ГУ НИИ БМХ РАМН Белки – молекулярные мишени для действия лекарств проф. А.С. Иванов ([email protected]) Москва - 2008 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 1 500 известных мишеней современных лекарств DNA 2% Nuclear receptors 2% Receptors 45% Ion channels 5% Unknown 7% Hormones & factors Enzymes 11% 28% Proteins/peptides ~ 95% 3D структура большинства мишеней не известна 16.04.08 2 1. Протеазы • • • Селективный гидролиз амидной связи Стабилизация переходного состояния Конкурентные ингибиторы моделируют переходное состояние Пептидные связи N-конец 16.04.08 С-конец Proteins - Molecular Targets 3 Два класса протеаз 1-й класс - прямой гидролиз амидной связи молекулой воды Активация H2O : 1) H2O связана c двумя Asp (аспарагиновые протеазы); Asp H2O Asp 2) H2O связана с ионом Zn (цинковые металлопротеиназы) Zn H2O 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 4 Два класса протеаз 2-й класс - непрямой гидролиз амидной связи Нуклеофильный атом остатка серина, треонина или цистеина атакует амидный карбоксил (сериновые, треониновые и цистеиновые протеазы) Разрыв связи C-N и образование ацил-ферментного интермедиата Интермедиат гидролизуется свободной молекулой воды acyl enzyme intermediate Ser−OH H2O (Thr)-OH (Cys)-SH 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 5 Специфичность протеаз Большинство протеаз обладают селективностью Селективность обусловлена комплиментарностью места связывания одному (или больше) аминокислотному остатку субстрата Стандартная номенклатура обозначения аминокислотных остатков субстрата и соответствующих им мест связывания в ферменте 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 6 1.1. Аспарагиновые протеазы • Классический объект - Пепсин Природный ингибитор Пепстатин (открыт в 1970 г.) Характеристический ингибитор аспарагиновых протеаз Комплекс пепсина с пепстатином (Ki = 5,6 х 10-11 M) Pepsin with pepstatin (1pso.ent) 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 7 1.1. Аспарагиновые протеазы • Катепсин D – лизосомальная протеаза Связь с развитием рака легких и болезни Альцгеймера Сконструированы ингибиторы Cathepsin D (1lya.ent) 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 8 1.1. Аспарагиновые протеазы • HIV-1 protease (HIVp) – протеаза ВИЧ Разрезание пробелка вируса на отдельные белки Ингибиторы – лечение СПИД Сконструированы сотни конкурентных ингибиторов -пептидомиметиков HIV-1 PROTEASE COMPLEX WITH ACETYL-PEPSTATIN (1hvp.ent) 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 9 1.1. Аспарагиновые протеазы • Ренин Вырабатывается почками и инициирует каскад реакций по регуляции кровяного давления Ингибиторы (пептидомиметики) – антигипертензивные средства До сих пор в клинике нет оральных ингибиторов ренина Проблема – биодоступность препарата * Renin with inhibitor (1rne.ent) 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 10 1.2. Сериновые протеазы • Трипсин/Химотрипсин Ингибиторы – лечение заболеваний ЖКТ Комплекс трипсин/ингибитор COMPLEX (TRYPSIN/INHIBITOR)(1taw.ent) 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 11 1.2. Сериновые протеазы • Тромбин - расщепляет растворимый фибриноген до нерастворимого фибрина (последний этап процесса коагуляции) Ингибиторы – антикоагулянты Комплекс тромбина с гирудином (из Hirudo medicinalis) Ki ~ 22 pM Human thrombin (1a4w.ent) 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 12 1.2. Сериновые протеазы • Эластаза нейтрофилов человека Выделяется при воспалении, деградация межклеточного матрикса, миграция нейтрофилов из сосудов в ткани Контролируется эндогенным белковым ингибитором, нарушение баланса – заболевания типа эмфиземы, кистозного фиброза, ревматоидных артритов Ингибиторы – лечение этих заболеваний (1hne.pdb) 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 13 1.2. Сериновые протеазы • Перспективные белки-мишени 1AT3 Протеаза вируса герпеса 1A1Q Протеаза вируса гепатита С 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 14 1.3. Ферменты, похожие на сериновые протеазы β–лактамазы Бактериальные ферменты, разрушающие β–лактамные антибиотики Ингибиторы – повышение эффективности и спектра действия антибиотиков 1BLC 1BC2 β-Lactamase From Bacillus Cereus 16.04.08 Inhibition of β-lactamase by clavulanate. Proteins - Molecular Targets 15 1.4. Треониновые протеазы • 20S протеосома Деградация большинства регуляторных белков в клетках Широкий спектр заболеваний (от иммунных до