МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКИЙ
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ
УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ. Н.И.ПИРОГОВА
На правах рукописи
СТЕПАНОВА ДИНА СЕРГЕЕВНА
ПОИСК ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ ДЛЯ ТЕРАПИИ
НЕЙРОФИБРОМАТОЗА II ТИПА
14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор, чл.-корр. РАН
Н. Л. Шимановский
МОСКВА – 2015
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
Оглавление . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
Список сокращений . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
Глава I. Обзор литературы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
1.1 Общие представления о нейрофиброматозе II типа . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
1.2 Причины развития НФ II. NF2 – «нетипичный» онкосупрессор . . . . . . .
16
1.3 Продукт гена NF2 – белок мерлин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
1.3.1 Мерлин, или шванномин, – новый представитель семейства
Эзрин/Радиксин/Моэзин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
1. 3.2 Регуляция активности белка мерлин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20
1.3.3 Функции и локализация белка мерлин, взаимодействия с другими
белками . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
21
1.3.4 Роль белка мерлин в контактном торможении клеточного роста . . . .
22
1.3.5 Сигнальные пути с участием мерлина и его онкосупрессорная
функция . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
1.4 Современные подходы к поиску терапии для нейрофиброматоза II . . .
29
1.5 Злокачественная трансформация и изменения клеточного метаболизма
32
Глава II. Материалы и методы исследования . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
2.1 Культивирование клеточных линий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
2.2 Получение фибробластов, нокаутных по гену Nf2 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
38
2.3 Геномное типирование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
38
2.3 Определение уровня пролиферации и выживаемости клеток . . . . . . . . .
39
2.4 Скрининг коллекции низкомолекулярных биоактивных веществ . . . . .
39
2.5 Трансфекции . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
40
2.6 Реэкспрессия белка мерлин в клетках Nf2-отрицательной мышиной
шванномы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
40
2.7 Иммуноблоттинг . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
40
3
2.8 Количественная ПЦР (кПЦР) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
41
2.9 Измерение внутриклеточных уровней ацетил- и малонил-КоА . . . . . . .
42
2.10 Измерение флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) .
43
2.11 Исследования противоопухолевой активности препаратов на
ксенографтной модели НФ II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
43
2.12 Определение половинной ингибиторной концентрации (IC50) . . . . . . .
44
2.13 Статистический анализ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
44
Глава III. Результаты и обсуждение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
45
3.1.1 Получение фибробластов, нокаутных по гену Nf2 . . . . . . . . . . . . . . . . .
45
3.1.2 Влияние утраты белка мерлин на функциональные свойства клеток
MEF Nf2-/- . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
48
3.2 Скрининг коллекции низкомолекулярных биоактивных веществ . . . . .
57
3.3 Первичная валидация результатов скрининга . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
59
3.3.1 Изучение зависимости цитотоксического эффекта исследуемых
соединений от их концентрации и тестирование соединений-кандидатов
на клетках Nf2-отрицательных линий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
59
3.3.2 Тестирование фармакологических аналогов соединений, отобранных
по результатам скрининга . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
64
3.3.3 Реэкспрессия белка мерлин в клетках линии Nf2-отрицательной
шванномы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
68
3.4 Исследование механизма действия ловастатина в отношении Nf2отрицательных клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
72
3.4.1 Эксперименты по снижению цитотоксичности статинов . . . . . . . . . . .
72
3.4.2 Истощение внутриклеточного пула геранилгераниола – ключевого
звена селективной токсичности статинов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
74
3.4.3 Аактивация Rac1, сопровождающаяся нарушением её
геранилирования и клеточной гибелью . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
77
3.4.4 Транслокация Rac1 в ядро под действием статинов . . . . . . . . . . . . . . .
80
3.5 Ингибиторы синтазы жирных кислот (FASN) как потенциальные
83
4
препараты для фармакотерапии НФ II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.5.1 Сходство эффектов от нокдауна гена Fasn и действия церуленина
на Nf2-отрицательные клетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
84
3.5.2 Эксперименты по снижению цитотоксического действия церуленина
87
3.5.3 Различия внутриклеточных уровней ацетил-коА и малонил-коА в
клетках линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2flox/flox . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
93
3.5.4 Повышенный уровень синтеза жирных кислот в Nf2-отрицательных
клетках . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
95
3.6 Эксперименты по изучению противоопухолевой активности
ловастатина, золендроновой кислоты и церуленина в ксенографтной
модели НФII на мышах . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
Заключение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
Выводы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
111
Практические рекомендации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
Блигодарности . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
Список литературы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
5
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
НФ II – нейрофиброматоз второго типа
РАК – р21-активируемые киназы
RAC – RAS-related C3 botulinum toxin substrate (родственный антигену крысиной
саркомы субстрат ботулинического токсина С3)
HRS – HGF-regulated kinase substrate (субстрат киназы, регулируемой
гепатоцеллюлярным фактором роста)
MTOR – mammalian target of rapamycin, белок-мишень рапамицина
млекопитающих
ЛВ – лекарственные вещества
ЦНС – центральная нервная система
ПНС – периферическая нервная система
ВШ – вестибулярная шваннома
Rb – retinoblastoma protein (ретинобластомный белок)
RAS – rat sarcoma, онкоген крысиной саркомы
ERM – семейство эзрин-радиксин-моэзин
RHO – RAS homolog gene family, семейство гомологов RAS
ПКА – протеинкиназа А
PIP – фосфатидилинозитолфосфат
MYPT – миозинфосфатаза
CPI 17 – малый белок-ингибитор фосфатаз, регулируемый протеинкиназой С, с
молекулярной массой 17 kDa
ERK – extracellular signal-regulated kinases, киназы, регулируемые внеклеточной
сигнализацией
CDK4 – cyclin-dependent kinase 4 (циклин-зависимая киназа 4)
PI3K – киназа фосфатидилинозитола-3-фосфата
AKT – v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1 (гомолог онкогена вирусной
мышиной тимомы v-akt), протеинкиназа В
6
ERBB – V-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog, гомолог
онкогена вирусной эритробластной лейкемии птиц
RTK – рецепторные тирозин-киназы
STAT – signal transducers and activators of transcription, передатчики сигнала и
активаторы транскрипции
STAM – signal transducing activator molecule, молекула-активатор передачи
сигнала
CRL4 – cullin-RING ubiquitin ligase 4, убиквитинлигаза, содержащая куллин и
цинковый палец, 4
PDGFR – platelet-derived growth factor receptor, рецептор тромбоцитарного
фактора роста
EGFR – epithelial growth factor receptor, рецептор эпителиального фактора роста
VEGFR – vascular endothelial growth factor receptor, рецептор эндотелиального
фактора роста
MEK – mitogen-activated kinases, митоген-активируемые киназы
RAF – v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog, гомолог онкогена вирусной
саркомы мышей
DCAF – DDB1 CUL4 associated factor, фактор, ассоциированный с CRL4убиквитинлигазой
ЭР – рецепторы эстрогена
CD20 – В-лимфоцитарный поверхностный антиген кластера дифференцировки 20
ЛДГА – лактатдегидрогеназа
ПДК – киназа пируватдегидрогиназы
FASN – fatty acid synthase, синтаза жирных кислот
DMEM – Dulbecco’s minimal essential medium, модифицированная по Дульбекко
среда Игла
MEF – mouse embryo fibroblasts, мышиные эмбриональные фибробласты
GFP – green fluorescent protein, зелёный флуоресцентный белок
CFP – cyan fluorescent protein, голубой флуоресцентный белок
YFP – yellow fluorescent protein, жёлтый флуоресцентный белок
7
дНТФ – динуклеотидтрифосфаты
ДМСО – диметилсульфоксид
FDR – false discovery rate, доля ложноположительных отклонений
миРНК – малые интерферирующие РНК
ПХ – пероксидаза хрена
ЩФ – щелочная фосфатаза
ПЦР – полимеразная цепная реакция
Fasn – ген синтазы жирных кислот
Acc – ацетил-коА карбоксилаза
Acaca – ген ацетил-коА карбоксилазы 1
Асaсb – ген Acc2
Lpin1 – ген Lipin1
Acl – АТФ-цитратлиаза
Acly – ген АТФ-цитратлиазы
Acecs1 – ацетил-коА синтетаза
Acss2 – ген ацетил-коА синтетазы
Acsl1 – long fatty acid acyl-coA ligase, лигаза длинноцепочечных жирных ацил-коА
Acsl1 – ген лигазы длинноцепочечных жирных ацил-коА
Srbp1 – ген стерольного регуляторного элемента Srebp1
Cpt1c – ген карнитилпальмитоилтрансферазы Iγ
Cpt2 – ген карнитилпальмитоилтрансферазы II
ТФЭ – твердофазная экстракция
УВЭЖХ-МС – ультравысокоэффективная жидкостная хроматография с массспектрометрией
FRET – fluorescence resonance energy transfer, резонансный перенос энергии
флуоресценции
PBD – p21-связывающий домен
IC50 – половинная ингибиторная концентрация
Bcl-2 – B-cell leukemia/lymphoma 2, белок В-клеточной лейкемии/лимфомы 2
8
Bcl-XL – B-cell leukemia/lymphoma XL, белок В-клеточной лейкемии/лимфомы
XL
Bad – Bcl2-associated agonist of cell death, ассоциированный с Bcl2 агонист
клеточной гибели
ГМГ-коА – 3-гидрокси-3метилглутарил коэнзим А
SIRT1 – протеиндеацетилаза Sirtuin1
GT I – геранилтрансфераза I
ТОФК – 5-тетрадецилокси-2-фуроевая кислота
9
Актуальность темы исследования и новизна работы
Нейрофиброматоз
второго
типа
(НФ
II)
–
аутосомно-доминантное
наследственное заболевание, характеризующееся образованием множественных
доброкачественных
опухолей,
преимущественно
шванном
и
менингиом,
локализующихся в центральной нервной системе и по ходу периферических
нервов
[1].
Несмотря
на
доброкачественную
природу
новообразований,
заболевание часто приводит к летальному исходу вследствие формирования
внутричерепных неоперабельных опухолей, нарушающих функции мозга.
Медикаментозного лечения этой болезни не существует, более того, пациенты
вынуждены подвергаться многократным хирургическим вмешательствам по
удалению опухолей, что рано или поздно приводит к глухоте и слепоте.
Развитие заболевания связано с повреждением гена NF2 [1, 2]. С мутациями
в этом гене связано как образование спорадических шванном и менингиом по
всему телу, так и развитие опухолей, на первый взгляд не связанных с
нейрофиброматозом, например, злокачественных мезотелиом.
NF2 проявляет себя как онкосупрессор, для его инактивации необходимо
выключение обоих аллелей. Это предположение было сделано после того, как
исследования показали, что пациенты с нейрофиброматозом II гетерозиготны по
NF2, а в клетках опухолей, развивающихся у этих пациентов, обнаруживается
биаллельное выключение NF2 [3].
Продукт гена NF2 – мерлин – гомологичен белкам эзрин-радиксинмоэзинового семейства, отвечающим за взаимодействие компонентов цитоскелета
и клеточной мембраны [4]. Доказано, что мерлин взаимодействует с белками
клеточной поверхности, белками, отвечающими за динамику цитоскелета, и
белками, участвующими в ионном транспорте. В норме мерлин регулирует как
пролиферацию, так и обусловленное актином движение клетки. Клетки,
утратившие ген NF2, неспособны образовывать стабильные клеточные контакты.
Известно, что клетки, нокаутные по гену NF2, не испытывают контактного
торможения клеточного роста, и, напротив, оверэкспрессия мерлина приводит к
10
угнетению пролиферации [5]. Не вполне ясно, каким образом мерлин регулирует
клеточный рост, однако недавние исследования показали, что основными его
мишенями являются р-21-активируемые киназы (РАК). В норме мерлин
ингибирует р-21-активируемые киназы, а его утрата приводит к избыточной
активации р-21-активируемых киназ с последующим запуском сигнальных путей,
отвечающих за усиленный клеточный рост. Тем не менее, доподлинно
неизвестно, насколько велик вклад активации р-21-активируемых киназ в
изменения клеточного роста в NF2-/- клетках.
Мерлин участвует в регуляции множества сигнальных путей, включая
активацию малых гуанозинтрифосфатаз (ГТФаз) семейства rat sarcoma-related C3
botulinum toxin substrate (RAC), взаимодействие с поверхностным антигеном
кластера дифференцировки 44 (CD44), белком HRS (HGF-regulated kinase
substrate, субстрат киназы, регулируемой гепатоцитарным фактором роста),
комплексом MTOR (mammalian target of rapamycin, белок-мишень рапамицина
млекопитающих), фактором регуляции натрий-протонного обмена, спектрином
βII и многими другими, однако функции мерлина до сих пор не ясны, а
взаимодействия не изучены.
До сих пор не существует фармакотерапии нейрофиброматоза II типа.
Пациенты
вынуждены
подвергаться
многократным
хирургическим
вмешательствам, что снижает качество и продолжительность жизни. Таким
образом, поиск лекарственнх веществ (ЛВ) для лечения нейрофиброматоза II типа
является чрезвычайно актуальной задачей. Традиционный подход к решению этой
задачи
заключался
в
испытании
зарегистрированных
противоопухолевых
препаратов на пациентах с нейрофиброматоза II типа и пока не привел к
положительнрым результатам [6, 7]. Мы опробовали качественно иное решение
задачи,
а
именно,
провели
скрининг
коллекции
биологически-активных
соединений, относящихся к различным классам лекарственных веществ.
11
Цель исследования
Целью данной работы является поиск кандидатов для фармакотерапии
нейрофиброматоза второго типа при помощи химического скрининга.
Задачи:
1) Модифицировать имеющуюся клеточную линию с высоким уровнем
экспрессии Nf2, добиваясь нокаута Nf2.
2) Охарактеризовать полученную линию и сравнить ее с исходной –
изогенной – линией, используя следующие критерии:
a морфологию
b кривые роста
c устойчивость клеток к истощению среды
d устойчивость клеток к действию цитотоксических агентов.
3) Сравнить действие некоторых известных биологически активных
молекул на изогенные Nf2-отрицательные и Nf2-положительные линии с целью
определения веществ, избирательно действующих на NF2-/- клетки с помощью
химического скрининга.
a провести скрининг коллекции низкомолекулярных биоактивных
соединений (оценить соотношение выживаемости Nf2-отрицательных и Nf2положительных клеток в присутствии исследуемых соединений)
b валидировать результаты скрининга:
• изучить зависимости концентрация/эффект для отобранных в
скрининге соединений
• протестировать соединения-кандидаты на различных Nf2отрицательных линиях
• оценить
влияние
реэкспрессии
белка
мерлин
в
Nf2-
отрицательных клетках на эффект исследуемых веществ.
• протестировать
фармакологические
отобранных по результатам скрининга.
аналоги
веществ,
12
4) Определить механизм действия веществ-кандидатов, найденных в
результате скрининга.
5) Проверить эффективность отобранных кандидатов in vivo.
Научная новизна работы
Работа содержит новые данные о селективных в отношении Nf2отрицательных
клеток
ЛВ.
Показана
селективность
ингибитора
3-
гидроксиметилглутарил-коА редуктазы ловастатина и ингибитора синтазы
жирных кислот церуленина в отношении Nf2-отрицательных клеток и описан
механизм селективности действия данных соединений. Работа содержит новые
данные о роли активации цитоплазматической фракции малой ГТФазы Rac1 в
запуске клеточной гибели. Ранее были подробно описаны функции мембранной
фракции Rac1, играющей важную роль в направленном движении клетки. Однако,
есть лишь одна статья, демонстрирующая роль активированной Rac1 в
цитоплазме [8]. В данной работе показано, что гиполипидемические препараты
группы статинов, вызывая истощение внутриклеточного пула геранил-гераниола,
переводят Rac1 из мембранной фракции в цитоплазматическую, а также,
селективно активируют Rac1 в Nf2-отрицательных клетках, вызывая их гибель.
Мы
впервые
описали
синергизм
между
статинами
и
ингибитором
геранилтрансферазы I.
Работа содержит данные о роли белка мерлин в регуляции метаболизма
жирных кислот. Известно, что мерлин является одновременно онкосупрессором и
регулятором актинового цитоскелета. Помимо стабилизации клеточных контактов
организации актинового цитоскелета, мерлин отвечает за контактное торможение
роста. Однако до сих пор не была показана связь белка мерлин с метаболическим
сдвигом. Мы впервые показали, что скорость основных метаболических путей
существенно
повышена
в
Nf2-отрицательных
клетках
по
сравнению
с
нормальными. В данной работе выявлены особенности метаболического сдвига в
13
Nf2-отрицательных клетках, и установлено, что благодаря этим особенностям
ингибиторы синтазы жирных кислот, в частности, церуленин, обладают
селективностью в отношении Nf2-отрицательных клеток.
Впервые предложены два возможных подхода к лечению НФ II:
ингибирование 3-гидрокси-3-метилглутарил-коА редуктазы препаратами группы
статинов и геранилтрансферазы I золедроновой кислотой; и ингибирование
синтазы жирных кислот церуленином.
Практическая значимость диссертации
При отсутствии терапевтических средств для лечения НФ II в настоящее
время активно ведется поиск и изучение ферментных каскадов, которые могут
быть нарушены в результате утраты мерлина. В данной работе были обнаружены
существенные изменения метаболического профиля Nf2-отрицательных клеток, а
также, доказана необходимость нормального геранилирования ГТФазы Rac1 для
выживания Nf2-отрицательных клеток. Таким образом, результаты работы
позволяют рассматривать ингибиторы геранилтрансферазы I, 3-гидрокси-3метилглутарил-коА редуктазы и синтазы жирных кислот в качестве новых
потенциальных фармакологических веществ в лечении НФ II.
Апробация результатов диссертационной работы
Результаты работы были представлены на международных конференциях:
“Cell Symposia: Systems Approach to Metabolic Diseases” (Чикаго, США, 2014),
“The NF Conference 2013”, (Монтеррей Бэй, США, 2013), “18th Annual Postdoctoral
and Graduate Student Conference” (Филадельфия, США, 2013), “The NF Conference
2011” (Джексон Хол, США 2011), “17th Annual Postdoctoral and Graduate Student
Conference” (Филадельфия, США, 2011).
14
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Общие представления о нейрофиброматозе II типа
Нейрофиброматоз
второго
типа
(НФII)
–
аутосомно-доминантное
наследственное заболевание, характеризующееся образованием множественных
доброкачественных
опухолей,
преимущественно
шванном
и
менингиом,
локализующихся в центральной нервной системе и по ходу периферических
нервов. Заболевание встречается с частотой примерно 1 на 33 – 40 тысяч [1]. НФII
развивается при возникновении инактивирующих мутаций в онкосупрессорном
гене NF2 [5]. Клинически заболевание проявляется формированием опухолей
центральной нервной системы (ЦНС): вестибулярных шванном, внутричерепных
менингиом, опухолей спинного мозга и его оболочек, эпендимом, глиом; и
опухолей периферической нервной системы (ПНС) (рис. 1 – 3) [2, 9].
НФ
II
не
обязательно
сопровождается образованием фибром.
Нейрофибромы скорее характерны для
нейрофиброматоза I типа, при котором
им обязательно сопутствуют пятна
цвета кофе с молоком. При НФ II пятна
«кофе-с-молоком» встречаются у 2%
Рисунок 1 «Фибромы при НФ II»
пациентов, что необходимо учитывать
при диагностике.
15
Рисунок 2 «Множественные менингиомы при
НФ II»
Образование
менингиом
множественных
(обозначены
красными
стрелками) типично для пациентов с НФ II.
У 60% пациентов с НФ II обнаруживается
хотя бы одна менингиома.
Рисунок 3
«Двусторонняя
вестибулярная шваннома»
Шванномы VIII пары черепно-мозговых
нервов обозначены красными стрелками.
Белой
стрелкой
Симметричное
обоих
обозначена
образование
нервах
VIII
менингиома.
шванном
пары
на
является
патогномоничным признаком НФ II.
Заболевание также всегда сопровождается аномалиями развития хрусталика
[1, 10, 11], и сетчатки [10]. Патогномоничным признаком нейрофиброматоза II
является развитие двусторонней вестибулярной шванномы (ВШ) – опухоли,
растущей из шванновой оболочки черепных нервов VIII пары – причём
билатеральную ВШ обнаруживают у 85% пациентов с НФ II [11-13]. Увеличение
опухоли приводит к развитию сенситивной атаксии и глухоты. Односторонняя
ВШ встречается у 5% пациентов [12]. У 60% пациентов обнаруживают как
минимум одну внутричерепную или спинальную менингиому [14]. Эпендимомы
обнаруживают в 5% случаев НФ II [12-15]. У 2% пациентов обнаруживают
пигментацию по типу пятен цвета «кофе с молоком» – характерный симптом
нейрофиброматоза I типа (болезни Реклингаузена), что вносит путаницу при
постановке
диагноза
[12-15].
Несмотря
на
доброкачественную
природу
новообразований, заболевание часто приводит к летальному исходу вследствие
16
формирования внутричерепных неоперабельных опухолей, нарушающих функции
мозга. Медикаментозного лечения этой болезни не существует, более того,
пациенты
вынуждены
подвергаться
многократным
хирургическим
вмешательствам по удалению опухолей, что рано или поздно приводит к глухоте
и слепоте.
Причины развития НФ II. NF2 – «нетипичный» онкосупрессор
Развитие заболевания связано с повреждением гена NF2 [1, 2]. Мутации в
этом гене вызывают как образование спорадических шванном и менингиом по
всему телу, так и развитие опухолей, на первый взгляд не связанных с
нейрофиброматозом, например, злокачественных мезотелиом.
