содержание нуклеотидов аденина и урацила в печени крыс и его
реклама
На правах рукописи Исмаилова Фариза Эйзудиновна СОДЕРЖАНИЕ НУКЛЕОТИДОВ АДЕНИНА И УРАЦИЛА В ПЕЧЕНИ КРЫС И ЕГО КОРРЕКЦИЯ ПЕРФТОРАНОМ ПРИ СОЧЕТАННОМ ВОЗДЕЙСТВИИ γ-ИЗЛУЧЕНИЯ И ГАЗОВОГО КОНДЕНСАТА 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Краснодар – 2011 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Дагестанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Нагиев Эйзудин Рамазанович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Сторожук Александр Петрович доктор медицинских наук Шестопалов Александр Вячеславович Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ставропольская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Ставрополь). Защита состоится «___» ___________2011 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.038.02 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России) (350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4, тел. (861) 262-73-75). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России. Автореферат разослан «____» __________ 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета Д 208.038.02 профессор Л.А. Скорикова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования: В связи с широким использованием ионизирующих излучений и радиоактивных изотопов в народном хозяйстве, медицинской науке и практике здравоохранения, исследование механизмов их воздействия на организм является актуальной задачей современной биохимии и медицины. Особую значимость подобные исследования приобрели после трагической аварии на Чернобыльской АЭС [А.М. Кузин, 1995; Л.А. Ильин, 1998; В.И. Глазко, 2006; В.А. Барабой, 2007]. Все более очевидна патогенетическая связь облучения организма с канцерогенезом, старением и некоторыми генетическими нарушениями [К.П. Хансон и др., 2005; Ю.Е. Дуброва, 2009; S.E. Kerr, 2006]. Как известно, в бывшем СССР в широких масштабах проводились подземные ядерные взрывы в промышленных целях, в том числе и для интенсификации добычи нефти и газа. Газовый конденсат, выбрасываемый в атмосферу при нефте- и газодобыче, представляет собой жидкую смесь высококипящих углеводородов и растворенных газов метан-бутановой фракции [С.А. Воробьев и др., 2001; В.Т. Цегельский и др., 2003]. Значительное увеличение разведочных и строительных работ нефтегазового комплекса в районе Каспийского шельфа, естественно, влечет к возрастанию выбросов загрязнителей в окружающую среду. Нефть и нефтепродукты, в том числе и газовый конденсат, обладают канцерогенными свойствами, нарушают функции органов и тканей человека, снижают общий иммунитет, в целом оказывают неблагоприятное влияние на окружающую среду и на здоровье человека [В.М. Ракитский, 2006; Ф.Н. Гильямирова и др., 2007; Э.Р. Нагиев и др., 2008]. Актуальность данной проблемы существенно возрастает в ближайшие годы, так как по оценке разных специалистов на Каспии ожидается нефтегазовый бум [С.Н. Гаранина и др., 2006; С.И Кияшко и др., 2007; Р.Г. Мелконян, 2008; М.Н. Саксонов и др., 2009]. Следует отметить, что до настоящего времени не исследованы механизмы сочетанного воздействия радиации и газового конденсата на организм. В то же время биохимические изменения, возникающие при совместном воздействии радиации с другими факторами нелучевой природы, могут привести к выраженному биологическому эффекту, изменить его характер и течение [А.М. Кузин, 1996; М.А. Пальцев и др., 2002; Ю.Б. Кудряшов, 2009; С.I. Mothersill et al., 2007; V.I. Glasko et al., 2009]. Основу жизнедеятельности клетки составляет энергетический обмен, а адениловые нуклеотиды являются ядром энергетического заряда клетки. Адениловые и уридиловые 3 нуклеотиды участвуют в синтезе нуклеиновых кислот, белков, гликогена, выполняют роль коферментов, оказывая регуляторное влияние на различные физиологические процессы организма [С.В. Белов, 2003; J. Lin et al., 2006; H. Malhier, 2008]. Обмен нуклеотидов интенсивно протекает в печени, отличающейся также высоким их содержанием. Печень играет интегрирующую роль во всем нуклеотидном и нуклеиновом обмене организма [Я. Кольман и др., 2006; D.W. Bianchi, 2009]. Важнейшей задачей практической медицины является купирование нарушений и направленная регуляция метаболизма при экстремальных состояниях. В последние годы существенно усилились исследования перфторуглеродов как в экспериментальном, так и в клиническом аспекте. Перфторан является перспективным отечественным препаратом для клиники, поэтому стоит задача его всестороннего исследования, в том числе и биохимического [Ф.Ф. Белоярцев, 1993; А.М. Голубев, 1998; Г.Р. Иваницкий, 2006]. Механизм защитного действия перфторана связан не только с газотранспортными и реологическими свойствами, но и с непосредственным взаимодействием перфторана с мембранами клеток, стабилизируя структуру последних [Г.Р. Иваницкий и др., 1994; А.О. Волжин, 1998; И.Н. Кузнецова, 2005; Л.Е. Богданова и др., 2008]. Следует отметить, что в доступной литературе мы не нашли работ, посвященных исследованию содержания нуклеотидов при радиационно-токсическом поражении организма и коррекции перфтораном. В этой связи работа представляется актуальной и имеющей важное научное и практическое значение. Работа выполнена по плану НИР ГОУ ВПО ДГМА МЗ СР РФ. Номер государственной регистрации темы 0120.1000001. Цель работы: Изучить содержание нуклеотидов аденина и урацила в печени крыс при сочетанном воздействии γ-излучения и газоконденсата и коррекции перфтораном. Задачи исследования: 1. Выявить особенности изменений содержания нуклеотидов аденина и урацила в печени крыс, подвергшихся воздействию γ-излучения и газового конденсата. 2. Изучить при модельных условиях эксперимента активность ключевых ферментов (5/нуклеотидазы, УМФ-азы, прямой и обратной аденилаткиназы) метаболизма нуклеотидов. 