилирования, предложенная Питером Митчелом[1]. Согласно этой теории, на внутренней мембране митохондрий создаѐтся электрохимический потенциал. Протоны, создающие этот потенциал, переносятся через мембрану за счѐт функционирования электрон-транспортной цепи. Движение протонов по градиенту концентрации обратно через мембрану сопровождается работой АТФсинтетазы. Таким образом, энергия, сосредотачиваемая в электрохимическом потенциале, используется для выполнения химической работы. Схема Митчелла достаточно хорошо аргументирована. Одни из первых экспериментальных доказательств верности гипотезы Митчелла были получены в нашей стране под руководством Е.А. Либермана и В.П. Скулачева [2]. Одной из важнейших проблем, обсуждаемых в связи с хемиосмотической гипотезой, является вопрос о степени делокализованности протонных токов и о выходе протонов из мембраны в водную фазу. Вильямс опубликовал свою гипотезу протонного сопряжения процессов дыхания и фосфорилирования в митохондриях.[3]В отличие от Митчела, Вильямс постулирует, что дыхательная Н+-помпа и АТФ-синтетаза образуют в мембране единый функциональный комплекс, в составе которого ион водорода, (который является продуктом дыхательных Н+-помп) передаѐтся на АТФ-синтетазу в составе мембранного метаболона без выхода в водную фазу. Можно видеть, что по сравнению с гипотезой Митчела эта схема имеет два недостатка: 1) она не говорит, в какую форму энергии трансформируется энергия окислительной реакции; 2) экспериментальная проверка такой схемы представлялась в то время невозможной в силу того, что не существовало метода регистрации переноса протона в мембране. В силу этих обстоятельств модель Вильямса долгое время оставалась без внимания экспериментаторов. 4 Суперкомплексы Во внутренней мембране митохондрии находится 5 белковых комплексов, обеспечивающих окислительное фосфорилирование. Каждый ферментативный комплекс катализирует отдельную стадию энергопередающего процесса. В настоящее время получена обширная информация относительно структуры большинства трансмембранных белковых комплексов, формирующих дыхательную цепь митохондрий, однако до сих пор во многом остается неясным механизм взаимодействия отдельных ферментных комплексов друг с другом, их надмолекулярная организация. Были предложены две модели, объясняющие процесс функционирования дыхательных ферментов – модель случайной организации предполагающая отдельных существование дыхательных суперкомплексов комплексов [4] (метаболонов), и модель, образованных функционально и структурно связанными друг с другом ферментами дыхательной цепи[5]. Шрер[6] предложил следующее определение метаболона: надмолекулярный комплекс ферментов, катализирующих последовательные стадии метаболического пути, и структурных элементов клетки. Существуют доказательства существования таких комплексов для различных метаболических процессов, таких как биосинтез высокомолекулярных соединений, окисление жирных кислот, цикл мочевины и цикл трикарбоновых кислот[7] В 60-х годах прошлого века большинство исследований придерживалось теории случайного распределения дыхательных комплексов в мембране, полученные ими данные были интерпретированы в пользу этой модели. Ультраструктурные исследования [8] тонкой структуры митохондрий с низким содержанием липидов показали, что удаление из мембраны митохондрий липидов не оказывает существенного влияния на микроскопическое строение мембраны и дыхательную активность, что трактовалось исследователями как то, что одних только белок-белковых контактов в условиях высокого отношения белок/липид в мембране достаточно для поддержания постоянной формы мембраны и нормального функционирования дыхательной цепи, а роль фосфолипидов в процессе окислительного фосфорилирования незначительна. В дальнейшем эти исследования были продолжены, и в другой лаборатории было показано, что латеральная диффузия цитохромсоксидазы в мембране митохондрий происходит независимо от других интегральных белков, а электронная микроскопия показала, что внутримембранные частицы случайным образом распределены во внутренней мембране [9,10].Дополнительным доказательством в пользу 5 случайного распределения электрон-переносящих комплексов послужило открытие, что антитела к комплексам III и IV агрегируют их раздельно [11]. Прямые исследования мобильности митохондриальных комплексов с помощью электрофоретической релаксации и флуоресцентных исследований выявили коэффициенты латеральной диффузии мембранных комплексов в пределах 10-9- 10-10 см2/сек., что указывало на то, что дыхательные комплексы могут свободно перемещаться во внутренней мембране митохондрий. Первым серьезным доказательством, говорящим против модели случайного распределения дыхательных комплексов в митохондриальной мембране послужило выделение группой Хатефи[12]связанных между собой дыхательных комплексов I и III, а также II и III[13], что показало возможность структурного взаимодействия различных дыхательных комплексов с образованием суперкомплексов. Удалось также показать избирательное взаимодействие между IV комплексом и АТФ-синтетазой[14].. Стабильные суперкомплексы из комплексов III и IV, изолированы из Parococcusdenitrificans[15,16], термофильных BacillusPS3[17] и термоацидофильных archeon Sulfolobus[18]. Группой Крусиата[19] и Шаггера[20,21] были получены новые доказательства существования суперкомплексов из дрожжей и митохондрий млекопитающих, полученных новым количественным методом –BN-PAGE. На обработанных дигитонином митохондриях Saccharomyces cerevisae, у которых нет комплекса I, удалось изолировать две группы белков с молекулярной массой ~ 750 и 1000 kDa, содержащих субъединицы комплексов III и IV. Меньший комплекс (III2IV1) состоял из димера III комплекса и мономера IV, в то время как больший комплекс (III2IV2) состоял из димера III, ассоциированного с двумя мономерами IV. Подобные образования суперкомплексов были также обнаружены в митохондриях, выделенных из сердца быка [22]. В дальнейшем обнаружилось что I1II2суперкомплекс может взаимодействовать с разным количеством комплекса IV (I1II2IV0-4). Всего из митохондрий из сердца быка был выделен целый ряд суперкомплексов, отличающихся различным количеством компонентов и молекулярной массой (рис.1). 6 Рис.1 Организация дыхательных суперкомплексов, выделенных из митохондрий сердца быка с помощью метода BNPAGE. В последние годы проводились большие исследования по изучению выделенных из митохондрий суперкомплексов с помощью электронной микроскопии, которые показали большую стабильность выделенных комплексов, кроме того, было установлено, что они сохраняют свою ферментативную активность, будучи выделенными из митохондрий как млекопитающих[23], так и растений[24]. Обнаружение сжатых крист Ранее в нашей лаборатории удалось обнаружить существование двух структурных состояний мембран митохондрий, переход между которыми контролировался системой осморегуляции [25]. Кинетические параметры системы сопряжения дыхания и фосфорилирования в гипотонии соответствуют модели мультиферментного суперкомплекса.[26] В экспериментах по малоугловому нейтронному рассеянию, а так же при электронной (см рис.2) и атомно-силовой микроскопии были изучены два различных структурных состояния митохондрий, наблюдалось, что в гипотонических условиях происходит сжатие митохондриальных крист и слипание внешней и внутренней мембран митохондрий, образовывались дифрагирующие структуры, их толщина была измерена.[27] 7 Б Рис.2. Электронная микроскопия митохондрий. А-изотония. Б-гипотония Были проведены опыты по тушению флуоресценции триптофана.[25] В мембраны митохондрий встраивался пирен, который может поглощать излучение триптофана. Температурное различие тушения флуоресценции триптофана трактовалось как изменение доступности мембранных белков для контакта с пиреном. При кластеризации белков площадь контакта с пиреном будет уменьшаться, и, следовательно, тушение уменьшаться. (см. рис.4) Опыты проводились в изотонической и гипотонической средах. Было обнаружено, что в изотонии тушение флуоресценции не меняется. В гипотонии же зависимость имеет более сложную форму. По графику тушения (рис.3) можно предположить кластеризацию белков в гипотонии при низких температурах, усиленную кластеризацию при температуре около 19С, и их последующую декластеризацию при увеличении температуры. При высоких температурах тушение выходит на уровень, соответствующий изотонии. Рис.3. Процент тушения флуоресценции триптофана пиреном. 