ФЕДЕРАЛЬНОЕ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ АГЕНТСТВО ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ-

ФЕДЕРАЛЬНОЕ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ АГЕНТСТВО
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
«ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИФЕДЕРАЛЬНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ БИОФИЗИЧЕСКИЙ ЦЕНТР ИМЕНИ
А.И.БУРНАЗЯНА»
На правах рукописи
Шуленина Лилия Викторовна
ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ МИКРОРНК, МОДУЛИРУЮЩИХ
ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ Р53- ЗАВИСИМОЙ СИСТЕМЫ ЗАЩИТЫ
ГЕНОМА, ПРИ ФОРМИРОВАНИИ ОТДАЛЕННЫХ ПОСЛЕДСТВИЙ РАДИАЦИОННОГО
ВОЗДЕЙСТВИЯ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА
03.01.01 - радиобиология
Диссертация
на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Научный руководитель:
Кандидат биологических наук
В.Ф.Михайлов
Москва - 2015
2
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК ИСПЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ…………………………..5
СПИСОК ТЕРМИНОВ………………………………………………………………........6
ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………………..7
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………….....12
1.1. р53-зависимая системазащиты генома и ее нарушение при развитии отдаленных
последствий действия радиации…………………………………………………....12
1.1.1. Контроль функциональной активности белка р53 на различных уровнях
……………………………………………………………………………… …...12
1.1.2. Механизмы снижения эффективности функционирования белка р53……….15
1.1.3. Функциональная активность системы Р53-MDM2-MDM4 после облучения....17
1.2. Роль микроРНК в функционировании р53-системы защиты генома в отдаленный
период после облучения………………………………………………………………..20
1.2.1. МикроРНК, их биогенез и функции, а также причины нарушения экспрессии
микроРНК, значение в диагностике и терапии заболеваний………………………...20
1.2.2. МикроРНК и р53………………………………………………………………….27
1.2.3.МикроРНК, модулирующие активнсть р53 после воздействия ионизирующей
радиации…………………………………………………………………………………42
1.3. Эксперименты по изучению экспрессии микроРНК, модулирующих активность
р53-системы
защиты
генома,
в
отдаленные
сроки
после
облучения………………………………………………………………………………..50
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ………………………………………………...59
2.1. Объект исследования……………………………………………………………….59
2.1.1. Животные…………………………………………………………………………59
2.1.2. Пациенты, пренесшие ОЛБ, ОЛБ+МЛП и МЛП……………………………….60
2.1.3. Онкологические больные, перенесшие курс ЛТ……………………………….61
2.2. Методы исследования……………………………………………………………...61
2.2.1. Получение гомогената клеток костного мозга крыс…………………………...61
2.2.2. Получение гомогената ткани молочной железы крыс………………………....61
2.2.3. Выделение общей РНК, содержащей фракцию зрелых микроРНК из гомогената
костного мозга и молочной железы, а также цельной крови………………………...63
2.2.4. Определение концентрации РНК………………………......................................63
3
2.2.5.
Обратная
транскрипция
для мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 крыс и
человека…………………………………………………………………………………..63
2.2.6. Обратная транскрипция для зрелых miR-21, miR-34, miR-125b, miR-145, miR-16,
let-7 крыс и человека со шпилькообразными праймерами «stem-loop»……………...64
2.2.7. Основные этапы подбора праймеров для целевых генов Р53, MDM2, MDM4, mir34, mir-125b, mir-145, mir-16, mir-21, let-7 и конститутивных генов GAPDH, β-actin
крыс и человека для постановки ПЦР в реальном времени………………………….66
2.2.8. ПЦР в реальном времени………………………………………………………....69
2.2.9. Анализ данных, полученных с помощью ПЦР в реальном времени…………..74
2.2.10. Статистическая обработка результатов………………………………………...75
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………………………………....76
3.1. Исследование экспрессии микроРНК, регулирующих р53- зависимую систему
защиты генома, в опухолях молочных желез и костном мозге аутбредных крыс-самок
после однократного ɣ-облучения в дозе 2,5 Гр…………………………......................76
3.1.1. Динамика возникновения опухолей молочной железы у аутбредных крыс-самок в
условиях проведенного эксперимента…………………………………………………76
3.1.2. Экспрессия генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c, miR-125b, miR145, miR-16-2, let-7i в гомогенате опухолей молочных желез аутбредных крыс-самок
на 315 и 550 сутки после ɣ-облучения в дозе 2,5 Гр…………………………………...77
3.1.3. Экспрессия генов Р53, MDM2, MDM4 и экспрессия зрелых miR-21, miR-34c,
miR-125b, miR-145, miR-16-2, let-7i в гомогенате костного мозга аутбредных крыссамок на 75, 315 и 550 сутки после однократного ɣ-облучения в дозе 2,5
Гр……………………………………………………………………………………………80
3.1.4. Анализ соотношениия содержания мРНК гена Р53 и мРНК генов MDM2, MDM4,
miR-34с, miR-145, miR-16-2, miR-125b, let-7a, miR-21 в гомогенате опухолей молочных
желез и костного мозга аутбредных крыс-самок на 75, 315 и 550 сутки после
однократного ɣ-облучения в дозе 2,5 Гр…………………………………………………88
3.2.
Исследование
экспрессии
микроРНК,
регулирующих
р53-зависимую
системузащиты генома, в отдаленный период у лиц, перенесших ОЛБ, ОЛБ+МЛП и
МЛП………………………………………………………………………………………...91
3.2.1. Анализ содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c,
miR-125b, miR-145, miR-16, let-7i в периферической крови лиц в отдаленный период
после перенесения
ОЛБ, ОЛБ+МЛП, МЛП с помощью метода ПЦР в реальном
4
времени со специально подобранными праймерами
и
условиями
амплификации
……………………………………………………………………………………………..91
3.2.2. Анализ соотношениия содержания мРНК гена Р53 и мРНК генов MDM2, MDM4,
miR-34с, miR-145, miR-16, miR-125b, let-7a, miR-21 в периферической крови пациентов
в отдаленные сроки после перенесения ОЛБ, ОЛБ+МЛП, МЛП……………………..93
3.3.
Исследование
экспрессии
микроРНК,
регулирующих
р53-
зависимую
системусохранения стабильности генома, в крови онкологических больных до и после
курса дистанционной ɣ-терапии…………………………………………………………95
3.3.1. Анализ содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c,
miR-125b, miR-145, miR-16, let-7i в периферической крови онкобольных с диагнозом
РПЖ, РМЖ, РГШ до и после полного курса ЛТ с помощью метода ПЦР в реальном
времени с теми же праймерами и условиями амплификации, которые были
экспериментально подобраны при исследовании крови пациентов с диагнозом ОЛБ,
ОЛБ+МЛП и МЛП………………………………………………………………….…….95
3.3.2. Анализ соотношениия содержания мРНК гена Р53 и мРНК генов MDM2, MDM4,
miR-34с, miR-145, miR-16, miR-125b, let-7a, miR-21 в периферической крови
онкобольных с диагнозом РПЖ, РМЖ и РГШ до и после полного курса дистанционной
ɣ-терапии…………………………………………………………………………………99
ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ………………….....101
ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………………….....125
ВЫВОДЫ…………………………………………………………………………….......127
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………………….....129
БЛАГОДАРНОСТИ………………………………………………………………….......148
5
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В
РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ
ЛТ
Лучевая терапия
МЛП
Местные лучевые поражения
MDM2 (Murine double
Ген, кодирующий белок, который обладает Е3-
minute 2)
MDM4 (MDMX)
лигазной активностью и ингибирует опухолевой
супрессор р53.
Ген, кодирующий белок на 90% гомологичный белку
mdm2, который вносит свой вклад в общее
ингибирование активности р53.
МикроРНК (miR, mir)
Класс малых некодирующих РНК, содержащих в
зрелом состоянии около 22 нуклеотидов и
специфично регулирующих активность, по крайней
мере, около 35% генов.
МЖ
Молочная железа
ОЛБ
Острая лучевая белезнь
п.н.
Пара нуклеотидов
ПЦР
Полимеразная цепная реакция
P53
Ген, кодирующий белок р53 с молекулярной массой
53 кДа, опухолевой супрессор, который является
транскрипционным фактором, регулирует клеточный
цикл и апоптоз, контролирует целостность генома.
РГШ
Рак головы и шеи
РМЖ
Рак молочной железы
РПЖ
Рак предстательной железы
6
СПИСОК ТЕРМИНОВ
апрегуляция: Увеличение
биогенез микроРНК: Процесс образования микроРНК
ген Р53 «дикого типа»: Нуклеотидная последовательнось гена Р53, обеспечивающая
его нормальную работу
гомогенат: Однородная масса из измельченных тканей животных и человека,
используемая для медико-биологических задач
даунрегуляция: Уменьшение
микроРНК-миметики: Вещества, похожие на естественно синтезированные в
организме микроРНК и имитирующие их действие
нокаут гена: Метод молекулярной генетики, при котором из организма удаляют или
делают неработоспособными определенные гены
нокдаун гена: Методика, позволяющая снизить экспрессию одного или нескольких
генов при помощи изменения соответствующей последовательности нуклеотидов, либо при
помощи короткого олигонуклеотида, комплементарного соответствующей молекуле мРНК
праймер: Олигонуклеотид, комплементарный участку ДНК- или РНК-мишени, служит
затравкой для синтеза комплементарной цепи с помощью ДНК-полимеразы
промотер: Участок молекулы ДНК, к которому присоединяются молекулы РНКполимеразы, что сопровождается инициацией транскрипции соответствующих генов
р53-респонсивные элементы: Определенные последовательности ДНК палиндромной
структуры, с которыми связывается р53 и, как правило, активирует промотеры, содержащие
эти элементы
сайленсинг: Процесс подавления экспрессии генов
«ломкие сайты» ДНК: Участки ДНК, склонные к разрывам
экспрессия генов: Процесс, в ходе которого наследственная информация от гена
преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок
7
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность
темы.
В
настоящее
время
научно-технический
прогресс
непосредственно связан с увеличением применения источников излучения, используемых в
разных сферах деятельности человека. Однако техногенные катастрофы показали реальность
развития тяжелых отдаленных последствий радиационных поражений. Пожизненное
исследование когорты лиц, переживших атомную бомбардировку в Хиросиме и Нагасаки,
является первым источником информации для оценки рисков формирования патологии от
воздействия ионизирующего излучения [Folley J.H. et al. 1952, Preston D.L. et al. 1994].
Возможность возникновения техногенных катастроф на сегодняшний день подтверждается
аварией на Фукусиме.
Известно, что использование медицинского облучения для лечения онкологических
заболеваний осуществляется органо-специфическими дозами, достигающими 40 Гр и более.
Связь лейкемии с терапевтическим облучением была впервые выявлена во время
исследования пациентов, больных анкилозирующим спондилитом более 50 лет назад [CourtBrown W.M., Doll R. 1957]. Различные примеры применения радиации в медицине включают
в себя маммографию, рентген, компьютерную томографию (КТ), сканирующую позитронноэмиссионную томографию (ПЭТ), радионуклидные исследования щитовидной железы,
костей, печени, селезенки. Технологии, использующие ионизирующие излучения, спасают
тысячи жизней ежедневно. В 2012 г около половины среднегодового воздействия
ионизирующего излучения на население США (около 6,2 мЗв) пришлось на радиологические
диагностические процедуры. Компьютерная томография (КТ) является основным виновником
увеличения численности облученного населения. В нашей стране также стремительно
возрастает внедрение КТ в практику здравоохранения.
Для усиления эффективности лучевой
терапии и снижения риска развития
отдаленных последствий действия радиации у лиц, пострадавших от радиационных аварий,
интенсивно
проводятся
исследования
механизмов
онкотрансформации,
включая
радиационный канцерогенез. Расшифровка молекулярно-генетических основ развития
отдаленных эффектов облучения является причиной поиска средств, препятствующих
формированию опасных для здоровья радиационных поражений, в первую очередь,
злокачественных новообразований.
Эффективное функционирование клеток в организме осуществляется при помощи
внутриклеточных сигнальных путей, управляющих основными процессами. Конечным
звеном сигнального каскада часто оказываются транскрипционные факторы, вызывающие
изменения профиля экспрессии генома. Установлено, что микроРНК модулируют активность
генов на посттранскрипционном уровне, корректируя внутриклеточные программы. При
8
одинаковом генотипе профиль экспрессии генов в клетках различных тканей организма,
так же, как и ответ этих клеток на экстремальные воздействия, существенно различаются.
Глобально анализируются генетические и эпигенетические нарушения функционирования
генов при канцерогенезе. При ряде онкологических заболеваний такие исследования
позволяют осуществить направленные воздействия на экспрессию генов, приводящие к
замедлению клеточного роста, снижению резистентности опухолевых клеток к лучевой и
химиотерапии.
В последние годы интенсивно изучается активность генов после облучения.
Установлено, что в первые сутки после радиационного воздействия наблюдаются
значительные изменения профиля экспрессии сотен генов, вовлеченных в работу важнейших
внутриклеточных регуляторных путей. Временная динамика пострадиационного изменения
экспрессии генов, захватывающая отдаленные сроки после лучевого воздействия, на
млекопитающих мало изучена. При всем разнообразии нарушений экспрессии генов,
наблюдаемых при различных формах злокачественных новообразований, общим для них
является изменение функционирования р53- зависимой системы защиты генома. Поэтому для
оценки риска развития отдаленных последствий лучевого воздействия важным является
длительное изучение динамики пострадиационных изменений состояния этой системы.
Эффективность работы системы защиты генома определяется активностью онкосупрессора белка р53, воздействующего на гены- мишени. Усиление активности белка р53, вызванное
стресс-воздействием, является кратковременным. Содержание самого белка в клетке зависит
от времени жизни его молекулы, скорости транскрипции, трансляции и деградации мРНК, а
активность - от белок-белковых взаимодействий. Основными белковым регуляторами
содержания р53 в клетке является Е3 лигаза mdm2 и ее структурный гомолог mdm4. mdm2
убиквинтилирует р53 и способствует его быстрой протеосомной деградации. mdm4 блокирует
взаимодействие р53 с генами-мишенями и увеличивает время жизни белков mdm2 и р53.
Время жизни белков и мРНК P53, MDM2, MDM4 мало и составляет десятки минут, причем
р53 является транскрипционным фактором для гена MDM2. Быстрая деградация белков и
мРНК указанных генов увеличивает значимость определения содержания мРНК в клетках
после облучения. На сегодняшний день активно исследуются микроРНК, которые
связываются с мРНК генов-мишеней и останавливают трансляцию. Поэтому экспрессия
мРНК не дает полной информации, так как при еѐ высоком уровне синтез продукта может
быть снижен при вмешательстве специфических для данного гена микроРНК. С другой
стороны, сами микроРНК могут быть мишенями транскрипционных факторов [Chaudry M.,
Omaruddin R. 2012, Erson-Bensan A. 2014]. Эффективность функционирования p53-системы
защиты генома после стресс-воздействий в клетке определяется балансом активации
9
транскрипционного фактора р53, а также экспрессией
специфических
микроРНК,
модулирующих трансляцию мРНК генов этой системы. Изменение этого баланса в
отдаленные сроки после лучевого поражения может повысить опасность
развития
канцерогенеза.
Цель и задачи исследования
Изучение экспрессии микроРНК, модулирующих функциональную активность р53зависимой
системы
защиты
генома,
при
формировании
отдаленных
последствий
радиационного воздействия у экспериментальных животных и человека.
Для достижения сформулированной цели были поставлены следующие задачи:
1.
Исследовать содержание мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и экспрессию зрелых
микроРНК
miR-34c,
miR-16-2,
miR-125b,
miR-145,
miR-21,
let-7i,
влияющих
на
функциональную активность р53, в клетках костного мозга аутбредных крыс-самок в
отдаленные сроки (75, 315 и 550 сутки) после однократного кратковременного тотального γоблучения в дозе 2,5 Гр.
2.
Оценить содержание мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и экспрессию зрелых микроРНК
miR-34c, miR-16-2, miR-125b, miR-145, miR-21, let-7i, влияющих на функциональную
активность р53, в образовавшихся опухолях молочной железы у интактных и облученных в
дозе 2,5 Гр аутбредных крыс-самок.
3.
Выявить уровень содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и экспрессии зрелых
микроРНК miR-34a, miR-16, miR-125b, miR-145, miR-21, let-7a в крови у пациентов в
отдаленные сроки (2-51 год) после перенесения острой лучевой болезни (ОЛБ) и местных
лучевых поражений (МЛП).
4.
Изучить уровень мРНК генов Р53, MDM2, MDM4, а также содержание зрелых
микроРНК miR-34a, miR-16, miR-125b, miR-145, miR-21, let-7a в периферической крови
онкологических больных с диагнозом рак предстательной железы (РПЖ), рак молочной
железы (РМЖ) и рак головы и шеи (РГШ) до и после курса дистанционной γ-терапии.
Положения, выносимые на защиту
1)
В отдаленные сроки после радиационного воздействия в костном мозге и молочных
железах экспериментальных животных и в периферической крови человека происходят
изменения содержания зрелых микроРНК, модулирующих функциональную активность р53зависимой системы защиты генома.
2)
Изменения экспрессии зрелых микроРНК, модулирующих активность р53, оказывают
влияние на патофизиологическое состояние организма в отдаленный период после облучения.
.
10
Научная новизна
Впервые изучены закономерности временной динамики изменения транскрипционной
активности генов Р53, MDM2, MDM4, а также содержания зрелых miR-21, miR-34c, miR125b, miR-145, miR-16-2, let-7i в костном мозге аутбредных крыс-самок в длительный период
(550 суток), сопоставимый со временем их жизни, после острого ɣ - облучения в дозе 2,5 Гр.
Впервые обнаружено изменение функционирования Р53- зависимой системызащиты
генома в отдаленные сроки после облучения в период, предшествующий возникновению
опухолей.
Впервые показаны изменения транскрипционной активности генов Р53, MDM2,
MDM4, а также содержания зрелых miR-21, miR-34c, miR-125b, miR-145, miR-16-2, let-7i в
периферической крови пациентов в отдаленные сроки после перенесения ОЛБ, ОЛБ+МЛП и
МЛП.
Впервые исследована корреляция между содержанием зрелых miR-21, miR-34, miR125b, miR-145, miR-16, let-7 и мРНК гена Р53 в костном мозге и молочных железах крыссамок, а также в периферической крови человека в отдаленные сроки последействия
радиации.
Практическая значимость результатов
Изучение изменений содержания микроРНК и мРНК генов р53- зависимой системы
защиты генома в клетках крови после радиационного воздействия может представлять
практический интерес для формирования групп риска развития отдаленных лучевых
эффектов у лиц после профессионального облучения, вследствие катастроф и аварий.
Экспрессия зрелых микроРНК имеет прогностическую значимость для индивидуальной
оценки эффективности лечения опухолей и может быть полезна при отборе средств,
способных снижать острые или поздние радиационныеэффекты.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены на VI Cъезде по
радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность)
(Москва, 2010 г), научной конференции «Актуальные проблемы онкогенетики» (Москва, 2011
г.), Международной конференции «Медико-биологические проблемы действия радиации»
(Москва, 2012), V Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике
«Непостоянство генома» (Звенигород, 2012 г), Международной конференции «Genome
Instability, Evolution and Human Diseases» (Санкт-Петербург, 2013 г.), Международной
научной конференции «Радиобиологические основы лучевой терапии опухолей» (Москва,
11
2013 г.), VII Съезде по радиационном исследованиям (радиобиология, радиоэкология,
радиационная безопасность) (Москва, 2014 г.)
Диссертация апробирована на
заседании секции №1 Ученого совета ФГБУ ГНЦ
«ФМБЦ им А.И.Бурназяна» (протокол №3 от.29.05.2014 г).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 7 статей в российских изданиях,
рекомендованных ВАК, а также 10 тезисов докладов в материалах отечественных и
международных конференций.
Структура диссертации
Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения,
обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования,
их обсуждения, заключения и выводов, а также списка литературы. Работа содержит 17
таблиц, 17 рисунков. Список литературы включает 251 источников, из них 16 отечественных
и 235 зарубежных.
12
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. р53-зависимая система защиты генома и ее нарушение при развитии
отдаленных последствий действия радиации
Белок р53 участвует в процессах нормального развития и роста, сохранении
клеточного гомеостаза, а также в канцерогенезе [Kenzelmann B.D., Attardi L.D. 2010]. Он
является центральным элементом сети, обрабатывающей входящие сигналы от различных
путей,
при
воздействии
генотоксического
и
цитотоксического
стресса,
блокирует
распространение поврежденных клеток и индуцирует их апоптоз. Соответственно, p53
вызывает экспрессию генов-ингибиторов клеточного цикла и проапоптотических генов.
Мутации и/или потери гена P53 индуцируют геномную нестабильность и способствуют
неоплазии.
1.1.1. Контроль функциональной активности белка р53 на различных уровнях
Ген Р53 расположен в коротком плече человеческой хромосомы 17 в регионе 17p 13.1,
который склонен к делециям в опухолевых клетках, и состоит из 11 экзонов, охватывающих
16-20 kb ДНК. Белковый продукт гена Р53 состоит из 392 аминокислотных остатков. Он
образует тетрамерный комплекс, способный узнавать специфическую последовательность
ДНК и регулировать транскрипцию ряда генов, имеющих
в своѐм промоторе р53-
респонсивный элемент [Чумаков П.М. 2007]. Молекулы белка р53 могут находиться в
различных конформационных состояниях, в которых они проявляют разные биохимические
активности. Кроме способности индуцировать экспрессию генов-мишеней, р53 обладает 3'-5'
экзонуклеазной активностью и непосредственно участвует в узнавании поврежденных
участков ДНК. Молекула белка р53 состоит из нескольких доменов. Транскрипционная
активность р53 приходится на его N-терминальный домен – трансактивационный домен
(TAD).
Транскрипционные
коактиваторы
и
корепрессоры
воздействуют
на
транскрипционные свойства р53 путем влияния на связывание р53 с промоторами его геновмишеней или благодаря активации или блокировки сложной ассамблеи транскрипционной
машины. Транскрипционные коактиваторы и корепрессоры также содействуют регуляции
р53- зависимого транскрипционного ответа за счет изменений структуры хроматина
[Laptenko O., Prives C. 2012]. Этот же участок взаимодействует и с белком mdm2 [Kussie et
al. 1996]. Фосфорилирование N-концевых аминокислот приводит к изменению связывания
р53 с mdm2, а также к изменению взаимодействий с транскрипционным комплексом.
Центральный
домен
р53
необходим
для
связывания
со
специфическими
13
последовательностями ДНК; пролин-богатый
домен
отвечает
за
проявление
полной
супрессорной активности р53; α-спиральный домен обеспечивает тетрамеризацию молекул
р53; С-терминальный домен содержит сигналы ядерной локализации (аминокислоты 300323) и экспорта (аминокислоты 356-364) (NLS и NES, соответственно) и олигомеризационный
домен (аминокислоты 324-355) [Okorokov A.L. et al. 2006].
Уровень белка р53 в клетке регулируется на уровне мРНК гена Р53, при помощи
пострансляционного контроля времени жизни белка р53, аллостерической регуляции, как
результата посттрансляционных модификаций [Bai L. et al. 2006]. После воздействия на
клетки генотоксических агентов, таких как ионизирующая радиация, хемиотерапевтические
препараты и химические канцерогены происходит активация р53, направленная на
устранение повреждений в молекуле ДНК. Изменение ДНК может повлиять на целостность
генома из-за образования двунитевых разрывов и за счет возникновения мутаций,
приводящих к потенциальным перестановкам в геноме или потери генетической
информации.
Ответ
на
повреждения
ДНК
осуществляется
благодаря
инициации
посттрансляционных модификаций р53, увеличения частоты пульсаций р53-оборота,
постоянно происходящих в клетках, или за счет эндогенных процессов, связанныx с
репликацией и метаболизмом.
Контроль времени жизни белка р53
Контроль времени жизни белка р53 происходит благодаря посттрансляционным
модификациям белков mdm2 и p53. Белок mdm2 катализирует перенос активированного
убиквитина с фермента группы Е2 на белок р53. Полиубиквитилирование p53, в отличие от
моноубиквитирования, приводит к протеасомной деградации р53 в цитоплазме [Waning D.L.
et al. 2010]. Моноубиквитирование p53осуществляется, когда уровень mdm2 низкий, и p53
выносится в цитоплазму для дополнительного убиквитилирования и деградации. Однако,
большая часть моноубиквитилированного p53 направляется в митохондрии. p53 может
подвергаеться деубиквитилированию с помощью белка HAUSP (herpesvirus-associated
ubiquitin-specific protease), кодируемого геном USP7 (Ubiquitin-specific-processing protease 7).
Связь между mdm2 и HDAC1 (Histone deacetylase 1) способствует деацетилированию p53 и,
как следствие, его деградации [Ito A. et al. 2002].
Белок p53 быстро стабилизируется и накапливается в клетке за счет освобождения от
mdm2 в ответ на стресс-сигналы путем многочисленных механизмов, например, при
связывании MDM2 с опухолевым супрессором ARF в ядрышке. Под влиянием стресссигналов ARF положительно контролирует стабильность и активацию p53 [Sui G. et al. 2004].
И наоборот, высокий уровень белка p53 ведет к образованию отрицательной обратной связи с
ARF, уменьшая уровень ARF и увеличивая связывание mdm2 с p53.
14
Стресс-сигналы
активируют
ATM/CHK2 и ATR/CHK1-киназы, которые
фосфорилируют p53, mdm2, и mdm4. В отличие от p53, фосфорилирование mdm2 приводит к
его дестабилизации. Деградация фосфорилированного mdm2 и mdm4 приводит к
стабилизации p53. Белок p53 напрямую активирует транскрипцию гена MDM2 за счет
связывания с 2-мя соседними p53-респонсивными элементами в области его промотора, а
увеличение экспрессии MDM2, в свою очередь, способствует деградации p53. Это
обеспечивает отрицательную регуляторную связь, контролирующую экспрессию р53, и
сдерживает активность р53 в нормальных клетках в отсутствии стресса [Moll U.M., Petrenko
O. 2003].
Посттрансляционная регуляция р53
Известно,
что
более
36
аминокислот
в
р53
могут
быть
подвержены
посттрансляционным модификациям, которые влияют на стабильность и активность р53, а
также расширяют его возможности как транскрипционного фактора [Karve T.M., Cheema
A.K. 2011]. Наиболее известными модификациями в р53 являются фосфорилирование серина
и треонина, ацетилирование и метелирование лизина [Meek D.W., Anderson C.W. 2009].
Фосфорилирование N-терминального конца p53 участвует в его стабилизации. В ответ
на многочисленные стрессы, включая повреждения ДНК, все треонины и серины Nтеминального конца p53 в его первых 89 остатках способны фосфорилироваться и
дефосфорилироваться.
После
фосфорилирования
увеличивается
транскрипционная
активность p53 и время жизни белка. Фосфорилирование р53 по Ser15, Thr18, и Ser20
вызывает его последующее ацетилирование. HIPK2 (Homeodomain-interacting protein kinase 2)
является киназой, которая фосфорилирует p53 по Ser46, что обеспечивает специфичность
связывания р53 с промотором про-апоптотических генов и индуцирует апоптоз.
Регуляция р53 на уровне мРНК
Регуляции белка р53 на уровне мРНК в литературе уделяется не так много внимания.
Помимо регулирования промотора р53 наблюдается посттранскрипционный контроль уровня
мРНК гена Р53. Возможна регуляция через 5′UTR и 3′UTR -регионы. 5′UTR-регион имеет
высокое содержание GC-оснований и образует структуру «стебель-петля» и может
регулировать как трансляцию, так и стабильность мРНК p53. Рибосомальный белок RPL26
связывается с 5′UTR-регионом р53 и увеличивает трансляцию мРНК р53. Показано, что
сверхэкспрессия RPL26 увеличивает р53-зависимый ответ на различные виды стресса [Takagi
M. et al. 2005].
3′UTR – регионы в мРНК содержат сайты, комплементарные miRNA, а также AUбогатые элементы (AREs). Показано, что miR-125a и miR-125b, воздействуют на сайт внутри
15
3′UTR-региона мРНК гена Р53, в результате
чего уменьшается уровни мРНК и белка р53
[Le M.T. et al. 2009].
Большое значение для посттранскрипционной регуляции экспрессии генов имеет
изменение
длины
3′UTR-региона.
Около
половины
всех
генов
человека
имеют
альтернативные сайты полиаденилирования, использование которых генерирует мРНК с
различными 3′UTR -регионами [Zhang H., Lee J.Y., Tian B., 2005]. Наличие длинных 3′UTRформ генов ведет к уменьшению экспрессии белка [Sandberg R. et al. 2008].
Пролиферирующие и трансформированные клетки, также как эмбриональные клетки,
демонстрируют глобальное укорачивание 3′UTR-конца [Ji Z. et al. 2009].
1.1.2. Механизмы снижения эффективности функционирования белка р53
Мутации в гене Р53
В опухолевых клетках высока вероятность обнаружения мутаций в гене Р53.
Обнаружение мутаций P53 сильно зависит от локализации первичного рака и его
гистологического типа [Petitjean A. et al. 2007]. Частота проявления мутаций в гене Р53 для
рака пищевода, толстой кишки, легкого, желудка, печени, РМЖ, РПЖ составляет 45.4%,
43.3%, 37.2%, 32.4%, 31.2%, 22.8% и 16.9% соответственно. Внутри одного вида рака
некоторые типы опухолей демонстрируют увеличенную частоту мутаций в гене P53.
Например, серозный рак яичников высокой гистологической степени имеет почти 100%
мутации в Р53, в то время как суммарно рак яичников различного генеза имеет частоту
мутации равную только 47,5%.
В некоторых случаях различия в частоте мутаций можно объяснить воздействием
факторов окружающей среды. Например, при гепатоцеллюлярной карциноме выявлена G>Tзамена в кодоне 249 ДНК-связывающего домена р53, обусловленная пищевым поступлением
афлотоксина В1, содержащегося в плесневом грибе aspergillus [Bressac B. et al. 1991].
Бензопирен-диол-эпоксид (БПДЭ), который является одним из 3000 мутагенов, содержащихся
в табаке, образует аддукты на G-остатках в ДНК, вызывая G>T –мутации и может быть
причиной мутаций в Р53 у курильщиков, а также и у части больных при раке легкого
[Patterson M. 2000, Rodin S.N., Rodin A.S. 2000].
В отличие от большинства других опухолевых супрессоров, которые обычно
инактивируются за счет сдвига «рамки считывания» или нонсенс-мутаций, большинство
мутаций в Р53 являются миссенс-мутации (~80%). Последствия мутаций в Р53 при раке
имеют больший онкогенный эффект, чем фенотип, наблюдаемый при потере гена Р53
[Petitjean A. et al. 2007].
Субклеточная локализация р53
16
Абберантная локализация белка р53 в
цитоплазме приводит к потере его функций.
При воздействии стресса p53 обычно находится в ядре клеток, где выполняет свою роль, как
фактор транскрипции.
В опухолевых клетках часто обнаруживается аберрантная локализация, например, при
нейробластоме, раке прямой кишки, раке молочной железы и ретинобластоме [Nikolaev A.Y.,
Gu W. 2003].
Другие причины снижения эффективности функционирования белка р53
Для тех опухолей, которые сохраняют ген Р53 «дикого типа», функциональная
активность р53 часто блокируется и на другом уровне [Vogelstein B. et al. 2000]. Показано,
что метилирование промотора гена Р53 вызывает снижение транскрипции р53, а мутации в 5’
UTR –регионе уменьшают трансляцию.
К снижению функциональной активности р53 приводит усиление экспрессии его
ингибиторов. В 1992 году было показано, что mdm2 прочно связывается с р53 и ингибирует
его биологическую активность, после чего этот белок получил название «привратник» р53. В
настоящее время существуют около 22 миллионов человек с опухолями, которые содержат
инактивированный р53 либо за счет мутаций [Brown C. J. et al. 2009], либо за счет большого
содержания ингибиторов р53 - mdm2 и mdm4 [Halatsch M. E. et al. 2006].
Сверхэкспрессия отрицательных регуляторов р53 таких, как mdm2 и mdm4
обнаруживается, по крайней мере, в 10% человеческих опухолей [Toledo F., Wahl G.M.
2006]. Mdm2 сверхэкспрессирован в 14% остеосарком, а mdm4 сверхэкспрессирован в 4%
глиобластомах, 5% рака молочной железы, 50% гепатоцеллюлярных карциномах, 60%
ретинобластомах и 65% кожных меланом. Белок mdm2 может быть сверхэкспрессирован в
результате генной амплификации. Кроме того, однонуклеотидный полиморфизм (SNP) в
промоторе гена MDM2 увеличивает транскрипцию, приводящую к 2-4 кратному увеличению
мРНК и белка mdm2.
Сверхэкспрессия mdm4 может быть результатом усиления трансляции его мРНК, или
увеличения числа копий гена, особенно при ретинобластоме и гепатоцеллюлярной карциноме
[Laurie N.A. et al. 2006, Schlaeger C. et al. 2008, Valentin-Vega Y.A et al. 2007].
После стресс-воздействия mdm2 самоубиквинтилируется и убиквинтилирует mdm4,
что ведет к накоплению и активации р53 и, таким образом, р53 –зависимый
транскрипционный ответ возрастает. Активированный р53 увеличивает транскрипцию гена
MDM2, и, в свою очередь, аккумулированный mdm2 вызывает деградацию mdm4 еще более
эффективно, что способствует полной активации р53, и транскрипционный стресс-ответ
17
достигает пика. После окончания стресса
накопленный
белок
mdm2
снова
воздействует на р53, уровень белка р53 падает, при этом уровень белка mdm4 растет, и
активность р53 уменьшается. Небольшое количество p53 снижает количество белка mdm2, и
цикл завершается [Khoury K. 2013].
Поиск средств, направленных на разобщение р53 от mdm2 и mdm4 в раковых клетках,
идет полным ходом [Roxburgh P. 2013].
Стоит сказать, что в настоящее время уже признается, что mdm2 и mdm4 могут
функционировать за пределами возможности ингибирования р53, и уже получены
доказательства, свидетельствующие о специфике их влияния на гены-мишени р53 и других
транскрипционных факторов. mdm2 сам может функционировать как транскрипционный
кофактор через пострансляционную модификацию хроматина. Кроме этого, mdm2 может
оказывать действие и на посттранскрипционном уровне, изменяя стабильность мРНК и
трансляцию различных транскриптов.
1.1.3. Функциональная активность системы p53- mdm2- mdm2 после облучения
Транскрипционный фактор р53, необходим для защиты клеток от нестабильности
генома и важен для формирования реакции клеток на радиационное воздействие. Уже в 1990х годах было установлено, что в ответ на радиационное повреждение ДНК в клетках
наблюдается активация онкосупрессора р53 [Kastan M.B. 1991, Lowe S.W. 1993]. После
воздействия ионизирующей радиации и образования повреждений ДНК в клетках быстро
мобилизуются р53-зависимые программы, обеспечивающие устранение повреждений генома
и восстановление клеточного гомеостаза.
В экспериментах на клеточных культурах показано увеличение активности р53 через 2
ч после облучения, приводящее к реализации программ остановки клеточного цикла и
репарации ДНК, и только через 6-8 ч появляется второй пик активности, который вызывает
включение программ апоптоза [Batchelor E. 2008]. Дальнейшие исследования действия
радиации, проведенные на культурах клеток человека и экспериментальных животных,
показали пульсовое изменение активности р53, частота и длительность которой зависят от
фенотипа клеток, вида и дозы радиационного воздействия и обеспечивает реализацию
программ остановки клеточного цикла, раперацию ДНК, апоптозы, старение [Purvis, J.E.
2012]. Разнообразие клеточных р53-зависимых программ частично можно объяснить тем, что
супрессор опухоли р53 имеет большое количество транскрипционных мишеней. В различных
тканях клетки отличаются фенотипом, и транскрипционный фактор р53 активирует
экспрессию тканеспецифических наборов генов-мишеней, ведущих к различному ответу
клеток на радиационное воздействие (рисунок 1).
18
Рисунок 1. Роль р53 в регуляции клеточного ответа на радиационное воздействие in
vivo в различных тканях [Lee C. et al. 2013].
Активность р53 в клетках, как это было описано выше, регулируется его взаимодействием с
белками mdm2 и mdm4. После облучения взаимодействие p53-mdm2-mdm4 может изменяться
[Perry M.E. 2010].
Сигнал двунитевых повреждений ДНК после действия радиации передается с
помощью киназы ATM (ataxia telangiectasia mutated serine/threonine protein kinase) на p53,
CHK2 и H2AX, вызывая остановку клеточного цикла, активацию репарации ДНК, апоптоз,
старение. ATM фосфорилирует аминокислотные концы человеческого белка р53 по Ser15, что
ведет к разрыву связи р53 с mdm2 и mdm4 и накоплению р53 в клетке. Фосфорилирование Стерминальных концов белков mdm2 и mdm2 способствует их быстрой деградации. ATM
также активирует вторую киназу c-Abl, фоосфорилирующую mdm2 по Tyr394 и mdm4 по Tyr
99, снижая их возможность ингибировать белок р53.
ATM-активированная киназа CHK2 фосфорилирует добавочные сайты внутри mdm4,
облегчая его связь с 14-3-3-белками и его убиквинтилирование за счет mdm2. Более того
CHK2-опосредованное
деубиквинтилирующим
фосфорилирование
ферментом
mdm4
нарушает
его
убиквинтин-специфической
взаимодействие
протеазой
с
HAUSP
(herpesvirus associated ubiquitin-specific protease), что способствует беспрепятственному
убиквинтилированию и протеосомной деградации. Важность фосфорилирования mdm4 для
активации р53 после радиационного воздействия была показана в экспериментах на мышах,
мутированных по Ala [Wang Y.V. et al. 2009]. По сравнению с мышами, несущими «дикий
тип»
р53,
мыши
с
мутантным
р53
обладали
ослабленным
р53-опосредованным
19
транскрипционным ответом и выдерживали
большие дозы радиации. Таким образом,
после воздействия радиации временно увеличивается активность р53 за счет изменения связи
с mdm2 и mdm4. После реализации программы сохранения стабильности генома
взаимодействие между р53 и его ингибиторами восстанавливается. Экспрессия mdm2
индуцируется в ответ на высокое содержание онкосупрессора р53 через р53-респонсивный
элемент в гене MDM2, и образуется отрицательная регуляторная «петля», необходимая для
функционирования клетки.
Другой механизм, который может быть критичным для периода восстановления клетки
после радиационного поражения – это дефосфорилирование mdm2 за счет фосфатазы Wip1.
Wip1 дефосфорилирует mdm2 по Ser395, т.е. по сайту фосфорилирования ATM. В этом
случае
Wip1
облегчает
взаимодействие
между
mdm2
и
p53
и
подавляет
аутоубиквинтилирование mdm2. Подобное функционирование регуляторной «петли» р53 зависимой системы защиты генома подтверждено в экспериментах по исследованию уровня и
активности р53, mdm2 и mdm4 в единичных клетках после действия ионизирующей радиации
[Batchelor E. 2009].
Использование
генетически
сконструированных
мышей
с
возможностью
«переключения» экспрессии белка р53 из функциональной формы в неактивную форму,
показало, что у мышей, на момент облучения обладающих функционально активной формой
р53, возникали опухоли с той же частотой, что и у облученных мышей с неактивныой
формой р53. Оказалось, что преобразование р53 в функциональную активную форму через 8
дней после облучения защищает мышей от развития гемобластозов даже, если острой гибели
клеток не наблюдалось [Christophorou et al. 2006]. Это наблюдение предполагает, что ранний
ответ р53 на облучение не участвует в формировании последствия, связанного с подавлением
развития опухоли, или это ответ менее критичен, чем более позднее участие р53. Показано,
что онкосупрессия р53 может зависеть от экспрессии ARF (alternative reading frame), который
инактивирует mdm2, и, таким образом, увеличивает экспрессию p53.
Проведенные эксперименты говорят о том, что следует
различать участие р53 в
механизмах чувствительности клеток и организма к ближайшим и отдаленным последствиям
действия ионизирующей радиации. Пострадиационная гибель клеток является наиболее
важным ранним эффектом облучения, в то время как онкотрансформация - наиболее тяжкое
отдаленное последствие.
В настоящее время установлено, что активация р53 направлена на сохранение
стабильности генома и приводит к гибели клеток с поврежденной ДНК, и это вызывает
20
снижение выживаемости животных после
лучевого воздействия. Анализ результатов
экспериментов, проведенных на лабораторных животных, показал, что p53 после воздействия
ионизирующего излучения, может приводить, например, к развитию костномозгового
синдрома при острой лучевой болезни (ОЛБ), и во многом определять серьезные
неблагоприятные эффекты, возникающие при лечении рака [Gudkov A.V. 2010].
Westphal C. et al. было показано, что снижение активности р53 увеличивает
радиорезистентность животных по критерию их выживаемости. После γ‐облучения в дозе 10
Гр трансгенных мышей с полностью «выключенным» р53 все животные выживали,
приблизительно половина гетерозиготных по гену P53 мышей умерла, в то время как все
мыши с «диким типом» Р53 погибали в течение 1-2 недель [Westphal C.H. 1998].
Аналогичные результаты получены при использовании трансгенных мышей с
уменьшенным уровнем mdm2, являющимся ингибитором р53. Все трансгенные мыши
умирали в течение 12-22 дней после облучения в дозе 10 Гр, в то время как 50% мышей с
«диким типом» mdm2 оставались живыми в течение 40 дней после облучения.
Для достижения адекватной активации р53 необходимо фосфорилирование mdm4 с
помощью киназ ATM и Chk2. На мышиной модели 3SA, несущей мутации в генах ATM и
Chk2, после тотального облучения 10 Гр показано увеличение выживаемости этих животных
по сравнению с мышами, несущими «дикий тип» ATM и Chk2.
Таким образом, можно сделать вывод, что активация р53 сразу после облучения
способствует гибели поврежденных клеток, а в более отдаленные сроки после радиационного
воздействия данный онкосупрессор принимает участие в предотвращении канцерогенеза.
Приведенные данные свидетельствуют о том, что после воздействия радиации р53регулируемая система защиты генома может способствовать как гибели, так и выживанию
клеток, и демонстрируют сложную организацию р53-сетей, регулирующих клеточный и
тканевой ответ на облучение.
1.2. Роль микроРНК в функционировании Р53-системы защиты генома в
отдаленный период после облучения
1.2.1. МикроРНК, их биогенез и функции, а также причины нарушения
экспрессии микроРНК, значение в диагностике и терапии заболеваний
МикроРНК
В настоящее время открыто более 2000 микроРНК (mir, miR) человека. Номенклатура
этих микроРНК основана на префиксе «mir» и «miR» с номером, присвоенным
21
последовательно на момент открытия: «mir» обозначает
предшественника
микроРНК,
тогда как «miR» обозначает последовательность зрелых микроРНК. Похожим или
идентичным последовательностям присваивается тот же номер. Различие осуществляется
далее с помощью буквы (аналогичные последовательности, отличающиеся несколькими
нуклеотидами) или цифры (идентичные последовательности). Например, mir-15a и mir-15b
имеют идентичные 5'-концы, но отличаются четырьмя нуклеотидами в их 3'-регионе.
Напротив, miR-16-1 и miR-16-2 идентичны, но закодированы на двух отдельных хромосомах,
хромосомах 13 и 3, соответственно.
Локализация и биогенез микроРНК
Гены микроРНК находятся либо в межгенных регионах, либо в интронах кодирующих
белки генов. Результаты исследований показали, что транскрипция многих микроРНК
регулируются по принципу белок-кодирующих генов.
Биогенез микроРНК включает в себя несколько этапов. Транскрипция генов
микроРНК может идти с «чужих» или собственных промоторов в зависимости от
локализации микроРНК в геноме и специфики самого гена. Гены микроРНК могут
транскрибироваться в ядре поодиночке,
или одним полицистронным транскриптом с
помощью РНК-полимераз. Образованные первичные транскрипты, которые называются примикроРНК (pri-microRNA), имеют длину от 70 до 200 нуклеотидов и более, с характерными
множественными шпильками с неполной внутренней комплементарностью. Молекулы примикроРНК подвергается кэпированию, полиаденилированию и редактированию. Зрелая
микроРНК может быть локализована как на 3/ , так и на 5/-концах шпилечной структуры.