3. Исследовать влияние перфторана на биохимические показатели печени и сыворотки крови крыс, подвергшихся сочетанному воздействию γ-излучения и газового конденсата. Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование содержания и активности ключевых ферментов метаболизма нуклеотидов аденина и урацила в печени крыс, подвергшихся сочетанному воздействию радиации и газового конденсата. 4 Впервые получены данные об активности аденилаткиназы (прямой и обратной реакции), 5'-нуклеотидазы и УМФ-азы в печени и сыворотке крови крыс, подвергшихся сочетанному воздействию γ-излучения и газоконденсата. Обнаружены специфические особенности функционирования ферментных систем обмена нуклеотидов в митохондриях и постмитохондриальном супернатанте из клеток печени подопытных животных. Впервые охарактеризовано влияние перфторана на метаболизм нуклеотидов и их содержание в печени облученных и отравленных крыс. Получены доказательства, свидетельствующие эффективного о препарата целесообразности для коррекции использования метаболизма перфторана адениловых в и качестве уридиловых нуклеотидов при сочетанном лучевом и токсическом поражении организма. Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные дают новую информацию, расширяя наши представления о механизмах повреждающего действия проникающей радиации и газового конденсата на метаболизм нуклеотидов аденина и урацила, их содержание и в целом на организм. Обнаруженные ранние изменения активности ферментов в сыворотке крови облученных и отравленных животных можно использовать в качестве индикаторов лучевого и токсического поражения и применить их определение в целях практической медицины. На основании анализа результатов экспериментальных исследований, теоретически обосновано использование перфторана в качестве средства, благоприятно влияющего на обмен нуклеотидов печени и на общее состояние животных при сочетанном воздействии γизлучения и газового конденсата. Эти данные могут служить теоретической предпосылкой для прикладных исследований по направленной фармакологической коррекции метаболизма при радиационно-токсических поражениях. Результаты диссертации используются в учебном процессе Дагестанской государственной медицинской академии при чтении лекций и проведении практических занятий по клинической биохимии, фармацевтической и токсикологической химии, а также в научном и учебном процессах Дагестанского государственного университета. Результаты работы вошли в «Лабораторный Практикум» по медицинской биохимии (Махачкала, 2009). Основные положения, выносимые на защиту: 1. Установлено, что в развитии патогенетических механизмов лучевого и токсического поражения существенную роль играют нарушения содержания и основных путей метаболизма адениловых и уридиловых нуклеотидов печени, что коррелируют с летальностью пораженных животных и изменениями гематологических показателей. 5 2. Установлен факт резкого снижения содержания АДФ, УДФ и особенно АТФ и УТФ, а также адекватного повышения количества АМФ и УМФ в печени пораженных животных, особенно в период разгара острой лучевой болезни и при сочетанном воздействии радиации и газового конденсата. Изменения содержания нуклеотидов в большинстве случаев коррелируют с изменениями активности исследуемых ферментов их метаболизма. 3. На основании полученных результатов теоретически обоснована роль перфторана в нормализации нарушений метаболизма нуклеотидов аденина и урацила, их содержания в печени экспериментальных животных, что позволяет рекомендовать его включение в комплекс средств направленной регуляции при экстремальных состояниях. Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на научных конференциях молодых ученых Дагестанской медицинской академии; международной научной конференции «Фармакология и фармакотерапия: достижения и перспективы» (Махачкала, 2006); межвузовской научной конференции «Фундаментальные проблемы морфологии» (Махачкала, 2007); международной научной конференции «Научные и методологические проблемы современного биологического ресурсоведения» (Махачкала, 2008); III международном молодежном медицинском Конгрессе (Санкт-Петербург, 2009); межрегиональной научной конференции «Здоровье молодежи и сохранение трудового потенциала России» (Пермь, 2009); международной Пироговской научной конференции (Москва, 2009, 2010); юбилейной научной конференции, посвященной 50-летию Дагестанского научного медицинского общества терапевтов (Махачкала, 2010); Всероссийской научной конференции «Закономерности распространения, воспроизведения и адаптации животных» (Махачкала, 2010); Всероссийском симпозиуме, посвященном экологии Каспийского моря (Махачкала, 2011). Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 5 в журналах, рекомендованных ВАК. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах компьютерного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 281 источник, из них 158 работ отечественных и 123 зарубежных авторов. Работа содержит 26 таблиц и иллюстрирована 15 рисунками. 6 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования проводились на 180 половозрелых беспородных крысах-самцах средней массой 180–200 г. Подопытные животные, как и контрольные, содержались в одинаковых стандартных условиях вивария на полноценном пищевом рационе. Крыс подвергали однократному общему облучению γ-лучами [60Со] в дозе 6 Гр (Грей), мощность дозы 0,48 Гр/мин, утром, натощак, на телегамматерапевтической установке «Агат-С»; расстояние «источник-кожа» 50 см; поле 9х13 см. С целью облучения животных помещали в специально изготовленные нами клетки из тонкого органического стекла с отверстиями для доступа воздуха. Дозиметрический контроль проводился дозиметрической службой Республиканского онкологического диспансера (г.