1-изотония 2-гипотония График из статьи [25] 8 Рис.4. Схематичное изображение распределения пирена и белков в мембране митохондрий в случаях кластеризованных и не кластеризованных белков. Вид сверху на плоскость мембраны. Роль липидов в формировании белковых суперкомплексов в мембране митохондрий Факторы, влияющие на структурное расположение белков в биомембранах подробно описаны в работе[28]. Одним из решающих факторов, определяющих организацию белков является гетерогенная природа липидного бислоя. В работе [29]на митохондриях из бычьей печени, а также на дрожжах [30]была предпринята попытка выяснить, что является связующим звеном между III и IV комплексами. Как выяснилось, роль такого связующего звена могут выполнять фосфолипиды, которые были обнаружены в кристаллах мембранных белков. В частности, в лаборатории Шаггера сравнивали кардиолипин-дефицитный штамм S.cerevisiae с диким типом. Оказалось, что кардиолипин является необходимым для образования суперкомплекса III и IV.[31] В кардиолипиндефицитном мутанте комплексы III и IV удалось выделить только в свободном виде.[32]При добавлении к этим свободным комплексам кардиолипина удалось получить суперкомплекс. Все выделяемые комплексы дыхательной цепи являются липопротеиновыми комплексами, ассортимент липидов, связанных с белком зависит от конкретного метода изоляции комплексов. Наиболее часто встречаемыми фосфолипидами являются кардиолипин, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, а также небольшие количества нейтральных липидов и фосфатидилинозитола[8]. В результате обширных исследований удалось установить основные роли фосфолипидов: в первую очередь это обеспечение необходимого гидрофобного окружения для эффективной работы мобильного переносчика электронов – убихинона, а также участие в связывании между собой отдельных компонентов дыхательной цепи. Большинство фосфолипидов, окружающих мембранные белки являются высоко мобильными, однако выяснилось, что кардиолипин образует достаточно тесные контакты, поэтому является наиболее 9 вероятным кандидатом на роль соединительного мостика между различными дыхательными комплексами[33] .Кроме того показана необходимость присутствия кардиолипина для поддержания электронного транспорта [34]. Получены данные, показывающие что повреждающее действие активных форм кислорода на дыхательную активность обусловлено их действием на кардиолипин, который необходим для нормального функционирования ферментных комплексов [35]. В лаборатории Леназа проведены эксперименты, показывающие что образование дыхательных суперкомплексовсильно зависит от состава и количества липида, а пероксидация фосфолипидов вызывает диссоциацию суперкомплекса.[36] Липидные рафты В настоящее время известно, что липиды могут избирательно аггрегировать между собой, образуя отдельные кластеры в мембране. Области, в которых наблюдается упорядоченная жидко-кристаллическая фаза (Lo, liquid-ordered), принято называть липидными рафтами (от англ – «плот»). Рафты находятся в жидкой не упорядоченной фазе липида (Ld, liquid-disordered). Совместное существование двух фаз наблюдалось не только на искусственных и модельных мембранах, но и в живых системах. [37] Кроме того, установлено, что рафты могут существовать в форме маленьких микродоменов, размерами порядка 10нм. При определѐнных условиях микродомены агрегируют, образуя макродомены (см. рис.5). Формированию таких крупных кластеров упорядоченной фазы способствует увеличение концентрации холестерина и актина, увеличивающих степень упорядоченности мембраны. В работе[38] показано, что добавление цитохрома С к многосоставным везикулам вызывает перераспределение липида в мембране и стимулирует образование липидных рафтов. Кроме того, оказывать влияние на формирование рафтов могут трансмембранные белки, избирательно связываясь с определѐнными липидами. Показано, что сродство многих белков к упорядоченной фазе липида выше, чем к неупорядоченной и они избирательно накапливаются в липидных рафтах. [39] В то же время, некоторые белки, наоборот, вытесняются в неупорядоченную фазу. Т.о. в липидных мембранах может происходить сортировака белков в зависимости от их сродства к липидным рафтам. Кроме того, образование рафтов стимулируется снижением тоничности среды. Известно, что на модельных мембранах латеральное натяжение приводит к образованию больших липидных доменов.[40] Точно такой же эффект образования в гипотонии больших липидно-белковых доменов наблюдался и на лимфоцитах. [37] 10 Рис.5. Образование рафтовой фазы из нанокластеров Вязкость аннулярного липида Липиды, непосредственно примыкающие к мембранным белкам, называются аннулярными или граничными липидами. Они играют важную роль в поддержании и регулировании функционирования белков. Вязкость липидов является важным параметром, способным влиять на ориентацию интегральных мембранных белков, проницаемость мембраны и трансмембранный транспорт. [41,42] В работе [43] было показано, что уменьшение вязкости аннулярных липидовкоррелирует с увеличением активности некоторых ферментов, в том числе Mg2+11 АТФазы. Кроме того, в той же работе было обнаружено, что добавление докозагексаеновой жирной кислоты уменьшает вязкость аннулярных липидов сильнее, чем вязкость липидов всей мембраны в целом. Это может говорить о возможности неравномерного распределения жирных кислот в мембране. Вязкость липидов мембраны можно измерить, встраивая в мембрану пирен и исследуя его флуоресценцию. Возбуждѐнный пирен может существовать в двух формах – мономера и эксимера. Степень эксимеризации пирена измеряется как отношение интенсивности излучения мономерной и эксимерной форм. Степень эксимеризации зависит от подвижности пирена в мембране, т.е. от вязкости липида, в котором находится пирен. Вязкость аннулярных липидов можно измерить отдельно, если пирен возбуждается под действием флуоресценции триптофана. При такой постановке эксперимента, возбуждаться будет лишь пирен, находящийся недалеко от белков, содержащих триптофан, т.е. аннулярный липид. Поверхностный слой воды Помимо липида, белки в мембране митохондрий имеют значительную поверхность контакта с водной фазой, прежде всего с примембранным слоем воды. Поверхностные слои жидкости отличаются по своему строению и свойствам от объѐмной фазы. Структура поверхностного слоя упорядочена и сходна со структурой твѐрдого тела. [44] Об этом говорят такие свойства поверхностных слоѐв воды, как мгновенное образование слоя, постоянство поверхностного натяжения, возможность образования на них нанокристаллов некоторых неорганических веществ со стороны водной фазы[45]. Перестройка поверхностного слоя воды, требует энергетических затрат. Так, например, в тонких капиллярах, где большая часть воды находится в структуированном поверхностном слое, такая перестройка настолько не выгодна, что даже не происходит еѐ замерзания. Из геологии известно об образовании прочносвязанной воды на частицах горных пород с настолько значительной энергией связи, что ее можно отжать и то лишь частично при давлениях, равных десяткам и сотням мегапаскалей.[46] В статье[44]показано, что при изменении давления, оказываемого намонослой Ленгмюра, происходят параллельно перестройка поверхностного слоя воды и изменение структуры липидного монослоя. Таким образом, структура поверхностного слоя воды может оказывать влияние на состояние липида в мембране митохондрий, а также напрямую на белки, с которыми имеет значительную площадь соприкосновения. Кроме того, протон, переносимый протонными помпами на внешнюю сторону внутренней 12 мембраны митохондрий попадает именно в поверхностный слой воды. Поэтому свойства поверхностного слоя воды играют ключевую роль в процессах переноса энергии при окислительном фосфорилировании. Фракция неравновесно связанных ионов водорода Перенос энергии окислительных реакций на систему синтеза АТФ в суперкомплексе должен происходить без выброса переносчика энергии (протона) в водную фазу. В настоящее время в литературе представлены данные, свидетельствующие в пользу существования достаточно высокого кинетического барьера в реакции отрыва протона от границы раздела фаз мембрана/вода. Эксперименты проведены на разных моделях в разных лабораториях. Так, например, Тесье и соавт.