Следующий этап биогенеза микроРНК - это превращение при-микроРНК в пре-микроРНК
(pre-microRNA), осуществляемое микропроцессорным комплексом ядерной РНКазой III
Drosha/ DGCR8 (область 8, критическая для синдрома Ди-Джорджи), в котором DGCR8
распознает особенности структуры двухцепочечной РНК и связывается с ней, а Drosha
осуществляет разрезание нити при-микроРНК. Отрезанные фланкирующие элементы
деградируют в ядре. Образующаяся пре-микроРНК имеет стеблепетлевую 70-нуклеотидную
структуру и «липкий» 3/-конец размером две нулеотидные пары. Этот конец необходим для
взаимодействия с белком экспортином 5 Ran-GTP-зависимым (Exportin 5–Run-GTP),
участвующим в переносе пре-микроРНК из ядра в цитоплазму [Bohnsack М.Т. et al. 2004].
Далее пре-микроРНК превращается в двухцепочечную микроРНК, длиною в 20-25
нуклеотидов с помощью фермента РНКазы III, названного Dicer, который вместе с его
dsRBD-партнером TRBP осуществляют двухцепочечный разрез. На последнем этапе
биогенеза одна цепь двухцепочечной микроРНК связывается с белком Argonaute (Ago),
22
который
вовлекает
одноцепочечную
микроРНК в работу РНК-индуцируемого
комплекса выключения гена RISC (RNA-Induced Silencing Complex).
После включения miR в состав RISC запускается механизм сайленсинга. Мишенями
для микроРНК, расположенных в составе RISC, являются MRE (microRNA Response
Elements), находящиеся на мРНК в области 3/UTR-региона. miR, не связанные с мишенью,
удаляются из клетки. Комплекс RISC может блокировать инициацию трансляции, за счет
удержания RISC на MRE, препятствуя узнаванию кэпа фактором инициации трансляции и
сборке рибосом. Комплекс RISC также может ингибировать элонгацию, индуцировать
быстрое отделение рибосомы или облегчать протеолиз образующегося пептида [Fabian M.R.
et al. 2010].
Функциональное взаимодействие miR с мишенью
miRNA-RISC-комплекс связывается с 3´ UTR-регионом мРНК за счет нуклеотидной
комплементарности. Механизм работы RISC зависит от степени комплементарности его
взаимодействия с мРНК, т.е. при полной комплементарности MRE с микроРНК происходит
деградация мишени (85-90% случаев), а при неполном комплементарном взаимодействии
происходит трансляционная репрессия мишени без влияния на стабильность мРНК.
Благодаря связи с белками Argonaute (Ago) микроРНК высокостабильны, время их полужизни
сильно варьируют (от нескольких часов до нескольких дней). Однако, при отсутствии
мишеней в клетке возможно быстрое снижение содержания микроРНК из-за их деградации с
помощью специфических нуклеаз. Кроме репрессивного действия микроРНК на мишени,
возможно и активирующее влияние микроРНК в случае расположения центров связывания
микроРНК в области 5/UTR-региона мРНК-мишени. Хотя связывание может осуществляться
и в 5´ UTR-регионе и в открытой рамке считывания, тем не менее, такой вид взаимодействия
встречается относительно редко [Bartel D.P. 2009]. Присутствие в miR последовательности из
6 - 8 нуклеотидов, именуемых «seed» («семя»), комплементарной к MRE мишени приводит к
специфическому связыванию с мРНК.
Как правило, одна miR может иметь много мишеней. Бионформационный анализ
последовательности мРНК предоставляет достаточно сведений для отбора соответствующих
miRs к интересуемой мишени, однако необходима экспериментальная проверка реальности
таких взаимодействий, приводящих к биологическому эффекту для разных типов
клеток/тканей или стадией заболевания [Landgraf P. et al. 2007]. Учитывая огромное
количество прогнозируемых мишеней для любой miR, очевидно, что только часть
прогнозируемых мишеней является существенно значимой [Selbach M. et al. 2008].
Исследования
показали, что большинство miR, потенциально взаимодействующих с
23
транскриптами,
не
имеют,
либо
имеют
слабый функциональный выход [Lal A. et al.
2011]. Поэтому необходимо использовать комбинированные подходы анализа биологических
сетей для полного разделения miR-функциональных мишеней, снижая их количество и
выделяя наиболее важные miR-мишени.
МикроРНК в диагностике заболеваний
Анализ 217 miRs млекопитающих в нескольких сотнях образцов, включающий
клинические образцы, раковые линии клеток и мышиные опухоли, показал, что профиль
экспрессии miR может отличаться в опухолях разного происхождения, и что экспрессия
miRs
в
большинстве
своем
в
опухолях
ингибируется.
Интересно,
что
слабо
дифференцированные опухоли показывают низкий уровень экспрессии miR по сравнению с
опухолями высокой степени дифференцировки [Lu J. et al. 2005]. Анализ отдельных видов
рака демонстрирует, что профиль экспрессии miR может предсказывать клиническое
развитие опухоли. miR-15a и miR-16-1 могут быть
прогностическими биомаркерами
хронической лимфоидной лейкемии, а let-7a - рака легких [Calin G.A. et al. 2005]. Профиль
экспрессии miR полезен и может быть использован для характеристики различных форм
заболеваний сердца, мышечных нарушений, нейродегенеративных нарушений.
Циркулиующие микроРНК
Подавляющее большинство сообщений о профиле экспрессии miR вытекают из
анализов солидных опухолей, тем не менее miRs могут быть обнаружены в человеческой
плазме, сыворотке или в цельной крови [Schwarzenbach H. еt al. 2011]. Циркулирующая в
сыворотке miR-21 может быть биомаркером у пациентов с большой диффузной В-клеточной
лимфомой [Lawrie C.H. et al. 2008]. Больные РПЖ могут отличаться от здоровых доноров по
уровню экспрессии miR-143 [Volinia S. et
al. 2006]. Такие же выводы сделаны при
исследованиях miRs при РМЖ (с использованием цельной крови) [Heneghan H.M. et al.
2010], колоректальном раке (с использованием плазмы) [Huang Z. et al. 2010] и при
плоскоклеточном раке легких (с использованием мокроты) [Xing L. et al. 2010].
Циркулирующие в биологических жидкостях miRNAs могут также быть использованы для
прогностических целей [Boeri M. еt al. 2011]. Keller et al. анализировали 863 miRNAs в 454
образцах крови у
пациентов, страдающих 14 различными заболеваниями, включая рак
легкого, РПЖ, рак протоков поджелудочной железы, меланому, рак яичников, рак желудка,
рак поджелудочной железы, рассеянный склероз, хроническое обструктивное заболевание
легких, периодонтит, панкреатит и инфаркт миокарда. В среднем, содержание более чем 100
miRs было изменено в крови при каждом заболевании. Применение математических
алгоритмов и построение вероятностных графиков показало информационную значимость
24
полученных
данных
для
выявления
заболевания более чем у 2/3 больных,
участвующих в этом исследовании [Keller A.et al. 2011].
Источниками miR в периферической крови являются различные ткани организма.
Установлено, что секреция miRs из В-клеток осуществляется в экзосомах, обеспечивающих
защиту miRNA от РНК-аз [Pegtel D.M. et al. 2010]. Опухолевые клетки, эпиталиальные
клетки, стволовые и мезенхимальные клетки также способны выделять экзосомы с
микроРНК. Перемещение miRs из эмбриональных стволовых клеток к фибробластам
осуществляется в клеточных микровизикулах [Yuan A. et al. 2009].
Причины нарушения экспрессии микроРНК в различных клетках
Было показано, что при канцерогенезе происходят нарушения экспрессии микроРНК.
Одними исследователями обнаружено уменьшение зрелых микроРНК во время образования
опухолей, а другими - увеличение. Противоречивые данные в вопросе «глобальной
даунрегуляции и апрегуляции» микроРНК могут быть связаны с различиями между типами
опухолей, видами анализируемых тканей, а также методами исследования [Ariel I. et al.
2009].
Изменения экспрессии микроРНК в различных клетках могут осуществляться
различными механизмами. Сверхэкспрессия специфических микроРНК может быть вызвана
амплификацией генного региона, кодирующего эту микроРНК, промоцией транскрипции гена
микроРНК, потерей эпигенетического сайленсига генов микроРНК.
Снижение уровня экспрессии микроРНК может быть продиктовано делециями в генах
микроРНК, наличием мутаций в предшественниках и в зрелых «seed»-последовательностях
микроРНК, гиперметилированием промотора генов микроРНК.
Изменение содержания белков-участников биогенеза микроРНК Dicer1, Drosha, Ago2,
Xpo-5 (кодирует экспортин 5) может приводить как к снижению, так и увеличению
продукции зрелых микроРНК.
Мутации,
делеции,
инсерции,
транслокации,
амплификации,
одиночный
олигонуклеотидный полимрфизм в 3/ UTR-регионе генов-мишеней микроРНК нарушают их
взаимодействие с микроРНК.
Croce et. al. [Croce M.D. et al. 2009] впервые показали, что хромосомный регион,
который составляет кодирующие сайты для miR-15a и miR-16-1, часто делетирован при
хронической лимфоидной лейкемии. miR-15a и miR-16-1 ингибируют экспрессию
антиапоптотических факторов BCL-2 (B-cell lymphoma 2, белок регулирующий апоптоз),
MCL-1 (myeloid cell leukemia, белок семейства BCL-2). И наоборот, кластер miR-17-92,
25
кодирующий 6 микроРНК (miR-17, -18a, -
19a,
-19b-1,-20a,-92-1),
локализован
в
геномном регионе, который часто амплифицирован при лимфомах. Эти микроРНК
подавляют опухолевые супрессоры Bim (проапоптотический белок, член семейства BCL-2),
PTEN (Phosphatase and tensin homolog, протеин-тирозин-фосфатаза), CDKN1 (CyclinDependent Kinase Inhibitor 1A, ингибитор циклин-зависимой киназы 1А).
Секвенирование ДНК образцов опухолевой ткани легких выявило точковые мутации в
промоторе гена mir-7 [Juannjuan Zh. et al. 2015]. Экспрессия miR-7 с промотора, несущего
мутации, была значительно ниже, чем в той же ткани без мутаций. Следовательно, мутации в
промоторе гена mir-7 нарушают его активность и снижают экспрессию mir-7. Авторами
достоверно показано, что наличие мутаций в mir-7 коррелировало с плохим прогнозом у
пациентов с раком легких.
Проведя анализ одиночных нуклеотидных полиморфизмов (a single nucleotide
polymorphism, SNP) в человеческом геноме, Matthew A. Saunders et.al. обнаружили
относительно низкий уровень вариаций последовательностей в функциональных регионах
микроРНК, в то время как при анализе вариаций сайтов мишеней микроРНК найдено около
250 SNP [Matthew A. et el. 2007].
Сhin et al. идентифицировали SNP в 3/ UTR-регионе гена K-Ras для связывания let-7.
Нарушение взаимодействия коррелировало с высоким риском развития немелкоклеточного
рака легкого среди курильщиков [Chin L.J. et al. 2008]. В своем полногеномном
исследовании Calin et al. обнаружили SNP в микроРНК-связывающих сайтах ключевых
белков: BRCA1 (breast cancer protein 1), mdm2, TGFBR1 (transforming growth factor beta
receptor I) и XIAP (X-linked ingibitor of apoptosis protein) [Calin G.A. 2006] Роль SNP генамишени в нарушении взаимодействия с микроРНК показана с помощью люциферазного
анализа 3/UTR-региона мРНК генов BRCA1, TGFBR1.
Большинство микроРНК транскрибируются РНК-полимеразой II с промоторов,
чувствительных к аберрантно-активным транскрипционным факторам, которые могут либо
увеличивать, либо подавлять экспрессию микроРНК. Например, транскрипция семейства
miR-34 (a,b,c) напрямую индуцируется транскрипционным фактором р53, что показано с
помощью
метода
иммунопреципитации
хроматина.
Гены
mir-29,
mir-15-16
также
положительно регулируются р53 [Suresh A. 2013]
Онкоген Myc отрицательно регулирует экспрессию членов семейства let-7 a,-c,-d,-f,-g
и mir-29а, -в, -с, связываясь с консервативной последовательностью промотора этих
микроРНК.
26
Сайленсинг «структурно-нормальных» генов
микроРНК
происходит
за
счет
гиперметилирования промотора ДНК и/или гипоацетилирования гистонов, наблюдаемых при
солидных опухолях и при раке крови. Например, экспрессия miR-127 даунрегулируется в
ответ на гиперметилирование ДНК при раке мочевого пузыря [Kovalchuk I., Kovalchuk O.
2012].
Экспериментально-индуцированная утрата метилирования ДНК
приводила к
дерепрессии miR-127 и последующему сайленсингу мишени miR-127 – BCL-6 (B-cell
lymphoma protein-6).
Широкий диапазон нарушений экспрессии микроРНК связан с изменением
процессинга микроРНК, а именно потеря экспрессии рибонуклеаз Dicer и Drosha
способствует онкотрасформации in vivo. Экспериментальным путем на мышиных моделях
было
продемонстрировано,
что
сайленсинг
этих
факторов
при
использовании
интерферирующих РНК для Dicer и Drosha или за счет условного нокаута экспрессии Dicer1
обратно коррелировал с тяжестью исхода ракового заболевания, развивающегося из
эпителия яичников.
Martello et al. обнаружили, что miR-103/107 сверхэкспрессирован в большинстве
метастатических раках молочной железы и вызывает сайленсинг Dicer, что приводит к
глобальному снижению уровня зрелых miR, в том числе miR-200, отвечающего за
эпителиально-мезенхимальный переход и метастатическую потенцию раковых клеток
[Martello G. et al. 2010].
МикроРНК в терапии
Лечебное применение miRs относится к РНК-терапии. В отличие от применения
коротких интерферирующих и коротких шпилькообразных РНК (siRNAs и shRNAs), которые
нацелены на один транскрипт, использование miRs значительно сложнее, поскольку miR
может оказывать влияние на сотни транскриптов, вызывая значительные изменения
функционирования различных внутриклеточных сигнальных цепей. На сегодняшний день в
экспериментальной разработке в качестве терапевтических средств находятся десятки miR,
однако они пока не получили широкого применения в клинике. Создание препаратов для
miR-терапии вполне возможно, тем более, что уже существуют наработки для siRNAs,
имеющие сходные с микроРНК структуры [Burnett J.C. 2012]. Несмотря на то, что siRNAs и,
аналогичным образом, миметики («mimics») miR могут быть стабилизированы через
химические модификации, существует необходимость привлечения транспортных носителей
для адресной доставки соединений в различные ткани в условиях in vivo [Siegwart D.J. 2011].
27
Есть
ряд
крупных
компаний,
занимающихся
разработкой
препаратов,
влияющих на активность miR. Созданный датской фирмой Santaris Pharma A/S препарат
Miravirsen
(или
SPC3649)
является
LNA-модифицированным
олигонуклеотидом,
разработанным для ингибирования miR-122 [Lanford R.E. 2010]. Miravirsen образует
комплекс с miR-122, которая после этого не способна связываться с вирусом. Miravirsen,
введенный шимпанзе, инфецированным хроническим вирусом гепатита С, приводит к
супрессии вируса HCV без каких-либо побочных эффектов. Препарат прошел 2 этапа
клинических испытаний, и успешно доказал безопасность использования на людях и
перспективность для терапии пациентов с хроническим вирусным гепатитом.
Компания Regulus Therapeutics, основанная в Сан-Диего, занимается большой
программой, нацеленной на разработку ингибиторов miRs при лечении гепатоцеллюлярной
карциномы, почечного фиброза, атеросклероза, гепатита С и глиобластомы. Исследуются
ингибиторы miR-33a/b при лечении атеросклероза, miR-21 для подавления миграции/инвазии
глиом [Shukla S. 2010], проявления антифиброзного ответа у мышей с заболеванием почек
[Lanford R.E. 2010].
Компания Mirna Therapeutics разрабатывает синтетические «miR-миметики» для
заместительной терапии. В качестве объекта исследования отобраны miRs, у которых
выражены опухоль-супрессивные свойства (miR-34, let-7 and miR-16). Их ведущий кандидат
MRX34, вероятно, будет первой miR, принявшей участие в заместительной терапии и в
клинических испытаниях.
Доклиническая
исследования,
проведенные
компанией
Mirna
Therapeutics,
продемонстрировали выраженные противоопухолевые эффекты miR-34a, введенной в
липосомах с наночастицами на различных моделях рака мышей [Ma L. 2010, Swarbrick A.
2010].
miRagen Therapeutics –это американская компания, созданная в 2007 году с целью
развития лекарств, изготовленных на основе miR, для лечения сердечных и мышечных
заболеваний. Их препарат MGN-9103, содержащий miR-208, предполагается использовать
для лечения хронической сердечной недостаточности [Huynh C. 2011], диабета и ожирения
[He L. 2007]. Исследуются препараты MGN-1374 (miR-15 и miR-195) для лечения инфаркта
миокарда [Trang P. 2011].
1.2.2. МикроРНК и р53
Регуляция экспрессии микроРНК с помощью р53
МикроРНК являются ключевыми медиаторами р53-ответа на стресс. Взаимодействие
между р53 и генами микроРНК может активировать экспрессию микроРНК. Интересно также,
что р53 может напрямую и подавлять экспрессию онкогенных микроРНК, таких как кластер
28
miR-17-92 [Yan H.L. 2009]. Регулируемые
р53 miR вовлечены в комплекс обратных и
прямых замкнутых связей и способствуют совместному контролю, усилению и настройки
сигналов в ответ на стресс. Кроме того, вариабельность сигнатуры экспрессии р53регулируемых miR и их генов-мишеней зависит от типа клеток, природы стресса и причины
повреждения ДНК. р53 способен регулировать экспрессию микроРНК на уровне
траснкрипции, т.е. за счет прямого связывания с промотором гена miRNA.
В 2007 г несколько исследовательских групп, используя различные методы скрининга,
сообщили, что mir-34a и mir-34b/c являются первыми идентифицированными генами
микроРНК, которые регулируются р53 [Chang T.C. 2007, He L. 2007]. Семейство miR-34
состоит из 3-х членов: miR-34a, miR-34b и miR-34c [Maroof H. 2014]. miR-34a представлена
22 нуклеотидами и гомологична на 86% miR-34b и на 82% miR-34c. Зрелые miR-34b и miR34c состоят из 23 нуклеотидов, и степень гомологии друг с другом составляет 83%. Все
микроРНК семейства miR-34 имеют строгую гомологию в области региона 2-9 оснований на
5’-конце зрелой последовательности, так называемом «seed» - регионе, который необходим
для взаимодействия с мишенью. Кроме сходства в организации, члены семейства miR-34
имеют и различия. Так, ген mir-34a находится в хромосоме 1p36.22., промотор гена mir-34a
содержит
CpG-островки,
и
индуцированное
гиперметилирование
CpG
вызывает
даунрегуляцию экспрессии miR-34a при раках. mir-34b и mir-34c локализованы в хромосоме
11q23.1 и транскрибируются как единый полицистронный транскрипт. Ген mir-34b/c
содержит «ломкие» сайты, которые имеют высокую склонность к мутациям. Эти сайты
могут являться доминантами нарушенной регуляции этих микроРНК при раке [Calin G.A. et
al. 2004].
MiR-34 влияет на важнейшие внутриклеточные программы (рисунок 2).
29
Рисунок 2. Регуляторное воздействие miR -34 на гены-мишени, влияющие на
функционирование внутриклеточных программ [Rokavec M. et al. 2014]. (ЭПМэпителиально-мезенхимальный переход). Английская аббревиатура названия генов-мишеней
представлена на сайте www.ncbi.nlm.nih.gov/
С помощью биоинформационного прогнозирования и экспериментальной валидации
было показано, что мишени miR-34 включают в себя мРНК генов, связанных с клеточным
циклом (E2F3, cyclin E2, CDK4/6 и MYC), эпителиально-мезенхимальным переходом
(например, SNAIL), репарацией ДНК, ангиогенезом, клеточной выживаемостью (например,
SIRT1),
метаболизмом
(например,
LDHA)
и
иммунным
надзором
за
опухолью.
Соответственно, уменьшение экспрессии miR-34 может наблюдаться в различных опухолях
[Chang T.C. 2007], и потеря miR-34 может способствовать канцерогенезу.
Другие микроРНК, чью транскрипцию индуцирует р53, включают в себя miR-15a/16,
miR-107, miR-122, miR-143, miR-145, miR-182, miR-192/194/215 и члены семейства miR-200,
miR-205, miR-605 и miR-1204. Хотя все эти микроРНК потенциально могут быть
активированы за счет прямого связывания р53 с промотором генов микроРНК, стоит
отметить, что в каждом конкретном случае необходимы экспериментальные подтверждения
подобного взаимодействия.
p53 напрямую связывается с р53-респонсивным элементом в промоторе гена mir-145,
имеющего 1 экзон и расположенного в клетках человека в 5 хромосоме в регионе 5q32, и
30
индуцировать экспрессию этой микроРНК
[Sachdeva
M.
et
al.
2009].
miR-145
отрицательно регулирует c-MYC и другие клеточные регуляторы, например, CDK4/6, что
приводит к miR-145-опосредованному ингибированию опухолевой пролиферации in vitro и in
vivo [Sachdeva M. 2009, Zhu H. 2011]. miR-145 подавляет плюрипотентность человеческих
эмбриональных стволовых клеток за счет действия на мРНК генов OCT4, SOX2 и KLF4 [Xu
N. 2009]. MiR-145 подавляет мРНК гена MDM2, регулируя его экспрессию в клетках
сквамозной клеточной карциномы, что ведет к увеличению р53-зависимого апоптоза и
старению [Zhang J. 2012].
Гены микроРНК семейства let (lethal)-7 впервые были обнаружены у Caenorhabditis
Elegans в 2000 г как ключевые регуляторы перехода развития круглых червей из поздней
личиночной стадии во взрослую особь [Reinhart et al. 2000]. Обнаружено, что let-7
комплементарна 3/-UTR-региону мРНК гена lin-41, который является временным регулятором
плюрипотентности в зародыше.
У человека существует 13 членов семейства let-7 (let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3, let-7b, let7c, let-7d, let-7e, let-7f-1, let-7f-2, let-7g, let-7i, miR-98, miR-202), локализованных в разных
хромосомах [Roush S. and Slack F.2008]. На примере круглых червей было показано, что
основная функция let-7 – это клеточная дифференцировка. У млекопитающих уровень let-7
повышен во время эмбриогенеза и во время развития мозга, let-7 не обнаруживается в
человеческих и мышиных эмбриональных стволовых клетках, уровень let-7 увеличивается
после дифференцировки и поддерживается в дальнейшем в тканях взрослого организма.
В литературе let-7 рассматривается как опухолевой супрессор, поскольку в
большинстве раков члены семейства let-7 имеют сниженную экспрессию по сравнению с
нормальными тканями, что может иметь прогностическую ценность. Так, например, общая
даунрегуляция let-7 коррелировала с плохой выживаемостью пациентов с диагнозом рак
легких, особенно let-7а-2 [Takamizawa J. et al. 2004]. Низкая экспрессия let-7d была найдена
у пациентов со сквамозной клеточной карциномой головы и шеи и тоже коррелировала с
плохой выживаемостью [Childs G. et al. 2009].
Хотя низкий уровень let-7 – частое явление при раке, может также наблюдаться и
апрегуляция определенных членов let-7. Апрегуляция let-7b и let-7i обнаружена на поздней
стадии онкотрасформации при развитии лимфомы, поэтому повышенная экспрессия let-7
может быть прогностическим маркером идентификации пациентов с поздней стадией рака
[Lawrie С.Н. et al. 2008]. Более детальный анализ апрегуляции членов let-7 был выполнен для
let-7-3a, а конкретно было показано, что гипометилирование локуса, содержащего let-7-3a,
31
может быть причиной высокой экспрессии
let-7-3a при эпителиальном раке яичника [Lu
L. et al. 2007] и легкого [Brueckner B. et al. 2007].
К настоящему времени показано, что мишени воздействия всех членов let-7
перекрываются. Однако, есть сообщения, в которых показано, что определенные виды let-7
могут быть апрегулируемыми, а другие - даунрегулируемыми, например, в злокачественной
мезотелиоме экспрессия let-7b была высокая, а let-7e- низкая [Guled M. et al. 2009].
С помощью биоинформационного анализа были идентифицированы основные мишени
let-7. Показано, что let-7 специфически воздействует на мРНК гена Ras в раковых клетках
человека. Экспрессия let-7a,-c,-g значительно понижена в опухолях легкого, и большинство
членов let-7 локализовано в геномных регионах, которые часто делетированы при раке
легкого. Эти данные вместе с тем фактом, что Ras часто апрегулируется в человеческих
опухолях легких, предполагают, что основная роль семейства let-7 - это супрессия
онкогенных белков in vivo [Kumar M.S. et al. 2008].
Вторая главная мишень let-7 – это мРНК гена HMGA2 (хроматинсвязанный
негистоновый белок), способный модулировать структуру хроматина и воздействовать на
транскрипцию. Этот ген с онкофетальным паттерном экспрессии высоко экспрессируется в
эмбриональных тканях, но не определяется в тканях взрослого организма. Роль этого гена в
онтогенезе была показана мышах, нокаутных по данному гену, у которых развивалась
мезенхимальная тканевая гипоплазия, приводящая к карликовому фенотипу. Помимо участия
в эмбриогенезе, ген HMGA2 может высоко экспрессироваться в доброкачественных и
злокачественных опухолях, благодаря хромосомными аберрациями на 12q13–15. Из-за этой
перестройки происходит либо урезание открытой рамки считывания HMGA2, либо отделение
3/UTR-региона от интактной кодирующей HMGA2 последовательности, влекущие за собой
неопластический эффект [Mayr С. et al. 2007]
Было показано, что эпителиальные прогениторные клетки молочной железы,
обладающие свойствами стволовых клеток, способные репопулировать и давать возможность
разрастанию молочной железы из одиночных клеток, имеют низкий уровень экспрессии let-7.
Такие данные демонстрируют, что главные мишени let-7, включая HMGA2, могут
участвовать в поддержании фентипа стволовых клеток.
Есть сообщения, в которых говорится, что let-7a свою антинеопластическую функцию
реализует через противодействие с-Мус-индуцированному клеточному росту при лимфоме
Баркета. Экзогенная сверхэкспрессия let-7a вызывает значительную репрессию уровня с-Мус,
что ведет к снижению клеточной пролиферации в клетках лимфомы in vitro [Sampson V.B. et
al. 2007].
32
Для реализации своих онкогенных
свойств let-7а может использовать мишень –
каспазу 3, содержащую сайты для связывания «seed»-последовательности [Tsang W.P. and
Kwok T.T. 2008]. Онкогенный потенциал let-7 может осуществляться через воздействие на
транскрипционный репрессор Blipm-1 (PRDM1), который важен для терминальной
дифференцировки лимфоцитов и эпидермальных клеток. Потеря экспрессии Blipm-1 является
характерным событием для клеток лимфомы Ходжкина и клеток других человеческих
лимфом [Nie K. et al. 2008].
Интересны последние сообщения, где показана обратная связь между let-7 и Dicer. На
панели из 20 клеточных линий обнаружена обратная корреляция между let-7a и Dicer, и
отсутствие корреляции между let-7 и Drosha [Tokumaru S. et al. 2008]. мРНК гена Dicer – это
прямая мишень действия let-7a, однако экзогенная экспрессия let-7a, c, d также вызывает
даунрегуляцию мРНК и белка Dicer. Такое подавление синтеза белка Dicer негативно
сказывается не только на процессинге членов семейства let-7, но других микроРНК как в
нормальных, так и опухолевых клетках. Важно отметить, что подавление Dicer связано с
плохим прогнозом при немелкоклеточном раке легкого. Регуляция Dicer осуществляется не
только через 3/UTR-регион его мРНК, но также и через открытую рамку считывания,
кодирующей последовательности Dicer, которая содержит 3 сайта для связывания let-7.
МикроРНК
let-7f
и
let-7g
апрегулируются
в
клетках
с
индуцированным
преждевременным старением [Maes О.С. et al. 2009]. Показано, что let-7f апрегулируется во
время репликативного старения мезенхимальных стволовых клеток [Wagner W. et al. 2008].
Регуляция процесса старения c помощью let-7 осуществляется за счет мишени HMGA2.
МикроРНК let-7 – это маркер полностью дифференцированных клеток, let-7 не
определяется в стволовых клетках. Основными регуляторами экспрессии let-7 являются белки
Lin28 и Lin28B, которые блокируют с помощью различных механизмов процессинг членов
семейства let-7. Показано, что Lin28B может быть апрегулируемым при гепатоцеллюлярной
карциноме, хронической миелоидной лейкемии, раке яичника [Viswanathan S.R. et al.
2009].Эти белки могут действовать как факторы «стволовости» клеток совместно с белками
Oct4, Sox2, Nanog и запускать репрограммирование соматических фибробластов в
плюрипотентные стволовые клетки [Yu J. et. al. 2007].
Lee J. et al. обнаружили, что активированный р53 может индуцировать экспрессию
let-7 за счет подавления Lin28A [Lee J.Y. et al. 2013] в то время как 2 другие
исследовательские группы нашли, что let-7 отрицательно коррелирует с уровнем р53 из-за
того, что р53 напрямую связывается с энхансером промотора членов гена семейства let-7
[Hau A. et.al. 2011]. Активированный белок р53 может индуцировать экспрессию белка
триcтетрапролина (tristetraprolin (TTP), который связывается с АU-богатыми элементами 3/-
33
UTR-региона
короткоживущих
мРНК,
например, Lin28A. Ингибирование Lin28A
приводит к увеличению биогенеза let-7.
МикроРНК miR-16 входит в состав 2-х кластеров miR-15a/16-1 и miR-15b/16-2,
локализованных в разных хромосомах. Зрелая miR-16-2 точно такая же, как miR-16-1.
Прдполагается, что близкорасположенные гены микроРНК транскрибируется в виде
единого
полицистронного
первичного
предшественника,
который
в
дальнейшем
процессируется до индивидуальных микроРНК.
Кластер miR-15a/16-1 локализован в не кодирующем белок гене DLEU2, который
часто делетирован при хроническом лимфоидном лейкозе (ХЛЛ) [Mertens D. et al. 2009].
Кластер miR-15b/16-2 локализован в гене SMC4, который в основном регулирует
хромосомную стабильность, сборку и сегрегацию хромосом, благодаря образованию
комплекса с SMC2 [Kulawiec M. et al. 2008]. Зрелая miR-16, образованная с 2-х кластеров,
воздействует на белки, регулирующие клеточный цикл: циклин D, E, Cdk6. Главное отличие
между 2-мя кластерами – это miR-15a и miR-15b, которые имеют 4 нуклеотида,
отличающиеся в зрелой последовательности, однако функциональные отличия этих
микроРНК до сих пор не определены.
МикроРНК miR-15a и miR-16-1 высоко экспрессированы в нормальных В-лимфоцитах
+
CD5 , дающим начало образования клеткам ХЛЛ. Предполагается, что эти микроРНК играют
важную роль в подержании гомеостаза В-лимфоцитов CD5+, а в случае делеции хромосмого
региона, содержащего кластер miR-15a/16-1, могут стать причиной развития ХЛЛ [Calin G.A.
et al. 2002]. Кластер miR-15b/16-2 экспрессирован на гораздо более низком уровне в Влимфоцитах и в CD5+/CD19-положительных клетках.
Общей мишенью для обоих кластеров является мРНК гена BCL-2. Репрессия BCL-2 с
помощью miR-15a/16-1 индуцирует апоптоз в лейкемических клетках. Трансфекция в клетки
MEG-01 дикого типа miR15a/16-1 увеличивает скорость апоптоза, опосредованного
расщеплением про-каспазы 9 и поли (АДФ-рибозы) полимеразы, демонстрируя, что падение
уровня
белка
BCL-2,
вызванное
микроРНК,
является
эффективным
инициатором
апоптотического процесса [Cimmino A. et al. 2005]. Кроме мРНК BCL-2, miR15a/16-1
воздействует на мРНК CCND1 и WNT3a, которые отвечают за выживаемость, пролиферацию
и инвазию клеток предстательной железы in vivo. Показано, что нокдаун miR15a/16-1
способствует гиперплазии предстательной железы, связанной с апрегуляцией CCND1 и
WNT3a [Bonci D. et al. 2008]. О роли miR-15b/16-2 при РПЖ ничего неизвестно, однако
принимая во внимание сходные «seed» - последовательности и мишени 2-х кластеров
микроРНК, вполне вероятно, что и функции их тоже совпадают.
34
Нарушение регуляции экспрессии гена
mir-15a/16-1
при
раках
происходит
независимо от расположенного по близости гена Rb (ретинобластомы), и возможной
причиной инактивации miR15a/16-1 могут быть точковые мутации. Анализ 75 случаев ХЛЛ
выявил герминальные и соматические мутации в 5 из 42 секвенированных микроРНК у 11 из
75 пациентов. Герминальная мутация в pri-miR-16-1 у 2-х пациентов с ХЛЛ нарушает
экспрессию miR-16-1 in vivo по сравнению с экспрессией в нормальных в CD5+- клетках
[Calin G.A. et al. 2005].
В работе [Purmessur N. Sh. 2013] с помощью метода иммунопреципитации хроматина
обнаружено, что промотор гена mir-16-2 имеет сайты для связывания белка р53, причем это
связывание усиливается после повреждения ДНК. Взаимодействие р53 с miR-16-2 строго
специфично, поскольку р53-респонсивные элементы не найдены на гене mir-16-1.
Кроме прямого воздействия р53 на промотор гена кодирующего микроРНК, возможно
участие р53 в регуляции экспрессии микроРНК и на посттранскипционном уровне через
регуляцию процессинга miRNA. Например, созревание miR-15a, miR-16–1, miR-23a, miR- 26a,
miR-103, miR-143, miR-203 и miR-206 индуцируется за счет связи p53 и DROSHA и их
партнера DGCR8 путем взаимодействия с DDX5, который является частью этого комплекса
(microprocessor) [Suzuki H.I. 2009]. Транскрипционно неактивные участки гена Р53
препятствуют связыванию р53 с комплексом p68, что ведет к снижению процессинга miR.
Помимо созревания miRNA через DROSHA-процессинг, p53 контролирует также созревание
miRNA на уровне DICER1. Потеря функции DICER1 может иметь канцерогенные
последствия [Pellegrino L. 2013].
Хотя большинство p53-регулируемых miRs работают как опухолевые супрессоры,
некоторые из них при определенных условиях действуют как онкогены. Высокие
концентрации miR-7 (при РПЖ) и miR-149 (в клетках меланомы) увеличивают резистентность
клеток к апоптозу, miR-194 приводит к увеличению опухолевого ангиогенеза в клетках рака
толстой кишки HCT116 [Sundaram P. 2011].
Регуляция экспрессии р53 с помощью микроРНК
Регуляция экспрессии р53 микроРНК осуществляется либо за счет прямого
взаимодействия «seed» miRNA и 3´UTR региона мРНК P53, или непрямого:
через
взаимодействие микроРНК с мРНК генов вышележащих («upstream»)-регуляторов p53. Те
miRs, которые связывают р53 напрямую и ингибируют р53, включают в себя miR-125b,
miR-504, miR-33, miR-380, miR-1285, miR-25 и miR-30d. Эти микроРНК могут быть
клинически значимыми онкогенами и их сверхэкспрессия коррелирует с тяжелыми
заболеваниями и плохой выживаемостью при различных типах опухолей [Hermeking H.
2012.]. Подход in silico (условия полностью смоделированы в компьютерной системе)
35
идентифицировал,
что
miR-504
может
связываться с 2-мя сайтами 3´UTR-региона
p53 и отрицательно регулировать его экспрессию [Hu W. 2010]. Более того, сверхэкспрессия
miR-504 нарушает p53-опосредованную остановку клеточного цикла и апоптоз и
способствует канцерогенезу в условиях in vivo на модели рака толстой кишки.
MiR-125b отрицательно регулирует р53 у человека в ответ на стресс. miR-125b
является повсеместно экспрессируемой микроРНК, больше всего ее содержится в тканях
мозга и яичников. Эта микроРНК принадлежит к семейству miR-125, состоящему из miR125a, miR-125b-1, miR-125b-2 [Banzhaf-Strathmann1 J. 2014]. Зрелые miR-125a и miR-125b
имеют сходную «seed»-последовательность, могут регулировать одинаковые мишени, но
локализованы в разных хромосомах. Зрелая miR-125b транскрибируется с 2-х генов: 125b-1
(на хромосоме 11q24) и miR-125b-2 (на хромосоме 21q21). Было показано, что оба локуса
находятся в пределах так называемых «ломких сайтов», которые обычно делетированы при
РМЖ, раке шейки матки, раке яичников, раке легкого. В других исследованиях также
показано, что miR-125b даунрегулируется при РГШ, глиомах, меланомах, остеосаркомах,
однако механизмы снижения уровня miR-125b при этих видах рака неизвестны.
Предполагается, что метилирование промоторных регионов гена mir-125b может быть
вовлечено в блокировку экспрессии этой микроРНК. Обнаружено, что уровень miR-125b
может быть повышенным и связан с плохим прогнозом при колоректальном раке, раке
желудка, раке поджелудочной железы, при определенных видах лейкемий. Причины
апрегуляции
miR-125b
не
до
конца
понятны,
однако,
показано,
что
при
миелодиспластическом синдроме, который может приводить к миелоидной лейкемии,
связанной с транслокацией хромосом t (2;11) (p21; q23), апрегуляция miR-125b может
достигать 90-кратного размера [Bousquet M. et al. 2008].
Блокировка экспрессии miR-125b приводит к увеличению уровня белка р53 и
индуцирует апоптоз в
клетках, в то время как сверхэкспрессия miR-125b подавляет
эндогенный уровень р53 и уменьшает апоптоз [Le M.T. 2011]. При раке толстой кишки
увеличение экспрессии miR-125b было связано с инвазией и увеличением размера опухоли и
коррелировало со снижением выживаемости [Nishida N. 2011]. Интересно, что miR-125b
также может регулировать другие гены в р53-сигнальном пути и опосредовать апоптоз и
пролиферацию (рисунок 3).
36
Рисунок 3. Мишени miR-125, вовлеченные в развитие патологических процессов [Wu
N. et al. 2013]. Английская аббревиатура названия генов-мишеней представлена на сайте
www.ncbi.nlm.nih.gov/
Использование люциферазного анализа позволило установить, что miR-125b напрямую
контролирует, по крайней мере, 20 мишеней, принадлежащих р53-сигналингу [Le M.T. 2011].
Среди этих мишеней выявлены такие регуляторы апоптоза, как Bak1, TNFAIP3, Puma и Prkra,
а также регуляторы клеточного цикла cyclin C, Cdc25c и Cdkn2c. Показано, что в клетках
человека miR- 125b действует напрямую на 3´UTR -регион мРНК гена P53, а в клетках
грызунов miR-125b-опосредованный апоптоз осуществляется за счет подавления других
мишеней, принадлежащих р53-сети, а именно Bak1, Bcl-2 и cyclin C.
Важное значение в регуляции активности р53-сигналинга имеют микроРНК, не
оказывающие прямого воздействия на мРНК гена Р53. МiR-192, miR-194, miR-215 и miR-605
снижают активность MDM2 за счет прямого связывания, а miR-122 воздействует на MDM2
косвенно через даунрегуляцию cyclin G1 и последующего ингибирования фосфатазы PP2A,
влияющей на MDM2. Оба эти пути приводят к увеличению активности опухолевого
супрессора р53. МiR-34a и miR-449, имеющие сходные «seed»-последовательности, обе
воздействуют на SIRT1, что приводит к увеличению ацетилирования p53 и активации p53индуцированного апоптоза [Hermeking H.2012, Yamakuchi M. 2008]. На рисунке 4
показано, что активация р53 приводит к увеличению экспрессии miR-34, которая ингибирует
мРНК MDM4, а р53- зависимое увеличение экспрессии miRs -145, 143, 215, 194, 192 приводит
к супрессии мРНК MDM2.
Таким образом, одни miRs могут быть р53-зависимыми, а другие действуют на мРНК
самого гена Р53.
37
Рисунок 4. Непрямая регуляция активности р53- сигнальной системы при помощи
микроРНК, ингибирующих mdm2 и mdm4 [Hoffman Y. et al. 2014]. Английская аббревиатура
названия генов-мишеней представлена на сайте www.ncbi.nlm.nih.gov/
Особое
значение
в
функционировании
р53-
зависимой
системысохранения
стабильности генома занимает miR-21. В клетках человека ген mir-21 расположен в
интронной части кодирующего белок гена VMP 1 (вакуольный мембранный белок 1),
именуемый также TMEM49 (трансмембранный белок 49), локализованный в 17 хромосоме в
области 17q23.1. Установлено, что гены mir-21 и TMEM49 имеют независимую друг от друга
регуляцию и самостоятельно транскрибируются [Fujita S. et al. 2008].
Несмотря на то, что mir-21 локализован в геномном регионе хромосомы 17q23.,
амплификация которого часто ассоциирована с РМЖ, РПЖ, медуллобластомой, высокий
уровень miR-21 не связан с амплификацией гена, а обусловлен контролем ее содержания на
транскрипционном и посттранскрипционном уровне [Krichevsky A.M., Gabriely G. 2009].
Интересно отметить, что ген mir-21 расположен в «ломком сайте» гена FRA17B
внутри хромосомного региона 17q23.2, который является одним из локусов интеграции
вируса герпеса HPV16. Известно, что вирус HPV внедряется в геном хозяина и может быть
причиной генетических и эпигенетических нарушений, заставляя ученых думать, что
близость участков
интеграции
вируса и гена mir-21 в ДНК вызывает повышенную
экспрессию miR-21 при раке шейки матки [zur Hausen H. 2002].
38
Анализ промотора гена mir-21 помог
идентифицировать
несколько
консервативных энхансерных элементов, включая сайты для связывания белка активации
(activation protein 1, AP-1, состоящего из семейства Fos и Jun -ядерных онкогенов), Ets/PU.1,
C/EBP- (ключевые факторы, управляющие дифференцировкой кроветворных клеток),
ядерного фактора (nuclear factor I,NFI), SRF, p53 и сигнального трансдуктора и активатора
транскрипции 3 (signal transducer and activator of transcription 3, STAT3) [Fujita S. et al. 2008].
Онкогенная трансформация клетки часто связана с увеличением эндогенной активности AP1 через различные пути трансдукции сигнала и сильно способствует онкогенному
потенциалу miR-21. Следовательно, апрегуляция экспрессии miR-21 в различных типах рака
может быть ответом на повышенную активность АР-1 в этих карциномах. Кроме этого,
транскрипция
miR-21 индуцируется STAT3, другим фактором, чья активация является
существенной для трансформирующего потенциала многих онкогенов. STAT3-зависимая
транскрипция miR-21 показана в клетках миеломы XG-1 и
INA-6, стимулированных
интерлейкином -6 (IL-6), и клетках гепатоцеллюлярной карциномы HepG2 [Löffler D. et al.
2007].
С другой стороны, NFIB и C/EBP- связываются с промотором mir-21 и способствуют
реперессии тарнскрипции базального уровня miR-21 [Fujita S. et al. 2008]. Диссоциация этих
факторов с промотора mir-21 происходит очень быстро (в течение 4-х часов) после РМАстимуляции клеток HL-60, и это ведет к вновь повышенной активности промотора mir-21.
Важно отметить и различную роль в дифференцировке AP-1/PU.1 для моноцитов и C/EBPдля гранулоцитов, частично опосредованную через miR-21. Дополнительный механизм
регуляции экспрессии miR-21- это эпигенетическая модификация его транскрипционной
регуляторной последовательности. Исследование авторов Iorio M.V.et al. показало, что
гипометилирование гена mir-21, вызванное обработкой клеток яичников диметилирующим
агентом 5-AZA, вызывает сверхэкспрессию miR-21 in vivo [Iorio M.V. et al. 2007].
Транскрипционный контроль экспрессии miR-21 кажется довольно исключительным
явлением, поскольку для большинства микроРНК, дисрегулируемых при раке, изменения в
экспрессии зрелой микроРНК не коррелируют с уровнем их предшественника (pri-mir), что
свидетельствует о посттранскрипционном уровне регуляции их содержания [Thomson J.M.
et al. 2006]. Однако для miR-21, по крайней мере, во время онтогенеза, существует хорошая
корреляция между уровнем pri-miR-21 и miR-21.
Исследования многочисленных видов раков установили, что большинство микроРНК
в раковых клетках подавлено. Этот феномен носит название «глобальная репрессия
39
микроРНК при раке», и тот факт, что эта репрессия
не
совпадает
с
низким
количеством первичных транскриптов микроРНК, предполагает нарушение «биохимической
машины» процессинга микроРНК при раке.