Махачкала, Республика Дагестан) на базе которой проводилось облучение. Острое отравление газовым конденсатом вызывали путем однократного перорального введения токсиканта предварительно наркотизированным животным. В качестве наркоза использовали калипсол. Газовый конденсат вводили экспериментальным крысам в желудок через зонд в количестве 1 мл на 100 г массы животного спустя 30 мин после облучения. Контрольным крысам вводили эквивалентное количество дистиллированной воды. Животных до и после облучения и введения газоконденсата взвешивали, вели за ними наблюдения, оценивали общее состояние, подвижность, потребление пищи, состояние кожных покровов и видимых слизистых, наличие диареи и других патологических проявлений. Для коррекции нарушений у подопытных животных использовали перфторан, который вводили крысам в хвостовую вену в дозе 1 мл/100 г. Эмульсию перфторана вводили через 30 мин после введения газового конденсата животным и повторно через 24 часа и 48 часов в тех же дозировках. Контрольной группе крыс вводили эквивалентное количество физиологического раствора. Ежедневное введение перфторана после облучения и отравления газоконденсатом приходится на скрытый период лучевой болезни, что создает условия насыщения фармакологическим препаратом и дает возможность выяснить эффективность действия перфторана в период разгара острой лучевой болезни и в последующие сроки развития лучевого и токсического поражения. Следует отметить, что применение лекарственных средств, другие терапевтические меры воздействия целесообразны только в скрытый период, так как в разгар лучевой болезни проведение лечебных мероприятий мало эффективно [С.П. Ярмоненко и др., 2004; Ю.Б. Кудряшов, 2009; L.C. Dugan et al., 2003]. 7 Экспериментальные животные были разделены на 5 групп. 1 группа – контроль (10 интактных крыс); 2 группа – животные, подвергшиеся воздействию радиации (60 крыс); 3 группа – животные, подвергшиеся отравлению газоконденсатом (40 крыс); 4 группа – животные, подвергшиеся сочетанному воздействию радиации и газоконденсата (40 крыс); 5 группа – животные, которым после воздействия радиации и газоконденсата вводили перфторан (30 крыс). Исследования проводились в печени (отдельные серии и в сыворотке крови) подопытных животных. Печень, как известно, является весьма важным в метаболическом отношении органом и нарушения ее функций под влиянием различных экстремальных факторов в значительной мере отражаются на состоянии всего организма. Кроме того, печень как обезвреживающий орган, чрезвычайно тонко реагирует на самые различные неблагоприятные воздействия [С.В. Белов, 2003; B. Barbirolli et al., 1986]. Печень является основным депо гликогена, в биосинтезе которого непосредственное участие принимают уридиловые нуклеотиды, в печени активно протекает метаболизм всех нуклеотидов, биосинтез белков, а содержание нуклеотидов в этой ткани, т.е. в ткани с интенсивной биосинтетической активностью, отличается и относительно высоким уровнем [S. Dische et al., 1997; K.M. Roberti, 2003]. Животных забивали декапитацией, быстро извлекали печень, затем отмывали ее от крови охлажденным физиологическим раствором, высушивали между листами фильтровальной бумаги и взвешивали. Выделение митохондрий из гомогената производили общепринятым методом дифференциального центрифугирования. Определение содержания нуклеотидов проводили методом ионообменной хроматографии [М.М. Киреев и др., 1979; Э.Р. Нагиев, 2001]. Ионообменная хроматография позволяет определить нуклеотиды с хорошим разделением и выходом всех компонентов, что особенно важно при исследовании уридиловых нуклеотидов, содержание которых в тканях значительно ниже адениловых [И.Н. Литовченко, 1986; Э.Р. Нагиев, 1996; Алатыцев В. В. и др., 2005]. Активность 5/-нуклеотидазы и УМФ-азы исследовали с использованием в качестве субстратов АМФ и УМФ соответственно, оценивали по приросту неорганического фосфата и выражали в мкмоль неорганического фосфата на 1 мг белка [В.П. Скулачев, 1962]. Активность прямой аденилаткиназы определяли по интенсивности образования АДФ в системе, сопряженной с пируваткиназной и лактатдегидрогеназной реакциями и выражали в мкмолях НАДН+Н+ на мг белка или мл сыворотки крови [С.А. Шестакова, 1992]. Активность обратной аденилаткиназы определяли по интенсивности образования 8 АТФ в системе, сопряженной с гексокиназной и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной реакциями и выражали в мкмоль восстановленного НАДФ на мг белка или мл сыворотки крови [И.Н. Литовченко, 1986]. Белок определяли микробиуретовым методом [Г.А. Кочетов, 1989]. Результаты исследований обработаны общепринятыми методами вариационной статистики, включая вычисление t-критерия Стьюдента [В.С. Кокунин, 1975], с использованием компьютерной программы «Statistika V.5.5A» [О.Ю. Реброва, 2002]. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В результате проведенных исследований установлено, что воздействие радиации и газоконденсата приводит к существенным нарушениям содержания адениловых и уридиловых нуклеотидов печени крыс. Одной из закономерностей наблюдающихся изменений является прогрессирующее снижение содержания АДФ, УДФ и особенно АТФ и УТФ, а также повышение количества АМФ и УМФ в большинстве сроков исследования (табл. 1, 2). Так, в частности, содержание всех уридиловых нуклеотидов печени достоверно снижается спустя 1 сутки после радиационного воздействия, причем количество УТФ составляет около 62% от контроля. Таблица 1 Изменения содержания нуклеотидов аденина в печени крыс после воздействия γ-излучения и газового конденсата (мкмоль/г ткани; M±m) АТФ АДФ АМФ Контроль 2,57±0,08 1,38±0,04 1,65±0,04 1 час 2,62±0,09 1,35±0,04 1,69±0,05 1 сут 2,03±0,08* 1,29±0,03 1,76±0,06 7 сут 1,74±0,06* 0,76±0,02* 2,33±0,07* 1 сут 2,29±0,10 1,32±0,04 1,52±0,04 7 сут 1,95±0,07* 1,11±0,03 1,22±0,03* 1 сут 1,72±0,06* 0,97±0,03* 2,18±0,07* 7 сут 1,49±0,06* 0,83±0,03* 2,39±1,11* Обл.