[47] работали на монослоях, сформированных из фосфатидилэтаноламина, который ковалентно присоединял рН-зонд - ФИТЦ. Авторам удалось показать, что поток сильной кислоты, который подавался непосредственно на поверхность монослоя, не сразу переходит в объем водной фазы, но проходит достаточно длинный путь вдоль поверхности фосфолипида, о чем можно было судить по изменению флуоресценции рН-зонда. Длина этого пути сильно зависела от концентрации буфера в водной фазе. Хеберле и Денхер[48]исследовали светоиндуцированный выброс протонов бактериородопсином с помощью двух рН -индикаторов: флуоресцеина, ковалентно связанного с поверхностью, и растворенного в воде пиранина. Флуоресцеин протонировался за ~0,1мс, что было сопоставимо со временем образования интермедиата, в то время как протонирование пиранина происходило намного медленнее (~0,8мс). Задержка переноса протона с поверхности в объемную водную фазу была в последствии подтверждена и в ряде других лабораторий. В нашей лаборатории также было продемонстрировано существование высокого кинетического барьера в реакции отрыва протона от поверхности БЛМ в процессе трансмембранного переноса ионов водорода через липидный бислой. Были найдены катализаторы– цитрат и HEPES, являющиеся сильными нуклеофильными агентами, которые увеличивает скорость этой реакции, усиливая величину трансмембранного переноса ионов водорода. Ацетат, который является более слабым нуклеофильным агентом чем цитрат, не вызывал подобного эффекта[49]. 13 В нашей лаборатории в работе[50]также было обнаружено, что в процессе работы Н- помп протон пересекает изолирующий, гидрофобный слой мембраны и образует потенциал на мембране, но не выходит в воду, а связывается в зоне межфазной границы. Ввиду наличия потенциального барьера на границе раздела фаз установление протонного равновесия между поверхностью мембраны и объемной водной фазой происходит медленнее, чем диффузия протонов вдоль поверхности. Латеральный протонный транспорт вдоль поверхности мембраны осуществляется с аномально большими скоростями[51,52]и может иметь важное функциональное значение. Помимо очевидного выигрыша в скорости, перенос связанных протонов вдоль поверхности внутренней митохондриальной мембраны может иметь преимущество в более высокой эффективности использования транспортируемых ионов водорода конечным потребителем (АТФ-синтетазой). В нашей лаборатории[53,54] предложен механизм переноса энергии с участием поверхностно-связанного иона водорода, который предполагал возможность запасания части энергии окислительных реакций в форме термодинамического “сольватационного” потенциала ионов водорода ( solv), локализованных в зоне межфазной границы. Образование solv при работе дыхательных Н+- помп может происходить за счет частичной десольватации Н+- ионов, например на стадии их перехода из матрикса в состав мембраны. Согласно такой модели гидратация ионов водорода при переходе с внешней поверхности внутренней мембраны в водную фазу должна приводить к снижению эффективности системы сопряжения дыхания и фосфорилирования. В статье[55]было показано, что эффективность протонного транспорта напрямую зависела от молекулярной упаковки липидов, формирующих протонпроводящую поверхность. Все вышеперечисленные данные подчѐркивают существование тесной связи между липидами, водой и белковыми комплексами митохондрий. Таким образом, исследование системы оксилительного фосфорилирования митохондрий должно затрагивать детальное изучение взаимодействия этих элементов и их взаимное влияние друг на друга. 14 Материалы и методы Выделение митохондрий В экспериментах использовались взрослые крысы породы Wistar женского пола весом около 200 г. Все среды были приготовлены с использованием бидистиллированной воды. В процессе выделения митохондрий использовались следующие среды: a)Среда выделения митохондрий (среда I): 210 мМманнитол, 40 мМ сахароза, 5 мМ HEPES, 0,5 мМ ЭДТА (рН 7,5), 40 мг BSA\100 мл. Среда промывки митохондрий (среда II): 210 мМманнитол, 40 мМ сахароза, b) 5 мМ HEPES, 0,5 мМ ЭДТА (рН 7,5). Митохондрии из печени крысы получали по методике дифференциального центрифугирования. Печень охлаждали до 0°С в среде I и после удаления крови и непеченочных тканей гомогенизировали ручным гомогенизатором в объеме среды I около 100 мл. Для удаления клеточного дебриса суспензия центрифугировалась 8 мин при 2000 об/мин на центрифуге Eppendorf, ротор F-34. Для осаждения митохондрий отобранный супернатант центрифугировали 10 мин при 10000 об/мин. Осадок гомогенизировали ручным гомогенизатором в объеме среды II около 20 мл и центрифугировали 12 мин при 10500 об/мин. Осадок (митохондрии) ресуспензировали в малом количестве среды до концентрации ~50-150 мг белка/мл и держали на льду. Принятые обозначения БСА(BSA) – бычий сывороточный альбумин ЖК - жирная кислота (жирные кислоты) catr – карбоксиатрактилазид, ингибитор АДФ-АТФ переносчика (транслокатора нуклеотидов) Измерение степени эксимеризации пирена Встраивание пирена проводили в термостатированных ячейках с постоянным перемешиванием при его добавлении порциями по 2-5мкл спиртового раствора к суспензии митохондрий. При измерении степени эксимеризации пирена в граничных липидах образцы облучали светом длиной волны 285нм (в полосе поглощения триптофана). Степень эксимеризации измеряли как соотношение интенсивности полос флуоресценции мономерной (373нм) и эксимерной (465нм) форм.Согласно данным работ[56,57]вносились поправки в интенсивность прямого возбуждения молекул пирена светом 285нм. Измерения проводили при pH=7.5 в среде содержащей 0.5мМ ЭДТА, 20мМ 15 KCl, 5мМ MgCl2, 10мМ KH2PO4, 10мМ HEPES, 1мкМ ротенона, 5мМ янтарной кислоты и сахарозы до тоничностей 120 и 300мосМ. Измерение скоростей дыхания и параметра АДФ/О Скорость дыхания митохондрий измерялась полярографическим методом в ячейке объемом 600мл с использованием кислородного электрода Кларка (Strathkelvin Mitocell MT200, OxygenMeter 782). Стабилизация температуры производилась термостатом (Julabo F25) с точностью 0,1°С. В экспериментах использовались следующие среды: a) Гипотоническая среда (120 мОсм): 3мМ HEPES, 90,5 мМманнитол, 0,25 мМ ЭДТА, 1мМ MgSO4, 13 мМKCl (рН = 7,5). b) Изотоническая среда (350 мОсм): 3мМHEPES, 320,5 мМманнитол, 0,25 мМЭДТА, 1мМMgSO4, 13 мМKCl (рН = 7,5). В ячейку добавлялось 3-5 мкл суспензии митохондрий. Фосфорилирование измеряли в условиях работы сукцинатоксидазы, в присутствии 1,5 мкМ ротенона и 0,5 мМ янтарной кислоты в ячейке полярографа. Для запуска фосфорилирования добавлялось 80-160мкМ АДФ и 0,4-0,8мМ фосфата. Параметр АДФ/О, характеризующий эффективность работы дыхательной цепи, рассчитывался как отношение молярного количества добавленного АДФ к количеству кислорода, поглощенного суспензией митохондрий при полном фосфорилировании добавленного АДФ. Максимальное значение АДФ/О, которое было определено в наших опытах, равнялось двум, что близко к теоретическому. На рисунке показан пример полярограммы. 16 Тангенс угла наклона кривой характеризует скорость дыхания митохондрий. Эти скорости принято обозначатать V2, V3, V4. Учёт изменений митохондрий со временем, прошедшим после выделения Надо заметить, что проведение большого количества экспериментов на одном препарате выделенных митохондрий осложнено в связи с коротким временем существования митохондрий после выделения без существенных функциональных изменений, вызванных окислительным стрессом в условиях большого парциального давления кислорода и другими факторами. Митохондрии портятся в течении нескольких часов после выделения. В экспериментах, где измерения проводились более, чем через 2 часа, часто наблюдалось падение адф к о и скорости дыхания не зависимо от температуры. На рисунке показано падение АДФ/О и скорости дыхания V3 при 20С от времени, прошедшего после выделения. Чтобы исключить эффект изменения митохондрий со временем, эксперименты проводились сторону двумя повышения способами и в – в сторону снижения температуры. Построение графиков Аррениуса Температурная зависимость константы скорости химической реакции имеет вид: , где A-предэкспоненциальный множитель, Еа -энергия активации, обычно принимающая положительные значения, Т-абсолютная температура, k-постоянная Больцмана. Применение закона Аррениуса и термина “энергия активации” к биологическим объектам относительно, так как химические реакции в них осуществляются в многофазной гетерогенной среде, где протекаютодновременно тысячи химических реакций, требующих определенного температурного оптимума. Часто при повышении температуры выше оптимальной происходит уменьшение скорости биологических 17 реакций. Поэтому, в нашем случае, будет правильнее называть Ea кажущейся энергией активации. Далее, везде под Ea будет подразумеваться именно кажущаяся энергия активации. При построении графика Аррениуса по оси ординат откладывается логарифм скорости реакции, а по оси абсцисс - обратная величина к абсолютной температуре. Таким образом, при соответствии параметров реакции, написанному выше уравнению, график будет прямой линией с наклоном равным (-Ea/k). Таким образом, можно наблюдать изменение кажущейся энергии активации по наклону графика Аррениуса. Разобщающий эффект жирных кислот. За разобщающий эффект принималось процентное увеличение скорости дыхания при добавке ЖК по отношению к скорости дыхания на сукцинате. Также проводилось определение составляющих разобщающего эффекта ЖК: catr-чувствительного эффекта и глутамат-чувствительного эффекта. На рисунке изображѐн пример полярограммы эксперимента по определению разобщающего эффекта ЖК. Общий разобщающий эффект экзогенных ЖК рассчитывался по формуле . Весь разобщающий эффект ЖК (экзогенных и эндогенных) можно определить по формуле . 