Показано, что высокая экспрессия miR-21 наблюдается в опухолях у больных РМЖ
[Qian B. et al. 2009], РГШ [Chan S.H. et al. 2008], РПЖ [Folini M. et al. 2010] и других видах
рака.
Изучение профиля экспрессии микроРНК в 6 опухолях различных типов выявило, что
только miR-21 во всех опухолях был гиперэкспрессирован [Volinia S. et al. 2006].
Обнаружено, что miR-21 играет ключевую роль в процессах инициации и развития опухолей,
а также увеличивает их способность к выживанию и резистентность к действию
антиканцерогенных средств. Молекулярные механизмы, определяющие такое действие miR21 в клетках, представлены на рисунке 5.
Транскрипционные факторы, активирующие гены, участвующие в пролиферативных
процессах, например, АР-1, NF-kB, воздействуют на промотор гена mir-21 и стимулируют его
транскрипцию. Зрелая miR-21 ингибирует р53-сигналинг, препятствуя остановке клеточного
цикла
после
повреждения
ДНК,
развитию
апоптозов,
Рисунок 5. Регуляторы и мишени miR-21 [Xuan Pan X et. al. 2010]. Английская
аббревиатура названия генов-мишеней представлена на сайте www.ncbi.nlm.nih.gov/
воздействуя на мРНК генов PTEN (гомолог фосфотазы и тензина), PDCD4 (белок 4
программируемой клеточной гибели), FasL (Fas лиганд). Таким образом, miR-21 ингибирует
40
клеточные
программы,
направленные
на
защиту
генома,
которые
активируются
транскрипционным фактором р53.
Несмотря на обширное профилирование микроРНК при раке в контексте сравнения с
нормальными
тканями
и
клетками,
функциональных
исследований,
посвященных
исследованию «случай-эффект» между miR-21 и неопластической трансформацией не так
много. Ниже приводятся некоторые из них:
1) Нокдаун miR-21 в культуре клеток глиобластомы вызывает активацию каспаз и приводит
к увеличению клеточной апоптотической смерти, утверждая, что экспрессия miR-21 может
действовать как антиапоптотический фактор [Chan J.A. et al. 2005].
2) Нокдаун miR-21 в раковых клетках молочной железы MCF7 приводит к подавлению
клеточного роста in vitro и росту опухоли в ксенографтных мышиных моделях. Супрессия
клеточного роста была связана с увеличенным апоптозом и сниженной клеточной
пролиферацией (возможно, благодаря даун-регуляции экспрессии белка
Bcl-2 [Si M.L.
2007].
3) Нокдаун
miR-21 в метаститческих клетках рака молочной железы MDA-MB-231
существенно уменьшает инвазию и метастазы в легкие [Zhu S. et al. 2008].
4) Нокдаун miR-21 в гепатоцеллюлярных клетках увеличивает экспрессию опухолевого
супрессора PTEN (phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10) и усиливает
опухолевую клеточную пролиферацию, миграцию и инвазию. Увеличение экспрессии miR21 в гепатоцеллюлярных клетках приводит к увеличенной опухолевой пролиферации,
миграции и инвазии [Meng F. 2007].
5) Наблюдается обратная корреляция в колоректальных клеточных линиях между miR-21 и
опухолевым супрессором белком PDCD4 (programmed cell death 4). Нокдаун miR-21
приводит к увеличению уровня белка PDCD4 и снижает инвазивность, в то время как
сверхэкспрессия miR-21 способствует инвазивности и метастазам [Asangani I.A. 2008].
6) Увеличение экспрессии miR-21 в миеломных клетках (в отсутствии интерлейкина-6) ведет
к уменьшению уровня апоптоза в этих клетках [Loffler D. et al. 2007].
7) При скрининге микроРНК в клетках HeLa, обработанных ингибиторами микроРНК,
обнаружено, что ингибирование miR-21 вызывает уменьшение клеточного роста [Cheng
A.M. 2005].
41
8) Антисмысловое ингибирование miR-21
вызывает
существенную
апоптотическую
клеточную смерть в нейроэпителиальных клетках через повышенную активацию каспаз.
Обработанные антисмысловой miR-21 клеточные культуры показали высокий уровень
высвобождаемой лактатдегидрогеназы, как признак апоптотической клеточной смерти
[Sathyan P. 2007].
9) Использование ПЦР в реальном времени, совмещенной с обратной транскрипцией,
позволило определить экспрессию зрелой miR-21 в свежих опухолевых образцах, взятых у
пациентов с диагнозом РМЖ. С учетом стадии заболевания, степени злокачественности
опухоли, гистологии, статуса рецепторов гормонов и поражения лимфатических узлов было
показано, что высокая экспрессия miR-21 связана с агрессивным фенотипом опухоли,
высокой степенью злокачественности, с отрицательным статусом гормональных рецепторов,
плохой безрецидивной выживаемостью пациентов с ранней стадией рака и с протоковой
карциномой, однако клиническая оценка miR-21 для прогноза заболевания отсутствует [Qian
B. 2008].
Полученные данные свидетельствуют, что нокдаун miR-21 может приводить к
функциональным эффектам, четко связанным с инициацией и прогрессией рака. Такие
исследования показывают, что miR-21 проявляет некоторую онкогенную активность, которая
в случае удаления miR-21, ингибирует развитие связанного с раком фенотипа в клеточных
линиях.
Перспективы использования взаимодействия микроРНК и р53 в клинике
р53 представляет собой центральный регулятор, который может использовать
многочисленные кодирующие и некодирующие гены для достижения опухолевой супрессии.
Поэтому экспериментальное изменение функционирования одиночного белок-кодирующего
гена Р53 редко способствует остановке опухолевого роста в условиях in vitro или in vivo
[Concepcion
C.P.
2012].
Соответственно,
одна
р53-индуцированная
miR
способна
воздействовать на более, чем один кодирующий ген и может иметь существенный
терапевтический потенциал [Kasinski A.L. 2012].
Однако оценка эффектов одной р53-
индуцированной miRs осложнена, так как несколько микроРНК могут воздействовать на одну
и ту же мРНК белок кодирующего гена, что приводит к фенотипической компенсации. Bandi
and Vassella показали, что синергический эффект miR-15a/16 и miR-34a был необходим для
остановки клеточного цикла в клеточных линиях рака легкого, поскольку их согласованное
действие способствовало даунрегуляции большого количества генов, чем при действии
каждой микроРНК в отдельности [Bandi N. 2011]. Поэтому, совместная работа р53-связанных
42
miRs и их генов-мишеней имеет значение для
опухолевой супрессии и требует в будущем
экспериментальной валидации функционирования комплекса нескольких микроРНК, которые
могут быть критичны для оценки и понимания их причастности к функционированию р53.
Создано много алгоритмов, которые предсказывают мишени miR (например, TargetScan,
PicTar and miRanda) [John B. 2004, Lewis B.P. 2005, Robins H. 2005]. Число мишеней,
предсказанных для каждой miR с помощью этих программ, обычно составляют десятки или
сотни. В ближайшие годы может быть будет достигнут прогресс в исследованиях изменений
в уровнях miR и мРНК, связанных р53-зависимой системой. Эти данные важны для
определения, какие p53-регулируемые miRs могут быть использованы в качестве
диагностических, прогоностических и терапевтических инструментов в клинике. МикроРНКзаместительная терапия может быть применена для усиления функционирования р53зависимой системызащиты генома, и этот подход может уже не опираться на присутствие не
имеющего мутаций гена Р53. Интересно, что на мышиной модели РПЖ и рака легкого
показана терапевтическая эффективность введения «миметиков» miR-34a. Необходимы
доклинические испытания и других р53-индуцированных микроРНК, которые в эксперименте
дают обнадеживающие результаты [Krell J. 2013]. Дизайн новой терапии с использованием
p53–miR-сетей
позволит
побороть
такие
трудности,
как
резистентность
к
ДНК-
повреждающим агентам в опухолях с аберрантным р53. Факт, что miRs могут воздействовать
на многочисленные мРНК, вовлеченные в р53-сигналинг, внушает оптимизм в решении
вопросов защиты организма от возникновения опухолей, резистентных к терапии во время
системного лечения.
1.2.3.
МикроРНК,
модулирующие
активность
р53
после
воздействия
ионизирующей радиации
Экспериментальные исследования, посвященные влиянию ионизирующей радиации на
экспрессию генов, проведены на клеточных культурах и лабораторных животных.
Абсолютное большинство таких работ сосредоточено на изучении эффектов, возникающих в
первые часы и сутки после облучения. Работ, раскрывающих молекулярно-генетические
изменения через несколько месяцев после лучевого воздействия, значительно меньше.
Ионизирующая радиация вызывает глобальное изменение экспрессии генов в клетках
млеопитающих и человека [Saini D. 2012]. В результате этих изменений происходит
перестройка функционирования ведущих сигнальных сетей, активация клеточных программ,
способствующих адаптации к изменившимся условиям существования. Установлено, что
изменение экспрессии генов зависит от вида и дозы радиационного воздействия [Paul S.
2008]. Применение технологий микрочипов позволяет при изучении экспрессии генов
43
выделить
наборы
генов,
являющиеся
эффективными
главными
модуляторами
биомаркерами
дозы
радиационного воздействия.
МикроРНК
являются
экспрессии
генов
на
постранскрипционном уровне и принимают активное участие в процессах ответа клеток на
стресс-воздействия. Экспрессия белков, определяющих функционирование клеток, включая
транскрипционные факторы, регулируется микроРНК. Поэтому нет ничего удивительного в
том, что в первые часы после радиационного воздействия в клетках наблюдается изменение
экспрессии микроРНК (таблица 1).
Таблица 1. Содержание зрелых miR в нормальных и опухолевых клетках после воздействия
ионизирующей радиации [Mao A. et al. 2014]
Направлен
Биологический
Геныие
miR
мишени*
эффект
изменений
let-7
↑/↓
K-Ras,
CDC25a,
CDK6
Снижение радиорезистентности
опухолевых клеток.Усиление
радиотерапевтической эффективности.
Подавлениепролиферацию клеток
miR-7
↓
EGFR,
IGFR,
PIK3CD, PAK1
Увеличение
радиочувствительности раковых клеток.
Репрессия туморогенеза.
miR15a/16
↑
Bbcl-2,
CDC25a, Cyclin
El/Dl, Wipl, HuR,
VEGF
Индукция апоптоза клеток
опухоли. Ингибирование пролиферации
и роста стволовых клеток опухолей.
miR-1792
miR-18a
↑
/↓
miR-21
miR-24
miR-26b
↑
/↓
/↓
miR-34s
miR-99a
miR-100
↑
ATM
PTEN,
ERK, EGFR,
CDC25aPDCD
4,
Увеличение
радиорезистентности клеток лимфомы
Влияние на ДНК репарацию
Модуляция радиорезистентности.
Индукция ангиогенеза и
метастазирования
↑
H2AX,
E2F2, Мус
Влияние на ДНК репарацию
↑
ATF2,
GATA4, COX2, PTGS2,
ATM, PTEN
Усиление действия радиации
E2F,
SIRT1, CDK4,
Мус, HDAC1,
NOTCH, Bcl-2
Усиление
радиочувствительности. Индукция
апоптозов
↑
/↓
P21,
CTGF, E2F,
PTEN, Bim,
TGFBR2
Влияние на ДНК репарацию
↑
SNF2H,
FGFR3, Akt
Влияние на системы репарации
двойных разрывов.
↑
ATM,
DNA-PKcs,
Модуляция
44
/↓
PLK1
DNAPKcs, ATM
радиочувствительности
Усиление
радиочувствительности опухолей.
miR-101
↑
miR-106
↑/↓
miR143/145
↑/↓
Мус, KRas, FHIT, Bcl2
miR181a
↓
ATM,
K-Ras, Bcl-2
miR-185
↓
ATR,
Sixl
Ингибирование пролиферации
клеток
miR-210
↑/↓
RAD52,
HIF
Влияние на процессы
репарации двойных разрывов
↑/↓
p27,
PTEN, PUMA
miR221/222
p21,
E2F5
Регуляция прохождения
клеточного цикла
Модуляция
радиочувствительности. Промоция
апоптозов.
Действие на ДНК репарацию
и промоцию апоптозов.
Регуляция пролиферации и
радиорезистентности опухолевых
клеток
miR-335
↓
CtIP,
Rbl
Влияние на репарацию ДНК.
miR-421
↓
ATM
Влияние на репарацию ДНК
miR449a
↑
miR-521
↓
miR-663
↑/↓
HDAC1
, NOTCH 1,
Bcl-2, CyclinDl
CSA
SMAD3
, p21
Индукция апоптозов
Влияние на репарацию ДНК
Модуляция радиочувствительности
Промоция пролиферации и
туморогенеза.
Примечание: *- английская аббревиатура названия генов-мишеней представлена на сайте
www.ncbi.nlm.nih.gov/
Представленные в таблице 1 результаты иллюстрируют положение о том, что после
воздействия ионизирующей радиации экспрессия микроРНК значительно изменяется.
Показано, что облучение приводит к индукции образования таких микроРНК, как miR-17,
miR- 22, miR-29, miR-34, miR-100, miR143, miR-145, miR-193, miR-365. В зависимости от
типа клеток может происходить как активация, так и ингибирование экспрессии miR-15, miR16, miR-17, miR-18, miR-21, miR-24, miR-106, miR-107, miR-146, let-7 и других [Czochor J.R.
2014]. Облученные клетки могут индуцировать в интактных клетках изменения экспрессии
микроРНК через «эффект свидетеля». Обнаружено, что профиль экспрессии микроРНК в
облученных клетках отличался от экспрессии в «клетках-свидетелях». Экспрессия микроРНК
семейства let-7 активируется в облученных клетках, но эти же микроРНК остаются
подавленными в «клетках-свидетелях». Также активируется экспрессия miR-17-3p, miR-19b, и
miR-18a в облученных клетках, но подавляется в «клетках-свидетелях». miR-17-5p, miR-142-
45
3p,
miR-142-5p
и
miR-19a
были
индуцированы только короткое время в
«клетках-свидетелях». [Chaudhry M.A. 2012].
Исследование нарушения экспрессии микроРНК в клетках при низкой дозе облучения
помогает понять природу формирования рисков для здоровья человека. Выявлены различия в
экспрессии miRs в зависимости от дозы и мощности дозы облучения [Chaudhry M.A. 2012].
Установлено, что низкодозовое воздействие влияет на экспрессию miR, и что это напрямую
связано с нарушением экспрессии белков [Barjaktarovic Z. 2013]. Изменения в уровне miR
после низкодозового облучения может влиять на неопластические процессы в клетках и
иметь отношение ко вторичным ракам. В настоящее время предложены различные комплексы
miR, позволяющие оценить тяжесть лучевого поражения [Cui W. 2011].
Ведущая роль транскрипционных факторов в изменении содержания микроРНК после
облучения очевидна, поскольку установлено, что ионизирующая радиация в большинстве
случаев не влияет на экспрессию генов, участвующих в созревании зрелых микроРНК [Mao
A. 2014]. Двутяжевые разрывы ДНК, возникающие после лучевого поражения, инициируют
активность
многочисленных
внутриклеточных
сигнальных
путей,
влияющих
на
транскрипцию генов и процессы посттранскрипционной регуляции, осуществляемой
микроРНК. После возникновения разрывов ДНК ATM серин/треанин киназа фосфорилирует
р53, что вызывает активацию транскрипционного фактора р53. Это приводит к изменению
активности микроРНК, задействованых в работе р53- зависимой системы (рисунок 6).
Рисунок 6. Р53-зависимая экспрессия и биогенез микроРНК в клетках после
воздействия ионизирующей радиации [Mao A. 2014].
46
В экспериментах in vitro и
in vivo
показано, что пострадиационная активация
р53 приводит к увеличению содержания зрелых miR-34 [Girardi C. 2012, Kato M. 2009].
Установлено, что увеличение содержания miR-34 наблюдается и через 4 часа после
воздействия низких доз радиации, причем в опухолевых клетках оно менее выражено
[Stankevicins. L.2013].
Транскрипция микроРНК семейства let- 7 после облучения в зависимости от типа
клеток может репрессироваться, либо активироваться [Saleh A.D. 2011]. Кроме того, р53
после радиационного воздействия способен активировать посттранскрипционный биогенез
таких микроРНК, как miR-16, miR-143, miR-145 [Zhang J. 2013]. Связываясь с р68/р72,
онкосупрессор р53 взаимодействует с комплексом Drosha/DGCR8, регулируя его активность
и ускоряя созревание miR-16, miR-145, miR-21.
Показано, что через 8 часов после ɣ-облучения наблюдается снижение экспрессии
miR-125 [Le M.T. 2009]. Поскольку хорошо известно, что miR-125 может являться
ингибитором р53 и некоторых других генов р53-сети, снижение miR-125 является одним из
факторов, способствующим радиационно-индуцированной экспрессии р53 и ряду других
генов р53-завиисимых путей. Увеличение экспрессии miR-504 приводит к тому, что после
облучения разных типов клеток с геном p53+/+ , наблюдается снижение содержания белка р53
и его действия как транскрипционного фактора на экспрессию mdm2 и р21 ослабевает [Hu W.
2010]. Увеличение miR-25 и miR-30 приводили к ингибированию р53-зависимой остановке
клеточного цикла [Kumar M. 2011].
В клетках, имеющих мутации в гене P53, влияние облучения на экспрессию микроРНК
меняется [Brachova P. 2014]. «Онкоморфный» ген P53 с мутациями, препятствующими
остановке клеточного цикла и апоптозу, теряет способность через 0.5, 1 , 4 , 8 ч и 24 ч после
облучения в дозе 8 Гр активировать, как транскрипционный фактор, экспрессию микроРНК,
которые модулируют эти процессы, например, miR-34. Установлено, что в таких клетках не
наблюдается
пострадиационной
р53
-зависимой
активации
комплекса
Drosha,
обеспечивающего созревание mir-16 и mir-145 [Kawai S. 2012].
Таким образом, ответ р53- зависимой системысохранения стабильности генома на
радиационное воздействие определяется многими факторами, такими как мощность и доза
облучения, фенотип клетки и, конечно, уровенем экспрессии микроРНК, имеющих
отношение к сохранению клеточного гомеостаза и пролиферации.
Лучевая терапия и экспрессия miR в опухолях
Лучевая терапия (ЛТ) представляет собой основную форму лечения опухолей.
Устойчивость новообразований к действию радиации определяется состоянием генома,
47
эпигенетической
регуляцией
в
раковых
клетках, микросредой, состоянием кровотока
и является существенной клинической проблемой. Исследования последних лет показали, что
микроРНК
могут
изменять
радиочувствительность
опухолей, влияя на
репарацию
повреждений ДНК, механизмы остановки клеточного цикла, процессы апоптотической
гибели
клеток
[Zhao
L.
2012].
МикроРНК
модулируют
эти
программы,
и
их
функционирование в трансформированных клетках отличается от функционирования в
нормальных клетках. Полагают, что важнейшее значение для развития злокачественных
новообразований приобретает дисрегуляция микроРНК. В настоящее время получены
убедительные
доказательства,
что
дисрегуляция
экспрессии
микроРНК
является
отличительной чертой злокачественных гемобластозов [Iorio M.V. 2009]. Причины
аномальной экспрессии микроРНК в гемобластозах многочисленны и могут включать в себя
хромосомные аберрации, эпигенетическое дерегулирование, аномальную экспрессию
транскрипционных факторов, которые регулируют промоторные регионы микроРНК. Многие
из микроРНК, которые аномально экспрессируются в гематологических злокачественных
новообразованиях, также являются ключевыми регуляторами кроветворения.
Получено очень много данных, свидетельствующих о ключевой роли микроРНК в
нарушениях гемопоэза, в том числе и после радиационного воздействия. Однако, применение
полученных результатов в клинической практике весьма скромно. Существует надежда, что
использование препаратов, влияющих на экспрессию индивидуальных микроРНК, позволит
регулировать процессы кроветворения. Показано, что miR-15а, miR-16, miR-342, miR-107, let7а, miR-21, miR-34a, miR-125 принимают активное участие в формировании гемабластозов.
Уже в 2005 году удалось показать, что существуют комплекс из 29 микроРНК,
изучение экспрессии которых позволяет различить опухоли молочной железы от нормальных
тканей с точностью до 100%. [Iorio M.V. 2005]. miR-10b, miR-125b и miR-145 cнижали свою
экспрессию в опухолях молочной железы, в то время как miR-21 и miR-155 были
активированы. Индивидуальные микроРНК, такие как члены семейства let-7, связаны с
подтипом опухоли и позволяют оценить степень развития РМЖ. Пять микроРНК (miR-210, 21, -106b , - 197, и let-7i) были связаны с выживаемостью, метастазами.
Примерно один из трех мужчин в возрасте старше 50 лет демонстрирует
гистологические признаки аденомы предстательной железы. Тем не менее, только у 10%
диагностированы клинически значимые карциномы предстательной железы. Большинство же
аденом никогда не прогрессируют и не становятся опасными для жизни. До сих пор мало
известно
о
механизмах,
приводящих
к
злокачественному перерождению
аденомы
предстательной железы, делающей еѐ опасной для жизни. Исследование профиля экспрессии
микроРНК в опухолях выявили значительные изменения в содержании микроРНК, по
48
сравнению с нормальной тканью. Кластер
mir-15а/16-1
находится
в
хромосомной
области 13q14, которая инактивируется в 50% случаев РПЖ [Bonci D. 2008]. Повышенная
экспрессия этого кластера при РПЖ обеспечивает ингибирование пролиферации клетки,
индукцию апоптоза и подавление онкогенеза как in vitro, так и in vivo.
В связи с этим, влияние радиации на экспрессию микроРНК в нормальных клетках
отличается от картины, наблюдаемой после облучения опухолей. Радиациационноиндуцированные повреждения ДНК в нормальных клетках вызывают увеличение активности
транскрипционного фактора р53, что приводит к индуции экспрессии miR-34a, участвующей
в реализации механизмов ареста клеточного цикла, старения и апоптоза [He L. et al. 2007].
Однако, хорошо известно, что в большинстве опухолей активность р53 ингибирована,
наиболее часто за счет мутаций в гене, либо при высокой активности ингибиторов: mdm2 и
mdm4. Поэтому после облучения опухолей не наблюдается адекватной стресс-воздействию
активации онкосупрессора р53, а также экспрессии микроРНК, гены которых являются
мишенями этого транскрипционного фактора, например, miR- 34, miR- 16.
Экспрессия miR, являющихся онкосупрессорами, часто подавлена в первичных
человеческих опухолях, например, снижено содержание let-7c при РПЖ [Nadiminty N. 2012].
Некоторые miR также участвуют в замкнутых циклах регулирования р53 и, главным образом,
транскрипта, добавляя другой регуляторный «слой» в радиационном ответе [Feng et al. 2011].
Нарушения основных сигнальных путей выживаемости клеток, опосредованные микроРНК,
являются общими путями защиты раковых клеток от радиационно-индуцированной
остановки клеточного цикла и смерти. Например, miR-21 и miR-95 вызывает увеличение
выживаемости с помощью подавления регуляторов PTEN и SGPP1, соответственно [Huang X.
2013]. И наоборот, miR-9 и let-7 воздействуют на транскрипт NF-κB1, отменяя эффект
усиления выживаемости
посредством активации NF-κB –зависимого сигнального пути
[Arora H. 2011]. Вовлечение miR в эти хорошо изученные пути опухолевой выживаемости
подчеркивает возможность развития терапевтических стратегий, нацеленных на эти пути.
Особое значение имеют эксперименты на стволовых опухолевых клетках. Показано,
что miR-34a подавляет сохранение и развитие человеческих стволовых раковых клеток
предстательной железы CD44+ , нарушая развитие опухоли и метастазов в условиях in vivo
[Liu C. 2011]. miR-145 воздействует на транскрипционные факторы OCT4, SOX2 и KLF4,
которые являются центральными белками поддержания свойств стволовых клеток [Xu N.
2009], а также участвует в регуляции способности к самообновлению стволовых клеток в
различных опухолях, включая РПЖ [Huang S. 2012].
Проведенные
экспериментальные
исследования
позволяют
надеяться,
что
индивидуальное определение профиля экспрессии miR у пациентов может позволить
49
установить радиорезистентность опухолей и
подобрать
персонифицированную
схему
лечения для онкологических больных [Korpela E. 2015]. Основанием для использования
микроРНК при лечении опухолей является представление о том, что фенотип рака может
быть изменен направленным действием на экспрессию «онкомиров» и микроРНКсупрессоров опухолей.
Что касается клинической значимости miRNAs как предикторов ответа на ЛТ или
химио-лучевую терапию, то результаты предварительных исследований, выполненные на
отдельных
типах
опухолей,
предусмотрели
возможность
установления
корреляции
специфических микроРНК (или сигнатуры микроРНК) и клинического исхода [Gandellini1 P.
2014].
Так на когорте из 93 пациентов с диагнозом РМЖ, получавших либо химио- и лучевую
терапию, или только ЛТ, было показано, что уровень экспрессии miR-155 коррелировал с
положительной общей выживаемостью. Из результатов, полученных на экспериментальных
моделях РМЖ, известно, что miR-155 регулирует активность репарации ДНК и
чувствительность к ионизирующему излучению за счет подавления RAD51.
В случае исследования 31 пациента с немелкоклеточным раком легких, перенесших
резекцию и послеоперационную ЛТ, обнаружено 12 miRNAs, которые дифференциально
экспрессировались в опухолевых образцах пациентов с хорошим и плохим прогнозом, с точки
зрения общей выживаемости и частотой местных и отдаленных рецидивов. В частности, 5
микроРНК (miRNA- 126, miRNA-let-7a, miRNA-495, miRNA-451, и miRNA- 128b) были
значительно апрегулируемыми и 7 микроРНК (miRNA-130a, miRNA-106b, miRNA-19b,
miRNA-22,
miRNA-15b,
miRNA-17-5p,
и
miRNA-21)
были
даунрегулируемыми
в
радиочувствительных опухолях по сравнению с радиорезистентными опухолями.
В серии исследований, состоящих из 159 пациентов с назофарингеальной карциномой,
получавших только ЛТ, или пациентов с более поздней стадией рака, получавших ещѐ
химиотерапию (циспластин или флуорацил (5-FU)), было найдено, что miR-29c гораздо чаще
экспрессируется в опухолевых образцах пациентов, у которых лечение было неэффективным,
поэтому miR-29 считать предиктором терапевтического воздействия. Доклинические
исследования на назофарингеальных моделях предположили, что роль
miR-29c в ответе
опухоли на облучение опосредована двумя мишенями MCL-1 и Bcl-2 .
Одно исследование, выполненное на 21 пациенте с диагнозом рак желудка, которые
подвергались хирургической резекции и последующей химиотерапии 5-FU и ЛТ, показало,
что низкий уровень miR-451 в опухолевых образцах был связан с плохой общей
50
выживаемостью Биоинформационный анализ
и исследование с помощью микрочипов
определили новый онкогенный ингибиторный фактор миграции (MIF), как главную мишень
воздействия miR-451, хотя его функция в ответе на ЛТ до сих пор еще не известна.
Результаты исследований, выполненные на 43 пациентах с диагнозом мультиформная
глиобластома, которые получали ЛТ параллельно с адьювантной терапией темозоломидом
(temozolomide), показали, что высокий уровень экспрессии miR-132 в опухолевых образцах
до лечения связан с плохой общей выживаемостью.
1.3.
Эксперименты
по
изучению
экспрессии
микроРНК,
модулирующих
активность Р53 –системы защиты генома в отдаленные сроки после облучения.
После воздействия ионизирующей радиации в различных сублетальных дозах в
клетках возникают повреждения ДНК, которые либо репарируются, либо клетки с
сохранившимися
повреждениями
элиминируются.
Однако,
у
части
клеток
радиационного воздействия сохраняются генетические изменения. Например,
после
возникшие
двутяжевые повреждения ДНК репарируются двумя механизмами, называемыми репарация
за счет гомологичной рекомбинации (homologous recombinational repair (HRR) и репарация
путем соединения негомологичных концов (non-homologous end joining (NHEJ) [Iliakis G.
2007]. NHEJ подвержена высокому риску генерации de novo мутаций в сайтах двутяжевых
повреждений ДНК [Goedeccke W. 2007]. Клетки с такими мутациями способны сохранять
свою жизнеспособность и не подвергаться апоптозу. Они представляют опасность для
развития онкотрансформации. Гибель клеток с поврежденным геномом приводит к
уменьшению
клеточности
радиочувствительных
тканей.
Поэтому,
после
облучения
развиваются процессы восстановления органов. Продолжительность восстановительных
процессов зависит от дозы радиационного воздействия и может продолжаться в течение
длительного времени. Данные позволяющие судить об изменениях, происходящих в органах
в
отдаленные
сроки
после
радиационного
воздействия,
получены
в
результате
эпидемиологических исследований, а также в экспериментальных работах на животных.
Показано, что различные ткани обладают разной радиочувствительностью не только к ранним
детерминированным эффектам лучевого воздействия, но и к формированию отдаленных
радиационных поражений, наиболее опасными из которых являются новообразования. К
числу радиочувствительных отдаленных проявлений относятся гемобластозы и опухоли
молочной железы. Эксперименты на мелких лабораторных животных позволяют изучить
достаточно
представительную
репрезентативную
группу
животных,
содержащихся
длительное время после лучевого воздействия, имеющих одинаковый геном и строгий
51
контроль
за
действием экстремальных
факторов.
Мышиная
модель
наиболее
широко используется для изучения радиационных лейкозов и лимфом, в то время как на
крысах наиболее часто проводятся исследования радиационно-индуцированного рака
молочной железы [Yokoro
K. 1986]. Главной причиной, не позволяющей исследовать
механизмы формирования радиогенных гемабластозов на крысах, является низкий уровень
появления этих опухолей после облучения, в то время как мыши обладают высокой видовой
чувствительностью к образованию радиационно-индуцированных лейкозов и лимфом.
Установлено, что в течение нескольких месяцев после
острого сублетального
облучения мышей наблюдаются процессы восстановления гемопоэза. Однако число
гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге через 1 – 4 месяца после облучения
мышей в дозе 2 Гр остается в несколько раз ниже контрольного уровня. Трансплантация этих
клеток показало наличие дефектов в их репопуляционной способности [Acharya S. S. 2015].
Самое интересное, что в первые сутки после радиационного воздействия на мышей радиации
в дозах 2,0 Гр, 6,5 Гр и 8,0 Гр по уровню экспрессии miR-187-3p, miR-27a-3p, miR-30a-3p и
miR-30c-5p можно было установить тяжесть радиационного поражения и на примере
действия амифастина характеризовать эффективность радиозащитных средств [Acharya S. S.
2015].
Экранирование костного мозга предотвращяет развитие лимфомы в тимусе после
радиационного воздействия. Установлено, что возникновение лимфомы в тимусе после
облучения в дозе 1,75 Гр связано с увеличением экспрессии miR-21. Одним из механизмов
реализации этого эффекта– это ингибирование транскрипции мРНК онкосупрессора,
играющего важную роль в радиационном канцерогенезе, гена bigH3β, являющегося мишенью
miR-21 [Liu C. et al. 2011].
Крысы являются плохой моделью для изучения радиационно-индуцированных
лимфогематопоэтических новообразований [Ward J. M. 1990]. Спонтанное появление
гемабластозов у крыс наблюдается редко [Cook G. J. 2013]. Однако следует отметить, что у
определенных линий крыс при сочетанных воздействиях удается обнаружить высокий
уровень радиогенных гемобластозов. Так, в отечественной литературе показаны случаи
достаточно высоких образований гемабластозов у крыс линии Вистар после длительного
равномерного β-облучения инкорпорированным тритием в сочетании с действием
бактериального липополисахарида [Муксинова К.Н. 2009].
Низкий уровень образования радиогенных гемабластозов у крыс не доказывает
нормализации функционирования кроветворной системы в отдаленные сроки после острого
облучения этих животных. Эксперименты, проведенные на белых крысах, свидетельствуют о
глубоких и длительно сохраняющихся поражениях гемопоэза после облучения. В первые 3
52
месяца после лучевого поражения в дозе 5 Гр
наблюдается
период
относительной
стабилизации, через 6 месяцев обнаруживаются явления гиперплазии костного мозга, а после
9 месяцев – период в который возможно появление выраженных изменений, таких как
эритропения, а в костном мозге и гиперплазии [Шмелева Н.И. 1962, Кондратьева Т.М.
1964].
В противоположность данным по радиационно-индуцированным гемобластозам,
важно отметить, что РМЖ у крыс сравним с РМЖ у человека во многих отношениях, таких
как высокая частота гормональной зависимости и патологическая прогрессия от гиперплазии
протоков к карциноме протоков in situ. Поэтому крысы являются широко используемой
моделью для исследования риска и механизма развития РМЖ. Мышиные опухоли молочной
железы имеют некоторые отличия от человеческих раков молочной железы, такие как низкая
частота гормональной зависимости и прогрессия карциномы преимущественно от
альвеолярной гиперплазии [Thompson H. J. 2000]. Необходимо констатировать, что у крыс в
молочной железе после облучения развиваются как доброкачественные опухоли фиброаденомы, так злокачественные - аденокарциномы [Shellabarger C. J. 1960]. Поэтому не
вызывает удивления использование именно крысиной модели для исследований изменения
профиля экспрессии генома в латентный период после облучения до формирования опухолей
молочной железы, а также в самих опухолях. За рубежом и в России подобного рода
эксперименты проводятся на крысах различных линий. Крысы линии ACI демонстрируют
высокую чувствительность к высокому уровню эстрогенов с маленьким латентным
периодом развития опухоли, поэтому широко применяются для исследования гормонального
канцерогенеза молочных желез. Крысы линии Fischer-344 склонны к крайне тяжелым
метастатическим и лекарственно-устойчивым опухолям. Крысы линии ACI имеют низкий
уровень спонтанных и радиационно-индуцировнных опухолей, в то время как большинство
самок линий Fischer-344, Long–Evans, Sprague Dawley более чувствительны к этим опухолям.
Крысы линии Sprague Dawley были чувствительны к химическому и радиационноиндуцированному канцерогенезу, но резистентны к гормональному [Luzhna L. et al. 2015].
Гормональная
зависимость
радиационно-индуцированных
новообразований
продемонстрирована с помощью экспериментов по удалению гипофиза и ячников у
облученных крыс, имеющих небольшие опухоли. Обнаружено, что овариэктомия может
вызывать частичную или полную регрессию опухоли. Однако удаление яичников до общего
облучения или после него понижает, но не элиминирет развитие опухоли молочных желез у
крыс [Москалев Ю.В. и др. 1982].
Используя
GeneChip
Rat
Genome
230 2.0
arrays
для
исследования
31000
последовательностей генов, было изучено содержание мРНК генов в клетках молочной
53
железы у 3-х интактных крыс, 3-х крыс со
спонтанными и 4-х крыс с радиоционно-
индуцированными карциномами. Выявленные различия в экспрессии генов между группами
были количественно охарактеризованы с применением технологии ПЦР в реальном времени
[Imaoka T. 2008]. Удалось показать, что 50 генов проявляли различия экспрессии в
спонтанных и радиогенных опухолях молочных желез. Наибольшую информационная
значимость представляла высокая экспрессия генов Pig (плазминоген), Pgr (рецептор
прогестерона) и Wnt4 (Wingless-related MMTV integration site 4) для всех спонтанных
карцином; Tnfsfll (суперсемейство фактора некроза опухоли номер11), FgflO (фактор роста
фибробластов 10), Agtrla (ангеотензин II рецептор типа 1), S100A9 (SI00 кальций-связанный
белок A9) и Pou3f3 (POU домен класса 3 транскрипционный фактор 3) – для радиационноиндуцированных
(амфирегулин),
карцином.
Igf2
Увеличение
(инсулин-подобный
экспрессии
фактор
Gp2
роста
2)
(гликопротеин
2),
Areg
наблюдалось
для
всех
новообразований. На рисунке 7 показано, что крыс по изменениям экспрессии генов Tnfsfll,
FgflO, Agtrla, S100A9 и Pou3f3 в радиационно-индуцированных опухолях можно разделить на
две группы: в одной экспрессия соответствовала результатам, полученным в спонтанных
карциномах, а у другой - значительно увеличивалась.
Рисунок 7. Уровень экспрессии генов Tnfsfll (А), FgflO (В), Agtrla (С), Pou3f3 (D),
S100a9 (Е) в спонтанных (левые точки) и радиационно-индуцированных карциномах (правые
точки). За 1 принят уровень значений экспрессии у интактных крыс
Точки – индивидуальные значения. Светлые точки – уровень экспрессии превышает 3
стандартных отклонения от значений экспрессии генов в спонтанных опухолях [Imaoka T.
2008].
Важно отметить, что уже через 10 недель после острого ɣ-облучения в дозе 1 Гр,
задолго до образования карцином, в молочных железах наблюдалось значительное
увеличение экспрессии генов Tnfsfll, FgflO, Agtrla, S100A9 и Pou3f3 .
Изучению молекулярных механизмов онкотрансформации клеток молочных желез у
крыс посвящен также цикл работ Ковальчук с соавторами [Kristy R. 2010, Luzhna L. 2014,
54
Kutanzi K 2013]. Авторы полагают, что РМЖ
у
крыс
линии
ACI,
индуцированный
эстрогеном и рентгеновским облучением, связан с дисрегуляцией процессов клеточной
пролиферацией и апоптоза, и эти изменения могут происходить на ранних стадиях
опухолевой
трансформации,
предшествующей
образованию
пренеопластического
и
неопластического поражений в ткани молочной железы. Известно, что р53 принимает
непосредственное участие в активации апоптоза в ответ на повреждение ДНК и поэтому
исследование его экспрессии вызывает интерес. Было установлено, что уровень белка р53 у
крыс, подвергавшихся действию радиации или эстрогена, не изменяется во время всего
периода исследований (6, 12, 18 недель). В противовес сказанному, крысы, после
одновременного действия радиации и эстрогена, имели повышенный уровень р53 через 12
недель (превышение в 7 раз по сравнению с контролем). На 18 неделе р53 в этой группе
продолжал увеличиваться. Параллельно в этой группе наблюдался рост экспрессии белка
mdm2. Масштабное исследование профиля экспрессии генов позволило установить, что через
96 ч после облучения в дозе 2,5 Гр наблюдается значительное изменение экспрессии 32
генов, а через 168 дней – 51. Было установлено, что на 168 сутки наблюдалась активация
экспрессии р53 и miR-34 [Luzhna L. 2014]. Следует отметить, что и в других тканях у крыс
через несколько месяцев после острого лучевого воздействия наблюдаются изменения
функционирования клеточных регуляторных сетей, и
их модуляторов – микроРНК.
Изменения содержания мРНК и микроРНК в легких крыс наблюдали во весь исследуемый
период, составляющей 26 недель после облучения [Xie L. 2014]. В общей сложности за это
время изменялась экспрессия 23 микроРНК и 5100 белок кодирующих генов. Была показана
четкая связь между уровнями let-7 и экспрессией их генов-мишеней. На примере let-7 и miR21 продемонстрировано, что использование «миметиков» miR позволяет в клетках легких
нормализовать сниженный уровень miR-21, наблюдаемый через 3 и 12 недель после
облучения, а использование ингибиторов let-7 снизить высокий уровень этой микроРНК,
обнаруживаемый в эти же сроки.
Клеточное старение является нормальным биологическим процессом, приводящим к
удалению из пролиферативного пула потенциально вредных поврежденных клеток,
формирующихся после действия эндогенных и экзогенных факторов. Поэтому старение
клеток можно рассматривать как процесс, направленный на подавление развития опухолей. С
другой стороны, старение клеток может способствовать развитию опухолей, например, из-за
нарушения микроокружения тканей и развития проонкогенной среды, главным образом, с
помощью секреции провоспалительных факторов. Доля стареющих клеток, как известно,
увеличивается ещѐ и с возрастом. Клеточное старение является метаболически активной
формой необратимой остановки роста и, как следствие, старение предотвращает передачу
55
повреждений
дочерним
клеткам. Эти
сложные клеточные события инициируется в
ответ на различные внутренние и внешние генотоксические стимулы [Davalos A.R. 2010] и
связаны с активацией сигнальных путей с участием р53 и p16INK4A/PRB. Действительно, в
большинстве
случаев
злокачественные
новообразования
имеют
мутации
в
генах,
принадлежащих Р53 и / или pRb/p16 -путям, что является механизмом клеточной
трансформации [Gil J. 2006].
Важно отметить, что механизмы, подавляющие образование опухолей в результате
клеточного старения функционируют как у человека, так и у лабораторных животных
[Serrano M.2010]. Вероятно, клеточное старение при высокой активности р53, наряду с
сохранением
р53-системы
стабильности
генома,
способствует
предотвращению
онкотрансформации. Экспрессия супрессора опухолей p16INK4a, являющегося маркером
старения, увеличивается с возрастом. В модельных экспериментах в течение 8 месяцев после
радиационного воздействия было показано, что его экспрессия увеличивается у облученных
мышей и индуцирует старение мультипотентных стволовых клеток и остеобластов
[Carbonneau C.L. 2012]. В формировании радиогенного старения клеток принимают участие
и стромальные элементы [Carbonneau C. L. 2014].
Приведенные данные показывают, что крысы могут быть моделью, позволяющей
исследовать роль р53- зависимой системызащиты генома в формировании отдаленных
последствий лучевого поражения, радиогенных опухолей по нескольким причинам. Вопервых,
крысы
являются
распространенной
экспериментальной
моделью
изучения
механизмов формирования опухолей молочной железы после воздействия генотоксических
факторов, включая радиацию. Во-вторых, на этой модели возможно проведение длительных
экспериментов на генетически однородных животных, в условиях строго контролируемых
внешних воздействий. И, наконец, применение модели крыс-самок позволяет на одном и том
же животном исследовать особенности пострадиационного функционирования
р53-
зависимой системыв двух органах: костном мозге, где после острого лучевого воздействия в
сублетальных дозах появление злокачественных новообразований маловероятно, а также в
тканях молочной железы - органе,
индуцированных
в котором образование спонтанных и радиационно-
опухолей достаточно частое событие. Проведение таких исследований
полезно для оценки антиканцерогенных возможностей р53- зависимой системызащиты
генома и определения маркеров, способных выявить различия в функционировании р53системы в костном мозге и молочной железе в длительной временной
динамике после
облучения.
Другим источником информации, позволяющим судить о механизмах развития
отдаленных эффектов радиационного воздействия, являются данные, полученные в период
56
оказания
медицинской
инцидентов.
помощи
лицам,
пострадавшим
в
результате
ядерных
Эпидемиологические исследования показывают, что у данного контингента
риск развития рака на несколько процентов статистически значимо превышает возникновение
заболеваний в контрольных группах. Однако, индивидуальные различия геномов и отсутствие
возможности длительного контроля за возможными дополнительными воздействиями
химических
и
физических
генотоксических
факторов,
затрудняют
оценку
вклада
ионизирующего излучения в генез заболеваний, развивающихся в отдаленный период после
острой лучевой болезни (ОЛБ). Установлено, что облучение увеличивает частоту проявления
различных форм лейкозов [Байсоголов Г. Д. 1991, Воробьев А.И. 2000, Mabuchi K. 1995].
ОЛБ, возникающая вследствии радиационных катастроф, хорошо изучена с точки
зрения ранних проявлениий отклонений различных систем организма, в том числе
кроветворения. В 2011 году была выполнена работа по исследованию одаленных последствий
ОЛБ у пациентов, наблюдавшихся в течение длительного времени в клиническом отделе
ФМБЦ им.А.И.Бурназяна [Галстян И.А. 2011]. Галстян И.А. был проведен анализ более 100
историй болезни пациентов, перенесших ОЛБ различной степени тяжести вследствие гамма -,
гамма-бета, гамма-нейтронного облучения. У части больных были зафиксированы местные
лучевые поражения (МЛП) из-за неравномерного распределения поглощенной дозы по телу.
Установлено, что формирование отдаленных последствий после лучевого поражения тесно
связано с состоянием системы кроветворения. Было показано, что в отдаленные сроки после
однократного лучевого воздействия в сублетальных дозах процессы кроветворения являются
субкомпенсированными. Т.е. клеточный состав периферической крови на протяжении
длительного периода наблюдения остается нормальным, однако могут возникать преходящие
количественные сдвиги клеток крови, связанные как с недостаточностью костного мозга, так
и с функциональными расстройствами самих клеток. Нестабильное состояние гемопоэза
может привести к развитию лейкоза [Галстян И.А. 2011].
