Молекулярная биология Молекулярная биология – это наука о
реклама
Молекулярная биология Молекулярная биология – это наука о механизмах сохранения, воспроизведения, передачи и реализации генетической информации, структуре и функциях нуклеиновых кислот и белков 1. Компоненты нуклеиновых кислот Нуклеиновые кислоты (НК) - это линейные биополимеры (полинуклеотиды), построенные из мононуклеотидов, соединенных фосфодиэфирными связями. В клетках НК существуют в виде нуклеопротеинов - комплексов с белками. 1.История молекулярной биологии. Впервые соединения кислой природы, содержащие азот и фосфор, были выделены швейцарским химиком Фридрихом Мишером (в 1869г.) из ядер клеток гноя хирургических повязок, а позже из спермы лосося. В 1889 г. Рихард Альтман назвал эти вещества нуклеиновыми кислотами. В 1879–1888 г. Альбрехт Коссель нашел в составе НК пиримидиновые, а Эмиль Фишер - пуриновые азотистые основания. Фашель Левин обнаружил в составе НК рибозу и дезоксирибозу, а Джон Гулланд (1947г.) установил наличие водородных связей в молекуле ДНК. Фредерик Гриффит (1926г.) заметил, что внесение убитых патогенных пневмококков в культуру непатогенных превращает непатогенные микроорганизмы в патогенные. Он сделал вывод, что в убитых патогенных пневмококках содержится фактор, который передается непатогенным микробам и делает их способными вызывать пневмонию у мышей (вирулентными). В 1943–1944г. Оствальд Евери доказал, что этим фактором является ДНК. Альфред Херши (1952г.) определил, что именно ДНК является носителем наследственной информации. Установлено, что при заражении клеток E.сoli бактериофагом в клетку попадает лишь ДНК. В 1949–1953 годах Эрвин Чаргафф (родом из Черновиц, Украина) установил соотношение между пуриновыми и пиримидиновыми азотистыми основаниями в НК (правила Чаргаффа). В 1953 р. Уотсон и Крик расшифровали вторичную структуру ДНК, которая представлена двойной спиралью. Эта модель объяснила механизм репликации ДНК. Артур Корнберг (1956г.) открыл фермент ДНК-полимеразу. В 1961–1964 годах Маршалл Ниренберг и другие ученые расшифровали генетический код. Корана (1974г.) синтезировал искусственный ген. Фредерик Сенгер (1980г.) разработал метод определения первичной структуры НК. В 1985г. в Ладыжине Винницкой области начал функционировать завод по производству генно-иженерного интерферона. В 1988 году начались работы по программе «Геном человека». A. Компоненты нуклеиновых кислот. Структурными единицами НК являются мононуклеотиды (нуклеотиды), которые состоят из азотистого основания, углевода и остатка фосфорной кислоты. Поэтапный гидролиз НК ведет к образованию нуклеотидов, которые далее распадаются на фосфорную кислоту и нуклеозид, а последний - на азотистое основание и пентозу. Основная цепь НК состоит из многочисленных звеньев фосфорной кислоты и углевода, а азотистые основания играют роль боковых групп. Азотистые основания являются производными пиримидинового и пуринового гетероциклов. К пиримидиновым АО относятся урацил, тимин и цитозин, а к пуриновым – аденин и гуанин. В НК есть и минорные основания – метилированные или гидроксилированные производные (5-метилцитозин, 5-оксиметилцитозин, 5-оксиметилурацил, 7метилгуанин, и т.д.). Пиримидиновые азотистые основания находятся в двух таутомерных формах - лактимной и лактамной. В состав НК эти основания входят в лактамной форме, в которой атом водорода может замещаться на остаток рибозы или дезоксирибозы. Азотистые основания поглощают свет в УФ части спектра при 230 нм, что используется для количественного определения НК. Некоторые синтетические производные пиримидиновых и пуриновых оснований имеют противоопухолевые и иммунодепрессивные свойства – 5-фторурацил (аналог тимина), 6меркаптопурин (аналог аденина). Они конкурируют с нормальными азотистыми основаниями, нарушают синтез НК и тормозят размножение клеток. Нуклеозиды - содержат азотистое основание и рибозу (β-D-рибофуранозу) или дезоксирибозу (2-дезокси-β-D-рибофуранозу). Атомы в пентозном цикле нумеруются со знаком „штрих”. Нуклеозиды - это N-гликозиды. Они образуются при взаимодействии полуацетального гидроксила пентозы и атомов гидрогена при 1 или 9-ом атоме пиримидинового или пуринового циклов, соответственно. В состав РНК входят рибонуклеозиды - уридин, цитидин, аденозин и гуанозин и многочисленные минорные нуклеозиды. В составе ДНК присутствуют дезоксинуклеозиды - дезоксицитидин, тимидин (тимидин есть только в ДНК, поэтому приставку дезокси- не добавляют), дезоксиаденозин, дезоксигуанозин. Некоторые синтетические аналоги нуклеозидов имеют противоопухолевые и противовирусные ( арабинозид аденина) свойства. Нуклеотиды – это фосфаты нуклеозидов. Остаток фосфорной кислоты присоединен сложноэфирной связью к 5’-атому рибозного или дезоксирибозного цикла, реже к 3’-атому нуклеозида. В зависимости от типа пентозы различают рибонуклеотиды и дезоксирибонуклеотиды. Остаток фосфорной кислоты придает нуклеотидам кислые свойства, и они диссоциируют как двухосновная кислота. Известны также циклические нуклеотиды, в которых фосфорная кислота образует сложноэфирные связи одновременно с 5’ та 3’-атомами карбона рибозного цикла. Это аденозин-3’,5’-циклофосфат (цАМФ) и гуанозин-3’,5’циклофосфат (цГМФ). Эти два нуклеотида не входят в состав НК, но играют роль передатчиков, посредников (мессенджеров) сигналов в клетке, стимулируя переход белков из неактивного состояния в активное, или наоборот. Фосфорилированные производные нуклеозидов: ди - и три - фосфаты нуклеозидов играют важную роль в обмене веществ как коферменты и макроэргические соединения. Это АТФ, АДФ, ГТФ, ГДФ, УТФ, УДФ, ЦТФ, ЦДФ. НуклеоСокращенные названия Названия нуклеотидов тиды Как монофосфатов Как кислот РНК 1.Аденозин-5’Адениловая кислота АМФ монофосфат 2.Гуанозин-5’Гуаниловая кислота ГМФ монофосфат 3.Цитидин-5’Цитидиловая кислота ЦМФ монофосфат 4.Уридин-5’Уридиловая кислота УМФ монофосфат ДНК 1.Дезоксиаденозин-5’-монофосфат Дезоксиадениловая дАМФ кислота 2.Дезоксигуанозин-5’-монофосфат Дезоксигуаниловая дГМФ кислота 3.Дезоксицитидин-5’-монофосфат Дезоксицитидиловая дЦМФ кислота 4.Тимидин-5’-монофосфат Тимидиловая кислота дТМФ Цикличес- Аденозин-3’,5’-циклофосфат Циклоадениловая цАМФ кие нуклекислота отиды Гуанозин-3’,5’-циклофосфат Циклогуаниловая цГМФ кислота Биологические функции нуклеотидов: 1. Структурная - участие в построении НК; 2. Энергетическая -АТФ, АДФ и другие три- и дифосфаты нуклеозидов участвуют в энергетическом обмене; 3.Регуляторная -нуклеотиды аллостерические модуляторы ферментов. Так, АМФ -регулятор гликолиза, АДФ активатор тромбоцитов, цАМФ и цГМФ - вторичные мессенджеры. 4. Биосинтетическая –нуклеотиды выступают в роли активаторов и переносчиков мономеров при синтезе полисахаридов или липидов – УДФглюкоза, ЦДФ-холин и другие; 5.Коферментная – часть нуклеотидов (НАД, НАДФ, ФМН, ФАД, КоА и другие) играют роль кофакторов для многих ферментов. 3. Строение и функции нуклеиновых кислот. НК делят на 2 класса – дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоты (РНК). Между ДНК и РНК есть отличия: 1. В состав РНК входят азотистые основания урацил, цитозин, аденин, гуанин, а в ДНК вместо урацила - тимин. 2.Углеводным компонентом РНК является рибоза, а ДНК – дезоксирибоза. 3. ДНК образует двойную цепь, а РНК в основном одинарную. Цепь НК – это последовательность нуклеотидов, связанных сложноэфирными связями между 5’-атомом карбона пентозы одного нуклеотида и 3’-атомом карбона пентозы другого нуклеотида. На рисунке показан фрагмент цепи РНК Началом полинуклеотидной цепи считают 5’-атом карбона первого, а концом - 3’-атом карбона последнего нуклеотида. Цепь - полярна и имеет направление 5’> 3’. В НК 5’конец пентозы первого нуклеотида содержит фосфатную, а 3’-конец пентозы последнего – свободную гидроксильную группу. Цепь ДНК построена аналогично цепи РНК и отличается только типом нуклеотидов. Для записи цепей ДНК и РНК используют первые буквы названий нуклеотидов (А, Г, Ц, Т, У). Буквой Ф (или английской Р) отмечают 5’-начало, а символом 3’-ОН – конец цепи. Функции ДНК: 1. Сохранение наследственной информации. Количество ДНК в соматических и половых клетках является постоянной величиной для данного вида организмов и воспроизводится в поколениях. ДНК содержит не только информацию о структуре всех белков и РНК в организме, но и порядок реализации этой информации в процессе онтогенеза и при различных функциональных состояниях. Все соматические клетки организма несмотря на сильные структурные и функциональные отличия между клетками, содержат в своих ДНК одну и ту же генетическую информацию. 2. Передача наследственной информации потомкам. Удвоение молекул ДНК при репликации и передача потомкам копий материнской ДНК является основой сохранения основных биологических признаков вида. При репликации материнская ДНК служит матрицей для синтеза ДНК дочерней клетки. 3. Реализация генетической информации. Эта функция реализуется за счет передачи закодированной в ДНК информации на молекулы белков, которые выполняют необходимые для жизни клетки операции. В этом случае ДНК является матрицей для синтеза РНК, а РНК – матрицей при синтезе белков (центральная догма молекулярной биологии). Первичная структура ДНК. Первичная структура - это последовательность нуклеотидов в цепи ДНК. Длина цепи ДНК варьирует в зависимости от биологического объекта. Наименьшую молекулярную массу имеют ДНК вирусов и прокариот, а ДНК эукариот значительно большую. Так все 46 молекул ДНК человека содержат 3,3 миллиарда нуклеотидов и имеют общую длину 1,9 м. ДНК в клетках прокариот находится в цитоплазме и часто имеет форму замкнутого кольца, а у эукариот ДНК находится в ядре в форме хроматина в интерфазе, а в период подготовки клетки к делению - в форме хромосом. Особенности строения цепи ДНК: 1.Повторы отдельных нуклеотидных последовательностей (их бывает от 10 до 104 на ДНК). Такие повторы есть одновременно на обоих цепях ДНК. Чаще всего бывают такие повторы: 5’-ЦТТЦГАЦТТЦГА-3’ - цепь ДНК 3’-ГААГЦТГААГЦТ-5’ - антипараллельная цепь 2.Перерывание повторяющихся последовательностей Например – ЦТТЦГААТГЦАЦТТЦГА 3.Палиндромы - повторы последовательностей нуклеотидов на обоих цепях, которые читаются одинаково слева направо и справа налево (если их читать в направлении 5'>3' ). 5’- ЦТТЦГАТЦГААГ.....ЦТТЦГАТЦГААГ-3’ 3’- ГААГЦТАГЦТТЦ.....ГААГЦТАГЦТТЦ-5’ Вторичная структура ДНК отображает пространственную организацию ее цепи. Молекула ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепей, закрученных вправо с образованием двойной спирали диаметром до 2 нм. Эти цепи антипараллельны друг другу: в одной цепи направление соединения нуклеотидов определяется как 5’> 3’, а в другом как 3’ > 5’. Две цепи ДНК являются комплементарными (дополняющими), поскольку между азотистыми основаниями цепей образуются поперечные водородные связи. Существуют комплементарные пары – аденин-тимин (2 водородные связи) и гуанин-цитозин (3 связи). Площади, которые занимают пары комплементарных оснований, приблизительно одинаковы. Этим объясняется постоянный диаметр спирали. Причиной комплементарности оснований является совпадение углов, по которым основания присоединяются к пентозофосфатным остаткам ДНК. Это обеспечивает максимальное сближение между собой пар – аденин-тимин и гуанин – цитозин. Комплементарность оснований открыл Чаргафф, который сформулировал такие правила: 1. Количество пуриновых оснований равно количеству пиримидиновых (А + Г = Ц + Т) 2. Количество аденина равно количеству тимина, а гуанину - цитозина (А = Т; Г = Ц). У ДНК разных видов соотношения между аденином и гуанином, цитозином и тимином является неодинаковым и видоспецифическим и является таксономическим признаком. Существует несколько форм правозакрученной двойной спирали ДНК. В клетке ДНК чаще всего находится в В-форме, в которой на один виток спирали приходится до 10 пар нуклеотидов. Диаметр спирали 2 нм, причем пуриновый нуклеотид имеет размер 1,2 нм, а пиримидиновый - 0,8 нм. В А-форме на 1 виток приходится 11 пар нуклеотидов, а в С-форме – 9,3 пар нуклеотидов. Внутреннюю пустоту в спирали ДНК занимают гидрофобные азотистые основания. Эта часть ДНК является неполярной областью, тогда как внешняя сторона полярной и заряженной отрицательно за счет остатков углеводов и фосфатных групп. Цепи ДНК образуют 2 желоба - малую и большую борозды. Считается, что в А-форме ДНК принимает участие в процессах транскрипции, а в В-форме – в процессах репликации. Кроме правозакрученной спирали существует одна левая спираль ДНК - (Z -форма), в которой на один виток приходится 12 пар нуклеотидов. Двойная спираль характерна для большинства молекул ДНК, однако некоторые вирусы содержат одноцепную или кольцевую молекулу ДНК В функциональном отношении цепи ДНК не эквивалентны. Кодирующей цепью (матричной, смысловой) является та, которая считывается в процессе транскрипции и служит матрицей для PHK. Некодирующая цепь (антисмысловая) подобна РНК (при условии замены T на У). Структуру гена обычно подают в виде последовательности некодирующей цепи ДНК в направлении 5'>3'. Если прочитать кодоны в этом направлении, то посредством генетического кода можно воспроизвести аминокислотную последовательность белка от N- к С-концу. Третичная структура ДНК. В клетках ДНК образует суперспирали, что обеспечивает компактность ее упаковки. ДНК длиной до 4 см располагается в хромосоме размером до 5 нм. Длина ДНК уменьшается в 100 тысяч раз. Третичная структура ДНК эукариот формируется путем взаимодействия с ядерными белками и на определенном этапе клеточного цикла приобретает форму хромосом. Физико-химические свойства ДНК. Благодаря наличию фосфатных групп молекулы ДНК и РНК имеют кислотные свойства. Они полианионы, поскольку несут отрицательные заряды. НК легко образуют комплексы с катионами Са2+, Mg2+, Zn2+ и др, с основными белками (гистоны, протамины. Растворы ДНК имеют высокую вязкость, величина которой зависит от конформации молекул. Денатурация ДНК – это нарушение двуспиральной структуры молекул ДНК в результате разрыва водородных связей между комплементарными парами оснований. Это происходит при резких изменениях рН, при нагревании. Термическая денатурация ДНК, которая приводит к расплетанию двойной спирали ДНК без разрушения ее цепей, называется плавлением. Точка плавления зависит от соотношения пар А-Т и Г-Ц. Она тем выше, чем больше в ДНК пар Г-Ц, так как на разрыв трех водородных связей нужно больше энергии, чем на разрыв двух в паре А-Т. Строение, свойства и функции РНК. Молекулы РНК - это линейные полинуклеотидные цепи из нуклеотидов, соединенных между собой 5’, 3‘фосфодиэфирными связями. Цепи полярны, то есть у них есть 5’- и 3‘-концы. Особенности первичной структуры РНК: 1) В состав РНК входят рибонуклеотиды (углевод рибоза); 2) вместо тимина входит урацил; 3) РНК содержит больше минорных оснований, чем ДНК; 4) Цепь РНК значительно короче цепи ДНК. Общее количество нуклеотидов РНК может варьировать от сотен до тысяч единиц. Особенностью вторичной структуры РНК является то, что она представлена одной цепью, и только некоторые вирусы имеют короткую двухцепочечную РНК. У комплементарных оснований РНК меньшая способность взаимодействия между собой, чем у оснований ДНК. Преимущественно одноцепочечное строение РНК имеет свой биологический смысл: свои функции РНК выполняет лишь в одноцепном состоянии. Тяжело представить, как могла бы произойти трансляция двуцепочечной мРНК в рибосомах. Однако вторичная структура РНК характеризуется наличием отдельных участков, имеющих вид двойной спирали. Это петли или „булавки”, которые насчитывают 20-30 нуклеотидов и образуются за счет изгибов цепи и взаимодействия комплементарных оснований в пределах одной цепи. Эта структура стабилизируется комплементарными парами А-У и Г-Ц и частично „неправильными” парами типа Г-У. Функции РНК: 1. Генетическая репликативная функция – сохранение наследственной информации вирусов и фагов в виде РНК и ее копирования (репликации). Здесь функция РНК и ДНК является аналогичной. Эта функция реализуется лишь в инфицированных вирусом клетках, поскольку в нормальных РНК синтезируется на матрице ДНК. В одних случаях на вирусной РНК, как на матрице, синтезируется ДНК (обратная транскрипция), а в других на вирусной РНК, как на матрице, синтезируется комплементарная цепь. То есть у вирусов реализуется способность РНК воспроизводить собственную структуру, как это присуще ДНК. 2.