Введение

Введение
П о с т ул а ты Бо р а с о с та в ля е т о с н о в у д ля п о н и м а н и я я вл е н и й л юм и н е с ц е н ц и и
, к о то р ы е д о э то г о о с т а в а ли с ь с о в е р ш е н н о н е п о н я тн ы м и . О тв е ти м с н а ч а л а н а во п р ос , ч то т а к о е
люминесценция?
В с е те ла и с п ус к а ю т э ле к тр о м а г н и тн ы е во л н ы , и н те н с и в н о с ть и с те п е н ь п о ля р и за ц и и к о то р ы х в р а з ли ч н ы х уч а с тк а х
с п е к тр а о п р е д е л я ютс я те м п е р а т ур о й т е л а и е г о п о г ло щ а те л ь н о й с п о с о б н о с ть ю в с о о т ве т с т ви и с за к о н о м К и р х г о ф а ( 1 8 2 4 1 8 8 7 ) . Т а к о е и зл уч е н и е н а зы ва е т с я те м п е р а ту р н ым и ли р а в н о в е с н ым . По м и м о т е м п е р а т ур н о г о и зл уч е н и я , м н о г и е те ла в р е з ул ь т а те р а з ли ч н ы х вн е ш н и х во зб уд и т е л е й д а ю т и зб ы то ч н о е
и зл уч е н и е , н е о п р е д е ля ющ е е с я т е м п е р а т ур о й т е ла . Та к о во ,
н а п р и м е р , с ве ч е н и е эк р а н а в т е л е ви зо р е , с ве ч е н и е г а з а в г а з о р а з р я д н о й тр уб к е п р и п р о х о ж д е н и и ч е р е з н е г о эл е к тр и ч е с к о г о
то к а , с ве ч е н и е с а х а р а п р и р а с к а лы в а н и и , с ве ч е н и е н е к о то р ы х
ж и вы х о р г а н и зм о в ( с ве т ля ч к о в) , с в е ч е н и е г н и ющ е г о д е р е ва и
т .д . В с е э то - п р и м е р ы х о ло д н ог о с ве ч е н и я . Т а к о е и зб ы то ч н о е
н а д т е м п е р а т ур н ы м и з л уч е н и е м н а зы в а е т с я л ю ми н е с ц е н ц и е й ,
е с ли е г о д ли те л ьн о с т ь п о с ле п р е к р а щ е н и я вн е ш н е г о во зд е й с т ви я ( п о с ле с ве ч е н и е ) зн а ч и те л ьн о п р е вы ш а е т п е р и о д с ве т о вы х к о ле б а н и й .
Пе р в а я ч а с ть э то г о о п р е д е л е н и я и с а м о й т е р м и н « лю м и н е с ц е н ц и я » б ы ли вв е д е н ы Е. В и д е м а н о м ( 1 8 2 6 - 1 8 9 9 ) . В то р а я
ч а с т ь к р и т е р и й д ли те л ьн о с ти - б ы л в ве д е н С . И. В а ви ло вы м ,
ч то б ы о т ли ч и т ь л ю м и н е с ц е н ц и ю о т б о л е е к р а тк о вр е м е н н ы х я в л е н и й вто р и ч н о г о и з л уч е н и я - о тр а ж е н и я и р а с с е я н и я с ве т а ,
то р м о зн о г о и з л уч е н и я за р я ж е н н ы х ч а с ти ц , и з л уч е н и я В а ви ло ва
Ч е р е н к о в а . К о н е ч н о , эти к р и те р и й н е о п р е д е ле н ы вп о лн е ж е с т к о и м о ж е т с л уж и т ь то ль к о о б щ е й о р и е н ти р о вк и . В р я д е с л уч а е в о н н е п о зво ля е т п р о ве с ти р е з к ую г р а н ь м е ж д у л юм и н е с ц е н ц и е й и н е л юм и н е с ц е н ц и е й . Р а н ьш е я в л е н и я л юм и н е с ц е н ц и и
д е ли ли н а ф л уо р е с ц е н ц и ю и ф о с ф о р е с ц е н ц и ю . П о д ф л уо р е с ц е н ц и е й п о н и м а л и и зл уч е н и е , п р е к р а щ а ющ е е с я м г н о ве н н о п о с ле п р е к р а щ е н и я д е й с тви я вы зы в а ю щ е г о е г о вн е ш н е г о во зб уд и т е ля , то е г о н а зы в а ю т ф о с ф о р е с ц е н ц и й . В с в е т е б о ле е п о з д н и х и с с л е д о ва н и й б ы ло вы я с н е н о , ч то н и к а к о й п р и н ц и п и а л ьн о й р а зн и ц ы м е ж д у ф л уо р е с ц е н ц и е й и ф о с ф о р е с ц е н ц и е й н е т.
Р а з ли ч и е м е ж д у н и м и ч и с то к о ли ч е с т ве н н о е – п о вр е м е н и д л и т е льн о с ти п о с ле с ве ч е н и я . По это м у ук а за н н о е д е л е н и е п о те р я ло
с м ы с л. Те р м и н « ф л уо р е с ц е н ц и я » п р и м е н я тс я и с е й ч а с , н о
то л ьк о д ля то г о , ч то б ы к а ч е с т ве н н о п о д ч е р к н ут ь к р а т к о вр е м е н н о с т ь с ве ч е н и и . На п р и м е р , д л и те л ьн о с т ь р е зо н а н с н о г о с в е ч е н и я р а зр е ж е н н ы х г а зо в с о с та в ля е т п о р я д к а 1 0 - 8 – 1 0 - 9 с .
К п р и ве д е н н о м у о п р е д е ле н и ю лю м и н е с ц е н ц и и с л е д уе т
1
д о б а ви т ь н е к о то р ы е за м е ч а н и я . П о с к о ль к у те м п е р а т ур а - м а к р о с к о п и ч е с к о е п о н я ти е , р а зд е ля ть п о лн о е и зл уч е н и е н а т е м п е р а т ур н о е и лю м и н е с ц е н ц и ю и м е е т с м ы с л н е д ля о тд е л ьн ы х м о л е к ул и а то м о в, а то л ьк о и х с о во к уп н о с те й – т е л , и м е ющ и е
о п р е д е ле н н ую те м п е р а т ур у. Е с ли с о с то я н и е те ла с то ль н е р а в н о в е с н о , ч то г о во р и ть о б е г о те м п е р а т ур е н е п р и х о д и тс я , то в
э то м с л уч а е н е ль зя г о во р и т ь и т е м п е р а т ур н о м и зл уч е н и и , и о
л ю м и н е с ц е н ц и и . Т а к б уд е т и п р и с ве ч е н и и о тд е л ьн ы х а то м о в и
м о л е к ул . По это й п р и ч и н е д ля с в е ч е н и я г а зо в, и с с ле д о ва н н о г о
В уд о м , п р е д п о ч ти те л ьн е е н е й тр а л ьн ы й те р м и н «р е зо н а н с н а я
и зл уч е н и е » в м е с то ч а с то уп о тр е б ля е м о г о т е р м и н а «р е зо н а н с н а я ф л уо р е с ц е н ц и я » . Д е й с тви те л ьн о , т а к о е с ве ч е н и е н а б люд а е тс я и в р а зр е ж е н н ы х г а з а х . Т е р м и н «р е зо н а н с н а я ф л уо р е с ц е н ц и я » о п р а вд а н , к о г д а р е ч ь и д е т о с ве ч е н и и с р а вн и те льн о
п ло тн ы х г а зо в .
В е щ е с т ва , в к о то р ы х во зб уж д а е тс я л ю м и н е с ц е н ц и я , н а з ы в а ют с я л юм и н о ф о р а м и . По м е то д у во зб уж д е н и я с в е ч е н и я р а з л и ч а ют:
1 ) Ф о то л юм и н е с ц е н ц и ю – л юм и н е с ц е н ц и ю , во зн и к а ющ ую
п р и о с ве щ е н и и л ю м и н о ф о р а вид и м ы м и ли ул ь тр а ф и о л е то вы м с ве то м ;
2 ) Р е н тг е н о л юм и н е с ц е н ц и ю – с ве ч е н и е л юм и н о ф о р а п р и о б л уч е н и и е г о р е н т г е н о вс к и м и и ли - л уч а м и ;
3 ) К а то до л юм и н е с ц е н ц и ю – с ве ч е н и е л юм и н о ф о ра п р и б о м б а р д и р о вк е е г о э л е к тр о н а м и ( к а то д н ы м и л уч а м и ) ;
4 ) Р а ди о л юм и н е с ц е н ц и ю – с ве ч е н и е п о д д е й с т ви е м я д е р н ы х
и зл уч е н и й : α - ч а с ти ц , β - ч а с ти ц , γ - л уч е й , п р о то н ов и т .д .;
5 ) Э л е к тр о л юм и н е с ц е н ц и ю – с ве ч е н и е , во зн и к а ю щ е е п р и
р а с ти р а н и и , р а зд а вли ва н и и и ли р а с к а лы ва н и и н е к о т о р ы х
к р и с та лло в ( н а п р и м е р , с а х а р а ) ;
6 ) К а н до л юм и н е с ц е н ц и ю – с ве ч е н и е ( н о н е те м п е р а т у р н о е ) ,
во зн и к а ющ е е п р и п о м е щ е н и и н е к о то р ы х в е щ е с тв в п ла м я ,
н а п р и м е р в п ла м я г а з о во й г о р е л к и .