Усовершенствование
техники
ЛТ
позволяет
избежать
развития
отдаленных
последствий действия ионизирующего излучения, однако, эпидемиологические исследования,
проведенные на онкологических больных, получавших ЛТ, свидетельствуют о некоторых
рисках озникновения вторичных раков.
Вторичные раки образуются за счет повреждения ДНК облученных клеток и клетоксвидетелей, что сопровождается генетическим перепрограммированием, приводящем к
усилению
клеточной
пролиферации.
Многочисленные
исследования
показали,
что
стандартизированный коэффициент заболеваемости раком, рассчитываемый как отношение
наблюдаемого
уровня
заболеваемости
к
ожидаемому
уровню
(SIR)
у
больных,
подвергавшихся радиационному воздействию в лечебных целях, увеличен. Показано
57
существование
вызванных
не
только
проведенными
химиотерапевтическими
радиационно- индуцированных
хирургическими
препаратами.
раков,
операциями
Возникновение
и
но
и
раков,
примененными
химически-индуцированных
и
хирургически-индуцированных раков только осложняют выявление истинных причин
возникновения вторичных опухолей. Комбинированные методы лечения онкологических
больных затрудняют выявление радиационного фактора в возникновении вторичных
опухолей и усложняют оценку их истинных причин. Кроме того, формирование вторичных
опухолей зависит от локализации первичной опухоли, подвергавшейся ЛТ.
Научно-исследовательским сообществом были достигнуты значительные успехи в
области лечении онкологических заболеваний и связанных с ним рисков образования
вторичных новообразований, проведена документированная оценка дозы-реакции между
конкретными
химиотерапевтическими
и
радиационными
воздействиями,
однако
идентификация подгрупп пациентов, которые имеют повышенную восприимчивость к
развитию вторичного рака, до сих пор не решена. На сегодняшний день существуют
некоторые данные о молекулярных основах генетической предрасположенности к развитию
поздних эффектов терапии, которые свидетельствуют о перспективности дальнейших
исследований генотипа и генных взаимодействий. Поиск молекулярных маркеров опухолей в
ответ на действие лечебного фактора является своевременным и необходимым [Van’t Veer
L.J. et al. 2002].
Несмотря на то, что ЛТ является широко используемым методом лечения рака в
медицинских центрах онкологического профиля и в радиологических отделениях, длительное
наблюдение за состоянием здоровья пациентов на предмет обнаружения отдаленных
последствий ЛТ, осуществимо не во всех учреждениях. В случае развития радиационного
канцерогенеза исследования функционирования генома клеток после курса ЛТ могут служить
начальной точкой выявления промужуточных молекулярных изменений.
Таким образом, изучение функционирования р53- зависимой системызащиты генома в
отдаленный
период
после
воздействия
ионизирующей
радиации
представляет
исключительный интерес для определения механизмов формирования радиогенных
злокачественных
модулирующих
новообразований.
функциональную
Поэтому
важен
активность
р53
анализ
при
экспрессии
микроРНК,
формировании
отдаленных
последствий радиационного воздействия, поскольку реальна возможность коррекции этих
показателей для предотвращения развития перечисленных патологий.
В заключение следует отметить, что действие ионизирующей радиации приводит к
повреждениям генома, важному фактору для последующего развития отдаленных эффектов
58
облучения. В течение жизни вследствие
различных видов стресса клетки животных и
человека накапливают геномные изменения. Однако, не все из них имеют фенотипические
последствия. Влияние окружающей среды и неправильный образ жизни привносят изменения
и в экспрессию генов. Анализ транскриптом обеспечивает информацию обо всех этих
влияниях и может выявить, какие патологии на самом деле начинают развиваться.
Исследование профиля экспрессии, по существу производит диагностику, на основе снимка
транскриптома личности, сделанным в определенный момент в его жизни. Особое значение
приобретают микроРНК, модулирующие экспрессию большинства генов, включая гены,
кодирующие транскрипционные факторы. Предложены методы диагностики ранних этапов
развития онкологических заболеваний путем сравнения циркулирующих микроРНК у
обследуемых
здоровых
и
онкологических
больных
с
данными
опорной
карты
транскрипционных сигнатур [Lauria M. 2014]. Диагноз для нового пациента может быть
выполнен путем выяснения относительного положения на этой карте его сигнатур. Однако,
подобные методы являются трудоемкими и дорогостоящими. Для их осуществления
необходимо проведение качественной оценки экспрессии большого количества микроРНК с
использованием микрочипов, с последующей
количественной оценкой отобранных
микроРНК с применением ПЦР в реальном времени.
Другим подходом, позволяющим снизить стоимость анализов определения маркеров
развития онкологических заболеваний, является исследование функционально важных
микроРНК, модулирующих экспрессию генов, участвующих в программах, контролирующих
онкотрансформацию.
Необходимым звеном для онкотрансформации является инактивация Р53-зависимых
систем защиты стабильности генома. Поэтому целью нашего исследования было изучение
экспрессии микроРНК, модулирующих функциональную активность р53, при формировании
отдаленных последствий радиационного воздействия.
В модельных экспериментах на облученных крысах планировалась оценка экспрессии
транскрипционного фактора p53, генов MDM2, MDM4 и зрелых микроРНК, влияющих на
функциональную активность этого онкосупрессора, как показателей развития отдаленных
последствий радиационного поражения.
Следующим этапом работы было изучение информационной значимости отобранных
показателей в периферической крови у пациентов, в отдаленные сроки после перенесенной
ОЛБ, ОЛБ+МЛП и МЛП, а также у онкологических больных с диагнозом РПЖ, РМЖ и РГШ
до и после проведения дистанционной γ-терапии.
59
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1.Объекты исследований
2.1.1.Животные
Объектом исследования служили костный мозг и образцы ткани молочной железы
белых аутбредных крыс-самок со средней массой 230-330 г. Животных подвергали на
установке «ИГУР» воздействию γ - излучения
137
Cs в дозе 2,5 Гр (мощность дозы 1,1378
Гр/мин, длительность облучения 2 мин 12 сек). Крысы содержались на стандартной
лабораторной диете, имели свободный доступ к воде и были ограничены в спаривании.
На 75-е, 315-е и 550-е сутки после облучения животных умерщвляли дислокацией
шейных позвонков. У части крыс на протяжении 22 месяцев длительного эксперимента
визуально и путем пальпации без морфологического исследования в области каудальной
абдоминальной и паховой молочных желез определялись опухоли плотной консистенции. В
качестве контрольных образцов для сравнения использовали ткани костного мозга и
молочной железы крыс, не подвергавшихся облучению.
Всего в эксперименте использовалось 600 крыс-самок, которые были разделены на
несколько групп: на части животных исследовалась выживаемость после облучения, а на
другой – молекулярно-генетические показатели. Количество животных, отобранных для
изучения микроРНК, регулирующих Р53- зависимую системузащиты генома, представлено в
таблице 2.
Таблица 2. Количество животных, использованных для исследования микроРНК,
регулирующих р53- зависимую систему защиты генома в костном мозге и молочной железе
(м.ж.)
Исследуемая группа
75 сутки после
315 сутки после
550 сутки после
животных
облучения
облучения
облучения
Костный
Опухоли
Костный
Опухоли
Костный
Опухоли
мозг
м.ж.
мозг
м.ж.
мозг
м.ж.
Биоконтроль
15
-
7
-
7
-
Облучение
10
-
7
-
4
-
Облучение+опухоль
-
-
6
5
7
7
-
-
-
-
6
6
м.ж.
Биоконтроль+опухоль
м.ж.
60
Все
технические
манипуляции
с
лабораторными животными проведены в
соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных»
(Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755) и с
соблюдением
принципов
Хельсинкской
декларации
ВМА
(2000).
2.1.2. Пациенты, перенесшие ОЛБ, ОЛБ+МЛП и МЛП
Объектом исследования явились образцы крови от 28 пациентов: 14 пациентов имели в
анамнезе диагноз ОЛБ, 8 ОЛБ+МЛП и 6 МЛП. Дозы лучевого воздействия были рассчитаны в
ФМБЦ им. А.И. Бурназяна при помощи цитогенетических методов и ЭПР эмали зубов.
Гистограмма распределения доз между пациентами представлена на рисунке 8.
9
8
7
6
5
4
число пациентов
3
2
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
доза, Гр
Рисунок 8. Гистограмма распределения доз среди пациентов.
Больные наблюдались в клинике ФМБЦ им. А. И. Бурназяна со времени лечения
лучевых поражений и до момента взятия крови в период от двух лет до 51 года. В группах
ОЛБ
и
ОЛБ+МЛП
в
поздние
сроки
после
облучения
были
диагностированы
онкогематологические заболевания и солидные опухоли у больных в каждой группе. В группе
ОЛБ+МЛП обнаружено 9 эпизодов опухолей на 5 человек, из которых 5 базалиом. В группе
ОЛБ установлены 6 эпизодов опухолей на 5 человек, из них 2 базалиомы. Во время
очередного стационарного обследования в 2004–2007 гг. были взяты образцы крови. После
проведенного обследования ещѐ у 6 пациентов (полученные ими дозы составляли от 3,1 Гр до
4,3 Гр) в последующий период было выявлено появление новообразований: рак мочевого
пузыря, хронический миелолейкоз, рак гортани и толстого кишечника и 3 базалиомы. В
61
течение 7–10 лет до проведения настоящего
исследования пробы сохранялись в условиях
морозильной камеры при -750 С, наиболее оптимальных для хранения РНК.
2.1.3. Онкологические больные, перенесшие курс лучевой терапии
Объектом исследования явились образцы крови от 61 пациента с различными
онкологическими заболеваниями. 33 пациентам был поставлен диагноз рак предстательной
железы (РПЖ) с классификацией от T1N0M0 до T3N0M0, 15 пациентам — рак молочной
железы (РМЖ) от T1N0M0 до T4N1M0, 13 пациентам — рак в области головы и шеи (РГШ),
включающими новообразования носоглотки, гортани, языка и верхнечелюстной пазухи.
Больные находились на стационарном лечении в радиотерапевтическом отделении Главного
военного клинического госпиталя им.Н.Н. Бурденко в 2010–2011 гг. Дистанционная лучевая
терапия проводилась на гамма-терапевтической установке «РОКУС» (источник радионуклид
60
Со) по стандартным лечебным протоколам. Суммарная очаговая доза за курс лечения
составляла около 70 Гр. Взятие крови у пациентов осуществляли дважды: до проведения ЛТ и
после ЛТ при выписке больного. Образцы крови до начала экспериментов хранились при -75
0
С
Контрольная группа пациентов
В качестве контрольной группы исследованы здоровые доноры в количестве 27
человек (по данным Центра переливания крови Минздравсоцразвития России за период 2004–
2008 гг). Все доноры обследованы на ВИЧ-носительство и признаны практически здоровыми
по результатам стандартной процедуры медицинского освидетельствования. Возрастной
диапазон группы «доноры» статистически значимо не отличался от группы «пациенты» (от
1927 по 1982 год рождения). Образцы крови здоровых доноров до начала эксперимента
хранились при -70 0С.
2.2. Методы исследований
2.2.1. Получение гомогената клеток костного мозга крыс
Из задней конечности животного извлекали большеберцовую и малоберцовую кости,
максимально очищая их от мягких тканей. Из костей извлекали суспензию клеток костного
мозга и растворяли еѐ в модифицированной среде RPMI-1640 («Sigma», США) с рН 7,2 с
содержанием в 0,1 мл 0,5-2х106 клеток. Полученная суспензия костного мозга хранилась при 70 0С до использования.
2.2.2. Получение гомогената опухолевой ткани молочной железы у крыс
Образцы опухолевой ткани молочной железы обрабатывали на автоматическом
гомогенизаторе Daihan HS (DAIHAN Scientific, Ю. Корея) в растворе охлажденного тризола
62
при скорости вращения насадки 5000 об/мин.
Полученный гомогенат (0,2 г ткани/1 мл
тризола) хранился при -70 0С до последующего извлечения из него РНК.
2.2.3. Выделение общей РНК, содержащей фракцию зрелых микроРНК из
гомогената костного мозга и молочной железы, а также цельной крови.
Выделение тотальной РНК проводили тризольным методом с использованием набора
«Trizol RNA Prep 100» (000 «Лаборатория Изоген», Россия) в соответствии с протоколом
фирмы-производителя. Метод основан на применении лизирующего реагента Trizol
(гуанидинтиоционат с фенолом, рН=4,0) с добавлением хлороформа и последующим
осаждением РНК спиртом из водной фазы [Chomczynski e Sacchi 1987].
К 100 мкл исследуемой пробы (за исключением гомогената опухолей молочных желез)
добавляли 1 мл Trizol реагента, интенсивно перемешивали до появления гомогенной
эмульсии. Смесь охлаждали при 4 0С 5 минут. Затем для увеличения плотности органического
слоя добавляли 200 мкл хлороформа, перемешивали и снова охлаждали в течение 5 минут при
4 0С. Центрифугировали пробирку со смесью 5 минут при 13500 об/мин для расслоения фаз.
Так как плотности органических растворителей отличны от воды, при центрифугировании
эмульсии лизата клеток происходит разделение фаз: нижняя органическая, состоящая из
фенола и хлороформа, и верхняя, представляющая собой водный раствор. Белки
денатурируют и образуют преципитат в виде белого кольца на границе водной и органической
фазы, а нуклеиновые кислоты, будучи растворимыми в воде, оказываются в водной фазе. Но
поскольку фенол был уравновешен буфером с кислым значением рН, то ДНК оказывается в
нижнем органическом слое. Прозрачную верхнюю фазу с РНК осторожно переносили в
отдельную пробирку, не задевая пограничную белую пленку с белками и ДНК. Для
концентрирования РНК из водного раствора к отобранному количеству РНК добавляли 0,6 мл
изопрапанола. Содержимое пробирки интенсивно перемешивали и переносили в морозильник
на -20
0
С на 30 минут. Инкубация РНК под спиртом при пониженной температуре
способствует лучшей агрегации РНК, хотя некоторые исследователи считают, что
температура инкубации не влияет на выход продукта. Затем центрифугировали 15 минут при
13500 об/мин. Супернатант удаляли, аккуратно переворачивая пробирку на фильтровальную
бумагу. Поскольку изопропанол менее летуч, и РНК менее в нем растворима, то последующая
промывка 75% этанолом обязательна. К осадку добавляли 1 мл холодного 75% водного
раствора этанола, перемешивали, переворачивая пробирку 4-5 раз. Центрифугировали 5 минут
при 13500 об/мин, образовавшийся супернатант удаляли переворачиванием пробирки.
Полученный осадок подсушивали при 65 0С в течение 10 минут. Для обессоливания среды
РНК и сорбции низкомолекулярных соединений и хелатирования двухзарядных катионов
63
металлов (Mg2+, Mn2+, Ca2+ и т. д.) к
высушенному осадку добавляли 30 мкл
ЭкстраГена Е (суспензия смеси ионообменников). Содержимое пробирки суспендировали на
вортексе 15-20 сек и прогревали при 65 0С 5 минут. Еше раз суспендировали содержимое
пробирки на вортексе. Центрифугировали 1 минуту при 13500 об/мин. Выделенную РНК
хранили при -70 0С до использования.
Набор реагентов ООО «Изоген» обеспечивает высокую частоту выделенной РНК,
оптическая плотность которой (OD) 260/280 нм =2,0
2.2.4. Определение концентрации РНК
Количественную детекцию РНК осуществляли на флуориметре Qubit™ («Invitrogen»,
США) с использованием набора реактивов Quant-iTTMRNA Assay Kit («Invitrogen», США)
согласно протоколу фирмы - производителя. Метод основан на измерении флуоресценции
исследуемой РНК с реагентом Quant-iT™ RNA reagent со спектром возбуждения/испускания
644/673 нм.
Для приготовления рабочего раствора Quant-iT™ working solution реагент Quant-iT™
RNA reagent разводили в 200 раз (199 мкл Quant-iT™ RNA buffer и 1 мкл Quant-iT™ RNA
reagent), отбирали из него 180-199 мкл и вносили в пробирку с 1-20 мкл исследуемого образца.
Перемешивали на вортексе 2-3 сек, инкубировали при комнатной температуре 2 мин.
Измерение флуоресценции проводили на приборе Qubit™, расчет концентрации РНК в пробе
производился автоматически с помощью калибровочной кривой. В качестве контрольных
стандартных образцов использовалась рРНК E. coli с концентрацией о нг/мкл и 10 нг/мкл.
Выход чистой РНК составлял от 0,5 до 30 мкг/мл.
2.2.5. Обратная транскрипция для мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 крыс и
человека
Синтез
комплементарной
ДНК
(кДНК)
проводили
с
помощью
набора
лиофилизированных реагентов для проведения реакции обратной транскрипции «GenePak RT
Corе» (000 «Лаборатория Изоген», Россия), содержащего 100 ед. обратной транскриптазы MMLV («Promega», США), 20 ед. ингибитора РНК-аз RNasin («Promega», США), cлучайные
гекса- и нанонуклеотидные праймеры, дезоксинуклеотидтрифосфаты и оптимизированную
буферную систему. Обратная транскрипция со случайными затравками основана на том, что
гекса- и нанонуклеотидные праймеры гибридизируются с РНК-матрицей в многочисленных
участках с образованием коротких кДНК со всех типов РНК.
Согласно рекомендациям фирмы-производителя в пробирки с готовой смесью ОТ
МастерМикса добавляли 5 мкл ОТ Растворителя и 5 мкл исследуемой РНК. В качестве
отрицательного контроля вместо РНК использовали ЭкстраГен Е (без частичек сорбента), в
64
котором была растворена исследуемая РНК.
Для отжига рандомных гекса- и наномеров
содержимое пробирок интенсивно перемешивали до полного растворения при комнатной
температуре в течение 7-10 минут. Реакцию обратной транскрипции проводили путем
термостатирования пробирок 40 минут при 50 0С. Для инактивации обратной транскриптазы в
пробирки добавляли 10 мкл Стоп Раствора и нагревали 10 мин при 95 0С.
Полученные
образцы
кДНК
замораживали
при
-20
0
С
для
последующего
использования в качестве матрицы для проведения ПЦР в реальном времени.
2.2.6. Обратная транскрипция для зрелых miR-21, miR-34, miR-125b, miR-145,
miR-16, let-7 крыс и человека со шпилькообразными праймерами «stem-loop».
Суммарная РНК, выделенная методом «Trizol RNA Prep 100» (000 «Лаборатория
Изоген», Россия), содержала фракцию зрелых микроРНК.
Известно, что зрелые микроРНК представляют собой короткие одноцепочечные РНК
размером 20-25 п.н. Для проведения ПЦР в реальном времени таких коротких фрагментов
необходима модификация микроРНК. Нами был применен метод, основанный на
присоединении специфического шпилькообразного (―stem-loop‖) праймера со свободным 3’концом к зрелой микроРНК за счет комплементарного взаимодействия с небольшими
участками микроРНК [Chen C. et al. 2005]. На стадии обратной транскрипции обратная
транскриптаза использовала этот праймер как затравку и синтезировала кДНК по матрице
микроРНК с получением конструкции длиной около 70 нуклеотидов, которая в дальнейшем
могла использоваться в ПЦР в реальном времени (рисунок 9).
Рисунок 9. Схема обратной транскрипции микроРНК со специфическими «stem-loop»
праймерами [Chen C. et al. 2005]
Реакция обратной транскрипции осуществлялась с использованием набора «GenePak
RT Corе» (000 «Лаборатория Изоген»), специально изготовленного по нашему заказу,
содержащего 100 ед. обратной транскриптазы M-MLV («Promega», США), 20 ед. ингибитора
РНК-аз RNasin («Promega», США), дезоксинуклеотидтрифосфаты и оптимизированную
буферную систему, но без добавления cлучайных гекса- и нанонуклеотидных праймеров.
65
В
пробирки
с
лиофилизованной
смесью вносилось переменное количество
общей РНК и 5 мкл специфического «stem-loop»-праймера (ООО «ДНК-Синтез», Россия) к
определенной
микроРНК,
последовательность
которых
и
конечная
концентрация
представлена в таблице 3. Обратную транскрипцию осуществляли на амплификаторе
«Терцик» (НПФ «ДНК-технология», Россия) в следующих температурных условиях: 160С/ 30
мин (отжиг ―stem-loop‖ праймера), 420С/30 мин (синтез кДНК обратной транскриптазой) и
850С/5 мин (инактивация обратной транскриптазы). Для оценки специфичности синтеза
первой цепи кДНК были использованы отрицательные контроли, не содержащие РНК.
Продукты обратной транскрипции микроРНК замораживались на -70 0С до использования.
Таблица 3. Олигонуклеотидная последовательность ―stem-loop‖ праймеров для микроРНК
животных и человека
Объект
МикроРНК
Последовательность “stem-loop” праймеров и их концентрация
miR-34c-3p
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCTGGC-3' (50 нМ)
let-7i
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCAAG-3' (50 нМ)
miR-21
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA-3' (50 нМ)
miR-16
5'- GTCTCCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGGAGACCGCCAA -3' (5 нМ)
miR-145
5'- CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGGGATTC -3' (50 нМ)
miR-125b-5p
5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCACAA-3' (10 нМ)
miR-34а
5'- GTCGTATCCAGTGCTGGGTCCGAGTGATTCGCACTGGATACGACACAACCA-3' (50 нМ)
let-7а
5'GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT ACGACAACTA-3' (50 нМ)
miR-21
5'- CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACATC -3' (50 нМ)
miR-16-2
5'- GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3' (50 нМ)
miR-145
5'- GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAGGGA -3' (50 нМ)
исследовани
я
Крысы
человек
66
miR-125b-1
5'- GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACAA -3' (5 нМ)
2.2.7. Основные этапы подбора праймеров для целевых генов Р53, MDM2, MDM4,
mir-34, mir-125b, mir-145, mir-16, mir-21, let-7 и конститутивных генов GAPDH, β-actin
крыс и человека для постановки ПЦР в реальном времени
Для выбора олигонуклеотидной последовательности праймеров и флуорецентномеченных зондов к исследуемым генам, а также температурного профиля ПЦР были
использованы биоинформационная база данных NCBI (National Center for Biotechnological
Information, USA), предоставляющая сведения о структуре генома животных и человека, а
также зарубежные научные статьи в которых изучали интересующие нас гены. При подборе
праймеров и зондов необходимо было учитывать структурную организацию генов,
кодирующих мРНК, чтобы исключить отжиг праймеров на геномной ДНК, а также наличие
псевдогенов и различные варианты альтернативного сплайсинга.
Использованные праймеры имели основные характеристики, необходимые для
эффективной ПЦР, которые представлены на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast:
1) размер праймеров не менее 16 п.н.,
2) разница в Тm между прямым и обратным праймером не более 6 0С,
3) состав GC пар ~ 50-60%,
4) отсутствие вторичной структуры праймеров и димеров,
5) минимум G/C на 3' конце праймеров
6) область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или
инсерций в пределах видовой или иной специфичности
В таблице 4 представлены характеристики праймеров генов, кодирующих белки р53,
mdm2, mdm4, используемые в нашей работе.
Таблица 4. Характеристика праймеров, использованных в работе по изучению экспрессии
генов и микроРНК с помощью ПЦР в реальном времени
Область
мРНК
(размер,
п.н.)
Последовательность (5'-
«посадки»
Теор.
GC
>3') и длинна (п.н.)
праймера
Тm
%
(п.н.)
Отсутс
Отсутствие
твие
комплемент
Размер
внутре
арности
продукт
нней
между 3'-
а (п.н.)
вторич
концами
67
ной
структу
ры
F:
Homo
sapiens
Р53
(2451)
GCCCCCAGGGAGCACT
960-976
60,35
70,59
7,00
2,00
A (17)
52
R:
GGGAGAGGAGCTGGT
1010-993
59,70
63,16
4,00
0
569-588
59,6
55,0
4,00
2,00
GTTG (19)
F:
Homo
sapiens
MDM2
(1401)
CTACAGGGACGCCATC
GAAT (20)
R:TGAATCCTGATCCAA
CCAATCA (22)
77
645-624
57,4
40,9
6,00
1,00
-
-
-
-
-
F:
GTCCATCCATTCAGCC
Homo
sapiens
MDM4
ATCT (20)
R:
CCAGGGTGATGAGGAA
-
-
-
-
-
1276-1295
56,4
45,00
4,00
2,00
GAAAG (21)
F: GATGAGATTGGC
Homo
sapiens βactin
(1852)
ATGGCTTT (20)
141
R: ATTGTGAACTTT
GGGGGATG (20)
1416-1397
55,8
45,00
3,00
0,00
655-672
60,36
61,10
4,00
3,00
F:
CCCACCATGAGCGTTG
Rattus
norvegicus
P53
(1792)
CT (18)
63
R:
CCACCCGGATAAGATG
TTGG (20)
717-698
58,03
55,0
4,00
0,00
68
F:
CGGCCTAAAAATGGTT
GCAT (20)
R:
Rattus
norvegicus
MDM2
(2855)
TTTGCACACGTGAAAC
1478-1497
57,36
45,0
4,00
2,00
68
1545-1524
59,84
40,9
6,00
3,00
58-78
62
50,0
-
-
ATGACA (22)
F:
CTACCGAGTGTCTGTC
TAAG (20)
Rattus
norvegicus
MDM4
124
R:
TCCTGGGTGTTTGTATT
161-182
62
52,4
-
-
1369-1388
60,32
55,00
5,00
3,00
T (18)
F:
ACCACAGTCCATGCCA
TCAC (20)
R:
Rattus
norvegicus
GAPDH
(2039)
TCCACCACCCTGTTGC
452
1820-1801
61,06
55,00
4,00
4,00
TGTA (22)
Исключение составляют праймеры для мРНК гена MDM4 крыс и человека, чьи
последовательности отсутствовали в базе данных NCBI, однако их использование при
правильно подобранных условиях приводило к накоплению специфического продукта во
время ПЦР.
В
базе NCBI- nucleotide находили полноразмерные последовательности мРНК
исследуемых генов, переносили их в программу Primer-Blast с указанием взятых из
зарубежных
работ
последовательностей
праймеров.
Выяснялось,
что
данные
последовательности могут «отжигаться» не только на интересующей нас мишени, но и за счет
неполного комплементарного взаимодействия могут связываться и с регионами других генов.
Поэтому основным условием выбора праймеров было отсутствие неспецифического продукта
ПЦР, контролируемое по кривым плавления в случае использования технологии SybrGreen I
(и технологии TaqMan). В качестве примера можно привести кривую плавления продукта
амплификации гена mir-21, имеющего один остроконечный пик плавления при температуре
76,50 С (рисунок 10). Критерием специфического связывания праймеров и зондов с матрицей
69
также служило отсутствие амплификации в
отрицательных
контрольных
образцах
(праймеры без добавления кДНК и праймеры с внесенной общей РНК).
1
2
Рисунок 10. Кривые плавления продуктов ПЦР c красителем SybrGreen I после
обратной транскрипции miR-21 человека (1) и образца, не содержащего кДНК (2). На оси
абсцисс представлена температура плавления фрагмента кДНК, 0С, на оси ординат интенсивность флуоресценции (dF/dT).
2.2.8. ПЦР в реальном времени
ПЦР в реальном времени генов P53, MDM2, MDM4, а также miR-34, miR-21, miR-145,
miR-125, miR-16, let-7 у животных и человека проводили на амплификаторе «DTprime 5М3»
(«НПО
ДНК-Технология»,
Россия)
в
большинстве
случаев
с
использованием
интеркалирующего красителя SYBR Green I (Thermo Scientific, США) или линейных зондов
TaqMan Probe (ООО «ДНК-Синтез», Россия). Применение данных технологий основано на
том, что детекция продуктов амплификации ПЦР происходит либо после встраивания
красителя SYBR Green I в двухцепочечную ДНК, либо за счет выщепления Taq ДНК
полимеразой с 5'-экзонуклеазной активностью на 5'-конце флюорофора, либо его ингибитора
(TaqMan Probe), сопровождаемого усилением флуоресцентного свечения.
Двухкратные готовые реакционные смеси для ПЦР в реальном времени «Thermo
Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X)», (Thermo Scientific, США) или
«Thermo Scientific Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)» (Thermo Scientific, США)
содержали Hot Start Taq ДНК полимеразу с термолабильными защитными группами на
аминокислотных остатках, краситель SYBR Green I (или Probe), референсный краситель ROX,
смесь дНТФ, оптимизированный ПЦР-буфер. Активация полимеразы происходила при
температуре 95 0С, используемой в первом цикле ПЦР.
В пробирку вносили смесь «Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master
Mix (2X)», или «Thermo Scientific Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) объемом 12,5
70
мкл, 5 мкл кДНК переменной концентрации,
5 мкл праймеров различной концентрации
(прямого и обратного) и 2,5 мкл воды свободной от нуклеаз. При работе с технологией
TaqMan Probe (для Р53 человека и miR-34 крыс) вместо воды добавлялись специфические
зонды,
меченные
с
3/-конца
флуорофором
FAM
(6-carboxyfluorescein,
6-
карбоксифлуоресцеин, с λпогл=490 нм) и с 5/-конца флуоресцентным тушителем BHQ-1 (Black
Hole Quencher, флуоресцентный тушитель с λпогл.=534 нм) в количестве 2,5 мкл с переменной
концентрацией.
Для предотвращения контаминации для некоторых генов в реакционную смесь
вносилась
урацил-ДНК-гликозилаза,
фермент
выщипляющий
урацил
из
одно-
и
двухцепочечной ДНК, активирующийся при температуре 50 0С.
Условия ПЦР для генов и микроРНК были подобраны эмпирическим путем в
основном с помощью температурного градиента по матрице на амплификаторе «DT prime
5М3» («НПО ДНК-Технология», Россия). Отдельно для miR-21 и let-7i крыс была разработана
технология «touchdown» ПЦР (тачдаун, «ступенчатая»), при которой специфическая
температура отжига праймеров задавалась благодаря постепенному снижению высокой
температуры денатурации кДНК до оптимальной температуры связывания праймеров с
матрицей.
Регистрация сигнала флуоресценции происходила на канале FAM при
возбуждении флуорофора 490 нм и испускании 530 нм.
После проведения ПЦР реакционную смесь всех образцов нагревали в широком
диапазоне температур (от специфической температуры отжига до полной денатурации ДНК)
и непрерывно измеряли флуоресценцию. По достижении температуры плавления продукта
амплификации флуоресценция резко падала.
Температурно-временной режим ПЦР в реальном времени для мРНК и микроРНК
человека и животных представлен в таблице 5.
Таблица 5. Температурно-временной режим ПЦР в реальном времени для мРНК и микроРНК
человека и крыс
Объект
крысы
Ген и
его
локус
Р53
(10q24)
MDM2
Метод ПЦР в
реальном
времени
TaqMan
Sybr GreenI
Олигонуклеотидная последовательность
праймеров и зондов и их концентрации
Условия ПЦР в реальном
времени
F: 5'- CCCACCATGAGCGTTGCT -3' (400
нМ)
R: 5'- CCACCCGGATAAGATGTTGG -3'
(400 нМ)
TaqMan probe 5/-FAM
AGGAGCGACGACCAGGCCGTCACCATC
A-3/ -BHQ1 (200 нМ)
F: 5'-CGGCCTAAAAATGGT TGCAT-3'
940 C-5 мин
940 C-15 с
0
60 C-75 с
500 C-2 мин
45 циклов
71
(7q22)
MDM4
(13q13)
(300 нМ)
R: 5'-TTTGCACACGTGAAA CATGACA-3'
(300 нМ)
Sybr GreenI
940 C-15 с
600 C-45 с
720 C-20 с
40 циклов
550 C-15 c – Δt 50 циклов
(0,80)
F: 5'- GTCCATCCATTCAGCCATCT-3' (300 500 C-2 мин
нМ)
R: 5'- CCAGGGTGATGAGGAAGAAAG-3' 950 C-10 мин
(300 нМ)
950 C-15 с
570 C-30 с
45 циклов
0
75 C-20 с
miR-34c- Sybr GreenI
3p (chr.8)
F: 5'-GGTGGAATCACTAACCACACG-3'
(200 нМ)
R: 5'- GTGCAGGGTCCGAGGT-3' (200 нМ)
let-7i
F: 5'-TAGTACTGCGCAAGCTACTGC-3'
(200 нМ)
R: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' (200 нМ)
F: 5'-CGCGCTAGCTTATCAGACTGA-3'
(200 нМ)
R: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' (200 нМ)
miR-21
(chr.10)
940 C-10 мин
550 C-15 c – Δt 50 циклов
(0,80)
950 C-5 мин
950 C-15 с
45 циклов
620 C-60 с
550 C-15 c – Δt 50 циклов
(0,80)
950 C-5 мин
950 C-15 с
5 циклов
0
70 C-60 с
950 C- 15 с
10 циклов (-1,1)
700 C-60 с Δt
950 C-15 с
600 C-60 с
30 циклов
550 C-15 c – Δt 57 циклов
(0,70)
miR-16
(chr.2)
miR-145
Sybr GreenI
Sybr GreenI
F:5'- CAGCCTAGCAGCACGTAAAT -3'
(300 нМ)
R: 5'- GAGGTATTCGCACCAGAGGA -3'
(300 нМ)
F:5'-
500 C-2 мин
950 C-10 мин
950 C-15 с
600 C-45 с
730 C-40 с
40 циклов
550 C-15 c – Δt 50 циклов
(0,80)
950 C-10 мин
72
(chr.18)
miR125b-5p
(Chr.8)
GAPDH
(4q42)
человек
Sybr GreenI
Sybr GreenI
Р53
Sybr GreenI
(17p13.1)
CGCGCTCGAGCCCAGAGCAATAAGCCA
CAT -3' (700 нМ)
R: 5'GGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTG
AG -3' (700 нМ)
950 C-15 с
580 C-45 с
730 C-25 с
F:5'-GGGTCCCTGAGACCCTAAC-3' (300
нМ)
R: 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3' (300
нМ)
950 C-10 мин
F:5'- ACCACAGTCCATGCCATCAC -3'
(300 нМ)
R: 5'- TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3'
(300 нМ)
550 C-15 c – Δt 50 циклов
(0,80)
500 C-2 мин
950 C-15 с
580 C-45 с
730 C-25 с
MDM4
(1q32)
Sybr GreenI
Sybr GreenI
40 циклов
550 C-15 c – Δt 50 циклов
(0,80)
950 C-5 мин
950 C-15 с
40 циклов
620 C-60 с
550 C-15 c – Δt 80 циклов
(0,50)
500 C-2 мин
F:5'- GCCCCCAGGGAG CACTA-3' (700
нМ)
R: 5'-GGGAGAGGA GCTGGTGTTG-3' (700 950 C-10 мин
нМ)
950 C-15 с
600 C-45 с
720 C-40 с
MDM2
(12q14.3.
-q.15.)
40 циклов
F:5'- CTACAGGGACGCCATCGAAT-3'
(300 нМ)
R: 5'- TGAATCCTGATCCAACCAATCA -3'
(300 нМ)
F:5'- CTACCGAGTGTCTGTCTAAG-3' (300
нМ)
R: 5'- TCCTGGGTGTTTGTATTT -3' (300
нМ)
40 циклов
550 C-15 c – Δt 37 циклов
(1,80)
940 C-10 мин
940 C-15 с
540 C-45 с
720 C-35 с
40 циклов
550 C-15 c – Δt 50 циклов
(0,80)
500 C-2 мин
940 C-10 мин
940 C-15 с
570 C-45 с
720 C-25 с
45 циклов
550 C-15 c – Δt 40 циклов
73
miR-34а TaqMan
(1p36.22)
(1,00)
F:5'- GCGATTGGCAGTGTCTTAGC-3' (200 500 C-2 мин
нМ)
R: 5'- CAGTGCTGGGTCCGAGTGA
950 C-10 мин
-3' (200 нМ)
950 C-15 с
TaqMan Probe: 5'-FAMTCGTATCCAGTGCGAATCACTC-BHQ1 -
600 C-60 с
50 циклов
3' ( 200 нМ)
let-7а
Sybr GreenI
(9q22.32)
miR-21
Sybr GreenI
(17q23.1)
miR-16-2 Sybr GreenI
(3q.25.33
)
miR-145
(5q32)
Sybr GreenI
miRSybr GreenI
125b-1
(11q24.1)
F:5'GCCGCTGAGGTAGTAGGTTGTA -3' (300
нМ)
R: 5'GTGCAGGGTCCGAGGT-3' (600 нМ)
F:5'ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGAC
TGA -3' (500 нМ)
R: 5'- GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3'
(500 нМ)
F:5'- TTCGGTAGCAGCACGTAAATA-3'
(700 нМ)
R: 5'- CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3' (700
нМ)
F:5'- GTCCAGTTTTCCCAGGAATCC-3'
(300 нМ)
R: 5'- GTGCAGGGTCCGAGGT -3' (300
нМ)
F:5'- CGTCCCTGAGACCCTAACTTGT -3'
(700 нМ)
R: 5'- GTGCAGGGTCCGAGGT-3' (700 нМ)
500 C-2 мин
950 C-10 мин
950 C-15 с
570 C-45 с
720 C-20 с
40 циклов
550 C-15 c – Δt 50 циклов
(0,80)
950 C-10 мин
950 C-15 с
40 циклов
600 C-45 с
550 C-15 c – Δt 50 циклов
(0,80)
950 C-10 мин
950 C-15 с
570 C-45 с
720 C-20 с
40 циклов
550 C-15 c – Δt 50 циклов
(0,80)
500 C-2 мин
950 C-10 мин
950 C-15 с
600 C-45 с
720 C-15 с
45 циклов
550 C-15 c – Δt 40 циклов
(1,00)
500 C-2 мин
950 C-10 мин
950 C-15 с
570 C-45 с
720 C-25 с
40 циклов
74
β-actin
(7p22)
Sybr GreenI
550 C-15 c – Δt 50 циклов
(0,80)
F:5'-GATGAGATTGGC ATGGCTTT-3' (200 950 C-10 мин
нМ)
R: 5'- ATTGTGAACTTT GGGGGATG -3'
950 C-15 с
(200 нМ)
600 C-35 с
40 циклов
720 C-40 с
550 C-15 c – Δt 40 циклов
(1,00)
Обозначения: Δt-инкремент по температуре,
2.2.9. Анализ данных, полученных с помощью ПЦР в реальном времени
Основным критерием выбора референсного гена («housekeeping gene» или гена
«домашнего хозяйства») для нормализации данных ПЦР является относительное постоянство
уровня его экспрессии во всех рассматриваемых в ходе исследования условиях. Изучение
стабильности гена β-actin у человека было проведено на крови онкобольных до и после
лучевой терапии и пациентов, перенесших ОЛБ и МЛП, по сравнению с донорами. Было
показано, что уровень экспрессии мРНК гена β-actin статистически значимо не отличался у
пациентов до и после лучевой терапии, а также у пациентов с ОЛБ и МЛП по сравнению с
донорами. В экспериментах, выполненных на крысах, содержание мРНК гена GAPDH имело
эквивалентное значение как в здоровой, так и в опухолевой ткани молочной железы, а также в
костном мозге. Для микроРНК характеристикам референсного гена в наших исследованиях
соответствовали гены GAPDH и U6 (малый ядерный рибонуклеопротеин) в случаях, когда
значения порогового цикла (Ct) для гена U6 изменялись в опытных группах по сравнению с
контролем в пределах менее двух циклов.
Расчет относительной экспрессии исследуемых генов и микроРНК проводили с
использованием метода ΔΔCt [Livak K.J., Schmittgen T.D. 2001] с учетом эффективности
амплификации (Е), определенная программным обеспечением прибора «DT prime 5М3»
(«НПО ДНК-Технология», Россия).
Экспрессию исследуемых генов, нормализованную по референсному гену, вычисляли
по формулам (1) и (2):
экспрессия исследуемого гена = Е-ΔCt,
(1)
где Е – эффективность амплификации, которая в идеальных условиях равна 2;
75
Ct (threshold cycle) – пороговый цикл,
цикл
на
котором
пороговый
уровень
флуоресценции превышает базовый уровень (threshold над baseline) в диапазоне 8-10
стандартных отклонений
ΔCt=Ct (housekeeping ген)–Ct (исследуемый ген)
(2)
Оценку изменения экспрессии генов в опытной группе по сравнению с тем же
показателем в контрольной группе вычисляли по формуле (3):
изменение экспрессии исследуемого гена = 2-ΔΔСt,
(3)
где ΔΔСt =ΔСtопыт- Сt контроль
2.2.10. Статистическая обработка результатов.
Статистическая обработка результатов осуществлялась с использованием пакета
статистических программ STATISTICA 7.0 и включала в себя определение медианы (Ме) и
25% и 75% квартилей. Каждая ПЦР проводилась не менее 2-х раз, для оценки достоверности
различий применялись непараметрический критерий Манна-Уитни. Значения медианы (Ме) в
контрольной группе были приняты за 1, а значения медианы в исследуемых группах
показывали во сколько раз уровень экспрессии гена выше или ниже по отношению к
контрольной группе.
Корреляционные зависимости рассчитывали по непараметрическому ранговому
критерию Спирмена.
Данные считали достоверными при р<0,05, где р - показатель статистической
значимости (достоверности) данных.
76
Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Исследование экспрессии микроРНК, регулирующих Р53- зависимую
системузащиты генома, в опухолях молочных желез и костном мозге аутбредных крыссамок после однократного ɣ-облучения в дозе 2,5 Гр.
Задачей данного этапа исследований являлось изучение методом ПЦР в реальном
времени экспрессии генов P53, MDM2 и MDM4, а также содержания зрелых микроРНК (miR34c, let-7i, miR-125b, miR-16, miR-145, miR-21) в гомогенате опухолей молочных желез,
образованных после однократного ɣ-облучения в сублетальной дозе на 315 сутки, в опухолях,
развивающихся на 550 сутки эксперимента, а также в клетках костного мозга на 75, 315 и 550
сутки после облучения.
3.1.1. Динамика возникновения опухолей молочной железы у аутбредных крыссамок в условиях проведенного эксперимента.
Белые аутбредные крысы-самки в возрасте 3,5 месяца и с исходной массой тела 175+20
г были выбраны в качестве модели для исследования влияния ионизирующей радиации на
спонтанное и радиационно-индуцированное возникновение опухолей.
Наблюдение за развитием опухолей осуществляли в течение 22-х месяцев после
облучения. Известно, что в процессе старения у самок крыс могут возникать опухоли
молочных
желез.
Воздействие
ионизирующей
радиации
в
сублетальных
дозах
интенсифицирует этот процесс. Опухоли молочных желез определяли пальпаторным методом
- без морфологического исследования. Критерием оценки бластомогенной эффективности
внешнего облучения, так же, как и развития спонтанных опухолей, служил латентный период
- срок появления опухолей молочных желез, а также частота образования опухолей. Частота
появления опухолей за весь период наблюдения составила для спонтанных опухолей – 0,2, а
для облученных животных – 0,7. Результаты образования первых опухолей молочных желез
проводимого в течение двух лет эксперимента представлены на рисунке 11. Из рисунка
следует, что, облучение приводит к снижению латентного периода выхода опухолей
молочных желез, появляющихся у животных. Первые опухоли у облученных крыс
появляются на 5-й месяц после радиационного воздействия. В группе
контрольных
необлученных животных опухоли молочной железы появляются на 12-ый месяц
исследований. В связи с этим нами были выбраны следующие сроки для молекулярногенетических исследований:
77
1.
75-е сутки после облучения
крыс (до появления у животных опухолей
молочных желез);
2.
315-е сутки после облучения крыс (появление опухолей молочных желез в
группе у облученных крыс);
3.
550-е сутки после облучения (наличие опухолей молочной железы в группах
"контроль" и "облучение").
18
время появления первых опухолей, месяцы
16
Median
25%-75%
14
12
10
*
8
6
4
2
0
биоконтроль
облучение
Примечание: *- отличия от контроля в группе «облучение» статистически значимы
(р<0,05).
Рисунок 11. Время появления первых опухолей молочных желез у аутбредных крыссамок
3.1.2. Экспрессия генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c, miR-125b,
miR-145, miR-16-2, let-7i в гомогенате опухолей молочных желез аутбредных крыс-самок
на 315 и 550 сутки после ɣ-облучения в дозе 2,5 Гр
А) Анализ содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c,
miR-125b, miR-145, miR-16-2, let-7i в гомогенате молочных желез аутбредных крыс-самок на
315 сутки после однократного ɣ-облучения в дозе 2,5 Гр с помощью метода ПЦР в реальном
времени
78
Впервые произведена относительная
количественная оценка уровня экспрессии
генов Р53, MDM2, MDM4, а также зрелых miR-145, miR-16-2, miR-125b, miR-34c, miR-21, let7i со специально подобранными праймерами и зондами для ПЦР в гомогенате опухолей
молочной железы крыс-самок на 315 сутки после облучения. Полученные результаты
нормированы к группе «биоконтроль», условно принятой за 1, и представлены в виде
медианы и 25% и 75% квартилей в таблице 5 .