Кодирующая функция – в последовательностях (триплетах) РНК записана информация об аминокислотной последовательности белков (аналогично ДНК). Эта функция реализуется мРНК, которая переносит информацию от ДНК к белку. 3.Структурирующая функция – формирование трехмерных структур при взаимодействии с белками. Эта функция реализуется рибосомальными РНК. 4.Транспортная функция - участие в процессе трансляции через доставку аминокислот в рибосомы специфическими транспортными РНК 5. Каталитическая функция - специфический катализ химических реакций ферментами-рибозимами (эта функция РНК является аналогичной функции белков-ферментов). Рибосома фактически рибозим, поскольку синтез пептидной цепи катализируется рибосомальной РНК, а не белками. Идентифицирован каталитический участок большой рибосомальной РНК, который отвечает за транспептидацию - реакцию наращивания пептидной цепи. 6. Функция распознавания – молекулы РНК способны вступать во взаимодействия с другими макромолекулами – белками, другими РНК, низкомолекулярными лигандами. Например, тРНК специфически распознают отдельные аминокислоты. Характеристика отдельных видов РНК РНК в зависимости от функций делят на геномные, информационные, транспортные, рибосомальные, малые РНК и другие. Виды РНК Размер в Функция нуклеотидах 1 Геномные РНК 10000-100000 Несут наследственную информацию некоторых (гРНК) вирусов 2 Информационные, Является матрицами для синтеза белков или матричные РНК 100-100000 (иРНК или мРНК) 3 Транспортные РНК Поставляют аминокислоты для процесса 70-90 (тРНК) трансляции белков 4 Рибосомальные РНК Несколько Является строительными блоками рибосом (рРНК) классов с размерами от 100 до 500000 5 Малые РНК Принимают участие в упаковке 100 – 300 рибопротеиновых частиц, сплайсинге, и т.д. Информационные (матричные) РНК (2-5% РНК клетки). Существует множество различных мРНК, в каждой из которых содержится информация о составе соответствующей полипептидной цепи. мРНК свойственна нестабильность и гетерогенность в размерах молекул. По своему нуклеотидному составу мРНК комплементарна определенным участкам последовательности ДНК. В молекуле мРНК имеется несколько определенных участков: 1. 5’-конец всех мРНК имеет название „кеп” и содержит от одного до 4-х модифицированных нуклеотидов, которые защищают 5’-конец мРНК от действия экзонуклеаз. Первый из них 7-метилгуанозин, который через трифосфатную связь соединяется с 5’-гидроксилом рибозы следующего (второго) нуклеотида. Этот нуклеотид имеет метилированную по 2’-гидроксилу рибозу и может повторяться. Например:7-метилгуанозин-Ф-Ф-Ф-2’-метил-рибоза-урацил-Ф-2’метил-рибоза-цитозин-Ф2.За “кепом” идет 5’-нетранслированный участок из нескольких десятков нуклеотидов, комплементарный одному из участков рРНК в малой субъединице рибосомы. Благодаря этой нетранслируемой последовательности мРНК связывается с рибосомальной РНК. 3. Трансляция (считывание) мРНК всегда происходит от инициирующего кодона, который во всех мРНК является одинаковым и имеет последовательность АУГ (кодирует метионин). 4. За инициирующим кодоном идет кодирующая часть, которая и содержит информацию о последовательности аминокислот в полипептидной цепи. В зрелой мРНК последовательности являются непрерывными, не содержат интроны, и читаются в направлении 5’> 3’. У эукариот зрелые мРНК моноцистронны – то есть каждая мРНК несет информацию о структуре только одной полипептидной цепи (что не исключает в дальнейшем разрезания этой цепи на более мелкие части). У прокариот мРНК полицистронна, и на рибосомах могут одновременно синтезироваться разные полипептидные цепи. 5. По окончании кодирующей части мРНК находится кодон терминации (один из трех бессмысленных триплетов УАА, УАГ и УГА) 6. За кодоном терминации идет 3’-нетранслирующий участок, который по размерам больше, чем 5’-нетранслирующий участок. 7. На 3’-конце почти все зрелые мРНК эукариот содержат длинные полиаденилатные последовательности - поли(А) - фрагмент, из 20-250 нуклеотидов. 3’-нетранслирующий участок и полиаденилатные последовательности являются объектом атаки 3’-экзонуклеаз, которые разрушают мРНК. Существует мысль, что поли(А)-фрагмент является подобным по функции теломерам ДНК. После того, как дежурная рибосома завершает трансляцию мРНК, от этого фрагмента отщепляются 10-15 нуклеотидов, идет разрушение кодирующей части мРНК и прекращение трансляции. В клетках молекулы мРНК связаны с белками (информосомы), которые защищают ее от преждевременного разрушения. Транспортные РНК – (10-20% всей РНК) насчитывают несколько десятков (1- 6 на каждую аминокислоту). Виды тРНК, способные связывать одну и ту же аминокислоту, называют изоакцепторными. Специфичность тРНК отражается верхним индексом, например тРНКала Число нуклеотидов в тРНК до 100. 1.тРНК содержат много (до 10%) минорных нуклеозидов: дигидроуридин и псевдоуридин, метилинозин, метилгуанозин и диметилгуанозин, метилуридин. 2. Благодаря образованию булавок вторичная структура тРНК имеет конформацию листка клевера и такие участки: - акцепторную ветвь – 3’-конец содержит концевой аденозин, который через 3’-гидроксильную группу рибозы связывает аминокислоту; - антикодоновую петлю – участок, содержащий триплет нуклеотидов (антикодон), который отвечает за взаимодействие тРНК с комплементарным триплетом мРНК; - дигидроуридиловую и псевдоуридиловую петли и дополнительную ветви, которые необходимы для взаимодействия тРНК с рибосомой и создания функционально активной конформации молекулы тРНК (псевдоуридин обозначается также символом ψ). Связывание тРНК „своей” аминокислоты происходит при участии специфических аминоацил-тРНК-синтаз, которых насчитывается 20 видов. Эти ферменты имеют сайты распознавания аминокислоты и соответствующих этой аминокислоте тРНК. Фермент катализирует активацию аминокислоты и образование связи между аминокислотой и соответствующей тРНК с образованием аминоацил-тРНК. Фермент - высокоточный, в случае присоединения к тРНК чужой аминокислоты, реакционный центр гидролитическим путем удаляет «неправильную» аминокислоту. Взаимодействие тРНК с кодоном мРНК осуществляется по принципам комплементарности и антипараллельности (кодон в мРНК читается в направлении 5’> 3’, а антикодон в тРНК - в направлении 3’> 5’). Рибосомальные РНК (до 80-90% всей РНК) являются структурным элементом рибосом. рРНК, как и субъединицы рибосом, различают по константе седиментации. Малая суъединица рибосом содержит 1 молекулу рРНК и около 30 молекул разных белков. Большая субъединица - 3 разных рРНК и 45 белков. В рРНК больше Г и Ц, чем в других видах РНК, есть нуклеотидов (1%), метилированные по рибозе; во вторичной структуре рРНК встречается относительно много двухцепочечных участков и петель. Малые РНК – это небольшие молекулы, которые содержат лишь десятки или сотни нуклеотидов. Они присутствуют в цитоплазме, митохондриях, ядре, ядрышке, но их функция пока неизвестна. Некоторые малые ядерные РНК (мяРНК) участвуют в процесинге и сплайсинге РНК, в транспорте синтезированных белков через мембраны. В активный центр фермента теломеразы входит малая РНК (450 нуклеотидов). Роль других мяРНК становится понятной лишь в последние годы. Оказалось, что введение в организм червяка Caenorhabditis elegans дополнительных копий генов в виде ДНК вызывает не усиление работы этих генов, а, напротив, полностью исключает их функцию, с одновременным появлением большого количества малых РНК - копий отдельных участков генов, которые вводились в клетку. Оказалось, что введение различным организмам малых РНК, которые являются копиями определенных участков отдельных генов, также блокирует работу этих генов. Эффект гашения генов получил название РНКинтерференции, а малые РНК названы – малыми интерферирующими РНК (siRNA small interfering RNA). siРНК связывается с хеликазою и нуклеазой, а затем с комплементарным участком мРНК, и это вызывает раскручивание мРНК и ее гидролиз РНК-азой. То есть siРНК в клетке блокируют работу генов, участок которых отвечает одной из цепей siРНК. На растениях и насекомых доказано, что при попадании РНК-вирусов в клетку, siРНК, которые имеют последовательности, комплементарные участкам РНК вирусов, вызывают уничтожение РНК вирусов, а в случае ДНК-вирусов, siРНК блокируют продукцию вирусных белков, уничтожая соответствующие этим белкам мРНК. Возможно роль малых РНК заключается в исключении из генома нежелательных элементов. Возможны перспективы торможения работы генов, вызывающих заболевание. Например, в культуре клеток некоторые малые РНК подавляют роботу генов, отвечающих за синтез S-гемоглобина при серповидно-клеточной анемии. Гетерогенные ядерные РНК (гяРНК) - это продукты транскрипции генов в ядрах, которые образовались действием РНК-полимеразы ІІ и не прошли посттранскрипционный процессинг. Они отличаются большой вариабельностью размеров молекул. Затем они модифицируются по 5'- и 3'-концам и становятся отличными от РНК, синтезированных другими РНК-полимеразами. Считают, что они служат сигналами для начала трансляции мРНК в белки. Молекулярная организация ядерного хроматина и рибосом эукариотичных клеток. Ядро - наибольшая органелла клетки, окруженная двойной мембраной с порами, которые обеспечивают как выход в цитоплазму мРНК и других компонентов, так и поступление в ядро рибосомных белков, нуклеотидов, регуляторов и т.д. Содержимое ядра (нуклеоплазма) содержит хроматин и ядрышко. Хроматин окрашивается определенными красителями и содержит ДНК, связанную с гистонами и небольшим количеством кислых негистоновых белков и РНК. Хроматин ядра на электронных фотографиях напоминает нить ожерелья с отдельными бусинками (нуклеосомы). При делении хроматин конденсируется, приобретая форму хромосом. В интерфазном ядре хромосомы незаметны, а воспринимаются как хроматин. Часть хроматина (гетерохроматин) плотная, хорошо окрашивается и функционально неактивна. Другая часть (эухроматин), имеет рыхлую форму, и в ней происходят процессы считывания информации. Ядрышко – это структура, в которой происходит синтез рибосомной РНК. Содержит много ДНК и РНК и особенный участок, имеющий большое число копий генов, которые кодируют рРНК. В ядрышке начинается сбор рибосом, который завершается в цитоплазме. В ядре диплоидной клетки человека существует 46 хромосом (22 пары аутосом и 2 половые хромосомы). В постмитотический период каждая хромосома содержит одну молекулу ДНК, во время деления число молекул ДНК удваивается. До 60-80% белков хроматина составляют гистоны, остальную часть негистоновые белки. Гистоны содержат много аргинина и лизина и гидрофобных аминокислот (валина и др.). Благодаря основным группам аргинина и лизина гистоны взаимодействуют с отрицательно заряженными группами ДНК, а благодаря гидрофобным аминокислотами - между собой. Комплекс ДНК и белков называется нуклеосомой. Нуклеосома- это октамер из 8 белковых молекул (по 2 молекулы гистонов – Н2А, Н2В, Н3 и Н4), вокруг которого молекула ДНК делает 2 оборота, общей длиной 140 нуклеотидных пар. Участки ДНК вокруг гистоновых октамеров называются коревыми (core-DNA). Нуклеосомы разделяются линкерными (соединительными) участками. С каждым таким участком связана 1 молекула гистона 1 (Н1). В каждой из 46 молекул ДНК содержится около 600 тысяч нуклеосом. В хромосомах ДНК закручивается в спираль типа соленоида и образует петли, что делает упаковку ДНК очень компактной. В хромосомах различают: а) центромеру (первичную перетяжку); б) плечи (части хросомом по обеим сторонам от центромеры); в) теломеры (концевые участки плеч хромосом). Негистоновых белков несколько сотен. Некоторые из них играют структурную роль, а большинство является ферментами и факторами репликации, транскрипции и репарации ДНК. Рибосомы - рибонуклеопротеиновые комплексы, при участии которых происходят синтез белков. Рибосомы состоят из 2 субъединиц – малой и большой. 4. Биосинтез нуклеотидов. Существуют 2 пути синтеза нуклеотидов в клетке. В-первых - путь повторного использования (реутилизации) азотистых оснований и нуклеозидов как экзогенных (которые всосались в кишечнике), так и тех, что образовались в клетке в процессе репарации ДНК или при распаде отработанных РНК. Во-вторых – это синтез нуклеотидов de novo из низкомолекулярных предшественников (этот путь главный и обеспечивает 80-90% общего фонда нуклеотидов в клетке). 4.1. Повторное использование нуклеозидов и азотистых оснований включает: 1. Синтез нуклеотидов на основе нуклеозидов включает а) фосфорилирование нуклеозидов в мононуклеотиды нуклеозидкиназами; б) фосфорилирование мононуклеотидов до нуклеозиддифосфатов и нуклеозидтрифосфатов, соответствующими нуклеозидмоно- и нуклеозиддифосфокиназами. 2. Синтез нуклеотидов из готовых азотистых оснований проходит через образование активной формы рибозо-5-фосфата (фосфорибозилпирофосфата), который затем взаимодействует с азотистым основанием с образованием мононуклеотида. Так синтезируется ГМФ и АМФ, а гипоксантин превращается в инозинмонофосфат (ИМФ). Образованные мононуклеотиды далее фосфорилируются до нуклеозидди- и нуклеозидтрифосфатов. Запасные пути синтеза нуклеотидов в наибольшей мере представлены в тканях, которые интенсивно размножаются (эмбриональных, эпителиальных, регенерирующих, опухолевых). Наличие таких путей позволяет использовать синтетические аналоги пуринов и пиримидинов (5-фторурацил, меркаптопурин) для химиотерапии опухолей. Эти препараты встраиваются в молекулу ДНК и прекращают репликацию. Некоторые аналоги нуклеотидов тормозят репликацию вирусов (ацикловир, азидотимидин и другие). 