рака) Необратимые природные ингибиторы – лактацистин (SP-59) и его β-лактонный аналог (SP-60) 1pma.ent 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 16 1.5. Цистеиновые протеазы • Класс Папаина Активный центр содержит каталитическую триаду Cys-25, His-159, Asn-175 (подобно химотрипсину) Папаин (1pad.pdb) 16.04.08 Катепсин В 1CSB Proteins - Molecular Targets 17 1.5. Цистеиновые протеазы • Класс ICE - (Interleukin Converting Enzyme) Интерлейкин-конвертирующий фермент - продукция интерлейкина в моноцитах Субстратная селективность - аспартат в позиции Р1 Воспалительные заболевания (ревматоидные артриты) (1ice.pdb) 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 18 1.5. Цистеиновые протеазы • Класс ICE CED-3 – апоптоз у Caenorhabditis elegans CPP32 – апоптоз у млекопитающих (?) (1cp3.pdb) 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 19 1.5. Цистеиновые протеазы • 3С протеиназа пикорновирусов (гепатит А, полиовирусы, риновирусы) HEPATITIS A VIRUS 3C PROTEINASE SYNONYM: PICORNAIN 3C (1hav.ent) 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 20 1.6. Цинковые металлопротеиназы • Angiotensin-Converting Enzyme, ACE Ангиотензин-превращающий фермент, АПФ АПФ был открыт в ГУ НИИ БМХ РАМН Ингибиторы – гипотензивное действие Nature, 2003 * 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 21 1.6. Цинковые металлопротеиназы • Endothelin-Converting Enzyme, ECE Эндотелин-конвертирующий фермент Структуры фермента нет Сердечно-сосудистые заболевания 1edn.pdb Эндотелин 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 22 MMPs • Matrix metallo-proteinases (MMPs) семейство цинковых металлопротеиназ Всевозрастающая роль в качестве мишеней • Деградация и изменения соединительной ткани • Протеолиз и разрушение межклеточного матрикса Регуляция MMPs цитокинами и факторами роста через транскрипцию Секреция неактивного проферемента, специфическая активация Эндогенные тканевые ингибиторы MMPs (TIMPs) Нарушение регуляции – деградация соединительной ткани (артриты, инвазия опухолей, метастазы) 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 23 MMP catalysis “metallo” in MMP = zinc → catalytic domain contains 2 zinc atoms Whittaker et al. Chem. Rev. 1999, 99, 2735-2776 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 24 MMPs Есть 3D структуры 16.04.08 Whittaker et al. Chem. Rev. 1999, 99, 2735-2776 Proteins - Molecular Targets 25 2. Иммунофилины • Циклофилин (Cyclophilin, peptidylprolyl cis-trans isomerase) Ингибитор - Циклоспорин А блокирует образование цитокина IL-2 (иммуносупрессор, терапия после пересадки органов) 2RMA 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 26 2. Иммунофилины • FKBP12 Ингибитор – FK506 также блокирует образование цитокина IL-2 (иммуносупрессор) FK506 from 1tco.pdb 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 27 2. Иммунофилины • FKBP12 Рапамицин - блокирует клеточный ответ на цитокин IL-2 (иммуносупрессор) Rapamycin from 1nsg.pdb 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 28 2. Иммунофилины • FKBP12 1TCO 16.04.08 FK506 в комплексе с FKBP12 связывается и ингибирует серин/треониновую фосфатазу Сalcineurin Complex of Calcineurin, Fkbp12 and immunosuppressant drug Fk506 Proteins - Molecular Targets 29 2. Иммунофилины • FKBP12 • Комплекс rapamycin/FKBP12 связывается с новой мишенью FRAP (FBBP12 rapamycin associated protein) • Ни rapamycin, ни FKBP12 не связываются по одиночке с FRAP Immunophilin-FKBP12-Rapamycin Complex Interacting With Human Frap 1NSG 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 30 3. Фолат-содержащие ферменты • • • • Фолиевая кислота – витамин, кофактор многих метаболических ферментов. Многие фолат-зависимые ферменты являются ключевыми в клеточном цикле Ингибиторы – противоопухолевые средства (напр. метотрексат) Дигидрофолат-редуктуза (DHFR) Methotrexate from 1ra3.pdb 1ra3.pdb 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 31 4. Карбоангидраза • Карбоангидраза человека (HCA) – катализирует диффузионно-контролируемое превращение СО2 в бикарбонат • Ингибиторы – лечение глаукомы (контроль потока жидкости в глазах) • Активный центр содержит атом цинка, соединенный координационными связями с 3 остатками гистидина • Исследовательская группа фирмы Merck создала (structure-based design) ингибиторы HCA 1azm.pdb 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 1bzm.pdb 32 5. Фосфолипаза А2 Фосфолипаза А2 (ФЛ) - гидролиз фосфолипидов по sn-2 