Медицинские генетики относят НФ II к заболеваниям, наследуемым
аутосомно-доминантным путем [1, 11]. Действительно, пациенты с НФ II
гетерозиготны по гену NF2 и получают мутантный аллель от одного из родителей
[16], однако для развития заболевания необходимо инактивирующее повреждение
второго – нормального – аллеля, что соответствует механизму двухступенчатой
инактивации Кнудсона [17]. Гомозиготы по мутантному NF2 погибают на
доэмбриональной стадии развития до начала гаструляции [16, 18].
Высокий уровень экспрессии NF2 наблюдается в эмбриональном периоде;
во взрослых организмах ген активен в шванновских клетках, клетках оболочек
мозга, эпендимоцитах и эпителиоцитах хрусталика [19]. В спорадических
шванномах и менингиомах в большинстве случаев обнаруживаются мутации в
гене NF2 [20, 21], что доказывает, что инактивация этого гена ведет к
неопластическому перерождению шванновских и лептоменингеальных клеток in
vivo. Исследования позволяют предположить, что онкосупрессорная функция NF2
очень значительна: в 1999 г. Cheng et al. показал, что большая часть мезотелиом,
вызванных асбестовой пылью, несут мутации в гене NF2 [3], также Fleury-Feith et
al., 2003, показал, что у мышей, гетерозиготных по Nf2, при воздействии асбеста
возникают
злокачественные
мезотелиомы,
характеризующиеся
потерей
17
гетерозиготности [22]. Более того, мутации или утрата NF2 наблюдаются в
некоторых случаях меланомы, тироидной карциномы, гепатоцелюллярной
карциномы и опухолей влагалищ периферических нервов [2, 23-25]. Мыши,
гетерозиготные по Nf2, склонны к образованию остеосарком, фибросарком и
гепатоцелюллярных карцином [12]. И наоборот, восстановление экспрессии Nf2 в
опухолевых клетках тормозит или даже останавливает развитие опухоли [26].
Оверэкспрессия данного гена в нормальных клетках приводит к остановке
клеточного цикла в G1 фазе [26].
Определение генетического дефекта, вызывающего развитие НФ II,
неожиданно показало, что онкосупрессором в данном случае является белоккомпонент цитоскелета [4, 27]. До этого момента были известны «классические»
онкосупрессоры, как, например, p53 и ретинобластомный белок Rb, находящиеся в ядре и непосредственно контролирующие клеточный цикл [28].
Также, был описан ген NF1, негативно регулирующий промитотический
сигнальный путь от RAS (rat sarcoma, онкогена крысиной саркомы) [28]. Однако
продукт гена NF2, мерлин, или шванномин, как оказалось, не имеет
каталитических
или
ДНК-связывающих
участков,
но
обнаруживает
существенную гомологию с белками моэзин-эзрин-радиксинового семейства [16].
Продукт гена NF2 – белок мерлин.
Мерлин, или шванномин, – новый представитель семейства
Эзрин/Радиксин/Моэзин
Белки
этого
семейства
обеспечивают
взаимодействие
компонентов
актинового цитоскелета с цитоплазматической мембраной. До открытия мерлина
считалось, что семейство образовано тремя отчетливо сходными (по сиквенсу)
белками, которые впервые были выделены и затем исследованы Bretscher et al. в
1983-89 [29]. Эзрин (цитовиллин или p81) впервые выделили из микроворсинок
18
энтероцитов тонкого кишечника; в этих клетках он играет роль линкера между
плазматической
мембраной
и
актиновыми
филаментами.
Радиксин
-
актиномодулирующий белок, впервые выделенный из фракции межклеточных
контактов (присутствует в опоясывающих десмосомах [30], а также десмосомах,
присутствующих в кольце деления клеток животных). Моэзин - с одной стороны
выявляется в филоподиях, а с другой - будучи встроенным в плазматическую
мембрану выполняет функции одного из рецепторов гепараната, т.е. является
гепарин-связывающим белком.
У белков этого семейства наиболее консервативным является NH2концевой участок; степень гомологии - приблизительно 80% (рис. 4).
Рисунок 4 «Гомология белков эзрин-радиксин-моэзинового семейства»
В связи с очень высокой степенью гомологии этих белков их
идентификация в клетке с помощью иммуноцитохимических методов была
затруднена, однако в последнее время удалось надежно показать, что каждый из
этих белков имеет в клетке вполне определенную локализацию, а также и то, что
они все выступают как интегральные мембранные белки и играют существенную
роль в ассоциации между актиновыми филаментами и плазматической
19
мембраной. Кроме того, они играют определенную роль во взаимодействиях
"клетка-клетка" и участвуют в структуризации сайтов адгезии.
Продукт гена NF2 – мерлин – стал четвертым членом эзрин-радиксинмоэзинового семейства, предположительно, отвечающим за взаимодействие
компонентов цитоскелета и клеточной мембраны. Как и другие белки этого
семейства, он содержит высоко консервативный N-концевой FERM-домен, за
которым следует суперспирализованный участок [4, 27]. У мерлина, в отличие от
других представителей ERM-семейства, на С-конце нет актин-связывающей
последовательности [16]. Предположительно, белки ERM-семейства существуют
в двух конформациях: закрытой (неактивной) и открытой, обеспечивающей
взаимодействие
определенных
плазматических
рецепторов
с
актиновым
цитоскелетом и регулирующей сигнализацию RHO-ГТФаз [16, 29, 31].
Фосфорилирование высококонсервативных сериновых остатков на С-конце и
связывание фосфатидилинозитол(4,5)-бифосфата с FERM-доменом нарушают
внутримолекулярные взаимодействия и переводят белки ERM-семейства из
закрытой конформации в открытую [29]. Однако мерлин, находясь в открытой,
фосфорилированной, конформации, способен образовывать гетеродимеры с
другими членами семейства, а его закрытая форма участвует в подавлении
пролиферации и, следовательно, должна считаться активной. Таким образом,
мерлин ведет себя противоположно другим членам ERM-семейства [32].
Активация мерлина связана с дефосфорилированием серина Ser518 на С-конце
молекулы [16]. Повышение уровня дефосфорилированного мерлина наблюдается
в клетках, испытывающих контактное торможение роста, при откреплении клеток
от субстрата, в отсутствие факторов роста или при контакте клеток с
гиалуроновой кислотой [33, 34], что доказывает, что мерлин собирает сигналы от
множества различных ингибиторов роста.
20
Регуляция активности белка мерлин
Как уже было сказано выше, ключевым в регуляции активности мерлина
является серин Ser518. Его фосфорилирование вызывает резкое увеличение
подвижности молекулы и переход закрытой конформации в открытую [35-38], что
подавляет
супрессорную
функцию
мерлина
[34].
Наиболее
изучено
фосфорилирование мерлина под влиянием малой ГТФазы Rac1 [36]. Посредником
Rac-обусловленного фосфорилирования мерлина являются эффекторы Rac – р21активируемые киназы (Pak) – семейство серин-треониновых киназ, активируемых
членом семейства малых ГТФаз – белком р21 [35, 37]
Существует также Pak-независимый путь фосфорилирования мерлина под
влиянием протеинкиназы А (ПКА) [39]. Однако практически ничего не известно о
фосфорилировании мерлина по другим аминокислотным остаткам. На N-конце
молекулы инактивацию мерлина осуществляет фосфатидилинозитолбифосфат
(PIP2), который связывается с высококонсервативными PIP2-связывающими
сайтами [40].
Наиболее изученным активирующим воздействием на мерлин является его
взаимодействие с миозин-фосфатазой MYPT1–PP1δ [41], которая способна
дефосфорилировать Ser518 мерлина, тем самым вызывая его переход в активную
закрытую конформацию. Миозин-фосфатаза MYPT1–PP1δ состоит из двух
субъединиц: посадочной MYPT1, которая связывается с ближней к N-концу
частью суперспирали мерлина, и киназной PP1δ [16]. В 2007 г. Ahronowitz et al.
показал, что миссенс-мутация NF2, обнаруживаемая в клетках спорадических
менингиом (L339F) препятствует связыванию MYPT1–PP1δ с мерлином, что,
возможно,
свидетельствует
о
необходимости
этого
взаимодействия
для
онкосупрессорной активности мерлина[17]. Это предположение подтверждается и
тем фактом, что CPI-17, малый белок (17 kDa) – ингибитор фосфатаз,
регулируемый протеинкиназой С, вызывает неопластическую трансформацию
клеток in vitro в результате инактивации мерлина [41]. Повышение уровня CPI-17
21
в клетках панкреокарциномы и меланомы увеличивает способность этих клеток к
опухолеобразованию in vivo [16]. Индуцированная экспрессия мерлина в
мышиных
эмбриональных
фибробластах
NIH3T3
ингибирует
мерлин
и
активирует промитотический сигнальный путь RAS-ERK, в результате чего такие
клетки приобретают способность расти в полужидком агаре и образовывать
опухоли при подсадке бестимусным мышам [16]. Подобный же эффект оказывает
аномальная активация РАК [16] – серин-треониновых неспецифических киназ,
участвующих в организации актинового цитоскелета, и регулируемых белком р21
– представителем суперсемейства малых ГТФаз. Мутантная форма РАК с
постоянной активностью нарушает контактное торможение роста в нормальных
эндотелиальных клетках, поскольку фосфорилирует и, следовательно, ингибирует
мерлин [42]. Также РАК способны фосфорилировать CPI-17 in vitro [43]. Если
этот механизм работает in vivo, то РАК способны ингибировать MYPT1, а
следовательно, и инактивировать мерлин.
Функции и локализация белка мерлин, взаимодействия с другими белками
Визуализация мерлина представляет определенные трудности в связи с
низким уровнем эндогенного белка в большинстве клеток. Однако функции белка
тесно связаны с его локализацией в клетке, поэтому многие исследователи
предприняли
попытки
описать
распределение
экзогенного,
оверэкспрессированного мерлина, несмотря на то, что такой подход может не
вполне точно отражать реальную картину. Тем не менее, эти работы подтвердили
гипотетические представления о мерлине как о белке, связывающем актиновый
цитоскелет и клеточную мембрану. Мерлин скапливается в области плотных
контактов, где он колокализован с моэзином [29]. В культуре клеток
млекопитающих эндогенный и экзогенный мерлин сконцентрирован в участках
клетки
с
наибольшей
плотностью
актиновых
структур,
как,
например,
складчатость мембраны или опоясывающие десмосомы [5, 31, 44] Известно, что
клетки, утратившие ген NF2, перестают испытывать контактное торможение
22
роста [5], что согласуется с локализацией мерлина в области плотных контактов и
подтверждает его участие в контроле пролиферации и контактном торможении
роста. Снижение экспрессии NF2 ведет к возникновению дефектных кадгеринопосредованных клеточных контактов [5]. Все эти исследования подтверждают
взаимодействие мерлина с актиновым цитоскелетом, несмотря на отсутствие у
этого белка актин-связывающего участка на С-конце. Действительно, в 2001 г.
было показано, что актин связывается с N-концевым доменом мерлина [45, 46].
Также взаимодействие мерлина с актиновым цитоскелетом может осуществляться
с помощью промежуточных белков – спектрина, паксиллина или белков ERMсемейства [47-51]. Еще одним доказательством служат существенные изменения
кортикального актинового скелета в шванновских клетках и кератиноцитах,
дефектных по NF2 [5, 52]. Значительные дефекты актинового цитоскелета
наблюдаются в клетках всех опухолей, возникающих при НФ II [53].
Помимо
участия
в
перестройке
актинового
цитоскелета,
мерлин,
повидимому, связан и с движением клетки, обеспечиваемым актиновыми
волокнами. У мышей с направленными мутациями в гене Nf2 развиваются
злокачественные
опухоли,
обладающие
высокой
способностью
к
метастазированию [53].
Роль белка мерлин в контактном торможении клеточного роста
Известно, что клетки, нокаутные по гену NF2, не испытывают контактного
торможения клеточного роста [5, 33, 54]. Неконтролируемый рост – это наиболее
заметное и совершенно очевидное последствие утраты мерлина в любых клетках
[5]. Не вполне ясно, каким образом мерлин регулирует клеточный рост. Одним из
возможных механизмов является его взаимодействие с кадгеринами в области
клеточных
контактов.
Мерлин
связывается
с
Е-кадгерин-β-катениновым
комплексом и таким образом накапливается в области плотных контактов в
фибробластах и кератиноцитах [5] (рис. 5).
Рисунок 5 «Колокализация мерлина и b-катенина в области десмосом»
23
Недавно в исследованиях на дрозофиле было показано, что мерлин
действует совместно с еще одним FERM-содержащим белком, Expanded [55, 56].
Expanded ингибируется белком Fat, предшественником кадгерина [57], который
связывает Expanded и удерживает его на плазматической мембране [16]. Таким
образом,
кадгерины
и
прокадгерины
предположительно
контролируют
локализацию мерлина и Expanded в области плотных контактов. Будучи
закрепленным на десмосомах, мерлин стабилизирует эти структуры, локально
подавляя сигнализацию от RAC [5, 16] (рис. 6).
Рисунок 6 «Мерлин и сигнальный путь Хиппо (WNT) у дрозофилы и
млекопитающих»
24
Еще одним потенциальным механизмом торможения роста является
взаимодействие мерлина с рецептором гиалуроновой кислоты CD44 [33]. Мерлин,
подобно
остальным
членам
ERM-семейства,
способен
связываться
с
цитоплазматическим доменом CD44. Предположительно, мерлин, находясь в
открытой конформации, образует с остальными белками ERM-семейства
гетерогенные комплексы, являющиеся митогенами. В клетках, достигших
конфлуэнтности, или контактирующих с гиалуроновой кислотой, мерлин выходит
из состава комплекса, связывается с CD44 и ингибирует клеточный рост [33].
Однако утрата CD44 не оказывает такого же эффекта, как потеря мерлина, на
фибробласты, достигшие монослоя, из чего следует, что CD44 не являтся
необходимым звеном контактного торможения роста [5].
Недавние исследования показали, что р-21-активируемые киназы (РАК) не
только играют важную роль в регуляции мерлина, но и являются его основными
мишенями. В норме мерлин ингибирует РАК, а его утрата приводит к избыточной
активации РАК с последующим запуском сигнальных путей, отвечающих за
усиленный клеточный рост (рис. 5). Тем не менее, доподлинно неизвестно,
насколько велик вклад активации РАК в изменения клеточного роста в NF2клетках [58].
Рисунок 7 «Взаимодействие белка мерлин с p21-активируемыми киназами»
25
Механизмы контактного торможения роста не вполне ясны, но, повидимому, межклеточные взаимодействия и клеточные контакты вносят
существенный вклад в рост и распространение опухоли в NF2-дефектном
организме [59].
Cигнальные пути с участием мерлина и его онкосупрессорная функция
Мерлин участвует в регуляции множества сигнальных путей, включая
активацию Rac, взаимодействие с CD44, HRS (HGF-regulated kinase substrate,
субстрат тирозин-киназы, регулируемой фактором роста гепатоцитов), фактором
регуляции натрий-протонного обмена, спектрином βII и многими другими,
однако, функции мерлина до сих пор не ясны [58]. Были проведены исследования,
в которых в опухолевых клетках, дефектных по гену NF2, восстанавливалась
экспрессия мерлина посредством аденовирусной инфекции гена. В результате
клетки останавливались в G1-фазе клеточного цикла, что сопровождалось
снижением
экспрессии
циклина
D1,
ингибированием
CDK4
и
дефосфорилированием ретинобластомного белка (pRB) [53]. И наоборот,
выключение при помощи РНК-интерференции NF2 в нормальных клетках
приводило к повышению уровня циклина D1 и инициировало переход в S-фазу.
Возможно, эксперименты с выключением экспрессии циклина D1 помогут
объяснить влияние мерлина на пролиферацию, однако пока не ясно, какие
посредники обеспечивают взаимодействие мерлина и циклина D1 [53].
Одними из ключевых эффекторов мерлина являются малые ГТФазы
семейства RAC (Ras-related C3 botulinum toxin substrate) [60, 61]. Роль активации
RAC в канцерогенезе хорошо изучена [62-64]. Активирующие мутации в генах
RAC обнаружены в клетках меланомы [65-67], немелкоклеточного рака лёгких
[68, 69], рака печени [70] и метастазирующего рака молочной железы [71, 72].
Основными
клеточными
эффектами
RAC
являются
усиление
интегрин-
опосредованного движения и, как следствие, активация пролиферативного
26
каскада PI3K – AKT [73], что обусловливает инвазивность RAC-зависимых
опухолей.
При помощи коиммунопреципитации было выявлено множество белков,
взаимодействующих с мерлином. Большинство из них входит в состав
комплексов молекул адгезии с рецепторами факторов роста или участвует в
везикулярном транспорте [16].
Таблица 1 «Белки, взаимодействующие с мерлином» [16]
Белок
Функция
Мембранные белки и комплексы
Паксиллин–интегрин–ERBB2
β-катенин, E-кадгерин
Фокальная адгезия
CD44
Рецептор гиалуроновой кислоты
Лайилин
Рецептор гиалуроновой кислоты, связывание с
талином
Плотные контакты
Адапторные-вставочные белки
PDZ-доменсодержащий адапторный белок,
связывается с Эрбином
Компонент цитоскелета, образует комплекс с
Grb2 и мерлином
PDZ-доменсодержащий адапторный белок
Регулятор эндоцитоза
NHFE-RF
Магицин
Синтенин
HRS
Белки, связывающие F-актин
βII-спектрин (β-фодрин)
Белок, связывающий F-актин
ERM
Связь мембраны и цитоскелета, передача
сигналов от Rho ГТФаз
Сигнальные молекулы
RalGDS
Эффектор Ras, GEF для Ral
RhoGDI
Регулятор RhoГТФаз
Pak
Эффектор Cdc42 и Rac, Ser/Thr киназа
27
MLK3
Киназа MAP киназ
RIβ
Регуляторная субъединица PKA
PIKE-L
Нейрональная ГТФаза, участвующая в активации
PI3K пути
Эффектор Cdc42, индуцирует полимеризацию
актина через комплекс Arp2–Arp3
N-WASP
Остальные белки
MYPT1
Посадочная субъединица миозинфосфатазы
Фактор инициации трансляции
eIF3c
HIV-1 transactivation-responsive RNA-binding
protein
Суперспирализованный белок с неизвестной
функцией
Белок, связывающий циклин B, регулятор
клеточного цикла
Белки, ассоциированные с микротрубочками
T-антиген JC-вируса полиомы человека
TRBP
SCHIP-1
HEI10
MAP
JC virus T-antigen
Ни
один
из
этих
белков
не
взаимодействует
с
закрытой,
дефосфорилированной формой мерлина. Также нет данных, позволяющих
утверждать, что эти белки необходимы для осуществления онкосупрессорной
функции мерлина. Однако все эти пути ведут так или иначе к подавлению
пролиферации или активации апоптоза [16].
Также важным взаимодействием мерлина является его связывание с HRS
[74].
HRS
содержит
FYVE-домен,
фосфатидилинозитол-3-фосфат
убиквитином
[75-77].
(PI3P),
HRS
–
и
связывающий
участок,
мощный
эндосомальный
взаимодействующий
регулятор
с
транспорта
убиквитинилированных рецепторных тирозин-киназ (RTK) в лизосомы [77-79].
Мерлин колокализован с HRS на эндосомах и, по-видимому, принимает участие в
обороте RTK [74]. Мерлин, совместно с HRS, ингибирует STAT (signal transducers
and activators of transcription) и STAM (signal transducing activator molecule) –
28
активатор Янус-киназ [80, 81]. Это приводит к угнетению синтеза ДНК и
остановке пролиферации [82].
Наконец, недавние исследования выявили ещё два мощных эффектора
мерлина, взаимодействие с которыми оказывает огромное влияние на клетку –
MTOR (белок-мишень рапамицина у млекопитающих) [83, 84], и убиквитинлигазу
семейства E3 CRL4 [85]. В 2009 г. James et al. и Lopez-Lago et al. удалось связать
утрату белка мерлин с активацией интегринов и комплекса MTORC1 [83, 84].
Lallemand et al. в 2009 и Ammoun и Hanemann в 2011 доказали, что мерлин
напрямую
и
через
взаимодействие
с
интегринами
взаимодействует
с
рецепторными тирозин-киназами, включая PDGFR (platelet-derived growth factor
receptor, рецептор тромбоцитарного фактора роста) и VEGFR (vascular endothelial
growth factor receptor, рецептор эндотелиального фактора роста) [86]. Чуть ранее,
в 2008 г., Ammoun et al. показали выраженную активацию MEK, ERK и AKT в
клетках, утративших ген NF2 [87]. Приведённые данные позволяют говорить о
двух главных сигнальных промитотических каскадах, активирующихся с утратой
мерлина: RAS/RAF/MEK/ERK и PI3K/AKT.
Ещё одним крупным открытием, изменившим представления о функциях и
регуляции мерлина, стало показанное в 2009 г. в лаборатории д-ра Джанкотти
(Filippo Giancotti) взаимодействие мерлина с CRL4 (Cullin-RING ubiquitin ligase 4,
убиквитинлигаза, содержащая куллин и цинковый палец, 4) – убиквитинлигазой
семейства E3 [85]. Было показано, что мерлин напрямую связывается с
убиквитинлигаза-ассоциированным фактором 1 (DCAF1), который является
субстрат-связывающим агентом для CRL4. Мерлин в активной (закрытой)
конформации способен транслоцироваться в ядро и связываться с комплексом
CRL4
DCAF1
, подавляя его активность (рис.8). Мутации, приводящие к утрате или
нарушению активности мерлина, вызывают перманентную активацию CRL4,
которая играет важную роль в стабилизации генома, регуляции клеточного цикла
и метилировании гистонов. По современным представлениям, активация CRL4 –
одно из ключевых звеньев гиперпролиферации NF2-отрицательных клеток,
которое может быть скомпенсировано выключением экспрессии DCAF1.