4.2. Биосинтез пуринових нуклеотидов de novo. Источники атомов пуринового ядра: глутамин, глицин, аспартат, формильные и метенильные группы, СО2. Синтез пуринових нуклеотидов 1. начинается с образования активной формы рибозо-5-фосфата – фосфорибозилдифосфата (ФРПФ). К нему при участии фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы присоединяется аминогруппа глутамина с образованием фосфорибозиламина. 2. Затем образуется инозинмо-нофосфат (ключевой метаболит). К фосфорибозиламину присоединяется глицин, а затем пуриновое ядро наращивается за счет глутамина, аспартата, СО2, метенил- и формилтетрагидрофолата. Инозинмонофосфат служит источником синтеза других пуринових нуклеотидов. В частности АМФ образуется при замещении кетогруппы на аминогруппу аспарагиновой кислоты (через аденилосукцинат). Синтез ГМФ происходит при окислении пуринового ядра до ксантозин-5’-монофосфата и замещении образованной кетогруппы на аминогруппу глутамина. 3. Превращение АМФ иГМФ на ди- и трифосфаты (АДФ, ГДФ, АТФ, ГТФ) идет за счет энергии АТФ и ферментов нуклеозидмоно- и нуклеозиддифосфокиназ Синтез ГДФ и ГТФ: а) ГМФ + АТФ = ГДФ + АДФ (нуклеозидмонофосфокиназа; б) ГДФ + АТФ = ГТФ + АДФ (нуклеозиддифосфокиназа) Синтез АДФ и АТФ: а) АМФ + АТФ = АДФ + АДФ (аденилаткиназа); б) АДФ + Фн = АТФ (окислительное или субстратное фосфорилирование) Регуляция синтеза пуринових нуклеотидов: 1 Главный пункт регуляции синтеза пуринов - это образование фосфорибозиламина, катализируемое аллостерическим ферментом фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазой. Фермент тормозится по принципу обратной связи ИМФ, АТФ и ГТФ. 2. Дополнительными путями регуляции является торможение АТФ и ГТФ синтеза фосфорибозилпирофосфата, а также ингибирование АМФ реакции превращения ИМФ в аденилосукцинат и ГМФ реакции превращения ИМФ в ксантозин-5-монофосфат. 4.3. Биосинтез пиримидинових нуклеотидов de novo. Источниками атомов пиримидинового ядра являются аммиак (глутамин), диоксид углерода (СО2) и аспарагиновая кислота. Процесс начинается с образования карбамоилфосфата, а источником аммиака является амидная группа глутамина. Реакция протекает в цитозоле и катализируется карбамоилфосфатсинтазой. Глутамин + СО2 + 2АТФ = Карбамоилфосфат + Глутамат + 2АДФ + Фн. Карбамоилфосфат при участии аспартаткарбамоилтрансферазы взаимодействует с аспартатом с образованием карбамоиласпартата, который затем дегидрируется в дигидрооротовую, а затем и в оротовую кислоту. Последняя, взаимодействуя с фосфорибозилпирофосфатом, дает оротидин-5’-монофосфат, который декарбоксилируется до уридин-5’-монофосфата (УМФ). Из уридин-5’-монофосфат (ключевой метаболит) синтезируются другие нуклеотиды: УТФ, ЦТФ, дЦТФ и ТТФ. Образование УДФ и УТФ происходит путем последовательного фосфорилирования УМФ нуклеозидфосфокиназами), а ЦТФ путем аминирования УТФ (донор аминогруппы глутамин): дГДФ, дЦДФ при участии АТФ и нуклеотиддифосфокиназ превращаются в дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, которые используются для синтеза ДНК. Особый путь синтеза тимидиловых нуклеотидов начинается дефосфорилированием дУДФ в дУМФ. Последний тимидилатсинтазой с участием метилентетрагидрофолата метилируется в дТМФ. дТМФ фосфорилируется АТФ в дТДФ и дТТФ. При превращении дУМФ в дТМФ расходуется метилентетрагидрофолат, который окисляется в дигидрофолат. Регенерация дигидрофолата в тетрагидрофолат обеспечивается дигидрофолатредуктазой, тетрагидрофолат может акцептировать одноуглеродную группу серина или глицина и превращаться в метилентетрагидрофолат. Регуляция синтеза пиримидинових нуклеотидов осуществляется на уровне карбамоилфосфатсинтазы и аспартаткарбамоилтрансферазы. Избыток пиримидиновых нуклеотидов тормозит эти ферменты, а избыток пуринових, напротив, активирует. При наследственном заболевании оротатацидурии нарушается превращение ОМФ (оротидин-5’-монофосфат) в УМФ. Заболевание проявляется анемией в результате нарушения синтеза ДНК и размножения клеток. Противоопухолевые препараты. Синтез дезоксирибонуклеотидов, необходимых для репликации ДНК, осуществляется лишь перед делением клетки, поэтому препараты, которые его блокируют, способны тормозить деление клеток злокачественных опухолей. Например, метотрексат, который по структуре похож является конкурентным ингибитором на фолиевую кислоту, дигидрофолатредуктазы и нарушает синтез дТМФ. 5-фторурацил - структурный аналог дУМФ блокирует действие тимидилатсинтазы и тормозит синтез дТМФ. 5. Гидролиз нуклеопротеинов в пищеварительном тракте. В желудке под действием пепсина и соляной кислоты нуклеопротеины распадаются до нуклеиновых кислот и белков (последние гидролизируются на аминокислоты). ДНК и РНК распадаются в 12-палой кишке под действием панкреатических ДНКазы и РНК-азы на мононуклеотиды, которые дефосфорилируются кишечными нуклеотидазами до нуклеозидов. Последние нуклеозидазами расщепляются на рибозу или дезоксирибозу и азотистые основания. Образовавшиеся продукты всасываются слизистой тонкой кишки (активный транспорт). 6. Катаболизм пуриновых нуклеотидов в тканях. Расщепление АМФ и ГМФ идет аналогичными путями, хотя они чем-то и отличаются. Реакции катаболизма: 1) катализирование 5’-нуклеотидазой отщепления фосфатной группы с образованием нуклеозидов аденозина и гуанозина; 2) дезаминирование аденозина (аденозиндезаминаза) и гуанозина (гуанозиндезаминаза), или дезаминирование гуанина и аденина (гуаниндезаминаза и аденозиндезаминаза); 3) отщепление от нуклеотидов рибозофосфатного или дезоксирибозофосфатного остатков (фосфорилазы пуриновых нуклеозидов), или остатков углеводов от нуклеозидов (нуклеозидазы); 4) окисление образовавшихся продуктов (гипоксантина и ксантина) до мочевой кислоты при участии ксантиноксидазы с использованием кислорода (при этом образуется пероксид водорода). Конечным продуктом распада пуринов является мочевая кислота. Мочевая кислота проявляет антиоксидант-ные свойства и усиливает действие адреналина и норадреналина, тормозя активность фосфодиэстеразы (стимулятор мозга). Нормальный уровень мочевой кислоты в сыворотке крови людей находится в пределах 30-70 мг/л, а за сутки с мочой выводится 0.4 - 0.6 г мочевой кислоты. Усиленное образование мочевой кислоты (при аномально высокой активности ФРПФсинтазы) приводит к увеличению уровня мочевой кислоты в крови (гиперурикемия) и выпадения ее кристаллов в тканях (подагра). Для лечения подагры используют ингибитор ксантин-оксидазы алопуринол, который блокирует образование мочевой кислоты. Существует синдром Леша-Нихана, проявляющийся гиперурикемией, подагрой еще в детском возрасте. Биохимической основой его является генетический дефект гипоксантингуанинфосфорибозилтранс феразы, которая обеспечивает повторное использование гипоксантина и гуанина для синтеза пуриновых нуклеотидов. Накопление гипоксантина и гуанина ведет к усилению их превращения в мочевую кислоту и рост концентрации последней в крови и тканях. 7. Катаболизм пиримидиновых нуклеотидов в тканях. Начальные стадии деградации пиримидинових нуклеотидов заключаются в отщеплении фосфорной кислоты и углевода (5’-нуклеотидаза, нуклеозидаза, фосфорилазы пиримидинових нуклеозидов). Азотистые основания, которые при этом освобождаются, далее окисляются с разрушением пиримидинового ядра и образованием β-аланина и βаминоизобутирата (цитозин предварительно дезаминируется в урацил). В свою очередь β-аланин и β-аминоизобутират при переаминировани теряют NH3, а их скелеты окисляются до СО2 и Н2О. β-аминоизобутират частично выводится с мочой в неизмененном виде. Таким образом, конечными продуктами катаболизма пиримидинових оснований являются аммиак (который превращается в мочевину), диоксид углерода и вода. Существуют наследственные нарушения дигидропиримидиндегидрогеназы, которые проявляются накоплением урацила и тимина и поражением мозга. 7. Основные этапы передачи наследственной информации. Направление передачи генетической информации впервые было установлено Ф.Криком (1958 год) в первом постулате центральной догмы молекулярной биологии: информация передается от нуклеиновых кислот к белку (ДНК > РНК > белок). Этот путь универсален для всех клеточных организмов. Репликации генома отвечает информационный переход ДНК > ДНК. Второй постулат дал возможность перехода информации в направлениях РНК>РНК и РНК>ДНК (у некоторых вирусов), а также возможность передачи изменений в конформации белков от одной молекулы к другой. В рамках взаимодействия между ДНК, РНК и белками выделяют три пути переноса информации между этими макромолекулами: общие, специальные и неизвестные. Пути передачи биологической информации Общие (присущи Специальные (присущи вирусам и Неизвестные (пока большинству организмов) мобильным элементам генома) не найдены в живых организмах) ДНК > ДНК (репликация) РНК > ДНК (обратная транскрипция) Белок>ДНК ДНК > РНК РНК > РНК (репликация РНК) Белок>РНК (транскрипция) РНК > Белок (трансляция) ДНК > Белок (прямая трансляция на Белок >Белок матрице ДНК) Известные пути переноса биологической информации включают: 1. репликацию – синтез дочерних молекул ДНК идентичных материнской ДНК; 2. транскрипцию – синтез на матрице ДНК молекул всех типов РНК, нуклеотидная последовательность которых комплементарна определенному участку ДНК; 3. трансляцию – синтез белков, последовательность аминокислот в которых определяется последовательностью нуклеотидов мРНК; 4. обратную транскрипцию – синтез ДНК на матрице вирусной РНК; 5. репликацию РНК синтез новых молекул РНК на матрице вирусной РНК; 6. прямую трансляцию ДНК - синтез белков рибосомами E.сoli на матрице ДНК без участия мРНК. Успешное функционирование системы сохранения и передачи генетической информации обеспечивается процессами: 1. репарации – удаление и повторный синтез поврежденных участков ДНК; 2. рекомбинации – обмен генетическим материалом между разными молекулами ДНК; 3. транспозиции – перемещение гена или группы генов из одного места генома в другой. 4. амплификации – увеличение копий одного гена. Генетическая система митохондрий. Митохондриальный геном млекопитающих представлен одною кольцевой молекулой ДНК, которая кодирует 37 генов, 13 белков (АТФ-синтазу, ферменты первого, второго и третьего комплексов дыхательной цепи), 22 разных тРНК и 2 рРНК. В митохондриях есть и собственные рибосомы. Однако большинство митохондриальных белков кодируется ядерной ДНК и синтезируется в цитоплазме. Митохондриальный геном передается по материнской линии, поскольку гены митохондрий сперматозоидов на попадают в оплодотворенную яйцеклетку. 8. Репликация ДНК. Репликация - это процесс удвоения ДНК, или синтез дочерней ДНК на матрице ДНК. В период подготовки к митозу происходит удвоение ДНК и в S-фазе клетка имеет диплоидний набор генетического материала, а каждая хромосома содержит две идентичные молекулы ДНК. Особенности репликации ДНК: 1. Субстраты синтеза дезоксинуклеозидтрифосфаты, хотя мономеры ДНК дезоксинуклеозидмонофосфаты. При репликации от каждого трифосфата отщепляется пирофосфат; т.е. дезоксинуклеозидтрифосфаты также выполняют роль источников энергии. 2. Матрицами синтеза дочерней ДНК служат обе цепи материнской ДНК. Согласно полуконсервативного механизма репликации, в каждой из образовавшихся дочерних молекул ДНК одна цепь - материнская, а вторая - вновь синтезированная. 3. Образование цепей дочерних ДНК происходит по принципу комплементарности к материнской цепи. 4.Продолжение цепи ДНК происходит в направлении от 5’- к 3’-концу: каждый новый нуклеотид присоединяется лишь к 3’-концу растущей цепи; 5. У еукариот удвоение ДНК осуществляется во многих местах, то есть одновременно существует много точек начала репликации; 6. Образованию каждого фрагмента, как длинного, так и короткого, предшествует синтез короткой последовательности (10-15 нуклеотидов) РНК-затравки, которая потом заменяется на последовательности нуклеотидов ДНК. Для синтеза дочерней ДНК необходимы такие факторы: 1.ДНК-матрица; 2.Праймер – олигорибонуклеотид (последовательность РНК); 3.Ферменты: а)ДНК-полимераза (у еукариот - α-, β-, γ- ,δ-, ε-формы) ; у прокариот ДНК-полимераза 1 (фермент Корнберга), ДНК-полимераза II, ДНК-полимераза III. б) гираза (топоизомераза); в) хеликаза; г) праймаза; д) лигаза; е) эндонуклеаза; 4. Строительный и энергетический материал: трифосфаты нуклеозидов: для ДНК дезокси-АТФ, дезокси-ГТФ, дезокси-ЦТФ, ТТФ; для РНК-праймера - АТФ, ГТФ, УТФ, ЦТФ; 5.ДНК-связывающие (SSB) белки; 6.Ионы Мg2+, Zn2+ Характеристика ферментов: 1.ДНК-полимеразы I, II, III – у прокариот, как и α, β, γ, δ, ε-ДНК-полимеразы эукариот обладают суперточностью копирования и ориентируют присоединение нуклеотида к 3’ОН-группы. Однако эти ферменты не распознают начало копирования и синтезируют цепь лишь в направлении 5’>3’. У прокариот: ДНК-полимераза І катализирует ощепление праймера, ДНКполимераза ІІ участвует в репарации, то есть исправляет ошибки в цепях ДНК. ДНК-полимераза ІІІ синтезирует главную часть дочерних цепей ДНК. У эукариот: δ-ДНК-полимераза синтезирует лидирующую цепь; α-ДНКполимераза - отстающую цепь; γ-ДНК-полимераза участвует в синтезе ДНК митохондрий; β- и ε-ДНК-полимеразы обладают репарационной способностью. 2.Топоизомеразы уменьшают степень спирализации ДНК (число витков суперспирали) путем временного одноцепочечного (топоизомераза I) или двуцепочечного надрезываний (топоизомераза II, или ДНК-гираза), проведения через образованный разрыв другого сегмента и воссоединения цепи в месте разрыва). В результате целостность цепей сохраняется, но их взаимное расположение изменяется. 3.ДНК-хеликаза расплетает двойную спираль ДНК, разрушая водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями ДНК. 4. Праймаза (ДНК-зависимая РНК-полимераза) синтезирует праймер (олигорибонуклеотид), который потом вырезается и заменяется соответствующим олигодезоксирибонуклеотидом. 5.Лигаза сшивает фрагменты Оказаки. 6. Эндонуклеаза (рестриктазы) разрезает ДНК в середине цепи на фрагменты (репликоны) до 100000 нуклеотидов, которые будут удваиваться. 8.2. Этапы репликации. 1.Инициация. Репликация начинается с возникновения репликативной точки. Эта точка имеет специфическую последовательность богатую парами А-Т. К ней присоединяются специальные распознающие белки, которые обеспечивают присоединение хеликазы и топоизомеразы (гиразы) и запускают процесс репликации. Хеликаза расплетает ДНК на две цепи. Образуется репликативная вилка. Молекула ДНК жестко закреплена на ядерном матриксе и не может свободно вращаться при расплетании какого-либо участка. Это блокирует продвижение хеликазы по цепи. Топоизомераза надрезает нити ДНК и снимает структурное напряжение. В одной репликативной вилке действуют две хеликазы, которые движутся в противоположных направлениях. Разделенные цепи фиксируются ДНКсвязывающими белками. Участки формирования репликативной вилки называются «точками ori» (origin - начало). У эукариот одновременно образуется тысячи таких вилок, что обеспечивает высокую скорость репликации 2.