18 Catr-зависимый, какотносительное glut-зависимый изменение БСА,соответстеннопо формулам и скорости , остаточный при эффекты добавлении , catr, рассчитывались глутамата и . Порядок добавки catr и глутамата не влияет на величину соответствующих эффектов. Добавление БСА полностью снимает разобщение, вызванное жирной кислотой. Vbsa даже меньше, чем V2, т.к. альбумин в том числе связывает и эндогенные ЖК 19 I. Результаты. Теоретическая часть Аннулярные липиды Как указывалось выше, фосфорилирующая система митохондрий переходит в режим работы суперкомплекса в условиях низкоамплитудного набухания при снижении тоничности среды. Формирование изменением суперкомплекса свойств липидов, по определению непосредственно должно быть контактирующих сопряжено с с ферментами фосфорилирующей системы. В связи с этим, представляется важным исследовать, как изменяются свойства аннулярных липидов при переходе фосфорилирующей системы из диссоциированного состояния в суперкомплекс. Исследования были проведены в различных диапазонах температур в изотонической и гипотонической средах. Совпадение локализации пирена и триптофана в липидном бислое Изучение липидной мембраны митохондрий проводилось с помощью флюоресценции пиреного зонда. В мембраны митохондрий встраивался пирен и митохондрии облучались светом 285нм на частоте поглощения триптофана. Под действием флуоресценции триптофана пирен переходит в возбуждѐнное состояние. Пирен, являясь ароматической молекулой должен быть локализован в той же области мембраны, что и ароматические аминокислоты (см.рис. 6 и 7). Гидрофобные свойства пирена соответствуют его положению в зоне мембраны, близкой к межфазной границе. Это делает возможным измерения степени эксимеризации пирена в аннулярном липиде и создаѐт условия для эффективного тушения флуоресценции триптофана, достигающей 70-95%. (см.рис.3). Кроме того, в известных белках внешней мембраны митохондрий (в частности, в порине) содержится минимальное количество триптофана, поэтому с помощью данного метода представляется возможным изучить свойства именно внутренней мембраны митохондрий. 20 Рис.6. Первый комплекс митохондрий (НАДН дегидрогеназа). Структура из базы данных PDB. Чѐрным цветом выделен триптофан. Прямыми линиями показана граница липидной мембраны . Рис.7. Четвѐртый комплекс митохондрий (Цитохром С оксидаза). Структура из базы данных PDB. Чѐрным цветом выделен триптофан. Прямыми линиями показана граница липидной мембраны. Температурная зависимость изменения наблюдаемой вязкости аннулярного липида в митохондриальных мембранах в условиях образования суперкомплекса. Представляло интерес изучить индуцированные температурой и осмотическим давлением изменения аннулярного липида. С увеличением температуры, обычно возрастает подвижность, а значит, падает вязкость липидов. Было исследовано температурное изменение вязкости аннулярных липидов мембраны митохондрий (см. материалы и методы). Соударение возбуждѐнного и не возбуждѐнного пирена приводит к образованию ассиметричных комплексов - эксимеров. Согласно общепринятой модели [58,59] образование эксимеров пропорционально текучести липидной мембраны. Таким образом, по соотношению интенсивности излучения мономерной и эксимерной линий 21 измерялось соотношение Im/Ie(мономер/эксимер) пропорциональное вязкости липида. Т.к. возбуждались лишь молекулы пирена, находящиеся на незначительном удалении(до 15Å) от белков, то наблюдалась вязкость не мембраны в целом, а вязкость только аннулярных липидов. На рис.8 приведено отношение количества возбуждѐнного мономера к количеству эксимера. Это отношение пропорционально вязкости аннулярного липида, которая контролирует число соударений возбуждѐнного пирена. Можно наблюдать принципиальное различие температурной зависимости в гипотонической и изотонической средах. В изотонии вязкость липида практически монотонно уменьшается при увеличении температуры, имея лишь особенность в районе 22-25С, что соответствует известному из литературы фазовому переходу в липидах митохондриальных мембран.[60] Рис.8. Графики Im/Ie (обратная величина к степени эксимеризации). 1изотоническая среда, 2-гипотоническая среда. Данные из статьи [25] В гипотонии, во-первых, при 10-15С степень эксимеризации пирена почти в два раза выше, чем в изотонии. Вовторых, в диапазоне 10-25С происходит не уменьшение, а наоборот, увеличение соотношения мономер/эксимер с температурой. После 25ºС вид графика становится похож на график для изотонии и вязкость, как и в изотонии, начинает уменьшаться с увеличением температуры, достигая при 35 одинаковых значений в изотонии и гипотонии. Структурное изменение липида в гипотонии при 25ºС хорошо коррелирует с изменением липида в изотонии, наблюдаемым при тех же температурах. Важно указать на аномальное поведение температурной зависимости вязкости аннулярных липидов в условиях гипотонии в диапазоне температур 10-25ºС. Можно видеть, что степень эксимеризации пирена падает с увеличением температуры, что формально соответствует увеличению вязкости аннулярных липидов с увеличением температуры. Это обстоятельство потребовало специального анализа данных литературы, в первую очередь, по температурным изменениям флуоресценции пирена в бислойных липидных мембранах. 22 Модельная система. Эффект образования кластеров с повышенной концентрацией пирена Как отмечалось, увеличение степени эксимеризации может быть вызвано фактическим падением вязкости липида, увеличивающим подвижность молекул внутри мембраны. Такое значительное изменение вязкости означает принципиальное изменение в состоянии мембраны митохондрий. До недавнего времени, наблюдаемое изменение эксимеризации трактовалось именно так. Повышение степени эксимеризации может быть также вызвано увеличением концентрации пирена. Известно [25], что увеличение концентрации пирена на 10% влечѐт увеличение степени эксимеризации на 6%. Т.о, для увеличения степени эксимеризации на 70% при переходе из изотонии в гипотонию при температуре 12С, необходимо увеличение концентрации пирена на 115%. Такое значительное увеличение концентрации пирена в окрестности белка вызвало бы не менее значительное усиление тушения флуоресцензии триптофана, которого не наблюдается. Однако, возможен эффект локального повышения концентрации пирена, который наблюдался в работе Галла и Сакманна [58] на модели бислойных липосом, сформированных из химически чистого дипальмитоил-лецитина, имеющего температуру фазового перехода 41ºС. [61,62] Авторы постулируют, что в бислойной мембране в условиях эксперимента в диапазоне температур 20-42С существуют липид-пиреновые кластеры, содержащие резко повышенные концентрации пирена. При температурах 2030С эти кластеры устойчивы, и как отмечалось выше, в силу высокой концентрации пирена, вероятность образования в них эксимера очень высока. В дипазоне 32-41С происходит постепенная диссоциация этих кластеров, в результате повышения растворимости пирена в липидах в районе фазового перехода, который характеризуется сниженим упорядоченности. В результате распада кластеров пирена, возникает эффект аномального снижения степени эксимеризации с увеличением температуры. Таким образом, в этих условиях наблюдается такой же аномальный эффект температурной зависимости флуоресценции пирена, как тот, который мы наблюдаем на митохондриях в гипотонической среде вблизи фазового перехода митохондриальных липидов.