Таблица 5. Содержание мРНК (Ме) генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-145, miR-16-2,
miR-125b, miR- 34c, miR- 21, let-7i в молочной железе (м.ж.) на 315 сутки после однократного
γ-облучения аутбредных крыс-самок в дозе 2,5 Гр
Исследуем
ая группа
группа
P53
MDM2
MDM4
miR-125b miR-34c miR-145
miR16-2
let-7i
miR-21
Биоконтр 1,19 (0,64- 0,97 (0,66- 1,0 (0,54- 1,00 (1,0- 1,08 (0,47- 1,12 (0,88- 1,00 (0,15- 1,26 (0,59- 1,10 (0,531,56)
1,2)
1,6)
4,6)
3,2, )
2,6)
3,5)
7,3)
2,0)
оль
n
10
10
10
10
10
10
10
10
10
Облучени
49667*
19961,9
21,86
0,04* (0,04- 0,20* (0,2- 0,20 (0,0948,50* 3,73 (3,73- 8,57 (0,03(32768,00*(7069,84- *(20,39е+опухоль
0,1)
0,2)
16,1)
(5,28-90,5) 27,9)
55,7)
161368,6)
32128,2)
401,2)
м.ж.
5
5
4
3
3
5
3
4
5
n
Примечания:
Значения медианы (Ме) показателей экпериментальных групп нормированы к медиане
группы «биоконтроль», условно принятой за 1,0;
25% и 75% квартили указаны в скобках;
n- величина выборки;
*- отличия от контроля статистически значимы (р<0,05).
Нами было обнаружено, что в образовавшейся опухолевой ткани молочной железы
крыс после облучения, относительное нормализованное количество мРНК гена Р53
варьировало от 0,04 до 0,1 с медианой распределения 0,04. У всех крыс группы
«облучение+опухоль м.ж.» наблюдалось значительное снижение содержания мРНК гена Р53
по сравнению с нормальной тканью. У этих же животных обнаружено статистически
значимое уменьшение уровня мРНК гена MDM2 в 5 раз (медиана составила 0,2 отн.ед.).
Таким образом, на 315 сутки наблюдается 30-кратное снижение транскрипционной
активности гена P53 в группе «облучение+опухоль м.ж.» по сравнению с контрольной
группой, а содержание мРНК гена MDM2 также снижается в молочной железе крыс этой
группы, однако, только в 5 раз. Содержание мРНК MDM4 сильно колебалось от одного
образца к другому, но в среднем по выборке не отличалось от нормы.
79
При
исследовании
изменений
относительного
количества
микроРНК,
модулирующих р53- зависимую системузащиты генома, в гомогенате опухолей молочных
желез нами было зафиксировано статистически значимое увеличение miR-34c, let-7i, miR-21 и
miR-125b. Содержание miR-34c и miR-21 превышало контрольный уровень в десятки раз
(медиана составила 48,50 отн.ед. и 21,86 отн.ед. соответственно), причем изменения miR-34c
удалось детектировать только в 3-х образцах из исследуемых 5. Изучение экспрессии зрелых
микроРНК, модулирующих работу р53-системы, демонстрирует дисбаланс их экспрессии в
радиогенных опухолях молочной железы. В опухолях существенно увеличивается экспрессия
«онкомиров». miR-125b растет в группе «облучение+опухоль м.ж.» в 49000 раз, а miR-21 – в
21 раз (р<0.05). Уровень let-7i в группе «облучение+опухоль м.ж.» достигает 20000 раз.
Тенденция к количественному росту прослеживается и у miR-16 и miR-145.
Б) Анализ содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c,
miR-125b, miR-145, miR-16-2, let-7i в гомогенате молочных желез аутбредных крыс-самок на
550 сутки после однократного ɣ-облучения в дозе 2,5 Гр с помощью метода ПЦР в реальном
времени.
Результаты относительной количественной оценки содержания мРНК генов и
микроРНК для данной исследуемой группы животных нормированы к группе «биоконтроль»,
условно принятой за 1, и представлены виде медианы и 25 и 75% квртилей в таблице 6.
Таблица 6. Содержание мРНК (Ме) генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-145, miR-16-2,
miR-125b, miR- 34c, miR- 21, let-7i в молочной железе (м.ж.) на 550 сутки после однократного
γ-облучения аутбредных крыс-самок в дозе 2,5 Гр
Исследуе
мая
группа
Биоконтр
оль
P53
MDM2
MDM4
miR125b
miR-34c
miR145
miR-16-2
let-7i
miR-21
1,19
(0,641,56)
10
0,11
(0,041,36)
0,97 (0,661,2)
1,0 (0,541,6)
1,00 (1,04,6)
1,08
(0,47-3,2)
1,12
(0,882,6)
10
22,6*
(13,0042,00)
1,00
(0,15-3,5)
1,26
(0,59-7,3)
10
103,9*
(73,521097)
10
24117*
(188201956712)
1,10
(0,532,0)
10
745,3*
(3494871, 6)
6
955,43**
(724,089410)
6
38,05***
(1,93163)
5
6
10
10
10
10
n
0,27 (0,131,46
37642*(1, 57,99*
Облучени
0,57)
(1,2890(36,76е+
478)
127523)
676)
Опухоль
м.ж.
5
6
4
4
6
5
n
*
***
**
8,57
4,24
2,23
Биоконтр 0,06
0,32
0,54
**(0,04 (0,23-0,406) (0,35-1,0) (2,30(0,32-17) (0,44оль+
104)
18)
Опухоль -0,069)
м.ж.
6
6
3
3
6
6
n
Примечание:
Значения медианы (Ме) показателей экпериментальных групп
группы «биоконтроль», условно принятой за 1,0;
5
90,51
(0,09256)
3
нормированы к медиане
80
25% и 75% квартили указаны в скобках;
n- величина выборки;
*- различия между группами «облучение+опухоль м.ж.» и «биоконтроль» статистически
значимы (р<0,05)
отличия от биоконтроля статистически значимы (р<0,05).
** - различия групп «облучение+опухоль м.ж.» и «биоконтроль+опухоль м.ж.» статистически
значимы (р<0,05).
***
- различия между группами «биоконтроль+опухоль м.ж.» и «биоконтроль» статистически
значимы (р<0,05)
Как видно из таблицы 6 содержание мРНК гена P53 в гомогенате опухолей м.ж.,
образованных спонтанно на 550 сутки эксперимента (группа «биоконтроль+опухоль м.ж.),
достоверно снижено во всех образцах по сравнению с нормальной тканью. В этой же группе
наблюдается падение мРНК гена MDM2 (медиана составила 0,32 отн.ед., р<0,05) и
увеличение зрелых let-7i и miR-21 (медиана составила 955,43 и 38,05 отн.ед. соответственно).
Нестабильность содержания зрелой miR-16-2 от одного образца к другому проявляется
широким диапазоном между верхним и нижним квартилями (таблица 6), по критерию
Манна-Уитни изменение относительного количества miR-16-2 статистически не значимо (р
>0,05).
В гомогенате опухолей м.ж., образованных после облучения на 550 сутки (группа
«облучение+опухоль м.ж.»), не наблюдается изменений относительной экспрессии генов Р53,
MDM2, MDM4 по сравнению с контролем. Относительное количество зрелой let-7i было
высоким и варьировало во всей выборке (n=6) от 18820 до 1956712 отн.ед. (медиана 24117
отн.ед., р<0,05). Содержание зрелых miR-21 и miR-34c также статистически значимо
превышало контрольный уровень и колебалось от 349 до 4871,6 отн.ед. для miR-21 и 36,76676 отн.ед. для miR-34c. В 5-ти образцах опухолевой ткани м.ж. после облучения удалось
зафиксировать достоверное увеличение содержание зрелых miR-145 и miR-16-2 в 22,3 и 103,9
раза соответственно по сравнению с нормальной тканью. Относительное количество зрелой
miR-125b статистически превышало группу «биоконтроль».
Различия
групп
«облучение+опухоль
м.ж.»
и
«биоконтроль+опухоль
м.ж.»
статистически значимы для мРНК MDM4 и let-7i (р<0,05).
Наглядно данные изменения иллюстрируются при помощи лепестковой диаграммы,
представленной на рисунке 12.
81
В
А
P53***
1000000
P53*
1000000
miR-21*
miR-21*,***
MDM2*
10000
10000
100
100
1
Let-7i*
MDM2***
1
Let-7i*,***
MDM4
MDM4,**
0,01
0,01
miR-16-2
miR16-2*
miR-125b*
miR-125b*
Биоконтроль
miR-145
miR-34c*
miR-145*
Биоконтроль
miR-34c*
Облучение+опухоль
м.ж.
Облучение+опухоль
м.ж.
Биоконтроль+опухоль
м.ж.
Примечание:
-изменения уровней содержания (Ме) мРНК и микроРНК отображено на круговых
осях в логарифмическом масштабе;
- значения медианы (Ме) показателей экпериментальных групп нормированы к
медиане группы «контроль», условно принятой за 1,0;
*- различия между группами «облучение+опухоль» и «биоконтроль» статистически
значимы (р<0,05);
** - различия между группами «облучение+опухоль» и «биоконтроль+опухоль»
статистически значимы (р<0,05);
***
- различия между группами «биоконтроль+опухоль» и «биоконтроль» статистически
значимы (р<0,05)
Рисунок 12. Лепестковая диаграмма изменения экспрессии (Ме) мРНК генов P53, MDM2,
MDM4 и зрелых miR-145, miR-16-2, miR-125b, miR-34c, miR-21, let-7i в гомогенате опухолей
молочных желез крыс на 315 (А) и 550 (В) сутки после тотального однократного ɣ облучения в дозе 2,5 Гр.
3.1.3. Экспрессия генов Р53, MDM2, MDM4 и экспрессия зрелых miR-21, miR-34c,
miR-125b, miR-145, miR-16-2, let-7i в гомогенате костного мозга аутбредных крыс-самок
на 75, 315 и 550 сутки после однократного ɣ-облучения в дозе 2,5 Гр
Другой радиочувствительной тканью является костный мозг, где после острого
лучевого
воздействия
в
сублетальных
дозах
у
крыс
появление
злокачественных
новообразований маловероятно, в отличие от тканей молочной железы - органе, в котором
образование спонтанных и радиационно-индуцированных
опухолей достаточно частое
событие. Проведение исследований по сопоставлению влияния ионизирующей радиации в
молочной железе и костном мозге полезно для оценки антиканцерогенных возможностей р53-
82
системы и определения маркеров, способных
выявить различия в функционировании р53-
системы в этих органах в длительной временной динамике после облучения.
А) Анализ содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c,
miR-125b, miR-145, miR-16-2, let-7i в гомогенате костного мозга аутбредных крыс-самок на 75
сутки после однократного ɣ-облучения в дозе 2,5 Гр с помощью метода ПЦР в реальном
времени
Впервые исследованы изменения состояния р53-сиситемы путем относительного
количественного анализа мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c, miR125b, miR-145, miR-16-2, let-7i в гомогенате костного мозга аутбредных крыс-самок в
отдаленный период после острого однократного ɣ-облучения (75 сутки), когда в костном
мозге происходит субкомпенсированное восстановление клеточности, но образование
опухолей еще маловероятно. Полученные результаты нормированы к группе «биоконтроль»,
условно принятой за 1, и представлены в виде медианы и 25% и 75% квартилей в таблице 7.
Таблица 7. Содержание (Ме) мРНК генов P53, MDM2,MDM4 и зрелых miR-145, miR-16-2,
miR-125b, miR-34c, miR-21, let-7i в костном мозге аутбредных крыс-самок на 75 сутки после
ɣ-облучения в дозе 2,5 Гр.
Группа
P53
MDM2
MDM4
Биоконтроль
1,04
(0,171,63)
15
0,02*
(0,010,06)
10
1,25
(0,282,56)
15
0,06*
(0,040,12)
10
1,00
(0,752,46)
7
2,29
(2,144,0)
7
n
Облучение
n
Примечание:
miR125b
1 (0,265,41)
miR34c
1 (0,51,41)
10
0,5
(0,021,48)
8
14
0,03*
(0,020,25)
10
miR145
1,02
(0,392,55)
8
0,23
(0,0823,48)
7
miR16-2
let-7i
miR-21
1,1
(0,276,07)
10
0,35
(0,152,04)
10
1,36
(0,414,65)
8
0,2
(0,062,17)
8
1,08
(0,612,39)
15
1,73
(0,4533,5)
11
Значения медианы (Ме) показателей экпериментальных групп нормированы к медиане
группы «контроль», условно принятой за 1,0;
25% и 75% квартили указаны в скобках;
n- величина выборки;
*- отличия от биоконтроля статистически значимы (р<0,05).
Из таблицы 7 видно, что в гомогенате костного мозга после облучения (группа
«облучение») происходит достоверное уменьшение содержания мРНК Р53, MDM2 в 52 и в 21
раз соответственно по сравнению с группой «биоконтроль» (р<0,05).
Относительный уровень содержания miR-34c в гомогенате костного мозга на 75 сутки
после облучения составляет 0,03 отн.ед., что достоверно ниже группы «биоконтроль»
(р<0,05).
83
Обращают на себя внимание данные
по содержанию зрелой miR-21 в клетках
костного мозга у облученных крыс на 75 сутки после радиационного воздействия (рисунок
13). В клетках костного мозга у 5 крыс из 10 обследованных животных на 75-е сутки после
облучения обнаружено более чем 10-кратное увеличение содержания зрелой микро РНК miR21 по сравнению с медианой этого показателя группе «биоконтроль». Таких значений
содержания зрелой микро РНК miR-21 в контрольной группе, состоящей из 15 животных, не
обнаруживалось.
Применение
непараметрического
точного
критерия
Фишера
при
сопоставлении групп «облучение» и «контроль» показало, что появление в клетках костного
мозга у части облученных крыс значений, превышающих более чем в 10 раз медиану
содержания miR-21 в группе контроль, не является случайным (р = 0,0038).
Содержание зрелой miR-21, отн.ед.
50
45
облучение , 75 сутки
контроль
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Рисунок 13. Индивидуальные значения содержания зрелой miR-21 в клетках костного
мозга крыс-самок в группе контроля и на 75 сутки после ɣ-облучения в дозе 2,5 Гр.
(значения нормированы к медиане группы «биоконтроль», условно принятой за 1,0)
Б) Анализ содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c,
miR-125b, miR-145, miR-16-2, let-7i в гомогенате костного мозга аутбредных крыс-самок на
315 сутки после однократного ɣ-облучения в дозе 2,5 Гр с помощью метода ПЦР в реальном
времени
Впервые было исследовано содержание микроРНК, характеризующие р53-систему в
гомогенате костного мозга аутбредных крыс-самок в отдаленный период (315 сутки) после
однократного ɣ-облучения в дозе 2,5 Гр, когда продолжаются восстановительные процессы в
кроветворении, а развитие опухолей гематологической и солидной природы становится
весьма вероятным. Результаты определения относительного содержания мРНК генов Р53,
84
MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c,
miR-125b,
miR-145,
miR-16-2,
let-7i,
нормированого к группе «биоконтроль», условно принятой за 1, представлены в виде
медианы и 25% и 75% квартилей в таблице 8.
Таблица 8. Содержание (Ме) мРНК генов P53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-145, miR-16-2,
miR-125b, miR-34c, miR-21, let-7i в костном мозге аутбредных крыс-самок на 315 сутки после
ɣ-облучения в дозе 2,5 Гр.
Группа
P53
MDM2
MDM4
Биоконтроль
1,0 (0,572,14)
1,0 (0,871,31)
1,0 (0,551,36)
miR125b
1,03 (0,73,73)
n
Облучение
7
0,7 (0,50,87)
6
1,07
(0,78-1,1)
6
0,11 (0,041,23)
n
Облучение+опух
оль м.ж.
7
0,87 (0,871,07)
7
0,61
(0,460,93)
7
1,86
(0,57-2,0)
7
1,91
(0,424,43)
6
7
0,5 (0,0090,707)
miR-34c
1,0
(0,4061,51)
6
1,07
(0,753,03)
7
1,41
(0,612,46)
5
miR145
1,0
(0,811,62)
7
2,14
(0,323,48)
7
2,46
(1,743,48)
6
miR1
6-2
1,01
(0,177,21)
6
2,07
(0,9610,92)
7
0,39
(0,360,39)
5
let-7i
miR-21
1,0 (0,934,59)
1,0 (0,354,59)
7
1,5 (0,612,63)
7
0,7 (0,613,24)
7
0,52
(0,150,93)
6
7
0,16
(0,120,26)
5
6
6
5
n
Примечание:
Значения медианы (Ме) показателей экпериментальных групп нормированы к медиане группы
«контроль», условно принятой за 1,0;
25% и 75% квартили указаны в скобках;
n- величина выборки;
Из таблицы 8 видно, что содержание мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21,
miR-34c, miR-125b, miR-145, miR-16-2, let-7i в костном мозге после облучения (группа
«облучение») достоверно не отличается от содержания в группе «биоконтроль», условно
принятой за 1.
Использование критерия Манна-Уитни не выявило разницу в изменении показателей в
костном мозге у животных, у которых развивались опухоли молочной железы (группа
«облучение+опухоль м.ж.») по сравнению с животными группы «биоконтроль» (р>0,05).
В) Анализ содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c, miR125b, miR-145, miR-16-2, let-7i в гомогенате костного мозга аутбредных крыс-самок на 550
сутки после однократного ɣ-облучения в дозе 2,5 Гр с помощью метода ПЦР в реальном
времени
Впервые проведена оценка относительного содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4
и зрелых miR-21, miR-34c, miR-125b, miR-145, miR-16-2, let-7i в гомогенате костного мозга
аутбредных крыс-самок в отдаленный период (550 сутки) после однократного ɣ-облучения в
дозе 2,5 Гр, когда происходит старение организма и возможно появление спонтанных опухолей.
85
Полученные результаты были нормированы по
отношению к группе «биоконтроль», условно
принятой за 1, и представлены в виде в виде медианы с 25% и 75% квартилями в таблице 9
Таблица 9. Содержание (Ме) мРНК генов P53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-145, miR-16-2,
miR-125b, miR-34c, miR-21, let-7i в костном мозге аутбредных крыс-самок на 550 сутки после
ɣ-облучения в дозе 2,5 Гр.
Группа
P53
MDM2
MDM4
Биоконтроль
1,0 (0,91,68)
n
Облучение
6
1,87 (1,262,14)
n
Облучение
+опухоль м.ж.
4
1,1 (0,841,56)
1,0
(0,651,23)
7
0,81
(0,670,906)
4
0,84
(0,650,93)
1,36
(0,313,78)
4
0,7
(0,611,41)
3
0,68
(0,560,73)
n
Биоконтроль
+опухоль м.ж.
6
0,75***,**
(0,63-0,84)
6
0,43****
*, ***
(0,400,53)
5
4
0,4***,*
* (0,410,43)
miR125b
1,43
(0,148,57)
6
30,25*
(15,48166,73)
4
8,0 (0,379,1)
miR-34c
5
0,09
(0,000425,99)
6
1,6 (0,33,2)
1,0
(0,4564,28)
7
0,57
(0,273,03)
3
0,69
(0,430,93)
miR145
1,01
(0,247,72)
6
0,2
(0,078,44)
4
0,68
(0,451,68)
6
6,03
(0,4215,4)
miR1
6-2
1,00
(0,5713,9)
5
157*
(137207)
6
18,37
****
(9,18119,4
2)
9
4,59
(0,938,0)
let-7i
miR-21
1,00
(0,462,63)
7
35,56*
(19,88121,25)
4
43,48**
**
(12,1268,59)
1,00
(0,199,8)
7
26,55*
(21,1155,39)
4
34,56**
**
(11,3155,71)
6
2,25
(0,2639,39)
6
4,24
(0,5729,85)
6
5
5
6
6
5
6
6
n
Примечание:
Значения медианы (Ме) показателей экпериментальных групп нормированы к медиане
группы «контроль», условно принятой за 1,0;
25% и 75% квартили указаны в скобках;
n- величина выборки;
* - различия между группами «облучение» и «биоконтролем» статистически значимы (р<0,05);
**- различия групп «облучение» и «биоконтроль+опухоль м.ж.» статистически значимы
(р<0,05);
*** - различия групп «облучение+опухоль м.ж.» и «биоконтроль+опухоль м.ж.» статистически
значимы (р<0,05);
**** - различия групп «облучение+опухоль м.ж.» и «биоконтроль» статистически значимы
(р<0,05);
***** - различия групп «биоконтроль+опухоль м.ж.» и «биоконтроль» статистически значимы
(р<0,05);
Как показано в таблице 9 на 550 сутки гомогенате костного мозга после облучения
(группа «облучение») не изменяется относительное содержание мРНК генов Р53, MDM2,
MDM4 по сравнению с биоконтролем (группа «биоконтроль»). Получены статистически
значимые отличия для этой группы животных в содержании зрелых miR-125b, let-7i и miR-21,
miR-16-2 (р<0,05). Относительное количество зрелой miR-16-2 варьировало от 137 до 207
86
отн.ед.
(медиана
составила
157
отн.ед.),
количество зрелых miR-125b, let-7i и miR-21
увеличивалось однонаправлено примерно в 30 раз.
В группе «облучение+опухоль м.ж.» в костном мозге не наблюдается изменения
содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4, а происходит достоверное увеличение зрелых
miR-21, let-7i, miR-16-2 (медианы 34,56; 43,48 и 18,37 отн.ед. соответственно) по сравнению с
группой «биоконтроль».
В гомогенате костного мозга группы «биоконтроль+опухоль м.ж.» обнаружено
достоверное снижение относительного количества мРНК гена MDM2 (медиана составила 0,43
отн.ед., n=5) по сравнению с группой «биоконтроль». Гетерогенность в количестве miR-125b
выявлена в 5 образцах костного мозга данной группы (медиана составила 0,09 отн.ед., 25% и
75% квартили 0,0004 и 25,99 отн.ед. соответственно), по критерию Манна-Уитни падение
miR-125b не достоверно (р>0,05).
Статистически значимые различия в содержании мРНК генов Р53 и MDM4
обнаружены между группами ««облучение+опухоль м.ж.» и «биоконтроль+опухоль м.ж.»,
«облучение» и «биоконтроль+опухоль м.ж.» (р<0,05).
Более наглядно изменения содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR34c, miR-16-2, miR-145, miR-125b, miR-21, let-7i в костном мозге аутбредных крыс-самок в
различные сроки (75, 315 и 550 сутки) после облучения представлены на рисунке 14.
В
А
С
P53*
10
miR-21
P53
10
miR-21
MDM2*
1
P53***,**
1000
miR-21*,****
MDM2
1
Let-7i
Let-7i
0,1
Let-7i*,****
MDM4
MDM4
MDM2*****,***
10
1
0,1
100
MDM4***,**
0,01
0,1
0,01
miR16-2
miR16-2
miR-125b
Биоконтроль
Облучение
miR-145
miR-125b
miR-145
miR-16-2*,****
Облучение+опухоль
м.ж.
miR-34c*
Биоконтроль
Биоконтроль
Облучение
miR-34c
miR-125b*
miR-145
miR-34c
Облучение
Облучение+опухо
ль м.ж.
Биоконтроль+опу
холь м.ж.
Примечание:
-изменения уровней содержания (Ме) мРНК и микроРНК отображено на круговых осях в логарифмическом масштабе;
- значения медианы (Ме) показателей экпериментальных групп нормированы к медиане группы «контроль», условно принятой за 1,0;
*- различия между группами «облучение» и «биоконтролем» статистически значимы (р<0,05);
** - различия групп «облучение» и «биоконтроль+опухоль м.ж.» статистически значимы (р<0,05);
*** - различия групп «облучение+опухоль м.ж.» и «биоконтроль+опухоль м.ж.» статистически значимы (р<0,05);
****- различия групп «облучение+опухоль м.ж.» и «биоконтроль» статистически значимы (р<0,05);
*****- различия групп «биоконтроль+опухоль м.ж.» и «биоконтроль» статистически значимы (р<0,05);
Рисунок 14. Лепестковая диаграмма изменения содержания (Ме, отн.ед.) мРНК генов р53, mdm2, mdm4 и зрелых miR-145, miR-16-2, miR125b, miR-34c, miR-21, let-7i в суспензии костного мозга крыс на 75 (А), 315 (В) и 550 (С) сутки после однократного ɣ - облучения в дозе 2,5
Гр.
3.1.4. Анализ соотношениия содержания мРНК гена Р53 и мРНК генов MDM2, MDM4,
miR-34с, miR-145, miR-16-2, miR-125b, let-7a, miR-21 в гомогенате опухолей молочных
желез и костного мозга аутбредных крыс-самок на 75, 315 и 550 сутки после
однократного ɣ-облучения в дозе 2,5 Гр.
А) Анализ зависимости содержания мРНК гена Р53 от мРНК генов MDM2, MDM4, а
также зрелых miR-34a, miR-145, miR-16-2, miR-125b, let-7a, miR-21 от мРНК гена Р53 в
гомогенате нормальной и опухолевой тканях молочных желез крыс на 315 и 550 сутки после
облучения, по методу непараметрической корреляции Спирмена.
Результаты представлены в виде оценок коэффициента корреляции Спирмена (R) для
каждой исследуемой группы животных (таблица 10).
Таблица 10. Коэффициент корреляции Спирмена R содержания мРНК генов MDM2,
MDM4, а и зрелых miR-34a, miR-145, miR-16-2, miR-125b, let-7a, miR-21 относительно мРНК
гена Р53, а также мРНК MDM2 от miR-145 и мРНК MDM4 от miR-34c в гомогенате опухолей
молочных желез (м.ж.) аутбредных крыс-самок в различные сроки после острого ɣ-облучения
в дозе 2,5 Гр
Исследуе
мая
группа
животны
х
Комбинации мРНК генов и микроРНК для сравнения
315 сутки после облучения
Р53MDM2
P53MDM4
MDM2
MDM4
P53miR125b
P53miR34c
P53miR145
P53miR16-2
P53
-let7i
P53miR21
MDM2- MDM4miR-145 miR-34c
Биоконт
роль
_
-0,5
(0,66)
0,5
(0,66)
-0,86
(0,33)
0,5
(0,66)
-0,5
(0,66)
0,5
(0,66)
0,5
(0,6
6)
-0,5
(0,66)
-0,4
(0,6)
0,5
(0,66)
Облучен
ие+опухо
ль м.ж.
-0,44
(0,45)
_
0,31
(0,68)
-0,5
(0,66)
0,5
(0,66)
-0,05
(0,93)
_
_
0,3
(0,62)
0,68
(0,19)
-0,5
(0,66)
550 сутки после облучения
Биоконт
роль
_
-0,5
(0,66)
0,5
(0,66)
-0,86
(0,33)
0,5
(0,66)
-0,5
(0,66)
0,5
(0,66)
0,5
(0,6
6)
-0,5
(0,66)
-0,4
(0,6)
0,5
(0,66)
Облучен
ие+опухо
ль м.ж.
0,7
(0,18)
-0,5
(0,39)
_
-0,4
(0,60)
0,9*
(0,037
)
-0,7
(0,18)
0,6
(0,28)
0,9
0
(0,0
37)
_
0,70(0,1
8)
0,60(0,40
)
Биоконт
-0,2
-0,03
0,5
-0,05
-0,77
-0,71
0,35
-
-0,69
0,71
_
89
роль+оп
ухоль
м.ж.
(0,7)
(0,95)
(0,66)
(0,93)
(0,07)
(0,11)
(0,55)
0,9
*
(0,0
3)
(0,12)
(0,11)
Примечание: в скобках приведен уровень достоверности корреляции. *- р<0,05
__- значения коэффициента ранговой корреляции Спирмена отсутствуют из-за маленького
количества образцов, в которых детектировались исследуемые показатели
Как видно из таблицы 10 для большинства соотношений содержания мРНК гена Р53 c
микроРНК использованный коэффициент ранговой корреляции Спирмена оказался не
чувствительным из-за маленького количества образцов, в которых выявлялся тот или иной
показатель.
На 315 сутки в гомогенате опухолей молочных желез в группах «биоконтроль» и
«облучение + опухоль м.ж.» корреляция между уровнем мРНК гена Р53 и мРНК генов
MDM2, MDM4, а также зрелыми miR-34a, miR-145, miR-16-2, miR-125b, let-7a, miR-21 была
статистически не значима. В этих же группах отсутствовала корреляция между мРНК гена
MDM2 и miR-145, между мРНК гена MDM4 и miR-34c, мРНК гена MDM2 и мРНК гена
MDM4 (p>0,05).
На 550 сутки после облучения в группе «облучение+опухоль м.ж.» содержание мРНК
гена Р53 в гомогентате молочных желез положительно коррелирует с содержанием зрелой
miR-34c (R=0,9, p<0,05), а в группе «биоконтроль+опухоль м.ж.» мРНК гена Р53
положительно коррелирует с содержанием let-7i (R=-0,9, p<0,05).
Б) Анализ зависимости содержания мРНК гена Р53 от мРНК генов MDM2, MDM4, а
также зрелых miR-34a, miR-145, miR-16-2, miR-125b, let-7a, miR-21 от мРНК гена Р53 в
гомогенате костного мозга крыс на 75, 315 и 550 сутки после облучения по методу
непараметрической корреляции Спирмена. Результаты представлены в виде оценок
коэффициента корреляции Спирмена (R) для каждой исследуемой группы животных
(таблица 11).
Таблица 11. Коэффициент корреляции Спирмена R содержания мРНК генов MDM2, MDM4
и зрелых miR-34a, miR-145, miR-16-2, miR-125b, let-7a, miR-21 относительно мРНК гена Р53,
а также мРНК MDM2 от miR-145 и мРНК MDM4 от miR-34c в гомогенате костного мозга
аутбредных крыс-самок в различные сроки после острого ɣ-облучения дозой 2,5 Гр
Исследу
емая
группа
животн
ых
Комбинации мРНК генов и микроРНК для сравнения
75 сутки после облучения
Р53MD
P53MDM4
MDM2
-
P53miR-
P53miR-
P53miR-
P53miR-
P53let-7i
P53- MDM2- MDM
miR-21 miR-145
4miR-
90
M2
Биоконт 0,92*
(0,000
роль
8)
0,11
(0,82)
Облучен
ие
-0,1
(0,83)
0,79*
(0,02)
MDM4
125b
34c
145
0,43
(0,33)
0,97*
(0,0000
3)
0,71*
(0,04)
0,78*
(0,02)
0,92*
0,94*
(0,0008) (0,0003)
0,88*
(0,003)
0,64
(0,08)
0,6
(0,15)
0,94*
(0,0004)
0,68
(0,06)
-0,73
(0,05)
0,90*
(0,002)
0,87*
(0,004)
0,93*
(0,0009)
-0,7
(0,07)
-0.4
(0,4)
0,05
(0,91)
16-2
34c
315 сутки после облучения
Биоко
нтрол
ь
0,67
(0,09)
0,37
(0,46)
0,2
(0,7)
0,71
(0,11)
-0,14
(0,78)
-0,07
(0,87)
0,6
(0,2)
0,86*
(0,01)
0,85*
(0,01)
-0,17
(0,7)
-0,7
(0,1)
Облуч
ение
- 0,03
(0,93)
- 0,54
(0,26)
0,25
(0,62)
0,14
(0,75)
0,28
(0,53)
0,82*
(0,02)
0,78*
(0,03)
0,67
(0,09)
0,85*
(0,01)
_
-0,2
(0,7)
Облуч
ение+о
пухоль
м.ж.
0,92*
(0,007)
0,81* 0,88*
(0,049) (0,01)
0,97*
(0,004)
0,41
(0,49)
0,37
(0,46)
0,15
(0,80)
0,58
(0,22)
0,66
(0,21)
0,6
(0,21)
0,3
(0,62)
550 сутки после облучения
Биоко
нтрол
ь
-0,17
(0,74)
0,6
(0,4)
_
0,17
(0,82)
0,49
(0,32)
0,37
(0,46)
0,20
(0,740
-0,10
(0,84)
-0,11
(0,82)
-0,48
(0,32)
0,8
(0,2)
Облуч
ение
0,8
(0,2)
-0,5
(0,66)
_
0,4
(0,60)
_
-0,4
(0,60)
-0,5
(0,66)
0,8
(0,20)
-0,4
(0,60)
-0,8
(0,2)
0,5
(0,66)
Облуч
ение+о
пухоль
м.ж.
-0,61
(0,26)
0,35
(0,55)
-0,16
(0,79)
-0,6
(0,28)
-0,14
(0,78)
-0,37
(0,46)
-0,2
(0,74)
-0,37
(0,46)
-0,37
(0,46)
-0,05
(0,93)
-0,6
(0,21)
Биоко
нтрол
ь+опух
оль
м.ж.
0,8
(0,2)
-0,5
(0,66)
_
0,4
(0,6)
_
-0,4
(0,6)
-0,5
(0,66)
0,8
(0,2)
-0,4
(0,6)
-0,8
(0,2)
0,5
(0,66)
Примечание: в скобках приведен уровень достоверности корреляции. *- р<0,05
__- значения коэффициента ранговой корреляции Спирмена отсутствуют из-за маленького
количества образцов, в которых детектировались исследуемые показатели
Из таблицы 11 видно, что на 75 сутки эксперимента в группе «биоконтроль»
присутствовала положительная корреляция между мРНК гена Р53 и мРНК гена MDM2, miR-
91
125b, miR-34c, miR-16-2, let-7i, miR-21,
коэффициент
Спирмена
для
корреляции
между этими показателями близок к 1 (р<0,05). Значимая корреляция между мРНК Р53 и
мРНК MDM4, а также мРНК MDM2 и miR-145, мРНК MDM4 и miR-34c отсутствовала. В
группе «облучение» корреляционные связи сохранялись, за исключением miR-34c, miR-145,
чьи уровни содержания в этой исследуемой группе не зависели от мРНК Р53.
На 315 сутки эксперимента в группе «биоконтроль» достоверная положительная
корреляция обнаруживалась только между мРНК Р53 и let-7i, мРНК Р53 и miR-21 (R=0,86;
0,85 cоответсвенно). При выявлении опухолей молочных желез, вызванных облучением, к
этому сроку в группе «облучение+опухоль м.ж.» наблюдалась прямая зависимость
содержания мРНК MDM2, мРНК MDM4 и miR-125b от содержания мРНК P53, а также
содержания мРНК MDM4 от мРНК MDM2, коэффициент Спирмена близок к 1 (р<0,05).
На 550 сутки эксперимента в гомогенате костного мозга достоверные корреляции
между показателями не обнаружены нами ни в одной из исследуемых групп животных, в том
числе, и в «биоконтроле».
3.2. Исследование экспрессии микроРНК, регулирующих p53-зависимую систему
защиты генома, в отдаленный период у лиц, перенесших ОЛБ, ОЛБ+МЛП и МЛП
3.2.1. Анализ содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c,
miR-125b, miR-145, miR-16, let-7i в периферической крови лиц в отдаленный период после
перенесения
ОЛБ, ОЛБ+МЛП, МЛП с помощью метода ПЦР в реальном времени со
специально подобранными праймерами и условиями амплификации.
Результаты количественного анализа мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых
микроРНК miR-34a, miR-145, miR-16, miR-125b, let-7a, miR-21 в периферической крови
пациентов с ОЛБ, ОЛБ+МЛП, МЛП, нормированы к контрольной группе «Доноры» («Д»),
условно принятой за 1 и представлены в виде в виде медианы с 25% и 75% квартилями на
рисунках 15 А и В.
В
А
Примечание : * — отличия от контроля статистически значимы (р<0,05)
Рисунок 15. Изменение содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 (А) и микроРНК (В) в крови пациентов с диагнозом ОЛБ, ОЛБ+МЛП
и МЛП в отдаленные сроки после облучения. В качестве контрольной группы взяты здоровые доноры (Д).
Как видно из рисунка 15 А, из изученных нами показателей достоверное увеличение
содержания наблюдается только для мРНК гена MDM4 (р<0,05). В периферической крови
пациентов с диагнозом ОЛБ относительное количество мРНК гена MDM4 варьировало от 1,46
до 3,48 отн.ед. (медиана составила 2,54 отн.ед.), у пациентов с диагнозом МЛП содержание
мРНК гена MDM4 изменялось от 1,8 до 3,86 отн.ед. (медиана 2,53 отн.ед.).
Различия в содержании мРНК генов Р53 и MDM2
по сравнению с контрольной
группой «Д» были статистически не значимы (р>0,05).
При исследовании зрелых микроРНК (рисунок 15 В) обнаружено, что относительное
количество miR-34a и miR-21 был достоверно снижено у пациентов с диагнозом ОЛБ по
сравнению с контрольной группой «Д» в 3,3 и 3 раза соответственно (p<0,05).
В крови с диагнозом МЛП наблюдается повышение содержания зрелой miR-145.
Относительное количество miR-145 колебалось от 3,24 до 8,0 отн.ед. (медиана составляла 6,07
отн.ед.).
Исследуемые группы пациентов с первичным диагнозом ОЛБ, ОЛБ+МЛП и МЛП
были не однородны по дате реализации онкологических последствий облучения. У части
больных уже после обследования был диагностирован рак. Поэтому, анализируя
индивидуальные значения содержания мРНК и микроРНК P53-системы в крови пациентов в
период, предшествующий онктрансформации, было обнаружено что за 4–6 лет до
образования базалиом содержание miR-34a и miR-21 не отличалась от контрольной группы
«Д». В то время как у одного пациента до возникновения рака тослстой кишки содержание
miR-34a в периферической крови был существенно понижен и составлял 0,0008 отн.ед.
У 3-х онкологических больных (с диагнозом на момент обследования «рак щитовидной железы», «рак мочевого пузыря» и «хронический миелолейкоз»), перенесших ранее ОЛБ,
во время лечения уровень miR-34a составлял 0,0036 отн.ед. У пациента с первичным
диагнозом ОЛБ+МЛП на момент лечения хронического миелолейкоза содержание miR-21 в
крови в 22 раза превышало контрольные значения.
3.2.2. Анализ соотношениия содержания мРНК гена Р53 и мРНК генов MDM2, MDM4,
miR-34с, miR-145, miR-16, miR-125b, let-7a, miR-21 в периферической крови пациентов в
отдаленные сроки после перенесения ОЛБ, ОЛБ+МЛП, МЛП.
Анализ зависимости содержания мРНК генов MDM2, MDM4 и зрелых miR-34a, miR145, miR-16-2, miR-125b, let-7a, miR-21 относительно мРНК гена Р53, а также мРНК MDM2 от
miR-145 и мРНК MDM4 от miR-34c в периферической крови пациентов в отдаленный период
94
после облучения выполнен с использованием
метода
непараметрической
корреляции
Спирмена. Результаты представлены в виде оценок коэффициента корреляции Спирмена (R)
для каждой исследуемой группы пациентов (таблица 12).
Таблица 12. Коэффициент корреляции Спирмена R содержания мРНК генов MDM2, MDM4 и
зрелых miR-34a, miR-145, miR-16-2, miR-125b, let-7a, miR-21 относительно мРНК гена Р53, а
также мРНК MDM2 от miR-145 и мРНК MDM4 от miR-34c в периферической крови
пациентов отдаленный период после перенесения ОЛБ, ОЛБ+МЛП, МЛП
Исследуем
ая группа
лиц
Комбинации мРНК генов и микроРНК для сравнения
Р53MDM
2
P53MDM
4
MDM2MDM4
P53miR125b
P53miR34a
P53miR-145
P53miR16
P53let-7a
P53miR21
MDM2- MDM4miR-145 miR-34a
Доноры
0,02
(0,92)
0,63*
(0,000
4)
0,02
(0,93)
-0,27
(0,19)
0,51
(0,05)
0,74*
(0,00004
)
0,31
(0,11)
0,34
(0,09)
0,2
(0,36)
-0,15
(0,56)
0,35
(0,21)
ОЛБ
0,04
(0,88)
-0,06
(0,83)
0,59*
(0,04)
-0,36
(0,33)
-0,09
(0,81)
0,05
(0,86)
0,07
(0,81)
0,27
(0,38)
0,52
(0,11)
0,44
(0,17)
0,06
(0,86)
ОЛБ+МЛ
П
-0,08
(0,82)
-0,22
(0,53)
0,26
(0,46)
-0,03
(0,93)
0,3
(0,43)
-0,2
(0,7)
-0,46
(0,29)
0,07
(0,87)
-0,23
(0,65)
0,65
(0,16)
0,28
(0,45)
МЛП
0,5
(0,39)
-0,8
(0,10)
0,03
(0,95)
0,6
(0,28)
-0,2
(0,8)
0,9*
(0,037)
_
0,1
(0,87)
-0,2
(0,74)
0,77
(0,072)
0,4 (0,6)
Примечание: в скобках приведен уровень достоверности корреляции. *- р<0,05
__- значения коэффициента ранговой корреляции Спирмена отсутствуют из-за маленького
количества образцов, в которых детектировались исследуемые показатели
Из таблицы 12 видно, что в периферической крови лиц, принадлежащих к группе
«Доноры», существует достоверная положительная корреляция только между содержанием
мРНК MDM4 и мРНК Р53, miR-145 и мРНК Р53 (R=0,63; 0,74 соответственно).
В группе «ОЛБ» обнаружена положительная корреляция между мРНК MDM2 и мРНК
MDM4 (R=0,59, p<0,05), в то время как между остальными показателями корреляционные
взаимодействия достоверно не выявляются.
В группе «ОЛБ+МЛП» корреляция исследуемых показателей статистически не
значима.
При анализе периферической крови лиц группы «МЛП» выявлена
только одна
достоверная положительная корреляция между miR-145 и мРНК P53 (R=0,9, p<0,05), все
остальные показатели друг с другом не коррелируют.
95
3.3. Исследование экспрессии микроРНК,
регулирующих
P53-зависимую
систему
сохранения стабильности генома, в крови онкологических больных до и после курса
дистанционной ɣ-терапии
3.3.1.
Анализ содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c, miR-
125b, miR-145, miR-16, let-7i в периферической крови онкобольных с диагнозом РПЖ, РМЖ,
РГШ до и после полного курса ЛТ с помощью метода ПЦР в реальном времени с теми же
праймерами и условиями амплификации, которые были экспериментально подобраны при
исследовании крови пациентов с диагнозом ОЛБ, ОЛБ+МЛП и МЛП.
Результаты количественного анализа мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых
микроРНК miR-34a, miR-145, miR-16, miR-125b, let-7a, miR-21 в периферической крови
онкоболных до и после ЛТ, нормированы к контрольной группе «Доноры» («Д»), условно
принятой за 1 и представлены в виде в виде медианы с 25% и 75% квартилями в таблице 13.