К а к и вс я к о е и зл уч е н и е , л ю м и н е с ц е н ц и я во зн и к а е т
в р е з ул ь та те к в а н то вы х п е р е х о до в и зл уч а ю щ е й с и с те м ы с к а к и х - то во зб уж д е н н ы х эн е р г е ти ч е с к и х ур о в н е й н а ур о вн и б о ле е
н и з к и е . С это й то ч к и зр е н и я с та н о ви тс я п о н я тн ы м о д и н и з х а р а к те р н ы х п р и зн а к о в л юм и н е с ц е н ц и и – д ли т е л ьн о с ть с ве ч е н и я , - и б о м н о г и е т е л а м о г у т н а х о д и т ьс я в во зб уж д е н н ы х с о с то я н и я х д ли т е ль н о е вр е м я . Люм и н е с ц е н ц и я — и с п ус к а н и е ф о то н о в и з э ле к тр о н н о - в о зб уж д е н н ы х с о с то я н и й — д е ли тс я н а
д в а ти п а в за ви с и м о с т и о т п р и р од ы о с н о вн о г о и во зб уж д е н н о г о
с о с то я н и й . В с и н г ле тн о м во зб уж д е н н о м с о с то я н и и э ле к т р о н н а
э н е р г е ти ч е с к и б о ле е вы с о к о й о р б и т а ли и в то р о й э ле к тр о н н а
о р б и та ли с б о ле е н и з к о й эн е р г и е й и м е ю т п р о ти во п о ло ж н ую
2
о р и е н т а ц и ю с п и н о в . Г о во р я т , ч то э ти эл е к тр о н ы с п а р е н ы . В
тр и п ле тн о м с о с то я н и и э ти эл е к тр о н ы н е с п а р е н ы , т. е . и х с п и н ы и м е ют о д и н а к о в ую о р и е н та ц и ю. Пр и во з вр а щ е н и и эл е к тр о н а и з во зб уж д е н н о г о с и н г ле тн о г о с о с то я н и я в о с н о вн о е о р и е н т а ц и я е г о с п и н а н е д о лж н а м е н я т ьс я . Из м е н е н и е о р и е н та ц и и
с п и н а н е о б х о д им о п р и п е р е х о д е и з тр и п ле тн о г о с о с то я н и я в
с и н г л е тн о е о с н о в н о е с о с то я н и е . Ф л уо р е с ц е н ц и я - это и с п ус к а н и е , п р о и с х о д ящ е е п р и во з вр а щ е н и и с п а р е н н о г о э ле к тр о н а н а
б о л е е н и зк ую о р б и т а л ь . Та к и е пе р е х о д ы к в а н то во м е х а н и ч е с к и
" р а зр е ш е н ы " , а т и п и ч н ы е ве ли ч и н ы с к о р о с те й и с п ус к а н и я д ля
н и х ~1 0 8 с - 1 . В ы с о к и е зн а ч е н и я с к о р о с те й и с п ус к а н и я п р и во д я т
к вр е м е н а м за т у х а н и я ф л уо р е с ц е н ц и и ~1 0 - 8 с ( 1 0 н с ) . В р е м я
ж и зн и - это с р е д н и й п е р и о д вр е м е н и , в те ч е н и е к о то р о г о ф л уо р о ф о р н а х о д и тс я в во зб уж д е н н о м с о с то я н и и . Фо с ф о р е с ц е н ц и я - это и с п ус к а н и е , п р о и с х о д ящ е е п р и п е р е х о д е м е ж д у с о с т о я н и я м и р а з ли ч н о й м ул ь ти п ле тн о с ти , к а к п р а ви л о и з во з б уж д е н н о г о тр и п ле тн о г о с о с то я н и я в с и н г ле тн о е о с н о вн о е . Т а к и е
п е р е х о д ы н е р а зр е ш е н ы , и к о н с та н ты с к о р о с ти и с п ус к а н и я м а л ы . Ти п и ч н ы й д и а п а зо н вр е м е н и за т ух а н и я ф о с ф о р е с ц е н ц и и —
о т м и л ли с е к ун д д о с е к ун д , ч то г л а вн ы м о б р а з о м з а ви с и т о т
в к ла д а д р у г и х п р о ц е с с о в д е з а к ти ва ц и и .
П о г ло щ е н и е и и с п ус к а н и е с ве т а х о р о ш о и лл юс тр и р уе т д и а г р а м м а ур о в н е й э н е р г и и , п р е д ло ж е н н а я Я б ло н с к и м . О с н о вн о е ,
п е р во е и вто р о е э л е к тр о н н ы е с о с то я н и я о б о зн а ч а ю т S 0 , S 1 , и S 2
с о о т ве тс тве н н о . К а ж д ы й и з эти х ур о вн е й эн е р г и и м о ж е т с о с т о я ть и з м н о ж е с тва к о ле б а те ль н ы х эн е р г е ти ч е с к и х ур о вн е й , о б о з н а ч а е м ы х 0 , 1 , 2 и т. д . Пе р е х о д ы м е ж д у р а з ли ч н ы м и эл е к тр о н н ы м и ур о вн я м и о б о зн а ч е н ы в е р ти к а л ьн ы м и л и н и я м и . Т а к о е п р е д с та вл е н и е и с п о ль з уе т с я , ч то б ы н а г ля д н о п о к а з а т ь
м г н о ве н н ую п р и р о д у п о г л о щ е н и я с ве т а . Это т п р о ц е с с п р о и с х о д и т п р и м е р н о за 1 0 - 1 5 с , вр е м я , с л и ш к о м к о р о тк о е д ля за м е тн о г о с м е щ е н и я я д е р ( п р и н ц и п Фр а н к а - К о н д о н а ) .
З а п о г ло щ е н и е м с ве т а о б ы ч н о с л е д уе т н е с к о л ьк о д р уг и х
п р о ц е с с о в . В о зб уж д е н и е ф л уо р о ф о р а , к а к п р а ви л о , п р о и с х о д и т
д о н е к о то р о г о вы с ш е г о к о л е б а те л ьн о г о ур о вн я с о с то я н и й ( S 1
л и б о S 2 ) . 3 a н е к о то р ы м и р е д к и м и и с к лю ч е н и я м и , д ля м о ле к ул
в к о н д е н с и р о ва н н о й ф а з е х а р а к те р н а б ы с тр а я р е л а к с а ц и я н а
с а м ы й н и ж н и й к о ле б а т е льн ы й ур о в е н ь с о с то я н и я . Э то т п р о ц е с с н а зы ва е тс я вн утр е н н е й к о нв е р с и е й и п р о и с х о д и т б о л ьш е й
ч а с т ь ю за 1 0 - 1 2 с . П о с к о л ьк у ти п и ч н ы е вр е м е н а з а т ух а н и я
ф л уо р е с ц е н ц и и б ли зк и к 1 0 - 8 с , вн утр е н н я я к о н в е р с и я о б ы ч н о п о лн о с ть ю за к а н ч и ва е тс я д о п р о ц е с с а и с п ус к а н и я . С ле д о в а т е льн о , и с п ус к а н и е ф л уо р е с ц е н ц и и ч а щ е вс е г о о с ущ е с т в ля е тс я
и з те р м и ч е с к и ра вн о в е с н о г о во зб уж д е н н о г о с о с то я н и я . Ан а л о г и ч н о п о г ло щ е н и ю о б р а тн ы й п е р е х о д э ле к тр о н ов н а с а м ы й
3
н и ж н и й э ле к тр он н ы й ур о в е н ь та к ж е п р и во д и т к к о л е б а те льн о
во зб уж д е н н о м у с о с то я н и ю . Те р м и ч е с к о е р а вн о ве с и е д о с ти г а е тс я з а вр е м я п о р я д к а 1 0 - 1 2 с . Ин т е р е с н ы м с ле д с тв и е м и з та к о г о
р а с с м о тр е н и я я вл я е тс я то , ч то с п е к тр п о г ло щ е н и я м о ле к ул ы
о тр а ж а е т к о ле б а т е льн ую с тр ук тур у в о зб уж д е н н ы х э ле к тр о н н ы х
с о с то я н и й , а с п е к тр и с п ус к а н и я - к о ле б а те льн ую с тр ук т ур у о с н о вн о г о эл е к тр о н н о г о с о с то я н и я . В б о ль ш и н с т ве с л уч а е в э ле к тр о н н о е во зб уж д е н и е н е с и л ьн о и з м е н я е т р а с п о л о ж е н и е к о л е б а те льн ы х ур о вн е й эн е р г и и . В р е з ул ьт а т е это г о к о л е б а те л ьн ы е
с тр ук т ур ы , п р о я в ля ющ и е с я в с п е к тр а х п о г ло щ е н и я и и с п ус к а ния, сходны.
Молекулы в состоянии S, могут также подвергаться конверсии в первое
триплетное состояние Т1. Испускание из Т1 называемое фосфоресценцией,
обычно сдвинуто в сторону больших длин волн (меньших энергий) по сравнению с флуоресценцией. Конверсия из S1 в Т1 называется интеркомбинационной конверсией. Переход из Т1 в основное состояние запрещен, в результате чего константа скорости такого испускания на несколько порядков меньше
соответствующей константы для флуоресценции. На испускание флуоресценции могут влиять и другие факторы: влияние растворителей, релаксация растворителя, тушение, а также реакции, происходящие в возбужденных состояниях.
О бъ яс н е н и е п р о и с х о жд е н и я л и н е й чат ых с п е кт ро в .
Л и н е й ч а ты й
с пе к тр
и с п ус к а н и я
о б ъ я с н я ют
п ереходом
4
а то м а , н а х о д я щ е г о с я в во зб уж д е н н о м с о с то я н и и , с вы с ш е г о
э н е р г е ти ч е с к о г о ур о вн я н а б о ле е н и зк и й . На п р и м е р , п р и п е р е х о д е с о в то р о г о эн е р г е т и ч е с к о г о ур о вн я н а п е р вы й эн е р г и я
а то м а ум е н ь ш а е т с я н а Е2 - Е1 = 1 , 7 7 эВ ; п р и э то м и с п ус к а е тс я
ф о то н с ве та с д л и н о й во лн ы , р а в н о й
λ=
hc
E 2  E1
Л и н и и п о г ло щ е н и я в
Е5
тр е а то м а о б р а з ую тс я в
з ул ь т а те п е р е х о д а а то м а с Е4
г е ти ч е с к о г о ур о в н я , с о о т с тв ую щ е г о н е во зб уж д е н - Е3
с о с то я н и ю а то м а , н а б о л е е
к и й ур о ве н ь за с ч е т эн е р п о л уч а е м о й и з вн е . Та к к а к Е2
о б л а д а е т вп о лн е о п р е д е н ы м и , д и с к р е тн ы м и зн а я м и эн е р г и и , то и д ли н ы
и зл уч а е м о г о и ли п о г л о щ а с ве та вп о лн е оп р е д е ле н ы .
Е1
б о л ьш е р а зн о с ть эн е р г и й
н я а то м а , те м м е н ьш е й д ли н ы
во лн ы и с п ус к а е т с я с в е т .
hν54
hν15
hν42
hν51
hν21
спекреэнерветному
низгии
а то м
ленчениво лн
емого
Чем
ур о в -
Рис.1. Механизм флюоресценции
Ф о то н с эн е р г и е й h ν 1 5 п о г ло щ а е тс я м о ле к уло й , п е р е во д я
е е и з с о с то я н и я с эн е р г и е й Е в во зб уж д е н н о е с о с то я н и е Е1 .
О б р а тн ы й п е р е х о д м о ж е т и д ти п р я м о ( п ун к ти р н а я ли н и я ) и ли
в ви д е к а с к а д н о г о п р о ц е с с а , к о г д а и с п ус к а ю тс я р а зли ч н ы е ф о то н ы с эн е р г и я м и h ν 5 4 , h ν 42 , h ν 2 1 , п р и ч е м эн е р г и я п о г л о щ е н н о г о ф о то н а ( h ν 0 ) м о ж е т о к а за ть с я м е н ь ш е с ум м а р н о й
э н е р г и и и с п ус к а е м ы х ф о то н о в ( h ν ) . Ч а с т ь эн е р г и и ф о то н а ( А)
п е р е д а е т с я с о с е д н и м м о ле к ул а м и з а тр а ч и в а е тс я н а р а з ли ч н ы е
в н утр и м о ле к ул я р н ы е п р о ц е с с ы . П о это м у с п р а в е д ли во р а ве н с т во :
hν = hν0 –A
О тк уд а ν < ν 0 , λ > λ 0 ,то е с т ь д ли н а во лн ы и с п у с к а е м о г о
с ве та п р и л ю м и н е с ц е н ц и и м е н ьш е д ли н ы во л н ы п а д а ющ е г о
с ве та .