29
Рисунок 8 «Дополненная схема регуляции мерлина»
Современные подходы к поиску терапии НФ II
Лечение НФ II представляет чрезвычайно сложную задачу. Генная терапия
данного заболевания, как и любого заболевания, связанного с утратой
онкосупрессора, невозможна. Поскольку пациент гетерозиготен по гену NF2, а
опухоли развиваются из клеток, в которых произошла инактивация имеющегося
аллеля, задача генной терапии сводится к равномерному и умеренному
(избыточная экспрессия мерлина приводит к аресту клеточного роста и клеточной
гибели) распределению недостающего онкосупрессора по всем тканям организма.
Подобная операция возможна только на эмбриональной стадии развития, т е, на
30
стадии, когда ещё невозможна постановка диагноза. Фармакологический подход к
лечению
НФ
II
также
представляет
большие
трудности.
В
связи
с
доброкачественной природой и, следовательно, медленным ростом опухолей,
ассоциированных с НФ II, традиционные цитостатики оказались неэффективными
в отношении этого заболевания. Попытки селективного воздействия на NF2отрицательные клетки сводятся к выключению отдельных звеньев тех или иных
пролиферативных каскадов, подавляемых мерлином. Так, Ammoun et al. в 2011 в
исследованиях in vitro показали, что нилотиниб, ингибитор PDGFR, замедляет
рост NF2-отрицательных шванном [88]. Ингибитор EGFR эрлотиниб (торг. назв.
тарцева) и ингибитор EGFR/ERBB2 лапатиниб (торг. назв. тайверб, тайкерб)
также оказались эффективны в отношении вестибулярных шванном [6, 89].
Поскольку в вестибулярнх шванномах, развивающихся у пациентов с НФ II,
показано усиление ангиогенеза, была осуществлена успешная попытка применить
ингибитор рецепторов VEGFR бевацизумаб, подавляющий ангиогенез [7]. Также,
в испытаниях на клеточной и мышиной моделях НФ II успешными оказались
ингибиторы белка-мишени рапамицина MTOR сиролимус (рапамицин) и
эверолимус (Rad001) [90].
Однако трудность заключается в том, что мерлин регулирует множество
сигнальных путей с перекрывающимися эффектами. Результатом активации этих
каскадов в конечном итоге является усиление экспрессии генов MYC, FOS и JUN
и, следовательно, ускорение пролиферации. Выключения какого-то одного
сигнального пути недостаточно для подавления пролиферации, вызванной
утратой мерлина, т. к. положительное воздействие сводится на нет за счёт
активности остальных каскадов. Поэтому в последнее время исследователи
склоняются к идее комбинированной терапии. Например, сорафениб (торг. назв.
нексавар), ингибитор PDGFRβ и RAF, замедляет in vitro рост первичных клеток
шванномы [87]. В 2009 г. James et al предложили использовать NVP-BEZ235,
ингибитор MTOR и PI3K/AKT [84]. Тем не менее, даже одновременное
выключение двух каскадов может быть недостаточно эффективным для борьбы с
NF2-отрицательными
опухолями
[84].
Очевидно,
требуется
более
31
«универсальная»
мишень
для
фармакотерапии.
В
связи
с
открытием
взаимодействия мерлина с CRL4DCAF1, исследователи надеются, что СRL4 может
стать такой мишенью. Так, в 2011 г. Brooks, C.L. and Gu, W. начали эксперименты
по ингибированию протеасом, функцией которых является деградация белков,
убиквитинилированных лигазой CRL4, в NF2-отрицательных клетках [91].
Другая проблема, затрудняющая разработку фармакотерапии, связана со
спецификой
эффекторов
мерлина.
Выключение
сразу
нескольких
пролиферативных каскадов связано с большим количеством побочных эффектов,
т. к. те же каскады отвечают и за пролиферацию нормальных клеток. Прямое
ингибирование малых ГТФаз RAC, являющихся одними из важнейших
регуляторов и эффекторов мерлина, невозможно, т. к. для ГТФаз константа
диссоциации субстрата составляет порядка 10-8 – 10-11М [92] (например, для киназ
это число составляет 10-6М), и практически невозможно создать конкурентный
ингибитор с бόльшим сродством. Альтернативно проводятся эксперименты с
ингибиторами PAK, другой группы важных эффекторов и регуляторов мерлина,
одновременно являющихся активаторами RAC. В настоящее время многие
фармацевтические ведут поиск в этом направлении: например, разработаны
конкурентный ингибитор РАК групп I и II PF-3758309 (Пфайзер), конкурентный
ингибитор
РАК
группы
I
FRAX-597
(Афракса),
специфический
металлоорганический ингибитор РАК1 Fl-172 и аллостерический ингибитор РАК
группы I IPA-3 [93]. Из перечисленных соединений IPA-3 и Fl-172 не были
одобрены к клиническим испытаниям из-за высокой токсичности. PF-3758309
был
снят
с
первой
неудовлетворительными
фазы
клинических
показателями
испытаний
фармакокинетики
в
[94].
связи
с
FRAX-597
ингибирует широкий спектр рецепторных тирозин-киназ, что приводит к
нежелательным побочным действиям [93], однако успешные испытания на
животных позволяют надеяться, что более селективные аналоги этого соединения
окажутся мощными фармакотерапевтическими препаратами для борьбы с РАКзависимыми формами рака, в т. ч., НФ II.
32
Тем не менее, описанные трудности с лекарственным воздействием на пути,
регулируемые мерлином, заставляют искать принципиально новый подход к
фармакотерапии НФ II.
Злокачественная трансформация и изменения клеточного метаболизма
Помимо
изменений
в
протеомике
раковых
клеток
(активации
промитотических каскадов и угнетения апоптоза) были также показаны серьёзные
сдвиги метаболизма, происходящие при злокачественной трансформации клеток.
Известно, что энергетический метаболизм раковых клеток зависит от аэробного
гликолиза, синтеза жирных кислот и глютаминолиза [95]. Потенциально, эти
отличия от нормальных клеток могут быть использованы для создания
селективных фармакопрепаратов против рака.
Зависимость раковых клеток от аэробного гликолиза была впервые описана
Отто Варбургом (Otto Heinrich Warburg) в 1956 г. Варбург заметил, что в
опухолевых клетках уровни гликолиза аномально высоки, и лишь малая часть
поступающей в клетку глюкозы окисляется митохондриями. Варбург сделал ввод,
что
раковые
клетки
предпочитают
аэробный
гликолиз
окислительному
фосфорилированию, и поэтому опухоли становятся «глюкозными ловушками»
[96]. Хотя молекулярные механизмы подобного сдвига неясны, исследователи
признают, что этот эффект, получивший название «эффекта Варбурга» необходим
для поддержания ракового фенотипа клетки [97]. Повышенный захват глюкозы
клетками опухоли позволяет использовать для диагностики рака позитронноэмиссионную томографию с 2-F18-2-дезоксиглюкозой [98].
Две другие метаболические характеристики, отличающие раковые клетки от
нормальных – это повышенные уровни синтеза жирных кислот и метаболизма
глютамина. Ускоренние синтеза жирных кислот может быть связано с
повышенной потребностью в липидах для синтеза клеточных мембран быстро
делящихся клеток [99]. Раковые клетки также очень чувствительны к снижению
уровня глютамина в среде, несмотря на то, что глютамин не является
33
незаменимой
аминоксилотой
и
может
быть
синтезирован
из
глюкозы.
Зависимость от глютамина не может быть объяснена только его ролью донора
азота. Напротив, показано, что глютамин имеет важное значение для захвата
аминокислот раковыми клетками [100]. Но важнейшая роль глютамина в раковой
клетке – это продукция энергии путём глютаминолиза [101].
Нормальные клетки используют ровно столько энергии и строительных
веществ, сколько необходимо для поддержания стабильного состояния.
Потребление ресурсов и продукция энергии сверх этого базового уровня требует
внешней стимуляции, например, факторами роста [97]. Раковые клетки не
нуждаются в такой стимуляции и способны неограничено потреблять вещества,
содержащиеся во внутренних средах организма. Получаемую благодаря
гликолизу и глютаминолизу энергию эти клетки используют для поддержания
высокой скорости пролиферации.
Метаболические характеристики, присущие раковым клеткам, позволяют
им эффективно превращать доступные ресурсы в биомассу практически в
неограниченных количествах. Этот метаболический сдвиг снимает ограничения
роста, свойственные нормальным клеткам, но также и предоставляет возможность
отличить трансформированные клетки от здоровых [98]. В этих различиях может
крыться подход к селективному лечению злокачественных новообразований.
Также, есть данные, указывающие на связь метаболического сдвига с
лекарственной устойчивостью. Известно, что вещества, воздействующие на
изменённый клеточный метаболизм, могут повышать эффективность
противоопухолевых препаратов и снижать лекарственную устойчивость раковых
клеток [97].
Лекарственная устойчивость представляет наибольшую трудность в
терапии онкологических заболеваний. Понимание механизмов этого явления
позволило бы улучшить прогнозы при многих онкологических диагнозах.
Классические противоопухолевые препараты могут быть разделены на
несколько подклассов [98]:
34
1.
ЛС, влияющие на репликацию ДНК (универсальные
противоопухолевые препараты)
•
Алкилирующие агенты (цисплатин, темозоломид)
•
Антиметаболиты (гемцитабин, 5-фторурацил)
•
Алкалоиды растительного происхождения и прочие препараты
природного происхождения (винкристин, этопозид)

•
Препараты, стабилизирующие тубулин (паклитаксел)
Противоопухолевые антибиотики и родственные препараты

Препараты, стабилизирующие топоизомеразу II (доксорубицин,
адриамицин)
•
2.
Соединения платины (цисплатин, карбаплатин)
ЛС, ингибирующие рецепторы – активаторы пролиферативных
каскадов (применяются избирательно при определённых видах
злокачественных новообразований)
•
Антиэстрогены (тамоксифен, ралоксифен) – ЭР-положительный рак
молочной железы [102]
•
Ингибиторы рецепторов эпидермального фактора роста ERBB1 и
ERBB2 (лапатиниб, трастузумаб) – ЭР-положительнй
метастазирующий рак молочной железы [103], рак желудка [104],
серозная папиллярная карцинома эндометрия [105]
•
Ингибиторы рецепторов эпидермального фактора роста ERBB1
(цетуксимаб, панитумумаб) – колоректальный рак [106],
немелкоклеточный рак лёгкого [107], рак головы и шеи [108]
•
Ингибитор рецепторов эндотелиального фактора роста (бевацизумаб)
– колоректальный рак, немелкоклеточный рак лёгкого, глиобластома,
ренальная карцинома (NCI, 2006)
•
Молоклональные антитела к В-лимфоцитарному антигену CD20
(ритуксимаб) – неходжкинская лимфома [109]
35
Появляется всё больше данных, свидетельствующих о вкладе изменённого
метаболизма в развитие лекарственной устойчивости опухолей [110, 111], [112].
Например, лактатдегидрогеназа А (ЛДГА) влияет на устойчивость клеток рака
молочной железы к терапии паклитакселом и трастузумабом, киназа
пируватдегидрогиназы 3 (ПДК 3) играет роль в обусловленной гипоксией
лекарственной устойчивости колоректального рака и рака шейки матки [98].
Показана роль синтазы жирных кислот (СЖК, FASN) в приобретённой
устойчивости клеток рака молочной железы к терапии докситакселом,
трастузумабом и адриамицином, а также первичной устойчивости к гемцитабину
и лучевой терапии при раке поджелудочной железы [98]. Наконец, глютаминолиз
является важным звеном устойчивости к цисплатину, обусловленной активацией
косплекса mTORC1, при раке желудка [98].
Был проведён ряд исследований in vitro и in vivo, подтвердивший синергизм
модуляторов метаболизма с некоторыми противоопухолевыми препаратами (табл.
2)
Таблица 2 «Положительный эффект модуляторов метаболизма при
использовании противоопухолевых препаратов» [98]
Метаболический
путь
Фермент
Транспортёр
глюкозы 1
Транспортёр
глюкозы 4
Модулятор
метаболизма
Противоопухолевый
препарат
Флоретин
Даунорубицин
WZB117
Цисплатин/таксол
Ритонавир
Доксорубицин
ABT-737/ABT-263
2деоксиглюкоза
Гликолиз
Гексокиназа
3-бромпируват
Лонидамид
Пируваткиназа М2
Шпилечная
Тип рака
Источник
Рак толстой кишки,
лейкемия (in vitro)
Рак лёгкого, рак груди
(in vitro)
Множественная миелома
(in vitro)
Лейкемия, рак шейки
матки, гепатокарцинома,
рак груди, мелкоклеточный
рак лёгкого (in vitro), рак
простаты
(in vitro и in vivo)
Cao X, Fang L.
et al., 2009
Liu Y, Cao Y.
et al., 2012
McBrayer SK.
et al., 2012
Трастузумаб
Рак груди (in vitro и in vivo)
Преднизолон
Лейкемия (in vitro)
Даунорубицин
Лейкемия (in vitro)
Доксорубицин
Оксалиплатин/5-ФУ
Множественная миелома
(in vitro и in vivo)
Рак толстой кишки
(in vitro)
Преднизолон
Лейкемия (in vitro)
ABT-737
Лейкемия, лимфома
(in vitro)
Преднизолон
Лейкемия (in vitro)
Цисплатин
Рак лёгкого (in vivo)
Coloff JL et al., 2011
Meynet O et al., 2012
Yamaguchi R
et al., 2011
Zhao Y, Liu H et al.,
2011
Hulleman E et al.,
2009
Nakano A Tsuji D
et al., 2011
Nakano A Tsuji D
et al., 2011
Zhou Y et al., 2012
Hulleman E
et al.,2009
Meynet O,
Beneteau M et al.,
2012
Hulleman E et
al.,2009
Guo W et al., 2011
36
РНК
Лактатдегидрогеназа А
Киназа пируват
дегидрогеназы 3
FX11
Оксамат
миРНК
FK866
Паклитаксел
Трастузумаб
Рак лёгкого (in vitro и
in vivo)
Лимфома (in vivo)
Рак груди (in vitro)
Рак груди (in vitro и in vivo)
Паклитаксел
Рак шейки матки (in vitro)
Цисплатин/
Паклитаксел
Рак толстой кишки (in
vitro)
Фибросаркома (in vitro и in
vivo), рак толстой кишки
(in vitro)
Доцетаксел
Омепразол
Цикл
трикарбоновых
кислот
Омепразол +
тамоксифен
Киназа пируват
дегидрогеназы
Дихлорацетат
Церуленин
Синтез жирных
кислот
Синтаза жирных
кислот
С75
Орлистат
Фибросаркома (in vitro)
5-фторурацил
рак толстой кишки (in vitro)
Сулиндак
Рак лёгкого (in vitro),
плоскоклеточная
карцинома (in vitro и in
vivo)
Лучевая терапия
Рак простаты (in vitro)
Доцетаксел
Рак груди (in vitro)
Трастузумаб
Рак груди (in vitro)
5-фторурацил
Рак груди (in vitro)
Трастузумаб
Рак груди (in vitro)
Адриамицин/
Метоксантрон
Рак груди (in vitro)
Гемцитабин
Рак поджелудочной железы
(in vitro)
Shi HS et al., 2010
Le A et al., 2010
Zhou M et al., 2010
Zhao Y et al., 2011
Lu CW, Lin SC et al.,
2008
Lu CW, Lin SC et al.,
2011
Ishiguro T, Ishiguro M
et al., 2012
Ishiguro T, Ishiguro R,
Ishiguro M et al., 2012
Tong J, Xie G
et al., 2011
Ayyanathan K,
Kesaraju S et al., 2012
Cao W, Yacoub S,
Shiverick KT
et al., 2012
Menendez JA,
Lupu R, Colomer R.,
2004
Menendez JA, Vellon
L,Lupu R., 2005
Vazquez-Martin A,
Ropero S et al., 2007
Vazquez-Martin A,
Colomer R et al.,
2007
Liu H, Liu Y,
Zhang JT, 2008
Yang Y, Liu H, Li Z
et al., 2011
В настоящее время нет данных, указывающих на изменения метаболизма в
клетках доброкачественных опухолей, однако, если бы подобные изменения
удалось выявить, то модуляторы метаболизма могли бы стать новым оружием в
борьбе с медленно растущими доброкачественными новообразованиями.
37
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культивирование клеточных линий. Иммортализованные клетки
мышиной Nf2-отрицательной шванномы (SC4-9), иммортализованные мышиные
шванновские клетки FС912 (дикого типа) и FH912 (Nf2-отрицательные), и
первичные мышиные эмбриональные фибробласты, несущие флокс-аллель в гене
Nf2 (MEF Nf2flox/flox) были любезно предоставлены д-ром Марко Джованнини (dr
Marco Giovannini, Centre d'Etude du Polymorphisme Humain (CEPH) et Institut
Universitaire d’Hematologie, Paris, France). Клетки крысиной Nf2-отрицательной
шванномы (RT4) были получены из Американского банка клеток и тканей (ATCC,
кат. № CRL-2768).
Все клеточные линии, кроме FС912 и FH912, выращивали в
модифицированной по Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10%
эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2 мM L-глутамина, 1 мМ пирувата
натрия и 0.1 мМ смеси заменимых аминокислот (все Gibco Invitrogen Ltd, Paisley,
UK) при 370С, 5% СО2. Клетки линий FС912 и FH912 выращивали в среде
DMEM:F12 (1:1) с добавлением 2 мкM форсколина, 10 нг/мл нейрегулина и
добавки N2 в рекомендованной производителем концентрации начашках,
обработванных полилизином и ламинином. Клеточные линии растили на 10-см
чашках Петри. Все клеточные линии вели не более 30 пассажей.
Клетки MEF Nf2flox/flox иммортализовали, трансфецировав их плазмидой
pMSE-SV40LT (ранее получена в лаборатории д-ра Jonathan Chernoff), как
описано в [113].
Для экспериментов по тестированию биоактивных веществ (построения
кривых Концентрация/Эффект) клетки высевали в 96-луночные планшеты в
концентрации 104 клеток/лунку. Для вестерн-блоттинга клетки высевали в 6луночные планшеты в концентрации 2,5х105 клеток/лунку, через 4 часа после
пересева среду заменяли на бессывороточную. Для выделения мРНК для
количественной ПЦР клетки растили в 6-см чашках Петри до достижения
38
монослоя. Для УВЭЖХ-МС/МС клетки растили в 30-см чашках Петри до
достижения монослоя.
Получение фибробластов, нокаутных по гену Nf2. Иммортализованные
MEF Nf2flox/flox трансфецировали плазмидой pMSCV-Cre-GFP построенной на базе
ретровирусного
вектора
MSCV
и
несущей
Cre-рекомбиназу
и
зеленый
флуоресцентный белок (green fluorescent protein, GFP). Контрольные MEF
Nf2flox/flox трансфецировали плазмидой pMSCV-GFP (обе плазмиды получены ранее
в лаборатории д-ра Jonathan Chernoff), несущей только GFP. Через 48 часов после
трансфекции на проточном цитофлуориметре (Becton Dickinson FACS-VantageSE
flow cytometer) отбирали флуоресцентные клетки. Через 2 недели трансфекцию и
цитофлуориметрию повторяли.
Геномное типирование. Выделение геномной ДНК из культуры клеток
осуществляли с использованием экстракции смесью фенол-хлороформ, как
описано в [114].
Геномное типирование проводили методом, основанным на полимеразной цепной
реакции
(ПЦР).
Для
реакции
были
использованы
праймеры
P5
(5’-
GAAGGCAGCTTCCTTAAGTC-3’) и P6 (5’-CCTCTATTTGAGTGCGTGCCATG3’), фланкирующие область гена Nf2, ограниченную флокс-сайтами, и праймер P4
(5’-CTTCCCAGACAAGCAGGGTTC-3’), специфичный для участка между двумя
флокс-сайтами [115]. Генотипы определяли по наличию или отсутствию продукта
амплификации при использовании той или иной пары праймеров.
Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ
(NH4)2SO4, 1мM MgSO4, 0,2мM дНТФ, 10 пмоль каждого праймера, 0,5 ед. Taqполимеразы (ThermoPol, Biolabs Inc., США) и 100 нг геномной ДНК. Реакцию
ставили в стеклянных капиллярах на приборе 1605 Air ThermoCycler (Idaho
Technologies), программа амплификации: 50 циклов (10 с - 94°С; 1 с - 62°С; 30 с 72°С). Подукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 1%-
39
ном
агарозном
геле
в
присутствии
бромистого
этидия.
Изображение
визуализировали с помощью UVP ImageSystem.
Определение уровня пролиферации и выживаемости клеток. Уровень
пролиферации и выживаемости клеток оценивали по образованию солей
тетразолия (модифицированный МТТ-тест) используя набор Premixed WST-1 Cell
Proliferation Reagent (ClonTech, США) согласно протоколу, рекомендованному
фирмой-производителем.