Таблица 13. Cодержание (Me) мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых микроРНК miR-21,
miR-34a, miR-125b, miR-145, miR-16, let-7a в крови онкологических больных с диагнозом рак
РПЖ, РМЖ и РГШ до и после проведения дистанционной ЛТ
Показатель
Доноры
РПЖ
РМЖ
РГШ
До ЛТ
После ЛТ
До ЛТ
После ЛТ
До ЛТ
После ЛТ
Р53
1 (0,48-1,75)
1,6(1,19-2,76)
2,25*(1,32-3,37)
1,5 (0,5-1,72)
1,03 (0,47-1,5)
1,22 (0,79-3,01)
1,5 (0,92-2,28)
n
20
32
32
9
9
13
13
MDM2
1 (0,23-3,48)
1,03 (0,2-1,86)
0,68 (0,2-3,48)
0,81 (0,26-1,62)
0,93 (0,5-1,41)
n
18
30
30
11
13
1,11 (0,27-1,68)
0,90 (0,73-1,57)
11
13
MDM4
n
1,23 (0,43-3,24) 0,35* (0,28-1,0)
9
9
1 (0,63-2,92) 0,09*(0,008-0,225) 0,07*(0,01-0,26) 0,737 (0,52-0,78) 0,737 (0,42-0,84)
26
26
let-7a
1 (0,11-2,82)
133,23* (57,91403)
n
23
32
22
9
9
216,43*(52,11724,08*,**
2687,49)
1,32 (0,87-6,96) 2,00 (1,23-6,06) 181,02* (78,79-337,8) (181,01-1910,8)
32
9
9
11
11
13,96* (3,2434,3* (18,3717,76* (2,0042,22)
24,25* (3,73-84,44)
84,44) 21,1* (12,99-181) 73,73*(21,11-137,18)
209,93)
miR-21
1 (0,21-3,06)
n
20
30
miR-16
1 (0,16-2,63)
0,63 (0,41-2,29)
n
27
31
30
9
9
0,93 (0,31-2,63) 3,24 (0,93-4,28) 1,07 (0,5-4,28)
31
9
9
13
12
2,13 (0,31-4,14)
1,74 (0,65-5,65)
12
11
96
miR-34a
1 (0,13-7,46)
n
15
28
28
miR-125b
1 (0,31-2,29)
1,04 (0,57-2,07)
0,94 (0,3-2,63)
n
25
32
31
miR-145
n
0,97 (0,34-2,73) 6,5*, ** (3,48-22,68) 26,20* (3,41-750)24,25* (5,65-90,5) 12,13*(4,59-22,62) 3,29*(1,03-36,84)
1 (0,002-6,98) 1,14 (0,037-10,2)
24
32
4,9 (0,08-16)
29
13
12
0,66 (0,15-1,62) 0,93 (0,28-1,51)
9
9
10,56* (4,289,85*(3,73-13,92) 18,37)
9
9
13
12
0,59 (0,46-1,61)
0,87 (0,70-1,74)
12
13
8,0* (0,81-17,14) 7,46* (4,0-45,25)
11
11
Примечание:
Значения медианы (Ме) показателей онкобольных нормированы к медиане группы «доноры»,
условно принятой за 1,0;
25% и 75% квартили указаны в скобках;
n- величина выборки;
* — отличия от группы «доноры» статистически значимы р < 0,05 по критерю Манна-Уитни;
** — отличия между группами «до ЛТ» и «после ЛТ» статистически значимы р < 0,05 по
критерию Вилкоксона
Из таблицы 13 видно, что в периферической крови пациентов с диагнозом РПЖ
уровень мРНК Р53 не изменялся до ЛТ, а после ЛТ был повышен (n=32, р<0,05). Содержание
мРНК P53 после ЛТ колебалось от 1,32 до 3,37 отн.ед. (медиана составила 2,25 отн.ед.). Как
до ЛТ, так и после ЛТ обнаружен низкий уровень содержания мРНК гена MDM4 (медианы
составили 0,09 и 0,07 отн.ед. соответственно) по сравнению с группой «Доноры» (р<0,05).
При анализе содержания зрелых микроРНК у этой группы больных статистически
значимые отличия относительно контроля были отмечены для let-7a, miR-21 и miR-34a.
Показано увеличение let-7a до ЛТ в 133 раза, после ЛТ - в 216 раз (n=32, р<0,05). Содержание
miR-21 повышалось до ЛТ в 14 раз, после ЛТ - в 24 раза (n=30, р<0,05). Уровень зрелой miR34а у больных РПЖ до ЛТ не отличался от группы «Доноры», однако после ЛТ было
обнаружено его достоверное увеличение (медиана составила 6,5) при использование парного
критерия Вилкоксона для сравнения одной группы до и после лечения (n=28, р<0,05). У 5
пациентов количество miR-34a не определялось.
У пациентов в крови с диагнозом РМЖ обнаружено достоверное снижение количества
мРНК MDM2 после ЛТ в 2,8 раза по сравнению с группой «Доноры» (n=9, р<0,05). Не
отмечены изменения в содержании мРНК гена Р53, зрелых let-7a, miR-125b, miR-16 как до,
так и после ЛТ РМЖ. Уровни miR-145, miR-34a, miR-21 были достоверно выше до ЛТ по
сравнению с «Донорами» в 9,85; 26,2 и 34,3 раза соответственно (р<0,05), причем у
нескольких больных miR-145, miR-34a, miR-21 не определялись в периферической крови. ЛТ
97
не
нормализовывала
эти
показатели,
статистически значимое увеличение miR-145,
miR-34a, miR-21 сохранялось и после лечения (р<0,05).
У пациентов с диагнозом РГШ в крови содержание мРНК генов Р53, MDM2, MDM4
достоверно не отличалось от группы «Доноры». Выявлены статистически значимые отличия
для зрелых let-7a, miR-21, miR-34a, miR-145 как до ЛТ, так и после ЛТ по сравнению с
контролем (р<0,05). Относительное количество miR-21 колебалось до ЛТ от 21,11 до 137,18
отн.ед. (медиана 73,73 отн.ед.) и после ЛТ от 2,0 до 209,93 отн.ед. (медиана составила 17,76
отн.ед.). Уровень зрелой miR-34a до ЛТ изменялся от 4,59 до 22,62 отн.ед. (медиана 12,13
отн.ед.) и после ЛТ от 1,03 до 36,84 отн.ед. (медиана 3,29 отн.ед.). Колебания количества
зрелой miR-145 у этих пациентов до ЛТ находились в диапазоне от 0,81 до 17,14 отн.ед.
(медиана 8,0) и после ЛТ от 4,0 до 42,24 отн.ед. (медиана 7,46 отн.ед.). Уровень let-7a до ЛТ
превышал свое содержание в 181 раза, а после ЛТ – в 724 раза, причем по критерию
Вилкоксона разница в содержании let-7a до и после ЛТ была достоверной (n=11, р<0,05).
Более наглядно изменения содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых
микроРНК miR-21, miR-34a, miR-125b, miR-145, miR-16, let-7a в периферической крови
пациентов с диагнозом РПЖ, РМЖ и РГШ до и после ЛТ представлены на рисунке 16.
A
B
Р53
1000
miR-21*,**
100
C
Р53
1000
Р53
100
miR-21*,**
MDM2
miR-21*,**
10
MDM2**
10
0,1
1
MDM4**
1
let-7a*,**,***
let-7a
0,01
MDM2
10
1
let-7a*,**
100
MDM4
MDM4
0,1
0,1
miR-16
miR-125b
miR-16
miR-16
miR-145
miR-125b
miR-125b
Доноры
до ЛТ
miR-34a***
после ЛТ
Доноры
до ЛТ
miR-145*,**
miR-34a*,**
после ЛТ
miR-145*,**
miR-34a*,**
Доноры
до ЛТ
после ЛТ
Примечание:
-изменения уровней содержания (Ме) мРНК и микроРНК отображено на круговых осях в логарифмическом масштабе;- значения медианы
(Ме) показателей онкобольных нормированы к медиане группы «Доноры», условно принятой за 1,0;
*- различия между группами «до ЛТ» и «Донорами» статистически значимы (р<0,05);
** - различия групп «после ЛТ» и «Донорами» статистически значимы (р<0,05);
*** - различия групп «до ЛТ» и «после ЛТ.» статистически значимы (р<0,05);
Рисунок 16. Лепестковая диаграмма изменения содержания (Ме) мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых микроРНК miR-21, miR-34a, miR125b, miR-145, miR-16, let-7a в крови онкологических больных с диагнозом РПЖ (А), РМЖ (В) и РГШ (С) до и после проведения
дистанционной ЛТ
3.3.2. Анализ соотношениия содержания мРНК гена Р53 и мРНК генов MDM2, MDM4,
miR-34с,
miR-145,
miR-16,
miR-125b,
let-7a,
miR-21
в
периферической
крови
онкобольных с диагнозом РПЖ, РМЖ и РГШ до и после полного курса дистанционной
ɣ-терапии.
Анализ зависимости содержания мРНК генов MDM2, MDM4 и зрелых miR-34a, miR145, miR-16-2, miR-125b, let-7a, miR-21 относительно мРНК гена Р53, а также мРНК MDM2 от
miR-145 и мРНК MDM4 от miR-34c в периферической крови пациентов с диагнозом РПЖ,
РМЖ и РГШ до и после курса ЛТ выполнен с использованием метода непараметрической
корреляции Спирмена. Результаты представлены в виде оценок коэффициента корреляции
Спирмена (R) для каждой исследуемой группы пациентов (таблица 14).
Таблица 14. Коэффициент корреляции Спирмена R содержания мРНК генов MDM2, MDM4 и
зрелых miR-34a, miR-145, miR-16-2, miR-125b, let-7a, miR-21 относительно мРНК гена Р53, а
также мРНК MDM2 от miR-145 и мРНК MDM4 от miR-34c в периферической крови
онкологических больных до после полного курса ЛТ
Исследуем
ая группа
лиц
Комбинации мРНК генов и микроРНК для сравнения
Р53MDM2
P53MDM4
MDM2MDM4
P53miR125b
P53miR34a
P53miR-145
P53miR16
P53let-7a
P53miR21
MDM
2miR145
MDM
4miR34a
Доноры
0,02
(0,92)
0,63*
(0,0004)
0,02
(0,93)
-0,27
(0,19)
0,51
(0,05)
0,74*
(0,00004
)
0,31
(0,11)
0,34
(0,09)
0,2
(0,36)
-0,15
(0,56)
0,35
(0,21)
РПЖ до
ЛТ
0,04
(0,82)
-0,34
(0,08)
-0,26
(0,21)
0,25
(0,15)
-0,13
(0,51)
-0,56*
(0,0007)
-0,04
(0,83)
-0,36*
(0,04)
0,08
(0,64)
-0,16
(0,38)
-0,15
(0,45)
РПЖ после
ЛТ
0,02
(0,88)
0,1
(0,42)
-0,01
(0,95)
0,18
(0,32)
0,17
(0,39)
-0,09
(0,61)
0,01
(0,93)
0,1
(0,58)
-0,08
(0,65)
-0,22
(0,25)
-0,13
(0,56)
РМЖ до
ЛТ
0,53
(0,14)
-0,21
(0,58)
0,27
(0,48)
0,84*
(0,004)
-0,17
(0,69)
0,54
(0,13)
0,79*
(0,01)
0,51
(0,16)
0,66
(0,05)
0,45
(0,22)
-0,55
(0,15)
РМЖ
после ЛТ
0,48
(0,19)
0,07
(0,84)
0,64
(0,06)
0,46
(0,21)
0,15
(0,7)
0,21
(0,57)
0,25
(0,51)
0,31
(0,40)
0,25
(0,51)
0,68*
(0,04)
0,45
(0,22)
РГШ до
ЛТ
-0,44
(0,17)
0,17
(0,60)
0,35
(0,28)
-0,24
(0,44)
0,05
(0,87)
0,24
(0,47)
0,44
(0,14)
0,44
(0,14)
0,2
(0,49)
0,43
(0,18)
-0,4
(0,21)
РГШ после
ЛТ
0,005
(0,98)
-0,09
(0,75)
0,009
(0,97)
0,26
(0,39)
0,14
(0,66)
0,29
(0,37)
0,16
(0,63)
0,31
(0,31)
0,22
(0,49)
-0,43
(0,19)
0,32
(0,31)
Примечание: в скобках приведен уровень достоверности корреляции. *- р<0,05
100
__- значения коэффициента ранговой
корреляции Спирмена отсутствуют из-за
маленького количества образцов, в которых детектировались исследуемые показатели
Из таблицы 14 видно, что в группе «Доноры» содержание мРНК MDM4
положительно коррелирует с мРНК Р53 (R=0,63, p<0,05), miR-145 с мРНК Р53 (R=0,74,
p<0,05). В остальных случаях достоверной корреляции между исследуемыми показателями не
наблюдается.
В группе «РПЖ до ЛТ» обнаружена отрицательная зависимость между miR-145 и
мРНК Р53, между let-7a и мРНК Р53 (R= -0,56 и R=-0,36 при р<0,05 соответственно). После
ЛТ в группе «РПЖ после ЛТ» эта зависимость исчезает.
В группе «РМЖ до ЛТ» статистически значимая положительная корреляция
наблюдается между miR-125b и мРНК Р53, а также между miR-16 и мРНК Р53 (R=0,84, R0,79 при
p<0,05 соответственно), однако после проведения ЛТ в периферической крови
группы «РМЖ после ЛТ» достоверные корреляции между изучаемыми показателями не
выявляются.
В периферической крови пациентов, принадлежащих группам «РГШ до ЛТ» и «РГШ
после ЛТ», корреляции статистически не значимы.
101
Глава 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
МикроРНК – довольно стабильные молекулы, легко обнаруживаются в различных
биологических жидкостях. Вследствие особенностей механизма посттранскриционного
влияния
на
мРНК,
сходного
с
общими
принципами
взаимодействия
белковых
транскрипционных факторов с 5-8 нуклеотидами ДНК, микроРНК способны также как и
транскрипционные факторы, модулировать активность генома, что очень важно при
таргетном лечении онкологических заболеваний. Координация работы транскрипционных
факторов и микроРНК в условиях организма в контексте регулирования генных сетей в
масштабах всего генома является предметом последних исследований, ставящих перед собой
задачу объединить множество регуляторных цепей для ткани, организма или интересующего
процесса в единую модель. Анализ этих моделей с использованием математических подходов
способен обеспечить понимание механизмов, которые контролируют экспрессию генов на
уровне систем, а не на уровне отдельных генов [Natalia J. et al. 2009].
Супрессор опухолей p53 встроен в большую «молекулярную сеть» контроля
различных клеточных и организменных фенотипов. Разнообразные вне- и внутроклеточные
сигналы ведут к активации р53, а от активированного р53, в свою очередь, расходятся
отдельные эффекторные каскады, обеспечивающие клеточный ответ на стресс. р53 – это
регуляторный белок, транскрипционный фактор, способный связываться с ДНК, и его работа
в клетке направлена на активацию транскрипции сотни генов, участвующих в апоптозе,
остановке клеточного цикла, репарации, старении. Белок mdm2 является природным
ингибитором р53 за счет собственной Е3-убиквинтинлигазной активности, обеспечивающей
низкое содержание р53 в нормальных физиологических условиях. Структурный гомолог
mdm2 белок mdm4 не обладает Е3-убиквинтинлигазной активностью, однако он может
препятствовать самоубиквинтилированию mdm2 и взаимодействию р53 с генами-мишенями.
Считается, что именно убиквинтилирование – это фундаментальная модификация р53,
отвечающая
за
его
основные
свойства
(количество,
активность,
внутриклеточная
локализация). В литературе много внимания уделяется «входящим» внутриклеточным
сигналам, модулирующих деятельность р53, ведется поиск таргетных средств для
восстановления р53 от ингибирующего действия mdm2 и mdm4 при различных
онкологических заболеваниях.
Известно, что облучение вызывает однонитевые и двунитевые разрывы ДНК, которые
распознаются киназами ATM (Ataxia-Telangiectasia Mutated) и ATR (ATM and Rad3 Related),
использующие многовекторный подход для фосфорилирования белков р53 mdm2, mdm4, в
результате чего происходит разобщение р53, mdm2, mdm4. На ранних стадиях радиационного
102
ответа убиквинтинлигазное функционирование mdm2 перенаправляется с р53 на mdm4 и на
сам mdm2, и белки mdm2 и mdm4 деградируют. Функционально активированный таким
образом р53 осуществляет контроль за отсутствием геномных повреждений в клетке, запуская
либо остановку пролиферации, либо апоптоз, либо старение. То есть, старение в данном
случае оказывает защитный эффект, препятствуя неопластической трансформации. В то же
время,
сходство
процессов
старения
и
радиационно-индуцированного
апоптоза,
проявляющееся на уровне активации АТМ-сигнального каскада, индукции белков Chk2 и γН2АХ и последующего накопления ингибиторов cdk – p21 и р16, и фосфорилирования МАРкиназы – р38, делает невозможным обновление тканей из-за гибели делящихся и стволовых
клеток. Поэтому вопрос о роли р53 в радиационно-индуцированном канцерогенезе в
возрастном аспекте все еще нуждается в исследованиях.
Накоплен большой объем знаний по действию р53 на гены-мишени, кодирующих
белки, которые определяют конечную судьбу клетки. Выбор р53 между возможностями
остановки клеточного цикла или индукцией апоптоза может быть продиктован типом клеток,
характером стресс-сигналов [Комарова Е.А. и др. 2000]. Например, после повреждения ДНК
тимоциты гибнут по механизму апоптоза, а в фибробластах останавливается деление. Другой
пример показывает, что при облучении клеток лимфоидной линии человека Baf-3
интерлейкин-3 блокирует клеточный цикл, а отсутствие интерлейкина-3 вызывает апоптоз
клеток. Многочисленные р53-регулируемые сигналы могут усиливаться, тормозиться или
интегрироваться на транскрипционном, постранкрипционном и белково-поступательном
уровнях.
Так называемые р53-респонсивные элементы были найдены и на генах микроРНК
семейства mir-34, mir-145, mir-16-2, let-7a,-b. Помимо того, что микроРНК являются прямыми
участниками различных сигнальных внутриклеточных каскадов, лежащих в основе
механизмов развития того или иного заболевания, они также находят большое практическое
приложение в диагностике патологических состояний и в РНК - терапии. Выбранные нами и
изученные показатели мРНК генов Р53, MDM2, MDM4, а также зрелые miR-34, miR-145, miR125b, mir-21, let7, miR-16, участвуют в работе системы р53, обладающей сложной схемой
взаимодействий на уровне белков, мРНК и микроРНК и формирующей прямые и обратные
связи («петли») между собой. Общими свойствами всех злокачественных клеток является
повышенная пролиферация, потеря/снижение способности к дифференцировке и апоптозу, а
также инвазия и метастазирование. Принимая во внимание, что регулируемые р53 микроРНК,
в
большинстве
случаев
активируют
апоптоз,
остановку
клеточного
цикла
и
103
дифференцировку,
для
выяснения
роли
пролиферативных процессов в механизмах
канцерогенеза необходим показатель – антогонист р53-системы. В качестве маркера
усиленной пролиферации клеток можно исследовать содержание miR-21, которая вовлечена
во взаимодействие прямых и обратных связей между р53 и микроРНК. В ходе
экспериментальных исследований, а также бионформационного анализа показано, что
основными
мишенями
пролиферацию
и
действия
miR-21
ингибирующие
являются
процессы
мРНК
апоптоза.
генов,
В
контролирующих
качестве
объектов
экспериментального исследования были выбраны радиочувствительные органы: костный
мозг и молочная железа аутбредных крыс-самок в длительной временной динамике после
острого облучения животных в дозе 2,5 Гр.
Сроки для изучения отдаленных последствия действия радиации в модельном
эксперименте на крысах были выбраны нами согласно литературным данным, когда на 75
сутки происходит неполное восстановление кроветворения после острого ɣ-облучения в дозе
2,5 Гр, но формирование опухолей маловероятно; на 315 сутки возрастает частота
образования опухолей молочных желез после облучения; и на 550 сутки у животных
возможно появление спонтанных опухолей молочных желез из-за старости.
Р53-зависимая патология, индуцированная ионизирующим излучением, наиболее
очевидна в гематопоэтической системе. В костном мозге в период до образования опухолей
(75 сутки после облучения) нами выявлено уменьшение содержание мРНК гена Р53 и
экспрессии зрелой miR-34, являющейся мишенью транскрипционного фактора р53. Снижение
экспрессии зрелой miR-34 важно, поскольку показано, что в клетках с отсутствующим геном
Р53 введение miR-34 приводит к восстановлению апоптотической гибели клеток с
поврежденным геномом. Обращают на себя внимание данные по содержанию зрелой miR-21
в клетках костного мозга у облученных крыс на 75 сутки после радиационного воздействия. В
клетках костного мозга у 5 крыс из 10 обследованных животных на 75-е сутки после
облучения обнаружено более чем 10-кратное увеличение содержания зрелой miR-21 по
сравнению с медианой этого показателя в контрольной группе. Таких значений содержания
зрелой miR-21 в контрольной группе, состоящей из 15 животных, не обнаруживалось.
Применение непараметрического точного критерия Фишера при сопоставлении групп
«облучение» и «контроль» показало, что появление в клетках костного мозга у части
облученных крыс значений, превышающих более чем в 10 раз медиану содержания miR-21 в
группе контроль, не является случайным (р = 0,0038). Увеличение содержания онкогена miR21 у части облученных животных в этот период времени может свидетельствовать об
усилении пролиферативных процессов в клетках костного мозга на фоне снижения контроля
104
за сохранением стабильности генома. Можно
изменения содержания микроРНК
полагать,
что
зафиксированные
нами
и мРНК генов P53, MDM2 и miR-34c могут давать
информацию о риске формирования онкологического очага в качестве отдаленного
последствия радиационного воздействия. Это вытекает из того, что при низкой активности
р53 и возможном воздействии генотоксического фактора, приводящего к увеличению
содержания активных форм кислорода, клетки будут находиться в состоянии сниженной
клеточной защиты стабильности генома на фоне пролиферативной активности обусловленной
высоким содержанием miR-21. На 315 сутки после облучения исследуемые нами показатели в
костном мозге восстанавливаются и не отличаются от контрольных значений. На 550 сутки
после облучения у животных выявлено увеличение экспрессии зрелых miR-125b, miR-16-2,
miR-21 и let-7i. Изменение активности р53-системы зависит от уровня мРНК генов P53,
MDM2, MDM4 и экспрессии зрелых miR-34, miR-145, miR-16, let-7, miR-125b. Это
определяется тем, что время полужизни белков и мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 короткое и
составляет минуты, поэтому уровень мРНК критично влияет на уровень этих белков в клетке.
Транскрипция генов P53, MDM2, MDM4 в силу быстрого распада предопределяет содержание
их мРНК, а ингибирование и распад этих мРНК может происходить под влиянием зрелых
miR-125b для р53, miR-145 для MDM2 и miR-34c для MDM4 соответственно. Время
полужизни этих микроРНК варьирует и может достигать десятков часов. Таким образом,
получается, что активность р53-системы может зависеть от следующих соотношений
(miR125b:мРНК Р53; miR-145: мРНК MDM2; miR-34c:мРНК MDM4). Белок р53 является
транскрипционным фактором для генов MDM2, mir-34a,b,c, mir-145, mir-16-2, let-7 b,-c,
поэтому в этих условиях количество этих микроРНК будет диктоваться экспрессией р53, и
возможны следующие взаимоотношения в клетке мРНК P53: мРНК MDM2; мРНК P53: miR34; мРНК P53: miR-145; мРНК P53: miR-16-2; мРНК P53: let-7, мРНК Р53:miR-125b. Кроме
этого, р53 активирует работу Drosha и Dicer и ускоряет созревание различных микроРНК.
Непараметрический критерий корреляции Спирмена показал, что в костном мозге интактных
крыс наблюдается высокая корреляция между содержанием мРНК гена P53 и экспрессией
miR-34с, miR-145, miR-16-2, let-7i, miR-125 и miR-21. Эти результаты свидетельствуют о том,
что в костном мозге интактных крыс наблюдается активное функционирование цепочки
р53→ pre miRs + Drosha и Dicer → → miRs, при которой ускоряется созревание микроРНК.
Кроме этого выявлена активная роль транскрипционного фактора р53 на транскрипцию гена
MDM2. Связь между р53 и mdm2 регулирует активность онкосупрессора р53 на уровне,
позволяющем поддерживать клеточный гомеостаз и сохранять стабильность генома после
воздействия генотоксических факторов. В нашем исследовании показано, что на 75 сутки
105
после
облучения
корреляционные
связи
сохраняются только между между
P53 и
MDM2, Р53 и miR-125b, Р53 и miR-16-2, Р53 и miR-21.
У интактных животных на 315 сутки после начала опыта сохранялась лишь
корреляция между P53 и miR-21, P53 и let-7i. На 315 сутки после облучения у животных,
подвергавшихся
радиационному
воздействию,
хотя
и
наблюдается
количественное
восстановление изученных показателей, однако корреляционные связи между генами р53системы и микроРНК нарушаются. У облученных крыс в этот период наблюдали корреляцию
между P53 и miR-145, P53 и miR-16-2, P53 и miR-21. На 550 сутки как у контрольных, так и у
облученных крыс корреляция между р53 и микроРНК отсутствовала, что свидетельствовало о
дискоординации системы р53 в клетках костного мозга.
Бесспорно, наблюдаемые нами изменения уровней мРНК генов P53, MDM2, MDM4 и
экспрессии зрелых miR-34, miR-145, miR-16, let-7, miR-125b возникающие в отдаленный
период после острого облучения крыс в сублетальной дозе важны для формирования
глубоких и длительно сохраняющихся поражениях гемопоэза. Например, в отдаленный
период после облучения белых аутбредных крыс выявлено возникновение эритропении и
гиперплазии костного мозга [Шмелева Н.И. 1962, Кондратьева Т.М. 1964]. Основная
трудность для интропретации наших результатов связана с разнородным составом клеток в
костном
мозге.
Костный
мозг
взрослого
организма
содержит
долгоживущие
и
короткоживущие стволовые клетки крови, мультипотентные мезенхимальные (стромальные)
клетки, прогениторные
клетки
(клетки-предшественницы лимфо- и
миелопоэза) и
созревающие клетки, а также имеет хорошо развитую сосудистую систему. Особое значение
для развития отдаленных последствий имеют стволовые клетки, которые подвергались
воздействию ионизирующей радиации и в дальнейшем формировали клеточное потомство.
От их состояния во многом зависит и фенотип клеток костного мозга,
возникающий в
отдаленные сроки после облучения. У мышей долгоживущие и короткоживущие стволовые
клетки и прогенеторные клетки составляют 0,05% всех клеток костного мозга. Важное
значение
для
процессов
кроветворения
имеют
ростовые
факторы:
эритропоэтин,
тромбопоэтин, колониестимулирующие факторы, интерлейкины и др, распознаваемые
рецепторами стволовых клеток и участвующих в последующей дифференцировке клеток
крови. В отсутствии сигналов ростовых факторов гематопоэтические клетки выходят из
клеточного цикла и гибнут путем апоптоза. Все стволовые клетки обладают способностью к
неограниченному самообновлению (т.е. сохраняют неизмененный фенотип после деления) и
потентностью (т.е. дают потомство в виде специализированных типов клеток). При стрессвоздействии
мезенхимальные
стволовые
клетки
способны
пролиферировать
и
дифференцироваться в тканевые макрофаги, эндотелиоциты, хондробласты, остеобласты,
106
тучные клетки. Выбор клетки костного мозга
пролиферировать или погибнуть зависит от
внутри- и внеклеточных сигналов. Важную роль в этих процессах имеет р53-система.
Показано, что трансгенные мыши, у которых сайты фосфорилирования р53 мутированы,
имеют конститутивную активацию р53 и демонстрируют стареющий фенотип, который
коррелирует и с истощением стволовых клеток в многочисленных тканях, включая костный
мозг [Pant V., Quintás-Cardama A. 2012]. Аналогичным образом, другая модель трансгенных
мышей, у которых мутированы С-терминальные лизиновые остатки, являющиеся мишенями
mdm2-опосредованного
убиквинтилирования,
демонстрирует
конститутивную
р53-
активность с резким истощением популяции стволовых клеток. Показано, что генетически
конструируемые мыши с потерей гена P53 обладают высоким пулом стволовых клеток.
Однако, такая высокая пролиферативная способность стволовых клеток с дефицитным р53
приводит
к
отсутствию
репопуляционной
активности
стволовых
клеток
при
их
трансплантации по сравнению с р53 «дикого типа». Потенциал к приживлению – это маркер
функционально пригодности стволовых клеток, который уменьшается с возрастом и
коррелирует с низким содержанием р53. Нерегулируемая пролиферация стволовых клеток в
отсутствии р53 приводит к тому, что клетки накапливают мутации, и образование
гематологических опухолей увеличивается.
К сожалению, проведенные нами исследования не позволяют характеризовать
стволовые клетки крови, поскольку изучался гомогенат костного мозга. Из многочисленных
исследований по профилированию микроРНК в гематопоэтической системе известно, что
исследуемые нами микроРНК играют важную роль на каждой стадии гематопоэза.
Транскрипция miR-34a является ключевым шагом в индукции гранулоцитопоэза [Pulikkan
J.A. 2010]. miR-125b высоко экспрессируется в миелобластных клетках и промиелоцитах,
выделенных из костного мозга, и строго даунрегулируется в метамиелоцитах, в
долгоживущих стволовых клетках крови. Сверхэкспрессия miR-125 в стволовых клетках
демонстрируют повышенную миелоидную дифференцировку в условиях in vivo [Gerrits A.
et al. 2011] и вызывает сдвиг в дифференцировке миелоидных прогениторов в направлении
макрофагов. На мышиной модели с делециями miR-145 в костном мозге показано
уменьшение
короткоживущих
репопулирующих
стволовых
клеток
и
прогениторов
миелоидной линии [Jeffrey C. et al. 2014]. Предполагается, что miR-16 регулирует
дифференцировку поздних прогениторных клеток [Bruchova H. 2007] и
Choong et al.
показали корреляцию экспрессии miR-16 с увеличением эритроидных поверхностных
антигенов (например, CD235a) [Choong M.L. et al. 2007]. Wong et al. обнаружили, что miR-21
регулирует апоптоз эозинофилов за счет увеличения GM-CSF, который активирует и
107
поддерживает выживание эозинофилов через
ERK-путь.
Ингибирование
miR-21
уменьшает активность выживания и активирует апоптоз в эозинофилах [Wong C. K. 2013].
Sharbati et al.было найдено, что miR-21 апрегулируется при дифференцировке моноцитов
[Sharbati S. 2012]. miR-16, miR-21, let-7f участвуют в регуляции развития Т-клеток и
дифференцировке [Wu H. et al. 2007]. Поскольку прогениторные и созревающие клетки
костного мозга в отдаленный период после облучения образуются из сохранившихся
стволовых клеток, вполне вероятно, что обнаруживаемые нами изменения экспрессии зрелых
микроРНК отражают состояние стволовых клеток. В любом случае для выяснения этого
вопроса необходимы прямые исследования мРНК генов P53, MDM2, MDM4, а также
экспрессии зрелых микроРНК на стволовых и прогениторных клетках костного мозга в
отдаленные сроки после облучения животных.
Образование раковой опухоли в организме часто приводит к изменениям гемопоэза,
что проявляется в нарушении миелопоэза, лейкоцитозе, цитопении и/или анемии. Эти
события могут быть неблагоприятными для пациентов [Casbona Amy-Jo. et al. 2015].
Установлено, что гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), выделяемый
опухолью молочной железы влияет на гемопоэз в костном мозге (рисунок 17).
Примечание: HSC – гематопоэтические стволовые клетки; MMP –мультипотентные
прогениторные клетки; CMP – миелоидные прогениторные клетки; GMP –
гранулоцитарные/макрофогальные прогениторные клетки.
Рисунок 17. Влияние факторов выделяемых опухолью молочной железы на гемопоэз
костного мозга [Casbona Amy-Jo. et al. 2015]
В других исследованиях показано, что линия раковых клеток молочной железы MT1-4,
введенная мышам линии C57BL/6-MMTV-neuOTI/OTII приводила к развитию опухоли и
сопровождалась 3-7-ми кратным увеличением клеток крови за счет увеличения гранулоцитов.
108
При этом
образом,
наблюдалось также снижение
опухоль-секретируемые
факторы
красных клеток крови и тромбоцитов. Таким
молочной
железы
индуцируют
глубокие
изменения в кроветворении и экспрессию ключевых генов гемопоэза. Проведенные нами
исследования показывают, что на 315 сутки после облучения содержание микроРНК в
костном мозге у облученных животных с радиогенно-индуцированными опухолями
молочных желез отличалось от облученных крыс без опухолей. В костном мозге крыс группы
«облучение+опухоль» по сравнению с группой «облучение» мы наблюдали статистически
значимое снижение экспрессии зрелых miR-21 в 4,4 раза и miR-16-2 в 5,3 раза. Кроме этого в
группе
«облучение+опухоль
м.ж.»
выявлялась
корреляция
между
Р53
и
MDM2,
свидетельствующая о наличие связи между P53 и MDM2 в образовавшихся опухолях. Эти
результаты показывают, что выделяемые опухолями молочной железы в составе экзосом
факторы, такие как ростовые факторы, мРНК генов, микроРНК, воздействуют экспрессию в
костном мозге зрелых микроРНК, модулирующих работу р53- системы.
На 550 сутки после облучения
между группами «биоконтроль+опухоль м.ж.» и
«облучение+опухоль м.ж.» наблюдали
статистически значимые различия в содержание
мРНК гена MDM2 и гена P53. Различий в экспрессии зрелых микроРНК между этими
группами не выявлено.
Рак молочной железы является распространенным заболеванием среди женщин.
Несмотря на прогресс в понимании его молекулярной биологии и усовершенствование в
ранней диагностике и в лечении, в 2012 году в РФ заболеваемость РМЖ составила 76,74 на
100 тыс. населения, а смертность составила 29,81 на 100 тыс. [Каприн А.Д. 2014].
Вклад облучения в общую заболеваемость РМЖ незначителен и составляет около 1%,
тем не менее, эпидемиологические исследования, выполненные на
группах людей,
подверженных воздействию ионизирующей радиации, убедительно показали, что большие
дозы радиации могут вызывать РМЖ.
Животные модели часто используются для изучения механизмов радиационного
канцерогенеза и в этом направлении получены определенные результаты. На крысиной
модели РМЖ, индуцированного однократным облучением в постпубертальном периоде,
краткосрочная обработка эстрогенами во время облучения, увеличивает риск возникновения
РМЖ у крыс [Broerse J. J. 1987], а обработка антогонистом ER уменьшает появление этих
опухолей [Welsch C. W. 1981]. Риск возникновения радиационно-индуцированного РМЖ у
крыс также уменьшается благодаря
временной
гормнональной абляции за счет
овариоэктомии перед облучением и последующей хронической эстрогеновой обработки
после облучения [Inano H. et al. 1995]. Интересно, что у крыс, при длительном введении
эстрагенов, снижается риск радиационно-обусловленного рака после облучения. Известно,
109
что возникновение спонтанных опухолей у
крыс
зависит
от
гормонального
фона.
Молодые крысы Sprague–Dawley имеют 4-х дневный эструс [Schedin P. et al. 2000]. Однако,
когда они достигают среднего возраста (7–9 месяцев), 32% крыс Sprague–Dawley испытывают
нерегулярные циклы (4–7дней) и в
возрасте 15 или 16 месяцев
у крыс наблюдается
нерегулярный эструс. Эти возрастные нарушения в эструсе у крыс отличаются от человека
увеличением, а не уменьшением уровня эстрогена в крови (постоянный эструс или
псевдобеременность). Однако в последней трети жизни, когда появляются опухоли молочных
желез, у большинства самок развиваются атрофические изменения в яичниках и появляется
анеструс. Известно, что у женщин полная инволюция молочной железы уменьшает риск
появления РМЖ [Milanese T.R. 2006]. Было показано, что как ранняя, так и поздняя
овариоэктомия уменьшает риск развития спонтанных опухолей молочных желез у крыс.
Исследованию белка р53 при РМЖ посвящено множество работ. Были выявлены
отрицательные корреляции между содержанием мутантного белка р53 и общей и
безрецидивной выживаемостью пациентов с РМЖ, обнаружены положительные связи между
повышенной экспрессией мутантного белка р53 с увеличенным количеством больных с
метастазами в региональные лимфоузлы, а также устойчивостью к химиотерапии и ЛТ
[Щуров Н.Ф. 2014].
Исследование показателей, характеризующих функциональную активность р53системы позволило нам установить, что на 315-е сутки после облучения наблюдается
снижение в 30 раз транскрипционной активности гена Р53 в группе «Облучение + опухоль
молочной железы» по сравнению с контрольной группой. Содержание мРНК гена MDM2,
белковый продукт которого является ингибитором р53, также снижается в молочной железе
крыс этих групп, однако только в 5 раз, что, по-видимому, обеспечивает содержание mdm2,
достаточное для контроля над белком р53. Изменение содержания мРНК этих генов быстро
отражается на уровне белков, поэтому данные результаты свидетельствуют о возможном
снижении активности р53 в молочной железе у облученных животных. В работах других
авторов также показано, что уровень мРНК р53 в первичных карциномах молочной железы
может быть понижен. Поиск потенциальных регуляторов транскрипции гена P53 привел к
обнаружению сайтов для связывания HOXA5 в промоторе гена Р53 [Raman V.1. et al. 2000].
Трансфекция HOX/HOXA5 в эпителиальные клетки молочной железы с «диким типом» р53
способствовала восстановлению апоптоза. В большинстве карциномах молочной железы
экспрессия HOXA5 снижена из-за аберрантного метилирования промотора гена HOXA5.
Возможно, это один из механизмов низкого уровня мРНК гена р53, наблюдавшегося в нашем
эксперименте в опухолях молочных желез крыс на 315 сутки после облучения и на 550 сутки
в опухолях, развивающихся спонтанно. В отношении экспрессии mdm2 в молочной железе
110
известно, что в ER-положительных клетках
ZR-75 содержание мРНК mdm2 в 30 раз
выше, чем ER-отрицательных клетках Hs578T. Механизм, с помощью которого эстроген
модулирует накопление мРНК mdm2 не установлен. Гормон-независимые ER-отрицательные
клетки являются самыми недифференцированными и имеют высокий пролиферативный
индекс. Основы их агрессивного фенотипа непонятны, но предполагается, что это связано с
высоким конститутивным уровнем секретируемых ростовых факторов и апрегуляцией
онкогенов [Arteaga C. L. et al. 1988, Dickson R. B. 1992.]. Авторы предполагают, что на
ранней стадии развития опухоли р53 остается интактным, но он отрицательно регулируется
mdm2, который находится под гормональным контролем и имеет высокий уровень экспресии.
Поскольку нами не оценивался рецепторный статус опухоли молочной железы у крыс, то и не
определялось влияние гормональной регуляции на содержание мРНК MDM2. Содержание
мРНК MDM2 также находится под контролем miR-145. В нашем исследовании не
обнаружено статистически значимого увеличения miR-145 в опухолях молочной железы крыс
на 315 сутки после облучения и на 550 сутки эксперимента в опухолях, развивающихся
спонтанно, однако в опухолях, развивающихся на 550 сутки после облучения, уровень miR145 превышает контрольные значения.
Изучение экспрессии зрелых miR, модулирующих работу р53-зависимой системы,
демонстрирует дисбаланс их содержания в радиогенных и спонтанных опухолях молочной
железы.
В опухолях молочной железы в наших экспериментах на 315 сутки после облучения
существенно увеличивается экспрессия miR -125b, miR-21, let-7i. MiR-125b растет в группе
«Облучение + опухоль молочной железы» в 49 000 раз, , miR-21 – в 21 (р<0.05). Высокий
уровень let-7i, увеличение которого в группе «Облучение + опухоль молочной железы»
достигает 20 000 раз, показывает, что в радиогенных опухолях молочной железы крыс эта
miR подавляет активность каспаз и ингибирует апоптозы. Наблюдались увеличение
экспрессии miR-34c и тенденция к росту зрелых miR-16-2, miR-145. На 550-е сутки
эксперимента в опухолях, возникших у контрольных и облученных крыс, также наблюдался
дисбаланс экспрессии miR. Увеличивалась экспрессия зрелых miR-21, let-7i как в спонтанных
опухолях, так и в радиационно-индуцированных. В опухолях облученных крыс отмечалось
возрастание экспрессии микроРНК-супрессоров опухолей miR-34c, miR-16-2. Таким образом,
в радиогенных и спонтанных опухолях выявлены качественно одинаковые изменения miR-21,
let-7i, показывающие
снижение активности р53-системы, характеризующие опухоли
молочной железы. Однако в опухолях молочной железы у облученных животных экспрессия
miR-125b и miR-21, а также let-7i была более высокой, чем в спонтанных опухолях. При РМЖ
человека в большинстве случаев уровень miR-34 снижен. В одном исследовании [Peurala H.
111
et al. 2011] было показано, что низкая
экспрессия miR-34a наблюдалась в 32%
опухолей, высокая экспрессия miR-34a - в 25% опухолей молочных желез. Повышенный
уровень miR-34a коррелировал с агрессивным фенотипом ER- -опухолей, с высокой степенью
злокачественности и с высокой скоростью пролиферации. Увеличенный уровень экспрессии
зрелых miR-34 мог быть связан с воспалительными процессами в строме молочной железы,
поскольку показано, что при индукции воспаления, возможно увеличение экспрессии miR-21,
miR-29b, miR-34a,b,c, [Matthew M. et al. 2012]. Полученные нами результаты по усилению
экспрессии miR-125b и let-7i в опухолях молочной железы крыс отличаются от результатов,
полученных на клеточных культурах рака молочной железы. Например, показано, что в
результате делеций и гиперметилирования промотора гена mir-125b наблюдается снижение
экспрессии этой микроРНК в опухолевых клетках, что приводит к изменению экспрессии
гена ERBB2/3 и способствует развитию опухолей молочной железы [Banzhaf-Strathmann J.
2014]. Установлено, что в клетках гормонзависимых опухолей молочной железы
наблюдается уменьшение содержания let-7a/b [Sun X. et al. 2013]. Известно, что активность
let-7i в клетках молочной железы очень мала и на несколько порядков ниже, чем других
членов семейства let-7. Различия между уровнями экспрессии miR-125b и let-7i в наших
экспериментах и данными рассмотренных выше работ могут быть связаны с тем, что наши
эксперименты осуществлялись in vivo на аутбредных крысах со своим генотипом, а не на
культуре клеток рака молочной железы. Следует обратить внимание на то, что наши
исследования проводились на гистологически не охарактеризованных опухолях, состоящих
из различных клеток. Известно, что молочная железа у крыс состоит из стромы и паренхимы,
которая включает в себя сеть протоков, окруженных жировой тканью. Главный проток
соединяется с соском на одном конце и радиально разветвляется на дольковые единицы на
другом конце. Каждая единица далее ветвится на мелкие протоки и заканчивается
терминальными лопастями. Наиболее незрелая форма терминальной лопасти – это
терминальные концевые почки terminal end buds (TEBs), которые достигают своего
максимального количества на 21 день [Russo J. et al. 1987]. Под влиянием каждого цикла
эструса, начиная примерно с 32 – 36 дня у крыс, TEBs начинают раскалываться 3-5 раз,
дифференцироваться
в
альвеолярные
почки
alveolar
buds
(ABs),
которые
затем
дифференцируются в дольки. Во время беременности и лактации молочные железы
претерпевают дополнительное созревание, во время менопаузы регрессируют [Russo J. et al
2005]. TEBs грызунов и их человеческий эквивалент, терминальная протоковая дольковая
единица ductal lobular unit (TDLU), являются важными при изучении РМЖ, поскольку они
максимально подвержены действию канцерогенов, учитывая, что они состоят из быстро
делящихся клеток [Russo J. 1987].
112
Эпителий молочной железы содержит
маленькую
фракцию
стволовых
клеток
(которые способны воссоздавать всю железу), прогениторные клетки (с частичной
регенеративной способностью) и зрелые дифференцированные клетки [Smith G. H. 1996].
Стволовые и прогениторные клетки могут образовывать колонии, которые после
трансплантации могут дифференцироваться в протоковые и альвеолярные клетки молочной
железы. После острого облучения высокой дозой (4 Гр) большинство стволовых клеток
молочной железы погибают, а прогениторные клетки с индуцированными мутациями могут
пролиферировать после этого. Эти прогениторные клетки могут долго жить (сами по себе
или, заняв нишу стволовых клеток), в будущем накапливать мутации и, в конце концов,
приводить к возникновению рака [Shackleton et al. 2006]. Хотя прямые генетические
нарушения играют принципиальную роль в радиационно-индуцированнном канцерогенезе,
есть доказательства существования и других эффектов. Исследования in vitro предполагают
действие облученных человеческих фибробластов молочной железы на необлученные
эпителиальные клетки молочной железы, находящиеся в одной культуре, что нормальный
морфогенез эпителиальных протоков [Tsai K. K. 2005]. Эксперименты, проведенные in vivo
показали, что облученная мышиная строма молочной железы имеет способность
трансформировать неопухолевую клеточную линию молочной железы в опухолевую после
трансплантации клеток в строму [Barcellos-Hoff M. 2000]. Высвобожденный стромой
трансформирующий ростовой фактор (transforming growth factor β (TGFβ) может быть
вовлечен в опосредование таких непрямых эффектов ионизирующей радиации.
Таким образом, наши результаты определяли суммарный состав микроРНК,
синтезированный различными типами клеток. Причем вклад различных типов клеток в
суммарный получаемый
результат у крыс с нормальной молочной железой (группа
«биоконтроль») отличался от группы крыс с опухолями, поскольку у них в исследуемом
материале преобладали опухолевые клетки. Более того, нами не исследовался тип опухолей
молочных желез, возникающих у экспериментальных крыс, которые могли быть как
злокачественными, так и доброкачественными. Все эти факторы, безусловно, снижали
патогенетическую значимость результатов, однако позволяли приблизиться к оценке в
условиях in vivo.
В отличие от клеточных культур при исследовании in vivo возникают дополнительные
воздействия, влияющие на конечный результат. Известно, что восстановление способности к
апоптозам в р53-дефицитных опухолевых клетках возможно в результате паракринного
воздействия на них фибробластов с нормальным р53 статусом [Burkhanov R. Et al. 2014].