(см рис.9 и 10) 23 Рис.9. Температурная зависимость степени эксимеризации пирена в гипотонической и изотонической средах. Пунктиром показана ожидаемая зависимость в соответствии со статьѐй [54]. Разрыв оси сделан для наглядности сравнения Рис.10. Температурная зависимость степени эксимеризации пирена при разных концентрациях холестерола. Концентрация холестерола: (a)0 моль% , (b)1 моль%, (c)2 моль%, (d)5 моль%, (e)10 моль%,(f)30моль%, (g)50 моль% Графики из статьи [54]. 24 Образование «чистой» фракции аннулярного липида в митохондриях при гипотонических условиях. Из этих рисунков 9 и 10 также видно, что добавление холестерина, снижающего подвижность липидов в модельной системе, препятствует образованию кластеров пирена. В концентрациях 1-2% (рис.10 b,c) холестерин значительно снижает аномальный эффект эксимеризации, а в концентрации более 5% полностью его подавляет.( рис.10 d,e) Из этих данных можно заключить, что в митохондриальных мембранах в изотонических условиях процесс образования кластеров пирена должен быть тоже подавлен. Таким образом, сопоставление митохондрий и модели бислоя химически чистых липидов говорит о том, что в митохондриях в гипотонических условиях должна формироваться фракция «чистых» липидов, которые не содержат факторов, препятствующих образованию кластеров, обогащѐнных пиреном. Эффект расслоения белков и липидов подтверждѐн в нашей лаборатории экспериментами по малоугловому рассеянию нейтронов[27], в которых было показано, что в гипотонических условиях при температурах 15-18С в мембранах митохондрий образуются «липидные озѐра», сформированные из липидов, не содержащих белка. Для того, чтобы понять, каким образом при существовании суперкомплекса может происходить расслоение липидов и образование в окрестности белков чистой фракции липидов, нужно подробнее исследовать различие митохондриальных мембран в средах с разной тоничностью. К теории механизма образования суперкомплекса в митохондриях. О возможности функционирования рафтозависимого механизма образования суперкомплекса в митохондриях В настоящем разделе рассматривается вопрос о том, каким образом в митохондриях осуществляется процесс образования суперкомплекса. Процесс образования суперкомплекса достаточно хорошо изучен на плазматических мембранах клеток. При этом показано, что образование суперкомплексов включает в качестве необходимой стадии процесс формирования липидных кластеров(рафтов), обладающих избирательным сродством к трансмембранным белкам, входящим в состав образующихся суперкомплексов. Таким образом, в этой стадии осуществляется отбор белков по их сродству к липидным рафтам. Образование рафта зависит от поверхностного 25 натяжения, кривизны мембран [40] и наблюдается, в частности, в процессах экзоцитоза [63] и в процессе слияния клеток. Как показано выше, в наших экспериментах, проведѐнных на мембранах митохондрий процес образования суперкомплекса контролируется системой объѐмной регуляции, которая в гипотонических митохондриальных мембран. условиях изменяет Наблюдаемый в кривизну наших поверхности экспериментах крист эффект кластеризации белков и образования липидных озѐр в митохондриях хорошо согласуется с предположением о возможности протекания рафтозависимого механизма сборки суперкомплекса в митохондриях. Гипотонические условия являются одним из ключевых факторов, обеспечивающих рост размеров рафтов, что является важным условием для сборки больших суперкомплексов. О конкретных механизмах влияния низкой тоничности на процесс формирования рафтов Как говорилось выше, экспериментально показано, что на модельных мембранах латеральное натяжение приводит к образованию больших липидных доменов. Однако, в митохондриях, помимо поверхностного натяжения в гипотонии происходит слипание внутренней и внешней мембран. При этом значительно возрастает взаимодействие липидов с белками межмембранного пространства, например, с цитохромом С. В работе[38] показано, что цитохром С стимулирует образование липидных рафтов. Таким образом, в митохондриях возрастание взаимодействия с цитохромом С может быть дополнительным фактором для образования рафтов. Кроме того, с уменьшением тоничности увеличивается активность воды в среде, контактирующей с мембраной митохондрий, т.к. возрастает фактическая концентрация растворителя. Хорошо известно, что степень гидратации липида возрастает при уменьшении тоничности.[64] В низкой тоничности поверхность липида как бы «набухает» за счѐт воды. Подобное изменение должно оказывать влияние на упорядоченность липида и его упаковку в мембране. Так, в статье [63] показано, что в гипотонических условиях в эритроцитах скатов происходит изменение локализациии и олигомеризация анионных переносчиков skAE. В то же время, при набухании, вызванном не гипотонической средой, а с использованием проникающих растворѐнных веществ в изотонии, никаких изменений не наблюдается. Это говорит о том, что эти эффект вызван не столько натяжением, сколько именно изменением активности растворителя(воды), которое может способствовать упорядочеванию липида и формированию рафтов. 26 О возможных конерктных механизмах участия рафтов в формировании суперкомплекса Трансмембранные белки, имеющие высокое сродство к более упорядоченным липидным кластерам, накапливаются в липидных рафтах, в результате чего, в них сильно увеличивается концентрация белков. Это значительно увеличивает вероятность их столкновения и взаимодействия, тем самым создавая условия для сборки больших суперкомплексов. Кроме того, в гипотонических условиях, липиды, образующие рафты являются аннулярными. В рафтах находятся не все липиды, а только специфические, склонные к формированию упорядоченной фазы. Это наблюдается с помощью пиренового зонда, как температуры, образование снижая фракции степень «чистого» упорядоченности аннулярного системы, липида. ведѐт к Возрастание уменьшению упорядоченных областей липида и распаду кластеров, вплоть до точки фазового перехода в районе 25С, где происходит полное их исчезновение. Таким образом, построено полное объяснение наблюдаемой аномалии степени эксимеризации пирена и показано, что в гипотонической среде происходит расслоение липидов и белков в мембране митохондрий с образованием рафтоподобных структур, участвующих в сборке суперкомплекса. 27 II. Результаты. Экспериментальная часть Температурная зависимость скоростей дыхания и эффективности фосфорилирования в режиме суперкомплекса. Обнаружение двух режимов работы фосфорилирующей системы в состоянии суперкомплекса. Для изучения влияния структурных переходов в мембране на функционирование митохондрий проводились измерения скорости дыхания и параметра АДФ/О при различных температурах в гипотонических условиях. Были построены графики Аррениуса (см описание в мат. и методах) для скоростей дыхания митохондрий при дыхании на сукцинате без фосфорилирования (пример на рис.11), а также во время фосфорилирования.(рис.12) 3,3 Рис.11. ln V2 lnV2 Пример графика 2,8 Аррениуса для скорости 2,3 дыхания V2 в условиях 1,8 образования Ea≈64кДж суперкомплекса 1,3 0,8 3,15 3,2 3,25 3,3 3,35 3,4 3,45 3,5 103/T Для скоростей V2 дыхания на сукцинате, без синтеза АТФ, график Аррениуса не имеет перегибов во всѐм диапазоне температур 17-40 ºС. В этих условиях, электрохимический потенциал расходуется в основном на утечки, обусловленные разобщающим действием жирных кислот и другими факторами. Это может говорить о том, что скорость утечек не чувствительна к структурным изменениям в мембране митохондрий. Совсем другой результат можно наблюдать при идущем фосфорилировании. В этих условиях обнаруживается перегиб графика Аррениуса при переходе от низких к высоким температурам. Результаты нескольких экспериментов отображены в таблице 1. 