Скрининг коллекции низкомолекулярных биоактивных веществ. В
работе использована коллекция ICCB Known Bioactives (Enzo Life Sciences, США,
№ BML-2840-0100) [18]. В коллекции представлены лиганды рецепторов,
сопряжённых с G-белками; лиганды ядерных рецепторов; модуляторы актина и
тубулина; модуляторы вторичных мессенджеров; модуляторы генной экспрессии;
блокаторы ионных каналов; ингибиторы киназ, протеаз и дифосфоэстераз;
ингибиторы липидного синтеза и др., в т. ч., адреномиметики (4), альфа- и бетаадреноблокаторы (2), холинергические и антихолинэстеразные препараты (14),
регуляторы серотонинергических и дофаминергических процессов (4),
нестероидные противовоспалительные препараты (8), кортикостероиды (2),
простагландины и производные арахидоновой кислоты (40), активаторы и
блокаторы калиевых каналов (13), агонисты и антагонисты ионов кальция (30),
блокаторы натриевых каналов (12), эстрогены и антиэстрогены (3), антибиотики
различных классов (7), цитостатики (15), иммуномодуляторы (3), индукторы
апоптоза (37) в виде растворов в диметилсульфоксиде (ДМСО).
Скрининг был осуществлён на двух клеточных линиях: экспериментальной
MEF Nf2-/- и контрольной MEF Nf2flox/flox, в трипликатах, и повторён дважды.
Перенос веществ в планшеты с клетками осуществлялся с помощью прибора CyBi
Well Vario (CyBio, США), объём переноса – 100 нл. Перенос осуществляли через
4 часа после посева клеток. В качестве отрицательного контроля использовали
растворитель (ДМСО). В качестве положительного контроля использовали
40
стауроспорин в конечной концентрации 20 мкмоль. После 48-часовой инкубации
с биоактивными веществами оценивали уровень выживаемости клеток с
помощью модифицированного MTT-теста. Веществами, показавшими
положительный результат, считали такие, для которых соотношение
жизнеспособных клеток MEF Nf2-/- к MEF Nf2flox/flox было < 0,8, расценивая
разницу в 20% как умеренные различия, a ожидаемая доля ложных отклонений
гипотез (FDR, false discovery rate) по методу Бенджамини-Хохберга [19] < 20%
Трансфекции проводили методом электропорации с помощью прибора
Neon (Invitrogene, США) согласно протоколу, рекомендованному фирмойпроизводителем. После электропорации клетки высевали на 10-см чашки в
концентрации 4*106 клеток/чашку. Трансфекцию осуществляли, используя 5 мкг
ДНК на реакцию или миРНК в конечной концентрации 100 нМ.
Реэкспрессия белка мерлин в Nf2-отрицательных клетках. Клетки
линии SC4-9 трансфецировали плазмидой pEGFP-NF2 (ранее получена в
лаборатории д-ра Чернова, Chernoff Lab, Fox Chase Cancer Center), кодирующей
белок-фьюжн мерлин-GFP. В качестве контрольных использовали клетки SC4-9,
трансфецированные плазмидой pEGFP. Эффективность трансфекции оценивалась
визуально по соотношению GFP-положительных и GFP-отрицательных клеток и
составляла ~ 40%. Уровень экспрессии белка мерлин оценивался методом
иммуноблоттинга.
Иммуноблоттинг. Лизаты клеток получали, обрабатывая клетки буфером
RIPA (1% Triton-X100, 10% глицерин, 50мM HEPES, pH 7,4, 150мM NaCl, 1,5мМ
MgCl2, 1мМ EGTA, 1мМ EDTA, 0,1%SDS, 10мМ фенилметилсульфонил-фторид,
апротинин 10µг/мл, лейпептин 10µг/мл, пепстатин 10µг/мл, 10мМ ортованадат
натрия) в течение 15 мин. при +40 С. Присутствие специфических белков
определяли с помощью стандартного иммуноблоттинга, используя первичные
моноклональные антитела: мышиные анти-Merlin (Abcam, США, № ab88956) и
41
анти-β-Actin (Santa Cruz, США, № SC-130301) и кроличьи анти-Casp3 антиGAPDH (Cell Signaling Technology, США, № № 9579 и 5174S). Для определения
ферментов, участвующих в липогенезе, использовали набор первичных
моноклональных кроличьих антител Fatty Acid and Lipid Metabolism Antibody
Sampler Kit (Cell Signaling Technology, США, № 8335). Вторичные антитела –
поликлональные козьи антитела против кроличьих иммуноглобулинов, меченные
пероксидазой хрена (ПХ), или мышиных иммуноглобулинов, меченные щелочной
фосфатазой (ЩФ) (Jackson Immunoresearch, США). В качестве субстрата
использовали ImmunStar AP substrate (Bio-Rad, США) для ЩФ-конъюгированных
антител и Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore, США) для ПХконъюгированных антител. Белки визуализировали на приборе FluorChem™ E
System (ProteinSimple, США) и обрабатывали с помощью программы ImageJ.
Уровень экспрессии нормализовали к экспрессии Gapdh или β-актина.
Количественная ПЦР (кПЦР). Клетки MEF Nf2-/-, MEF Nf2f/f, SC4-9 Babe и
SC4-9 Мерлин выращивали в бессывороточных условиях. мРНК выделяли,
используя набор RNeasy Minikit (Qiagen, США), согласно протоколу
производителя. кПЦР с обратной транскриптазой выполнялась с использованием
праймеров TaqMan для генов Fasn (ген синтазы жирных кислот (Fasn), Acaca (ген
ацетил-коА карбоксилазы I Acc1), Асaсb (ген Acc2), Lpin1 (ген фактора
транскрипции липина1, Lipin1), Acly (ген АТФ-цитратлиазы Acl), Acss2 (ген
ацетил-коА синтетазы Acecs1), Acsl1 (ген лигазы длинноцепочечных жирных
ацил-коА, long fatty acid acyl-coA ligase Acsl1), Srbp1 (ген стерольного
регуляторного элемента 1, фактора транскрипции), Cpt1c (ген
карнитилпальмитоилтрансферазы Iγ) и Cpt2 (ген
карнитилпальмитоилтрансферазы II), на системе ABI PRISM 7700 (Applied
Biosystems, США), нормализуя результаты к усреднённому уровню экспрессии
генов «домашнего хозяйства» Actinb, Tbp1 и Hrpt.
42
Измерение внутриклеточных уровней ацетил- и малонил-коА.
Стоковые водные 1 мМ растворы ацетил-, малонил- и пропионил-коА хранили
при -80°C. При приготовлении стандартов для построения калибровочных кривых
стоковые растворы растворяли в желаемой концентрации в смеси аммонийформата:ацетонитрила (30:70 по объёму).
Исследовали 4 группы образцов: клетки MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f в
присутствии ДМСО (отрицательный контроль) или 5 µM церуленина. Для
приготовления исследуемых образцов клетки выращивали на 30-см чашках Петри
до достижения монослоя, после чего клетки собирали трипсинизацией с
последующим центрифугированием, взвешивали и мгновенно замораживали
жидким азотом. Каждый образец содержал ∼1 г клеточной массы. К
размороженным образцам добавляли пропионил-коА в качестве внутреннего
стандарта для оценки потерь при выделении ацил-коА, смесь гомогенизировали
ультразвуком в 10% хлорной кислоте и нейтрализовали нейтрализующим
буфером (2 M KOH, 0.4 M KCl и 0.4 M имидазол), центрифугировали 20 мин. на
8,000 g при +4°C и очищали твердофазной экстракцией (ТФЭ).
ТФЭ проводили на картриджах Waters Oasis HLB 3 (WAT094226, Waters,
США). Приготовленные как описано выше образцы закисляли 2% муравьиной
кислотой, наносили на картридж и элюировали последовательно 0.2 мл воды, 0.2
мл метанола и 3 мл метанола. Последнюю порцию элюата (3мл метанола)
лиофилизировали, сухой осадок растворяли в смеси аммонийформата:ацетонитрила (30:70 по объёму) и исследовали с помощью УВЭЖХМС/МС
Хроматографию проводили на хроматографе Waters Acquity H (UPLC,
Waters, США). 10 μл очищенного образца или стандартов для калибровочных
кривых или наносили на колонку Acquity HSS T3 (2.1 x 50 мм; размер частиц 1.8
μм) для изократического элюирования смесью аммоний-формата:ацетонитрила
(30:70 по объёму). Элюирование проводилось при потоке 0.4 мл/мин. и 30°C,
элюаты впрыскивались в ионизационную камеру масс-спектрометра Thermo (TSQ
Quantum Access, США) для количественного анализа при следующих параметрах:
43
напряжение электрораспыления +4 kV; давление на распылителе 45 psi; давление
вспомогательного газа 20 psi; давление ионообменного газа 2 psi; давление газа
для соударений 1.5 мTorr; температура капилляра 380°C. Для обнаружения
целевых ацил-коА в элюате использовался метод мониторинга множественных
реакций. Массовые переходы для ацетил-коА, малонил-коА и пропионил-коА
составляли соответственно 810303, 854347, и 824317 [116]. Площадь под
индивидуальными пиками рассчитывалась с помощью встроенной программы
Xcalibur (версия 2.1, Thermo TSQ Quantum Access, США).
Резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET). Измерение
активности Rac1 проводили с помощью FRET. Биосенсор, представляющий собой
два плазмидных вектора: донорный pCyPet-Rac1, кодирующий белок Rac1,
меченый голубым флуоресцентным белком (CFP), и акцепторный pYPet-PBD,
кодирующий субстрат Rac1 р21-связывающий домен (PBD), меченый жёлтым
флуоресцентным белком (YFP) были предоставлены лабораторией д-ра Клауса
Хана. Протокол измерения активности Rac1 описан в [117]. Измерения проводили
на конфокальном микроскопе Leica TCS SP8 с помощью встроенного
программного обеспечения.
Исследования противоопухолевой активности соединений на
ксенографтной модели НФ II. Все эксперименты на животных проводились в
соответствии с международными требованиями IACUC. Ксенографты с
использованием клеток крысиной шванномы RT4 выполняли на самках
бестимусных мышей (nu/nu), n=7, каждой мыши подкожно вводили 1 x 106 клеток
RT4 в растворе PBS. Ксенографты с использованием клеток мышиной шванномы
SC4-9 выполняли на самках бестимусных мышей (nu/nu), n=5. каждой мыши
подкожно вводили 3 x 106 клеток SC4-9 в смеси матригель:PBS 1:1. Стоковый
(100x) раствор церуленина, ловастатина или золедроновой кислоты в смеси
ДМСО:этанол (1:4) хранили при -20oC. Рабочие растворы препаратов в
кукурузном масле приготовляли перед процедурой ежедневно начиная с третьего
44
дня эксперимента и вводили животным с помощью желудочного зонда в дозе 2
мг/кг/день (церуленин), 1 мг/кг/день (ловастатин) и 0,4 мг/кг/день (золедроновая
кислота). Объём опухолей измеряли в указанные дни по трём параметрам с
помощью штангенциркуля и рассчитывали по формуле V = x*y*z/2
Среднюю ингибиторную концентрацию (IC50, концентрацию вещества,
при которой доля жизнеспособных клеток составляла 50%) рассчитывали по
формуле IC50 = a+b*arctg(1-1/2c) после аппроксимации кривой Доза/Эффект
логистической функцией y=с*(1-tg((x-a)/b)), где х – концентрация вещества,
методом наименьших квадратов по коэффициентам а, b и с.
Статистический анализ. Все эксперименты по определению IC50
повторяли в трипликатах по 4 раза Эксперименты по выключению генов Fasn и
Acaca и химическому модулированию активности Acc1 повторяли в трипликатах
по 3 раза. Измерение FRET повторяли в трипликатах 4 раза. Определение уровня
экспрессии ферментов липогенеза иммуноблоттингом и кПЦР повторяли 4 раза.
Определение внутриклеточного уровня ацетил-коА и малонил-коА методом
УВЭЖХ-МС повторяли 3 раза. Для построения таблиц использовали средние
значения и доверительный интервал для вероятности P=95%. В экспериментах по
определению уровня Casp3 и в исследованиях на ксенографтной модели
статистическую значимость результатов p оценивали с помощью
двухвыборочного t-критерия Стьюдента с коррекцией по Уэлчу. В остальных
исследованиях p оценивали по методу Холма-Сидака при α=5%.
45
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получение фибробластов, нокаутных по гену Nf2
В работе использовали мышиные эмбриональные фибробласты (MEF), так
как в норме в этих клетках наблюдается выраженная экспрессия гена Nf2, и
имеются литературные данные, подтверждающие, что потеря данного гена
оказывает значительный эффект на фенотип этих клеток [5, 33].
Первичные MEF, несущие флокс-аллель в гене Nf2, были любезно
предоставлены доктором Марко Джованнини (dr Marco Giovannini, CEPH et
Institut Universitaire d’Hematologie, Paris, France).
Первичные культуры мышиных эмбриональных фибробластов (MEF
Nf2flox/flox) были иммортализованы с помощью трансфекции большим Т-антигеном
вируса SV40, как описано ранее [118]. Клетки, не подвергшиеся старению и
миновавшие
кризис
(50
пассажей)
сочли
иммортализованными.
Иммортализованные MEF Nf2flox/flox трансфецировали плазмидой pMSCV-Cre-GFP,
несущей Cre-рекомбиназу и GFP (клетки MEF Nf2-/-). Контрольные клетки MEF
Nf2flox/flox трансфецировали плазмидой pMSCV-GFP, несущей только GFP (MEF
Nf2flox/flox). Через 48 часов после трансфекции клетки, несущие GFP, отбирали на
проточном цитофлуориметре. Через две недели процедуру трансфекции и отбора
GFP-позитивных клеток повторяли.
Для подтверждения нокаута гена Nf2 в клетках MEF Nf2-/- через 2 недели
после
вторичного
отбора
GFP-позитивных
клеток
было
проведено
генотипирование полученных линий и вестерн-блоттинг лизатов клеток.
Были синтезированы следующие праймеры:
1)
P4 (5’-CTTCCCAGACAAGCAGGGTTC-3’)
2)
P5 (5’-GAAGGCAGCTTCCTTAAGTC-3’)
3)
P6 (5’-CCTCTATTTGAGTGCGTGCCATG-3’)
На рис. 9 представлена схема расположения сайтов посадки праймеров,
использованных для генотипирования.
46
Рисунок 9 «Схема расположения сайтов посадки праймеров для
типирования по гену Nf2»
При анализе электрофореза продуктов ПЦР в 1% агарозном геле должны
быть видны следующие полоски (см. табл. 2):
Таблица 2 «Распределение продуктов ПЦР (генотипирования) при
электрофорезе в агарозном геле»
Р4+Р5
Р5+Р6
ДНК клеток дикого типа
305 п. осн.
-
ДНК клеток MEF Nf2flox/flox, не обработанных Creрекомбиназой
ДНК клеток MEF Nf2-/- (Nf2flox/flox, обработанных Creрекомбиназой)
442 п. осн.
-
-
338 п. осн.
На рисунке 10 представлены результаты генотипирования клеток MEF Nf2-/и MEF Nf2flox/flox. Делеция гена Nf2 в клетках MEF Nf2-/- подтверждена
распределением продуктов ПЦР в геле. Так, видно, что при использовании
праймеров Р4 и Р5 образуются продукты нужного размера только с ДНК,
выделенной из клеток MEF Nf2flox/flox, и с геномной ДНК мыши (442 и 305 п.о.,
соответственно) (рис 10). В то же время при использовании праймеров Р5 и Р6
образуется визуализируемый продукт только в реакции с ДНК клеток MEF Nf2-/-
47
(338 п. о.) (рис. 10), где произошла делеция области гена Nf2, ограниченной floxсайтами.
Рисунок 10 «Гель-электрофорез продуктов ПЦР»
NF2-/- – ДНК, выделенная из иммортализованных MEF NF2flox/flox после трансфекции
плазмидой, несущей Cre-рекомбиназу, и сортировки на проточном цитофлуориметре; NF2flox/flox
– ДНК клеток, трансфецированных контрольной плазмидой (pMSCV-GFP). В качестве
положительного контроля на наличие гена Nf2 использовали геномную ДНК мыши (New
England Biolabs, США), в качестве отрицательного контроля – стерильная дистиллированная
вода.
Иммуноблоттинг лизатов клеток MEF Nf2-/- и MEF Nf2flox/flox с антителами
против мерлина (рис. 11) показал, что в клетках после трансфекции плазмидой,
несущей Сre-рекомбиназу (MEF Nf2-/-), отсутствует продукция белка мерлин, в то
же время в контрольных клетках MEF Nf2flox/flox продукция мерлина сохраняется на
высоком уровне.
48
Рисунок 11 «Иммуноблоттинг лизатов клеток MEF Nf2-/- и MEF Nf2flox/flox»
Лизаты клеток получали, обрабатывая клетки буфером Роберта в течение 15 мин. при+40
С. Использовали моноклональные мышиные антитела к мерлину и к β-актину. В качестве
вторичных антител использовали поликлональные козьи антитела против мышиных
иммуноглобулинов, меченные щелочной фосфатазой
Полученные данные дают основание считать, что в клетках MEF Nf2-/произошла делеция области гена Nf2, кодирующего белок мерлин и отсутствует
синтез этого белка.
Влияние утраты белка мерлин на функциональные свойства
клеток MEF Nf2-/Поскольку было показано, что мерлин участвует во взаимодействии
компонентов
цитоскелета
и
клеточной
мембраны,
при
характеристике
полученных клеток MEF Nf2-/- мы, в первую очередь, оценивали их морфологию и
скорость прикрепления клеток к субстрату.
На рисунке 12 представлены фотографии клеток MEF Nf2-/- и MEF Nf2flox/flox
через 4 часа после пересева (световая микроскопия). Видно, что клетки MEF Nf2-/выглядят более распластанными, с большим числом отростков. В чашках с MEF
Nf2-/- наблюдается меньше нежизнеспособных всплывших клеток, чем в чашках с
MEF Nf2flox/flox.
49
Рисунок 12 «Световая микроскопия а) MEF Nf2-/- б) MEF Nf2flox/flox»
Клетки высевали на 10-см чашки Петри в концентрации 105 клеток на чашку и
культивировали в течение 4-х часов в полной культуральной среде. Микроскопию проводили
на инвертированном микроскопе при 20-кратном увеличении
При культивировании клеток было также выявлено, что клетки MEF Nf2-/быстрее прикрепляются к субстрату и распластываются: так, прикрепившиеся и
распластанные клетки MEF Nf2-/- обнаруживались в лунках уже через 15-20 минут
после пересева, тогда как для клеток MEF Nf2 flox/flox это время составляло не менее
1 часа.
На рисунках 13 – 15 представлены результаты исследования
функциональных свойств клеток MEF Nf2-/- (по сравнению с контрольными
фибробластами MEF NF2flox/flox). Из анализа кривых роста видно (рис.13), что
скорость роста существенно выше у клеток MEF Nf2-/-, и рост этих клеток не
подвержен контактному торможению.
50
Рисунок 13 «Кривые роста клеток MEF Nf2-/- и MEF Nf2 flox/flox»
Клетки высевали на 10-см чашки в концентрации 105 клеток на чашку, ежедневно клетки
трипсинизировали и производили подсчёт живых клеток с помощью камеры Горяева.
Представлены средние значения по результатам 4-экспериментов (по 5 параллелей в каждом).
Во время наблюдения у клеток MEF Nf2flox/flox также не было обнаружено
выраженного контактного торможения роста, однако их скорость роста начала
замедляться после 6-ого дня исследования, а срок наблюдения был ограничен,
поскольку при данных условиях роста на 9-10 день инкубирования клеток обеих
линий не представлялось возможным получать гомогенные суспензии клетки для
их подсчета.
Клетки MEF Nf2-/- также оказались более устойчивы к истощению среды
(рис. 14). Так, при постоянном культивировании в бессывороточной среде
значимая гибель клеток MEF Nf2flox/flox обнаруживалась уже на седьмой день, на
восьмой день жизнеспособность сохраняли только 25% клеток, однако количество
жизнеспособных клеток MEF Nf2-/- оставалось постоянным всё это время.
51
Рисунок 14 «Устойчивость клеток MEF Nf2-/- и MEF Nf2 flox/flox к
истощению среды в бессывороточных условиях»
Представлена зависимость количества живых клеток от времени инкубации в 96луночном планшете без смены среды. Клетки, ресуспендированные в полной среде, высевали в
планшеты в концентрации 10 тыс. клеток на лунку. Через 4 часа после посева среду меняли на
бессывороточную и инкубировали клетки в течение 8 дней. Уровень выживаемости клеток
оценивали с помощью модифицированного MTT-теста. Условное количество клеток
рассчитывалось исходя из измерения оптической плотности при длине волны 485 нм. Для
каждой клеточной линии количество клеток на момент посева (10 тыс. кл. на лунку) принято за
1.
Клетки MEF Nf2-/- также более устойчивы к действию одного из известных
цитотоксических агентов – стауроспорина, который является мощным
ингибитором киназ и вызывает гибель большинства типов клеток в
концентрациях меньше, чем 0.1 мкмоль/л уже через 4 часа инкубации [119]. И
хотя обе клеточные линии оказались достаточно устойчивы к действию
стауроспорина (половинная ингибиторная концентрация (IC50) стауроспорина для
клеток MEF Nf2flox/flox составила 1,035 ± 0,8 мкмоль/л, а для клеток MEF Nf2-/- 1,79
52
± 0,09 мкмоль/л), однако, в среднем, выживаемость клеток MEF Nf2-/- была выше,
чем выживаемость клеток MEF Nf2 flox/flox (отличия в IC50 составили 57%) (см. рис.
15).
Рисунок 15 «Устойчивость клеток MEF Nf2-/- и MEF Nf2 flox/flox к действию
стауроспорина»
Представлена зависимость количества живых клеток от концентрации стауроспорина.