Элонгация ДНК происходит неодинаково для двух ее цепей. ДНКполимераза III прокариот и δ- или α-ДНК-полимеразы эукариот осуществляют синтез лишь в направлении 5’>3’. Цепь с такой направленностью -лидирующая. ДНК-полимераза III или δ-полимераза непрерывно присоединяют к ней комплементарные нуклеотиды. Цепь с полярностью 3’>5’ является отстающей и достраивается по частям (также в направлении 5’>3’). α-ДНК-полимераза (или ДНК-полимераза III) синтезирует на этом цепи короткие участки - фрагменты Оказаки. Синтез фрагментов Оказаки и лидирующей цепи начинается с образования РНК-праймеров (затравок) длиной 1015 рибонуклеотидов ферментом праймазой (РНК-полимеразой). Ни одна из ДНКполимераз не способна начать синтез ДНК с нуля, а может лишь достраивать существующую цепь. Параллельно с образованием лидирующей цепи или фрагментов Оказаки происходит удаление рибонуклеотидов из праймеров и замена их нуклеотидами ДНК (при участием β-ДНК-полимеразы, которая имеет как экзонуклеазную, так и полимеразную активность). 3.Терминация (завершение) репликации происходит тогда, когда пробелы между фрагментами Оказаки заполнятся нуклеотидами (при участии ДНК-лигазы) с образованием двух непрерывных двойных цепей ДНК и когда встретятся две репликативные вилки. Затем происходит закручивание синтезированных ДНК с образованием суперспиралей. Правильность репликации обеспечивается точным соответствием комплементарных пар оснований и действием ДНК-полимераз, которые обладают кроме полимеразной, еще и экзонуклеазной активностью и способны распознавать и исправлять ошибки. Если включается некомплементарный нуклео-тид, то фермент делает шаг назад, отщепляет его и продолжает полимеразную реакцию. Поэтому процесс репликации является высокоточным. После завершения репликации происходит метилирование ДНК по аденину в последовательности –GАТС- (с образованием N-метиладенина) и остаткам цитозина с образованием 5-метилцитозина. Метилирование не нарушает комплементарности цепей и является необходимым для формирования структуры хромосом и регуляции транскрипции генов. 8.3. Теломеры. На каждом конце хромосомы есть последовательности с многочисленными повторами (десятками и сотнями тысяч) -GGGTTA-, которые называются теломерами. Они играют важную роль в сохранении генетической информации. После завершения репликации 5’-концы дочерних цепей ДНК оказываются недорепликованными, потому что β-ДНК-полимераза, которая отвечает за заполнение пробелов между фрагментами Оказаки, не может осуществлять синтез в направлении 3’>5’ и несколько первых с 3’-конца нуклеотидов каждой цепи остаются недостроенными, а 5’-концы оказываются длиннее на это же количество нуклеотидов («острые концы»). Эти концы удаляют экзонуклеазы. В результате на каждый цикл репликации теломерные участки хромосом укорачиваются на 50-100 нуклеотидных пар. Это не сопровождается нарушением функций генома, ведь теломерные последовательности не несут генетической информации. Хотя укорачивание незначительно, однако за много серий репликаций хромосомы могли бы вообще исчезнуть. Проблема восстановления длины теломер решается наличием необычного фермента теломеразы (нуклеотидилтрансферазы). В активном центре фермента есть фрагмент РНК, который комплементарен теломеразным последовательностям ДНК и служит матрицей. Теломераза функционирует как обратная транскриптаза и осуществляет синтез ДНК на РНК, и цепь ДНК удлиняется на один теломерный повтор. Потом идет новый цикл удлинения цепи. На феномене недорепликации ДНК построена теломеразная теория старения. Считается, что продолжительность жизни организма определяется длиной теломер и скоростью деления его соматических клеток. В процессе делений наступает такой момент, когда теломеразные последовательности исчерпываются; идет укорачивание кодирующих участков ДНК, разрушение структурных генов, гибель клеток и организма. Различные клетки имеют разную длину теломер и активность теломеразы. Клетки с низким потенциалом размножения (нервные, мышечные) имеют наименьшую длину теломер, и у них не проявляется теломеразная активность. Высокая активность теломеразы присуща активно размножающимся клеткам (лимфоциты, эндометрий, эпидермис), меньшая - в клеткам поджелудочной железы, печени, легких. В половых клетках, которые в известной степени «бессмертны», длина теломер и активность теломеразы наивысшая. 8.4. Регуляция клеточного цикла осуществляется семейством циклинзависимых протеинкиназ (Сdk – суclin-dependent kinases), котрые фосфорилируют регуляторные белки. Молекула Сdk сама по себе неактивна, но активируется при присоединении специального белка циклина. Циклины не только активируют Сdk, но и обусловливают их специфичность к тем или другим белкам. Так Сdk1 после связывания с циклином В получает свойства митозстимулирующего фактора. Синтез циклинов регулируется многочисленными факторами роста, интерлейкинами, гормонами. Их действие начинается с присоединения к соответствующим рецепторам на клетке-мишени митогенактивированных и других протеинкиназ и завершается активацией генов раннего (FOS, JUN) и позднего ответа, включая гены циклинов. Ингибиторы пролиферации (фактор некроза опухоли, трансформирующий фактор роста и другие), наоборот, тормозят синтез циклинов и прекращают деление клеток. Клеточный цикл жестко контролируется. К делению допускаются лишь те клетки, которые успешно прошли так называемые контрольные точки. В этих точках идет проверка наличия двухцепочечных разрывов в ДНК, разрывов микротрубочек, незавершенной репликации хромосом, достаточности уровня нуклеотидов. В зависимости от результатов проверки выбирается один из трех вариантов поведения клетки: 1) переход к следующей стадии митотического цикла; 2) остановка на бегущей стадии для исправления повреждений; 3) запуск механизма самоуничтожения (апоптоза), если нарушение невозможно исправить. 8.5.Мутации та репарация ДНК. Мутации - это изменения генотипа под действием факторов внутренней или внешней среды. Большинство мутаций абсолютно безвредны (молчащие) и не задевают фенотип. Лишь небольшая их часть вызывает изменения в структуре белка и может влиять на функции клетки. Мутации, приводящие к гибели организма, называют летальными, а вызывающие заметное снижение жизнеспособности - полулетальными. Не всякое повреждение ДНК ведет к мутациям, поскольку в клетке существуют механизмы репарации. Если мутация не была своевременно устранена, то мутантный ген передается потомкам клетки. Мутации в соматической клетке могут привести к новообразованиям, а в половой клетке – к изменению свойств всего организмапотомка. Однако мутации могут сопровождаться и появлением полезных признаков, что имеет положительное значение для организма. Поэтому мутации являются двигателем природного отбора. Мутация не всегда носит случайный характер. В частности, целенаправленные соматические мутации служат инструментом иммунитета. Создается разнообразие популяций лимфоцитов, которые могут дать иммунный ответ на неизвестный для организма патоген. Исследование мутаций ДНК Y-хромосомы (эта хромосома передается по родительской линии) и ДНК митохондрий (передается по материнской линии) позволяет реконструировать историю биологического развития человечества, происхождения отдельных этносов. По характеру изменений в структуре генетического аппарата различают такие виды мутаций: 1. геномные мутации – изменения числа хромосом. Такие мутации вызывают тяжелые формы хромосомных болезней (синдромы Дауна, ШерешевскогоТернера и другие). 2. хромосомные мутации – это структурные изменения хромосом: а) транспозиция – перенос фрагмента ДНК в другой участок той же хромосомы; б) транслокация – перенос участка одной хромосомы на другую; в) инверсия – изменение в участке хромосомы последовательности генов или азотистых оснований на другую обратную последовательность; г) делеция – выпадение определенных участков хромосомы или фрагментов ДНК; д) дупликация – удвоение определенных участков хромосомы. 3. генные (точковые) мутации – изменения структуры гена (нарушение последовательности нуклеотидов в пределах одного гена). Это: а) замена нуклеотидов, которые включают транзиции – замена одного пуринового основания на другое пуриновое или замена одного пиримидинового на другое пиримидиновое и трансверзии – замена пуринового на пиримидиновое, или пиримидинового на пуриновое; б) выпадение (делеции) одного или нескольких нуклеотидов в гене; в) вставки в цепь ДНК одного или нескольких дополнительных нуклеотидов. Выпадение и вставки нуклеотидов ведут к изменению рамки считывания и смысла гена (нонсенс-мутации), а при появлении стоп-кодона синтез белка прекращается. Мутации без сдвига рамки ведут лишь к изменению содержания одного триплета (мисенс-мутации). Мутагены - это химические и физические факторы, вызывающие повреждение генетического аппарата. К ним относятся: 1. аналоги азотистых оснований – 5-бромурацил и 2-аминопурин; 2. дезаминирующие агенты – азотная кислота и нитрозамины, которые вызывают дезаминирование цитозина (с образованием урацила) и аденина или гуанина (с образованием гипоксантина и ксантина); 3. алкилирующие агенты, которые алкилируют (чаще метилируют) азотистые основания – диметилсульфонат, азотные и сернистые иприты (часть из них противоопухолевые средства), нитрозодиметиламин и другие; 4. ультрафиолетовое и ионизирующее излучение. УФ-лучи вызывают образования тиминовых димеров - сшивок между расположенными в одном цепи молекулами тимина. Тиминовые димеры препятствуют продвижению ДНК-полимеразы по цепи ДНК и блокируют процесс репликации. Ионизирующее излучение и различные химические агенты вызывают повреждение цепей ДНК: поперечные сшивки (возникновение ковалентних связей между цепями ДНК или между ДНК и белком) и одноцепочечные разрывы ДНК (разрывается фосфодиэфирная связь между фосфатным остатком и дезоксирибозой). При накоплении в ДНК значительного количества таких повреждений нарушается структура хромосом и появляются хромосомные аберрации (хромосомные мутации). Репарация повреждений ДНК. Удаление тиминовых димеров осуществляется вырезанием поврежденного фрагмента и заменой его на правильный: а) сначала УФспецифическая эндонуклеаза расщепляет ДНК слева от тиминового димера и отводит в сторону конец, который содержит димер; б) далее формируется «заплатка». β-ДНКполимераза присоединяет нуклеотиды ко второй цепи ДНК, используя неповрежденную цепь как матрицу для ДНК; в) потом ДНК-лигаза сшивает новосинтезированную «заплатку» с основной цепью ДНК. Нарушение репарации УФиндуцированных повреждений ДНК лежит в основе наследственного заболевания – пигментной ксеродермы (дефект УФ-специфической эндонуклеазы) и синдрома преждевременного старения. Удаление остатков урацила из ДНК. Урацил в ДНК образуется при гидролитическом дезаминировании цитозина. Появление урацила в ДНК означает, что при репликации в новой цепи ДНК вместо гуанина будет аденин. Репарация такой мутации включает: а) удаление из ДНК урацила ферментом урацил-ДНК-гликозидазой с образованием апиримидинового участка цепи; б) вырезание этого участка эндонуклеазой ; в) достраивание β-ДНК-полимеразой пробела в цепи ДНК; г) сшивание разрыва ДНК-лигазой. 9. Транскрипция. Экспрессия - это процесс реализации информации закодированной в генах. Он состоит из двух основных стадий — транскрипции и трансляции. Транскрипция – это синтез информационной (матричной) РНК на матрице ДНК при участии ДНК-зависимой РНК-полимеразы. При транскрипции информация о структуре белка переписывается с ДНК на мРНК. Порядок включения рибонуклеотидов в цепь РНК программируется последовательностью дезоксирибонуклеотидов в матричной ДНК. Функциональная роль цепей ДНК принципиально отличается. Одна цепь является кодирующей (смысловой), другая матричной. Для транскрипции используется матричная (некодирующая) цепь ДНК, поэтому мРНК (продукт транскрипции) совпадает с кодирующей цепью ДНК (с заменой тимина на урацил). Для одних генов кодирующей является первая цепь, для других – вторая. Участок ДНК, который транскрибируется, у эукариот называется транскриптон, а у прокариот – оперон. Транскрипция РНК осуществляется ДНК-зависимыми РНК-полимеразами, которые, в отличие от ДНКполимераз, способны самостоятельно инициировать синтез цепи из нуля. Факторы транскрипции: 1. нативная ДНК-матрица; 2. ДНК-зависимая РНКполимераза; 3. строительный материал и источник энергии – рибонуклеозидтрифосфаты - АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ; 4. белковые факторы, которые обеспечивают инициацию, элонгацию и терминацию транскрипции; 5. Ионы Mg2+. Характеристика ферментов. У прокариот только одна РНК-полимераза, синтезирующая все три класса РНК (матричные, транспортные, рибосомальные). У эукариот есть три класса РНК-полимераз, каждая из которых синтезирует соответственно рибосомальные, матричные и транспортные РНК – РНКполимераза І (pol І), РНК-полимераза ІІ (pol II), РНК-полимераза ІІІ (pol III). В митохондриях есть своя РНК-полимераза, которая необходима для транскрипции генов митохондриальных белков. Основной фермент, который обеспечивает транскрипцию генов, кодирущих клеточные белки, - это-полимераза II. Фермент специфически блокируется α-аманитином - токсином гриба Amantia phaloides (бледная поганка). Поэтому при отравлении этим грибом в первую очередь страдает синтез белков. Класс РНК-полимераз Продукты транскрипции Локализация pol І Рибосомальная РНК Ядрышко pol II Гетерогенная ядерная РНК (гяРНК) Нуклеоплазма pol III Транспортная РНК Нуклеоплазма 9.1. Синтез РНК у прокариот Этапы синтеза РНК: 1. связывание РНК-полимеразы с ДНК-матрицей; 2. инициация синтеза полирибонуклеотидной цепи; 3. элонгация (наращивание цепи); 4.терминация (завершение синтеза РНК) с образованием первичного транскрипта. 1.Связывание РНК-полимеразы с ДНК-матрицей происходит при участии специальных участках генома – промоторов (до 40 нуклеотидов), которые прилегают к началу гена, или отделены от гена другими функциональными участками ДНК. Для инициации транскрипции важными являются такие шестинуклеотидные последовательности (боксы) промоторов: 1)”-35-последовательность” ТТГАЦА, которая находится на 35 нуклеотидов влево в направлении 5’-конца от точки инициации («0-точки»). К ней присоединяется РНК-полимераза 2)”-10-последовательность” - блок Прибнова (Pribnow box) – последовательность ТАТААТ, которая находится на 10 нуклеотидов влево от «0 точки». Здесь происходит расплетание цепей ДНК и кодирующая цепь становится доступной для каталитических сайтов РНК-полимеразы. За промотором находится акцепторная зона (у эукариот) или оператор (у прокариот) для связывания с регуляторами транскрипции. Эти участки выполняют функцию диспетчера, включая и выключая транскрипцию генов. 2.Инициация транскрипции начинается с включения в цепь первого 5’концевого нуклеотида, который представлен пуриновым нуклеозидтрифосфатом (у про- и эукариот). Скорость инициации определяется структурой промоторных последовательностей между «-35-» и «-10-» блоками. Существуют сильные и слабые промоторы. Взаимодействие РНК-полимеразы с ДНК-матрицей блокируется противоопухолевым антибиотиком – актиномицином D и противомикробными антибиотиками рифамицином и рифампицином. 3.Элонгация осуществляется комплементарно в направлении 5’-3‘ цепи. 4.