28 Энергии активации и температура фазового перехода в условиях образования суперкомплекса. дата 21.02.13 05.11.13 11.09.13 18.02.14 среднее Ea при T>Tп, ,кДж Tперегиба, ºC 41,9±4,1 27 36,9±4 25 30,3±1,7 26 42,6±2,4 26 37,9 26 Ea при T<Tп, ,кДж 71,2±4,2 76,2±8 73,7±6,2 67,6±4,8 72,2 Таблица 1. Ea - наблюдаемые энергии активации в реакции синтеза АТФ. Tп - температура, при которой наблюдается перегиб (фазовый переход в системе). Тоничность среды 120мОсм. При низкой температуре (до 26ºС) энергия активации – около 67-77кДж, что близко к данным 58кДж из статьи [65]. Высокой температуре соответствует более низкая энергия активации≈30-42кДж. Такие значения для энергий получились в том числе в эксперименте, где опыты начинались с высоких температур. Это исключает возможность того, что изменение энергии активации вызвано изменением митохондрий, связанным со временем, прошедшим после выделения. Наблюдаемое высокое значение АДФ/О и отстутсвтвие изменений в скорости дахания V2 говорят также о том, что перегиб не вызван окислительным стрессом и разрушением митохондрий при высокой температуре. Можно заключить, что перегиб на графиках Аррениуса и изменение наблюдаемых кинетических параметров реакции синтеза АТФ вызвано действительно ln V3 принципиальными функциональными или структурными изменениями в митохондриях. lnV3 Ea≈ 42кДж 3,6 26ºC 3,1 2,6 Ea≈68кДж 2,1 1,6 3,15 3,2 3,25 3,3 3,35 3,4 3,45 103/T 3,5 Рис.12. Пример зависимости скорости V3 реакции синтеза АТФ в условиях образования суперкомплекса в координатах Аррениуса. Обнаружение фазового перехода в диапазоне температур 25-27 (см таблицу) 29 Сравнительное изучение эффективности работы фосфорилирующей системы митохондрий при разных состояниях мембраны. Все измерения проводились в условиях образования суперкомплекса. Было выяснено, что в интервале высоких температур (30-38С) эффективность фосфорилирования выше, чем в среднем при низких температурах (17-24С). На рисунке 13ab приведены примеры измерений. Эксперименты выполнялись с прямым и обратным ходом по температуре. На обоих графиках видно, что в диапазоне высоких температур АДФ/О выше. Таким образом, приведѐнные результаты не связаны с повреждением митохондрий со временем. Наблюдаемая разница в эффективности фосфорилирования вызвана принципиальным отличием состояния митохондрий при разных температурах. 2 1,6 a) 1,9 1,8 b) АДФ/О АДФ/О 1,7 1,7 1,5 1,6 1,5 1,4 1,4 1,3 1,3 1,2 15 25 T,°C 35 1,2 15 25 35 Т, °С Рис.13 Примеры двух серий экспериментов по измерению параметра АДФ/О. Результаты измерений в особой точке 19 °С не приведены. a)Эксперимент с последовательным повышением температуры b)Cначала промерены точки 30-40°С, далее со снижением температуры от 27°С до 16°С Обнаружены два различных состояния работы фосфорилирующей системы в режиме суперкомплекса, которые различаются значениями энергии активации. Как следует из рис.12 эти два состояния различаются не только энергией активации, но также и эффективностью работы фосфорилирующей системы. Полученные данные позволяют предполагать, что снижение АДФ/О и повышение кажущейся энергии активации обсусловлено повышением разобщающего эффекта жирных кислот в диапазоне пониженных температур эксперимента. 30 Выяснение различий двух режимов работы митохондрий Наблюдаемое пониженное значение АДФ/О на всех температурах связано с наличием жирных кислот. При добавке БСА(бычьего сывороточного альбумина), который обладает способностью связывать жирные кислоты [66,67] АДФ/О повышается до значений близких к 2, что соответствует теоретическому значению. (см. рис14) Рис.14 Возрастание АДФ/О при АДФ/О с БСА АДФ/О добавлении БСА. Среднее по 11 экспериментам. 1 1,5 2 Рис.15. Схема переноса протона жирной кислотой. На рисунке изображѐн разрез внутренней мембраны митохондрии. Цифры у стрелок обозначают стадии цикла переноса протона. 1 – протон, переносимый протонной помпой на внешнюю сторону мембраны, присоединяется к карбоксильной группе ЖК. 2 – ЖК в нейтральной форме осуществляет флип-флоп переход на внутреннюю сторону мембраны 3 – протон отсоединяется от ЖК, а анион ЖК захватывается АДФ/АТФ-переносчиком 4 - АДФ/АТФ-переносчик транспортирует анион ЖК на внешнюю сторону мембраны. Конец цикла 5 – использование протона АТФ-синтазой для синтеза АТФ. 31 Механизм переноса протона жирной кислотой известен [68,69] и его схема изображена на рис.15, а стадии переноса протона описаны в подписи к рисунку. Помимо АДФ/АТФ–переносчика возврат аниона жирной кислоты на внешнюю сторону мембраны может осуществляться с помощью глутамат/аспартатного переносчика, UCP а также дикарбоксилатного переносчика[68,70]. Участие этих переносчиков в переносе ЖК можно измерить (см. материалы и методы). Температурная зависимость разобщающего эффекта жирных кислот Была изучена температурная зависимость разобщающего эффекта ЖК (см метариалы и методы) при разных температурах. График Аррениуса для скорости дыхания митохондрий на сукцинате в присутствии экзогенных ЖК не имеет перегиба (см.рис.16), и не значительно отличается по наклону от графиков скорости V2 (см.рис.11) и скорости V3 (см.рис.12 и таб.1) при низких температурах. Это свидетельствует о том, что энергия активации трансмембранного переноса протона жирной кислотой близка к энергии активации реакции синтеза АТФ. Как известно, ЖК так же как и субстраты АТФ синтетазы эффективно транспортируются транслокатором нуклеотидов, поэтому наблюдаемое энергии активации трансмембранного переноса протона на ЖК и процесса синтеза АТФ действительно может совпадать в том случае, если оба процессы лимитированы скоростью работы АДФ/АТФ-переносчика в условиях эксперимента. (См. схему на рис.14) Лимитирование процесса фосфорилирования транслокатором нуклеотидов при этих температурах показано также в литературе.[71,72] 4 lnV lnV 3 Ea≈56кДж 2 1000/Т, 1/К 1 3,2 3,25 3,3 3,35 3,4 3,45 3,5 Рис.16. Температурная зависимость скорости дыхания митохондрий на сукцинате в присутствии 10мкМ линолевой кислоты в координатах Аррениуса. 32 Соотношение транслокатора нуклеотидов и глутаматного переносчика в разобщающем эффекте ЖК в условиях образования суперкомплекса Глутамат-зависимая составляющая разобщающего эффекта ЖК слабо проявляется при физиологических температурах. Изменение участия анионных переносчиков в процессе переноса ЖК может оказывать значительное влияние на эффективность фосфорилирования и разобщающее действие ЖК. Были проведены эксперименты по изучению влияния температуры на разобщающий эффект ЖК. На рис. 16 показан вклад анионных переносчиков в разобщающее действие ЖК при пониженной и физиологической температурах. В то время, как catr-зависимый эффект не изменяется с температурой, участие глутамат/аспартатного переносчика в транспорте ЖК при высоких температурах значительно меньше, чем при пониженных. Это падение полностью компенсируется возрастанием роли остальных переносчиков. Тем самым, общий эффект практически не меняется. 70 % от V2 Рис.17. Компоненты разобщающего действия ЖК при 19ºC и 36ºС в процентах от скорости V2. Эф-т 60 50 эф-т глутамата 40 остальное 30 эф-т catr 20 глутамата 0 19 36 T, ºC процентное изменение скорости дыхания при добавлении глутамата. Эф-т catr – процентное изменение скорости дыхания при добавлении catr. Остальное – разобщение за счѐт других 10 – анионных переносчиков, снимаемое добавкой БСА. Измерения в присутствии 10мкМ линолевой кислоты. Можно заключить, что при физиологических температурах подавляется транспорт ЖК на глутаматном переносчике, даже в условиях без синтеза АТФ. Глутаматный переносчик не взаимодействует с эндогенными ЖК и не участвует в разобщении во время синтеза АТФ в условиях образования суперкомплекса. Глутамат/аспартатный переносчик не вовлечѐн в процесс фосфорилирования, поэтому можно ожидать, что ЖК будет транспортироваться на нѐм так же активно, как и в отсутствие синтеза АТФ. В таком случае, добавление глутамата, ингибирующего перенос 33 ЖК на глутамат/аспартатном переносчике, должно уменьшать разобщающее действие ЖК и увеличивать АДФ/О. С целью выяснения влияния глутамата на АДФ/О был проведѐн ряд экспериментов. Было обнаружено, что глутамат действительно увеличивает АДФ/О в условиях, когда к митохондриям дополнительно добавлены экзогенные ЖК. (см таб. 2) T, K 16 18 19 20 35 АДФ/О с добавкой ЖК с ЖК и глутаматом 1,23 1,70 1,47 1,80 1,50 1,70 1,32 1,56 1,55 1,67 Таблица 2. Влияние глутамата на АДФ/О в присутствии ЖК. В добавленных ячейку экзогенных добавлялось 11мкМ линолевой кислоты. Однако, в условиях, когда дополнительного добавления ЖК не производится, глутамат никак не изменяет значение АДФ/О, несмотря на значительное количество эндогенных ЖК. Добавление БСА при этом значительно повышает АДФ/О, что говорит о том, что эндогенные ЖК разобщают во время фосфорилирования, однако не переносятся глутаматным переносчиком. (см таб. 3) №эксп 1 2 3 среднее АДФ/О контроль 1,29 1,29 1,30 1,29 Таблица 3. Влияние глутамата на с глутаматом 1,31 1,30 1,28 1,30 с БСА 1,49 1,45 1,54 1,49 АДФ/О в присутствии только эндогенных ЖК. Глутамат не меняет АДФ/О. Подавление глутаматного переносчика не только не меняет АДФ/О, но и не оказывает влияния на температуру перегиба на графиках Аррениуса (данные не приведены). Можно заключить, что изменение глутамат-зависимой компоненты разобщения жирными кислотами не может быть причиной повышения АДФ/О на высоких температурах, т.