+ Отр-е ГК Отрав ление ГК Облучение Серии опытов Здесь и далее: *р < 0,05 по отношению к контролю. 9 Таблица 2 Изменения содержания нуклеотидов урацила в печени крыс после воздействия γ-излучения и газового конденсата (мкмоль/г ткани; M±m) УТФ УДФ УМФ Контроль 0,219±0,011 0,127±0,009 0,514±0,023 1 час 0,175±0,013 0,116±0,012 0,533±0,034 1 сут 0,141±0,011* 0,093±0,007* 0,391±0,013* 7 сут 0,135±0,009* 0,082±0,007* 0,813±0,033* 1 сут 0,182±0,014 0,117±0,012 0,457±0,22 7 сут 0,144±0,012* 0,110±0,008 0,359±0,012* 1 сут 0,129±0,008* 0,081±0,007* 0,889±0,037* 7 сут 0,112±0,008* 0,074±0,005* 1,014±0,039* Обл.+ Отрав л. ГК Отрав ление ГК Облучение Серии опытов Наиболее выраженные изменения в содержании нуклеотидов наблюдаются в период разгара острой лучевой болезни (через 7 суток после облучения), а также при сочетанном воздействии радиации и газового конденсата. Закономерным для обеих групп нуклеотидов печени через 7 суток после радиационного воздействия является максимальное снижение содержания АТФ и АДФ, а также УТФ и УДФ по сравнению с показателями контрольной группы животных. Следует отметить, что снижение содержания АТФ и УТФ и других полифосфатов печени, прогрессирует с увеличением сроков, прошедших после лучевого воздействия, причем наиболее выраженные изменения имеют место в период разгара острой лучевой болезни, а также после сочетанного воздействия радиации и газового конденсата. В отличие от этого содержание монофосфатов печени после облучения, а также после совместного воздействия радиации и газоконденсата существенно возрастает. Так, спустя 7 суток после облучения содержание АМФ в печени достоверно превышает контроль более чем на 40%. Острое отравление животных газовым конденсатом спустя 1 сутки не приводит к достоверным изменениям содержания как адениловых, так и уридиловых нуклеотидов. В то же время, через 7 суток после отравления у животных происходит существенное снижение содержания как АТФ и АМФ, так и УТФ и УМФ. Так, количество УМФ и АМФ в печени к этому периоду исследований снижается до 70-73% по отношению к контролю. 10 После сочетанного воздействия радиации и газового конденсата количество исследуемых нуклеотидов претерпевают наиболее резкие изменения. В частности, через 7 суток общий пул адениловых нуклеотидов снижается до 84% от контроля. Происходит это главным образом за счет снижения содержания АТФ и АДФ (57-60%). Количество АМФ к этому сроку, напротив, существенно повышается до 145% по отношению к контролю. Что касается уридиловых нуклеотидов, то сочетанное воздействие радиации и газового конденсата приводит к достоверным изменениям их содержания на всех этапах наблюдений. Спустя 1-7 суток после воздействия вредных экологических факторов содержание полифосфатов снижается - УТФ до 51-59%, УДФ до 58-64% от контроля. Содержание УМФ в эти же сроки почти в 1,5-2 раза превышает контрольные показатели. Воздействие радиации и газоконденсатной смеси приводит к существенным нарушениям активности 5/-нуклеотидазы и УМФ-азы (табл. 3). Через 1 час после радиационного воздействия наблюдается повышение 5/-нуклеотидазной активности, катализирующей дефосфорилирование АМФ в субклеточных фракциях печени подопытных животных. Наиболее выраженные изменения активности ферментов катаболизма нуклеотидов, как и содержания АМФ и УМФ, имеют место на 7 сутки после воздействия проникающей радиации. Таблица 3 Изменения активности ферментов катаболизма АМФ и УМФ в печени крыс, подвергшихся воздействию облучения и газоконденсата (мкмоль/мг белка; M±m) Серии опытов 5/-нуклеотидаза УМФ - аза митохондрии супернатант митохондрии 21,8±3,2 11,0±0,7 0,343±0,041 0,156±0,012 1 час 31,1±2,4* 14,4±1,4 0,317±0,033 0,163±0,025 1 сут 13,2±2,1* 12,0±0,8 0,299±0,025 0,116±0,010* 7 сут 34,0±3,7* 7,5±0,6* 0,285±0,072 0,405±0,068* 1 сут 18,2±2,2 9,8±1,3 0,394±0,036 0,176±0,14 7 сут 16,35±2,1* 7,7±1,2* 0,446±0,027 0,215±0,027* 1 сут 31,0±2,5* 7,3±1,1* 0,497±0,051* 0,280±0,034* 7 сут 35,75±2,7* 6,9±0,8* 0,556±0,053* 0,336±0,059* Отрав л. ГК Облучение Контроль Обл.+ Отр. ГК супернатант 11 Таблица 4 Изменения активности аденилаткиназы печени крыс после воздействия облучения и газового конденсата (мкмоль/мг белка; M±m) Серии опытов Облучение прямая обратная митохондрии супернатант митохондрии супернатант 3,03±0,15 1,27±0,11 0,32±0,01 0,25±0,01 1 час 3,13±0,14 1,72±0,11* 0,29±0,01 0,24±0,01 1 сут 3,81±0,16* 1,53±0,02* 0,37±0,02 0,28±0,01 7 сут 4,09±0,25* 2,10±0,09* 0,41±0,02* 0,30±0,01* 1 сут 3,24±0,15 1,22±0,10 0,39±0,03 0,29±0,01 7 сут 3,97±0,26* 1,51±0,023 0,43±0,02* 0,31±0,02* 1 сут 4,27±0,29* 1,94±0,12* 0,45±0,04* 0,34±0,02* 7 сут 4,69±0,32* 2,11±0,08* 0,48±0,05* 0,42±0,03* Контроль Обл.+ Отр. ГК Отравл ГК Аденилаткиназа Что касается газового конденсата, то достоверные снижение активности 5/нуклеотидазы до 70-75% от контроля происходит как в митохондриях, так и в супернатанте печени через 7 суток после отравления. В отличие от этого, УМФ-азная активность повышается и в супернатанте печени составляет около 138% от контроля. Сочетанное воздействие радиации и газового конденсата приводит к снижению 5/нуклеотидазной активности в супернатанте до 66% (1 сутки) и 62% (7 суток); в то же время в митохондриях ферментативная активность в этот период наблюдений на 40-60% превышает показатели контроля. УМФ-азная активность как в митохондриях, так и в супернатанте печени после воздействия радиации и газоконденсата повышается и более чем в 1,5 -2 раза превышает контрольные показатели спустя 7 суток после радиационнотоксического поражения животных. Превалирующей тенденцией в функционировании аденилаткиназы (табл. 4) является повышение ее активности после воздействия радиации и газового конденсата не только в субклеточных фракциях печени, но и в сыворотке крови экспериментальных животных (табл. 5), причем наиболее существенно - прямой аденилаткиназной реакции. Рост активности фермента максимально приходится на 7 сутки, то есть совпадает с периодом наиболее выраженных изменений в печени, а также состоянием пораженных животных. 