МАЛДИ спектроскопия сложных соединений

Методическое пособие
МАЛДИ спектроскопия сложных соединений.
Ходорковский М.А.
Лазерная десорбционная ионизация в присутствии матрицы (Matrix Assisted Laser
Desorption/Ionisation – MALDI) была открыта независимо Ф.Хилленкампом с М. Карасом1
и К.Танаке 2 в 1988 году как метод, позволяющий переводить высокомолекулярные,
труднолетучие, нестабильные молекулы в газовую фазу в виде неповрежденных ионов.
Метод заключается в облучении короткими лазерными импульсами образца,
представляющего собой твердый раствор анализируемого соединения в органической
матрице. Матрица выбирается таким образом, чтобы ее молекулы активно поглощали
фотоны, эмитируемые УФ- или ИК-лазером. Над поверхностью образца создается плотная
высокотемпературная плазма, в которой наряду с молекулами и ионами матрицы
оказываются и молекулы анализируемого соединения. Ионизация последних путем
поглощения энергии фотонов или в результате ионно-молекулярных реакций приводит к
образованию положительных и отрицательных ионов, которые выталкиваются высоким
потенциалом из области ионизации и направляются в анализатор.
Метод характеризуется интенсивными пиками молекулярных ионов разного типа и
низкой фрагментацией. В настоящее время методом МАЛДИ успешно анализируются
пептиды, белки, нуклеотиды, полисахариды, синтетические полимеры, гуминовые
кислоты, фуллерены, органические комплексные соединения и другие натуральные
продукты с молекулярными массами до нескольких сотен тысяч Дальтон. Важнейшими
параметрами метода являются природа матрицы, количественное соотношение матрица/
анализируемое соединение, способ приготовления образца, длина волны, долгота
импульса и мощность лазерного излучения.
Обычно, в МАЛДИ эксперименте используется ультрафиолетовый азотный лазер с
длиной волны 337 нм, с длиной импульса от десятых до единиц наносекунд и мощностью
лазерного излучения в диапазоне 106-107 Вт/см2.
Чаще всего метод МАЛДИ используется во времяпролетных масс-спектрометрах
(time-of-flight mass spectrometers TOF-MS). Необходимое условие для работы такого массспектрометра – это наличие высокого вакуума. Давление 10-6 -10-8 Торр является
типичным для времяпролетных масс спектрометров.
Основы масс-спектрометрии 3.
Масс-спектрометрия является физико-химическим методом анализа,
заключающимся в переводе молекул образца в ионизированную форму с последующим
разделением и регистрацией образующихся при этом положительных или отрицательных
ионов. Масс- спектр позволяет сделать выводы о молекулярной массе соединения, его
составе и структуре.
В случае графического изображения масс-спектра (масс-спектр может быть
представлен и в виде таблицы) по оси абсцисс откладывается величина отношения массы
иона к его заряду (m/z), а по оси ординат – их интенсивности, т.е. относительное
количество ионов данного вида. В качестве единицы размерности массы в массспектрометрии используются атомные единицы массы (а.е.м.) или Дальтоны (Да),
которые определяются как 1/12 массы атома 12С. Так как большинство ионов несет
единичный заряд, то термин «отношение массы иона к его заряду» обычно заменяется
«массой». (Это справедливо только для однозарядных ионов, которые обычно
реализуются в методе МАЛДИ, но не для двух и более зарядных ионов. Например, для
молекулы с весов 1000 Да, соответствующий ей однозарядный ион [M+H]+ появится в
спектре при 1001 Да, но дважды заряженный ион той же молекулы [M+2H]2+ будет
появляться при 501 Да).
Масс-спектрометр состоит из пяти главных компонентов: ввода образца, ионного
источника, анализатора масс, детектора и прибора для регистрации спектра. В
современных приборах управление всеми операциями, а также обработку результатов
осуществляет компьютер.
Основные принципы времяпролетного масс-спектрометра.