Поскольку хорошо установлен факт паракринного воздействия микроокружения на клеткимишени, полученные в нашем эксперименте результаты устанавливают возможные пути
113
влияния стромальных и жировых клеток на
функционирование
клеток
молочных
протоков или желез у крыс. Эти факты объясняют и отсутствие в своем большинстве
корреляционных зависимостей между мРНК Р53, мРНК MDM2 и
MDM4, а также
исследованных микроРНК в гомогенате тканей молочных желез как в норме, так и в
опухолях.
Клинические исследования показывают, что индивидуальные изменения экспрессии
miR-125b и let-7 у больных РМЖ могут быть как выше, так и ниже уровня, наблюдаемого у
женщин без
опухолей. Так, в результате проведенных
молекулярно-генетических
исследований Е.А. Гутковской с соавт. было установлено, что уровень экспрессии микроРНК
miR-125b у пациенток РМЖ колебался в пределах от 0,44 до 13,93 отн. ед, а let-7c– от 2,7 до
21,1 отн.ед. В анализируемой группе повышенная экспрессия микроРНК miR-125b выявлена
у 45% пациенток, let-7c – у 20%; гипоэкспрессия miR-125b детектирована в 10% случаев.
При анализе экспрессии miR-125b в зависимости от морфотипа опухоли отмечено, что
повышенная продукция miR-125b в 75% случаев диагностирована при дольковой и 25% при
протоковой аденокарциноме. Гиперэкспрессия let-7c выявлена с одинаковой частотой при
обоих морфотипах опухоли [Гутковская Е.А. и др. 2014].
Транскрипционные факторы, активирующие пролиферативные процессы, например
АР-1, NF-kB, воздействуют на промотор гена mir-21 и стимулируют его транскрипцию.
Зрелая miR-21 ингибирует р53-сигналинг, блокируя клеточные программы, направленные на
сохранение стабильности генома. Гиперэкспрессия miR-21 наблюдается в большинстве
злокачественных новообразований, включая лейкозы и опухоли молочной железы [Pan Х.
2010]. Таким образом, количественное определение указанных показателей может быть
полезно не только для выявления изменений, характерных для опухолей, но и для оценки
молекулярных
нарушений,
возникающих
на
стадиях,
предшествующих
появлению
новообразований..
На следующем этапе мы оценивали состоянии р53-системы и содержание ее
антогонистического партнера miR-21 в периферической крови пациентов, перенесших ОЛБ
после гамма-бета-нейтронного облучения, вследствие радиационных инцедентов в дозах от
1,1 до 3,45 Гр. Известно, что в реальных условиях внешнее облучение всего тела чаще
происходит неравномерно, и только если различия в дозах, поглощенных разными участками
тела, составляют 10-15%, то облучение можно считать равномерным. Поэтому из-за
неравномерного распределения дозы (0,2-12,5 Гр) гамма-бета-нейтронного облучения у части
обследованных больных диагноз ОЛБ был отягощен МЛП (сочетанное поражение), а у
другой части - развитие МЛП происходило без ОЛБ в случае рентгеновского, электронного и
гамма-бета-облучения в дозе от 0,15 до 54 Гр.
114
Длительное наблюдение пациентов с диагнозом ОЛБ, ОЛБ+МЛП, МЛП в
клиническом отделе ФМБЦ имени А.И.Бурназяна позволило оценить состояние системы
кроветворения и периферической крови в отдаленный период после действия радиации.
Следует отметить, что исследуемая нами выборка пациентов была частью когорты лиц,
обследованных в ФМБЦ имени А.И.Бурназяна, и все выводы о состоянии кроветворения в
отдаленный период после ОЛБ имеют к ней непосредственное отношение. В работе И.А.
Галстян [Галстян И.А. 2011] было показано, что у больных, выживших после острого
периода ОЛБ, в течение ближайших 2-х лет происходит восстановление среднегрупповых
показателей периферической крови, однако при индивидуальной оценки содержания
эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов выявляются некоторые отклонения от нормы. Так,
наиболее
распространенным
отдаленным
последствием
были
тромбоцитопения,
сохраняющаяся не менее 10 лет, эритроцитопения, длящаяся на протяжении всего периода
исследования, и нестабильный лейкоцитоз на протяжении 6 лет наблюдения. Наблюдаемые
автором преходящие разнонаправленные изменения клеток крови у пациентов не имели
явных клинических проявлений.
Следует отметить, что частота цитопенических синдромов в отдаленные сроки
после облучения зависела от степени тяжести ОЛБ и наличия или отсутствия МЛП. Так,
после перенесения ОЛБ I и II-ой степени тяжести наблюдалось наиболее компенсированное
кроветворение, в случае сочетания ОЛБ I и II степени тяжести с МЛП обнаруживалось
учащение тромбоцитопении, а в случае ОЛБ III и IV степени тяжести с МЛП изменения
картины периферической крови были разнонаправленные, но умеренные. Среди отдаленных
последствий МЛП автором отмечены следующие патологии. В случае перенесения МЛП
легкой степени тяжести (8-12 Гр) наблюдается отсутствие изменений пигментации кожи,
рубцов, лучевого фиброза и поздних лучевых язв. При МЛП средней тяжести (13-20 Гр) в
отдаленные сроки обнаружены атрофические изменения кожи, а также у 35,3 % пациентов
отмечены множественные телеангиоэктазии и поздние лучевые язвы. При МЛП тяжелой и
крайне тяжелой степени тяжести на фоне выраженных рубцово-атрофических изменений и
прогрессирующего лучевого фиброза у 66% больных наблюдается развитие рецидивирующих
резистентных к проводимой терапии поздних лучевых язв.
Нарушения кратины крови в отдаленный период после облучения могут быть
связаны как с недостаточностью функций костного мозга, так и со сниженеием
жизнеспособности зрелых клеток крови. Показано, что в костном мозге в острый период
после облучения может наблюдаться соединительно-тканное перерождение, жировая
115
атрофия,
повышенное
содержание
недифференцированных клеток, а также
склеротические изменения кровеносных сосудов. Данные морфологические изменения
костного мозга накладывают опечаток на состояние клеток периферической крови в
отдаленные сроки, выражающейся снижением количества форменных элементов
К отдаленным функциональным изменениям зрелых клеток крови следует отнести
иммунодепрессию Т- и В-лимфоцитов, снижение фагоцитарного индекса нейтрофилов,
снижение продукции легочными макрофагами активатора плазминогена и.т.д. [Жербин Е.А.
и др. 1989].
В наших исследованиях в периферической крови пациентов с диагнозом ОЛБ и
МЛП статистически значимо отличался от контрольной группы «Доноры» уровень
содержания мРНК гена MDM4, miR-34a, miR-21 miR-145. Конкретно показано, что
содержание miR-34a и miR-21 снижено только у больных с диагнозом ОЛБ, а miR-145 –
повышен у больных МЛП, содержание мРНК гена MDM4- увеличено в обеих группах.
Согласно данным литературы известно, что miR-21 высоко экспрессируется при
солидных опухолях, при сердечно-сосудистых заболеваниях, при воспалительных процессах.
Индукция miR-21 воспалительными стимулами зафиксирована в гемопоэтических клетках
иммунной системы (особенно в моноцитах/макрофагах, дентритных клетках и Тлимфоцитах), а также в негемопоэтических опухолевых клетках. Недавние исследования
подтвердили ключевую роль miR-21 в процессах воспаления и отрицательной регуляции
провоспалительного ответа, индуцированного теми же стимулами, которые вызывают
индукцию самого miR-21 [Frederick J. et al. 2015]. В частности, miR-21 является ключевым
посредником противовоспалительной реакции макрофагов. Это говорит о том, что
ингибирование miR-21 в лейкоцитах может провоцировать воспаление. Известно, что miR-21
умеренно экспрессируется в кроветворных прогениторных клетках, однако ее количество
значительно увеличивается в зрелых клетках крови, находящихся в активном состоянии, а
именно в тучных клетках, нейтрофилах, активированных Т-лимфоцитах [Monticelli S. et al.
2005]. Следовательно, высокий уровень экспрессии miR-21 – это маркер активации иммунной
системы, хотя необходимо еще выяснить, причина это или следствие.
На примере нейтрофилов больных миелодиспластическим синдромом было
продемонстрировано, что эктопическая экспрессия miR-34a влияет на миграцию нейтрофилов
[Cao M. et al. 2015]. Обнаружено, что высокий эктопический уровень miR-34a не оказывает
воздействие на дегрануляцию нейтрофилов, поскольку уровень миелопероксидазы и эластазы
не изменялся по сравнению с контрольными клетками, однако миграция клеток была
значительно
понижена
из-за
высокого
количества
miR-34.
Авторам
удалось
116
идентифицировать прямую мишень miR-34a-
это фактор обмена гуаниновых нуклеотидов
DOCK-8, который активирует регулятор клеточной миграции Сdc42.
Известно, что макрофаги осуществляют фагоцитоз апоптотических клеток для
предотвращения воспаления и скретируют большое количество интерлейкина-10 (Il-10) для
поддержания нормального гомеостаза. Не опровергая факт, что miR-145 способствует
апоптозу как опухолевой супрессор, в исследовании авторов [Li L., Jin H. et al. 2013]
показано, что экспрессия Il-10 находится под контролем miR-145, благодаря тому, что miR145 воздействует на деацетилазу гистонов HDAC, вызывающую сайленсинг IL-10.
Кроме неполноценности кроветворения, обнаруживаемоего в отдаленный период
после облучения, длительное наблюдение за пациентами позволяет оценить риски развития
опухолей солидной и гематологической природы. Показано, что частота появления солидных
опухолей, развиваюшихся в отдаленном периоде после ОЛБ, в целом не превышает частоту
развития раков населения России, а частота появления онкогематологических заболеваний
превышает таковую по стране. Наиболее часто встречаемой солидной опухолью явилась
базалиома (базальноклеточный рак кожи), выявляемая в случае перенесения тяжелых МЛП и
предусматривающая непосредственную связь новообразования и лучевого поражения.
Базалиомы – одна из наиболее часто встречаемых злокачественных опухолей кожи,
развивающаяся из базальных клеток эпидермиса и волосяных фолликулов, для которой
характерен местнодеструирующий рост без образования метастазов в лимфоузлы и
внутренние органы. Показано, что возникновение базалиом в большинстве случаев
происходит на фоне сниженного иммунитета и дефектов репарации ДНК [Писклакова Т.П.
2004]. Анализ индивидуальных показателей, характеризующих P53-зависимую систему
защиты генома, не выявил каких-либо изменений в периферической крови пациентов с
диагнозом базалиомы.
Помимо базалиом из солидных опухолей, обнаруживаемых среди пациентов после
перенесения ОЛБ, ОЛБ+МЛП, МЛП, были рак гортани, РПЖ, рак щитовидной железы, рак
мочевого пузыря, рак левой почки, рак ректосигмоидального отдела толстой кишки, а из
онкогематологических нарушений – хронический миелолейкоз и миелодиспластический
синдром (МДС). Длительный период наблюдения за состоянием здоровья больных (2-51 год)
показал, что пациенты с диагнозом ОЛБ+МЛП имели большую нагруженность эпизодами
опухолей, т.е. у одного и того же пациента последовательно развивалось несколько опухолей
различной локализации, включая базалиомы. У пациентов с диагнозом МЛП ни одного
случая
развития
злокачественного
новообразования
за
все
сроки
динамического
обследования зафиксировано не было. Данный патофизиологический феномен может быть
трактован
как
ранняя
активация
неспецифических
адаптационных
механизмов,
117
предотвращающий
развитие
более
серьезных
последствий.
Из
литературы
известно, что предварительное нанесение легкой механической травмы или ожога повышает
устойчивость организма к последующему радиационному воздействию, облегчает течение
ОЛБ и снижает показатели летальности [Гребенюк А.Н. 2012]. В данном случае
зафиксированное нами повышенное содержание miR-145 в периферической крови у
пациентов
с
диагнозом
МЛП
в
отдаленный
период
может
коррелировать
с
противовоспалительным действием miR-145 и отсутствием появлением новообразований.
Следует напомнить, что источником мРНК и микроРНК в периферической крови
являются клетки крови и выделяемые различными тканями организма экзосомы, содержащие
эти РНК-соединения. При развитии патологий в различных органах пациентов может
наблюдаться изменение их выброса в кровь в составе экзосом. Поскольку у обследуемых
нами пациентов, имевших в анамнезе ОЛБ, наблюдалось снижение экспрессии зрелых miR34а и miR-21, можно предполагать, что уменьшение содержания miR-21 вцелом может
определяться снижением пролиферативной способности тканей. Уменьшение экспрессии
зрелой miR-34а в периферической крови, возможно, обусловлено наличием в организме
тканей, в которых нарушена эффективность функционирования p53. Это может увеличивать
риск
онкотрансформации.
При
изучении
содержания
показателей
р53-системы
в
периферической крови «Доноров» и пациентов достоверные корреляции выявляются не
часто. Обнаружено, что в группе «Доноры» мРНК Р53 положительно коррелирует только с
miR-145, и мРНК MDM2. У пациентов с диагнозом ОЛБ содержание мРНК гена Р53
положительно коррелирует с мРНК гена MDM4, а в группе МЛП – с miR-145. В группе
пациентов с диагнозом ОЛБ+МЛП достоверные корреляции не выявляются.
Индивидуальный анализ исследованных нами пациентов показал, что у лиц,
перенесших во время обследования, либо после него, рак толстой кишки, рак щитовидной
железы, рак мочевого пузыря, либо хронический миелолейкоз обнаруживали многократное
уменьшение зрелой miR-34, либо увеличение miR-21. Это подтверждает информационную
значимость исследованных нами показателей для оценки эффективности P53 -системы
защиты генома и возможности их использования для оценки риска развития отдаленных
последствий.
Основными методами лечения онкологических заболеваний являются удаление
опухолей хирургическим путем, применение химиотерапии и ЛТ. Согласно данным
литературы до 40-60% онкологических больных получают ЛТ в процессе их лечения.
Несмотря на усовершенствование техники облучения больного риски развития
вторичных опухолей сохраняются. Установлено, что после применения дистанционной ЛТ у
118
онкологических больных с диагнозом РМЖ,
РПЖ, РГШ возможно появление вторичных
новообразований солидной и онкогематологической природы в различные сроки после
облучения (от 5 лет и более). О риске развития вторичных опухолей лимфотической и
гемопоэтической систем после лечения РМЖ, и РГШ с применением ЛТ свидетельствуют
результаты работ [Curtis R.E. et al. 1994. Soderholml A.L. 1994, Moon K. et al. 2006],
наглядно представленные в таблицах 15, 16. Результаты появления опухолей у пациентов с
РПЖ после ЛТ представлены в таблице 17.
Таблица 15. Возникновение вторичных опухолей у больных РМЖ после применения
дистанционной ЛТ по сравнению c лечением без ЛТ [Curtis R.E.et al. 2004]
Опухоли лимфатической и
гемопоэтической системы
Риск возникновения вторичных опухолей после ЛТ рака
молочной железы за период 1973-2000 гг (США).
< 10 лет
Всего
О
О/Е
О
О/Е
Лимфома Ходжкина
22
1,56*
29
1,69*
Лимфома неходжкинская
171
0,79*
253
0,92
Миелома
73
1,00
94
1,01
Острая лимфатическая
лейкемия
11
2,63*
11
2,10*
Хроническая лимфатическая
лейкемия
33
0,68*
58
0,94
Острая нелимфатическая
лейкемия
145
3,07*
168
2,80*
Хроническая миелоидная
лейкемия
27
1,51
33
1,45*
Примечание:
О-наблюдаемое число случаев вторичного рака
О/Е- отношение наблюдаемого числа случаев вторичного рака к ожидаемому
(стандартизированный коэффициент заболеваемости)
*
-уровень значимости Р<0,05
Таблица 16. Риск возникновения вторичных опухолей после ЛТ рака ротоглотки (язык,
ротовая полость, глотка) за период 1953-1989 гг [Soderholml A.L. 1994]
119
Опухоли
лимфатической и
гемопоэтической
системы
Риск возникновения вторичных опухолей после ЛТ рака ротоглотки
(язык, ротовая полость, глотка) за период 1953-1989 гг (Финляндия)
О
О/Е
95% СI
Лимфома Ходжкина
2
2,7
0,33-9,8
Лимфома
неходжкинская
4
1,5
0,41-3,9
Лейкоз
9
2,3
1,0-4,3
Примечание:
О-наблюдаемое число случаев вторичного рака
Е-ожидаемое число случаев вторичного рака
О/Е- отношение наблюдаемого числа случаев вторичного рака к ожидаемому
(стандартизированный коэффициент заболеваемости)
CI- 95% доверительный интервал
Таблица 17. Возникновение вторичных опухолей у больных раком простаты после
применения дистанционной ЛТ по сравнению лечением без ЛТ [Moon K. 2006]
Вторичные
опухоли
Коэффициент несогласия (OR)
возникновения вторичных опухолей
после ЛТ рака простаты за период 19731999 гг (США)
Лимфома
неходжкиснкая
нодальная
1,22
Лимфома
неходжкиснкая
экстранодальная
1,1
Острый
миелоидный
лейкоз
1,56
Хронический
лимфатический
лейкоз
1,0
Множественная
1,3
120
миелома
Рак мочевого
пузыря
1,63*
Рак прямой кишки
1,6*
Примечание:
*- уровень значимости Р<0,05
OR (Odds ratio) - коэффициент несогласия, отношение вероятности того, что событие
произойдет к вероятности того, что событие не произойдет.
Однако, следует учитывать, что при лечении больных, как правило, применяется
комплексная терапия, включающая кроме ЛТ, химиотерапию и хирургическое воздействие.
Также считается, что для образования вторичных гемобластозов существенную роль может
играть лечение цитостатиками. Данные Д. Бреннера из Колумбийского университета в США
показывают, что вероятность возникновения вторичного химически-индуцированного рака у
онкологических больных примерно такая же, что и радиационно-индуцированного рака, но
первый возникает на несколько лет раньше [Brenner D. 2001].
Ведутся поиски стратегий ЛТ, позволяющие снизить формирование отдаленных
последствий и повысить эффективность лечения. В России основными критериями
разработки протокола ЛТ при онкологических заболеваниях является возраст больного,
сопутствующие заболевания, локализация опухоли, ее размеры и гистологический тип, стадия
развития опухолевого процесса, а также гематологические показатели больного. Известно,
что ЛТ даже при выборе оптимальной конформации поля облучения и строгого расчета
параметров доставки дозы, оказывает большое влияние и на здоровые ткани. Этому могут
способствовать
несколько
причин,
во-первых,
сами
опухоли
могут
формировать
микроскопические инфильтраты в здоровых тканях, что необходимо учитывать при
планировании объема облучения, во-вторых, кровеносные сосуды, питающие опухоль и
связанные с общим кровотоком, неизбежно подвергаются облучению, также как и другие
близлежащие ткани. Неучтенные параметры могут приводить к развитию ближайших и
отдаленных последствий ЛТ и снижать ее эффективность. Отдельные больные могут поразному реагировать на ЛТ, поэтому важным становится персонализированный подход к
лечению, основанный на индивидуальном выборе дозы облучения, лекарственных
препаратов, усиливающих действие ЛТ.
Основными факторами, определяющие реакцию опухоли и здоровых тканей на ЛТ
является
радиочувствительность
клеток.
Разработка
предсказательного
теста
на
радиочувствительность является важной задачей клинической радиологии в течение
121
нескольких
десятилетий
и
связана
с
большими
достижениями
в
области
геномики, транскриптомики и протеомики [Иванов С.Д., Корытова Л.И. 2013]. Для этих
целей созданы крупные генетические проекты (GENEPI) и GENE-PARE, координирующие
радиационные исследования в нескольких центрах мира.
Определение молекулярных маркеров чаще всего включает исследования тканей
опухоли или анализ крови, направленные на выявление чувствительности или резистентности
к планируемой ЛТ.
Оценка р53-системы в виде мРНК и микроРНК в различных биологических жидкостях
малоинвазивными и быстрыми методами такими, как например, ПЦР в реальном времени,
может оказать существенную помощь врачу-клиницисту в постановки правильного диагноза
и определении эффективности лечения [Кондратова В.Н. и др. 2013]. О циркулирующих
нуклеиновых кислотах, защищенных оболочкой от действия свободных нуклеаз, и о
горизонтальной передачи генетической информации между клетками известно было давно
[Ситиков А.С. 2012], однако только в последнее время появляются многочисленные
публикации, посвященные использованию гибридизационных микрочипов, выявляющих
тысячи последовательностей мРНК и микроРНК в «жидком биоптате» больных. Изменения
профиля экспрессии именно нуклеиновых кислот в большей степени отражают причинноследственную связь в канцерогенезе по сравнению с белками из-за их высокой
онкоспецифичности (т.е. отсутствия опухолевых клеток без генетических и эпигенетических
нарушений). Полученные к сегодняшнему дню результаты по определению мРНК и
микроРНК с применением современных молекулярных технологий (секвенирования,
микрочипов, ПЦР в реальном времени, плавление ДНК и т.д.) в различных тканях больных
все еще нуждаются в верификации на больших контингентах пациентов, отработке условий
взятия и хранения биологического материала, методов выделения нуклеиновых кислот, а
также в количественной оценки полученных данных.
В исследовании, проведенном нами, по оценке содержания зрелых микроРНК у
больных РПЖ до ЛТ в периферической крови обнаружено достоверное увеличение
содержания miR-21, let-7a и снижение мРНК MDM4 по сравнению с контролем «Доноры»
Zhang с соавторами [Zhang H-L. et al. 2011] оценивали уровень miR-21 в сыворотке
крови у 20 пациентов с локализованным РПЖ, у 20 пациентов с метастатическим РПЖ,
которые сохраняли андрогеновую чувствительность, у 10 пациентов, которые имели
гормонорезистентный патогенез заболевания и 6 контрольных пациентов
с BPH. Авторы
обнаружили повышенный уровень miR-21 у пациентов с гормонорезистентным РПЖ и у
пациентов с андрогенчувствительным метастатическим РПЖ, у которых уровень ПСА был
выше 4 нг/мл. Не было отличий между экспрессией miR-21 у пациентов с локализованным
122
РПЖ и контрольной группой. Кроме того,
авторы
обнаружили,
что
среди
гормонрезистентной группы miR-21 был выше у тех пациентов, которые не демонстрировали
ответ на цитотоксическое лечение доцетакселом. Таким образом, miR-21 может служить
маркером прогрессии заболевания и ответом на лечение.
Уровень содержания циркулирующей let-7a в крови у пациентов с диагнозом РПЖ
может быть как повышен, так и понижен. Heneghan et al. анализировали цельную кровь у 20
пациентов с РПЖ и обнаружили ее высокую экспрессию по сравнению с 6 здоровыми
донорами [Heneghan H. et al. 2010]. В другом исследовании [Brian D. et al. 2015] let-7a был
найден даунрегулируемым в крови у больных РПЖ.
В
периферической
крови
пациентов
с
диагнозом
РМЖ
нами
обнаружено
статистически значимое увеличение уровня miR-21, miR-34a, miR-145 относительно группы
«Доноры»
В исследовании [Eichelser C. et al. 2013], включающим 152 пациента с диагнозом
РМЖ было показано, что высокая концентрация miR-34a в сыворотке крови коррелировала с
PR-/ER—cтатусом опухоли, что свидетельствует о вовлеченности этой miR в гормональный
механизм РМЖ.
Ряд исследователей обнаруживает уровень miR-145 в плазме крови пониженным
[Enders K. O. Ng et al. 2013], другие в сыворотке крови находили его повышенным [MarAguilar Fermín et al. 2013]. Авторы ссылаются на работу [Bockmeyer C.L. et al. 2011], в
которой показано, что увеличенное содержание miR-145 обнаруживается в миоэпителиоме
молочной железы, а не в базально-клеточном раке молочной железы. Известно, что miR-145
участвует в ангиогенезе, клеточном росте и инвазии, воздействую на мишени N-RAS и VEGFA, поэтому нарушенная экспрессия miR-145 при атипичной гиперплазии и карциноме in situ
при РМЖ может служить хорошим биомаркером для ранней детекции.
Содержание miR-21 в крови увеличивается при многих онкологических заболеваниях.
Применение мета-анализа показало, что высокий уровень miR-21 может предсказать
неблагоприятные прогнозы для больных раком молочной железы [Wang Y. et al. 2015].
Нами установлено, что в крови у больных РГШ наблюдаются статистически значимые
изменения микроРНК. Увеличивается экспрессия let-7a, miR-21, miR-34, miR-145. После
проведения курса ЛТ у больных РГШ увеличивалась экспрессия зрелых let-7 и у части
больных снижение miR-21. Многочисленные исследования других авторов показали
существенные изменения содержания микроРНК в биологических жидкостях у больных
РГШ. У пациентов с карциномой головы и шеи наблюдали снижение содержания let-7d и
увеличение
miR-21 [Childs G. et al. 2009]. В плазме крови у 50 пациентов
при
плоскоклеточной карциноме головы и шеи методом ПЦР в реальном времени обнаружен
123
высокий уровень miR-21 по сравнению со
здоровыми
донорами
[Coutinho-Camillo
C.M. et al. 2015]. Содержание miR-21 было понижено у больных с хорошим прогнозом,
перенесших операцию по поводу РГШ. Авторами предполагается, что циркулирующая miR21 может служить хорошим биомаркером рака как до, так и после операции РГШ.
Установлено, что низкий уровень miR-145 приводит к увеличению SOX9 и ADAM17, что
коррелирует с плохой выживаемостью [Yu C.C. et al. 2013]. Исследования показывают, что
высокий уровень miR-34 в карциноме головы и шеи может свидетельствовать об опасности
метастазов [Zhang J. et al. 2015].
При изучении корреляционных зависимостей показателей р53-системы защиты генома
в периферической крови онкобольных достоверные связи выявляются в единичных случаях.
Обнаружено, что у пациентов с диагнозом РПЖ уровень мРНК гена Р53 отрицательно
коррелирует с miR145 и let-7a, у пациентов с РМЖ мРНК гена Р53 положительно
коррелирует с miR-125b и miR-16. У пациентов с диагнозом РГШ в периферической крови
достоверные корреляции не найдены.
МикроРНК вовлечены в процесс, связанный с радиочувствительностью. Клетки, в
которые были трансфецированы синтетические молекулы pre-let-7, обладали большей
радиочувствительностью по сравнению с контролем [Weidhaas J.B. et al. 2007]. Sasaki et al.
показали, что высокий уровень экспрессии miR-34a в клетках глиобластомы A172 после
облучения в дозе 30 и 60 Гр индуцирует апоптоз в радиорезистентных глиобластомных
клетках A172 [Sasaki A. et al. 2012]. Duan et al. обнаружили, что восстановление экспрессии
miR-34a усиливает радиоиндуцированный апоптоз отчасти за счет супрессии
LyGDI-
сигнального пути, и что miR-34a может быть использован, как радиосенсибилизатор при
терапии немелкоклеточного рака легкого [Duan W. et al. 2013]. Известно, что р53 «дикого
типа» - ключевой фактор, воздействующий на радиочувствительность раковых клеток, и что
раковые клетки с мутантным р53 или дефицитным р53 имеют плохой ответ на радиацию.
Обнаружено, что индукция miR-34a после действия радиации происходит в р53-зависимой
манере и сверхэкспрессия miR-34a может значительно усиливать радиочувствительность.
Фракционированное облучение значительно нарушает экспрессию микроРНК по сравнению с
одноразовым
облучением.
miR-34a
и
let-7
miRNAs
апрегулируются
после
фракционированного облучения в радиочувствительных клетках LNCaP и раковых клетках
предстательной железы PC3 [Willers H. et al. 2006, John-Aryankalayil M. 2012].
После курса ЛТ у онкобольных достоверные корреляционные зависимости между
показателями р53-системы защиты найдены только у пациентов с диагнозом РМЖ. Показано,
что содержание мРНК гена Р53 положительно коррелирует с уровнем miR-145.
124
Таким
образом,
проведенные
исследования показывают, что микроРНК,
модулирующие функциональную активность р53, изменяются в опухолях РМЖ, РПЖ и РГШ.
Эти изменения можно обнаружить, исследуя периферическую кровь или плазму крови.
Анализ литературных данных подтверждает важность изучения miR-34, let-7, miR-21, miR125, miR-145, miR-16 в целях диагностики и прогноза онкозаболеваний. Влияние на
содержание этих микроРНК способно изменить радиочувствительность опухолей.
125
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В совокупности результаты нашего исследования показали, что изучение
изменений экспрессии генов Р53, MDM2, MDM4 на уровне транскрипции, а также
относительного количества зрелых miR-34, let-7, miR-21, miR-125, miR-145, miR-16 в
длительной временной динамике после радиационного воздействия в сублетальной дозе
на модели костного мозга и молочных желез экспериментальных крыс-самок, может
свидетельствовать о патофизиологичекой значимости этих показателей для организма.
При сопоставлении с
немногочисленными данными литературы, содержащими
результаты определения уровней активности микроРНК и р53 в отдельных популяциях
клеток и у трансгенных животных в отдаленные сроки после облучения, получены
подтверждения изменений ряда изученных показателей в активности р53 и зрелых miR-34,
let-7, miR-21, miR-125, miR-145, miR-16. Наличие достоверных корреляций между
микроРНК, MDM2, MDM4 и мРНК Р53 в наших экспериментах говорит о степени
принадлежности изучаемых показателей к р53-зависимой системе защиты генома.
Для изучения отдаленных последствий действия радиации на организм с точки
зрения формирования опухолей радиогенной природы, нами был поставлен длительный
эксперимент с использование крыс-самок, облученных в сублетальной дозе. Из
литературы известно, что образование радиационно-индуцированных лейкозов у крыс –
событие редкое, однако молекулярные нарушения в P53-системе защиты генома в костном
мозге после острого ɣ-облучения могут проявляться на уровне сдвигов количественных
показателей крови и расстройством кроветворения в целом.
Нарушения в р53-системе защиты генома, сопровождающиеся снижением
молекулярных связей между показателями,
обнаружены нами в гомогенате костного
мозга в отдаленные сроки на 75 сутки, 315 сутки и 550 сутки после облучения. Согласно
данным литературы на 75 сутки у крыс восстановление кроветворения является
неполным, а развитие радиационно-индуцированных опухолей еще маловероятно; к 315
суткам после облучения у крыс образуются опухоли молочной железы, при этом
происходят изменения р53-системы и в костном мозге под влиянием этих опухолей; на
550 сутки после облучения в период старения организма возможно формирование
спонтанных опухолей молочных желез, оказывающих также воздействие и на костный
мозг.
Длительный
эксперимент,
проведенный
на
крысах-самках,
по
изучению
отдаленных последствий действия радиации, позволил нам обнаружить качественные и
126
количественные отличия в экспрессии
зрелых микроРНК, относящихся к р53 –
системе защиты генома, в радиационно-индуцированных и спонтанных опухолях
молочных желез.
Опираясь на данные литературы о информационной значимости изучения в
периферической крови микроРНК, принадлежащих к р53-системе защиты генома, мы
показали, что происходят количественные сдвиги в содержании мРНК генов Р53, MDM2,
MDM4, а также зрелых miR-34, let-7, miR-21, miR-125, miR-145, miR-16 в периферической
крови пациентов в отдаленные сроки после перенесения ОЛБ, ОЛБ+МЛП и МЛП, на фоне
субкомпенсированных процессов кроветворения.
Нарушения
модулирующих
в
количественном
функциональную
и
качественном
активность
содержании
р53-системы,
отмечены
микроРНК,
нами
в
периферической крови онкобольных в зависимости от локализации опухолевого процесса.
Показано, что лучевая терапия вызывает изменение некоторых показателей р53-системы,
легко обнаруживаемых в периферической крови.
Для установления влияния ЛТ на
состояние Р53 системы защиты генома необходимы исследования ,проведенные через
несколько месяцев после лечебных процедур.
127
ВЫВОДЫ
1. Полученные
в
экспериментах
на
аутбредных
крысах-самках
результаты
свидетельствуют об информационной значимости показателей экспрессии генов Р53,
MDM2, MDM4, miR-125b, mir-34c, let-7i, miR-21 и miR-16-2 для характеристики р53зависимой системы защиты генома.
2. На 75 сутки после облучения в гомогенате костного мозга крыс обнаружены
изменения изученных показателей, свидетельствующие о снижении функциональной
активности р53. Наблюдается уменьшение содержания мРНК гена P53 и экспрессии
зрелой miR-34c. В этой же группе
у части крыс в костном мозге многократно
увеличивается экспрессия miR-21. На 315 сутки количественно исследуемые
показатели восстанавливались, однако корреляционные связи между мРНК гена P53 и
изученными микроРНК, обнаруживаемые у контрольных крыс, отсутствовали. На 550
сутки в костном мозге у облученных крыс выявлен высокий уровень экспрессии
зрелых miR-125b, miR-16-2, miR-21 и let-7i.
3. Время появления первых опухолей молочных желез выявляется значительно раньше в
группе облученных крыс-самок (медиана появления = 5 месяцев после воздействия),
чем у интактных (медиана= 12 месяцев). Установлено, что к 315 суткам эксперимента
в гомогенате опухолей молочной железы облученных крыс снижается активность
исследуемых генов, контролирующих защиту генома: в 30 раз уменьшается
содержание мРНК гена P53, в 5 раз – мРНК гена MDM2. В опухолях обнаружено
статистически
значимое увеличение экспрессии зрелых miR-125b, miR-34c, let-7i,
miR-21, свидетельствующее о вовлечении микроРНК в процессы радиационного
канцерогенеза молочных желез у крыс.
4. Изучение молекулярно-генетических показателей в гомогенате опухолей молочных
желез, возникающих к 550 суткам у облученных и у интактных аутбредных крыс,
показывает уменьшение содержания мРНК генов P53 и MDM2 только у контрольных
животных, в то время как экспрессия зрелых miR-34c, miR-125b, miR-16-2 возрастала
только в опухолях у облученных животных. Экспрессия miR-21, let-7i увеличивалась в
опухолях как у контрольных, так и у облученных животных. Данные изменения
характеризуют разницу молекулярного фенотипа спонтанного и радиационного
канцерогенеза молочных желез у крыс.
5. Появление опухолей молочных желез влияло на экспрессию зрелых miR в гомогенате
костного мозга. На 550 сутки эксперимента в костном мозге облученных животных с
опухолями, также как и в группе облученных животных без опухолей обнаружено
128
увеличение экспрессии miR-21, miR-16-2, let-7i. Увеличение miR-125b установлено
только в группе «облучение». У животных со спонтанными опухолями молочных
желез в костном мозге наблюдается снижение экспрессии MDM2. Полученные
результаты свидетельствуют о различных молекулярных механизмах влияния
радиационно-индуцированных и спонтанных опухолей молочных желез на костный
мозг.
6. При обследовании пациентов в отдаленный период после перенесенных ОЛБ (14
человек), ОЛБ+ МЛП (8 человек), МЛП (6 человек) установлено, что в
периферической крови у лиц перенесших ОЛБ наблюдается снижение экспрессии miR34 и miR-21, а у пациентов после МЛП обнаруживается увеличение miR-145.
7. Анализ периферической крови у пациентов с РПЖ, РГШ и РМЖ выявил изменения
экспрессии зрелых miR в зависимости от локализации опухоли. У пациентов с РПЖ
обнаружено снижение мРНК гена MDM4 и увеличение экспрессии зрелых miR-21 и
let-7a, у больных РМЖ увеличивалось содержание miR-21, miR-34, miR- 145, а у
пациентов с РГШ возрастали let-7a, miR-21, miR-34, miR-145. После проведения курса
лучевой терапии у пациентов не обнаруживали существенных изменений изученных
показателей, за исключением, повышения содержания miR-34 у больных РПЖ,
снижениия содержания мРНК гена MDM2 у больных РМЖ и увеличениея уровня let7a у больных РГШ.
129
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Байсоголов Г. Д., Болотникова М.Г., Галстян И. А. и др. Злокачественные новообразования
кроветворной и лимфатической тканей у персонала первого предприятия атомной
промышленности // Вопросы онкологии. 1991. T. 37, вып. 5. С. 553-559.
2. Воробьев А.И., Домрачева E.B. Радиационно-индуцированные лейкозы // Проблемы
гематологии и переливания крови. 2000. T 4. С. 515.
3. Галстян И.А. Состояние здоровья пострадавших в отдаленные сроки после перенесенной
острой лучевой болезни: Дисс. … докт. мед. наук. М. 2011.
4. Галстян И.А. Состояние здоровья пострадавших в отдаленные сроки после перенесенной
острой лучевой болезни: Автореф. дис. ... докт. мед. наук. М., 2011.
5. Гребенюк А.Н., Стрелова О.Ю., Легеза В.И., Степанова Е.Н. Основы радиобиологии и
радиационной медицины // Учеб. пособие. СПб. 2012. C. 232.
6. Гутковская Е.А., Готько О.В., Бабенко А.С., Смолякова Р.М. Молекулярно-генетическая
оценка экспрессии микроРНК mir-125b и let-7c при раке молочной железы // Актуальные
вопросы диагностики и лечения злокачественных новообразований. Минск. 2014. C. 30-32.
7. Жербин Е.А., Чухловин А.Б. Радиационная гематология // Медицина. Москва. 1989. C. 176.
8. Иванов С.Д., Корытова Л.И. Предскзательные маркеры эффективности лучевой
химиолучевой терапии в онкологии // СПб. 2013. C. 112.
9. Кондратова В.Н., Ботезату И.В., Шелепов В.П., Лихтенштейн А.В. Внеклеточные
нуклеиновые кислоты как маркеры опухолевого роста // Российский биотерапевтический
журнал. 2013. Т. 12, N3. C. 3-11.
10. Кондратьева Т.М., Сафронова В.Г. О необратимых изменениях элементов крови
облученных животных // В сб. « Восстановительные процессы при радиационных
поражениях» М. Атомиздат. 1964. C. 172-178.
11. Москалев Ю.В., Стрельцова В.Н. Лучевой канцерогенез в проблеме радиационной защиты
// М.:Энергоиздат. 1982. C. 120.
12. Муксинова К.Н., Мурзина Л.Д., Ревина В.С. Значение индивидуальных особенностей
миелопоэза
в
реализации
лейкемогенного
действия
ионизирующего
излучения
//
Медицинский вестник Башкортостана. 2009. T. 4, вып. 2. C. 109-114.
13. Писклакова Т.П. Характеристика иммунного статуса больных базально-клеточным раком
кожи // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2004. N3. C. 33-36.
130
14. Ситиков А.С. Антисмысловые РНК как
посланники в межклеточной коммуникации:
20 лет спустя // Успехи биологической химии. 2012. T. 52. C. 157-176.
15. Чумаков П.М. Белок р53 и его универсальные функции в многоклеточном организме //
Успехи биологической химии. 2007. Т. 47. C. 3-52.
16. Шмелева Н.И. Особенности эритропоэза у животных, перенесших острую лучевую
болезнь // Радиобиология. 1962. T. 2, N7. C. 50-52.
17. Acharya S.S., Fendler W., Watson J. et. al. Serum microRNAs are early indicators of survival
after radiatial-induced hematopoietic injury // Science transplantantial medicine. 2015. Vol. 7(287).
P. 1 -11.
18. Alahari S. MicroRNA in cancer // ebook. 2013
19. Arora H., Qureshi R., Jin S., Park A.K., Park W.Y. miR-9 and let-7 g enhance the sensitivity to
ionizing radiation by suppression of NF[kappa]B1 // Exp Mol Med. 2011. Vol. 43. P. 298–304.
20. Asangani I.A., Rasheed S.A., Nikolova D.A. et al. MicroRNA-21 (miR-21) post-transcriptionally
downregulates tumor suppressor Pdcd4 and stimulates invasion, intravasation and metastasis in
colorectal cancer // Oncogene. 2008. Vol. 27. P. 2128–2136.
21. Bai L., Zhu R., Chen Z. et al. Potential role of short hairpin RNA targeting epidermal growth
factor receptor in growth and sensitivity to drugs of human lung adenocarcinoma cells // Biochem
Pharmacol. 2006. Vol. 71(8). P. 1265-1271.
22. Bandi N., Vassella E. miR 34a and miR 15a/16 are co-regulated in non-small cell lung cancer
and control cell cycle progression in a synergistic and Rb-dependent manner // Mol. Cancer. 2011.
Vol. 10. P. 55.
23. Banzhaf-Strathmann J., Edbauer D. Good guy or bad guy: the opposing roles of microRNA 125b
in cancer // Banzhaf-Strathmann and Edbauer Cell Communication and Signaling. 2014. Vol. 12. P.
30.
24. Barcellos-Hoff M.H., Ravani S.A. Irradiated mammary gland stroma promotes the expression of
tumorigenic potential by unirradiated epithelial cells // Cancer Res. 2000. Vol. 60. P. 1254–1260.
25. Barjaktarovic Z., Anastasov N., Azimzadeh O. et al. Integrative proteomic and microRNA
analysis of primary human coronary artery endothelial cells exposed to low-dose gamma radiation //
Radiat Environ Biophys. 2013. Vol. 52. P. 87-98.
26. Bartel D.P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions // Cell. 2009. Vol. 136(2). P.
215–233.
27. Batchelor E., Loewer A., Lahav G. The ups and downs of p53: Understanding protein dynamics
in single cells // Nature Rev Cancer. 2009. Vol. 9. P. 371–377.
131
28. Batchelor E., Mock C.S., Bhan I., Loewer
A., Lahav G. Recurrent initiation: A mechanism
for triggering p53 pulses in response to DNA damage // Mol. Cell. 2008. Vol. 9. P. 277–289.
29. Bockmeyer C.L., Christgen M., Müller M. et al. MicroRNA profiles of healthy basal and
luminal mammary epithelial cells are distinct and reflected in different breast cancer subtypes //
Breast Cancer Res Treat. 2011. Vol. 130(3). P. 735-745.
30. Boeri M., Verri C., Conte D. et al. MicroRNA signatures in tissues and plasma predict
development and prognosis of computed tomography detected lung cancer // Proc Natl Acad Sci
USA. 2011. Vol. 108(9). P. 3713–3718.
31. Bohnsack M.T., Czaplinski K., Gorlich D. Exportin 5 is a anGTP-dependent dsRNA-binding
protein that mediates nuclear export of pre-miRNAs // RNA. 2004. Vol. 10(2). P. 185-191.
32. Bonci D., Coppola V., Musumeci M. et al. The miR-15a-miR-16-1 cluster controls prostate
cancer by targeting multiple oncogenic activities // Nat Med. 2008. Vol. 14. P. 1271–1277.
33. Bousquet M., Quelen C., Rosati R. et al. Myeloid cell differentiation arrest by miR-125b-1 in
myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia with the t (2;11) (p21; q23) translocation // J
Exp Med. 2008. Vol. 205. P. 2499–2506.
34. Brachova P., Mueting S.R., Devor E.J., Leslie K.K. Oncomorphic TP53 Mutations in
Gynecologic Cancers Lose the Normal Protein:Protein Interactions with the microRNA
Microprocessing Complex // Journal of Cancer Therapy. 2014. Vol. 5. P. 506-516.
35. Brenner D. Long-term risks ‒ Carcinogenic, Hereditary and Teratogenetic Effects. // «ASTRO».
2001. Refresher course. 417 C.
36. Bressac B., Kew M., Wands J., Ozturk M. Selective G to T Mutations of P53 Gene in
Hepatocellular Carcinoma from Southern Africa // Nature. 1991. Vol. 350. P. 429-431.
Brown C.J., Lain S., Verma C.S., Fersht A.R., Lane D.P. Awakening guardian angels: drugging the
p53 pathway // Nat Rev Cancer. 2009. Vol. 9. P. 862.
37. Brueckner B., Stresemann C., Kuner R. et al. The human let-7a-3 locus contains an
epigenetically regulated microRNA gene with oncogenic function // Cancer Research. 2007. Vol. 67.
P. 1419– 1423.
38. Burkhanov R., Shrestha-Bhattarai T., Hebber N. et.al. Paracrine apoptotic effect of h53 mediated
by tumor suppressor Par-4 // Cell reports. 2014. Vol. 6. P. 1-7.
39. Burnett J.C., Rossi J.J. RNA-based therapeutics: current progress and future prospects // Chem
Biol. 2012. Vol. 19(1). P. 60–71.
40. Calin G.A. Croce C.M. MicroRNA signatures in human cancers // Nat Rev Cancer. 2006. Vol.
6(11). P. 857-866.