к. глутаматный переносчик не переносит эндогенные ЖК. Значит высокое значение АДФ/О при высокой температуре вызвано другими причинами. Конкуренция АТФ-синтазы и жирных кислот за поверхностный протон Протон на внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий может находиться в связанном состоянии (см лит. обзор), удерживаясь на отрицательно заряженных группах, образуя неравновесную фракцию кислот Бренстеда. Жирные 34 кислоты, за счѐт отрицательно заряженных карбоксильных групп тоже должны участвовать в этом процессе, связывая протон. Поверхностные протоны, как было показано (см лит обзор), используются АТФ-синтазой. Исходя из совпадения энергий активаций процессов разобщения ЖК и синтеза АТФ, можно заключить, что в условиях наших экспериментов лимитирующая стадия обоих процессов – работа транслокатора нуклеотидов. В таком случае, в процессе синтеза АТФ, АТФ-синтаза будет не всегда работать из-за недостатка АДФ в матриксе митохондрии. Тогда протоны будут присоединяться к ЖК и она будет осуществлять флип-флоп, а энергия электрохимического потенциала рассеется в виде тепла (см. рис.14 стадии 1-4). Изменение энергии активации при температуре около 26ºС означает, что транслокатор перестаѐт быть лимитирующей стадией. В таком случае, АТФ-синтаза всегда имеет достаточное количество АДФ для фосфорилирования и будет работать непрерывно, пока не закончится субстрат. Протоны будут постоянно расходоваться АТФ-синтазой (см. рис.14 стадия 5). В этом случае разобщение во время фосфорилирования будет снижено, т.к. АТФ-синтаза будет использовать протоны, присоединяющиеся к ЖК, пока ЖК не успела осуществить флип-флоп. Таким образом, во время синтеза АТФ при температуре тела теплокровных физиологические концентрации эндогенных жирных кислот практически не разобщают и осуществляется эффективный синтез АТФ. При пониженных температурах фосфорилирование идѐт медленнее и увеличивается разобщающее действие ЖК, при этом энергия тратится на обогрев. Такой механизм помогает поддерживать оптимальную температуру тела у млекопитающих. 35 Выводы 1. В диапазоне температур 10-25ºС в условиях образования суперкомплекса зарегистрирован широкий фазовый переход во фракции аннулярных липидов. Путѐм сопоставления с данными литературы показано, что в этих условиях происходит расслоение мембранных белков и липидов, температурный переход которых полностью качественно сходен температурному переходу химически чистых липидов. 2. Расшифрована природа ключевой стадии формирования суперкомплекса, индуцированная системой объѐмной регуляции. Получены данные, позволяющие говорить о существовании рафтозависимого механизма сборки суперкомплекса в митохондриях. 3. Показано, что энергии активации реакции трансмембранного переноса протона ЖК и энергия активации синтеза АТФ при температурах ниже 26ºС практически равны между собой. Сделано заключение о том, что оба процесса лимитированы работой транслокатора нуклеотидов. 4. Расшифрованы детали механизма разобщающего действия ЖК в условиях работы суперкомплекса. 5. Обнаружено изменение состояния фосфорилирующей системы в области 25-27ºС. Высказана гипотеза, что при переходе к более высоким температурам происходит выигрыш работы АТФ синтазы по сравнению с переносом протона на жирной кислоте. 36 Литература 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Mitchell P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemiosmotic type of mechanism // Nature. 1961. Vol. 191. P. 144–148. Liberman E.A., Skulachev V.P. Conversion of biomembrane-produced energy into electric form. IV. General discussion // Biochim. Biophys. Acta. 1970. Vol. 216, № 1. P. 30–42. Williams R.J.P. Possible functions of chains of catalysts // J. Theor. Biol. 1961. Vol. 1, № 1. P. 1–17. Chance B. et al. Respiratory Enzymes in Oxidative Phosphorylation V. a Mechanism for Oxidative Phosphorylation // J. Biol. Chem. 1955. Vol. 217, № 1. P. 439–452. Green D.E., Tzagoloff A. The mitochondrial electron transfer chain // Arch. Biochem. Biophys. 1966. Vol. 116, № 1. P. 293–304. Robinson J.B. Jr, Srere P.A. Organization of Krebs tricarboxylic acid cycle enzymes // Biochem. Med. 1985. Vol. 33, № 2. P. 149–157. Srere P.A. Complexes of Sequential Metabolic Enzymes // Annu. Rev. Biochem. 1987. Vol. 56, № 1. P. 89–124. Fleischer S. et al. Studies of the electron transfer system. The role of phospholipids in electron transfer // J. Biol. Chem. 1962. Vol. 237. P. 3264–3272. Höchli M., Hackenbrock C.R. Lateral translational diffusion of cytochrome c oxidase in the mitochondrial energy-transducing membrane // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1979. Vol. 76, № 3. P. 1236–1240. Sowers A.E., Hackenbrock C.R. Rate of lateral diffusion of intramembrane particles: measurement by electrophoretic displacement and rerandomization // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1981. Vol. 78, № 10. P. 6246–6250. Hackenbrock C.R. et al. Localization of enzymes in mitochondrial membranes with ferritin conjugates of affinity purified antibodies // Methods Enzymol. 1979. Vol. 56. P. 683–717. Hatefi Y. et al. Studies on the Electron Transfer System. Reconstitution of the electron transfer system // J. Biol. Chem. 1962. Vol. 237, № 8. P. 2661–2669. Yu C.A., Yu L., King T.E. Soluble Cytochrome b-c1 Complex and the Reconstitution of Succinate-Cytochrome c Reductase // J. Biol. Chem. 1974. Vol. 249, № 15. P. 4905–4910. Qiu Z.H., Yu L., Yu C.A. Spin-label electron paramagnetic resonance and differential scanning calorimetry studies of the interaction between mitochondrial cytochrome c oxidase and adenosine triphosphate synthase complex // Biochemistry (Mosc.). 1992. Vol. 31, № 12. P. 3297–3302. Berry E.A., Trumpower B.L. Isolation of ubiquinol oxidase from Paracoccus denitrificans and resolution into cytochrome bc1 and cytochrome c-aa3 complexes // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260, № 4. P. 2458–2467. Stroh A. et al. Assembly of respiratory complexes I, III, and IV into NADH oxidase supercomplex stabilizes complex I in Paracoccus denitrificans // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, № 6. P. 5000–5007. Sone N., Sekimachi M., Kutoh E. Identification and properties of a quinol oxidase supercomplex composed of a bc1 complex and cytochrome oxidase in the thermophilic bacterium PS3 // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262, № 32. P. 15386–15391. Iwasaki T., Wakagi T., Oshima T. Resolution of the aerobic respiratory system of the thermoacidophilic archaeon, Sulfolobus sp. strain 7. III. The archaeal novel respiratory complex II (succinate:caldariellaquinone oxidoreductase complex) inherently lacks heme group // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270, № 52. P. 30902–30908. Cruciat C.M. et al. The cytochrome bc1 and cytochrome c oxidase complexes associate to form a single supracomplex in yeast mitochondria // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, № 24. P. 18093–18098. Schägger H., Pfeiffer K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria // EMBO J. 2000. Vol. 19, № 8. P. 1777–1783. 37 21. Schägger H. Respiratory chain supercomplexes // IUBMB Life. 2001. Vol. 52, № 3-5. P. 119–128. 22. Schägger H., Pfeiffer K. The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, № 41. P. 37861–37867. 23. Schäfer E. et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes // J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281, № 22. P. 15370–15375. 24. Dudkina N.V. et al. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005. Vol. 102, № 9. P. 3225–3229. 25. Красинская И.П., Литвинов И.С., Захаров С.Д., Бакеева Л.Е., Ягужинский Л.С. Два качественно различных структурно-функциональных состояния митохондрий // Биохимия. 1989. Vol. 54. P. 1550–1556. 26. Krasinskaya I.P. et al. Relationships of respiratory chain and ATP-synthetase in energized mitochondria // FEBS Lett. 1984. Vol. 167, № 1. P. 176–180. 