Ф о с ф о р е с ц е н ц и ю н а б л юд а ю т в к р и с т а л ла х , г д е ц е н тр а м и
с ве ч е н и я я в ля ютс я а то м ы , и о н ы и ли г р уп п ы и х .
Э л е к тр о н ,
во зб уж д е н н ы й п о г ло щ а е м ы м с в е то м , н е р е д к о о тд е ля е тс я о т
ц е н тр а с ве ч е н и я . Пр и во з вр а щ е н и и э ле к тр о н а н а п р е ж н е е м е с то с ве ч е н и е во зо б н о вля е тс я . Т а к к а к с к о р о с т ь п е р е м е щ е н и я
э л е к тр о н а в к р ис та л ле м а ла , то с в е ч е н и е м о ж е т п р о д о лж а т ьс я
5
д ли те л ьн о е вр е м я .
П о э то м у п р и и зуч е н и и эн е р г е ти ч е с к и х д и а г р а м м п о ле зн о
с о п о с та ви т ь и х с п ла н е та р н о й м о д е ль ю Р е зе р ф о р д а – Бо р а , о б р а ти в вн и м а н и е н а в а ж н ы е м о м е н ты :
- В эн е р г е ти ч е с к о й м о д е ли о р б и т н е т , ук а зы в а ю тс я ли ш ь
э н е р г и и а то м о в в о п р е д е ле н н ы х с о с то я н и я х .
- В с о о тве тс тви и с э ти м р е ч ь и д е т н е о п е р е с к о к а х с о р б и ты н а о р б и т у, а о п е р е х о д е а то м о в и з с о с тоя н и я с б о л ьш е й
э н е р г и е й в с о с то я н и е с м е н ьш е й эн е р г и е й ( п р и и зл уч е н и и ) и ли
ж е н а о б о р о т ( п р и во зб уж д е н и и ) .
- Р а с с то я н и е м е ж д у о р б и та м и и м е ют г е о м е тр и ч е с к и й
с м ы с л, а м е ж д у ур о вн я м и – эн е р г е ти ч е с к и й ; п о э то м у г о в о р и ть
о с к а ч к а х э ле к тр о н а с ур о вн я н а ур о ве н ь н е д о п ус т и м о .
Х а р а кт е р и с т ики ис пу с ка ни я фл у о р е с ц е н ц и и
Д ля я в ле н и я ф луо р е с ц е н ц и и и з ве с тн о н е с к о ль к о о с н о в н ы х
х а р а к те р и с ти к . С ущ е с тв ую т и и с к л юч е н и я , н о о н и р е д к и . Ес ли
к а к а я - ли б о и з н и ж е п е р е ч и с ле н н ы х х а р а к т е р и с ти к о тс ут с тв уе т
у д а н н о г о ф л уо р о ф о р а , м о ж н о с д е ла т ь вы во д о н е к о то р ы х о с о б ы х с во й с тв а х это г о с о е д и н е н и я .
1 . С то к с о в с д ви г
К а к п р а ви ло , вс е г д а н а б л юд а е тс я с д ви г и с п ус к а н и я о тн о с и т е льн о п о г ло щ е н и я в с то р о н у б о ль ш и х д ли н во л н , т .е . п о те р я
э н е р г и и ( и с к л юч е н и е — а то м ы в г а зо во й ф а з е ) . Э то я в ле н и е
в п е р вы е н а б л юда л С то к с в 1 8 5 2 г . в К е м б р и д ж е . И с то ч н и к о м
ул ь т р а ф и о л е то во г о во зб уж д е н и я с л у ж и л с о лн е ч н ы й с в е т , п р о п ущ е н н ы й ч е р е з п л а с ти н к у и з г ол уб о г о с те к ла . П е р е д п р и е м н и к о м в к а ч е с тве ж е л то г о ф и л ьтр а с то я л с та к а н с ви н о м . Фл уо р е с ц е н ц и я х и н и н а ле ж и т в о б ла с ти 4 5 0 н м и п о э то м у х о р о ш о
з а м е тн а н е во о р у ж е н н ы м г л а зо м . В н а с то я щ е е вр е м я д ля о п р е д е ле н и я в е ли ч и н ы с то к с о ва с д ви г а и с п о л ьз ую т д р уг и е м е то д ы .
П о те р и эн е р г и и м е ж д у во зб уж д е н и е м и и с п ус к а ни е м н е и з м е н н о н а б лю д а ю тс я д ля ф л уо р е с ц и р ую щ и х м о ле к ул в р а с тв о р а х . Од н о й и з ос н о вн ы х п р и ч и н во зн и к н о ве н и я с то к с о ва с д в и г а я в ля е тс я б ы с тр а я р е л а к с а ц и я н а н и ж н и й к о ле б а те льн ы й ур о в е н ь с о с то я н и я S 1 . К то м у ж е о б ы ч н о п р о и с х о д итп е р е х о д н а
во зб уж д е н н ы е к о ле б а т е льн ы е ур о вн и с о с то я н и я S 0 , ч то п р и в о 6
д и т к д о п о лн и т е л ьн о й п о те р е к о л е б а те льн о й эн е р г и и . В д о б а в о к к это м у с то к с о в с д ви г м о ж е т б ы т ь е щ е б о ле е ув е ли ч е н б л а г о д а р я вли я н и я м р а с тво р и те ля н а ф л уо р о ф о р ы и р е а к ц и я м в
во зб уж д е н н ы х с о с то я н и я х . В г а зо во й ф а зе у а то м о в и м о ле к ул
н е в с е г д а и м е е тс я с то к с о в с д ви г . Ис п ус к а н и е б е з с д ви г а
н а б люд а ю т то г д а , к о г д а к о н ц е н тр а ц и и г а за д о с та т о ч н о м а лы
д ля то г о , ч то б ы во зб уж д е н н ы е м о ле к улы н е п р е те р п е ва ли
с то л к н о ве н и й с д р уг и м и м о ле к ул а м и д о п р о ц е с с а и с п ус к а н и я .
Т а к и е с то л к н о ве н и я п р и во д я т к р е ла к с а ц и и . В ж и д к о й ф а з е
п р о ц е с с ы с о уд а р е н и я п р о и с х о дя т н е п р е р ы вн о .
2 . Н е за ви с и м о с ть с п е к тр а и с п ус к а н и я о т д ли н ы во лн ы во з б уж д е н и я ( п р а ви ло К а ш и )
С п е к тр и с п ус к а н и я ф л уо р е с ц е н ц и и о б ы ч н о н е за ви с и т о т
д ли н ы во лн ы во зб уж д е н и я . Пр и во зб уж д е н и и н а вы с ш и е эл е к тр о н н ы е и к о л е ба те л ьн ы е ур о вн и и зб ы то к эн е р г и и б ы с тр о р а с х о д уе тс я , п е р е во д я ф л уо р о ф о р н а с а м ы й н и ж н и й к о л е б а т е л ьн ы й ур о ве н ь с о с то я н и я S 1 . Э та р е ла к с а ц и и п р о и сх о д и т з а вр е м я п о р я д к а 1 0 - 1 2 с и я в ля е тс я , п о - ви д и м о м у, р е з ул ь та то м с и л ь н о г о п е р е к р ы ва н и я м н о ж е с т ва с о с то я н и й с п р и м е р н о р а вн ы м и
э н е р г и я м и . Б ла г о д а р я та к о й б ы с тр о й р е ла к с а ц и и д ли н а во лн ы
во зб уж д е н и я о бы ч н о н е в ли я е т н а с п е к тр и с п ус к а н и я .
3.
Пр а ви ло з е р к а л ьн о й с и м м е тр и и ( п р а ви ло Ле вш и н а )
О б ы ч н о с п е к тр и с п ус к а н и я ф л уо р е с ц е н ц и и п р е д с та вля е т с о б о й зе р к а л ьн о е о тр а ж е н и е с п е к тр а п о г ло щ е н и я , то ч н е е , то г о
п о г ло щ е н и я , к о то р о е с о о т ве т с т вуе т п е р е х о д у и з S 0 в S 1 . С и м м е тр и ч н а я п р и р о д а э ти х с п е к тр о в о п р е д е ля е тс я те м , ч то и п о г ло щ е н и е , и и с п ус к а н и е о б ус ло вл е н ы о д н и м и и те м и ж е п е р е х о д а м и , а та к ж е с х о д с т во м к о л е б а те льн ы х эн е р г е ти ч е с к и х
ур о вн е й с о с то я н и й S 0 и S 1 . Д ля м н о г и х м о ле к ул р а з ли ч н о е
р а с п р е д е л е н и е эл е к тр о н о в в с о с то я н и я х S 0 в S 1 с ущ е с тве н н о н е
в ли я е т н а э ти ур о вн и эн е р г и и . С о г ла с н о п р и н ц ип у Фр а н к а —
К о н д о н а , вс е э ле к тр о н н ы е п е р е х о д ы п р о и с х о д я т б е з и зм е н е н и я
м е ж ъя д е р н о г о р а с с то я н и я . В р е зул ь т а те , е с ли д а н н а я ве р о я т н о с ть п е р е х о д а ( ф а к то р Фр а н к а — К о н д о н а ) м е ж д у н ул е вы м и
в то р ы м к о л е б а те л ьн ы м и ур о вн я м и м а к с и м а л ьн а п р и п о г ло щ е н и и , с о о тве тс твую щ и й п е р е х о д б уд е т н а и б о ле е в е р о я т е н та к ж е
и в и с п ус к а н и и .
7
4.
Закон Вавилова
Квантовый выход люминесценции не зависит от длины волны возбуждения. Причиной этого явления является то, что молекула дольше
всего живет на нижнем подуровне возбужденного состояния и безизлучательный переход происходит именно из этого состояния.
Времена затухания и квантовые выходы флуоресценции
Часто измеряют времена затухания и квантовые выходы флуоресцирующих соединений. Смысл этих параметров хорошо виден из модифицированной диаграммы Яблонского. На этой диаграмме мы не
указываем подробно отдельные процессы релаксации, приводящие к
релаксированному состоянию S1, а обращаем большое внимание на
процессы, которые ответственны за возвращение в основное состояние. В частности, нас интересует константа скорости излучательной
дезактивации флуорофора (Г) и константа скорости безызлучательной
дезактивации в состояние S0 (к).