положению с образованием лизоформ и жирных кислот Ca2+ в активном центре Ингибиторы ФЛ - противовоспалительные средства 1POE 1a3d 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 33 6. Гемагглютинин • Гемагглютинин вируса гриппа 2viu 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 34 7. Сиалидаза • Сиалидаза (нейраминидаза) вируса гриппа Отщепляет концевую сиаловую кислоту от гликопротеинов, гликолипидов и олигосахаридов Участвует в освобождении новых вирионов из инфицированной клетки 1ivb 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 35 8. Топоизомеразы • • Топоизомеразы необходимы для решения различных топологических проблем, возникающих при репликации и транскрипции кольцевых замкнутых ДНК. Тип II (ДНК-гираза) и тип IV Ингибиторы – фторхинолоны (антибактериальные препараты) ципрофлоксацин, офлоксацин, ломефлоксацин, норфлоксацин 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 1EI1 36 9. ДНК-зависимая РНК-полимераза • Антибиотик Рифампицин (туберкулез) RNA Polymerase-Rifampicin Complex 1I6V 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 37 10. Рибосомальные субъединицы • 30S субъединица Тетрациклины ингибируют мРНК – 1FJG зависимое связывание аминоацил-тРНК с А-сайтом и угнетают начальную стадию белкового синтеза. 30S ribosomal subunit in complex with the antibiotics Streptomycin 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 38 10. Рибосомальные субъединицы • 50S субъединица Макролиды ингибируют реакцию переноса полипептидной цепи на аминоацил-тРНК и перемещение пептидил-тРНК из сайта А в сайт П. В результате тормозится формирование полипептидной цепи 1NWY Сomplex of 50S ribosomal subunit with Azithromycin 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 39 Проблема создания средств борьбы с РНК-содержащими вирусами Жизненный цикл ВИЧ 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 40 Мишени для создания лекарств против ВИЧ-инфекции ??? Обратная транскриптаза Протеаза Интеграза Мишени ВИЧ Протеаза (аспарагиновая) HIV-1 PROTEASE COMPLEX WITH ACETYL-PEPSTATIN (1hvp.ent) 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 42 Пример анти-ВИЧ лекарства 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 43 HIV drug resistance The drug-resistant protease modification is a result of the point mutation in both identical enzyme subunits. HIVp operates in homodimeric form, each of identical subunits being consisted of 99 amino acid residues. 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 44 HIV protease Active protease – homodimer Mutation Mutation competitive ACTIVE SITE SUBSTRATE inhibitor Mutation Mutation 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 45 HIV protease Mutation Mutation substrate Mutation Mutation 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 46 12. Новые перспективные мишени • Сравнительная геномика и протеомика – поиск новых мишеней и лигандов • Рецепторы (надсемейство G-сопряженных белков, ядерные рецепторы) • Киназы (фосфорилирование белков) и фосфатазы (дефосфорилирование белков) - передача сигналов, у человека идентифицировано > 500 киназ • Мембранные каналы • Мембранные транспортные белки • Белок-белковые взаимодействия (димеризация, фолдинг) 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 47 New Drug Targets Expected from the Human Genome Project Number of Drug Targets 12,000 5,000–10,000 10,000 8,000 6,000 4,000 2,000 Approx. 500 0 Cumulative Number of Targets Known Today New Targets Expected from Human Genome Project Source: Drews J. Nat Biotechnol 1996;14. Montreal-Kingston Bacterial SG Initiative (BSGI) Structural Proteomics in Europe (SPINE) Target DB http://targetdb.pdb.org Bacterial Targets IGS (BIGS) Yeast SG (YSG) Canada Europe France Marseille SG Platform (MSGP) Protein Structure Factory (PSF) German M. tuberculosis SG Consortium Germany Japan RIKEN SG/Proteomics Initiative Israel Structural Proteomics Center (ISPC) Oxford Protein Production Facility (OPPF) Israel UK New York SG Research Consortium (NYSGRC) Midwest Center for SG (MCSG) Berkeley SG Center (BSGC) Northeast SG Consortium (NESG) USA M. tuberculosis SG Consortium (TB) Southeast Collaboratory for SG (SECSG) Joint Center for SG (JCSG) SG of Pathogenic Protozoa Consortium (SGPP) Center for Eukaryotic SG (CESG) Structure 2 Function Project (S2F) 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 49 Спасибо за внимание 16.04.08 Proteins - Molecular Targets 50