27. Murugova T.N. et al. Detection of new double-membrane structures in native mitochondria by the method of small-angle neutron scattering // Biophysics. 2006. Vol. 51, № 6. P. 882– 886. 28. Gil T. et al. Theoretical analysis of protein organization in lipid membranes // Biochim. Biophys. Acta. 1998. Vol. 1376, № 3. P. 245–266. 29. Mochizuki M. et al. Quantitative reevaluation of the redox active sites of crystalline bovine heart cytochrome c oxidase // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274, № 47. P. 33403–33411. 30. Lange C. et al. Specific roles of protein-phospholipid interactions in the yeast cytochrome bc1 complex structure // EMBO J. 2001. Vol. 20, № 23. P. 6591–6600. 31. Zhang M., Mileykovskaya E., Dowhan W. Gluing the Respiratory Chain Together cardiolipin is required for supercomplex formation in the inner mitochondrial membrane // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, № 46. P. 43553–43556. 32. Zhang M., Mileykovskaya E., Dowhan W. Cardiolipin is essential for organization of complexes III and IV into a supercomplex in intact yeast mitochondria // J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280, № 33. P. 29403–29408. 33. Kang S.Y. et al. Nuclear magnetic resonance investigation of the cytochrome oxidase-phospholipid interaction: a new model for boundary lipid // Biochemistry (Mosc.). 1979. Vol. 18, № 15. P. 3257–3267. 34. Fry M., Green D.E. Cardiolipin requirement for electron transfer in complex I and III of the mitochondrial respiratory chain. // J. Biol. Chem. 1981. Vol. 256, № 4. P. 1874–1880. 35. Paradies G. et al. Reactive oxygen species affect mitochondrial electron transport complex I activity through oxidative cardiolipin damage // Gene. 2002. Vol. 286, № 1. P. 135–141. 36. Genova M.L., Lenaz G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes // Biochim. Biophys. Acta. 2014. Vol. 1837, № 4. P. 427–443. 37. Ayuyan A.G., Cohen F.S. Raft Composition at Physiological Temperature and pH in the Absence of Detergents // Biophys. J. 2008. Vol. 94, № 7. P. 2654–2666. 38. Pataraia S. et al. Effect of cytochrome c on the phase behavior of charged multicomponent lipid membranes // Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr. 2014. Vol. 1838, № 8. P. 2036–2045. 39. Lingwood D., Simons K. Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle // Science. 2010. Vol. 327, № 5961. P. 46–50. 40. Baumgart T., Hess S.T., Webb W.W. Imaging coexisting fluid domains in biomembrane models coupling curvature and line tension // Nature. 2003. Vol. 425, № 6960. P. 821–824. 41. Schachter D. Fluidity and function of hepatocyte plasma membranes // Hepatol. Baltim. Md. 1984. Vol. 4, № 1. P. 140–151. 42. Lenaz G. Lipid fluidity and membrane protein dynamics // Biosci. Rep. 1987. Vol. 7. P. 823–837. 38 43. Hashimoto M. et al. Effects of docosahexaenoic acid on annular lipid fluidity of the rat bile canalicular plasma membrane // J. Lipid Res. 2001. Vol. 42, № 7. P. 1160–1168. 44. Бульѐнков Н.А., Желиговская Е.А. Функциональная модульная динамическая модель поверхностного слоя воды // Журнал Физической Химии. 2006. Vol. 80, № 10. P. 1784–1805. 45. Wickman H.H., Korley J.N. Colloid crystal self-organization and dynamics at the air/water interface // Nature. 1998. Vol. 393, № 6684. P. 445–447. 46. Войтенко В.С. Прикладная геомеханика в бурении. Недра, 1990. 256 p. 47. Teissié J. et al. Evidence for conduction of protons along the interface between water and a polar lipid monolayer // Proc. Natl. Acad. Sci. 1985. Vol. 82, № 10. P. 3217–3221. 48. Heberle J., Dencher N.A. Bacteriorhodopsin in ice. Accelerated proton transfer from the purple membrane surface // FEBS Lett. 1990. Vol. 277, № 1-2. P. 277–280. 49. Antonenko Y.N., Kovbasnjuk O.N., Yaguzhinsky L.S. Evidence in favor of the existence of a kinetic barrier for proton transfer from a surface of bilayer phospholipid membrane to bulk water // Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr. 1993. Vol. 1150, № 1. P. 45–50. 50. Solodovnikova I.M. et al. Local coupling of respiration processes and phosphorylation in rat liver mitochondria // Biofizika. 2004. Vol. 49, № 1. P. 47–56. 51. Alexiev U. et al. Rapid long-range proton diffusion along the surface of the purple membrane and delayed proton transfer into the bulk // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995. Vol. 92, № 2. P. 372–376. 52. Heberle J. et al. Proton migration along the membrane surface and retarded surface to bulk transfer // Nature. 1994. Vol. 370, № 6488. P. 379–382. 53. Yurkov V.I., Fadeeva M.S., aguzhinsky L.S. Proton transfer through the membrane-water interfaces in uncoupled mitochondria // Biochem. Biokhimiia. 2005. Vol. 70, № 2. P. 195– 199. 54. Yaguzhinsky L.S., Yurkov V.I., Krasinskaya I.P. On the localized coupling of respiration and phosphorylation in mitochondria // Biochim. Biophys. Acta BBA - Bioenerg. 2006. Vol. 1757, № 5–6. P. 408–414. 55. Prats M., Tocanne J.F., Teissie J. Lateral proton conduction at a lipid/water interface. Effect of lipid nature and ionic content of the aqueous phase // Eur. J. Biochem. FEBS. 1987. Vol. 162, № 2. P. 379–385. 56. Dergunov A.D., Kaprel’iants A.S., Ostrovskiĭ D.N. Changes in the structural state of boundary lipids in bacterial membrane under effect of the membranotropic antibiotic gramicidin S // Biokhimiia Mosc. Russ. 1981. Vol. 46, № 8. P. 1499–1509. 57. Litvinov I.S., Obraztsov V.V. Viscosity of free and protein-bound lipids in membranes // Biofizika. 1982. Vol. 27, № 1. P. 81–86. 58. Galla H.-J., Sackmann E. Lateral diffusion in the hydrophobic region of membranes: use of pyrene excimers as optical probes // Biochim. Biophys. Acta BBA-Biomembr. 1974. Vol. 339, № 1. P. 103–115. 59. Galla H.J., Hartmann W. Excimer-forming lipids in membrane research // Chem. Phys. Lipids. 1980. Vol. 27, № 3. P. 199–219. 60. Brown M.A., Raison J.K. The influence of storage temperature on the transition, activation enthalpy, and activity of enzymes associated with inner mitochondrial membranes // Arch. Biochem. Biophys. 1988. Vol. 260, № 2. P. 798–805. 61. Chapman D., Williams R.M., Ladbrooke B.D. Physical studies of phospholipids. VI. Thermotropic and lyotropic mesomorphism of some 1,2-diacyl-phosphatidylcholines (lecithins) // Chem. Phys. Lipids. 1967. Vol. 1, № 5. P. 445–475. 62. Hinz H.J., Sturtevant J.M. Calorimetric studies of dilute aqueous suspensions of bilayers formed from synthetic L- -lecithins // J. Biol. Chem. 1972. Vol. 247, № 19. P. 6071–6075. 63. Musch M.W., Koomoa D.-L.T., Goldstein L. Hypotonicity-induced Exocytosis of the Skate Anion Exchanger skAE1. Role of lipid raft regions // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, № 38. P. 39447–39453. 39 64. Disalvo E.A. et al. Structural and functional properties of hydration and confined water in membrane interfaces // Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr. 2008. Vol. 1778, № 12. P. 2655–2670. 65. Klingenberg M., Grebe K., Appel M. Temperature dependence of ADP/ATP translocation in mitochondria // Eur. J. Biochem. 1982. Vol. 126, № 2. P. 263–269. 66. Mizushima S. Removal by bovine serum albumin of fatty acids from membrane vesicles and its effect on proline transport activity in Escherichia coli // J. Biochem. (Tokyo). 1978. Vol. 84, № 2. P. 251–258. 67. Spector A.A., John K., Fletcher J.E. Binding of long-chain fatty acids to bovine serum albumin // J. Lipid Res. 1969. Vol. 10, № 1. P. 56–67. 68. Skulachev V.P. Fatty acid circuit as a physiological mechanism of uncoupling of oxidative phosphorylation // FEBS Lett. 1991. Vol. 294, № 3. P. 158–162. 69. ANDREYEV A.Y. et al. The ATP/ADP-antiporter is involved in the uncoupling effect of fatty acids on mitochondria // Eur. J. Biochem. 1989. Vol. 182, № 3. P. 585–592. 70. Skulachev V.P. Anion carriers in fatty acid-mediated physiological uncoupling // J. Bioenerg. Biomembr. 1999. Vol. 31, № 5. P. 431–445. 71. Kemp A. Jr, Groot G.S., Reitsma H.J. Oxidative phosphorylation as a function of temperature // Biochim. Biophys. Acta. 1969. Vol. 180, № 1. P. 28–34. 72. Heldt H.W., Klingenberg M. Differences between the reactivity of endogenous and exogenous adenine nucleotides in mitochondria as studied at low temperature // Eur. J. Biochem. 1968. Vol. 4, № 1. P. 1–8. 40