Терминация транскрипции происходит, когда РНК-полимераза достигнет терминирующих участков – обратных повторов (палиндромов, которые читаются одинаково в прямом и обратном направлениях) и поли-А-последовательностей. В терминации принимает участие белок-терминатор (ρ-фактор). 9.2. Особенности синтеза РНК у эукариот: 1.У эукариот более сложная система инициации транскрипции, обусловленая наличием: а) многочисленных дополнительных последовательностей в ДНК, которые определяют не только начало синтеза РНК, но и ее скорость; б) общих факторов транскрипции, которые необходимы для взаимодействия РНКполимеразы с промотором; в) специфических факторов транскрипции (регуляторных белков), которые взаимодействуют с энхансерами или другими регуляторными элементами гена и стимулируют или тормозят транскрипцию гена, г) факторов элонгации транскрипции; д) трех факторов терминации транскрипции - по одному для каждой РНК-полимеразы 2.Сигнал инициации транскрипции - последовательность ТАТА в промоторе (аналог бокса Прибнова). С ТАТА-боксом взаимодействуют факторы транскрипции и РНК-полимераза-ІІ. 3). РНК-полимераза-ІІ в клетках эукариот продуцирует моноцистронную РНК, которая кодирует лишь одну полипептидную цепь. 4).У прокариот РНК синтезируется в зрелом виде (готовой для выполнения функции форме), а у эукариот синтезируется пре-мРНК или гяРНК (гетерогенная ядерная), которая подлежит посттранскрипционной модификации – процессингу. Специфические факторы транскрипции (регуляторные белки) обеспечивают включение (выключение) определенных генов. К ним относятся коактиваторы и корепрессоры транскрипции и белки, которые связываются с энхансерами и сайленсерами гена. Коактиваторы и корепрессоры транскрипции усиливают или угнетают взаимодействие общих факторов транскрипции с промоторами или энхансерами, влияя на их доступ к последовательностям промотора, которые обычно блокируются гистонами. Часть коактиваторов катализируют ацетилирование пистонов. Гистоны после ацетилирования их аминогрупп теряют положительный заряд и отсоединяются от ДНК, открывая доступ к регуляторной и кодирующей части гена. Специфические факторы транскрипции обеспечивают регуляцию онтогенеза и функций клеток, экспрессию генов. Поэтому в одних клетках гены могут находиться в активированном состоянии, а в других - в репрессированном. Активность факторов транскрипции регулируется гормонами. Присоединение гормона изменяет конформацию молекулы фактора транскрипции и, соответственно, его активность. Гормоны могут запускать каскады реакций, которые модифицируют факторы транскрипции: фосфорилирование/дефосфорилирование, обратимое окисление их тиольных групп (редокс-чувствительные факторы транскрипции), что тоже изменяет их активность. Существуют факторы транскрипции, которые контролируют экспрессию не одного, а целой группы генов (гены противовоспалительных цитокинов, белков острой фазы, синтазы оксида азота, простагландинсинтазы и т.д.). Фактор транскрипции р53 останавливает клеточный цикл и запускает процесс программируемой смерти (апоптоз) инфицированной или злокачественно переродженной клетки, Считается, что этот белок стоит на страже чистоты генома. Повреждение этого белка повышает риск образования злокачественных опухолей. Все факторы транскрипции можно разделить на конститутивные, которые всегда присутствуют во всех клетках – к ним принадлежат описанные уже главные факторы транскрипции, белки Sp1, NF1, CCAAT и активированные, которые проявляют активность при определенных условиях. К активированным факторам транскрипции принадлежат: 1 клеточно-специфические факторы, которые контролируют эмбриогенез и дифференциацию клеток. Например, миоген- и гепатоцитрегулирующие факторы контролируют появление мышечной ткани и печени, почек и кишечника. Эти факторы, после того началась их экспрессия, дальше уже не нуждаются в дополнительной активации. 2. сигнал-зависимые факторы для активации нуждаются во внешнем сигнале. Эти факторы начинают взаимодействовать с регуляторными участками генов лишь после связывания с соответствующими лигандами. К ним относятся: а) ядерные рецепторы – это факторы транскрипции, которые активируются экстрацеллюлярными сигналами: гормонами (эстрогены, тестостерон, кортизол, ретиноевая кислота, трийодтиронин, кальцитриол), метаболитами (жирные и желчные кислоты и т.д.), некоторыми ксенобиотиками. Активированные ядерные рецепторы или непосредственно взаимодействуют с регуляторными участками генов (гормон-чуствительными элементами генов или их аналогами) или взаимодействуют с коактиваторами или корепрессорами транскрипции и в такой способ влияют на транскрипцию; б) латентные цитоплазматические факторы, которые в неактивном состоянии находятся в цитоплазме и только после активации транспортируются в ядро в) резидентные ядерные факторы, которые находятся в ядре независимо от того, в каком они состоянии : активном или неактивном Рассмотрим роль ядерных рецепторов (рис.). Ядерные рецепторы первого типа находятся в цитоплазме клетки в неактивной форме в комплексе с белком теплового шока и активируются при присоединении соответствующего гормона – эстрогенов, андрогенов, глюкокортикоидов, минералокортикоидов и т.д. Связывание гормона вызывает диссоциацию комплекса рецептор/белок теплового шока. Рецептор освобождается и димеризуется. В виде димера рецептор проникает в ядро, где связывается со специфической последовательностью ДНК (гормон-чуствительным элементом). Это способствует взаимодействию с промотором коактиваторов, факторами транскрипции и РНК-полимеразы и запускает транскрипцию гена-мишени. В результате мРНК транслируются в белок, появление которого ведет к изменению той или иной функции клетки. Ядерные рецепторы второго типа находятся в ядре клетки и непосредственно связаны с гормон-чуствительным элементом ДНК. К ним относятся рецепторы тиреоидных гормонов, ретиноевой кислоты, гема, холестерола, витамина Д. Значительный интерес вызывают рецепторы, которые активируются пролифераторами пероксисом. Лиганды этих рецепторов - жирные кислоты (особенно полиненасыщенные), простагландины, лейкотриены, искусственные лиганды. Рецепторы второго типа в ядре клетки образуют гетеродимер с ретиноидным рецептором Х и белком корепрессором транскрипции. Этот комплекс белков в отсутствии лиганда блокирует регулярные участки соответствующих генов-мишеней и их транскрипцию. Однако, при связывании этих рецепторов с соответствующим лигандом корепрессор теряет сродство к рецептору и покидает промотор гена-мишени. На его место становится белок коактиватор транскрипции, что позволяет РНК-полимеразе осуществлять транскрипцию гена-мишени. Образованные при этом мРНК дальше транслируются в белок, который и изменяет функцию клетки. 9.3. Посттранскрипционная модификация РНК (процессинг) У прокариот при транскрипции образуется зрелые РНК, а у эукариот предшественники матричных, рибосомальних и транспортных РНК. Процессинг - это процесс дозревания первичных РНК. Он включает: 1.Сплайсинг - вырезание неинформативных (интронов) и сшивание информативных (экзонов) участков РНК. Сплайсинг осуществляется РНКбелковым комплексом (сплайсосомой), который обеспечивает точность разрезания пре-РНК и сшивания соседних экзонов. В его состав, кроме ферментных и вспомогательных белков, входят 5 малых ядерных РНК, которые по принципу комплементарности распознают начало интрона (последовательность Г-У) и его конец (дуплет А-Г). Некоторые молекулы мРНК могут катализировать собственный сплайсинг без участия белков (фермент здесь сама РНК – рибозим). Роль рибозима, в частности, могут выполнять и интроны. 2. Кепирование: с 5’-конца присоединяется 7-метилгуанозин – «сар». 3. Полиаденилирование: с 3’-конца прикрепляется полиадениловый хвост поли(А)-последовательности из 20-250 нуклеотидов. Роль кепирования и полиаденилирования заключается в усилении трансляционной активности мРНК и защите ее от РНК-аз в цитоплазме. 4. Химическая включает модификация метилирование отдельных нуклеотидов, изомеризацию уридина в псевдоуридин, восстановление уридина в дигидроуридин и т.д. Все это приводят к образованию зрелых молекул РНК: а) 4-х видов рибосомальной РНК (18S-, 28S-, 5.8S- и 5S-рРНК); б) нескольких десятков транспортных РНК (от 1 до 3-х и более на каждую из 20 аминокислот); в) многих тысяч различных матричных РНК. 10. Генетический код и его характеристика Генетический код - это информация о первичной структуре белков, записанная в молекуле ДНК. Генетическая информация в ДНК записана в виде триплетных кодов. Это было доказано М.Ниренбергом и другими учеными в 1961-64-х годах. Триплеты или кодоны – это последовательность трех мононуклеотидов, которая несет информацию о включении в белок одной из 20 аминокислот. В ДНК содержится 4 типа нуклеотидов, а число возможных триплетов составляет 64, этого с избытком хватает для кодировки 20 аминокислот. Диплетний код может обеспечить кодировку только 16 аминокислот (возможно такой код существовал при возникновении жизни на Земле). Генетический код имеет такие свойства: 1. Код - универсальный для всех живых систем – вирусов, бактерий, высших организмов. 2. Код однонаправленный: информация считывается «слева направо» (направление 5’> 3’) 3. Код непрерывный, между кодонами нет знаков препинания 4. Код не перекрывается, после считывания одного триплета рамка считывания передвигается вправо на три нуклеотида 5. Код специфический: каждому кодону отвечает лишь одна аминокислота 6. Существует колинеарность гена и продукта: в какой последовательности расположены триплеты в гене, в такой же и аминокислоты в белке. Колинеарность гена в ДНК перерывается интронами. 7. Код вырожденный или множественный и несет избыток информации. Одна аминокислота может кодироваться несколькими кодонами (так на аргинин, лейцин и серин приходится по 6 кодонов) и только на метионин и триптофан - по одному триплету. Вырожденность генетического кода уменьшает отрицательное влияние мутаций. Подсчитано, что 67% мутаций по третьему нуклеотиду в триплете не изменяют смысл кодона, поскольку кодоны одной аминокислоты отличаются лишь последним (третьим) нуклеотидом. Генетический код содержит 61 смысловой кодон (триплеты, которые определяют включение в белок аминокислот), 3 кодона являются бессмысленными (нонсенс-кодонами). Однако эти кодоны выполняют роль знаков препинания и сигнализируют об окончании считывания информации. Большое значение имеет инициирующий кодон (АУГ), который отвечает метионину у эукариот и Nформилметионину - прокариот. С этих аминокислот начинается рибосомальный синтез белков. Структура гена. Считается, что ген — это участок ДНК, который несет целостную информацию о строении одной молекулы белка или одной РНК. Цистрон – участок ДНК, который кодирует одну полипептидную цепь. Таким образом, если белок состоит из нескольких разных полипептидных цепей (субъединиц), то его ген включает несколько цистронов. Если цистроны располагаются в разных хромосомах, то их также называют генами (например, гены α- и β-цепей гемоглобина). Рядом с функционально активными генами в геноме присутствует также и псевдогены - мутационно измененные последовательности, которые не способные транскрибироваться или продуцируют функционально неактивные генные продукты. Гаплоидный геном клеток человека содержит около 2,4.109 пар нуклеотидов в 23 парах хромосом. Их достаточно для образования 1,5 млн. пар генов. Но реально в организме человека синтезируется от 100 до 300 тысяч разных белков, поэтому фактически не более 2% ДНК содержат информацию о белках. По последним оценкам в геноме человека насчитывается до 22000 тысяч генов, которые кодируют белки и предусматривается последующее сокращение числа генов. Но в последние 10 лет получены доказательства того, что: во-первых транскрибируется значительно большая часть генома, чем отмеченные 2%; вовторых, основная часть сайтов ДНК, которые транскрибируются, кодируют не белки, а малые ядерные РНК (от 20 до 1000 нуклеотидов). Известно, что число генов малых РНК превышает число известных и предполагаемых генов, которые кодируют белки. мяРНК еще называют некодирующими РНК (некодирующими в том смысле, что они не кодируют белки). Эти РНК принимают участие в регуляции экспрессии генов в качестве корепрессоров и коактиваторов и, возможно, выполняют другие функции. Особенностью генов эукариот является то, что они содержат не только кодирующие участки – экзоны, но и некодирующие – интроны. Кодирующую часть гена еще называют открытой рамкой считывания. Главным критерием наличия открытой рамки считывания является отсутствие стоп-кодонов. Экзоны и интроны чередуются между собой. Иногда на интроны приходится до 90% всей длины гена. Между генами находятся еще одни некодирующие последовательности – спейсеры, выполняющие структурную роль при образовании хроматина и хромосом. К некодирующим участкам ДНК принадлежат и регуляторные последовательности - участки, находящиеся в непосредственной близости от рамки считывания гена. Они называются цис-регуляторными элементами (это промотор, сайт для связывания РНК-полимеразы). Регуляторные последовательности, которые находятся на значительном расстоянии от начала гена, называются транс-регуляторными (это энхансеры, сайленсеры, инсуляторы). Итак, понятие гена не ограничивается лишь кодирующим участком ДНК, а включает в себя и регуляторные последовательности. ДНК эукариот и человека кроме уникальных последовательностей (экзоны и регуляторные последовательности) содержат много повторов. В зависимости от количества нуклеотидов и кратности их повторения различают: а) высокоповторные последовательности (1-10 млн копий) – участки с длиной от 5 до 500 пар, расположенные один за другим. Такие повторы образуют кластеры, и их относят к сателитной ДНК, которая не транскрибируется, с неизвестной пока еще функцией; б) умеренноповторные последовательности (менее 1 млн копий), которые не образуют групп (кластеров); в) короткие диспергированные (разбросанные) повторы – длиной от десятков до сотен нуклеотидов. В геноме человека распространены повторы семейства Alu, длиной до 500 нуклеотидов, в количестве до 500 тысяч копий. Эти повторы имеют сходство с концевыми последовательностями ретровирусов. Считается, что часть вышеописанных последовательностей выполняют функцию так называемых мобильных элементов генома – транспозонов. Приблизительно 42% генома человека состоит из ретротранспозонов и до 2-3% - ДНК-транспозонов. 11.Трансляция Трансляция – это синтез белка на рибосомах в соответствии с информацией м РНК. Факторы трансляции: 1. 20 аминокислот. 2. Набор тРНК (не менее 20, а всего их существует до 50), 3. Наличие мРНК (иРНК), котрые кодируют последовательность аминокислот в белке. 4. Рибосомы - органелы, в которых происходит синтез белков. 5. Ферменты, катализирующие различные этапы синтеза белка: а) аминоацил-тРНК-синтазы или кодазы. Фермент содержит три центра: для связывания АТФ, аминокислот и тРНК. Он определяет точность и скорость трансляции и является регуляторным; б) пептидилтрансфераза катализирует транспорт полипептида из пептидильного в аминоацильный центр; в) пептидилтранслоказа передвигает рибосому на один триплет 6. Белковые факторы: факторы инициации: IF1, IF2, IF3 у прокариот; еIF1, еIF2 до 10 у эукариот; факторы элонгации: ЕF1, ЕF2, ЕF3 у прокариот; ЕF-Т4; EF-TS; EF-G – у эукариот; факторы терминации: RF1, RF2 - у прокариот, eRF1, eRF3 у эукариот. 