Квантовый выход флуоресценции - это отношение числа испущенных фотонов к числу поглощенных. Обе константы скорости Г и к соот8
ветствуют процессам уменьшения заселенности возбужденного состояния. Доля молекул флуорофора, которые дезактивируются с испусканием, а, следовательно, и квантовый выход определяются выражением
Q=Г/(Г+k))
Квантовый выход близок к единице в том случае, если константа
скорости безызлучательной дезактивации много меньше константы
скорости испускания, т. е. к << Г. Заметим, что энергетический выход
флуоресценции всегда меньше единицы из-за стоксовых потерь.
Время жизни возбужденного состояния определяется как среднее
время, в течение которого молекула находилась в возбужденном состоянии до того, как вернуться в основное состояние. Обычно время
затухания флуоресценции ~10 нс. Для флуорофора, описываемого
диаграммой Яблонского, время затухания равно
т=1/(Г+к)
Необходимо помнить, что испускание флуоресценции - это случайный процесс и не все молекулы испускают фотоны при t = т. Время
жизни — это средняя продолжительность пребывания в возбужденном
состоянии. Время жизни флуорофора в отсутствие безызлучательных
процессов, называемое собственным временем жизни т0, равно
т0 = 1 / Г
Отсюда вытекает обычное соотношение между квантовым выходом
и временем жизни:
Q = т / т0
Квантовый выход и время жизни могут изменяться под действием
любых факторов, влияющих на константы скорости. Например, молекула может оказаться неспособной флуоресцировать из-за большой
скорости внутренней конверсии либо малой скорости испускания.
Сцинтилляторы обычно выбирают за их высокие квантовые выходы,
которые являются результатом больших значений Г. Им обычно соответствуют короткие времена жизни, порядка 1 нс.
Флуорофоры
Структуры некоторых типичных флуорофоров представлены на
рис. 2. Одним из широко распространенных флуорофоров является
хинин, который добавляют в тонизирующие напитки. Если посмотреть
9
на стакан тоника, выставленного на солнечный свет, часто можно увидеть слабое голубое свечение. Оно наиболее заметно, если на стакан
смотреть под прямым углом к направлению солнечного света, а также,
если диэлектрическая постоянная уменьшена благодаря присутствию
добавок. Хинин, возбуждаемый ультрафиолетовым излучением солнца, при возвращении в основное состояние испускает голубой свет с
длиной волны около 450 нм. Явление флуоресценции часто может
быть обусловлено некоторыми добавками. Например, зеленое или
красно-оранжевое свечение, наблюдаемое иногда в антифризе, вероятно, вызвано следовыми количествами флуоресцеина или родамина
соответственно (рис. 2). Многоядерные ароматические углеводороды,
такие, как антрацен или перилен, также флуоресцируют, чем может
частично определяться голубая флуоресценция бензина. И наконец,
сильно флуоресцируют такие соединения, как РРО и РОРОР, используемые в "сцинтилляционных" растворах и биохимических исследованиях.
Рис.2. Структуры типичных флуоресцирующих соединений
1. Природные флуорофоры
БЕЛКИ.
Триптофан - наиболее интенсивно флуоресцирующая аминокислота в белках. Около 90% всей флуоресценции белков обычно обусловлено триптофановыми остатками. Этот природный флуорофор крайне
чувствителен к полярности окружающей среды. Спектральные сдвиги
часто являются следствием нескольких явлений, среди которых можно
выделить связывание лигандов, ассоциацию белок — белок и денатурацию. Кроме того, максимумы испускания белков отражают среднюю
доступность их триптофановых остатков в водной фазе. Белки поглощают свет вблизи 280 нм, а максимумы спектров флуоресценции лежат в области 320 — 350 нм. Времена затухания флуоресценции триптофановых остатков лежат в диапазоне 1 — 6 нс.
10
Тирозин интенсивно флуоресцирует в растворе, однако в белках
его флуоресценция значительно слабее. Денатурация белков обычно
усиливает испускание тирозина. Как и для фенола, рКа тирозина очень
сильно уменьшается при возбужденнее, и может происходить ионизация в возбужденном состоянии.
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ. Нуклеотиды и нуклеиновые кислоты обычно не флуоресцируют. Тем не менее существуют некоторые исключения. tRNAPhe из дрожжей содержит интенсивно флуоресцирующее основание, известное как Y-основание, которое имеет максимум испускания вблизи 470 нм, а время жизни ~6 нс.
NADH флуоресцирует сильно, и максимумы его поглощения и испускания находятся при 340 и 450 нм соответственно. NAD
не флуоресцирует. Время затухания флуоресценции NADH в водном
буфере составляет примерно 0,4 нс. Флуоресцирующей группой является восстановленное никотинамидное кольцо, причем его флуоресценция частично потушена за счет столкновений с остатком аденина.
При связывании NADH с белками квантовый выход его флуоресценции
увеличивается обычно в четыре раза. Такое увеличение выхода обычно интерпретируют как следствие связывания NADH в вытянутой конформации, что подтверждается изучением дифракции рентгеновских
лучей на гидрогеназах.
КОФАКТОРЫ.
Рибофлавин и FAD. Рибофлавин, FMN (флавинмононуклеотид) и
FAD (флавинадениндинуклеотид) поглощают свет в видимой области
(~450 нм) и испускают в области 515 нм. Типичные времена жизни для
FMN и FAD составляют 4,7 и 2,3 не соответственно. Как и для NADH,
флуоресценция фла-вина динамически тушится аденином. Далее, FAD
также образует комплексы-ассоциаты, в которых флуоресценция флавина потушена аденином (статическое тушение). Флавопротеины в основном не флуоресцируют, однако опять же существуют исключения.
2. Искусственные флуорофоры
Часто естественные флуоресцентные свойства макромолекул не
позволяют получить из эксперимента желаемую информацию. Так,
например, флуоресценция белка и даже поляризация этой флуоресценции не отражают явление, которое хотят охарактеризовать количественно. В таком случае выбирают флуорофоры, которые хотя и являются посторонними по отношению к исследуемой системе, но имеют
лучшие спектральные свойства.
11
РИС. 3. Часто используемые искусственные флуорофоры
ИЗОЦИАНАТЫ и ИЗОТИОЦИАНАТЫ ФЛУОРЕСЦЕИНА и РОДАМИНА.
Эти красители широко используют в качестве меток для белков.
Меченные флуоресцеином иммуноглобулины — коммерческие реактивы; их часто используют в флуоресцентной микроскопии. Именно эти
вещества выбирают из-за высоких квантовых выходов и устойчивости
к фотообесцвечиванию. Кроме того, благодаря большим длинам волн
поглощения и испускания сведена к минимуму проблема фоновой
флуоресценции биологических образцов и можно избежать применения кварцевой оптики. Изоцианатная или изотиоцианатная группы
находятся либо в мета-, либо в пара-положении по отношению к карбокси-группе. Коммерческие меченые реагенты представляют собой
смесь изомеров. Эти красители реагируют в первую очередь с лизиновым или цистеиновым участком белков. Времена затухания флуоресценции красителей около 4 нс, а их спектры испускания мало чувствительны к полярности растворителя. Эти красители очень подходят для
количественного определения степени ассоциации небольших меченых молекул с белками на основании изменения поляризации флуоресценции.
ДАНСИЛХЛОРИД. Дансилхлорид широко используют в качестве метки
для белков, особенно в тех случаях, когда проводят измерения поляризации. Это вещество давно известно и имеет удобное время жизни
флуоресценции (~ 10 нс). На спектр испускания дансильной группы
сильно влияет полярность растворителя.
12
1-анилино-8нафталинсульфоновая
кислота,
2-толуидинилнафталин-6сульфонорая кислота и их производные часто используют в качестве
нековалентно связанных зондов для белков и мембран. Эти зонды почти не флуоресцируют в воде, но интенсивно флуоресцируют либо при
растворении в неполярных растворителях, либо когда они связаны с
макромолекулами. Низший квантовый выход в водной фазе позволяет
во многих случаях не учитывать эту часть флуорофора, что упрощает
эксперименты. Подобные флуорофоры связываются с сывороточными
альбуминами, липопротеинами, апомиоглобином, иммуноглобулинами
и липидными бислоями. Места связывания имеют, по-видимому, как
полярную, так и неполярную природу.
НАФТИЛАМИНСУЛЬФОНОВЫЕ
КИСЛОТЫ.
ГИДРОФОБНЫЕ МЕМБРАННЫЕ ЗОНДЫ.
Липиды обычно не флуоресцируют. Мембраны часто метят такими зондами, как перилен, 9винилантрацен и 1,6-дифенилгексатриен (DPH). Эти зонды нерастворимы в воде и встраиваются в гидрофобные участки мембран. Незамещенные многоядерные ароматические углеводороды и DPH малочувствительны к полярности растворителя. Их используют в первуюочередь для оценки внутренней вязкости двойных слоев по измерениям поляризации их флуоресценции. Путем целенаправленного изменения химического строения зонды могут быть локализованы на избранных участках мембраны. Одним из таких примеров является триметиламмониевая соль DPH (TMA-DPH). Полагают, что заряженный
атом азота приводит к локализации TMA-DPH в области липидноводной границы мембран. Другие зонды, как, например, PATMAN,
очень чувствительны к фазовому состоянию липидных бислоев. При
температуре перестройки мембран спектр испускания PATMAN сдвигается на 40 нм в длинноволновую область: от 425 до 465 нм. Повидимому, этот зонд реагирует на релаксацию мембраны вокруг диполя возбужденного состояния флуорофора. Были предложены и другие
зонды. Чувствительность к потенциалу мембраны может быть связана
с изменением ориентации зонда или его локальной концентрации в
мембране, а также с влиянием электрического поля на электронное
распределение в зонде. И, наконец, можно выделить зонды, которые
подвергаются реакциям в возбужденном состоянии. В возбужденном
состоянии зонд Р2-С3 может образовывать внутримолекулярный эксимер, и доля образовавшихся эксимеров определяет вязкость в их ближайшем окружении.
При введении этиленового мостика флуоресценция АТР и его производных становится более интенсивной. Такие производные Е-АТР чувствительны к вязкости растворителя, имеют
высокую предельную поляризацию флуоресценции, и времена затухания их флуоресценции близки к 23 нс. Нуклеотидные аналоги активны
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ.
13
во многих реакциях, катализируемых ферментами. Кроме того, были
синтезированы такие аналоги нуклеотидов с вытянутой конформацией,
как лин-бензо-АМР. Эти аналоги флуоресцируют и сохраняют способность к образованию водородных связей немодифицированных нуклеотидов.
Подводя итоги, можно сказать, что флуоресценцией обладают разнообразные молекулы и на спектральные свойства флуорофоров влияет целый ряд факторов и процессов. Как следствие этого, флуоресцентные методы полезны для изучения свойств растворов и биологических макромолекул.