Клетки высевали в 96-луночные планшеты в концентрации 10 тыс. клеток на лунку. Через 24
часа после посева добавляли стауроспорин. В качестве отрицательного контроля использовали
ДМСО. После 12-часовой инкубации со стауроспорином оценивали уровень выживаемости
клеток с помощью модифицированного MTT-теста. Условное количество клеток рассчитывали
исходя из измерения оптической плотности при длине волны 485 нм. Для каждой клеточной
линии среднее количество клеток в лунках с ДМСО принято за 1, остальные значения
нормализованы к отрицательному контролю.
При получении стабильных клеточных линий необходимо было убедиться,
что у нокаутной по гену Nf2 линии MEF Nf2-/- наблюдаются основные свойства,
вызванные отсутствием мерлина, а контрольная линия MEF Nf2flox/flox не
отличается от первичных клеток. К таким свойствам относят фенотипические и
53
ростовые характеристики клеток, а также, изменение уровня продукции и
фосфорилирования некоторых белков в норме прямо или опосредованно
взаимодействующих с мерлином.
Отличия в морфологии и скорости прикрепления клеток MEF Nf2-/- по
сравнению с клетками MEF Nf2flox/flox (Рис. 12) отражают принципиальные
изменения в организации актинового цитоскелета, это дает основание считать, что
именно отсутствие мерлина обуславливает эти изменения актинового цитоскелета
[29].
Ранее
было
показано,
что
наиболее
существенным
изменением,
наступающим в результате утраты гена Nf2, является нарушение контактного
торможения [5, 59]. Было установлено, что, действительно, рост клеток MEF Nf2-/не подвержен контактному торможению. Клетки MEF Nf2flox/flox, обнаруживают
неполное контактное торможение (рис. 13). Возможно, некоторое нарушение
контактного торможения в клетках MEF Nf2flox/flox связано с тем, что при
иммортализации в этих клетках был поврежден ген р53, поскольку ранее было
показано взаимодействие между р53 и Nf2 [120]. У клеток MEF Nf2-/- была
обнаружена устойчивость к истощению среды (рис. 14), что характерно для
клеток, дефектных по гену Nf2-/- [121]. Выявленная повышенная устойчивость
клеток MEF Nf2-/- к действию стауроспорина (рис. 15) ранее описана не была.
Этот результат также подтверждает общую устойчивость клеток, лишенных
мерлина, к действию апоптотических факторов.
На рисунке 16 представлен сравнительный анализ уровня продукции и
фосфорилирования в клетках MEF Nf2-/- и MEF Nf2 flox/flox некоторых белков,
активность которых в норме напрямую или опосредованно регулируется
мерлином. С помощью веcтерн-блоттинга в клетках MEF Nf2-/-, лишенных
мерлина, выявлено повышение уровня фосфорилирования киназ Pak1/Pak2, что
говорит об их активации; выявлено повышение уровня продукции белков,
участвующих в регуляции апоптоза, - Bcl-2 (B-cell leukemia/lymphoma 2) и Bcl-XL
(B-cell leukemia/lymphoma XL); повышение уровня фосфорилирования по серину
136 белка Bad (Bcl2-associated agonist of cell death), являющегося участником
антиапоптотического пути Akt – Bad; а также снижение уровня
54
фосфорилирования по серину 338 белка Raf1 (v-raf-1 murine leukemia viral
oncogene homolog 1), принадлежащего к семейству MAP3K-киназ.
Рисунок 16 «Уровни продукции и фосфорилирования некоторых белков в
клетках MEF Nf2-/- и MEF Nf2 flox/flox»
Лизаты клеток получали, обрабатывая клетки буфером Роберта в течение 15 мин.
при+40С. Использовали поликлональные первичные антитела: анти-Bcl-2, анти-BclXL, антиphosphoPak1(Ser144)/phosphoPak2
(Ser141),
анти-phosphoBad
(Ser136),
анти-Bad
и
моноклональные первичные антитела: анти-phospho Raf1 (Ser338), анти-Merlin и анти-β-Actin.
В качестве вторичных антител использовали поликлональные козьи антитела против кроличьих
или мышиных иммуноглобулинов, меченные, соответственно, пероксидазой хрена или
щелочной фосфатазой. В качестве субстрата использовали Immobilon Western Chemiluminescent
HRP Substrate или Bio-Rad ImmunStar AP Substrate.
55
Анализ уровня продукции и фосфорилирования белков, прямо или косвенно
связанных с белком мерлин, показал, что в клетках MEF Nf2-/- происходит
выраженная активация киназ Pak1 и Pak2 (рис. 16), что соответствует ожидаемой
картине, поскольку известно, что мерлин ингибирует р21-зависимые киназы [37,
42]. Активация Pak1 приводит к запуску пролиферативного каскада Mek
(Mapk/Erk kinase, киназа митоген-активируемых киназ) – Erk (extracellularregulated protein kinase, митоген-активируемая киназа) [122] (см. рис. 17). Таким
образом, активация Pak1 в клетках, дефектных по гену Nf2, может быть одной из
причин, обусловливающих разницу в скорости роста между клетками линий MEF
NF2-/- и MEF NF2flox/flox.
Ранее было показано, что мерлин ингибирует комплекс Mtorс2, что
приводит к запуску антиапоптотического пути Akt – Bad [123] (см. рис. 17).
Рисунок 17. «Возможная роль белка мерлин в апоптозе и пролиферации,
опосредованных взаимодействием комплекса mTor, киназ Akt и белка Bad» (см.
описание в тексте)
56
Комплекс Mtorc2 активирует киназу Akt, которая в норме ингибирует белок
Bad, фосфорилируя его по серину 136. Bad в нефосфорилированном состоянии
является проапоптотическим белком, подавляя экспрессию генов Bcl-2 и Bcl-XL и
удерживая
комплекс
антиапоптотических
белков
Bcl-2
и
Bcl-XL.
Фосфорилирование Bad, напротив, приводит к повышению экспрессии генов Bcl2 и Bcl-XL и к диссоциации комплекса белков Bcl-2 и Bcl-XL. Таким образом, Bad,
фосфорилированный по серину 136, является мощным антиапоптотическим
агентом [123]. Повышение уровня фосфорилированной Pak1 также вносит вклад в
активацию Akt – Bad, поскольку было показано взаимодействие Pak1 и Akt [122].
Было установлено, что общий уровень продукции проапоптотического
белка Bad одинаков в обеих клеточных линиях, однако уровень активированного
Bad, фосфорилированного по серину 136 (т. е., антиапоптотической формы Bad)
несколько выше в MEF Nf2-/-, что косвенно свидетельствует об активации
комплекса Mtorc2 и сигнального пути Akt – Bad. По-видимому, активацией Bad
объясняется и лучшая выживаемость этих клеток по сравнению с контрольной
клеточной линией. Также, об активации пути Mtorc2 – Akt – Bad косвенно
свидетельствует и пониженный уровень фосфорилированного по серину 338
белка Raf1 [122, 124]. Результатом активации Bad в MEF Nf2-/- является
повышенная экспрессия антиапоптотических генов Bcl-2 и Bcl-XL, что, очевидно,
также вносит вклад в выживаемость этих клеток. Таким образом, в клетках MEF
Nf2-/-, лишенных белка мерлин, удалось подтвердить активацию сигнальных
путей, в норме подавляемых мерлином, (Pak1, Pak2, Mtor-Akt).
В данной работе получены две линии клеток, отличающихся только по
одному гену Nf2, что может стать мощным инструментом для изучения
взаимодействий мерлина, а также для поиска лекарственной терапии НФ II. Ранее
делались попытки сравнивать клетки Nf2-дефектных опухолей с клетками
нормальной ткани [5], а также описать эффекты, вызываемые нокаутом гена Nf2,
на первичных клетках [125]. Однако, оба пути, очевидно, не подходят для
создания клеточной модели НФ II, т. к. в первом случае различия между клетками
могут быть обусловлены не только отсутствием мерлина, но и повреждением
57
других генов, а во втором случае невозможны эксперименты, требующие
длительного культивирования клеток. Независимо от наших исследований
сходная клеточная модель на основе спонтанно иммортализованных MEF Nf flox/flox
была получена в лаборатории N. Ratner [60], однако есть данные, что
иммортализация большим Т-антигеном вируса SV40 имеет преимущества перед
остальными способами иммортализации, поскольку клетки сохраняют фенотип,
близкий к исходным первичным клеткам [126]. Полученные в работе линейные
клетки были использованы для выполнения скрининга биологически-активных
соединений с целью поиска терапии НФ II.
Скрининг коллекции низкомолекулярных биоактивных веществ
Скрининг был проведён на клетках линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2flox/flox, чтобы
оценить избирательную токсичность соединений в отношении Nf2-отрицательных
клеток. На рис. 18 представлены первичные результаты скрининга, и цветом
выделены вещества, удовлетворяющие критериям отбора (соотношение
жизнеспособных клеток MEF Nf2-/- к MEF Nf2flox/flox < 0,8; FDR по методу
Бенджамини-Хохберга < 20%). Девять веществ, удовлетворяющих критериям
отбора, представлены в таблице на табл. 3.
58
Рисунок 18. «Первичные результаты скрининга коллекции
низкомолекулярных биоактивных соединений»
Скрининг коллекции ICCB Known Bioactives (Biomol, США) был выполнен на двух
клеточных линиях: экспериментальной MEF NF2-/- и контрольной MEF NF2flox/flox, в
трипликатах, и повторён дважды. Перенос веществ осуществлялся с помощью прибора CyBi
Well Vario (CyBio, США), объём переноса – 100 нл. Перенос осуществляли через 4 часа после
посева клеток. В качестве отрицательного контроля использовали растворитель (ДМСО). В
качестве положительного контроля использовали стауроспорин в конечной концентрации 20
мкмоль/л. После 48-часовой инкубации с биоактивными веществами оценивали уровень
выживаемости клеток с помощью модифицированного MTT-теста. Веществами, показавшими
положительный результат, считали такие, для которых соотношение жизнеспособных клеток
MEF NF2-/- к MEF NF2flox/flox было < 0,8, a ожидаемая доля ложных отклонений гипотез (FDR)
по методу Бенджамини-Хохберга < 20%
Таблица 3. «Вещества, удовлетворяющие критериям отбора»
MEF Nf2-/MEF Nf2f/f
Название
Класс
Мевинолин
(ловастатин)
Церуленин
ингибитор метилглутарил-коаредуктазы
ингибитор синтазы жирных кислот
Go6976
ингибитор протеинкиназы С
0.455
Нифедипин
блокатор кальциевых каналов
0.468
Ресвератрол
активатор протеиндеацетилазы SIRT1
0.499
Цитохалазин D
F-актин-связывающее в-во
0.541
Капсаицин (E)
антагонист ванилоидных рецепторов
0.657
Нигерицин
переносчик калия
0.665
Микофеноловая
кислота
общий антисептик
0.721
0.12
0.383
59
Первичная валидация результатов скрининга
Построение кривых Концентрация/Эффект и тестирование соединенийкандидатов на Nf2-отрицательных линиях
Для кандидатов, идентифицированных с помощью скрининга, определены
IC50 для обеих клеточных линий. Из девяти веществ, выбранных изначально,
только четыре:
ловастатин (Enzo Life Sciences, США, № BML-G226-0010)
ингибитор 3-гидрокси-метилглутарил-коА редуктазы;
церуленин (Enzo Life Sciences, США, № BML-G237-0005)
– ингибитор синтазы жирных кислот;
ресвератрол (Enzo Life Sciences, США, № BML-FR104-0100)
– активатор протеиндеацетилазы SIRT1;
капсаицин (Enzo Life Sciences, США, № BML-EI125-0200)
– антагонист ваниллоидных рецепторов
показали постоянные значимые различия токсичности в отношении Nf2отрицательных и Nf2-положительных клеток (рис. 19)
–
60
Рисунок 19. «Сравнение действия исследуемых соединений на Nf2отрицательные и контрольные клетки»
61
Эксперименты повторяли в трипликатах по 4 раза. Клетки высевали в 96-луночные
планшеты в концентрации 104 клеток/лунку. Через 4 часа после высева клеток в планшеты
добавляли биоактивные вещества и инкубировали 48 часов. Уровень пролиферации и
выживаемости клеток оценивали с помощью модифицированного МТТ-теста. IC50 определяли
по следующему алгоритму: методом наименьших квадратов по коэффициентам а, b и с кривую
Концентрация/Эффект аппроксимировали логистической функцией y=с*(1-tg((x-a)/b)), где х –
концентрация вещества. IC50 рассчитывали по формуле IC50=a+b*arctg(1-1/2c). Для построения
таблиц использовали средние значения IC50 и доверительный интервал для вероятности P=95%.
Статистическую значимость результатов p оценивали с помощью двухвыборочного t-критерия
Стьюдента.
62
Таблица 4 «Сравнение действия исследуемых соединений на Nf2отрицательные и контрольные клетки.»
IC50 (MEF NF2-/-), µM
IC50 (MEF NF2f/f), µM
P
Ловастатин
1,18 ± 0,09
33,1 ± 2,9
7,74E-08
Церуленин
10,67 ± 0,49
24,5 ± 0,21
4,44E-10
Ресвератрол
8,96 ± 0,34
57,52 ± 3,83
3,3E-08
Капсаицин
24,84 ± 3,045
451,35 ± 37,95
1,51E-05
n = 4, P = 95%
Эти вещества были протестированы на клетках других Nf2-отрицательных
линий (SC4-9 и RT4) (рис. 20). У ловастатина, церуленина и ресвератрола IC50 для
клеток линий SC4-9 и RT4 были сравнимы с IC50 для клеток линии MEF Nf2-/(табл. 5). К капсаицину клетки линий SC4-9 и RT4 оказались нечувствительны.
Рисунок 20. «Тестирование исследуемых соединений на различных Nf2отрицательных клеточных линиях»
63
RT4 – клетки линии крысиной Nf2-отрицательной шванномы, SC4-9 – клетки линии
мышиной Nf2-отрицательной шванномы.
64
Таблица 5 «Тестирование исследуемых соединений на различных Nf2отрицательных клеточных линиях»
IC50 (SC4-9), µM
IC50 (RT4), µM
IC50 (MEF Nf2-/-), µM
Ловастатин
3.09 ± 0.77
3.52 ± 0.4
1,18 ± 0,09
Церуленин
16.23 ± 1.65
16.1 ± 0.52
10,67 ± 0,49
Ресвератрол
10.47 ± 2.02
16.46 ± 2.7
8,96 ± 0,34
n = 4, P = 95%
Тестирование фармакологических аналогов соединений, отобранных по
результатам скрининга
Из трёх соединений, одинаково проявивших себя в отношении клеток всех
трёх Nf2-отрицательных линий, ловастатин является ингибитором 3-гидрокси-3метилглутарил-КоА-редуктазы (ГМГ-коА редуктазы), церуленин – ингибитором
синтазы жирных кислот, ресвератрол – природным полифенолом, активатором
протеиндеацетилазы SIRT1. Поэтому на следующем этапе работы были
протестированы различные модуляторы активности данных ферментов, чтобы
убедиться, что селективная токсичность ловастатина, церуленина и ресвератрола
связана с их прямым действием, а не с неизученными побочными эффектами этих
соединений. В работе использовали синтетические ингибиторы 3-гидрокси-
метилглутарил-коА редуктазы: флувастатин
Life Sciences, США, № ALX-270-466-M010), симвастатин
(Enzo
65
(Enzo Life Sciences, США, № BML-G244-0050) и мевастатин
(Enzo Life Sciences, США, № BML-G233-0010);
ингибиторы синтазы жирных кислот: С75
(Enzo Life Sciences, США, № ALX-270-286-M001)– синтетический аналог
церуленина; кемпферол
(Enzo Life Sciences, США, №
ALX-385-005-M010) и лютеолин
(Enzo Life Sciences,
США, № ALX-385-007-M010); активаторы протеиндеацетилазы SIRT1: BML-278
(Enzo Life Sciences, США, № BML-GR359-0005) и
66
кверцетин
(Enzo Life Sciences, США, № ALX-385-001-
G005). Все соединения проявили селективную токсичность в отношении Nf2отрицательных клеток (рис. 21), что доказывает, что ГМГ-коА редуктаза, синтаза
жирных кислот и проеиндеацетилаза SIRT1 имеют большое значение для
выживания Nf2-отрицательных клеток.
Рисунок 21. «Тестирование фармакологических аналогов ловастатина,
церуленина и ресвератрола»
67
Эксперименты повторяли 4 раза в трипликатах, на графиках отображены средние
значения и доверительный интервал для вероятности 95%
68
Таблица 6 «Тестирование фармакологических аналогов ловастатина,
церуленина и ресвератрола»
IC50 (MEF NF2-/-), µM
IC50 (MEF NF2f/f), µM
P
Флувастатин
0,7 ± 0,078
8,023 ± 0,237
6,5E-09
Симвастатин
0,387 ± 0,029
4,44 ± 0,317
9,44E-07
Мевастатин
0,584 ± 0,034
9,4 ± 0,77
1,77E-06
С75
6,528 ± 0,212
10,3 ± 0,87
0,0005
Кемпферрол
53,073 ± 3,523
443,63 ± 40,62
5,02E-06
лютеолин
14,45 ± 1,11
26,34 ± 0,15
2,8Е-06
Кверцетин
50,402 ± 0,843
104,94 ± 1,745
6,67E-08
BML-278
12,8 ± 0,3
27,25 ± 1,26
2,072E-06
n = 4, P = 95%
Реэкспрессия белка мерлин в клетках линии Nf2-отрицательной шванномы
Чтобы подтвердить, что селективная токсичность выбранных веществ
обусловлена отсутствием белка мерлин в клетках Nf2-отрицательных линий, в
клетках линии SC4-9 реэкспрессировали белок мерлин (рис. 22). Для оценки
эффективности трансфекции клетки SC4-9 были трансфецированы плазмидным
вектором, несущим ген зелёного флуоресцентного белка (GFP), позволяющего
идентифицировать успешно трансфецированные клетки по флуоресценции.
Эффективность трансфекции составила ≈ 30-40% (рис. 22). Для восстановления
экспрессии белка мерлин в клетках SC4-9 эти клетки трансфецировали
плазмидным вектором pBabe-NF2-puro, несущим ген Nf2. Поскольку размеры
обоих векторов примерно одинаковы, можно ожидать одинаковой эффективности
трансфекции. Уровень экспрессии белка мерлин оценивали с помощью
иммуноблоттинга (рис. 22)
69
Рисунок 22 «Оценка эффективности трансфекции и уровня экспрессии
белка мерлин.»
Эффективность трансфекции клеток линии SC4-9 плазмидным вектором pEGFP
оценивалась визуально по соотношению флуоресцирующих клеток к общему количеству
клеток на инвертированном флуоресцентном микроскопе. Экспрессия белка мерлин
подтверждена иммуноблоттингом с помощью моноклональных антител против белка мерлин. В
качестве контроля загрузки геля использовали моноклональные антетела против Gapdh.
Реэкспрессия белка мерлин в клетках шванномы привела к подавлению
эффекта ловастатина и церуленина (рис. 23). Для ресвератрола IC50 (SC4-9 GFP) и
IC50 (SC4-9 мерлин) не отличались.
70
Рисунок 23 «Сравнение IC50 ловастатина и церуленина в отсутствие и при
наличии белка мерлин.»
SC4-9 Babe – клетки линии мышиной Nf2-отрицательной шванномы,
трансфецированные контрольным плазмидным вектором pBabe-puro. SC4-9 Мерлин - клетки
линии мышиной Nf2-отрицательной шванномы, трансфецированные плазмидным вектором
pBabe-Merlin, кодирующим белок мерлин.
71
Таблица 7 «Сравнение IC50 ловастатина и церуленина в отсутствие и при
наличии белка мерлин.»
P
IC50 (SC4-9 GFP), µM
IC50 (SC4-9 Merlin), µM
Ловастатин
4,101 ± 0,357
12,44 ± 1,158
0,000232
Церуленин
13,272 ± 0,135
21,01 ± 0,216
4,28E-08
n = 4, P = 95%
Таким образом, из девяти соединений, удовлетворявших критериям отбора
скрининга, для дальнейших исследований были выбраны два – ловастатин и
церуленин.
Фармакотерапия для НФ II до сих пор не разработана. В настоящее время в
случае возникновения неоперабельных эпендимом применяется пульс-терапия
комбинацией ломустина, винкристина и преднизолона или, альтернативно,
карбаплатина и винкристина, с последующей лучевой терапией [127].