7. ГТФ, АТФ – источники энергии и ионы Mg2+, Са2+, Мn2+ Рибосомы состоят из двух субъединиц: большой и малой, которые отличаются константами седиментации при ультрацентрифугировании. Формирование обоих субъединиц обусловлено наличием рибосомальных РНК, которые играют роль каркаса, к которому присоединяются белковые молекулы. У эукариот рибосомы находятся в свободном состоянии в цитоплазме, или связанными с мембранами эндоплазматического ретикулума. По размерам рибосомы делят на три группы: - малые рибосомы прокариот с константой седиментации 70S. Состоят из малой и большой субъединиц. Малая (30S) содержит 1 молекулу рРНК, 21 молекула белка), большая (50S) - 2 молекулы рРНК, 34 молекулы белка; - большие рибосомы эукариот с константой седиментации 80S. Они дисоциируют на малую 40S субчастицу ( 1 молекула рРНК, 31 молекулы белка) и большую 60S ( 2 молекулы рРНК и 41 молекула белка); - рибосомы митохондрий и хлоропластов эукариот по размерам и функциям похожи на рибосомы прокариот. Рентгеноструктурным методом доказано, что малая субъединица рибосом выгнута в виде телефонной трубки, а большая напоминает ковш. Между ними остается щель, через которую проходит молекула мРНК и из которой появляется вновь синтезированный белок. Рибосомы содержат рибосомальные РНК, белки, полиамины, ионы - Mg2+, Ca2+, Mn2+ и другие компоненты. В трансляции принимают участие не сами аминокислоты, а их аминоацилтРНК-производные, поэтому предварительно происходит активация аминокислот и их присоединения к тРНК. 11.1. Активация аминокислот и их взаимодействие с тРНК. Этот процесс происходит в цитоплазме в 2 стадии: сначала при участии АТФ образуется макроэргическое соединение – аминоациладенилат, а затем остаток аминокислоты переносится на тРНК. Обе стадии катализируются набором из 20 ферментов аминоацил-тРНК-синтаз, каждая из которых проявляет высокую специфичность к «своим» аминокислоте и тРНК. Высокая точность распознавания (рекогниции) аминоацил-тРНК-синтазой своих субстратов обеспечивает правильное (соответствующее генетическому коду) включение аминокислот в структуру белка, который синтезируется. В случае присоединения аминокислоты к чужой тРНК реакционный центр аминоацил-тРНК-синтазы ее удаляет. Считается, что тРНК и аминоацил-тРНК-синтазы выполняют адапторную функцию, потому что они объединяют два информационных потока «нуклеотидный» и «аминокислотный». Это объясняется способностью тРНК специфически связывать соответствующую аминокислоту и наличием в тРНК специфического триплета – антикодона, который комплементарен кодону на мРНК и обеспечивает специфическое соединение мРНК и тРНК во время образования инициирующего комплекса в рибосомах. 11. 2. Механизм и этапы трансляции. Собственно трансляция происходит в рибосомах и включает три стадии: 1. Инициация: образование инициирующего комплекса, который включает метионин-тРНКи (инициирующая), мРНК и рибосомальные белки. Комплекс состоит из 40S и 60S субъединиц, объединенных в 80S-рибосому. Целостная рибосома имеет аминоацильный (А-сайт) и пептидильный участок (Р-сайт). Первый отвечает за связывание аминоацил-тРНК, а второй – за связывание растущей полипептидной цепи. В состав инициирующего комплекса входит мРНК, которая на 5’-конце имеет 7-метилгуанозиновый «кэп». Начиная с кэпа, рибосома движется по мРНК и сканирует один кодон за другим, пока не наткнется на инициирующий (стартовый) кодон AUG. мРНК ориентируется таким образом, чтобы напротив пептидильного сайта рибосомы размещался инициирующий кодон AUG (кодирует метионин). Инициирующая метиониновая тРНК (мет-тРНКи) поставляет в рибосому первую аминокислоту – метионин, который становится N-концевой аминокислотой для большинства эукариотических белков (у прокариот это формилметионин). Для формирования инициирующего комплекса необходимо присутствие фактора eIF2 и более десяти других факторов инициации трансляции (eIF1, eIF3, eIF4, eIF6 и других). Роль факторов инициации различна. Так, фактор eIF3 препятствует объединению субъединиц рибосом в отсутствии мРНК; фактор eIF2 распознает инициирующую мет-тРНКи и поставляет энергию для инициации, расщепляя ГТФ; фактор eIF4A раскручивает мРНК и позволяет рибосоме двигаться по ней; фактор eIF4E распознает кэп. Благодаря взаимодействию между рРНК и мРНК последняя правильно фиксируется на рибосомных частицах, что способствует инициации. 2. Элонгация. Суть элонгации заключается в возникновении пептидных связей между остатками аминокислот с образованием полипептидной цепи, в которой последовательность аминокислот отвечает последовательности кодонов в мРНК. Элонгации нуждается в энергии ГТФ и факторах элонгации – EF1 и EF2. Элонгация начинается после того, как мет-тРНКи займет пептидильний центр рибосомы. В свободный аминоацильний сайт рибосомы могут поступать любые аминоацил-тРНК, но остается в нем лишь та, антикодон которой комплементарен кодону на мРНК. В результате метионил-тРНК и вторая аминоацил-тРНК сближаются между собой, а пептидилтрансфераза (точнее пептидилтрансферазный центр), катализирует образование пептидной связи между ними. Заметим, что пептидилтрансферазный центр есть рибозимом и образуется как рибосомальной РНК (28S рРНК), так и белками большой субъединицы рибосом. После образования пептидной связи со второй аминокислотой высвобождается мет тРНКи и происходит транслокация (перемещение) образованного дипептида (дипептидил-тРНК) из аминоацильного сайта в пептидильный. Процессу нужна энергия ГТФ и фактор элонгации ЕF2. В результате транслокации освобождается аминоацильний сайт, в который поступает новая аа-тРНК, антикодон которой комплементарен очередному кодону на мРНК, а пептидилтрансфераза наращивает цепь белка еще на одну аминокислоту по такой схеме: Пептидил-тРНК(1)+ аминоацил-тРНК(2) >тРНК(1)+ пептидиламиноацилтРНК(2). Этот конвеер работает непрерывно до того момента, пока на мРНК не появятся терминирующие кодоны (UAA, UGA, UAG). 3.Терминация трансляции. Появление терминирующих кодонов на мРНК способствует завершению трансляции, поскольку этим кодонам не отвечает ни одна из аа-тРНК. С этими кодонами связываются факторы терминации (eRF1 и eRF2), которые стимулируют гидролазную активность пептидильного центра. От новообразованного пептида отщепляется тРНК, и он отделяется от пептидильного центра. Рибосома диссоциирует на две субъединицы, а мРНК гидролизуется на свободные мононуклеотиды. Полисомы (полирибосомы). В трансляции мРНК могут принимать участие несколько рибосом. Как только первая рибосома покидает инициирующий кодон на мРНК, он становится доступным для другой рибосомы и т.д. Поэтому на одну цепь мРНК может быть нанизано 5- 6 рибосом. Конвеерный характер трансляции существенно повышает скорость синтеза белка. Ингибиторы трансляции у прокариот: стрептомицин блокирует стадию инициации; тетрациклин - связывание аминоацил-тРНК с рибосомами, хлорамфеникол - пептидилтрансферазную активность, эритромицин - процесс транслокации. Циклогексимид тормозит пептидилтрансферазную активность у эукариот, а пуромицин конкурирует с аминоацил-тРНК за аминоацильний сайт рибосомы. Ингибитором трансляции является дифтерийный токсин. А-фрагмент токсина имеет активность АДФ-рибозилтрансферазы и переносит АДФ-рибозу с НАД на фактор элонгации eEF2, инактивируя его. Интерфероны – белки, которые продуцируются лимфоцитами при заражении организма вирусами, активируют протеинкиназы, фосфорилирующие фактор инициации eIF2 и инактивируют его. Блокируется синтез вирусных и клеточных белков, наступает гибель инфицированных клеток, чем предупреждается распространение вируса. 11.3. Нематричный синтез полипептидов. В клетке может происходить синтез полипептидов и без участия мРНК и рибосом. Он осуществляется двумя путями. Первый: синтез из аминокислот при участии мультиферментных комплексов. Так синтезируется глутатион, пептидная часть пептидогликанов бактериальной стенки, антибиотик грамицидин, рилизинг-факторы гипоталамуса и другие небольшие пептиды. Второй: нарезание пептидов из более длинной полипептидной цепи специальными протеазами. Так из белка-предшественника проопиомеланокортина синтезируются липотропины, меланоцитстимулирующий гормон, кортикотропин, эндорфины и энкефалины. 12. Посттрансляционные изменения белков включают формирование высших структур белка после синтеза полипептидной цепи в рибосомах. Описаны более сотни различных вариантов посттрансляцийних изменений в белках. К наиболее известным принадлежат: 1.Частичный протеолиз. Многие белки первично синтезируются в виде неактивных предшественников, из которых потом путем ограниченного протеолиза образуются отдельные функционально активные белки. Так, большинство протеолитических ферментов пищеварительного тракта образуется в виде неактивных проферментов (пепсиногена, триписиногена, прокарбоксипептидазы и т.д.), и активируются после отщепления пептидов, блокирующих их активный центр. Белковые гормоны также синтезируются в виде неактивных предшественников. Путем протеолиза из препроинсулина образуется инсулин, проопиомеланокортина - пептидные гормоны гипофиза и т.д. Секреторные белки, синтезированные на рибосомах, при прохождении через мембраны эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи поддаются ограниченному протеолизу. Примером является отщепление N-концевых формилметионина и метионина от синтезированной полипептидной цепи. 2. Гликозилирование. Белки, входящие в состав плазматических мембран или секретирующиеся клеткой наружу в процессе дозревания, поддаются действию многочисленных гликозилтрансфераз мембран эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи. Углеводов присоединяются по ОН группам серина и треонина (О-гликозилирование) или по NН2 аспарагина (N-гликозилирование). 3. Фосфорилирование белков осуществляется присоединением остатка фосфорной кислоты по гидроксигруппам серина, треонина, реже тирозина при участии ферментов протеинкиназ. Дефосфорилирование белков осуществляется протеинфосфатазами. Процесс фосфорилирования/дефосфорилирования белков один из популярных в живой природе способов регуляции их функций. 4. Метилирование и ацетилирование белков чаще проходит по аминогруппам аргинина, лизина. Метилирование и ацетилирование гистоновых белков - важный механизм регуляции процессов репликации и транскрипции. 5. Карбоксилирование и гидроксилирование белков. Пример: витамин Кзависимое карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты в кальцийсвязывающих белках системы cвертывания крови и костной ткани. Гидроксилирование пролина и лизина при участии аскорбиновой кислоты важный этапом дозревания коллагеновых белков. 6. АДФ-рибозилирование. Активность некоторых ферментов активируется или тормозится присоединением АДФ-рибозильного остатка от НАД. 7. Изопренилирование и пальмитилирование белков. Присоединение изопренових остатков (геранила и фарнезила) и пальмитиновой кислоты происходит чаще всего по остаткам цистеина. Так регулируется активность белков дифференциации клеток и их программируемой смерти (апоптоза). 8. Во время синтеза тиреоидных гормонов происходит иодирование остатков тирозина в белках. 9. При формирования сложных ферментов к их белковой части присоединяются простетические группы и коферменты (так, присоединение гема ведет к образованию функционально активных молекул цитохромов и гемоглобина). 10. Пример химической модификации - превращение гистидина в молекуле фактора инициации трансляции еЕF2 в необычную аминокислоту дифтамид под действием дифтерийного токсина. Суть этой реакции заключается в поочередном присоединении к остатку гистидина в молекуле фактора еЕF2 аминокарбоксипропильной и метильных групп S-аденозилметионина. 11. К пострансляционным изменениям относятся и процессы эпимеризации аминокислот, которые ведут к превращению L-аминокислот в Dаминокислоты. Некоторые опиоидные пептиды мозга выявляют аналгетическое и наркотическое действие лишь при наличии в их составе D-аминокислот. Фолдинг белков. Это свертывание полипептидной цепи в трехмерную структуру. Если белок состоит из нескольких субъединиц, то фолдинг включает и их объединение в одну макромолекулу. Фолдинг - это обязательный этап превращения полипептидной цепи, которая сходит с рибосомального конвеера, на функционально активный белок. В результате фолдинга у полипептида уменьшается свободная энергия, гидрофобные остатки аминокислот упаковываются преимущественно в середину молекулы, а гидрофильные остатки располагаются на поверхности белковой глобулы. Пространственное строение белковой молекулы определяется прежде всего первичной структурой. Считается, что белок принимает строго определенную конфигурацию лишь на основе физико-химических взаимодействий своих функциональных групп. Однако это справедливо для небольших белков. Для фолдинга больших белков нужны вспомогательные белки – шапероны и ферменты фолдазы. Пространственная структура белков определяется и их взаимодействием с лигандами. Лиганды – это вещества (ионы металлов и неметаллов, органические молекулы), способные взаимодействовать с определенными частями молекулы белка и изменять его пространственное строение и биологическую активность. Белково-лигандные взаимодействия можно разделить на такие типы: 1. лиганд, связываясь с белком, не вызывает существенных изменений конформации, но стабилизирует структуру белка (так, связывание ионов Са2+ не изменяет активность лизоцима, но увеличивает сопротивляемость фермента к действию денатурирующих факторов). 2. белок проявляет свою активность лишь после связывания с лигандом. Так, кальмодулин обретает протеинкиназные свойства после связывания с Са2+. 3. белок формирует третичную или четвертинную структуры лишь при наличии лигандов. Так с помощью ионов кальция формируется третичная структура лактоальбумина и четвертичная остеокальцина. Лишь в присутствии гема формируется третичная структура цитохрома с. Фолдазы – это ферменты, которые владеют каталитической активностью относительно белков. Так протеиндисульфидизомераза, тиоредоксин и глутаредоксин катализируют перемещение дисульфидных связей в молекуле белка (разрушают дисульфидные связи в одном месте и образуют в другом). Действие этих ферментов дает возможность найти (путем перебора) такую комбинацию дисульфидных связей, которая отвечает оптимальной пространственной структуре белка. Пептидилпролилизомераза меняет пространственную конфигурацию белковой цепи в том его месте, где находится остаток пролина и где пептидная цепь делает изгиб в ту или другую сторону. Шапероны – это белки, которые способствуют формированию правильной третичной структуры белковых молекул и доставляют белки с места их синтеза до места назначения. Считается, что шапероны «садятся» на полипептидную цепь, как только она начинает выходить из рибосомы. Шапероны изолируют вновь созданный белок от нежелательных взаимодействий с другими молекулами и предупреждают заблаговременное свертывание цепи. К числу шаперонов принадлежат белки теплового шока, синтез которых резко увеличивается при культивировании микроорганизмов при высокой температуре. Нарушение фолдинга белков лежит в основе болезни Альцгеймера, при которой в мозге откладывается β-амилоид – агрегаты белка, потерявшего свою α-спирализацию. Он имеет β-складчатую структуру, малорастворим и плохо поддается протеолизу. Амилоид накапливается в нервных клетках, нарушает их функцию и вызывает гибель. Аналогично действуют и прионовые белки. Приони не только самые лишены нормальной спирализации, но и при контакте с другими белками вызывают потерю ими нормальной конформации. Человек может заражаться прионовыми белками употребляя мясо животных, содержащих прионы, как это бывает при болезни Крейтцфельдта-Якоба. 