132
41. Calin G.A., Dumitru C.D., Shimizu M. et al.
Frequent deletions and down-regulation of
micro- RNA genes miR-15 and miR-16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia // Proc Natl Acad
Sci USA. 2002. Vol. 99. P. 15524–15529.
42. Calin G.A., Ferracin M., Cimmino A. et al. A MicroRNA signature associated with prognosis
and progression in chronic lymphocytic leukemia // N Engl J Med. 2005. Vol. 353(17). P. 1793–
1801.
43. Calin G.A., Ferracin M., Cimmino A. et al. A MicroRNA signature associated with prognosis
and progression in chronic lymphocytic leukemia // N Engl J Med. 2005. Vol. 353. P. 1793–1801.
44. Calin G.A., Sevignani C., Dumitru C.D. et al. Human microRNA genes are frequently located at
fragile sites and genomic regions involved in cancers // Proc Natl Acad Sci U S A. 2004. Vol.101(9).
P.2999-3004
45. Cao M., Shikama Y., Anzai M. et al. Impaired Neutrophil Migration Resulting from Mir-34a
and Mir-155 Overexpressed in Neutrophils from Myelodysplastic Syndrome Patients // 57th ASH
Annual Meeting & Exposition. 2015.
46. Carbonneau C. L., Despars G. et al. Heterotopic bone formation derived from multipotent
stromal cells is not inhibited in aged mice // Cytotherapy. 2014. Vol. 16. P. 1073-1079.
47. Carbonneau C.L., Despars G., Rojas-Sutterlin S. et al. Ionizing radiation-induced expression of
INK4a/ARF in murine bone marrow-derived stromal cell populations interferes with bone marrow
homeostasis // Blood. 2012. Vol. 119. P. 717-726.
48. Chan J.A., Krichevsky A.M., Kosik K.S. MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human
glioblastoma cells // Cancer Res. 2005. Vol. 65. P. 6029–6033.
49. Chan S.H., Wu C.W., Li A.F., Chi C.W., Lin W.C. miR-21microRNA expression in human
gastric carcinomas and its clinical association // Anticancer Res. 2008. Vol. 28. P. 907-911.
50. Chang T.C., Wentzel E.A., Kent O.A. et al. Transactivation of miR 34a by p53 broadly
influences gene expression and promotes apoptosis // Mol. Cell. 2007. Vol. 26(5). P. 745–752.
51.Chaudhry M.A., Omaruddin R.A. Differential regulation of microRNA expression in irradiated
and bystander cells // Molekuliarnaia biologiia. 2012b. Vol. 46. P. 634-643.
52. Chen C., Ridzon D.A., Broomer A.J. et al. Real-time quantification of microRNAs by stem–loop
RT–PCR // Nucleic Acids Res. 2005. Vol. 33(20). P. 179.
53. Cheng A.M., Byrom M.W., Shelton J., Ford L.P. Antisense inhibition of human miRNAs and
indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis // Nucleic Acids Res. 2005.
Vol. 33. P. 1290–1297.
133
54. Childs G., Fazzari M., Kung G. et.al. Low-
Level Expression of MicroRNAs let-7d
and miR-205 Are Prognostic Markers of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma // Am J
Pathol. 2009. Vol. 174(3). P. 736–745.
55. Childs G., Fazzari M., Kung G.et al. Low-level expression of microRNAs let-7d and miR-205
are prognostic markers of head and neck squamous cell carcinoma // American Journal of Pathology.
2009. Vol. 174. P. 736– 745.
56. Chin L.J., Ratner E., Leng S. et.al. A SNP in a let-7 microRNA complementary site in the KRAS
3' untranslated region increases non-small cell lung cancer risk // Cancer Res. 2008. Vol. 68(20). P.
8535-8540.
57. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium
thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal Biochem. 1987. Vol. 162(1). P. 156-159.
58. Christophorou M.A., Ringshausen I., Ginch A.J., Brown-Swigart L., Evan G.I. The pathological
response to DNA damage does not contribute to p53-mediated tumour suppression // Nature. 2006.
Vol. 443. P. 214–217.
59. Cimmino A., Calin G.A., Fabbri M. et al. miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting
BCL2 // Proc Natl Acad Sci USA. 2005. Vol. 102. P. 13944–13949.
60. Concepcion C.P., Han Y.C., Mu P. et al. Intact p53-dependent responses in miR 34-deficient
mice // PLoS Genet. 2012. Vol. 8(7). P. e1002797.
61. Cook G.J., Pardee T.S. Animal Models of Leukemia: Any closer to the real thing? // Cancer
Metastasis Rev. 2013. Vol. 32(0). P. 63–76.
62. Court-Brown W.M, Doll R. Leukaemia and aplastic anaemia in patients irradiated for ankylogin
sponylitis // Medical Research Council special Report Series. 1957. Vol. 27 (295). P. B15–B154
63. Coutinho-Camillo C.M., Lourenço S.V., de Araújo Lima L. Expression of apoptosisregulating miRNAs and target mRNAs in oral squamous cell carcinoma // Cancer Genet. 2015.
Vol. 208(7-8). P. 382-389.
64. Croce C.M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer , M.D. // Nat Rev
Genet. 2009. Vol. 10(10). P. 704–714.
65. Cui W., Ma J., Wang Y., Biswal S. Plasma miRNA as biomarkers for assessment of total-body
radiation exposure dosimetry // PLoS One. 2011. Vol. 6. P. e22988.
66. Curtis R.E., Ron E., Hoover R.N. // New Malignancies Following Breast Cancer. P. 181-205.
67. Czochor J. R., Glazer P. M. microRNAs in Cancer Cell Response to Ionizing Radiation. Antioxid
// Redox Signal. 2014. Vol. 21(2). P. 293–312.
134
68. Davalos A.R., Coppe J.P., Campisi J.,
Desprez P. Senescent cells as a source of
inflammatory factors for tumour рrogression // Cancer Metastasis Rev. 2010. Vol. 29. P. 273–283.
69. Duan W., Xu Y., Dong Y., Cao L., Tong J., Zhou X. Ectopic expression of miR-34a
enhances radiosensitivity of non-small cell lung cancer cells, partly by suppressing the LyGDI
signaling pathway // J Radiat Res. 2013. Vol. 54. P. 611-619.
70. Eichelser C., Flesch-Janys D., Chang-Claude J., Pantel K., Schwarzenbach H. Deregulated
serum concentrations of circulating cell-free microRNAs miR-17, miR-34a, miR-155, and miR373 in human breast cancer development and progression // Clin Chem. 2013. Vol. 59(10). P.
1489-1496.
71. Enders K.O., Li R., Shin V.Y. et al. Circulating microRNAs as Specific Biomarkers for
Breast Cancer Detection // PLoS One. 2013. Vol. 8(1). P. e53141.
72. Erson-Bensan A.E. Introduction to microRNAs in Biological Systems // Methods in Molecular
Biology. 2014. Vol.1107. P.1-14.
73. Fabian M.R., Sonenberg N., Filipowicz W. Regulation of mRNA translation and stability by
microRNAs // Annu Rev Biochem. 2010. Vol. 79. P. 351-379.
74. Feng Z., Zhang C., Wu R. Tumor suppressor p53 meets microRNAs // J Mol Cell Biol. Vol. 3(1).
P.44–50.
75. Folini M., Gandellini P., Longoni N. et al. miR-21: an oncomir on strike in prostate cancer // Mol
Cancer. 2010. Vol. 9. P. 12.
76. Folley J.H., Borges W., Yamasaki T. Incidence of leukemia in survivors of the atom bomb in
Hiroshima and Nagasaki, Japan // American Journal of Medicine. 1952. Vol. 13. P. 311–321.
77. Fujita S., Ito T., Mizutani T. et al. miR-21 Gene expression triggered by AP-1 is sustained
through a double-negative feedback mechanism // J Mol Biol. 2008. Vol. 378. P. 492-504.
78. Fujita S., Ito T., Mizutani T. et al. miR-21 gene expression triggered by AP-1 is sustained
through a double-negative feedback mechanism // J Mol Biol. 2008. Vol. 378. P. 492–504.
79. Gandellini P., Rancati T., Valdagni R., Zaffaroni N. miRNAs in tumor radiation response:
bystanders or participants? // Trends in molecular medicine. 2014. Vol. 20 (9). P. 529–539
80. Gil J., Peters G. Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumour supressor locus: all for one and
one for all // Nat Rev Mol Cell Biol. 2006. Vol. 7(9). P.667–677.
81. Girardi C., De Pitta C., Casara S. et al. Analysis of miRNA and mRNA expression profiles
highlights alterations in ionizing radiation response of human lymphocytes under modeled
microgravity // PLoS One. 2012. Vol. 7. P. e31293.
135
82. Goedeccke W. Double starnd break repair
mechanisms
in
mammalian
cells.
In
Chromoosmeal Alterations: Methods, Results and Importance in Human Health // Obe G.,
Vijayalaxmi, Eds. 2007. Vol. P. 55–66.
83. Gudkov A.V., Komarova E.A. Pathologies associated with the p53 response // Cold Spring Harb
Perspect Biol. 2010. Vol. 2(7). P. a001180.
84. Guled M., Lahti L., Lindholm P.M. et al. CDKN2A, NF2, and JUN are dysregulated among
other genes by miRNAs in malignant mesothelioma – A miRNA microarray analysis // Genes,
Chromosomes & Cancer. 2009. Vol. 48. P. 615– 623.
85. Halatsch M.E., Schmidt U., Unterberg A., Vougioukas V.I. Uniform MDM2 overexpression in a
panel of glioblastoma multiforme cell lines with divergent EGFR and p53 expression status //
Anticancer Res. 2006. Vol. 26. P. 4191.
86. Hau A., Ceppi P., Peter M.E. CD95 is part of a let-7/p53/miR-34 regulatory network // See
comment in PubMed Commons below PLoS One. 2012. Vol. 7. P. e49636.
87. He L., He X., Lim L.P. et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network //
Nature. 2007. Vol. 447(7148). P. 1130–1134.
88. Heneghan H.M., Miller N., Kelly R. et al. Systemic miRNA-195 differentiates breast cancer
from other malignancies and is a potential biomarker for detecting noninvasive and early stage
disease // Oncologist. 2010. Vol. 15(7). P. 673–682.
89. Hermeking H. MicroRNAs in the p53 network: micromanagement of tumour suppression // Nat.
Rev. Cancer. 2012. Vol. 12(9). P. 613–626.
90. Hoffman Y., Pilpel Y., Oren M. microRNAs and Alu elements in the p53–Mdm2–Mdm4
regulatory network // J Mol Cell Biol. 2014. Vol. 6(3). P. 192–197.
91. Hu W., Chan C.S., Wu R. et al. Negative regulation of tumor suppressor p53 by microRNA miR
504 // Mol. Cell. 2010. Vol. 38(5). P. 689– 699.
92. Huang S., Guo W., Tang Y., Ren D., Zou X., Peng X. miR-143 and miR-145 inhibit stem cell
characteristics of PC-3 prostate cancer cells // Oncol Rep. 2012. Vol. 28(5). P. 1831–1837.
93. Huang X., Taeb S., Jahangiri S. et al. miRNA-95 mediates radioresistance in tumors by targeting
the sphingolipid phosphatase SGPP1 // Cancer Res. 2013. Vol. 73(23). P. 6972–6986.
94. Huang Z., Huang D., Ni S. et al. Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early
detection of colorectal cancer // Int J Cancer. 2010. Vol. 127(1). P. 118–126.
95. Huynh C., Segura M.F., Gaziel-Sovran A. et al. Efficient In vivo microRNA targeting of liver
metastasis // Oncogene. 2011. Vol. 30(12). P. 1481–1488.
136
96. Iliakis G., Wu W., Wang M., Terzoudi G.I.,
Pantelias
G.E.
Backup
pathways
of
nonhomologous end joining may have a dominant role in the formation of chromosome aberrations.
In Chromosmeal Alterations: Methods, Results and Importance in Human Health // Obe
G.,Vijayalaxmi, Eds. 2007. Vol. P. 67–85.
97. Imaoka T., Yamashita S., Nishimura M. et al. Gene expression profiling distinguishes between
spontaneous and radiation-induced rat mammary carcinomas // J Radiat Res. 2008. Vol. 49(4). P.
349-360.
98. Iorio M.V., Ferracin M., Liu C.G. MicroRNA gene expression deregulation in human breast
cancer // Cancer Res. 2005. Vol.65(16).P. 7065-7070.
99. Iorio M.V., Visone R., Di Leva G. et al. MicroRNA signatures in human ovarian cancer //
Cancer Res. 2007. Vol. 67. P. 8699–8707.
100. Israel A., Sharan R., Ruppin E., Galun E. Increased MicroRNA Activity in Human Cancers //
PLoS One. 2009. Vol. 4(6). P. e6045.
101. Ito A., Kawaguchi Y., Lai C.H. et al. MDM2-HDAC1-mediated deacetylation of p53 is
required for its degradation // EMBO J. 2002. Vol. 21(22). P. 6236-6245.
102. Ji Z., Lee J.Y., Pan Z., Jiang B., Tian B. Progressive lengthening of 3′ untranslated regions of
mRNAs by alternative polyadenylation during mouse embryonic development // Proc Natl Acad Sci
USA. 2009. Vol. 106. P. 7028–7033.
103. John B., Enright A.J., Aravin A. et al. Human microRNA targets // PLoS Biol. 2004. Vol.
2(11). P. e363.
104. Juanjuan Z., Kailing W., Zhenyuan L. et al. Promoter mutation of tumor suppressor microRNA7 is associated with poor prognosis of lung cancer // Molecular and clinical oncology. 2015. Vol. 3.
P. 1329-1336.
105. Kareem K. Small Molecule Inhibitors of Protein-Protein Interactions // The dissertation
of
Doctor of Philosophy. 2013. Pittsburgh. P.1-229.
106. Karve T.M., Cheema A.K. Small changes huge impact: the role of protein posttranslational
modifications in cellular homeostasis and disease // J Amino Acids. 2011.
107. Kasinski A.L., Slack F.J. miRNA-34 prevents cancer initiation and progression in a
therapeutically resistant K-ras and p53-induced mouse model of lung adenocarcinoma // Cancer Res.
2012. Vol. 72(21). P. 5576–5587.
108. Kastan M.B., Onyekwere O., Sidransky D., Vogelstein B., Craig R.W. Participation of p53
protein in the cellular response toDNA damage // Cancer Res. 1991. Vol. 51. P. 6304–6311.
109. Kato M., Paranjape T., Ullrich R. et al. The mir-34 microRNA is required for the DNA damage
response in vivo in C. elegans and in vitro in human breast cancer cell // Oncogene. 2009. Vol. 28. P.
2419–2424.
137
110. Kawai S., Amano A. BRCA1 Regulates
MicroRNA Biogenesis via the DROSHA
Microprocessor Complex // Journal of Cell Biology. 2012. Vol. 197. P. 201-208.
111. Keller A., Leidinger P., Bauer A., et al. Toward the blood-borne miRNome of human diseases //
Nat Methods. 2011. Vol. 8(10). P. 841–843.
112. Kelly B.D., Miller N., Karl J. Sweeney K.J et al. A Circulating MicroRNA Signature as a
Biomarker for Prostate Cancer in a High Risk Group // J Clin Med. 2015. Vol. 4(7). P. 1369–
1379.
113. Kenzelmann Broz D., Attardi L.D. In vivo analysis of p53 tumor suppressor function using
genetically engineered mouse models // Carcinogenesis. 2010. Vol. 31(8). P. 1311-1318.
114. Korpela E., Vesprini D., Liu S.K.. MicroRNA in radiotherapy: miRage or miRador? // British
Journal of Cancer. 2015. Vol. 112. P. 777–782.
115. Kovalchuk I., Kovalchuk O. Epigenetics in Health and Disease. 2012, P. 478.
116. Krell J., Frampton A.E., Stebbing J. MicroRNAs in the cancer clinic // Front. Biosci. (Elite Ed.).
2013. Vol. 5. P. 204–213.
117. Krichevsky A.M., Gabriely G. miR-21: a small multi-faceted RNA // J. Cell. Mol. Med. 2009.
Vol. 13(1). P. 39-53.
118. Kulawiec M., Safina A., Desouki M.M. et al. Tumorigenic transformation of human breast
epithelial cells induced by mitochondrial DNA depletion // Cancer Biol Ther. 2008. Vol. 7. P. 1732–
1743.
119. Kumar M., Lu Z., Takwi A.A. et al. Negative regulation of the tumor suppressor p53 gene by
microRNAs // Oncogene. 2011. Vol. 30. P. 843–853.
120. Kumar M.S., Erkeland S.J., Pester R.E. Suppression of non-small cell lung tumor development
by the let-7 microRNA family // PNAS. 2008. Vol. 105. P. 3903– 3908.
121. Kussie P.H., Gorina S., Marechal V. et al. Structure of the MDM2 oncoprotein bound to the p53
tumor suppressor transactivation domain // Science. 1996. Vol. 274(5289). P. 948-953.
122. Kutanzi K., Kovalchuk O. Exposure to estrogen and ionizing radiation causes epigenetic
dysregulation, activation of mitogen-activated protein kinase pathways, and genome instability in the
mammary gland of ACI rats // Cancer Biology & Therapy. 2013. Vol. 14(7). P. 564–573.
123. Kutanzia K.R., Koturbasha I., Bronsonb R.T., Pogribnyc I.P., Kovalchuk O. Imbalance between
apoptosis and cell proliferation during early stages of mammary gland carcinogenesis in ACI rats //
Mutation Research. 2010. Vol. 694. P. 1–6.
124. Landgraf P., Rusu M., Sheridan R. et al. A mammalian microRNA expression atlas based on
small RNA library sequencing // Cell. 2007. Vol, 129(7). P. 1401–1414.
138
125. Lanford R.E., Hildebrandt-Eriksen E.S.,
Petri A. et al. Therapeutic silencing of
microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection // Science. 2010. Vol. 327(5962).
P. 198–201.
126. Laptenko O., Prives C. The p53-HAT connection: PCAF rules? // Cell Cycle. 2012. Vol.
11(16). P. 2975-2976.
127. Laurie N.A., Donovan S.L., Shih C.S. et al. Inactivation of the P53 Pathway in Retinoblastoma
// Nature. 2006. Vol. 444. P. 61-66.
128. Lawrie C.H., Chi J., Taylor S.et al. Expression of microRNAs in diffuse large B cell lymphoma
is associated with immunophenotype, survival, and transformation from follicular lymphoma //
Journal of Cellular and Molecular Medicine. 2008. Vol. 13. P. 1248– 1260.
129. Lawrie C.H., Gal S., Dunlop H.M. et al. Detection of elevated levels of tumourassociated
microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma // Br J Haematol. 2008. Vol.
141(5). P. 672–675.
130. Le M.T., Shyh-Chang N., Khaw S.L. et al. Conserved regulation of p53 network dosage by
microRNA-125b occurs through evolving miRNA-target gene pairs // PLoS Genet. 2011. Vol. 7(9).
P. e1002242.
131. Le M.T., Teh C., Shyh-Chang N. et al. MicroRNA-125b is a novel negative regulator of p53 //
Genes Dev. 2009. Vol. 23. P. 862–876.
132. Lee C.L., Blum J.M., Kirsch D.G. Role of p53 in regulating tissue response to radiation by
mechanisms independent of apoptosis // Translational Cancer Research. 2013. Vol. 2(5). P. 412-421.
133. Lee J.Y., Kim H.J., Yoon N.A. et al. Tumor suppressor p53 plays a key role in induction of
both tristetraprolin and let-7 in human cancer cells // See comment in PubMed Commons below
Nucleic Acids Res. 2013. Vol. 41. P. 5614-5625.
134. Lewis B.P., Burge C.B., Bartel D.P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines,
indicates that thousands of human genes are microRNA targets // Cell. 2005. Vol. 120(1). P. 15–20.
135. Li L., Jin H., Feng M. Type I IFN Inhibits Innate IL-10 Production in Macrophages
through Histone Deacetylase 11 by Downregulating MicroRNA-145 // The Journal of
Immunology. 2013. Vol. 191 (7), Р. 3896-3904
136. Liu C., Kelnar K., Liu B. et al. The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and
metastasis by directly repressing CD44 // Nat Med. 2011. Vol. 17(2). P. 211–215.
137. Liu C., Li B., Cheng Y. MiR-21 plays an Important Role in Radiation Induced Carcinogenesis
in BALB/c Mice by Directly Targeting the Tumor Suppressor Gene Big-h3 // Int J Biol Sci. 2011.
Vol. 7(3). P. 347–363.
139
138. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of
relative gene expression data using real-time
quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method // Methods. 2001. Vol. 25(4). P. 402-408.
139. Loffler D., Brocke-Heidrich K., Pfeifer G. et al. Interleukin-6 dependent survival of multiple
myeloma cells involves the Stat3-mediated induction of microRNA-21 through a highly conserved
enhancer // Blood. 2007. Vol. 110. P. 1330–1333.
140. Lowe S.W., Schmitt E.M., Smith S.W., Osborne B.A., Jacks T. P53 is required for radiationinduced apoptosis in mouse thymocytes // Nature. 1993. Vol. 362(6423). P. 847–849.
141. Lu J., Getz G., Miska E.A. et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers //
Nature. 2005. Vol. 435(7043). P. 834–838.
142. Lu L., Katsaros D., de la Longrais I.A. et al. Hypermethylation of let-7a-3 in epithelial ovarian
cancer is associated with low insulin-like growth factor-II expression and favorable prognosis //
Cancer Research. 2007. Vol. 67. P. 10117– 10122.
143. Luzhna L., Kovalchuk O. Low dose irradiation profoundly affects transcriptome and
microRNAme in rat mammary gland tissues // Oncoscience. 2014. Vol. 1(11). P.751-62
144. Luzhna L., Kutanzi K., Kovalchuk O. Gene expression and epigenetic profiles of mammary
gland tissue:Insight into the differential predisposition of four rat strains to mammary gland cancer //
Mutation Research. 2015. Vol. 779. P. 39–56.
145. Ma L., Reinhardt F., Pan E. et al. Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a
mouse mammary tumor model // Nat Biotechnol. 2010. Vol. 28(4). P. 341–347.
146. Mabuchi K., Kusima Sh. Leukemia and A-incidence and risk / In: Effects of A-bomb radiation
on the human body // Eds. I. Shigenatsu et al. -Tokio: Harwood Academ. Publishers, Bunkodo Co.
Ltd. 1995. P. 40-44
147. Maes O.C., Sarojini H., Wang E. Stepwise up-regulation of microRNA expression levels from
replicating to reversible and irreversible growth arrest states in WI-38 human fibroblasts // Journal of
Cellular Physiology. 2009. Vol. 221. P. 109– 119.
148. Mao A., Liu Y., Zhang H., Di C., Sun C. microRNA Expression and Biogenesis in Cellular
Response to Ionizing Radiation // DNA AND CELL BIOLOGY. 2014. Vol. 33(10). P. 667–679.
149. Mar-Aguilar F., Mendoza-Ramírez J.A., Malagón-Santiago I. et al. Serum Circulating
microRNA Profiling for Identification of Potential Breast Cancer Biomarkers // Disease
Markers Volume. 2013. Vol. 34(3). P. 163-169.
150. Mario Lauria. Rank-Based miRNA Signatures for Early Cancer Detection // BioMed Research
International. 2014. Vol. 2014. P. 7.
140
151. Maroof H., Salajegheh A., Smith R.A. et
al. MicroRNA-34 family, mechanisms of action
in cancer: a review // Curr Cancer Drug Targets. 2014. Vol.14(8). P.737-751.
152. Martello G., Rosato A., Ferrari F. et.al. A MicroRNA targeting dicer for metastasis control //
Cell. 2010. Vol. 141(7). P. 1195-1207.
153. Mayr C., Hemann M.T., Bartel D.P. Disrupting the pairing between let-7 and Hmga2 enhances
oncogenic transformation // Science. 2007. Vol. 315. P. 1576– 1579.
154. Meek D.W., Anderson C.W. Posttranslational modification of p53: cooperative integrators of
function // Cold Spring Harb Perspect Biol. 2009. Vol. 1(6). a000950.
155. Meng F., Henson R., Wehbe-Janek H. et al. MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN
tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer // Gastroenterology. 2007. Vol. 133. P. 647–
658.
156. Mertens D., Philippen A., Ruppel M. et al. Chronic lymphocytic leukemia and 13q14: miRs and
more // Leuk Lymphoma. 2009. Vol. 50. P. 502–505.
157. Moll U.M., Petrenko O. The MDM2-p53 interaction // Mol Cancer Res. 2003. Vol. 1(14). P.
1001-1008.
158. Monticelli S., Ansel K.M., Xiao C. et al. MicroRNA profiling of the murine hematopoietic
system // Genome Biol. 2005. Vol. 6(8). P.R71
159. Moon K., Stukenborg G.J., Keim J. // Cancer. 2006. Vol. 107(5). P. 991-998.
160. Nadiminty N., Tummala R., Lou W. et al. MicroRNA let-7c suppresses androgen receptor
expression and activity via regulation of Myc expression in prostate cancer cells // J Biol Chem.
2012. Vol. 287(2). P.1527-1537
161. Nie K., Gomez M., Landgraf P. MicroRNA-mediated down-regulation of PRDM1/Blimp-1 in
Hodgkin/Reed-Sternberg cells: a potential pathogenetic lesion in Hodgkin lymphomas // American
Journal of Pathology. 2008. Vol. 173. P. 242– 252.
162. Nikolaev A.Y., Li M., Puskas N., Qin J., Gu W. Parc: a cytoplasmic anchor for p53 // Cell.
2003. Vol. 112(1). P. 29-40.
163. Nishida N., Yokobori T., Mimori K. et al. MicroRNA miR 125b is a prognostic marker in
human colorectal cancer // Int. J. Oncol. 2011. Vol. 38(5). P. 1437–1443.
164. Pan X., Wang Z.X., Wang R. MicroRNA-21.A novel therapeutic target in human cancer //
Cancer Biology & Therapy. 2010. Vol. 10(12). P. 1224-1232.
165. Pan Х., Wang Zh-X., Wang R. MicroRNA-21. A novel therapeutic target in human cancer //
Cancer Biology & Therapy. 2010. Vol. 10(12). Р. 1224–1232.
141
166. Patterson M. The Trouble with Smoking //
Nat Rev Genet. 2000. Vol. 1. P. 168.
167. Paul S., Amundson S.A. Development of gene expression signatures for practical radiation
biodosimetry // Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2008. Vol. 71. P. 1236-1244.
168. Pegtel D.M., Cosmopoulos K., Thorley-Lawson D.A. et al. Functional delivery of viral
miRNAs via exosomes // Proc Natl Acad Sci USA. 2010. Vol. 107(14). P. 6328–6333.
169. Pellegrino L., Jacob J., Roca-Alonso L. et al., Altered expression of the miRNA processing
endoribonuclease Dicer has prognostic significance in human cancers // Expert Rev. Anticancer
Ther. 2013. Vol. 13(1). P. 21–27.
170. Perry M.E. The Regulation of the p53-mediated Stress Response by MDM2 and MDM4 // Cold
Spring Harb Perspect Biol. 2010. Vol. 2(1). P. a000968.
171. Petitjean A., Achatz M.I., Borresen-Dale A.L., Hainaut P., Olivier M. Tp53 Mutations in
Human Cancers: Functional Selection and Impact on Cancer Prognosis and Outcomes // Oncogene.
2007. Vol. 26. P. 2157-2165.
172. Petitjean A., Achatz M.I., Borresen-Dale A.L., Hainaut P., Olivier M. Tp53 Mutations in
Human Cancers: Functional Selection and Impact on Cancer Prognosis and Outcomes // Oncogene.
2007. Vol. 26. P. 2157-2165.
173. Preston D.L., Kusumi S., Tomonaga M. et al. Cancer incidence in atomic bomb survivors. Part
III: Leukemia, lymphoma and multiple myeloma, 1950-1987 // Radiation Research. 1994. Vol. 137.
P. 68–97.
174. Purmessur N. The regulation of p53-dependent microNA expression in response to genotoxic
stress // Thesis submitted for the degree of Doctor of Philosophy at the University of Leicester. 2013
175. Purvis J.E., Karhohs K.W., Mock C. et al. p53 dynamics control cell fate // Science. 2012. Vol.
336. P. 1440–1444.
176. Qian B., Katsaros D., Lu L. et al. High miR-21 expression in breast cancer associated with poor
disease-free survival in early stage disease and high TGFbeta1 // Breast Cancer Res Treat. 2009.
Vol.117(1). P.131-140
177. Reinhart B.J., Slack F.J.,Basson M. et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental
timing in Caenorhabditis elegans // Nature. 2000. Vol. 403. P. 901– 906.
178. Robins H., Press W.H. Human microRNAs target a functionally distinct population of genes
with AT-rich 3´ UTRs // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005. Vol. 102(43). P. 15557–15562.
179. Rodin S.N., Rodin A.S. Human Lung Cancer and P53: The Interplay between Mutagenesis and
Selection // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. Vol. 97. P. 12244-12249.
142
180. Rokavec M., Li H., Jiang L., Hermeking H.
The p53/miR-34 axis in development and
disease // J Mol Cell Biol. 2014. Vol. 6(3). P.214-230.
181. Roush S., Slack F.J. The let-7 family of microRNAs // Trends in Cell Biology. 2008. Vol. 18. P.
505– 516.
182. Roxburgh P. Manipulating the p53 pathway for cancer treatment // PhD thesis, Glasgow. 2013.
183. Russo J., Mailo D., Hu Y.F., Balogh G., Sheriff F., Russo I.H. Breast differentiation and its
implication in cancer prevention // Clin Cancer Res. 2005. Vol. 11. P. 931–936.
184. Russo J., Russo I.H. et al. Biological and molecular bases of mammary carcinogenesis // Lab
Invest. 1987. Vol. 57. P. 112–137.
185. Sachdeva M., Zhu S., Wu F. p53 represses c-Myc through induction of the tumor suppressor
miR-145 // Proc Natl Acad Sci U S A.. 2009. Vol. 106(9). P.3207-3212.
186. Saini D., Shelke S., Mani Vannan A. et al. Transcription profile of DNA damage response
genes at G₀ lymphocytes exposed to gamma radiation // Mol Cell Biochem. 2012. Vol. 364(1-2). P.
271-281.
187. Saleh A.D., Savage J.E., Cao L. et al. Cellular stress induced alterations in microRNA let-7a
and let-7b expression are dependent on p53 // See comment in PubMed Commons below PLoS One.
2011. Vol. 6. P. e24429.
188. Saleh A.D., Savage J.E., Cao L. et al. Cellular stress induced alterations in microRNA let-7a
and let-7b expression are dependent on p53 // PLoS One. 2011. Vol. 6. P. e24429.
189. Sampson V.B., Rong N.H., Han J. MicroRNA let-7a down-regulates MYC and reverts MYCinduced growth in Burkitt lymphoma cells // Cancer Research. 2007. Vol. 67. P. 9762– 9770.
190. Sandberg R., Neilson J.R., Sarma A., Sharp P.A., Burge C.B. Proliferating cells express
mRNAs with shortened 3′untranslated regions and fewer microRNA target sites // Science. 2008.
Vol. 320. P. 1643–1647.
191. Sasaki A., Udaka Y., Tsunoda Y. et al. Analysis of p53 and miRNA expression after
irradiation of glioblastoma cell lines // Anticancer Res. 2012. Vol. 32. P. 4709-4713.
192. Sathyan P., Golden H.B., Miranda R.C. Competing interactions between micro-RNAs
determine neural progenitor survival and proliferation after ethanol exposure: evidence from an ex
vivo model of the fetal cerebral cortical neuroepithelium // J. Neurosci. 2007. Vol. 27. P. 8546–8557.
193. Saunders M.A, Liang H., Li W.H. Human polymorphism at microRNAs and microRNA target
sites // PNAS. Vol. 104(9). P. 3300–3305
143
194. Schlaeger C., Longerich T., Schiller C. et
al. Etiology-Dependent Molecular Mechanisms
in Human Hepatocarcinogenesis // Hepatology. 2008. Vol. 47(2). Р.511-520
195. Schwarzenbach H., Hoon D.S., Pantel K. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer
patients // Nat Rev Cancer. 2011. Vol. 11(6). P. 426–437.
196. Selbach M., Schwanhausser B., Thierfelder N. et al. Widespread changes in protein synthesis
induced by microRNAs // Nature. 2008. Vol. 455(7209). P. 58–63.
197. Serrano M., Collado M. Senescence in tumours: evidence from mice and humans // Nat Rev
Cancer. 2010. Vol. 10. P. 51–57.
198. Shackleton M., Vaillant F., Simpson K.J. et al. Generation of a functional mammary gland from
a single stem cell // Nature. 2006. Vol. 439. P. 84–88.
199. Sheedy F.J. Turning 21: induction of miR-21 as a key switch in the inflammatory response //
Front. Immunol. 2015. P.6-19.
200. Shellabarger C.J., Bond V.P., Cronkite E.P. Studies on radiation-induced mammary gland
neoplasia in the rat. 4. The response of females to a single dose of sublethal total-body gamma
radiation as studied until the first appearance of breast neoplasia or death of the animals // Radiat.
Res. 1960. Vol. 13. P. 242–249.
201. Shukla S., Sumaria C.S., Pradeepkumar P.I. Exploring chemical modifications for siRNA
therapeutics: a structural and functional outlook // ChemMedChem. 2010. Vol. 5(3). P. 328–349.
202. Si M.L., Zhu S., Wu H., Lu Z., Wu F., Mo Y.Y. miR-21-mediated tumor growth // Oncogene.
2007. Vol. 26. P. 2799–2803.
203. Siegwart D.J., Whitehead K.A., Nuhn L. et al. Combinatorial synthesis of chemically diverse
core-shell nanoparticles for intracellular delivery // Proc Natl Acad Sci USA. 2011. Vol. 108(32). P.
12996–13001.
204. Smith G.H. Experimental mammary epithelial morphogenesis in an in vivo model: evidence for
distinct cellular progenitors of the ductal and lobular phenotype // Breast Cancer Res. Treat. 1996.
Vol. 39. P. 21–31.
205. Soderholml A.L., Pukkala E., Lindqvist C., Teppo L. // Br. J. Cancer. 1994. Vol. 69. P. 784787.
206. Sui G., Affar el B., Shi Y. et al. Yin Yang 1 is a negative regulator of p53 // Cell. 2004. Vol.
117(7). P. 859-872.
207. Sundaram P., Hultine S., Smith L.M. et al. p53 responsive miR 194 inhibits thrombospondin-1
and promotes angiogenesis in colon cancers // Cancer Res. 2011. Vol. 71(24). P. 7490–7501.
144
208. Suzuki H.I., Yamagata K., Sugimoto K. et
al. Modulation of microRNA processing by p53
// Nature. 2009. Vol. 460(7254). P. 529–533.
209. Swarbrick A., Woods S.L., Shaw A. et al. miR-380-5p represses p53 to control cellular survival
and is associated with poor outcome in MYCN-amplified neuroblastoma // Nat Med. 2010. Vol.
16(10). P. 1134–1140.
210. Takagi M., Absalon M.J., McLure K.G., Kastan M.B. Regulation of p53 translation and
induction after DNA damage by ribosomal protein L26 and nucleolin // Cell. 2005. Vol. 123. P. 49–
63.
211. Takamizawa J., Konishi H., Yanagisawa K. et al. Reduced expression of the let-7 microRNAs
in human lung cancers in association with shortened postoperative survival // Cancer Research. 2004.
Vol. 64. P. 3753– 3756.
212. Thompson H.J., Singh M. Rat models of premalignant breast disease // J. Mammary Gland Biol.
Neoplasia. 2000. Vol. 5. P. 409–420.
213. Thomson J.M., Newman M., Parker J.S. et al. Extensive post-transcriptional regulation of
microRNAs and its implications for cancer // Genes Dev. 2006. Vol. 20. P. 2202–2207.
214. Tokumaru S., Suzuki M., Yamada H. Let-7 regulates Dicer expression and constitutes a
negative feedback loop // Carcinogenesis. 2008 . Vol. 29. P. 2073– 2077.
215. Toledo F., Wahl G.M. Regulating the P53 Pathway: In Vitro Hypotheses, in Vivo Veritas // Nat
Rev Cancer. 2006. Vol. 6. P. 909-923.
216. Trang P., Wiggins J.F., Daige C.L. et al. Systemic delivery of tumor suppressor microRNA
mimics using a neutral lipid emulsion inhibits lung tumors in mice // Mol Ther. 2011. Vol. 19(6). P.
1116–1122.
217. Tsai K.K., Chuang E.Y., Little J.B., Yuan Z.M. Cellular mechanisms for low-dose ionizing
radiation-induced perturbation of the breast tissue microenvironment // Cancer Res. 2005. Vol. 65. P.
6734–6744.
218. Tsang W.P., Kwok T.T. Let-7a microRNA suppresses therapeutics-induced cancer cell death by
targeting caspase-3 // Apoptosis. 2008. Vol. 13. P. 1215– 1222.
219. Valentin-Vega Y.A., Barboza J.A., Chau G.P., El-Naggar A.K., Lozano G. High Levels of the
P53 Inhibitor Mdm4 in Head and Neck Squamous Carcinomas // Hum Pathol. 2007. Vol. 38. P.
1553-1562.
220. Van’t Veer L.J., Dal H., van de Vijver M.J. et al. // Nature. 2002. Vol. 415. Р. 530-536.
221. Viswanathan S.R.,Daley G.Q., Gregory R.I. Selective blockade of microRNA processing by
lin-28 // Science. 2008 . Vol. 320. P. 97– 100.
145
222. Vogelstein B., Lane D., Levine A.J.
Surfing the P53 Network // Nature. 2000. Vol.
408. P. 307-310.
223. Volinia S., Calin G.A., Liu C.G. et al. A microRNA expression signature of human solid tumors
defines cancer gene targets // Proc Nat Acad Sci USA. 2006. Vol. 103(7). P. 2257–2261.
224. Volinia S., Calin G.A., Liu C.G. et al. A microRNA expression signature of human solid tumors
defines cancer gene targets // Proc Natl Acad Sci USA. 2006. Vol. 103. P. 2257-2261.
225. Wagner W., Horn P., Castoldi M. et al. Replicative senescence of mesenchymal stem cells: a
continuous and organized process // PLoS ONE. 2008. Vol. 3. P. 2213.
226. Wang Y., Zhang Y., Pan C., Ma F., Zhang S. Prediction of Poor Prognosis in Breast
Cancer Patients Based on MicroRNA-21 Expression: A Meta-Analysis // PLoS One. 2015. Vol.
10(2). P. e0118647.
227. Wang Y.V., Leblanc M., Wade M., Jochemsen A.G., Wahl G. Increased radioresistance and
accelerated B cell lymphomas in mice with MDMX mutations that prevent modifications by DNAdamage-activated kinases // Cancer Cell. 2009. Vol. 16. P. 33–43.
228. Waning D.L., Lehman J.A., Batuello C.N., Mayo L.D. Controlling the MDM2-Mdmx-p53
Circuit // Pharmaceuticals (Basel). 2010. Vol. 3(5). P. 1576-1593.
229. Ward J.M., Rehm S., Reynolds C.W. Pathology of tumours in laboratory animals. Tumours of
the rat. Tumours of the haematopoietic system: IARC // Sci Publ. 1990. P. 625-657.
230. Weidhaas J.B., Babar I., Nallur S.M. et al. MicroRNAs as potential agents to alter
resistance to cytotoxic anticancer therapy // Cancer Res. 2007. Vol. 67. P. 11111-11116.
231. Westphal C.H. Hoyes K.P., Canman C.E. et.al. Loss of atm radiosensitizes multiple p53 null
tissues // Cancer Res. 1998. Vol.58(24). P.5637-5639.
232. Willers H., Held K.D. Introduction to clinical radiation biology // Hematol Oncol Clin
North Am. 2006. Vol. 20. P. 1-24.
233. Wu N., Lin X. et.al. MiR-125b acts as an oncogene in glioblastoma cells and inhibits cell
apoptosis through p53 and p38MAPK-independent pathways // British Journal of Cancer. 2013. Vol.
109. P. 2853–2863.
234. Xie L., Zhou J., Zhang S. et al. Integrating microRNA and mRNA expression profiles in
response to radiation-induced injury in rat lung Radiation // Oncology. 2014. Vol. 9(1). P. 111.
235. Xing L., Todd N.W., Yu L. et al. Early detection of squamous cell lung cancer in sputum by a
panel of microRNA markers // Mod Pathol. 2010. Vol. 23(8). P. 1157–1164.
146
236. Xu N., Papagiannakopoulos T., Pan G.,
Thomson J.A., Kosik K.S. MicroRNA-145
regulates OCT4, SOX2, and KLF4 and represses pluripotency in human embryonic stem cells //
Cell. 2009. Vol. 137(4). P. 647–658.
237. Xu N., Papagiannakopoulos T., Pan G., Thomson J.A., Kosik K.S. MicroRNA-145 regulates
OCT4, SOX2, and KLF4 and represses pluripotency in human embryonic stem cells // Cell. 2009.
Vol. 137(4). P. 647–658.
238. Yan H.L., Xue G., Mei Q. et al. Repression of the miR 17-92 cluster by p53 has an important
function in hypoxia-induced apoptosis // EMBO J. 2009. Vol. 28(18). P. 2719–2732.
239. Yokoro K., Seyama T., Yanagihara K. Experimental radiation carcinogenesis in rodents. //
Cancer in atomic bomb survivors. In A. Kagan, and I. Shigematsu, eds. 1986. P. 89-112.
240. Yu C.C., Tsai L.L., Wang M.L., et.al. miR145 targets the SOX9/ADAM17 axis to inhibit
tumor-initiating cells and IL-6-mediated paracrine effects in head and neck cancer // Cancer
Res. 2013. Vol. 73. P. 3425–3440.
241. Yu J., Vodyanik M.A., Smuga-Otto K. et al. bInduced pluripotent stem cell lines derived from
human somatic cells // Science. 2007. Vol. 318. P. 1917– 1920.
242. Yuan A., Farber E.L., Rapoport A.L. et al. Transfer of microRNAs by embryonic stem cell
microvesicles // PLoS One. 2009. Vol. 4(3). P. e4722.
243. Zhang H., Lee J.Y., Tian B. Biased alternative polyadenylation in human tissues // Gеnome
Biol. 2005. Vol. 6. P. 100.
244. Zhang H.L., Yang L.F., Zhu Y. et al. Serum miRNA-21: elevated levels in patients with
metastatic hormone-refractory prostate cancer and potential predictive factor for the efficacy of
docetaxel-based chemotherapy // Prostate. 2011. Vol. 71(3). P. 326-331.
245. Zhang J., Sun Q., Zhang Z. et al. Loss of microRNA-143/145 disturbs cellular growth and
apoptosis of human epithelial cancers by impairing the MDM2–p53 feedback loop // Oncogene.
2013. Vol.32(1). P.61-9.
246. Zhang J., Sun Q., Zhang Z., Ge S., Han Z., Chen W. Loss of microRNA-143/145 disturbs
cellular growth and apoptosis of human epithelial cancers by impairing the MDM2-p53 feedback
loop // Oncogene. 2013. Vol. 32. P. 61–69.
247. Zhang J., Wang Y., Chen X. et.al. MiR-34a suppresses amphiregulin and tumor metastatic
potential of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) // Oncotarget. 2015. Vol. 10 (6).
P. 7454–7469.
248. Zhao L., Bode A.M., Cao Y., Dong Z. Regulatory mechanisms and clinical perspectives of
miRNA in tumor radiosensitivity // Carcinogenesis 2012. Vol. 33. P. 2220–2227.
147
249. Zhu H., Dougherty U., Robinson V. et al.
EGFR signals downregulate tumor suppressors
miR 143 and miR 145 in western diet-promoted murine colon cancer: role of G1 regulators // Mol.
Cell. Proteomics. 2011. Vol. 9(7). P. 960–975.
250. Zhu S., Wu H., Wu F., Nie D., Sheng S., Mo Y.Y. MicroRNA-21 targets tumor suppressor
genes in invasion and metastasis // Cell Res. 2008. Vol. 18. P. 350–359.
251. zur Hausen H. Papillomaviruses and cancer:from basic studies to clinical application // Nat Rev
Cancer. 2002. Vol. 2. P. 342–50.
148
БЛАГОДАРНОСТИ
Автор благодарит научного руководителя Михайлова В.Ф. и сотрудников лаборатории
молекулярной биологии и генетики радиационных эффектов ФМБЦ имени А.И.Бурназяна за
неоценимую помощь в выполнении исследований.