Качественный и количественный флуориметрический
анализ биомолекул
Спектры люминесценции, как и абсорбционные электронные спектры,
используются для качественного и количественного анализа, в структурных исследованиях, для изучения физико–химических свойств
сложных молекулярных систем. Люминесцентные методы анализа обладают высокой чувствительностью, в 1000 раз превышающей чувствительность большинства спектрофотометрических методов. Такая
высокая чувствительность объясняется тем, что свечение молекул
определяют непосредственно, причём его можно усилить или ослабить
путём изменения интенсивности возбуждающего света.
Особенность люминесцентных методов анализа обусловлена двумя
основными факторами. Во-первых, существует относительно небольшое число веществ, обладающих люминесцентной способностью по
сравнению с поглощающими способностями. Во-вторых, в люминесцентном анализе используются две длины волны (возбуждения и испускания), тогда как в спектрофотометрии анализ проводят на одной
длине волны.
К недостаткам люминесцентных методов с точки зрения анализа веществ можно отнести зависимость люминесценции молекул от условий
окружающей среды (температура, рН, вязкость и т.д.). Но этот недостаток делает люминесцентные методы перспективными для исследования физико–химических процессов в конденсированных средах.
Природа
таких
процессов
определяется
из
спектрально–
люминесцентных характеристик молекул – зондов, которые носят
название люминесцентных зондов. Таким образом, люминесцентные
методы служат как для анализа самого вещества обладающего люминесцентной способностью (структурный анализ, качественный и количественный анализ), так и для изучения фотофизических процессов в
конденсированных средах с использованием люминесцентного зонда.
14
Качественный флуориметрический анализ.
Качественный флуориметрический анализ позволяет обнаружить
по спектрам флуоресценции (возбуждения и испускания) присутствие
определённого вещества в анализируемой пробе. Как и в случае абсорбционной спектроскопии, для отождествления измеренного спектра
флуоресценции со спектром какого-либо вещества определяют следующие параметры:
1) количество максимумов в спектре флуоресценции;
2) спектральное положение максимумов ( max ) полос флуоресценции;
3) полуширину полос флуоресценции ( 1/2 ) - разность между двумя
длинами волн, при которых интенсивность флуоресценции составляет
половину от максимальной.
При этом необходимо помнить, что экспериментальные условия, при
которых проводятся люминесцентные измерения, существенным образом влияют на форму спектра флуоресценции. Так, в частности, все
перечисленные выше параметры могут изменяться в зависимости от
рН среды, ее температуры, полярности растворителя, концентрации исследуемого вещества и т.д.
1) Исследование спектров испускания флуоресценции.
По спектрам испускания флуоресценции можно проводить качественный анализ веществ также как и в спектрофотометрическом анализе. При измерениях спектров испускания люминесценции часто облегчается анализ спектров многокомпонентных систем, поскольку не
все поглощающие вещества люминесцируют. Преимуществом флуоресцентного анализа смесей нескольких соединений также является
возможность выделения флуоресценции отдельных компонентов путём изменения длины волны возбуждения флуоресценции. Незначительные изменения состояния вещества: агрегация, комплексообразование, изменение кислотно-основного равновесия и т. д. - обычно
очень сильно сказываются на его люминесцентных свойствах. Поэтому
измерение спектров люминесценции - один из основных методов изучения состояния вещества в биологических системах.
2) Исследование спектров возбуждения флуоресценции.
В связи с тем, что спектр возбуждения люминесценции какоголибо вещества совпадает по форме и положению максимумов со спектром его поглощения, измерение спектра возбуждения люминесценции
позволяет установить характеристики спектра поглощения вещества,
люминесцирующего в данной спектральной области. Это очень важно
для идентификации люминесцирующих веществ. Например, совпадение спектра возбуждения люминесценции разбавленного раствора
триптофана с его спектром поглощения, является лучшим доказательством того, что в данной спектральной области люминесцирует именно триптофан, а не примеси. Совпадение спектра возбуждения люминесценции для разбавленных растворов белка со спектром поглоще15
ния триптофана свидетельствует о том, что из многих аминокислот,
входящих в состав белковых молекул, именно присутствие триптофана
обеспечивает люминесценцию в исследуемой спектральной области.
Количественный флуорометрический анализ.
Между интенсивностью флуоресценции (Iф) вещества и его концентрацией (С) существует следующая зависимость:
Iф = K  кв.  (I0 - I) = I0  K  кв.  (1 - T) = I0  K  кв.  (1 - 10 - D),
(1)
где
I0 и I - интенсивности возбуждающего (падающего) и выходящего из
образца светового пучка соответственно;
кв. - квантовый выход люминесценции;
К - коэффициент, характеризующий чувствительность прибора для измерения люминесценции;
Т - пропускание образца при длине волны возбуждения люминесценции;
D - оптическая плотность образца при длине волны возбуждения люминесценции.
Из уравнения (1) видно, что величина Iф меняется в зависимости от D
по экспоненциальному закону, и, следовательно, в общем случае между Iф и концентрацией вещества нет линейной зависимости, что
осложняет использование измерения Iф для количественного анализа.
Однако при небольших значениях D (D  0.01) в формуле (1) выражение в скобке можно разложить в ряд, и, ограничиваясь линейным членом, получаем равенство:
Iф  2.3  I0  K  кв.  D = 2.3  I0  K  кв.    C  l,
(2)
где
 - коэффициент молярной экстинкции люминесцирующего вещества
при длине волны возбуждения люминесценции;
С - концентрация люминесцирующего вещества;
l - длина оптического пути возбуждающего света
Таким образом, в определённых пределах оптических плотностей Iф
пропорциональна концентрации люминесцирующего вещества (С).
Для определения концентрации вещества по его люминесценции применяют графический метод, основанный на построении калибровочного графика в координатах Iф (C). Для построения калибровочного графика измеряют интенсивность люминесценции серии растворов данного вещества с известной концентрацией. Полученный график должен представлять собой прямую линию, тангенс угла наклона которой
равен:
tg = 2.3  I0  K  кв.    l
16
Измерив Iф исследуемого раствора, можно по калибровочному графику
определить концентрацию вещества.
Существует несколько факторов, осложняющих точное измерение Iф
или её применение для определения концентрации. Главные из них:
«паразитный» («рассеянный») свет, экранировка возбуждающего света
другими молекулами, реабсорбция исследуемыми молекулами или
другими веществами, светорассеяние и неравномерное распределение молекул по объёму, миграция энергии и тушение флуоресценции.
«Паразитный», или «рассеянный» свет, включает в себя излучение источника в спектральной области регистрации флуоресценции, присутствующее в возбуждающем пучке вследствие несовершенства систем
его выделения и попадающее на детектор, люминесценцию кюветы и
растворителя.
Эффект экранировки возбуждающего света – поглощение части возбуждающего света посторонними молекулами, в результате чего
уменьшается количество фотонов, поглощаемых исследуемым веществом, и тем самым снижается Iф.
Если известны значение D исследуемого вещества и общая оптическая плотность (Dоб.) образца при длине волны возбуждения, то
регистрируемую величину интенсивности флуоресценции можно поправить на эффект экранировки:
Iф’ = I0  K  кв.  (1 - 10 - Dоб.)  (D / Dоб.),
(3)
где
Iф’ - интенсивность флуоресценции при наличии экранировки.
Поправочный коэффициент, на который требуется умножить регистрируемую интенсивность флуоресценции вещества в смеси, находится
из соотношения:
э = (Iф / Iф’ ) = ((1 - 10 – D) / (1 – 10 – Dоб.))  (Dоб. / D),
(4)
Реабсорбция заключается во вторичном поглощении квантов флуоресценции. Это явление может быть обусловлено исследуемыми молекулами (собственная реабсорбция) и в этом случае наблюдается
лишь в области перекрывания спектра поглощения со спектром флуоресценции. При наличии собственной реабсорбции коротковолновая
часть регистрируемого спектра флуоресценции будет заниженной, и к
тому же его максимум окажется сдвинутым в длинноволновую область
по сравнению с истинным спектром излучения, если спектр поглощения простирается вплоть до максимума флуоресценции. В многокомпонентных образцах кванты флуоресценции исследуемого вещества
могут поглощаться молекулами других соединений, и это также сопровождается ослаблением свечения. Характер изменений формы спектра флуоресценции, в этом случае, полностью определяется формой
спектра поглощения других веществ. Эффект реабсорбции увеличива17
ется с возрастанием оптической плотности образца в области регистрации флуоресценции.
Также, как и в случае эффекта экранировки, эффект реабсорбции
можно учесть. Если известны значения оптической плотности образца
при длинах волн возбуждения (Dв) и испускания флуоресценции (Dф),
то регистрируемую величину интенсивности флуоресценции можно
поправить на эффект экранировки:
Iф’’ = I0  K  кв.  (1 - 10 – (Dв + Dф) )  (D / (Dв + Dф )),
(5)
где
Iф’’ - интенсивность флуоресценции при наличии реабсорбции.
Поправочный коэффициент, на который требуется умножить регистрируемую интенсивность флуоресценции вещества в смеси, находится
из соотношения:
р = (Iф / Iф’’ ) = ((1 - 10 – D) / (1 – 10 – (Dв + Dф)))  ((Dв + Dф ) / D),
(6)
Особенности измерения флуоресценции биологических объектов.
1. Интенсивность люминесценции биологических объектов часто бывает довольно низкой. Это объясняется малой величиной квантовых
выходов люминесценции, низкой концентрацией люминесцирующих
веществ, экранирующим эффектом других компонентов. Измерение
слабой люминесценции осложнено «паразитной» люминесценцией кювет, оптики, примесей и т.д. Поэтому повышение чувствительности аппаратуры, хорошая фокусировка света, правильный выбор условий
измерения, применение низких температур и тщательный контроль на
флуоресценцию кювет и растворителя, - всё это абсолютно необходимо для того, чтобы преодолеть экспериментальные трудности и уверенно производить люминесценцию биологических объектов.
2. При изучении люминесценции исследуемый образец подвергается
воздействию интенсивного возбуждающего света, что может приводить к значительным изменениям фотохимически активных веществ в
излучающей системе. Чем выше интенсивность возбуждающего света,
тем лучше условия для измерения люминесценции, но зато тем сильнее разрушительное действие возбуждающего света. Выход из этого
противоречия может быть найден при сочетании нескольких приёмов:
уменьшением яркости возбуждающего света на объекте за счёт увеличения площади пятна;
повышением чувствительности приёмника света и светосилы прибора;
увеличением скорости измерений;
понижением температуры.
Объект должен освещаться возбуждающим светом только в самый
момент измерения, а в остальное время возбуждающий свет должен
быть перекрыт специальной шторкой. В тех случаях, когда измерения
18
люминесценции можно производить в одной точке, открывать возбуждающий свет следует только в момент отсчёта.