12 Таблица 5 Действие γ-излучения и газового конденсата на активность ферментов метаболизма нуклеотидов в сыворотке крови крыс (мкмоль/мг белка; M±m). Серии опытов Облучение Отравл. ГК 5/- НТ УМФ - аза Прямая Обратная 0,97±0,06 0,52±0,04 42,67±1,36 0,079±0,005 1 час 0,96±0,07 0,49±0,04 30,08±1,55* 0,112±0,013* 1 сут 1,51±0,18* 0,52±0,03 32,02±0,67* 0,094±0,011 7 сут 1,64±0,24* 0,50±0,03 26,09±1,50* 0,195±0,018* 1 сут 1,12±0,13 0,52±0,03 40,54±1,33 0,102±0,009 7 сут 1,18±0,14 0,53±0,02 29,46±1,49* 0,143±0,014* 1 сут 1,67±0,25* 0,54±0,03 32,68±1,51* 0,166±0,015* 7сут 1,83±0,21* 0,55±0,03 24,75±1,37* 0,232±0,021* Контроль Облуч. +Отр. ГК Аденилаткиназа В сыворотке крови подопытных животных 5/-нуклеотидазная активность как при радиационном воздействии, так и при сочетанном воздействии радиации и газоконденсата достоверно снижается по сравнению с контрольными значениями. Следует отметить, что активность ферментов катаболизма нуклеотидов (5/-нуклеотидазы и УМФ-азы) в сыворотке крови претерпевают достоверные изменения в сравнительно ранние сроки – уже через 1 час после радиационного воздействия, а в период разгара острой лучевой болезни и после сочетанного воздействия радиации и газового конденсата отмечаются пиковые изменения, что могут сыграть роль индикаторов лучевого и токсического поражения организма и может быть использовано в целях практической медицины. Проведенные исследования активности прямой и обратной аденилаткиназной реакции позволили раскрыть некоторые механизмы функционирования фермента в обмене адениловых нуклеотидов печени животных в условиях радиационно-токсического поражения. Так, сравнивая содержание АТФ с одной стороны и активность прямой аденилаткиназы с другой, можно заметить, что высокая ферментативная активность в субклеточных фракциях печени коррелирует со снижением количества АТФ в печени подопытных животных при модельных условиях эксперимента (рис. 1). 13 рис 1. Изменения содержания АТФ и активности прямой аденилаткиназы в печени крыс после воздействия облучения и газоконденсата 80 60 40 20 % 0 -20 -40 -60 контроль АТФ обл.1 ч обл.1 сут обл. 7 сут аденилаткиназа (митохондрии) отр.ГК обл.+отр.ГК аденилаткиназа (супернатант) В печени и сыворотке крови обмен нуклеотидов с участием аденилаткиназы более интенсивно протекает по пути превращения АТФ и АМФ в аденозиндифосфорную кислоту (АТФ + АМФ → 2АДФ), чем в обратном направлении. Особенно это заметно в печени, где активность прямой аденилаткиназной реакции в митохондриях и супернатанте интактных животных соответственно в 9 и 5 раз выше, чем обратной. Интенсивно протекающая прямая аденилаткиназная реакция имеет важное значение в условиях быстрого использования АТФ для биосинтетических реакций [Y.E. Dubrova et al., 2005]. Как известно, аденилаткиназа и 5'-нуклеотидаза имеют не одинаковую молекулярную массу. Наиболее низкая ее величина у аденилаткиназы – 21500-40000 (W.E. Criss et al., 2001), а у 5'-нуклеотидазы составляет 110000–205000 [J. Neuhard et al., 2007]. Так как размер молекулы аденилаткиназы значительно меньше, чем 5'-нуклеотидазы, повышение ее активности в сыворотке крови может быть связано с тем, что фермент относительно легко проникает через плазматическую мембрану даже после незначительного повреждения ее различными повреждающими агентами, в том числе радиацией и ксенобиотиками. Активность обратной аденилаткиназной реакции в тканях животных выражена значительно слабее, чем прямой, что в определенной степени связано и с ингибирующей ролью АТФ на активность аденилаткиназы [Б.А. Цудзевич и др., 2002]. Повышение интенсивности обратной аденилаткиназной реакции способствует пополнению уровня АТФ и росту концентрации АМФ - субстрата 5'-нуклеотидазы и ингибитора обратной аденилаткиназной реакции. Поэтому повышение интенсивности катаболизма АМФ будет 14 способствовать превращению 2АДФ → АТФ + АМФ в аденилаткиназной реакции. Причем вначале, когда уровень АТФ относительно невысокий, АМФ подвергается преимущественно дефосфорилированию. По мере повышения концентрации АТФ угнетается 5'-нуклеотидаза, и адениловая кислота может использоваться другими путями обмена. При интенсивном расщеплении АТФ на АДФ и неорганический фосфат аденилаткиназа и 5'-нуклеотидаза способствуют ресинтезу АТФ. Причем ферменты в данной метаболической ситуации представляют собой сопряженную ферментную систему, в которой продукт предыдущего фермента служит субстратом для следующего. По всей видимости, в нарушениях аденилового и уридилового нуклеотидного фонда печени облученных и отравленных крыс, важнейшее место занимают комплексные изменения их метаболизма, в частности, угнетение синтеза в ранние сроки после радиационного воздействия, а также усиление процессов катаболизма АДФ, УДФ и особенно АТФ и УТФ, прогрессирующее со временем, прошедшим после облучения. Пиковые изменения имеют место в период разгара острой лучевой патологии (7 сутки после облучения) и при сочетанном воздействии радиации и газового конденсата. Известно, что усиление катаболизма является одним из важных аспектов метаболизма нуклеотидов в тканях облученного организма [В.А. Барабой, 2007; Э.Р. Нагиев и др., 2007, 2008]. Существенную роль в этих процессах играют нуклеозидфосфатазные системы клеток. Активность УМФ-азы, дефосфорилирующей УМФ, повышена в большинстве сроков исследования. По всей видимости, одной из причин этого является ответная реакция на повышенное содержание УМФ в печени облученных животных (рис. 2). Если у интактных крыс активность УМФ-азы в митохондриях печени существенно выше, чем в супернатантах, то после облучения эти соотношения меняются в пользу супернатанта, где ферментативная активность значительно превышает показатели контроля. 