Недавно была осуществлена успешная попытка использования эрлотиниба
у пациентов с неоперабельными шванномами слуховых нервов. Лечение привело
не только к уменьшению размера опухолей, но и к частичному восстановлению
слуха у пациентов [6]. Положительные результаты также принесло применение в
подобных случаях бевацизумаба – препарата моноклональных антител к
эндотелиальному фактору роста [7]. Оба препарата в настоящее время находятся
во второй фазе клинических испытаний (идентификаторы протоколов в списке
протоколов клинических испытаний Национального института здоровья США,
соответственно, NCT00503841 и NCT01767792). Таким образом, до сих пор
стратегия поиска фармакопрепаратов для лечения НФ II заключалась в
применении уже известных антинеопластических препаратов у пациентов с
неоперабельными опухолями. Насколько нам известно, никто не проводил
скрининг широкого спектра биоактивных веществ с целью поиска соединений,
действующих на Nf2-отрицательные клетки. Следует подчеркнуть, что
обнаруженные нами соединения-кандидаты - ловастатин и церуленин - не
относятся к классу противоопухолевых препаратов. Ловастатин, ингибитор 3гидрокси-метилглутарил-коА редуктазы, является гиполипидемическим
72
средством и используется под торговыми названиями «Ловастатин», «Ловакор»,
«Мевакор» и др. Церуленин, ингибитор синтазы жирных кислот, находится на
этапе доклинических испытаний. Изначально планировалось использование
церуленина в борьбе с ожирением [128, 129], однако последующие исследования
неожиданно показали его эффективность в отношении клеток рака толстого
кишечника [130], рака молочной железы [131] и рака простаты [132]. Изучение
ловастатина также показало его способность подавлять канцерогенез. Ловастатин
замедляет рост и вызывает апоптоз клеток рака поджелудочной железы [133],
злокачественной глиомы [134], рака простаты [135], и рака молочной железы
[136]. Обнаруженная in vitro эффективность обоих веществ в отношении
различных форм рака указывает на то, что механизм действия данных препаратов
затрагивает базовые внутриклеточные пути канцерогенеза. Можно предположить,
что в опухолях, ассоциированных с НФ II, не смотря на их доброкачественную
природу, задействованы те же самые процессы. Таким образом, ловастатин и
церуленин, выбранные по результатам скрининга и прошедшие первичную
валидацию, потенциально являются перспективными препаратами в борьбе в
новообразованиями, возникающими при НФ II.
Исследование механизма действия ловастатина в отношении Nf2отрицательных клеток
Эксперименты по подавлению действия статинов.
Ловастатин является ингибитором 3-гидрокси-3-метилглутарил-коА
редуктазы, фермента, который осуществляет синтез холестерола из мевалоната.
Статины блокируют первую стадию синтеза – превращение ацетил-коА в
мевалонат (рис. 24).
73
Рисунок 24. «Схема синтеза холестерола»
Чтобы выяснить, какой из этапов синтеза является ключевым для
жизнедеятельности Nf2-отрицательных клеток, в среду совместно с ловастатином
добавили холестерол или промежуточные продукты. Холестерол и ланостерол
(первый продукт, содержащий скваленовое кольцо) не влияли на токсичность
статинов, однако фарнезилфосфат и геранилгераниолфосфат полностью
подавляли действие статинов (рис. 25).
Рисунок 5. «Подавление действия статинов при добавлении
фарнезилфосфата и геранилгераниолфосфата»
74
ФФ – фарнезилфосфат, ГГФ – геранилгераниолфосфат. Фарнезилфосфат или
геранилгераниолфосфат в концентрации 5мкМ добавляли вместе с указанными концентрациями
симвастатина через 4 часа после высева клеток и инкубировали 48 часов. Эксперименты повторяли
в трипликатах 4 раза. На графиках отображены средние значения и доверительный интервал для
вероятности 95%
Истощение внутриклеточного пула геранилгераниола – ключевого звена
селективной токсичности статинов
Геранилгераниолфосфат и фарнезилфосфат необходимы для
пренилирования и заякоривания на мембране некоторых белков (рис. 26).
75
Рисунок 26. «Внутриклеточные функции промежуточных продуктов
синтеза холестерола»
Поскольку геранилгераниолфосфат может быть синтезирован в клетке из
фарнезилфосфата, были использовали различные ингибиторы
фарнезилтрансфераз и геранилтрансфераз, чтобы выяснить, какой из процессов
определяет селективную токсичность статинов. Ингибиторы фарнезилтрансфераз
(фарнезилтиосалициловая кислота) показали одинаково низкую токсичность в
отношении обеих клеточных линий. Только ингибиторы геранилтрансферазы
обладали селективной токсичностью в отношении Nf2-отрицательных клеток
(рис. 27)
76
Рисунок 27. «Ингибиторы геранилтрансфераз обладают селективной
токсичностью в отношении Nf2-отрицательных клеток»
Золедронат – неспецифический ингибитор геранилтрансфераз, GGTI-298 – специфический
ингибитор геранилтрансферазы I. Эксперименты повторяли в трипликатах 4 раза. На графиках
отображены средние значения и доверительный интервал для вероятности 95%
77
Учитывая, что специфический ингибтор геранилтрансферазы I GGTI-298
проявил выраженную селективную токсичность в отношении Nf2-отрицательных
клеток, можно предположить, что именно нарушение геранилирования белков
геранилтрансферазой I (GT I) определяет селективную токсичность ловастатина в
отношении этих клеток.
При активации Rac1 нарушение её геранилирования приводит к клеточной
гибели.
К белкам, геранилируемых GT I, относятся малые ГТФазы семейств Rho,
Rac, Ral и Rap, субъединицы G-белков и др. Отличительным признаком
геранилируемых белков является наличие С-концевой последовательности
CAAX, где C – цистеин, А – алифатические аминоксилоты, X – L, F, I, V или M.
Поскольку наиболее значимыми мишенями GT I являются ГТФазы семейств Rho
и Rac, мы применили ингибиторы активности этих ферментов. Ингибирование
ГТФазы RhoA привело к незначительному снижению количества
жизнеспособных клеток MEF Nf2-/-, а ингибирование Rac1 – к незначительному
его повышению. Поскольку RhoA ингибирует Rac1, было выдвинуто
предположение, что играть роль может не ингибирование, а, наоборот, активация
ГТФаз Rac. Химическое и генетическое повышение активности Rac привело к
потенциированию эффекта статинов, в особенности, в Nf2-положительных
клетках (рис. 28 и 29).
78
Рисунок 28. «Активатор ГТФаз семейства Rac потенциирует эффект
симвастатина»
А)
Б)
А) Активатор ГТФаз семейства Rac EHT1864 добавляли в указанных концентрациях
через 4 часа после высева клеток и инкубировали 48 часов.
Б) EHT1864 в концентрации 5 мкМ (~IC50 для клеток MEF NF2f/f) добавляли вместе с
указанными концентрациями симвастатина через 4 часа после высева клеток и инкубировали 48
часов. Эксперименты повторяли в трипликатах 4 раза. На графиках отображены средние
значения и доверительный интервал для вероятности 95%
79
Рисунок 29. «Генетическая активация ГТФаз семейства Rac потенциирует
эффект симвастатина»
Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f трансфецировали пдизмидными векторами
pCDNA3-Cdc42 или pCDNA3-Rac1 (отрицательный контроль) и pCDNA3-Cdc42L61 или
pCDNA3-Rac1L61, кодирующими перманентно активные формы белков Cdc42 и Rac1. Через
сутки после трансфекции в культуральную среду добавили указанные концентрации
симвастатина и инкубировали 48 часов. Эксперименты повторяли в трипликатах 4 раза. На
графиках отображены средние значения и доверительный интервал для вероятности 95%
80
Поскольку известно, что мерлин является ингибитором Rac, и в Nf2отрицательных клетках наблюдается их патологическая активация, можно
предположить, что нарушение геранилирования и, следовательно, заякоривания
активированной Rac на мембране вызывает клеточную гибель.
Выключение гена Rac1, как и следовало ожидать, приводило к подавлению
токсичности симвастатина (рис. 30). Выключение генов других ГТФаз семейства
Rac и Cdc42 не давало столь выраженного эффекта антагонизма.
Рисунок 30. «Подавление эффекта симвастатина при выключении гена
Rac1»
Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f трансфецировали некодирующей миРНК
(отрицательный контроль) и миРНК против гена Rac1. Через сутки после трансфекции в
культуральную среду добавили указанные концентрации симвастатина и инкубировали 48
часов. Эксперименты повторяли в трипликатах 4 раза. На графиках отображены средние
значения и доверительный интервал для вероятности 95%
Транслокация Rac1 в ядро под действием статинов
С помощью флуоресцентной микроскопии было установлено, что под
действием статинов происходит транслокация Rac1 в ядро. Клетки линий MEF
Nf2-/- и MEF Nf2f/f трансфецировали плазмидным вектором, кодирующим фьюжнбелок Rac1-GFP, и через 24 часа после трансфекции в среду был добавлен
81
симвастатин. Через час инкубации с симвастатином в большинстве клеток линии
MEF Nf2-/- Rac1 визуализировалась преимущественно в ядре. Тем не менее, через
24 часа транслокация наблюдалась уже в обеих клеточных линиях (рис. 31)
Рисунок 31. «Транслокация Rac1 в ядро в отсутствие геранилирования»
Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f инкубировали с 1 мкМ симвастатином в течение
суток. Микроскопию осуществляли на инвертированном флуоресцентном микроскопе,
увеличение 20х
Для сравнения активности ядерной фракции Rac1 в клеточных линиях был
использован метод резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) (рис.
32). Для этого клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f были трансфецированы
плазмидными векторами, кодирующими сенсоры активности Rac1: белок-фьюжн
Rac1-CFP и белок-фьюжн Pid-YFP, являющийся субстратом Rac1. Исследование
показало, что в клетках линии MEF Nf2-/- Rac1 под действием статинов
активируется, а в клетках линии MEF Nf2f/f её активность не меняется (рис. 32)
82
Рисунок 32. «Измерение активности ядерной Rac1 с помощью
флуоресцентного резонансного переноса энергии»
А)
Б)
Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f котрансфецировали плазмидными векторами
pCyPet-Rac1 и pYPet-PID и инкубировали с 1 мкМ симвастатином в течение суток. А) 1 –
клетки, инкубированные с ДМСО (отр. контроль), 2 – клетки, инкубированные с
симвастатином. Микроскопию осуществляли на конфокальном флуоресцентном микроскопе
Leica TCS SP8, увеличение 40х. На рисунке представлены наложение изображений с детекторов
сигналов CFP и YFP и обработанные изображения, демонстрирующие отсутствие (синий цвет)
или наличие (оранжевый цвет) FRET. Б) Измерения проводили с помощью встроенного
программного обеспечения. В качестве контролей засветки каналов выполняли
индивидуальные трансфекции векторами pCyPet-Rac1 и pYPet-PID. Представлены средние
значения и доверительный интервал для вероятности 95%.
83
Таким образом, было доказано, что статины вызывают истощение
внутриклеточного пула геранилгераниола, приводящее к нарушению
геранилирования малых ГТФаз, в частности Rac1. Под действием статинов Rac1
разъякоривается, отсоединяется от клеточной мембраны и транслоцируется в
ядро. В Nf2-отрицательных клетках разъякоренная Rac1 активируется и вызывает
клеточную гибель. Ранее было показано, что статины могут вызывать активацию
Rac [137]. По-видимому, именно эта дополнительная активация позволила
определить разницу в уровнях активации Rac между Nf2-отрицательными и
контрольными клетками.
Хорошо описана роль активации Rac в молекулярных механизмах
канцерогенеза. Например, были описаны фосфорилирование киназ семейства Pak
[138] и активация фактора транскрипции Stat3 [139] активной формой Rac.
Однако есть лишь одна статья [8], демонстрирующая роль активированной Rac1 в
цитоплазме. Ядерные цитотоксические функции Rac1 до сих пор не были
описаны и подлежат дальнейшему изучению.
Ингибиторы синтазы жирных кислот (FASN) как потенциальные препараты
для фармакотерапии НФ II
Церуленин – второе по эффективности соединение, прошедшее валидацию
– является ингибитором синтазы жирных кислот. Поскольку фармакологические
аналоги церуленина обладают селективной токсичностью в отношении Nf2отрицательных клеток, можно предположить, что этот фермент имеет большое
значение для клеток опухолей, развивающихся в результате утраты гена Nf2. Был
проведён ряд экспериментов, чтобы установить причину, по которой нормальное
функционирование Fasn особенно важно именно для Nf2-отрицательных клеток.
84
Сходство эффектов от нокдауна гена Fasn и действия церуленина на Nf2отрицательные клетки.
Наряду с химическим ингибированием Fasn были применены малые
интерферирующие РНК против гена синтазы жирных кислот Fasn. Клетки линий
MEF Nf2-/- and MEF Nf2flox/flox трансфецировали шпилечной РНК против гена Fasn
в плазмидном векторе pGFP-V-RS. Данный вектор содержит ген зелёного
флуоресцентного белка (GFP), позволяющий идентифицировать успешно
трансфецированные клетки по зелёной флуоресценции. Через 24 часа после
трансфекции в чашках с клетками MEF Nf2-/-, трансфецированными РНК против
гена Fasn, наблюдались округлившиеся всплывшие клетки, подвергшиеся
апоптозу (рис. 33). В чашках с клетками MEF Nf2-/-, трансфецированными
контрольной РНК, а также в чашках с клетками MEF Nf2f/f клеточной гибели не
наблюдалось.
85
Рисунок 33 «Выключение гена Fasn в клетках линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f»
Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f трансфецировали вектором T30013 c
некодирующей шпилечной РНК (отрицательный контроль) и вектором co шпилечной РНК
против гена Fasn. Микроскопию проводили через сутки на инвертированном флуоресцентном
микроскопе при 20-кратном увеличении.
Для количественной оценки апоптоза, вызванного выключением гена Fasn,
а также для сравнения действия церуленина с эффектом нокдауна Fasn, был
выполнен иммуноблоттинг с антителами против ээфекторной каспазы 3, которая
86
является надёжным индикатором апоптоза. Для приготовления лизатов для
блоттинга были использованы 6 групп образцов: клетки линий MEF Nf2-/- и MEF
Nf2flox/flox , трансфецированные миРНК против гена Fasn, клетки,
трансфецированные контрольной РНК, и клетки, трансфецированные
контрольной РНК и инкубированные с 10µM церуленином в течение 12 часов.
Значительное повышение уровня апоптоза наблюдалось только в лизатах клеток
MEF Nf2-/-, трансфецированных шпилечной РНК против гена Fasn, и MEF Nf2-/-,
подвергнутых действию церуленина (рис. 34). Ещё одним отличием Nf2отрицательных клеток от контрольных оказалось снижение уровня экспрессии
Fasn под действием церуленина, которое наблюдалось только в клетках линии
MEF Nf2-/-.
Рисунок 34 «Сравнение действия церуленина и выключения гена Fasn в
клетках линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f»
Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f трансфецировали некодирующей миРНК
(отрицательный контроль) и миРНК против гена Fasn. Через сутки после трансфекции к части
клеток, трансфецированных контрольной РНК, добавили 10мкМ церуленин и инкубировали 12
часов. Эксперименты повторяли в дубликатах 3 раза. На графиках отображены средние
значения и доверительный интервал для вероятности 95%
87
Эксперименты по снижению цитотоксического действия церуленина.
Эксперименты с химическим ингибированием и генетическим
выключением синтазы жирных кислот доказали, что селективность церуленина
связана с его прямым механизмом действия и обусловлена зависимостью Nf2отрицательных клеток от нормального функционирования Fasn. При выключении
метаболического пути гибель клетки может наступать либо в результате дефицита
конечного продукта данного пути, либо из-за накопления токсичных
промежуточных метаболитов. Fasn осуществляет каскад реакций синтеза
насыщенных жирных кислот, постепенно наращивая углеродную цепочку от
малоната (С3) к пальмитату (С16) (рис. 35).
Рисунок 35 «Основные реакции синтеза насыщенных жирных кислот»
Поскольку для каждой из протестированных клеточных линий (MEF Nf2-/-,
MEF Nf2f/f, SC4-9 и RT4) IC50 церуленина в бессывороточной и полнй среде не
отличалась, а добавление 5 µM пальмитата не уменьшало токсичности
церуленина, мы сделали вывод, что апоптоз, вызываемый данным соединением,
не обусловлен дефицитом жирных кислот. В то же время, известно, что
церуленин блокирует раннюю стадию синтеза жирных кислот – конденсацию
88
малонил-коА, – что приводит к накоплению в клетках малоната [30, 31].
Малонил-коА, утилизируемый синтазой жирных кислот, синтезируется из ацетилкоА ферментом ацетил-коА карбоксилазой (Acc).
Рисунок 36 «Химическое модулирование синтеза жирных кислот»
Чтобы убедиться, что в данном случае механизм действия церуленина не
отличается от уже описанного, действие церуленина было оценено в клетках с
выключенным геном ацетил-коА карбоксилазы (Acaca). Клетки линий MEF Nf2-/и MEF Nf2f/f трансфецировали миРНК против гена Acaca и сравнили действие
церуленина на клетки с выключенным геном Acaca и клетки, трансфецированные
контрольной миРНК (рис. 37).
89
Рисунок 37 «Снижение токсичности церуленина при выключении гена
Асаса»
Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f трансфецировали некодирующей миРНК
(отрицательный контроль) и миРНК против гена Acaca. Через сутки после трансфекции в
культуральную среду добавили указанные концентрации церуленина и инкубировали 48 часов.
Эксперименты повторяли в трипликатах 4 раза. На графиках отображены средние значения и
доверительный интервал для вероятности 95%
90
Снижение уровня экспрессии гена Acaca подтвердили иммуноблоттингом
(рис. 38):
Рисунок 38 «Оценка эффективности выключения гена Асаса с помощью
РНК-интерференции»
Acaca – лизаты клеток, трансфецированных миРНК против гена Acaca, Конт. РНК –
лизаты клеток, трансфецированных некодирующей РНК. Иммуноблоттинг выполнили с
поликлональными антителами против ацетил-КоА карбоксилазы 1 и моноклональными
антителами против Gapdh
Химическое ингибирование Acc 5-тетрадецилокси-2-фуроевой кислотой
(ТОФК) также повышало IC50 церуленина (рис. 39).
91
Рисунок 39 «Снижение токсичности церуленина при химическом
ингибировании Асс»
Ингибитор Асс тетрадецилоксифуроевую кислоту (ТОФК) в концентрации 25 мкМ (~IC50
для клеток MEF NF2-/-) добавляли вместе с указанными концентрациями церуленина через 4 часа
после высева клеток и инкубировали 48 часов. Эксперименты повторяли в трипликатах 3 раза. На
графиках отображены средние значения и доверительный интервал для вероятности 95%
92
Активация Acc 5-йодотуберцидином, наоборот, делала клетки более
чувствительными к церуленину (рис. 40).
Рисунок 40 «Реактивация Асс с помощью 5-йодотуберцидина»
Активатор Асс йодотуберцидин в концентрации 2 мкМ (~IC50 для клеток MEF NF2f/f)
добавляли вместе с указанными концентрациями церуленина через 4 часа после высева клеток и
инкубировали 48 часов. Эксперименты повторяли в трипликатах 3 раза. На графиках отображены
средние значения и доверительный интервал для вероятности 95%
93
Примечательно, что эффект ТОФК более заметен на клетках MEF Nf2-/-, а
действие 5-йодотуберцидина, наоборот, сильнее проявляется на MEF Nf2flox/flox.
Подавление конденсации малонила, опосредованное церуленином,
приводит к повышению внутриклеточного уровня малоната, токсичного для
клеток. Поскольку конденсация блокируется в любых типах клеток, разница в
чувствительности к церуленину может объясняться различием в уровне синтеза
жирных кислот. Было показано, что у некоторых раковых клеток повышена
скорость липогенеза [125]. Мы предположили, что в клетках опухолей,
возникающих при НФ II, несмотря на их доброкачественную природу, может
наблюдаться такой же метаболический сдвиг.
Различия внутриклеточных уровней ацетил-коА и малонил-коА в клетках
линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2flox/flox
Для подтверждения гипотезы о различных уровнях метаболизма в
опухолевых и нормальных клетках, мы измерили с помощью высокоэффективной
жидкостной хроматографии с масс-спетрометрией (ВЭЖХ/МС) уровни ацетилкоА и малонил-коА в клетках линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f, часть которых была
обработана церуленином (рис. 41)
94
Рисунок 41 «Измерение внутриклеточных уровней ацетил-коА и малонилкоА с помощью ВЭЖХ/МС»
Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f инкубировали с ДМСО или 5мкМ церуленином в
течение 48 часов, после чего трипсинизировали и приготовляли образцы, как описано в разделе
«Материалы и Методы». Определение внутриклеточных уровней ацетил-КоА и малонил-КоА
проводили с помощью УВЭЖХ-МС/МС. Эксперименты повторяли 3 раза, на графиках
отображены средние значения и доверительный интервал для вероятности 95%
95
Результаты эксперимента подтверждают резкое повышение уровня
метаболизма в Nf2-отрицательных клетках, а также свидетельствуют о различной
реакции клеток MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f на воздействие церуленина. Было
обнаружено двукратное повышение базового уровня ацетил-коА в клетках MEF
Nf2-/-. Базовые уровни малонил-коА в клетках MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f отличались
незначительно, что, по-видимому, объясняется более высокой скоростью
потребления малоната Nf2-отрицательными клетками в последующих реакциях.
Под действием церуленина в клетках MEF Nf2-/- содержание ацетил-коА и,
особенно, малонил-коА резко повышалось (десятикратная разница для малонилкоА). В клетках MEF Nf2f/f уровни данных соединений под действием церуленина
не менялись или даже понижались (ацетил-коА), что свидетельствует о
существовании отрицательной обратной связи, нарушающейся с утратой гена Nf2.
Повышенный уровень синтеза жирных кислот в Nf2-отрицательных клетках
Синтаза жирных кислот осуществляет синтез насыщенных жирных кислот
de novo, используя малонил-коА в качестве исходного материала. Малонил-коА
синтезируется из ацетил-коА ацетил-коА карбоксилазой. Хотя непосредственно
реакции синтеза осуществляются Fasn, в процессе липогенеза участвует
множество вспомогательных ферментов, необходимых для синтеза молекулпредшественников и для утилизации продуктов (рис. 42)
96
Рисунок 42 «Схема синтеза насыщенных жирных кислот»
Для оценки различий в уровне синтеза жирных кислот в клетках MEF Nf2-/и MEF Nf2f/f, был выполнен иммуноблоттинг с антителами против Fasn, Acc, Acl,
Acecs1, Acsl1 и фосфо-Aсс и фосфо-Acl (рис. 43 и 44). Уровень Fasn и, что ещё
важнее, Асс, оказались существенно повышены в клетках MEF Nf2-/-.