3. При измерениях люминесценции всегда приходиться считаться с
сильным светорассеянием, свойственным биологическим объектам.
Интенсивность возбуждающего света обычно на несколько порядков
превышает интенсивность люминесценции, поэтому при сильном светорассеянии измерения люминесценции невозможны, даже если незначительная часть возбуждающего света пропускается в спектральной области люминесценции. Поэтому необходимо производить контроль на рассеянный свет, производя измерения с растворителем или
же используя в качестве контроля какой-нибудь сильно рассеивающий,
но не люминесцирующий объект (например, окись магния).
Светорассеяние не только затрудняет измерение люминесценции, но и осложняет анализ спектров вследствие увеличения оптического пути света в рассеивающем образце (как возбуждающего, так и
света флуоресценции). Это приводит к появлению всех эффектов, характерных для объектов с высокой оптической плотностью: к возрастанию интенсивности люминесценции, к увеличению экранирующего
эффекта и к усилению реабсорбции. Основными путями уменьшения
нежелательных эффектов могут быть:
-измерение в тонких слоях и при малых концентрациях;
-выбор оптимальной области возбуждения;
-уменьшение светорассеяния.
При замораживании светорассеяние сильно увеличивается. Поэтому
при охлаждении образца наблюдается скачкообразное увеличение интенсивности люминесценции при температуре замерзания растворителя. Одновременно усиливается проявление всех других эффектов,
связанных со светорассеянием.
4. Неравномерное распределение исследуемых молекул по объёму
приводит к уменьшению оптической плотности (эффект «сита»). По
этой причине неоднородные объекты флуоресцируют слабее однородных даже при условии одинаковой средней концентрации вещества. Исключить влияние этого эффекта иногда удаётся с помощью
соответствующего подбора длин волн возбуждения.
Исследование явления флуоресценции в биологических объектах микробной природы, индуцированного лазерным излучением, позволило
разработать универсальный метод экспресс-диагностики состояния
этих объектов.
19
И с п о л ьз о ва н и е ф л у о р е с ц и р у ющи х бе л ко в в о н ко л о ги и .
Н а и б о л е е м н о г о о б е щ а ю щ и м и н с тр ум е н то м в м о л е к ул я р н о к ле то ч н о й б и о ло г и и с т а ли ц ве тн ы е ф л у о р е с ц и р ую щ и е б е лк и
( f l u o r e s c e n t p r o te i n s - F P ) . С н а ч а л а 9 0 - х г г . , к о г д а б ы ло о т к р ы то ун и к а льн о е с во й с т во г е н е ти ч е с к и х м а р к е р о в к о д и р о ва ть
я р к о о к р а ш е н н ы й ф л уо р е с ц и р ующ и й б е ло к п р и п о м о щ и о д н о г о
г е н а , о к о ло тр е х ты с я ч н а уч н ы х к о л ле к ти во в в с во и х и с с ле д о в а н и я х с та ли и с п о л ьзо ва т ь и х д ля ут о ч н е н и я б и о х и м и ч е с к и х
п р о ц е с с о в , п р о и с х о д я щ и х в о п р е д е ле н н ы х к ле тк а х .
Н а и б о л е е п е р с п е к ти вн а я о б ла с т ь п р и м е н е н и я к ле то ч н ы х
с е н с о р о в н а о с но в е ц в е тн ы х ф луо р е с ц и р ую щ и х б е лк о в - эк с п е р и м е н та л ьн а я о н к о ло г и я . С и н те з т а к и х б е лк о в о п ух о ле вы м и
к ле тк а м и , в к ото р ы е б ы ли в ве д е н ы с о о т ве т с т в ую щ и е г е н ы ,
с та б и ле н в т е ч е н и е н е о г р а н и ч е н н о г о вр е м е н и . И с п о л ь зо ва н и е
F P - м а р к е р о в п оз во ля е т и с с ле д о в а т ь р а з ви ти е п е р ви ч н ы х о п ух о л е вы х уз ло в и м е т а с та зо в в р е ж и м е р е а л ьн о г о вр е м е н и , н е
п р и б е г а я к ум е р щ в л е н и ю ж и во тн ы х . В ы с о к а я ч ув с т ви т е л ьн о с ть
д е те к ти р о ва н и я , о б ус ло вл е н н а я с и л ьн о й ф л уо р е с ц е н ц и е й ц ве т н ы х б е лк о в в ж и вы х о р г а н и з м а х , и х о р о ш е е п р о с тр а н с т ве н н о е
р а зр е ш е н и е и зо б р а ж е н и й д а е т во зм о ж н о с т ь н а б люд а т ь р а н н и й
о т ве т о п ух о ли н а ле к а р с т ве н н ую т е р а п и ю , к о г д а н е то льк о
р а зм е р о п ух о ли , н о п о р о й и е е н а ли ч и е н е во зм о ж н о о п р е д е ли ть
о б ы ч н ы м и м е то д а м и . Пр и п о м ощ и с п е ц и а л ьн ы х г е н е ти ч е с к и х
м а н и п уля ц и й в ж и в ую к л е тк у в во д я т г е н н о - и н ж е н е р н ы е к о н с т р ук ц и и ( п ла зм и д ы ) , п о з во ля ю щ и е с ле д и т ь за т е м , к а к и е м о л е к ул я р н ы е п р о ц е с с ы в н е й п р ои с х о д я т . Од н о вр е м е н н о с и з м е н е н и е м п а р а м е тр о в ( н а п р и м е р , с т а д и и к ле то ч н о г о ц и к л а ) в
к ле т к е н а ч и н а ют с и н те зи р о ва тьс я с п е ц и а л ьн ы е б е л к и , о т ве т с тв е н н ы е за вк лю ч е н и е м е х а н и зм о в а п о п то за ( за п р о г р а м м и р о в а н н о й г и б е ли к л е то к ) . Пр и зн а к о м е г о н а ч а л а с т а н о ви тс я с и н х р о н н ы й с и н те з с п е ц и а л ьн ы х и ф л уо р е с ц и р ующ и х б е л к о в .
М е то д ф л уо р е с це н ц и и п р и м е н я е т с я д л я и с с ле д о в а н и я р а з в и ти я о п ух о ли , м е та с та зи р о ва н и я , а н г и о г е н е за ( р а з ви ти я н о вы х с о с уд о в) и о т ве та н а ле к а р с тв е н н ую т е р а п и ю. Он п о з во л я е т вы я ви ть м н о г о ч и с ле н н ы е м и к р о м е та с та зы в ле г к и х , п е ч е н и ,
п о ч к а х , п ле вр а ль н о й м е м б р а н е , а та к ж е ви з уа ли зи р о ва ть е д и н и ч н ы е ф л уо р е с ц и р ую щ и е к ле тк и , к о то р ы е н е м о г ут б ы т ь д е т е к ти р о ва н ы п р и п о м о щ и с та н д а р тн ы х м е то д и к . П р и н ц и п и а л ьн о е о тли ч и е и н е с о м н е н н о е д о с то и н с т во ф л уо р е с ц е н ц и и - о т с ут с т ви е н е о б х о д и м о с ти д о п о лн и т е л ьн о г о вве д е н и я к о н тр а с т и р ую щ и х а г е н то в, ф е р м е н то в и ли с уб с тр а то в. В и то г е н а д о с т о в е р н о с т ь ви з уа ли за ц и и н е вли я ю т о с о б е н н о с ти р а с п р е д е ле н и я
э ти х а г е н то в в о р г а н и зм е , а т а к ж е о г р а н и ч е н ия , с вя за н н ы е с
во зм о ж н о й то к с и ч н о с ть ю и и х вз а и м о д е й с тви е м с те р а п е в ти ч е 20
с к и м и п р е п а р а та м и .
И з у ч е н и е п р о н и ц а е мо ст и ге ма т оэ н ц е ф а л и ч е с ко го ба р ье р а
С п о м о щ ь ю и зм е р е н и я лю м и н е с ц е н ц и и б ы ла п о д т ве р ж д е н а
г и п о те з а о н а р уш е н и и г е м а то э н ц е ф а ли ч е с к о г о б а р ье р а п о д
д е й с тви е м р а д и а ц и и . По д о п ы тн ы м м ы ш а м в во д и ли в к р о в ь в о д о р а с тво р и м о е в е щ е с т во ф л уо р е с ц е и н , к о то р о е в н о р м е н е
п р о п ус к а ло с ь ч е р е з г е м а то эн ц е ф а ли ч е с к и й б а р ь е р . По с ле о б л уч е н и я ж и во тны х , а н а ли з м о зг о во й тк а н и п о с л е с о о т ве т с т в ую щ е й п р о б о п о дг о то вк и вы я ви л н а ли ч и е в н е й ф л уо р е с ц е и н а .
Бы ли п о с тр о е н ы и за в и с и м о с ти с те п е н и н а р уш е н и я о т д о зы о б л уч е н и я .
И мму н н о ф л у о р е с ц е нт н ый а н а л и з
С о вр е м е н н ы е м е то д ы и м м ун о х и м и и п е р во н а ч а л ьн о б ы ли
о с н о в а н ы г ла вн ы м о б р а зо м н а и зм е р е н и и р а д и о а к ти вн о с ти
и зо то п н о - м е ч е н н ы х а н ти г е н о в и ли а н ти те л. Од н а к о м о ж н о з а м е н и т ь р а д и о а к ти вн ы е и зо то п ы ф л уо р е с ц и р ующ и м и в е щ е с т в а м и , к о то р ы е к о в а ле н тн о «п р и ш и ва ю тс я » к м о ле к ул е а н ти г е н а
и ли а н ти те ла . В а ж н о то л ьк о , ч то б ы вв е д е н и е т а к о й ф л уо р е с ц е н тн о й м е тк и н е п р и ве ло к и з м е н е н и ю и м м ун н ы х с во й с тв
к о м п о н е н то в с и с те м ы . Д о с то и н с тво и м м ун о ф л уо р е с ц е н тн о й
т е х н и к и з а к л юч а е тс я в то м , ч то п р и с о х р а н е н и и д о с т а то ч н о
вы с о к о й ч ув с т ви т е л ьн о с ти н а м н е п р и х о д и тс я п о д в е р г а т ь с е б я
о п а с н о с ти п о л уч е н и я и зве с тн о й д о зы и о н и зи р ующ е й р а д и а ц и и .
Н е кот о р ые д р у ги е п р и м е р ы п р и м е н е н и я л ю ми н е с ц е н ц и и
О с н о вн ы е о б ла с ти п р и м е н е н и я л юм и н е с ц е н ци и м о ж н о
с ум м и р о ва ть в ви д е п е р е ч н я и з 1 1 п ун к то в ( с м . н и ж е ) .