15 рис. 2. Изменения содержания УМФ и УМФазной активности в печени крыс после воздействия облучения и газоконденсата 160 140 120 100 80 % 60 40 20 0 -20 -40 контроль УМФ обл. 1 ч обл. 1 сут обл. 7 сут УМФаза (митохондрии) отравление ГК обл. + отр-е ГК УМФаза (супернатант) По всей видимости, это обстоятельство связано с нарушением структуры мембран митохондрий и изменением их проницаемости после воздействия ионизирующей радиации [А.М. Кузин, 1995, 1996; Ю.Б. Кудряшов, 2002, 2009], а в связи с этим с внутриклеточным перераспределением фермента. Учитывая данные литературы об относительной радиорезистентности реакций ферментативного превращения уридиловых нуклеотидов в цитидиловые, можно полагать, что пострадиационный дефицит УТФ занимает одно из ведущих мест при оценке изменений содержания не только ЦТФ и других цитидиловых нуклеотидов, но также и всех нуклеотидов пиримидиновой группы [Е.Ф. Романцев, 1987; Ю.С. Рябухин, 2000; Е.А. Пряхин и др., 2001]. Следует отметить, что обнаруженные изменения метаболизма адениловых и уридиловых нуклеотидов могут привести к существенным нарушениям обмена белков, липидов, нуклеиновых кислот, углеводов, в превращениях которых последние принимают непосредственное участие [С.П. Ярмоненко и др., 2004; Y.E. Dubrova et al., 2006]. Введение пораженным животным перфторана с целью коррекции обнаруженных нарушений, способствует существенной нормализации содержания нуклеотидов и активности ферментов их метаболизма в большинстве случаев исследования (рис. 3, 4). 16 рис. 3. Влияние перфторана на содержание адениловых и уридиловых нуклеотидов в печени экспериментальных крыс 40 30 20 10 0 % -10 -20 -30 -40 -50 АТФ контроль АДФ АМФ УТФ облучение+отравление УДФ УМФ коррекция перфтораном рис. 4. Влияние перфторана на содержание УТФ, УМФ и активность УМФазы в печени крыс после воздействия облучения и газоконденсата 120 100 80 60 40 % 20 0 -20 -40 -60 УТФ контроль УМФ УМФаза (митохондрии) облучение+отравление УМФаза (супернатант) коррекция перфтораном Особенно это касается адениловой группы нуклеотидов. В то же время, содержание УТФ в печени леченых крыс составляет 77% от контроля, а повышенное содержание УМФ хотя и снижается после введения перфторана, однако не доходит до контроля и на 47% превышает его уровень. Введение перфторана подопытным животным приводит к фазным изменениям активности 5/-нуклеотидазы и УМФ-азы, катализирующих распад АМФ и УМФ. Так, 17 после введения перфторана в митохондриях печени активность 5/-нуклеотидазы снижается почти на 40% по сравнению с группой животных не получавших лечения. Повышенная УМФ-азная активность в субклеточных фракциях печени после введения перфторана снижается более чем на 30% (митохондрии) и 80% (супернатант) и приближается к контрольным величинам. В то же время УМФ-азная активность в супернатанте леченых крыс остается достоверно высокой по сравнению с контролем. Введение перфторана способствует заметному ослаблению действия радиации и газоконденсатной смеси на все обнаруженные дисферментозы аденилового и уридилового нуклеотидного метаболизма. Так, у крыс, которым вводили перфторан, отмечается нормализация активности как прямой, так и обратной аденилаткиназной реакции по сравнению с животными, которым перфторан не вводили (рис. 5). рис.5. Влияние перфторана на активность аденилаткиназы в печени крыс после воздействия облучения и газоконденсата 50 40 30 20 % 10 0 -10 -20 аденилаткиназа прямая (митохондрии) контроль Нормализация аденилаткиназа прямая (супернатант) аденилаткиназа обратная аденилаткиназа обратная (митохондрии) (супернатант) облучение+отравление дисферментозов нуклеотидного коррекция перфтораном метаболизма в свою очередь способствует нормализации и восстановлению пула адениловых и уридиловых нуклеотидов печени подопытных крыс. Изменения в метаболизме нуклеотидов, направленные на восстановление их пула в печени пораженных животных посредством введения перфторана, служат познанию и раскрытию механизмов действия перфторана на метаболические реакции в условиях лучевого и токсического поражения. Полученные данные расширяют имеющиеся представления о механизмах сочетанного воздействия γизлучения и газового конденсата на организм, а также позволяют оценить эффективность перфторана в качестве средства направленной регуляции обмена веществ, что имеет 18 важное значение с практической точки зрения. Все это позволяет рекомендовать использование перфторана в комплексе терапевтических мероприятий, направленных на стабилизацию метаболизма при воздействиях на организм различных вредных экологических факторов внешней среды. Анализ проведенных исследований свидетельствует, что в патогенезе развития лучевого и токсического поражения существенную роль играют нарушения метаболизма и содержания нуклеотидов аденина и урацила. Введение перфторана способствует существенному ослаблению действия проникающей радиации и токсического действия газового конденсата. В частности, способствует улучшению клинической картины лучевой болезни, увеличивает сроки выживаемости облученных и отравленных крыс, усиливает репаративные механизмы восстановления клеточного состава периферической крови. В связи с изложенным, перфторан у которого открываются все новые и новые факты по влиянию на различные звенья метаболизма, можно рассматривать как средство, способное войти в комплекс мероприятий, направленных на улучшение метаболизма пораженного организма при критических состояниях. Подобная коррекция улучшает метаболизм, повышает содержание макроэргических нуклеотидов печени, что имеет важное значение в условиях лучевого и токсического поражения организма. Познание и