13. Регуляция экспрессии генов у прокариот Современная теория регуляции экспрессии генов у прокариот была предложена французскими исследователями Ф.Жакобом и Ж.Моно, которые исследовали биосинтез у E.сoli ферментов, метаболизирующих лактозу (βгалактозидазы, β-галактозидпермеазы и β-галактозидтрансацетилазы). Обнаружено, что при культивировании E.сoli на глюкозе содержание ферментов, метаболизирующих лактозу, минимально, но при замене глюкозы на лактозу происходит взрывоподобное усиление синтеза ферментов, разщепляющих лактозу на глюкозу и галактозу, и обеспечивают последующий метаболизм последних. У бактерий существуют ферменты 3-х типов: а) конститутивные, которые присутствуют в клетках в постоянных количествах, независимо от их метаболического состояния; б) индуцибельные – их количество в клетках при обычных условиях незначительно, но может увеличиваться в сотни и тысячи раз, если в культуральную среду добавлять субстраты этих ферментов; в) репрессабельные – ферменты, синтез которых в клетке прекращается при добавлении в среду конечных продуктов тех метаболических путей, где функционируют эти ферменты. На основании этих фактов и была сформулирована теория оперона. Оперон – это комплекс генетических элементов, отвечающих за координированный синтез ферментов, которые катализируют ряд последовательных реакций. В состав лактозного оперона E.сoli (Lac-оперон) входят: 1 структурные гены, которые кодируют первичную структуру ферментов, катализирующих последовательные реакции метаболизма лактозы 2. контрольные (регуляторные) сайты оперона, которые содержат промотор, оператор и терминатор. Промотор - это участок ДНК, с которым взаимодействует РНК-полимераза, а промотор Lac-оперона дополнительно содержит участок, с которым взаимодействует белок-активатор, контролирующий связывание РНКполимеразы с промотором. Оператор - это участок ДНК, с которым специфически связывается белок-репрессор. Оператор непосредственно прилегает к структурным генам и связывание белка-репрессора с оператором противодействует считыванию РНК-полимеразой информации со структурных генов. Терминатор – это последовательность ДНК, которая распознается РНКполмеразой как сигнал к прекращению транскрипции.Для функционирования оперона еще необходимо существование регуляторного гена, который экспрессирует регуляторный белок-репрессор. Этот ген структурно не связан с опероном и может находиться на значительном расстоянии от него. 1.Репрессия Lacоперона. Синтез ферментов метаболизма лактозы в клетках E.сoli заблокирован, поскольку связанный с оператором белокрепрессор противодействует транскрипции генов этих ферментов. Среда содержит достаточные количества глюкозы. 2.Индукция Lacоперона. При снижении в среде уровня глюкозы и появлении лактозы гены, кодирующие ферменты обмена лактозы, разблокируются. Лактоза связывается с белком-репрессором и изменяет его конформацию. Репрессор теряет сродство к оператору и покидает его. Начинается транскрипцию генов метаболизма лактозы и синтез молекул этих ферментов. То есть лактоза выполняет функцию индуктора синтеза ферментов, которые катализируют ее собственный обмен. 3.Существует еще один вариант индукции Lac-оперона, благодаря существованию белка активатора катаболических генов. Этот белок после присоединения цАМФ стимулирует транскрипцию структурных генов, а уровень цАМФ возрастает в ответ на дефицит глюкозы. Метаболический принцип регуляции активности оперона; сродство белкарепрессора к оператору контролируется метаболитами цепи реакций, ферменты которой кодируются этим опероном. Различают индуцибельные опероны, активатор которых - исходный субстрат метаболического пути. При отсутствии субстрата белок-супрессор блокирует оператор и не дает РНК-полимеразе транскрибировать структурные гены. При появлении субстрата определенное его количество связывается с белкомрепрессором, тот теряет сродство к оператору и покидает его. Это приводит к разблокированию транскрипции структурных генов. Репресабельные опероны – для них регулятором служит конечный метаболит. В его отсутствии белокрепрессор имеет низкое сродство к оператору и не мешает считыванию структурных генов (ген включен). При накоплении конечного метаболита, определенное его количество связывается с белком-репрессором, который приобретает повышенное сродство к оператору и блокирует транскрипцию генов. 14.Регуляция экспрессии генов у эукариот. Еукариоты имеют более сложную организацию, чем прокариоты, Например, в организме человека насчитывается более 200 разных типов клеток и 100 тысяч белков. Контроль экспрессии генов у эукариот включает не только механизмы, существующие у эукариот, но и механизмы, присущие только эукариотам. Регуляция экспрессии генома у эукариот осуществляется на нескольких уровнях: - на уровне структурной организации генома (претранскрипционный контроль) - на уровне транскрипции. Существует транскрипционная и посттранскрипционная регуляция. Регулироваться может сам процесс транскрипции, дозревание мРНК (процессинг), транспорт и деградация мРНК. - на уровне трансляции – через фосфорилирование-/дефосфорилирование белковых факторов трансляции. - на пострансляционном уровне – через регуляцию процессов формирования белковой молекулы, ее транспорта, активности и деградации. 14.1.Претранскрипционный контроль экспрессии генов у эукариот. Геном эукариот содержит много нуклеотидов, но лишь 2-5% ДНК используется для кодировки белков. Наличие у ДНК не только кодирующих, но и регуляторных (сигнальных) участков, значительного количества сайтов, которые не транскрибируются, составляет особенность генома эукариот. Хотя все соматические клетки содержат идентичный геном, но в разных типах клеток экспрессируются различные гены, а это свидетельствует о существовании механизмов, которые обеспечивают стабильную экспрессию в течение жизни клетки одних генов и торможения экспрессии других. А. Структурна та химическая модификация генома а) роль упаковки хроматина. В ядрах дифференцированных клеток хроматин так упакован, что только небольшое число генов (до 1%) доступно для транскрипции. В участках гетерохроматина ДНК упакована очень плотно и недоступна для транскрипции, тогда как в участках эухроматина, имеющего рыхлую упаковку, доступна для РНК-полимеразы. В разных типах клеток в область эухроматина попадают различные гены, а это означает, что в разных тканях транскрибируются различные гены. б) химическая модификация белков хроматина. Гистоновые и негистоновые белки, которые образуют прочные комплексы с ДНК, препятствуют использованию ДНК в процессах репликации или транскрипции. Ковалентная модификация (ацетилирование, фосфорилирование, метилирование, гликозилирование и АДФ-рибозилирование) изменяет заряд и другие свойства ядерных белков и может уменьшить или увеличить их взаимодействие с ДНК. Например, присоединение остатков уксусной кислоты к аминогруппам лизина (ацетилирование) в гистонах уменьшает положительный заряд этих белков, благодаря чему гистоны отсоединяются от ДНК, а на освобожденных от гистонов участках может происходить считывание информации. Поэтому ацетилирование пистонов усиливает скорость транскрипции. в) метилирование ДНК. Метилирование - это вариант эпигенетической регуляции активности генов, который не ведет к изменению нуклеотидной последовательности ДНК. ДНК-метилтрансферазы переносят метильную группу от Sаденозилметионина на цитозин с образованием 5-метилцитозина. Метилируется около 5% остатков цитозина ДНК в области СрG-островков (последовательностей от 500 до 2000 нуклеотидов с высоким содержанием гуанина и цитозина). Эти островки локализуются в регуляторных элементах гена, промоторах. Метилирование приводит к временной инактивации гена и блокировки его транскрипции. Однако конечный биологический результат метилирования определяется функцией гена. Если метилируется ген белка-активатора, то это ведет к торможению определенной функции клетки, а если ген белка-репрессора, то это усиливает определенную функцию. Например, метилирование гена-супрессора опухолевого роста (белка р53) способствует развитию опухолей. Метилирование - это обратимый процесс и вместе с метилированием существует процесс деметилирования. Однако, метилирование некоторых генов является необратимым, в частности генов, которые функционируют во время эмбриогенеза, а затем становятся ненужными. Б. Изменение количества генов. а) Амплификация - это процесс увеличения копий соответствующих генов. Молекулярной основой амплификации является многократная (взрывообразная) репликация одного гена, или его фрагмента. Амплифицированные участки могут располагаться в хромосоме друг за другом (тандемный) или образовывать внехромосомные фрагменты ДНК (двойные минихромосомы). Способны к амплификации гены металотионеина (белка, связывающего ионы тяжелых металлов), дигидрофолатредуктази, многих других белков. При поступлении в организм ионов тяжелых металлов или метотрексата (ингибитора дигидрофолдатредуктазы происходит взрывообразное усиление синтеза этих белков. Явление амплификации лежит в основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для проведения ПЦР используют РНК-праймеры (последовательности специфичны тем участкам ДНК, которые исследуются), а затем ДНК-полимераза реплицирует только те участки ДНК, которые отвечают праймеру. С применением ПЦР проводят диагностику вирусных и бактериальных инфекций, поскольку ПЦР дает возможность выявить ДНК и РНК возбудителей в организме хозяина. Метод ПЦР является основным в выявлении мутаций и генетического полиморфизма, установлении отцовства, этнической принадлежности и т.д. б) потеря генетического материала. Это редкий способ регуляции и, например, проявляется потерей ядра при дозревании эритроцитов или потери части генетического материала при дозревании лимфоцитов. В.Перестройка генов (генетические рекомбинации или реаранжирование) Перестройка генов – это обмен фрагментами ДНК между различными генами или объединение генов из различных биологических источников. Механизм рекомбинаций включает разрезание реципиентной ДНК и включение инородных фрагментов (транспозонов) из другой хромосомы или другого локуса той же хромосомы. Способность транспозонов встраиваться в молекулы других ДНК определяется наличием на их концах особенных фрагментов – инсерционных последовательностей. К рекомбинациям, присущим прокариотам, принадлежат: а) трансформация – включение в геном реципиентного микроорганизма донорной ДНК погибшей клетки того же вида; б) трансдукция – перенос бактериофагом фрагмента ДНК одного микроорганизма в геном другого реципиентного организма; в) конъюгация – процесс полового размножения у бактерий, который заключается в перенесении фрагмента ДНК из донорной в реципиентную клетку. У эукариот генетические рекомбинации обеспечивается механизмом кроссинговера (обмен идентичными участками между гомологичними хромосомами во время мейоза), который является необходимым элементом формирования половых клеток. Именно рекомбинация родительских хромосом при образовании гамет - главный фактор комбинативной изменчивости у людей. Процессы перемещения отдельных генов, или групп генов в другое место генома имеют место в В-лимфоцитах, гены которых кодируют образование иммуноглобулинов. Имеется несколько типов иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE), которые отличаются по типу тяжелых и легких цепей. В каждой белковой цепи иммуноглобулина существуют константные и вариабельные участки (соответственно, с постоянным или переменным составом аминокислот). Легкие цепи экспрессируються генами 3-х семейств, а тяжелые цепи – 4-х семейств. Каждое семейство насчитывает десятки и сотни генов. Благодаря рекомбинации генов, принадлежащим семействам генов легких и тяжелых цепей, становится возможным образование огромного количества (до 108) вариантов генов и, соответственно, столько же вариантов иммуноглобулинов с разной антигенной специфичностью. Транспозон – это последовательность ДНК, способная перемещаться в середине генома. Транспозоны принадлежат к так называемым мобильным элементам генома (к которым относят плазмиды и инсерционные элементы). Различают ДНК-транспозоны и ретротранспозоны. Перенос и вставка ДНКтранспозонов катализируется ферментом транспозазой (код фермента присутствует в самом транспозоне). Ретротранспозоны перемещаются по геному путем обратной транскрипции с их РНК (как ретровирусы). 14.2. Транскрипционный контроль экспрессии генов Гены эукариот имеют более сложное строение, чем гены прокариот. Регуляторная часть гена эукариот включает цис-регуляторные элементы (промотор, который граничит с открытой рамкой считывания гена) и трансрегуляторные элементы (энхансеры, сайленсеры, аттенюаторы и инсуляторы) которые расположены далеко от кодирующей части гена (на расстоянии миллионов пар нуклеотидов). Белки, которые связываются с цис- и транс-регуляторными элементами ДНК, называются транс-действующими факторами (транс-действие означает взаимодействие между разными молекулами, а цис-действие внутримолекулярные взаимодействия). а) У эукариот промоторы отличаются специфичностью к разным РНКполимеразам (у прокариот только одна РНК-полимераза). Это означает, что с промоторами генов, кодирующих транспортные РНК, связывается лишь РНКполимераза ІІІ, а с промоторами генов, которые кодируют мРНК – лишь РНКполимераза ІІ. Детально промоторы описаны ранее. б) в составе генов эукариот есть много регуляторных элементов. Для генов, которые экспрессируются конститутивно (то есть с постоянной скоростью), достаточно лишь наличие участков для связывания общих факторов транскрипции. Для генов, скорость экспрессии которых изменяется, существуют участки, связывающие регуляторные белки (специфические факторы транскрипции, репрессоры). К активирующим элементам генома принадлежат: энхансеры (усилители транскрипции) – участки ДНК (мотивы, модули), которые содержат несколько десятков пар нуклеотидов и расположены на значительном расстоянии от регулируемого ими гена, находясь спереди или сзади промотора, или в составе интронов. Связывание с энхансером соответствующих регуляторных белков усиливает в десятки и сотни раз процесс транскрипции. Среди регуляторных последовательностей выделяют так называемые элементы ответа, то есть энхансеры, общие для группы генов. Благодаря, этому один гормон, связавшись с одним регуляторным белком, может активировать несколько генов. Некоторые энхансеры после связывания с определенными белками не усиливают, а наоборот, блокируют транскрипцию генов, тогда они называются сайленсерами, или ослабляют транскрипцию, тогда они называются аттенюаторами. Они обеспечивают так называемое генетическое молчание, или сайленсинг. Благодаря сайленсингу организм может выключать из работы те гены, которые ему на этом этапе не нужны. Это явление имеет место во время дифференциации клеток. Известны также и инсуляторы или изоляторы - регуляторные элементы ДНК, которые отвечают за блокировку взаимодействия между энхансером и промотором. Действие инсулятора обеспечивается присоединением к нему специальных инсуляторных белков. Потребность в инсуляторе возникает тогда, когда активируется энхансер общий для группы генов, а активация одного гена из этой группы является нежелательной. Тогда инсулятор блокирует транскрипцию этого гена. в) регуляторные белки – это белки, которые взаимодействуют с регуляторными элементами генома – промоторами, энхансерами, сайленсерами и т.