П е р вы е тр и и з н и х о с н о ва н ы н е п о с р е д с т ве н н о н а л ю м и н е с ц е н тн о м а н а ли з е - о п р е д е л е н и и к о н ц е н тр а ц и и лю м и н е с ц и р ую щ и х ве щ е с тв в за ви с и м о с ти о т и н т е н с и вно с ти и зл уч е н и я .
О с та льн ы е м е то д ы о с н о ва н ы н а п р и м е н е н и и с п е ц и а льн ы х
в е щ е с т в - ф л уо р е с ц е н тн ы х м е то к ( х и м и ч е с к и п р и к р е п ле н н ы х
х и м и ч е с к и х г р уп п ) и зо н д о в ( н е с вя за н н ы х ве щ е с тв ,
находящихся в среде).
1 .Ан а ли з к о ли ч е с тв а п р и р о д н ы х с о е д и н е н и й п о и х
ф л уо р е с ц е н ц и и ,
2 .Ан а ли з ве щ е с т в п о о б р а зо в а ни ю и х ф л уо р е с ц и р ую щ и х п р о и зво д н ы х ,
21
3 .И с с ле д о ва н и е п р о н и ц а е м о с ти г е м а то эн ц е ф а ли ч е с к о г о и г и с то г е м а ти ч е с к о г о б а р ье р о в п о ф л уо р е с ц е н ц и и
ф л уо р е с ц е н и н а ,
4 .И м м ун н ы й а н а ли з п р и п о м о щ и ф л уо р е с ц е н тн ы х м е то к , п р и с о е д и н е н н ы х к а н ти г е н у и ли к а н ти те л у,
5 .И с с ле д о ва н и е д о с т уп н о с ти вн утр е н н е й о б л а с ти б е лк о в д ля
к и с ло р о д а п о ф о с ф о р е с ц е н ц и и тр и п то ф а н о вы х о с та тк о в п р и
о б ы ч н ы х те м п е р а т ур а х ,
6 .И з уч е н и е вр а щ а те л ьн о й п о д ви ж н о с ти зо н д о в в н утр и б е лк о в
и ли ли п и д н о й ф а зы м е м б р а н п о п о ля р и за ц и и ф луо р е с ц е н ц и и ,
7 .И з уч е н и е п о с т у п а те л ьн о й д и ф ф уз и и п и р е н а в м е м б р а н а х с
п о м о щ ь ю и зм е р е н и я е г о эк с и м е р и з а ц и и ,
8 .И зм е р е н и е р а с с то я н и я м е ж д у г р уп п а м и с п о м о щ ь ю п е р е н о с а
энергии,
9 .И з уч е н и е б и оп о т е н ц и а ло в, и с п о л ьз уя р а с п р е д е ле н и е за р я ж е н н ы х зо н д о в п о с то р о н а м м е м б р а н ы ,
1 0 . Ф л уо р е с ц е н тн а я м и к р о с к о п ия ( в то м ч и с ле
к о н ф о к а л ьн а я м и к р о с к о п и я ) ,
1 1 . Ф л уо р е с ц е н тн а я эн д о с к о п и я .
М Е Т ОД Ы И С Р Е Д С Т В А
Д И А Г Н ОС ТИ КИ
ЛА З Е РН ОЙ
ФЛ У ОР Е С Ц Е Н ТН ОЙ
С е г о д н я д ля д и а г н о с ти к и и и н д и к а ц и и р а з ли ч н ы х п р о ц е с с о в
м и к р о б н о й п р и р о д ы п р и м е н я ют с я тр а д и ц и о н н ы е м и к р о б и о л о г и ч е с к и е , и м м ун о ло г и ч е с к и е и б и о х и м и ч е с к и е м е то д ы и с с л е д о в а н и я . Фи зи ч е с к и е и ф и зи к о - х и м и ч е с к и е м е то д ы ( х р о м а т о г р а ф и ч е с к и е , м а с с - с п е к тр о м е тр и ч е с к и е и д р . ) д о р о г и , тр е б уют
д о п о лн и те льн ы х р е а г е н то в и и с п о ль з ую тс я в о с н о вн о м в к а ч е с тв е вс п о м о г а те л ьн ы х м е то д ов о г р а н и ч е н н о г о п р и м е н е н и я .
М и к р о б и о ло г и ч е с к и е м е то д ы , п р и то м ч то о н и и н о г д а д о во л ь н о с ло ж н ы и д ор о г и , тр е б ую т , к а к п р а ви ло , е щ е и д ли т е л ьн о г о
вр е м е н и , ч то н е вс е г д а уд о вл е т во р я е т тр е б о ва н и я м к ли н и ц и с то в . В ч а с тн о с ти , и д е н ти ф и к а ц и я а н а эр о б н ы х б а к т е р и й , с о с та вл я ю щ и х д о 4 0 – 7 0 % м и к р о ф л о р ы г н о й н о й р а н ы , ус ло ж н я е т с я в зн а ч и те л ьн о й м е р е д ли те л ьн о с ть ю ( д о 7 – 1 0 д н е й ) и х к ул ьти ви р о в а н и я . К р о м е то г о , и з в с е й с о во к уп н о с ти б а к те р и й в
н а с то я щ е е вр е м я уд а е тс я и д е н ти ф и ц и р о ва т ь н е б о ле е 4 0 – 5 0 %,
о с та льн ы е ж е ви д ы б а к те р и й – н е к ул ь ти ви р уе м ы е . У с уг уб ля е т
п о ло ж е н и е и о тс ут с т ви е ( и ли п р а к ти ч е с к о е о тс ут с т ви е ) в т е р а п е вти ч е с к и х , х и р ур г и ч е с к и х , с то м а то ло г и ч е с к и х , д е р м а то л о 22
г и ч е с к и х и д р уг и х к ли н и к а х м е то д о в и а п п а ра т ур ы д ля а д е к в а тн о й
п а то ло г и ч е с к о м у
процессу
эк с п р е с с - д и а г н о с ти к и .
В с вя зи с э ти м а в то р ы о б р а ти л и с ь к с о зд а н и ю м е то д о в эк с п р е с с - д и а г н о с ти к и п р о ц е с с о в м и к р о б н о й п р и р од ы , в ч а с тн о с ти
г н о й н о - во с п а ли т е льн ы х з а б о ле в а н и й , п и щ е вы х б и о те х н о ло г и й
и эк о ло г и и , н а о с н о ве я вл е н ия ф л уо р е с ц е н ц и и . Это т п о д х о д
п р е д с та вля е т с я п е р с п е к ти вн ы м д ля и н д и к а ц и и м и к р о о р г а н и з м о в, п о с к о л ьк у м н о г и е ве щ е с тва , уч а с тв ую щ и е в м е т а б о ли зм е
м и к р о б н ы х к ле то к , о б ла д а ю т ха р а к те р н ы м и с п е к тр а м и п о г л о щ е н и я и ф л уо р е с ц е н ц и и . Ла зе р н ы й л уч о т и с то ч н и к а и з л уч е н и я
( г е ли й - н е о н о вы й ла зе р с д ли н о й во лн ы 6 3 3 н м ) п о г и б к о м у
с ве то во д у п о д в о д и тс я к и с с ле д уе м о м у о б ъе к ту. П р и вза и м о д е й с тви и ла зе р н о г о и з л уч е н и я д л и н о й во лн ы 6 3 3 н м с б и о л о г и ч е с к о й т к а н ью во зн и к а е т о тр а ж е н н о е о т е е п о в е р х н о с ти и з л уч е н и е и и н д уц и р о ва н н а я л а з е ро м ф л уо р е с ц е н ц и я в д и а п а зо н е
о т 6 3 3 д о 1 0 0 0 н м . Э то вт о р и ч н о е и з л уч е н и е во с п р и н и м а е тс я
п р и е м н ы м и с в е то во д а м и , с о с та в ля ющ и м и е д и н ы й во ло к о н н о о п ти ч е с к и й к а б е л ь с о с ве ти те льн ы м с ве то во д о м , и п о с т уп а е т в
п о ли х р о м а то р . П о с ле п ло с к о й д и ф р а к ц и о н н о й р е ш е тк и с о
с п е к тр а лн ы м р а зр е ш е н и е м 3 н м д и с п е р г и р о в а н н ы й с в е т п о п а д а е т н а м н о г о к а н а л ь н ы й ф о то д е те к то р и з ли н е й к и 1 0 2 4 д и о д о в , о б ла с т ь с п е к тр а льн о й ч ув с т ви т е л ьн о с ти к о то р о г о 3 0 0 –
1 1 0 0 н м . С п о м о щ ь ю с п е ц и а ль н о г о к о м п ью те р а п о л уч е н н ы е
д а н н ы е о б р а б а ты в а ю тс я и о то б р а ж а ю тс я н а е г о м о н и то р е в в и д е с п е к тр а . Пр о ц е с с эк с п р е с с - д и а г н о с ти к и за н и м а е т н е б о ле е
м и н уты . Оп р е д е л е н и е за к о н о м е р н о с т е й ф л уо р е с ц е н ц и и м и к р о о р г а н и зм о в в ч и с ты х и с м е ш а н н ы х к ул ь т ур а х я ви ло с ь эк с п е р и м е н та л ьн о - т е о р е ти ч е с к и м о б о с но в а н и е м к ли н и ч е с к о г о п р и м е н е н и я м е то д а ЛФ Д д ля вы я в ле н и я м и к р о б о в и вы зы ва е м ы х и м и
п р о ц е с с о в , эк с п р е с с - д и а г н о с ти к и г н о й н о - во с п а ли т е л ьн ы х з а б о л е в а н и й р а з ли ч н о й эти о ло г и и и ло к а ли за ц и и , д и с б и о зо в ж е л уд о ч н о - к и ш е ч но г о тр а к та , к а р и е с а , о ц е н к и г и г и е н и ч е с к о г о
с о с то я н и я з уб о в и п о ло с ти р т а .
Х Е М И ЛЮ М И Н Е С Ц Е Н Т Н ЫЕ М Е Т ОД Ы .
Н а с е г о д н я ш н и й д е н ь д ля п р о ве д е н и я и с с ле д о в а н и й в к л и н и ч е с к о й ла б о р а то р и и н е о б х о д и м ы в с е б о л е е и б о ле е ч увс тви те л ь н ы е м е то д ы . Одн и м и з та к и х я в ля е т с я и з м е р е н и е х е м ил юм ин е с це н ци и б и о л о г и ч е с к и х п р об . Ни зк а я и н т е н с и вн о с т ь с о б с т в е н н о й х е м ил юм и не с ц е н ц и и и , к а к с ле д с тв и е н е во з м о ж н о с ть р е г и с тр а ц и и р е з ул ь та то в и з - з а н и зк о й ч ув с т ви т е л ьн о с ти
п р и б о р о в, я в ля ла с ь д о н е д а вн е г о вр е м е н и с а м ы м г ла вн ы м п р е п я т с т ви е м д ля вн е д р е н и я э то г о м е то д а в м а с с о вы е и с с ле д о в а н и я . Од н а к о , п ро во д я щ и е с я в это м н а п р а в ле н и и о п ы ты п о к а з а 23
л и , ч то м е т о д х е м ил юм и не с ц е нц и и и м е е т п р а во н а с ущ е с т в о в а н и е в п р и с ут с т ви и с п е ц и а л ьн ы х х и м и ч е с к и х в е щ е с т в - а к т и ваторов.