истолкование ранних биохимических изменений в органах и тканях облученного и отравленного организма позволяет раскрыть патогенетические механизмы развития отягощенного лучевого поражения и теоретически обосновать эффективные методы противолучевой защиты. Наибольшие перспективы в этом плане открываются при изучении динамики биохимических процессов, их направленности, интенсивности и взаимосвязей. Благодаря комплексному изучению метаболизма нуклеотидов аденина и урацила на отдельных этапах развития лучевого и токсического эффекта, удается проследить судьбу этих нуклеотидов и оценить вклад отдельных ферментативных звеньев в изменениях содержания различных форм адениловых и уридиловых нуклеотидов. Четкая корреляция между активностью ферментов метаболизма нуклеотидов и их содержанием в печени подопытных животных обнаруживается не всегда. Это свидетельствует о том, что другие реакции использования адениловых и уридиловых нуклеотидов (при синтезе белков, липидов, нуклеиновых кислот, циклических нуклеотидов, гликогена, взаимопревращениях различных сахаров и т. д.) также играют важную роль для общей оценки аденилового и уридилового нуклеотидного фонда печени. Однако, в большинстве сроков исследования, изменения содержания отдельных 19 нуклеотидов печени после облучения и отравления газовым конденсатом, а также после введения перфторана, хорошо согласуются с изменениями активности исследуемых ферментов, что свидетельствует о ведущей роли данных каталитических систем в поддержании уровня нуклеотидов печени. Как известно, печень отличается высоким уровнем катаболизма АМФ и УМФ с участием 5'-нуклеотидазы и УМФ-азы [Потапенко Р.И., 2003; D.W. Bianchi, 2004]. В печени и в сыворотке крови экспериментальных животных АМФ и УМФ подвергаются преимущественно ферментативному дефосфорилированию. 5'- нуклеотидаза, катализируя распад адениловой кислоты, участвует в регуляции пула адениловых нуклеотидов и повышает аденилатный энергетический заряд клеток не только путем ускорения ресинтеза АТФ, но и путем уменьшения содержания одного из компонентов адениловой системы – АМФ, не имеющего макроэргической связи [С.В. Белов, 2003; Han Bao Fen et al., 2002]. УМФ-аза, катализируя распад УМФ – предшественника не только уридиловых нуклеотидов, но и всех нуклеотидов пиримидиновой группы [Ветютнев А.И.и др., 2007; V.J Glazko et al., 2009], участвует в регуляции биосинтеза и содержания указанных нуклеотидов в клетке. Следует отметить, что рост активности прямой аденилаткиназной реакции в совокупности с уменьшением концентрации АТФ, особенно после совместного воздействия радиации и газового конденсата, следует рассматривать как отрицательное последствие действия указанных вредных экологических факторов на организм пораженных животных. Поскольку уровень АТФ, АДФ и АМФ отражает баланс между реакциями, приводящими к их образованию и использованию, то для оценки полученных результатов необходимо учитывать ряд факторов, определяющих количество этих нуклеотидов в тканях. Снижение скорости катаболизма АМФ в результате падения активности 5'нуклеотидазы, усиленный расход АТФ в связи со значительным повышением интенсивности прямой аденилаткиназной реакции усугубляет нарушение обмена нуклеотидов и еще больше снижает уровень АТФ и величину аденилатного энергетического заряда в печени пораженных животных. Независимо от механизмов снижения пула нуклеотидов происходит значительное замедление реакций синтеза, в частности, снижается биосинтез РНК, белка и других соединений. Причем высокий пул нуклеотидов коррелирует с ускорением синтеза РНК и белка, а низкий – с угнетением процессов синтеза [К.П. Хансон и др., 2005; J.V. Tikhonov, 2003]. 20 Таким образом, проведенные исследования комплекса ферментов обмена нуклеотидов аденина и урацила позволили раскрыть ранее неизвестные механизмы изменений содержания этих нуклеотидов в печени крыс после сочетанного воздействия проникающей радиации и газового конденсата. Применение перфторана, прежде всего, было направлено на усиление компенсаторных и репаративных механизмов восстановления содержания нуклеотидов, на улучшение гематологических показателей и общего состояния облученных и отравленных животных. В этом плане обнаруженное нормализующее влияние введения перфторана на метаболизм нуклеотидов, положительное влияние на общее состояние экспериментальных животных, заслуживают внимания и убеждают в полезности и целесообразности применения перфторана для нормализации метаболических процессов в пораженном организме. Полученные данные позволяют предположить, что перфторан может играть достаточно эффективную роль в комплексе профилактических и лечебных мероприятий в клинике радиационно-токсических поражений. ВЫВОДЫ 1. Содержание адениловых нуклеотидов в печени интактных крыс существенно выше уридиловых; характерным является соотношение АТФ>АДФ>АМФ и УМФ>УТФ>УДФ. Печень характеризуется высокой активностью ферментов метаболизма нуклеотидов аденилаткиназы (прямой и обратной реакции), 5'-нуклеотидазы, УМФ-азы. Активность ферментов в митохондриях печени существенно выше, чем в супернатанте; активность прямой аденилаткиназы значительно выше, чем обратной реакции. 2. Воздействие γ-излучения и газоконденсата вызывает нарушения содержания адениловых и уридиловых нуклеотидов печени: снижается количество АДФ, УДФ и, особенно АТФ и УТФ. Содержание АМФ и УМФ в большинстве сроков исследования повышается. Наблюдаемые изменения содержания нуклеотидов в большинстве случаев коррелируют с изменениями активности исследуемых ферментов. 3. В субклеточных фракциях печени подопытных крыс происходят фазные изменения активности 5/-нуклеотидазы и УМФ-азы, катализирующих дефосфорилирование АМФ и УМФ, с преимущественным усилением активности в период разгара острой лучевой болезни и при сочетанном воздействии γ-излучения и газового конденсата. 