Иммуноблоттинг также показал, что уровень фосфорилирования Асс в этих
клетках значительно ниже, чем в контрольных, что является признаком
повышения активности этого фермента (рис. 43 и 44). Низкий уровень
фосфорилирования Асс в клетках MEF Nf2-/- объясняет их слабую
чувствительность к 5-йодотуберцидину, механизм действия которого связан с
дефосфорилированием Асс. И, соответственно, отсутствие эффекта ТОФК в
клетках MEF Nf2f/f объясняется низким уровнем экспрессии Асс в этих клетках.
Иммуноблоттинг также выявил значительное повышение уровня экспрессии
остальных белков, участвующих в липогенезе, в клетках MEF Nf2-/- (рис. 43 и 44)
97
Рисунок 43 «Продукция и фосфорилирование белков, участвующих в
синтезе жирных кислот, в клетках линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f»
Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f инкубировали с ДМСО или 10мкМ церуленином в
течение 48 часов, после чего отмывали мёртвые клетки, а остальные анализировали методом
иммуноблоттинга, как описано в разделе «Материалы и методы». В качестве первичных
антител использовали набор Fatty Acid and Lipid Metabolism Antibody Sampler Kit (Cell Signaling
Technology, США, № 8335). В качестве контроля загрузки использовали Gapdh. Эксперименты
повторяли 4 раза. Лизаты каждого типа загружали в 2 лунки для контроля качества переноса.
На рисунке представлены типичные результаты.
98
Рисунок 44 «Количественная оценка продукции и фосфорилирования белков,
участвующих в синтезе жирных кислот, в клетках линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f»
99
– p ≤ 0,05; ** – p ≤ 0,01; *** – p ≤ 0,001; **** – p ≤ 0,0001; # – 0,1 ≤ p ≤ 0,05
Изображения, полученные при иммуноблоттинге, проанализировали с помощью
программы ImageJ. Интенсивность полосок, соответствующих исследуемому белку,
нормализовали к интенсивности полоски, соответствующей Gapdh. На графиках представлены
средние значения и доверительный интервал для вероятности 95%
Также была выполнена количественная ПЦР (кПЦР) для оценки уровня
экспрессии генов белков, участвующих в липогенезе (рис. 36). Результаты к ПЦР
показали значительное повышение уровня экспрессии всех исследуемых генов в
клетках линии MEF Nf2-/-, причём наиболее существенные различия наблюдались
в группе генов, продукты которых связаны с реакциями бета-окисления жирных
кислот (рис. 45).
100
Рисунок 45 «Экспрессия генов белков, участвующих в реакциях синтеза и βокисления жирных кислот»
*** – p ≤ 0,001
Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f выращивали в бессывороточных условиях.
Количественную ПЦР с обратной транскриптазой выполняли с использованием проб Taqman к
указанным генам. Уровень экспрессии исследуемых генов нормализовали к среднему значению
уровней экспрессии генов домашнего хозяйства Actinb, Tbp1 и Hrpt. Эксперименты повторяли 4
раза, на графиках представлены средние значения и доверительный интервал для вероятности
95%.
Реэкспрессия белка мерлин в клетках линии SC4-9 приводила к снижению
уровня продукции белков, вовлечённых в липогенез (рис. 46 и 47), повышению
уровня фосфорилирования Асс (рис. 46 и 47) и снижению экспрессии генов
белков, участвующих в синтезе жирных кислот (рис. 48)
101
Рисунок 46 «Влияние белка мерлин на продукцию и фосфорилирование
белков, участвующих в синтезе жирных кислот»
Клетки линии SC4-9, трансфецированные плазмидным вектором pBabe (отр. контроль) и
вектором pBabe-NF2, кодинующим белок мерлин, инкубировали с ДМСО или 10мкМ
церуленином в течение 48 часов, после чего отмывали мёртвые клетки, а остальные
анализировали методом иммуноблоттинга, как описано в разделе «Материалы и методы». В
качестве первичных антител использовали набор Fatty Acid and Lipid Metabolism Antibody
Sampler Kit (Cell Signaling Technology, США, № 8335). В качестве контроля загрузки
использовали Gapdh. Эксперименты повторяли 4 раза. Лизаты каждого типа загружали в 2
лунки для контроля качества переноса. На рисунке представлены типичные результаты.
102
Рисунок 47 «Влияние белка мерлин на продукцию и фосфорилирование
белков, участвующих в синтезе жирных кислот»
103
– p ≤ 0,05; ** – p ≤ 0,01; *** – p ≤ 0,001; **** – p ≤ 0,0001; # – 0,1 ≤ p ≤ 0,05
Изображения, полученные при иммуноблоттинге, проанализировали с помощью
программы ImageJ. Интенсивность полосок, соответствующих исследуемому белку,
нормализовали к интенсивности полоски, соответствующей Gapdh. На графиках представлены
средние значения и доверительный интервал для вероятности 95%
Рисунок 48 «Влияние белка мерлин на экспрессию генов белков,
участвующих в реакциях синтеза и β-окисления жирных кислот»
*** – p ≤ 0,001
Клетки линииSC4-9, трансфецированные плазмидным вектором pBabe (отр. контроль) и
вектором pBabe-NF2, кодинующим белок мерлин, выращивали в бессывороточных условиях.
Количественную ПЦР с обратной транскриптазой выполняли с использованием проб Taqman к
указанным генам. Уровень экспрессии исследуемых генов нормализовали к среднему значению
уровней экспрессии генов домашнего хозяйства Actinb, Tbp1 и Hrpt. Эксперименты повторяли 4
раза, на графиках представлены средние значения и доверительный интервал для вероятности
95%.
104
Наблюдаемые отличия в уровнях экспрессии генов и продукции белков в
клетках SC4-9-Babe и SC4-9-мерлин не так велики, как в клетках MEF Nf2-/- и
MEF Nf2f/f, поскольку исследования выполнялись не на клонах с контролируемой
экспрессией мерлина, а на смешанной популяции трансфецированных клеток, и
эффективность трансфекции составляла ≈ 30% (см. рис. 22).
Обнаруженные различия в уровнях экспрессии генов и продукции и
фосфорилирования белков, вовлечённых в синтез жирных кислот, доказывают,
что липогенез значительно повышен в Nf2-отрицательных клетках. В то же время,
повышение экспрессии генов и продукции белков, связанных с бета-окислением
жирных кислот, а также различия в реакции клеток MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f на
воздействие церуленина (например, противоположные изменения уровня Acsl1,
см. рис. 43 и 44) позволяют предположить, что утрата гена Nf2 вызывает
нарушения бета-окисления жирных кислот, что может служить дополнительным
механизмом селективности церуленина.
Эксперименты по изучению противоопухолевой активности
ловастатина, золендроновой кислоты и церуленина
в ксенографтной модели НФII на мышах
В исследованиях in vitro были установлены механизмы селективной
цитотоксичности ингибиторов 3-гидрокси-3-метилглутарил-коА редуктазы и
синтазы жирных кислот, что позволило предположить, что данные классы
соединений могут стать перспективными средствами терапии НФ II. Следующим
этапом доклинических испытаний этих веществ стали исследования на животных.
Был проведёг ряд ксенографтных экспериментов на бестимусных мышах (nu/nu) с
использованием клеток линий RT4 и SС4-9 (рис. 49).
105
Рисунок 49 «Тестирование ловастатина, зометы и церуленина в
ксенографтной модели НФ II на мышах»
А)
106
А) Ксенографты с использованием клеток крысиной шванномы. Бестимусным мышам (n
= 6) вводили 1 млн клеток, ресуспендированных в физиологическом растворе. Введение
масляных суспезий церуленина в дозе 2 мг/кг/день, ловастатина в дозе 1 мг/кг/день или
золедроновой кислоты в дозе 0,4 мг/кг/день с помощью желудочного зонда начинали на 3-й
день эксперимента. Через 3 недели лечения опухоли извлекали.
107
Б)
Б) Ксенографты с использованием клеток мышиной шванномы. Бестимусным мышам (n
= 5) вводили 3 млн клеток, ресуспендированных в матригеле. Введение масляных суспезий
церуленина в дозе 2 мг/кг/день, ловастатина в дозе 1 мг/кг/день или золедроновой кислоты в
дозе 0,4 мг/кг/день с помощью желудочного зонда начинали на 3-й день эксперимента. Через 4
недели лечения опухоли извлекали.
108
Введение исследуемых препаратов не приводило к уменьшению объёма уже
сформированных опухолей. Однако все три соединения значительно замедляли
рост опухолей при использовании их в качестве профилактических средств, то
есть, если лечение начинали вскоре после введения опухолевых клеток.
В экспериментах были использованы относительно низкие дозы препаратов
в связи с их высокой токсичностью. Умеренность лечебного действия церуленина
может быть объяснена его крайне низкой биодоступностью (около 3%) Также,
известно, что церуленин и его синтетический аналог С75 вызывают серьёзные
побочные эффекты, включая резкую потерю веса [129]. В данных исследованиях
мыши хорошо переносили вводимый препарат, потери веса не наблюдалось,
однако и лечебный эффект был умеренным. Возможно, следующие поколения
аналогов церуленина с лучшей биодоступностью и меньшим числом побочных
действий будут обладать большей противоопухолевой активностью.
109
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Была разработана клеточная система для исследования гена Nf2 in vitro и
выполнен химический скрининг с использованием этой системы. Из девяти
соединений-кандидатов, отобранных по результатам скрининга, два: ингибитор 3гидрокси-3-метилглутарил-коА редуктазы ловастатин и ингибитор синтазы
жирных кислот церуленин – успешно прошли валидацию и были отобраны для
последующих испытаний.
Было
доказано,
что
ингибирование
3-гидрокси-3-метилглутарил-коА
редуктазы вызывает истощение внутриклеточного пула геранил-гераниола, что
приводит к разъякориванию малой ГТФазы Rac1 и отсоединению её от клеточной
мембраны. Было установлено, что Rac1 активируется под действием статинов
только в Nf2-отрицательных клетках. Было также показано, что активация Rac1,
не ассоциированной с клеточной мембраной, приводит к клеточной гибели. Ранее
подобная роль Rac1 описана не была. В последующих исследованиях предстоит
выяснить механизм Rac1-опосредованной клеточной гибели.
Также было доказано, что утрата гена Nf2 приводит к метаболическому
сдвигу, заключающемуся в резком повышении скорости синтеза жирных кислот.
Nf2-отрицательные клетки зависимы от нормального функционирования синтазы
жирных кислот. Данные исследования позволяют предположить, что утрата гена
Nf2 приводит к нарушению бета-окисления жирных кислот, что негативно
отражается на энергетическом метаболизме этих клеток. Снижение продукции
энергии и повышенные энергетические потребности, обусловленные высокой
скоростью роста, приводят к резкому повышению синтеза жирных кислот и
зависимости от нормального функционирования участвующих в синтезе
ферментов.
Полученные результаты позволяют предположить обусловленные утратой
гена Nf2 глубокие сдвиги во всех метаболических путях. Известно, что для
раковых клеток характерна триада метаболических изменений: предпочтение
гликолиза перед митохондриальным окислением (эффект Варбурга), повышение
110
уровня липогенеза и повышение уровня глютаминолиза. В данной работе было
подтверждено повышение уровня липогенеза в Nf2-отрицательных клетках.
Последующие
исследования
будут
направлены
на
оценку
остальных
метаболических путей в этих клетках.
Несмотря на множество открытых вопросов, очевидно, что синтаза жирных
кислот, геранилтрансфераза I и 3-гидрокси-3-метилглутарил-коА редуктаза
представляют собой перспективные мишени для фармакотерапии НФ II.
Гиполипидемические препараты группы статинов, воздействующие на 3гидрокси-3-метилглутарил-коА редуктазу и препарат золедроновой кислоты
Зомета, применяющийся для лечения остеопороза и являющийся ингибитором
геранилтрансферазы
I,
являются
уже
одобренными
к
применению
лекарственными средствами, и, таким образом, для этих препаратов могут быть
начаты клинические испытания II и III фазы на пациентах с НФ II. И хотя
церуленин и его аналоги пока находится на стадии доклинических испытаний,
повышенный интерес к этой группе веществ позволяет надеяться, что вскоре
появится эффективное лекарственное средство, блокирующее синтазу жирных
кислот, которое можно будет применять для терапии НФ II.
111
ВЫВОДЫ
1.
Получена линия мышиных эмбриональных фибробластов, нокаутных по
гену Nf2, моделирующая нейрофиброматоз II типа.
2.
Сравнение данной линии с исходной (контрольной) показало, что
полученные Nf2-отрицательные клетки отличаются от контрольных по
морфологии (имеются признаки дезорганизации актинового цитоскелета,
отсутствуют плотные клеточные контакты), большей скоростью роста и
устойчивостью к неблагоприятным воздействиям среды.
3.
На полученных клеточных линиях проведён скрининг коллекции 486
низкомолекулярный биоактивных соединений, который выявил 9 веществ,
обладающих селективностью в отношении Nf2-отрицательных клеток.
•
Из отобранных по результатам скрининга 9 соединений-кандидатов 2
– ингибитор 3-гидрокси-3-метилглутарил-коА-редуктазы ловастатин
и ингибитор синтазы жирных кислот церуленин – прошли первичную
валидацию результатов скрининга, проявив стабильную
селективность в отношении различных Nf2-отрицательных клеток.
Селективность оказалась также характерна для фармакологических
аналогов данных соединений, а реэкспрессия белка мерлин в Nf2отрицательных клетках приводила к обращению токсичности
исследуемых соединений. При изучении механизмов действия данных
веществ селективная цитотоксичность в отношении Nf2отрицательных клеток была также установлена для ингибитора
геранилтрансфераз золедроновой кислоты.
4.
Исследование механизмов действия соединений, выбранных по результатам
скрининга, показало, что селективная цитотоксичность ловастатина в
отношении Nf2-отрицательных клеток обусловлена раъякориванием малой
ГТФазы Rac1 и отсоединением её от клеточной мембраны. Под действием
ловастатина Rac1 транслоцируется в ядро и актвируется в Nf2отрицательных клетках, вызывая клеточную гибель. Селективная
112
цитотоксичность церуленина обусловлена различиями в уровнях
метаболизма жирных кислот в Nf2-отрицательных и нормальных клетках.
Было показано, что под влиянием церуленина накопление промежуточных
продуктов синтеза насыщенных жирных кислот происходит интенсивнее в
Nf2-отрицательных клетках. Также, в Nf2-отрицательных клетках повышен
уровень экспрессии ферментов, участвующих в липогенезе.
5.
Ингибитор
3-гидрокси-3-метилглутарил-коА-редуктазы
ловастатин,
ингибитор геранилтрансферазы I золедроновая кислота и ингибитор
синтазы
жирных
кислот
церуленин
обладают
выраженной
противоопухолевой активностью в испытаниях in vivo на мышах с
ксенографтной трансплантацией мышиных и крысиных шванном. Все три
соединения снижали скорость роста шванном на 80% по сравнению с
контрольной группой.
113
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Материалы диссертационной работы могут быть использованы в разработке
фармакопрепаратов для лечения НФ II. Описанные в данной работе изменения
метаболизма жирных кислот, характерные для опухолей, ассоциированных с НФ
II, позволяют применить новый подход к терапии данного заболевания и могут
способствовать дальнейшему изучению применения ингибиторов синтазы
жирных кислот в терапии доброкачественных опухолей нервной системы.
Противоопухолевая активность золедроновой кислоты и комбинации
золедроновой кислоты с ловастатином может быть исследована в клинических
испытаниях данных соединений как противоопухолевых лекарственных средств
при Rac1-зависимых онкологических заболеваниях.
БЛАГОДАРНОСТИ
Автор благодарит научного руководителя Николая Львовича Шимановского
(РНИМУ им. Пирогова) и научного консультанта Джонатана Чернова (ФоксЧейзовский Онкологический Центр) за помощь в организации и планировании
работы, сотрудников Фокс-Чейзовского Онкологического Центра: Маргрет
Эйнарсон (управление скрининговым роботом), Йан Жу (статистическая
обработка результатов скрининга), Йин-Минг Куо (управление хроматографом с
масс-спектрометрией) и Галину Семёнову (помощь при измерении опухолей в
ксенографтной модели); а также Марко Джованнини (Институт Гематологии,
Париж) за предоставленные клетки и клеточные линии.
114
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Evans, D.G., et al., A genetic study of type 2 neurofibromatosis in the United
Kingdom. I. Prevalence, mutation rate, fitness, and confirmation of maternal
transmission effect on severity. J Med Genet, 1992. 29(12): p. 841-6.
Bianchi, A.B., et al., Mutations in transcript isoforms of the neurofibromatosis 2
gene in multiple human tumour types. Nat Genet. , 1994 6(2): p. 185-92.
Cheng, J.Q., et al., Frequent mutations of NF2 and allelic loss from chromosome
band 22q12 in malignant mesothelioma: evidence for a two-hit mechanism of
NF2 inactivation. Genes Chromosomes Cancer, 1999 24(3): p. 238-42.
Rouleau, G.A., et al., Alteration in a new gene encoding a putative membraneorganizing protein causes neuro-fibromatosis type 2. Nature, 1993. 363(6429): p.
515-21.
Lallemand, D., et al., NF2 deficiency promotes tumorigenesis and metastasis by
destabilizing adherens junctions. Genes Dev, 2003. 17(9): p. 1090-100.
Plotkin, S.R., et al., Audiologic and radiographic response of NF2-related
vestibular schwannoma to erlotinib therapy. Nat Clin Pract Oncol, 2008 5(8): p.
487-91.
Plotkin, S.R., et al., Hearing improvement after bevacizumab in patients with
neurofibromatosis type 2. N Engl J Med, 2009. 361(4): p. 358-67.
Liang, S.L., H. Liu, and A. Zhou, Lovastatin-induced apoptosis in macrophages
through the Rac1/Cdc42/JNK pathway. J Immunol, 2006. 177(1): p. 651-6.
Мельников, Р.А. and В.В. Китаев, Нейрофиброматоз, in Большая
медицинская энциклопедия, Б.В. Петровского, Editor. 1981, Советская
энциклопедия. p. 310-311.
Parry, D.M., et al., Germ-line mutations in the neurofibromatosis 2 gene:
correlations with disease severity and retinal abnormalities. Am J Hum Genet,
1996. 59(3): p. 529-39.
Baser, M.E., et al., Presymptomatic diagnosis of neurofibromatosis 2 using linked
genetic markers, neuroimaging, and ocular examinations. Neurology, 1996.
47(5): p. 1269-77.
Ruttledge, M.H. and G.A. Rouleau, Role of the neurofibromatosis type 2 gene in
the development of tumors of the nervous system. Neurosurg Focus. 19(5): p. E6.
Козлов, А.В., ed. Нейрофиброматоз 2 (НФ2) Хирургия опухолей основания
черепа, ed. А.Н. Коновалов. 2004, Можайский полиграфический комбинат.
169-170.
Patronas, N.J., et al., Intramedullary and spinal canal tumors in patients with
neurofibromatosis 2: MR imaging findings and correlation with genotype.
Radiology, 2001. 218(2): p. 434-42.
Mautner, V.F., et al., The neuroimaging and clinical spectrum of
neurofibromatosis 2. Neurosurgery, 1996. 38(5): p. 880-5; discussion 885-6.
Okada, T., L. You, and F.G. Giancotti, Shedding light on Merlin's wizardry.
Trends Cell Biol, 2007. 17(5): p. 222-9.
115
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
Ahronowitz, I., et al., Mutational spectrum of the NF2 gene: a meta-analysis of
12 years of research and diagnostic laboratory findings. Hum Mutat, 2007.
28(1): p. 1-12.
McClatchey, A.I., et al., The Nf2 tumor suppressor gene product is essential for
extraembryonic development immediately prior to gastrulation. Genes Dev, 1997.
11(10): p. 1253-65.
den Bakker, M.A., et al., Expression of the neurofibromatosis type 2 gene in
human tissues. J Histochem Cytochem, 1999. 47(11): p. 1471-80.
Kalamarides, et al., Nf2 gene inactivation in arachnoidal cells is rate-limiting for
meningioma development in the mouse. Genes Dev. , 2002. 16(9): p. 1060-5.
Giovannini, M., et al., Conditional biallelic Nf2 mutation in the mouse promotes
manifestations of human neurofibromatosis type 2. Genes Dev, 2000. 14(13): p.
1617-30.
Fleury-Feith, J., et al., Hemizygosity of Nf2 is associated with increased
susceptibility to asbestos-induced peritoneal tumours. Oncogene. 22(24): p.
3799-805.
Lasota, J., et al., The neurofibromatosis type 2 gene is mutated in perineurial cell
tumors: a molecular genetic study of eight cases. Am J Pathol. , 2001. 158(4): p.
1223-9.
Pineau, P., et al., Homozygous deletion scanning in hepatobiliary tumor cell lines
reveals alternative pathways for liver carcinogenesis. Hepatology, 2003. 37(4): p.
852-61.
Sheikh, H.A., et al., Molecular genotyping of medullary thyroid carcinoma can
predict tumor recurrence. Am J Surg Pathol. , 2004 28(1): p. 101-6.
Poulikakos, P.I., et al., Re-expression of the tumor suppressor NF2/merlin
inhibits invasiveness in mesothelioma cells and negatively regulates FAK.
Oncogene, 2006. 25(44): p. 5960-8.