Е с ли с о б с т ве н н о е с ве ч е н и е б и о ло г и ч е с к о й п р о б ы я в ля е тс я
о ч е н ь с л а б ы м , то п р и а к ти в а ц и и н е к о то р ы х с о е д и н е н и й о н о
м н о г о к р а тн о ус и ли ва е т с я , и и н т е н с и вн о с ти п о то к а с та н о ви тьс я
д о с т а то ч н о й д ля р е г и с тр а ц и и е е с п о м о щ ью с п е ц и а л ьн ы х ф л уо р и м е тр и ч е с к и х д е те к то р о в . Пр и это м в п р о б е м о г ут п р о и с х о д и т ь п р о ц е с с ы д в ух ти п о в: х и м и ч е с к и е и ли ф и зи ч е с к и е .
Х и м и ч е с к и е а к ти ва то р ы х е м ил ю м и не с ц е н ц и и - это с о е д и н е н и я , вс т уп а ю щ и е в х и м и ч е с к и е р е а к ц и и с а к ти вн ы м и ф о р м а м и
к и с ло р о д а и ли о р г а н и ч е с к и м и с во б о д н ы м и р а д и к а ла м и , в х о д е
к о то р ы х о б р а з ую тс я м о ле к улы , н а х о д я щ и е с я в н е с та б и льн о м
во зб уж д е н н о м эл е к тр о н н о м с о с то я н и и . Пр и п е р е х о д е м о ле к ул
в с во е о б ы ч н о е с о с то я н и е п р о и с х о д и т вы б р о с ф о то н о в и с в е ч е н и е . Хо р о ш о и зве с тн ы е п р е д с та в и те ли т а к и х а к ти ва то р о в э то л юм и н о л ( 3 - а м и н о ф т а л е вы й г и д р а зи д ) и люц и г е н и н - б и с N - м е ти ла к р и д и н и й . По д д е й с тви е м о к и с ли т е л я ( р а д и к а ла г и д р о к с и ла ) п р о и с х о д и т о б р а зо ва н и е р а д и к а ла лю м и н о л а , к о то р ы й
з а т е м вс т уп а е т в р е а к ц и ю с с уп е р о к с и д н ы м р а ди к а ло м , о б р а з у я
в н утр е н н юю п е р е к и с ь ( д и о к с и д ) . Ее р а зло ж е н и е п р и во д и т к
о б р а зо ва н и ю во зб уж д е н н о й м ол е к ул ы 3 - а м и н о ф та ла т а . Пе р е х о д э то й м о л е к ул ы в о с н о вн о е с о с то я н и е с о п р о во ж д а е т с я и с п ус к а н и е м к в а н т а с в е та .
Ф и зи ч е с к и е а к ти ва то р ы н е вс туп а ют в х и м и ч е с к и е р е а к ц и и и
н е в ли я ю т н а х о д р е а к ц и й , с о п р о во ж д а ющ и х с я с ве ч е н и е м , н о ,
т е м н е м е н е е , м н о г о к р а тн о ус и л и в а ю т и н те н с и в н о с т ь х е м ил юм ин е с це нц и и . В о с н о ве и х д е й с тви я л е ж и т ф и зи ч е с к и й п р о ц е с с п е р е н о с а э н е р г и и с м о ле к ул ы п р о д ук т а х е м ил юм и не с ц е нт но й р е а к ц и и н а а к ти в а то р . К ф и зи ч е с к и м а к ти ва то р а м
м о ж н о о тн е с ти н е к о то р ы е лю м и н е с ц и р ую щ и е с о е д и н е н и я ,
п р и м е н я е м ы е п р и ц е п н о м о к и с ле н и и ли п и д о в. В н а с то я щ е е
вр е м я е щ е н е и зуч е н о д о к о н ц а , к а к и е и м е н н о с о е д и н е н и я м о г ут б ы т ь п р и м е н е н ы , и в ла б о р а то р и я х , за н и м а ю щ и х с я п р о в е д е н и е м д а н н о г о в и д а и с с л е д о ва н и й , ве д ут с я р а б о ты п о и х п о и с к у. О к а за ло с ь, ч то н е к о то р ы е к р а с и т е ли и к о м п ле к с ы р е д к о з е м е л ьн ы х э ле м е н то в о б ла д а ю т с п о с о б н о с ть ю м н о г о к р а тн о
ус и ли в а т ь и н т е н с и вн о с т ь та к о й х е м ил юм и не с ц е нц и и . С а м ы м
э ф ф е к ти вн ы м а к ти ва то р о м о к а з а ло с ь п р о и з вод н ы е к ум а р и н а ,
к о то р ы е ус и ли ва ли р е а к ц и ю х е м ил юм и не с це нц и и в 1 5 0 0 р а з.
П РИ М Е РЫ П РИ М Е Н Е Н И Я А К Т И В И Р ОВ А Н Н ОЙ Х Е М И Л Ю МИНЕСЦЕНЦИИ
1 . М е то д о б н а р уж е н и я к а т а ли за то р о в , р а з ла г а ю щ и х п е р о к с и д
во д о р о д а с о б р азо ва н и е м с во б о д н ы х р а д и к а ло в. В м и к р о к о л и 24
ч е с т ва х п е р о к с и д во д о р о д а п р и с ут с т в уе т в о р г а н и з м е ч е ло ве к а
п о с то я н н о и я вл я е тс я н е й тр а л ьн ы м в е щ е с т во м . Но с то и т е м у
то л ьк о вс т уп и т ь в р е а к ц и ю с и о н а м и н е к о то р ы х м е та лло в ( ж е л е за , м е д и , м а р г а н ц а , х р о м а ) , о б р а з уе т с я г и д р о к с и л ьн ы й р а д и к а л , к о то р ы й м о ж е т с п р о во ц и р о в а т ь м ут а ц и и , з а п ус ти т ь п р о ц е с с ы п о д а в ле н и я ф е р м е н т а ти вн о й а к ти вн о с ти и ли р а зр уш е н и я
б и о ло г и ч е с к и х м е м б р а н . Им е н н о п о это м у, о ч е н ь ва ж н о к о н тр о ли р о ва т ь с о д е р ж а н и е м е та лл о в п е р е м е н н о й ва ле н тн о с ти , а
т а к ж е во о б щ е с п о с о б н о с ти б и ол о г и ч е с к о г о м а т е р и а ла р а з л а г а т ь п е р е к и с ь во д о р о д а с о б р а зо в а н и е м р а д и к а л о в . Н а п р и м е р ,
у б о л ьн ы х и н ф а р к то м м и о к а р д а в м о ч е м о ж н о о б н а р уж и т ь н е б о л ьш и е к о ли ч е с тв а г е м о с о д е р ж а щ е г о ве щ е с тва - м и о г ло б и н а ,
к о то р ы й д а е т я р к о е с ве ч е н и е в п р и с ут с т ви и п е р е к и с и во д о р о д а
и л юм и н о ла в с и льн о щ е ло ч н о й с р е д е . Та к и м о б р а зо м , с ве ч е н и е м о ч и в п р и с ут с т ви и л юм и н о л а и п е р е к и с и во д о р о д а м о ж е т
с л уж и т ь о д н и м и з п о к а за т е ле й п р о г р е с с и р ую щ е г о и н ф а р к та
м и о к а р д а . Та к ж е п о р е а к ц и и х е м ил юм и не с ц е нц и и м о ж н о с уд и т ь о б эф ф е к ти вн о с ти ле ч е н и я п о за ж и в ле н и ю р а н . В это м
с л уч а е а н а ли зи р уе т с я ж и д к о с ть , вы д е ля ющ а я с я и з р а н ы , и в ы я с н я е т с я к о ли ч е с тво т о к с и ч н ы х р а д и к а ло в в н е й . С н и ж е н и е с о д е р ж а н и я эти х р а д и к а ло в п о к а зы ва е т п р о ц е с с з а ж и вл е н и я р а ны.
2 . М е то д о б н а р уж е н и я ф а г о ц и то в и и с с ле д о ва н и е з а щ и тн ы х
м е х а н и з м о в к л е то к . Н е к о то р ы е к ле тк и о р г а н и зм а - г р а н ул о ц и т ы и м о н о ц и ты к р о ви и тк а н е вы е м а к р о ф а г и д л я б о р ьб ы с ч уж е р о д н ы м и к л е т к а м и вы д е ля ют , та к н а зы в а е м ы е , а к ти вн ы е
ф о р м ы к и с ло р од а ( с уп е р о к с и д н ы й р а д и к а л - п е р о к с и д во д о р о д а и р а д и к а л г и д р о к с и ла ) . Пр и а к ти в а ц и и это й р е а к ц и и л юм и н о ло м р е г и с тр и р уе т с я с в е ч е н и е б о л ьш о й и н те н с и вн о с ти . У с и л е н и е с ве ч е н и я н а б л юд а е тс я п р и во зн и к н о ве н и и в о р г а н и з м е
о ч а г о в во с п а ле н и я ( н а п р и м е р , п о с ле и н ф а р к та м и о к а р д а и ли у
б о л ьн ы х с е м е йн о й г и п е р х о ле с т е р и н е м и е й ( п р и э то й н а с ле д с т в е н н о й б о ле зн и в к р о ви с о д е р ж и тс я м н о г о х о л е с т е р и н а и
и м е е т с я в ы р а ж е н н а я п р е д р а с п о ло ж е н н о с ть к р а н н е м у р а зви ти ю
а те р о с к ле р о з а ) .
3 . М е то д о п р е д е ле н и я с уп е р м и к р о к о ли ч е с тв г е м о г ло б и н а в
к р о ви . В о с н о ве м е то д а ле ж и т с п о с о б н о с т ь п р о и зво д н ы х г е м о г ло б и н а и н и ц и и р о ва т ь ф о то х и м и ч е с к ую р е а к ц и ю о к и с ле н и я
л ю м и н о ла . Ин те н с и вн о с т ь во зн и к а ющ е й х е м ил ю м и не с ц е н ц ии
о п р е д е ля е тс я с о д е р ж а н и е м г е м ог ло б и н а в п р о б е .
Э то д а ле к о н е п о лн ы й с п и с о к пр и м е р о в, г д е с п о м о щ ь ю х е м и л юм и не с ц е нт ных м е т о до в м ож н о вы я в ля ть р а з ли ч н ы е п а то л о г и и в о р г а н и зм е н а р а н н и х с та д и я х .
25
Схема спектрофлуориметра
26
1