4. Введение перфторана облученным и отравленным крысам повышает активность прямой и обратной аденилаткиназной реакции и тормозит активность 5/-нуклеотидазы и 21 УМФ-азы, способствуя повышению содержания адениловых и уридиловых нуклеотидов в печени подопытных животных. 5. Перфторан, способствующий нормализации содержания нуклеотидов печени, регенерации клеточного состава периферической крови, увеличению продолжительности жизни животных, можно рассматривать как средство, способное войти в комплекс мероприятий, направленных на улучшение метаболизма при радиационно-токсических поражениях организма. 6. Ранние изменения активности исследуемых ферментов в сыворотке крови подопытных животных (спустя 1 час - 1 сутки), могут сыграть роль индикаторов лучевого и токсического поражения и могут быть использованы в целях практической медицины. Список научных работ, опубликованных по теме диссертации 1. Исмаилова Ф.Э., Чудинов А.Н., Нагиев Э.Р. Исследование содержания нуклеотидов как важнейшее звено биоэнергетики организма // Труды международной научной конференции «Современные проблемы адаптации и биоразнообразия». – Махачкала: ИД «Наука плюс», 2006. – С. 158-160. 2. Нагиев Э.Р., Исмаилова Ф.Э., Нажмудинов Н.Г. Некоторые подходы к медикаментозной коррекции критических состояний // Труды международной научной конференции «Фармакология и фармакотерапия: достижения и перспективы».-Махачкала: ИПЦ ДГМА, 2006. – С. 256-258. 3. Нагиев Э.Р., Исмаилова Ф.Э. Биохимические и морфологические изменения печени и слизистой оболочки тонкой кишки при лучевом поражении // Материалы межвузовской научной конференции с международным участием «Фундаментальные проблемы морфологии. - Махачкала: ИД «Наука плюс», 2007. - С. 41-44. *4. Нагиев Э.Р., Исмаилова Ф.Э., Чудинов А.Н. Энергетический обмен при критических состояниях организма и его коррекция перфтораном // Экология промышленного производства. - 2007. - № 1. – С. 46-50. 5. Сейфаддинова М.С., Исмаилова Ф.Э. Гематологические показатели и продолжительность жизни крыс при воздействии γ-излучения и газоконденсата // Материалы международной научно-практической конференции «Научные и методологические проблемы современного биологического ресурсоведения». – Махачкала: ИПЦ ДГУ, 2008. – С. 91-93. *6. Нагиев Э.Р., Сейфаддинова М.С., Исмаилова Ф.Э. Катаболизм и реутилизация адениловых нуклеотидов в сыворотке крови крыс при остром отравлении газоконденсатом // Токсикологический вестник. – 2008. - № 1.- С. 13-16. *7. Исмаилова Ф.Э. Влияние экстремальных факторов на содержание нуклеозидтрифосфатов в печени крыс и коррекция перфтораном // «Вестник Российского государственного медицинского университета». – 2009. - № 3. – С. 32-33. 8. Исмаилова Ф.Э., Нагиева С.Э. Коррекция содержания АТФ и креатинфосфата при критических состояниях организма в эксперименте // III Международный молодежный 22 медицинский Конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения». – Санкт-Петербург. 2009. – С. 31-32. 9. Исмаилова Ф.Э. Коррекция перфтораном активности аденилаткиназы печени крыс после сочетанного воздействия гамма-излучения и газоконденсата // Материалы межрегиональной межвузовской научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Здоровье молодежи и сохранение трудового потенциала России». – Пермь: ГОУ ВПО ПГМА. - 2009. – С. 19-22. *10. Исмаилова Ф.Э., Нагиева С.Э. Исследование содержания адениловых нуклеотидов в тканях животных при воздействии вредных экологических факторов // «Вестник Российского государственного медицинского университета». – 2010. - № 2. – С. 495-496. 11. Исмаилова Ф.Э., Нагиев Э.Р. Влияние перфторана на показатели периферической крови при экспериментальной лучевой болезни // Материалы пятой научно-практической конференции фтизиатров Дагестана. – Махачкала: ИПЦ ДГМА, 2010. – С. 122-124. 12. Нагиев Э.Р., Исмаилова Ф.Э. Коррекция перфтораном содержания макроэргических полифосфатов печени при лучевой болезни // Материалы юбилейной научной конференции посвященной 50-летию организации Дагестанского научного медицинского общества терапевтов. – Махачкала: ИПЦ ДГМА, 2010. – С. 270-274. 13. Исмаилова Ф.Э., Нагиев Э.Р., Сейфаддинова М.С. Нуклеотидазная активность в печени и в сыворотке крови при отравлении крыс смесью углеводородов // Материалы Всероссийской конференции «Закономерности распространения, воспроизведения и адаптации животных». – Махачкала: ИПЦ ДГУ, 2010. – С. 298-300. *14. Нагиев Э.Р., Исмаилова Ф.Э., Дадашев М.Н. Обмен макроэргических фосфатов при критических состояниях организма // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. – 2011. - № 1. – С. 55-59. 15. Исмаилова Ф.Э. Исследование влияния газового конденсата Каспийского шельфа на биоэнергетику организма // Труды Всероссийского симпозиума, посвященного экологии Каспийского моря. – Махачкала: ИПЦ ДГТУ, 2011. – С. 305-307. * - работа опубликована в журнале, включенном ВАК в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий. Cписок используемых сокращений АТФ – АДФ – АМФ – УТФ – УДФ – УМФ – ЦТФ – 5/-НТ – УМФ-аза – НАДН+Н+ - аденозинтрифосфорная кислота аденозиндифосфорная кислота аденозинмонофосфорная кислота уридинтрифосфорная кислота уридиндифосфорная кислота уридинмонофосфорная кислота цитидинтрифосфорная кислота 5/-нуклеотидаза уридинмонофосфатаза восстановленный никотинамидадениндинуклеотид 23 Исмаилова Фариза Эйзудиновна СОДЕРЖАНИЕ НУКЛЕОТИДОВ АДЕНИНА И УРАЦИЛА В ПЕЧЕНИ КРЫС И ЕГО КОРРЕКЦИЯ ПЕРФТОРАНОМ ПРИ СОЧЕТАННОМ ВОЗДЕЙСТВИИ γ-ИЗЛУЧЕНИЯ И ГАЗОВОГО КОНДЕНСАТА 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Подписано в печать 21.03.11 Набор компьютерный. Гарнитура Times. Усл.п.л. 1,6. Тираж 100 экз. Заказ № 21 Отпечатано на копировально-множительной технике ИП Калашников, г. Краснодар, пр-т Чекистов, 22 [email protected] 24