MacCollin, M., et al., DNA diagnosis of neurofibromatosis 2. Altered coding
sequence of the merlin tumor suppressor in an extended pedigree. JAMA, 1993.
270(19): p. 2316-20.
Sherr, C.J., Principles of tumor suppression. Cell, 2004. 116(2): p. 235-46.
Bretscher, A., K. Edwards, and R.G. Fehon, ERM proteins and merlin:
integrators at the cell cortex. Nat Rev Mol Cell Biol, 2002 3(8): p. 586-99.
Lankes, W.T. and H. Furthmayr, Moesin: a member of the protein 4.1-talin-ezrin
family of proteins. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(19): p. 8297-301.
Gonzalez-Agosti, C., et al., The merlin tumor suppressor localizes preferentially
in membrane ruffles. Oncogene, 1996. 13(6): p. 1239-47.
McClatchey, A.I., Merlin and ERM proteins: unappreciated roles in cancer
development? Nat Rev Cancer, 2003. 3(11): p. 877-83.
Morrison, H., et al., The NF2 tumor suppressor gene product, merlin, mediates
contact inhibition of growth through interactions with CD44. Genes Dev, 2001.
15(8): p. 968-80.
116
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
Shaw, R.J., A.I. McClatchey, and T. Jacks, Regulation of the neurofibromatosis
type 2 tumor suppressor protein, merlin, by adhesion and growth arrest stimuli. J
Biol Chem, 1998. 273(13): p. 7757-64.
Kissil, J.L., et al., Merlin phosphorylation by p21-activated kinase 2 and effects
of phosphorylation on merlin localization. J Biol Chem, 2002. 277(12): p. 103949
Shaw, R.J., et al., The Nf2 tumor suppressor, merlin, functions in Rac-dependent
signaling. Dev Cell, 2001. 1(1): p. 63-72.
Xiao, G.H., et al., p21-activated kinase links Rac/Cdc42 signaling to merlin. J
Biol Chem, 2002. 277(2): p. 883-6.
Rong, R., et al., Serine 518 phosphorylation modulates merlin intramolecular
association and binding to critical effectors important for NF2 growth
suppression. Oncogene, 2004. 23(52): p. 8447-54.
Alfthan, K., et al., Cyclic AMP-dependent protein kinase phosphorylates merlin
at serine 518 independently of p21-activated kinase and promotes merlin-ezrin
heterodimerization. J Biol Chem, 2004. 279(18): p. 18559-66.
Barret, C., et al., Mutagenesis of the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate
(PIP(2)) binding site in the NH(2)-terminal domain of ezrin correlates with its
altered cellular distribution. J Cell Biol, 2000. 151(5): p. 1067-80.
Jin, H., et al., Tumorigenic transformation by CPI-17 through inhibition of a
merlin phosphatase. Nature, 2006. 442(7102): p. 576-9.
Okada, T., M. Lopez-Lago, and F.G. Giancotti, Merlin/NF-2 mediates contact
inhibition of growth by suppressing recruitment of Rac to the plasma membrane.
J Cell Biol, 2005. 171(2): p. 361-71.
Takizawa, N., Y. Koga, and M. Ikebe, Phosphorylation of CPI17 and myosin
binding subunit of type 1 protein phosphatase by p21-activated kinase. Biochem
Biophys Res Commun, 2002. 297(4): p. 773-8.
Maeda, M., et al., Expression level, subcellular distribution and rho-GDI binding
affinity of merlin in comparison with Ezrin/Radixin/Moesin proteins. Oncogene,
1999. 18(34): p. 4788-97.
James, M.F., et al., The neurofibromatosis 2 protein product merlin selectively
binds F-actin but not G-actin, and stabilizes the filaments through a lateral
association. Biochem J, 2001. 356(Pt2): p. 377-86.
Brault, E., et al., Normal membrane localization and actin association of the NF2
tumor suppressor protein are dependent on folding of its N-terminal domain. J
Cell Sci, 2001. 114(Pt 10): p. 1901-12.
Scoles, D.R., et al., Neurofibromatosis 2 tumour suppressor schwannomin
interacts with betaII-spectrin. Nat Genet., 1998. 18(4): p. 354-9.
Grönholm, M., et al., Homotypic and heterotypic interaction of the
neurofibromatosis 2 tumor suppressor protein merlin and the ERM protein ezrin.
J Cell Sci, 1999. 112(Pt 6): p. 895-904.
Meng, J.J., et al., Interaction between two isoforms of the NF2 tumor suppressor
protein, merlin, and between merlin and ezrin, suggests modulation of ERM
proteins by merlin. J Neurosci Res, 2000. 62(4): p. 491-502.
117
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
65.
Nguyen, R., D. Reczek, and A. Bretscher, Hierarchy of merlin and ezrin N- and
C-terminal domain interactions in homo- and heterotypic associations and their
relationship to binding of scaffolding proteins EBP50 and E3KARP. J Biol Chem,
2001. 276(10): p. 7621-9.
Fernandez-Valle, C., et al., Paxillin binds schwannomin and regulates its densitydependent localization and effect on cell morphology. Nat Genet., 2002. 31(4): p.
354-62.
Pelton, P.D., et al., Ruffling membrane, stress fiber, cell spreading and
proliferation abnormalities in human Schwannoma cells. Oncogene, 1998.
17(17): p. 2195-209.
Hirokawa, Y., et al., A clue to the therapy of neurofibromatosis type 2:
NF2/merlin is a PAK1 inhibitor. Cancer J, 2004. 10(1): p. 20-6.
Johnson, K.C., et al., Cellular transformation by a FERM domain mutant of the
Nf2 tumor suppressor gene. Oncogene, 2002. 21(39): p. 5990-7.
Hamaratoglu, F., et al., The tumour-suppressor genes NF2/Merlin and Expanded
act through Hippo signalling to regulate cell proliferation and apoptosis. Nat
Cell Biol, 2006. 8(1): p. 27-36.
Maitra, S., et al., The tumor suppressors Merlin and Expanded function
cooperatively to modulate receptor endocytosis and signaling. Curr Biol, 2006.
16(7): p. 702-9.
Silva, E., et al., The tumor-suppressor gene fat controls tissue growth upstream of
expanded in the hippo signaling pathway. Curr Biol, 2006. 16(21): p. 2081-9.
Xiao, G.H., J. Chernoff, and J.R. Testa, NF2: the wizardry of merlin. Genes
Chromosomes Cancer, 2003. 38(4): p. 389-99.
McClatchey, A.I. and M. Giovannini, Membrane organization and
tumorigenesis--the NF2 tumor suppressor, Merlin. Genes Dev, 2005. 19(19): p.
2265-77.
Bosco, E.E., et al., NF2-deficient cells depend on the Rac1-canonical Wnt
signaling pathway to promote the loss of contact inhibition of proliferation.
Oncogene, 2010. 29(17): p. 2540-9.
Manchanda, P.K., et al., Rac1 is required for Prkar1a-mediated Nf2 suppression
in Schwann cell tumors. Oncogene, 2013. 32: p. 3491–3499.
Qiu, R.G., et al., An essential role for Rac in Ras transformation. Nature, 1995.
374(6521): p. 457-9.
Hill, C.S., J. Wynne, and R. Treisman, The Rho family GTPases RhoA, Rac1, and
CDC42Hs regulate transcriptional activation by SRF. Cell, 1995. 81(7): p. 115970.
Khosravi-Far, R., et al., Activation of Rac1, RhoA, and mitogen-activated protein
kinases is required for Ras transformation. Mol Cell Biol, 1995 15(11): p. 644353.
Scott, G.A. and L. Cassidy, Rac1 mediates dendrite formation in response to
melanocyte stimulating hormone and ultraviolet light in a murine melanoma
model. J Invest Dermatol, 1998. 111(2): p. 243-50.
118
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
Pervaiz, S., et al., Activation of the RacGTPase inhibits apoptosis in human tumor
cells. Oncogene, 2001. 20(43): p. 6263-8.
Hodgson, L., A.J. Henderson, and C. Dong, Melanoma cell migration to type IV
collagen requires activation of NF-kappaB. Oncogene, 2003. 22(1): p. 98-108.
Shieh, D.B., et al., Cell motility as a prognostic factor in Stage I nonsmall cell
lung carcinoma: the role of gelsolin expression. Cancer, 1999. 85(1): p. 47-57.
Soon, L.L., et al., Overexpression of WISP-1 down-regulated motility and
invasion of lung cancer cells through inhibition of Rac activation. J Biol Chem,
2003. 278(13): p. 11465-70.
Lee, T.K., et al., Significance of the Rac signaling pathway in HCC cell motility:
implications for a new therapeutic target. Carcinogenesis, 2005. 26(3): p. 681-7.
Liu, J.F., et al., Functional Rac-1 and Nck signaling networks are required for
FGF-2-induced DNA synthesis in MCF-7 cells. Oncogene, 1999. 18(47): p. 642533.
Mira, J.P., et al., Endogenous, hyperactive Rac3 controls proliferation of breast
cancer cells by a p21-activated kinase-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U
S A, 2000. 97(1): p. 185-9.
Keely, P.J., et al., Cdc42 and Rac1 induce integrin-mediated cell motility and
invasiveness through PI(3)K. Nature, 1997. 390(6660): p. 632-6.
Scoles, D.R., et al., The neurofibromatosis 2 tumor suppressor protein interacts
with hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate. Hum Mol
Genet, 2000. 9(11): p. 1567-74.
Komada, M., et al., Hrs, a tyrosine kinase substrate with a conserved double zinc
finger domain, is localized to the cytoplasmic surface of early endosomes. J Biol
Chem, 1997. 272(33): p. 20538-44.
Simonsen, A., et al., EEA1 links PI(3)K function to Rab5 regulation of endosome
fusion. Nature, 1998. 394(6692): p. 494-8.
Shih, S.C., et al., Epsins and Vps27p/Hrs contain ubiquitin-binding domains that
function in receptor endocytosis. Nat Cell Biol, 2002. 4(5): p. 389-93.
Raiborg, C. and H. Stenmark, Hrs and endocytic sorting of ubiquitinated
membrane proteins. Cell Struct Funct, 2002. 27(6): p. 403-8.
Lloyd, T.E., et al., Hrs regulates endosome membrane invagination and tyrosine
kinase receptor signaling in Drosophila. Cell, 2002. 108(2): p. 261-9.
Asao, H., et al., Hrs is associated with STAM, a signal-transducing adaptor
molecule. Its suppressive effect on cytokine-induced cell growth. J Biol Chem,
1997. 272(52): p. 32785-91.
Takeshita, T., et al., STAM, signal transducing adaptor molecule, is associated
with Janus kinases and involved in signaling for cell growth and c-myc induction.
Immunity, 1997. 6(4): p. 449-57.
Scoles, D.R., et al., Neurofibromatosis 2 (NF2) tumor suppressor schwannomin
and its interacting protein HRS regulate STAT signaling. Hum Mol Genet, 2002.
11(25): p. 3179-89.
119
López-Lago, M.A., et al., Loss of the tumor suppressor gene NF2, encoding
merlin, constitutively activates integrin-dependent mTORC1 signaling. Mol Cell
Biol., 2009. 29(15): p. 4235-49.
84. James, M.F., et al., NF2/merlin is a novel negative regulator of mTOR complex 1,
and activation of mTORC1 is associated with meningioma and schwannoma
growth. Mol Cell Biol, 2009. 29(15): p. 4250-61.
85. Li, W., et al., Merlin/NF2 suppresses tumorigenesis by inhibiting the E3 ubiquitin
ligase CRL4(DCAF1) in the nucleus. Cell, 2010 Feb 19. 140(4): p. 477-90.
86. Lallemand, D., A.L. Saint-Amaux, and M. Giovannini, Tumor-suppression
functions of merlin are independent of its role as an organizer of the actin
cytoskeleton in Schwann cells. J Cell Sci, 2009 Nov 15. 122(Pt 22): p. 4141-9.
87. Ammoun, S., et al., Dissecting and targeting the growth factor-dependent and
growth factor-independent extracellular signal-regulated kinase pathway in
human schwannoma. Cancer Res. 68(13): p. 5236-45.
88. Ammoun, S., et al., Nilotinib alone or in combination with selumetinib is a drug
candidate for neurofibromatosis type 2. Neuro Oncol, 2011. 13(7): p. 759-66.
89. Ahmad, Z.K., et al., ErbB expression, activation, and inhibition with lapatinib
and tyrphostin (AG825) in human vestibular schwannomas. Otol Neurotol, 2011.
32(5): p. 841-7.
90. Giovannini, M., et al., mTORC1 inhibition delays growth of neurofibromatosis
type 2 schwannoma. Neuro Oncol, 2014. 16(4): p. 493-504.
91. Brooks, C.L. and W. Gu, p53 regulation by ubiquitin. FEBS Lett, 2011. 585(18):
p. 2803-9.
92. John, J., et al., Kinetics of interaction of nucleotides with nucleotide-free H-ras
p21. Biochemistry, 1990. 29(25): p. 6058-65.
93. Radu, M., et al., PAK signalling during the development and progression of
cancer. Nat Rev Cancer, 2014. 14(1): p. 13-25.
94. Bradshaw-Pierce, E.L., et al., Tumor P-Glycoprotein Correlates with Efficacy of
PF-3758309 in in vitro and in vivo Models of Colorectal Cancer. Front
Pharmacol, 2013. 4:22.
95. Vander Heiden, M.G., L.C. Cantley, and C.B. Thompson, Understanding the
Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science, 2009.
324(5930): p. 1029-33.
96. WARBURG, O., On respiratory impairment in cancer cells. Science, 1956.
124(3215): p. 269-70.
97. Robey, I.F., et al., Regulation of the Warburg effect in early-passage breast
cancer cells. Neoplasia, 2008. 10(8): p. 745-56.
98. Zhao, Y., E.B. Butler, and M. Tan, Targeting cellular metabolism to improve
cancer therapeutics. Cell Death Dis, 2013. 4: p. e532.
99. Pandey, P.R., et al., Anti-cancer drugs targeting fatty acid synthase (FAS).
Recent Pat Anticancer Drug Discov, 2012. 7(2): p. 185-97.
100. Wise, D.R. and C.B. Thompson, Glutamine addiction: a new therapeutic target
in cancer. Trends Biochem Sci, 2010. 35(8): p. 427-33.
83.
120
101. Rossignol, R., et al., Energy substrate modulates mitochondrial structure and
oxidative capacity in cancer cells. Cancer Res, 2004. 64(3): p. 985-93.
102. Jordan, V.C. and A.M. Brodie, Development and evolution of therapies targeted
to the estrogen receptor for the treatment and prevention of breast cancer.
Steroids, 2007. 72(1): p. 7-25.
103. Subbaramaiah, K., et al., EP2 and EP4 receptors regulate aromatase expression
in human adipocytes and breast cancer cells. Evidence of a BRCA1 and p300
exchange. J Biol Chem, 2008. 283(6): p. 3433-44.
104. Vecchione, L., et al., Novel investigational drugs for gastric cancer. Expert Opin
Investig Drugs, 2009 18(7): p. 945-55.
105. Santin, A.D., et al., Trastuzumab treatment in patients with advanced or
recurrent endometrial carcinoma overexpressing HER2/neu. Int J Gynaecol
Obstet, 2008. 102(2): p. 128-31.
106. Messersmith, W.A. and D.J. Ahnen, Targeting EGFR in colorectal cancer. N
Engl J Med, 2008. 359(17): p. 1834-6.
107. Salloway, S., et al., Two phase 3 trials of bapineuzumab in mild-to-moderate
Alzheimer's disease. N Engl J Med, 2014. 370(4): p. 322-33.
108. Vermorken, J.B., et al., Overview of the efficacy of cetuximab in recurrent and/or
metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck in patients who
previously failed platinum-based therapies. Cancer J, 2008. 112(12): p. 2710-9.
109. Maloney, D.G., et al., IDEC-C2B8: results of a phase I multiple-dose trial in
patients with relapsed non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol, 1997. 15(10): p.
3266-74.
110. Zhao, Y., et al., Overcoming trastuzumab resistance in breast cancer by targeting
dysregulated glucose metabolism. Cancer Res, 2011. 71(13): p. 4585-97.
111. Zhou, M., et al., Warburg effect in chemosensitivity: targeting lactate
dehydrogenase-A re-sensitizes taxol-resistant cancer cells to taxol. Mol Cancer,
2010. 9:33.
112. Wang, J.B., et al., Targeting mitochondrial glutaminase activity inhibits
oncogenic transformation. Cancer Cell, 2010. 18(3): p. 207-19.
113. Conzen, S.D. and C.N. Cole, The three transforming regions of SV40 T antigen
are required for immortalization of primary mouse embryo fibroblasts.
Oncogene., 1995 11(11): p. 2295-302.
114. Müller, C.C., et al., Quantitative genotyping of mouse brain-specific PEX13 gene
disruption by real-time PCR. Journal of Neuroscience Methods, 2009. 181(1): p.
73-81.
115. Giovannini, M., et al., Conditional biallelic Nf2 mutation in the mouse promotes
manifestations of human neurofibromatosis type 2. Genes Dev, 2000. 14(13): p.
1617-1630.
116. Gilibili, R.R., et al., Development and validation of a highly sensitive LC-MS/MS
method for simultaneous quantitation of acetyl-CoA and malonyl-CoA in animal
tissues. Biomed Chromatogr, 2011. 25(12): p. 1352-9.
121
117. Hodgson, L., F. Shen, and K. Hahn, Biosensors for Characterizing the Dynamics
of Rho Family GTPases in Living Cells, in Current Protocols in Cell Biology.
2010, John Wiley & Sons, Inc. p. 14.11.1-14.11.26.
118. Conzen, S.D. and C.N. Cole, The three transforming regions of SV40 T antigen
are required for immortalization of primary mouse embryo fibroblasts.
Oncogene, 1995. 11(11): p. 2295-302.
119. Bertrand, R., et al., Induction of a common pathway of apoptosis by
staurosporine. Exp Cell Res, 1994. 211(2): p. 314-21.
120. Berghmans, S., et al., tp53 mutant zebrafish develop malignant peripheral nerve
sheath tumors. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005. 102(2): p. 407-12.
121. McClatchey, A.I., et al., Mice heterozygous for a mutation at the Nf2 tumor
suppressor locus develop a range of highly metastatic tumors. Genes Dev, 1998.
12(8): p. 1121-33.
122. Somanath, P.R., et al., The role of PAK-1 in activation of MAP kinase cascade
and oncogenic transformation by Akt. Oncogene, 2009. 28(25): p. 2365-9.
123. Chappell, W.H., et al., Ras/Raf/MEK/ERK and PI3K/PTEN/Akt/mTOR inhibitors:
rationale and importance to inhibiting these pathways in human health.
Oncotarget, 2011. 2(3): p. 135-64.
124. Kissil, J.L., et al., Merlin, the product of the Nf2 tumor suppressor gene, is an
inhibitor of the p21-activated kinase, Pak1. Mol Cell, 2003. 12(4): p. 841-9.
125. !!! INVALID CITATION !!!
126. Mather, J., Animal Cell Culture Methods, in Methods in Cell Biology, J.P. Mather
and D. Barnes, Editors. 1998, Elsevier.
127. Prados, M.D., Holland-Frei Cancer Medicine. 5 ed. 2000: BC Decker.
128. Ronnett, G.V., et al., Fatty acid metabolism as a target for obesity treatment.
Physiol Behav, 2005 May 19. 85(1): p. 25-35.
129. Loftus, T.M., et al., Reduced food intake and body weight in mice treated with
fatty acid synthase inhibitors. Science, 2000. 288(5475): p. 2379-81.
130. Shiragami, R., et al., Enhanced antitumor activity of cerulenin combined with
oxaliplatin in human colon cancer cells. Int J Oncol, 2013. 43(2): p. 431-8.
131. Menendez, J.A., et al., Pharmacological inhibition of fatty acid synthase (FAS): a
novel therapeutic approach for breast cancer chemoprevention through its ability
to suppress Her-2/neu (erbB-2) oncogene-induced malignant transformation.
Mol Carcinog., 2004. 41(3): p. 164-78.
132. Swinnen, J.V., et al., Androgens, lipogenesis and prostate cancer. J Steroid
Biochem Mol Biol., 2004. 92(4): p. 273-9.
133. Sumi, S., et al., Lovastatin inhibits pancreatic cancer growth regardless of RAS
mutation. Pancreas, 1994. 9(5): p. 657-61.
134. Jones, K.D., et al., Lovastatin induces growth inhibition and apoptosis in human
malignant glioma cells. Biochem Biophys Res Commun, 1994. 205(3): p. 1681-7.
135. Marcelli, M., et al., Caspase-7 is activated during lovastatin-induced apoptosis of
the prostate cancer cell line LNCaP. Cancer Res, 1998. 58(1): p. 76-83.
122
136. Seeger, H., D. Wallwiener, and A.O. Mueck, Statins can inhibit proliferation of
human breast cancer cells in vitro. Exp Clin Endocrinol Diabetes, 2003. 111(1):
p. 47-8.
137. Kou, R., J. Sartoretto, and T. Michel, Regulation of Rac1 by Simvastatin in
Endothelial Cells. JBC, 2009. 284(22): p. 14734–14743.
138. Stofega, M.R., et al., Constitutive p21-activated Kinase (PAK) Activation in
Breast Cancer Cells as a Result of Mislocalization of PAK to Focal Adhesions.
Mol Biol Cell, 2004. 15(6): p. 2965-2977.
139. Simon, A.R., et al., Regulation of STAT3 by direct binding to the Rac1 GTPase.
Science, 2000. 290: p. 144-147.