д. Таких белков насчитывается сотни, если не тысячи. К ним принадлежат общие и специфические факторы транскрипции, коактиваторы и корепрессоры транскрипции, которые нами были охарактеризованы ранее. Принципиальной особенностью строения этих белков является наличие ДНК-связывающего домена, который отвечает за их соединение со специфическими участками ДНК, доменов, которые активируют транскрипцию за счет взаимодействия с белками основного инициаторного комплекса, факторами транскрипции, коактиваторами, РНКполимеразой и доменов, связывающих лиганды. Благодаря присоединению лигандов происходит активация регуляторных белков. Различают: лиганды индукторы транскрипции - глюкокортикоиды, половые гормоны, ретиноевая кислота и кальцитриол, гормоны щитоподобной железы. Лигандами-репрессорами чаще всего являются конечные продукты метаболических путей. Корегуляторы транскрипции - многочисленная группа белков, которые взаимодействуют с факторами транскрипции и активируют (коактиваторы) или подавляют (корепрессоры) транскрипцию определенных генов (рассматривалось ранее). Однако влияние этих белков может касаться не только этапов инициации, элонгации и терминации транскрипции, но даже и сплайсинга РНК. При этом сами коактиваторы или корепрессоры с ДНК непосредственно не взаимодействуют. Механизм действия части корегуляторов заключается в том, что они модифицируют гистоновые белки, увеличивая или уменьшая доступность ДНК для транскрипции. Часть коактиваторов владеют ацетилтрансферазной, а часть корепрессоров - деацетилазной активностью. Присоединение ацетильных групп к аминогруппам гистонов ведет к уменьшению положительного заряда этих белков и освобождению отрицательно заряженной молекулы ДНК, которая становится доступной для транскрипции. При деацетилировании положительный заряд пистонов повышается, усиливается связь гистонов с ДНК и уменьшается доступность последней для считывания. Лигандами коактиваторов транскрипции нередко служат ядерные рецепторы разных гормонов, в частности рецепторы андрогенов, глюкокортикоидов. 14.3. Посттранскрипционная регуляция Регуляция экспрессии генов может происходить и после синтеза молекулы мРНК, в частности во время дозревания (процессинга) первичных мРНК. Основные способы такой регуляции – альтернативный сплайсинг, РНК-интерферренция и изменения стабильности РНК (изменения скорости деградации РНК). Альтернативный сплайсинг – это вырезание экзонов и их объединение в разных комбинациях. Поэтому одна пре-РНК может давать несколько разных мРНК. Один ген может кодировать не один белок, а несколько. Например, во всех клетках есть ген кальцитонина, но в щитовидной железе он экспрессируется в виде гормона кальцитонина, в гипофизе - нейропептида CGRP. Альтернативный сплайсинг широко представлен в геноме человека, поэтому протеом человека содержит намного большее количество белков, чем протеомы других организмов. РНК-интерференция – это торможение экспрессии гена на стадии трансляции или транскрипции действием малых РНК. Они выключают роботу тех генов, последовательности которых отвечают цепи молекулы малой РНК. Деградация мРНК. Время жизни эукариотических мРНК составляет от нескольких часов до нескольких дней, а прокариотических – несколько минут. Продолжительность жизни мРНК является важным механизмом регуляции синтеза белков. Разрушение мРНК у эукариот осуществляется 3’-РНК-азами (у прокариот 5’-РНК-азами). мРНК эукариот начинает разрушаться с некодирующего полиаденилатного фрагмента. Этот фрагмент подобно теломерным последовательностям ДНК служит буферной зоной, которая защищает кодирующую часть мРНК от разрушения. В промежутке между завершением трансляции мРНК одной рибосомой и началом трансляции следующей 3’-РНК-аза успевает отщепить от ее поли(А) фрагмент 10-15 нуклеотидов. Когда в этом фрагменте остается около 50 нуклеотидов (критическая длина), быстро наступает полный гидролиз мРНК. Кратность трансляции мРНК обычно не превышает 10-15 раз. Разница в продолжительности жизни различных мРНК объясняется как разной длиной поли-(А) -фрагмента, так и тем, что в короткоживущих мРНК между кодирующей частью и полиаденилатным фрагментом находятся АУ-багатые элементы. Наличие последовательностей обогащенных аденином и урацилом резко усиливает деградацию поли(А) -фрагмента. 14.4. Регуляция экспрессии гена на уровне трансляции Основным механизмом контроля за процессом трансляции является фосфорилирование факторов трансляции. Так, фактор инициации eIF2 при фосфорилировании теряет активность, а при дефосфорилировании - приобретает. В свою очередь процессы фосфорилирования-/дефосфорилирования катализируются протеинкиназами/протеинфосфатазами, активность которых контролируется циклическими нуклеотидами, гормонами и другими регуляторами. Второй способ регуляции - дискриминация мРНК. Существуют «сильные» и «слабые» мРНК. Сильные мРНК имеют большее сродство к инициирующей рибосоме и факторам инициации, поэтому их трансляция идет эффективнее. К третьему принадлежит блокировка трансляции белками-репрессорами, в качестве которых часто выступает сам продукт трансляции. Таким образом избыточные количества синтезированного белка тормозят свое же образование. 14.5. Регуляция на пострансляцийному уровни Пострансляционная регуляция связана с регуляцией транспорта, дозревания и активности белков – продуктов генов. Активность белков регулируется на уровне фолдинга посттрансляцийной модификации (фосфорилирование/дефосфорилирование и другие реакции), процессов деградации белков убиквитиновой системой и т.д. Недавно было открыто явление сплайсинга белков (подобно сплайсингу пре-мРНК). В процессе сплайсинга происходит вырезание из внутренней части синтезированной полипептидной цепи короткой аминокислотной последовательности (интерна) со следующим сшиванием внешних N- и Счастей (экстернов). Этот процесс происходит автокаталитично при участии гидроксигрупп серина. 15. Репликация геному вирусов Вирусы содержат лишь один вид нуклеиновых кислот – ДНК или РНК. Вирусная ДНК может быть одно- или двухцепочечной и иметь линейную или кольцевую форму. Вирусные нуклеиновые кислоты кодируют специфические для вирусов белки и ферменты, необходимые для репликации вируса в клетке хозяина. Репликация ДНК-содержащих вирусов идет по общему для всех ДНК полуконсервативному механизму. На матрице вирусной ДНК сначала синтезируется мРНК, а дальше идет образование вирусных белков. Этот процесс полностью обеспечивается метаболическим аппаратом клетки-хозяина. Репликация РНК-содержащих вирусов происходит двумя путями. Первый идет при участии РНК-зависимой РНК-полимеразы (РНК-синтазы или РНКрепликазы). Он присущ вирусам гриппа, кори. Различают вирусы, содержащие (+) РНК цепь (плюс-цепь), которая служит как мРНК, так и геномом, и вирусы, содержащие (-) РНК цепь (минус-цепь), которая служит лишь геномом. Существуют также вирусы, которые содержат двухцепочечную РНК. а) (+)-РНК цепь вируса может непосредственно использоваться в трансляции в качестве мРНК. Поэтому когда в клетку попадает (+) -РНК вирус (вирус полимиолиту, гепатита А), его РНК связывается с рибосомами клетки и транслируется в белковую цепь. Эта цепь разрывается протеазой вирусной частицы на 7 белков, один из - РНК-синтаза. После появления РНК-синтазы начинается репликация вирусной РНК. На первом этапе на (+) -цепи как на матрице образуется (-) цепь РНК, а на втором этапе (-) -цепь служит матрицей для синтеза (+) цепей РНК, идентичных вирусной. б) Рабдовирусы (вирусы бешенства, Эбола, Марбурга) и парамиксовирусы (вирусы парагриппа, кори, паротита) имеют (-) -цепь РНК, которая не может прямо транслироваться в белок. Вместо трансляции эта (-) -РНК используется как матрица для транскрипции (+) -РНК. Транскрипция осуществляется РНКсинтазой, которая присутствует в вирусной частице. Синтезированная вирусная (+) -РНК дальше используется как матрица для рибосомального синтеза вирусных белков и как матрица для синтеза (репликации) (-) -цепи РНК идентичной вирусной. в) (+-)-РНК (двухцепочечную РНК) имеют реовирусы, вызывающие респираторные инфекции. Принцип репродукции этих вирусов такой же как репликация двуцепочечной ДНК, но вместо ДНК-полимеразы функционирует РНКполимераза (РНК-синтаза). Второй путь идет при участии обратной транскриптазы (РНК-зависимой ДНК-полимеразы, ревертазы). Он присущ ретровирусам (вирус иммунодефицита) и части онкогенных вирусов. Фермент катализирует последовательно три процесса: 1) синтез (-) цепи ДНК на матрице вирусной (+) -РНК; 2) разрушение вирусной РНК в составе образованного гибрида РНК-ДНК; 3) синтез (+) –цепи ДНК на (-) -цепь ДНК с образованием двухцепочечной ДНК. Эта ДНК из цитоплазмы проникает в ядро, интегрируется в геном хозяина и служит матрицей для синтеза вирусных РНК при участии РНК-полимеразной системы клетки-хозяина. Образованные вирусные РНК выходят в цитоплазму, где инициируют трансляцию вирусных белков. Из этих белков и РНК собираются вирусные частицы, которые способны инфицировать новые клетки. 16. Генная инженерия. Рекомбинантные ДНК. Генная инженерия - это совокупность технологий выделения генов из клеток, получение рекомбинантных ДНК и РНК, осуществление манипуляций с генетическим материалом, введение генов в другие организмы. Важным заданием генной инженерии является получение новых генотипов (и фенотипов) путем трансплантации гена одного организма в генотип другого. На этом пути достигнуты определенные успехи. Созданы причудливые формы микроорганизмов, которые включают в себя гены необходимых для человека белковых продуктов и которые используются как промышленные продуценты – интерферона, инсулина, вакцин против гепатита В и т.д. Развивается генная терапия – трансплантация генов для лечения заболеваний. Технология трансплантации генов состоит из нескольких этапов. 1. Получение необходимого гена. Короткие гены получают химическим синтезом из нуклеотидов, а можно выделить из генома клетки (что сложно). Другой способ - это конструирование гена на мРНК с применением обратной транскриптазы (фермента репликации ретровирусов). Для этого из тканей выделяют мРНК, которая кодирует определенный белок, и синтезируют на этой мРНК необходимую комплементарную ДНК (кДНК). 2. Конструирование рекомбинантной ДНК. Полученный ген (кДНК) вводят в геном клетки-реципиента в виде рекомбинантной ДНК, которую создают путем присоединения к ДНК специального проводника - вектора. В роли векторов применяют вирусы или плазмиды (небольшие кольцевые молекулы ДНК, расположенные отдельно от нуклеоида бактерии). Плазмиду выделяют из бактерий, которые будут служить реципиентом нового гена. Кольцевую ДНК плазмиды и кДНК обрабатывают рестриктазами (эндонуклеазы бактерий, которые расщепляют ДНК бактериофагов). Рестриктазы разрезают обе ДНК в участках палиндромов с образованием «липких» концов (участки неспаренных нуклеотидов). При взаимодействии разрезанных плазмиды и гена между собой их полинуклеотидные цепи объединяются. Образуется новое кольцо плазмиды, которое включает новый ген. ДНК-лигаза завершает сшивание гена и плазмиды. 3. Введение рекомбинантной ДНК в клетку-реципиента и клонирование необходимого гена. Плазмида, содержащая новый ген, проникает в бактериальные клетки, где происходит репликация (клонирование) рекомбинантной ДНК с образованием тысяч копий. Далее эти клетки способны транслировать пересаженный ген в белок. С применением таких технологий производят белковые препараты – интерферон, инсулин, белковые гормоны и т.д. Нокаутируемые гены. Для исследования функции того или иного гена применяется технология исключения (нокаут) гена. Для этого синтезируют такой же ген или его фрагмент, измененные таким образом, чтобы продукт гена потерял свою функцию. Полученную конструкцию вводят в эмбрионные стволовые клетки мышей, где она замещает нормальный ген. После этого измененные клетки вживляют в бластоцист суррогатной матери, из которого развивается организм, с исключенным геном. Искусственная экспрессия генов - введение в организм гена, которого раньше у него не было. Для этого применяют технологии подобные нокаута гена, но при этом существующие гены не повреждается и не замещаются. Визуализация генных продуктов. Для этого используют технологию замещения нормального гена на генную конструкцию, которая содержит нормальный ген, сшитый с геном-репортером (например, с геном зеленого флуоресцирующего белка). Это дает возможность увидеть, в какой части клетки накапливается продукт гена. Изучение механизма экспрессии генов. Скорость экспрессии гена определяется регуляторными элементами гена, и прежде всего, его промотором. Существуют технологии, которые позволяют добавлять или извлекать из промотора отдельные фрагменты ДНК. Генная терапия – это совокупность методов, направленных на внесение изменений в генетический аппарат соматических клеток человека с целью лечения заболеваний. Цель - исправление дефектов, обусловленных мутациями генов, придания клеткам новых функций или блокировка активности тех или других генов. Используют два подхода: фетальна генотерапия – при которой инородную ДНК вводят в зиготу или эмбрион на ранней стадии развития, при этом ожидается, что введенный генный материал попадет во все клетки реципиента и в половые клетки, обеспечивая его передачу следующему поколению. Соматическая генотерапия, при которой генетический материал вводят лишь в соматические клетки и он не передается половым клеткам. Генетически модифицированые организмы – это живые организмы, генотип которых был целеустремленно изменен методами генной инженерии. Трансгенные организмы широко используют для производства врачебных препаратов (инсулина, белковых гормонов и т.д.). Благодаря пересадке генов можно обеспечить растениям большую производительность или большую стойкость к вредителям.