При лазерном облучении образца внутри ионного источника образуются
газообразные ионы. Затем все ионы ускоряются приложением электростатического поля,
приобретая, в идеале, ту же самую кинетическую энергию, и выталкиваются в бесполевое
пространство (область дрейфа), где физически разделяются друг от друга на основе их
отношений массы к заряду (m/z). Специальный детектор регистрирует время прибытия и
интенсивности сигналов групп масс разрешенных ионов. При фиксированной
кинетической энергии ионы с малыми массами двигаются быстрее ионов с большими
массами. Ионы матрицы и легкие пептиды приходят к детектору первыми, а затем более
тяжелые протеины, в соответствии с увеличением отношения m/z.
Ekin = U ⋅ z ⋅ e =
1 2
mv
2
, где
Еkin – полная кинетическая энергия, U – ускоряющий электростатический потенциал,
v – скорость, которую приобретают ионы с отношением масса/заряд - m/z.
Этот результат является фундаментальным отношением между отношением массы к
заряду и временем пролета иона.
Это простое отношение позволяет определять массы ионов из их времени пролета
после калибровки прибора.
Простейшей конфигурацией времяпролетного масс-спектрометра является его
линейная мода.
Рис.1
Все десорбированные ионы ускоряются на коротком расстоянии d при помощи
электрического поля U/d . Ионы массой m и количеством z элементарных зарядов е
ускоряются силой:
, где асс – ускорение, зависящее от
массы. Время пролета tacc за время ускорения можно вычислить из:
, где d – расстояние между мишенью образца,
находящейся при ускоряющем потенциале U и заземленной ускоряющей сеткой.
Время дрейфа иона tdrift во времяпролетной трубе длиной L между ионным источником и
детектором:
Тогда полное время пролета иона внутри линейного времяпролетного масс-спектрометра
есть сумма этих двух времен:
Если точные значения d и L неизвестны, то уравнение можно привести к виду:
, что является уравнением
времяпролетного масс-спектрометра.
Реально измеренное время tmeas всегда немного отличается от реального времени
пролета treal из-за существования времени задержки t0,lin детектирующей электроники
(Обычно, для регистрации сигнала используются высокоскоростные детекторы на основе
микроканальных пластин и АЦП, регистрирующие спектры со скоростью 5х108
измерений в секунду и лучше).
Если известны времена пролета и массы двух ионов, то эти данные могут быть
использованы для получения калибровочной функции с двумя постоянными калибровки:
, где const(U) есть
калибровочная постоянная пропорциональная ускоряющему напряжению.
Ограничением применения линейных масс-спектрометров является их
относительно низкое разрешение по массам из-за разброса ионов с одной массой по
времени, по скорости (энергии) и в пространстве.
Использование импульсных лазеров для генерирования ионов позволяет
достаточно эффективно работать на линейных времяпролетных приборах, так как в этом
случае время создания ионов ограничивается длительностью импульса, т.е. разброс ионов
по времени имеет конечное значение, причем, чем короче импульс, тем меньше разброс.
Разброс по энергиям связан с тем, что ионы, образующиеся при облучении образца
лазерным излучением, двигаются от мишени со скоростями ~200-1000 м/с, и ионы
имеющие то же соотношение массы к заряду будут иметь различные начальные скорости
и различную кинетическую энергию ∆Ekin до 100eВ. Начальные скорости ионов зависят от
материала матрицы и от мощности лазерного излучения. В результате полная энергия
движения ионов в области дрейфа будет (Ekin ± ∆Ekin).
Пространственный разброс связан с тем, что ионы в источнике находятся не на
одной линии, а занимают конкретный объем. Часть их оказывается ближе к сетке, а часть
дальше. Если обозначить это отклонение в пространстве ∆d, и, учитывая, что U=E*d (где
Е- напряженность электрического поля), то получается, что энергия ионов в области
дрейфа равна eE(d ± ∆d), что так же приводит к разбросу по энергиям и, следовательно, к
уширению сигнала и потери разрешения.
В методе МАЛДИ происходит генерирование ионов с поверхности, в результате
устраняется не только разброс образования ионов во времени, но и в большой степени
пространственный разброс, наблюдающийся при использовании методов ионизации
молекул в газовой фазе.
Для устранения разброса по энергиям и повышения разрешающей способности
линейных анализаторов был предложен метод времени задержки выталкивания ионов из
источника 4. В этом методе образец облучается импульсным лазерным излучением в
отсутствии выталкивающего электрического поля. В течение времени задержки ионы
дрейфуют с начальной скоростью, полученной в процессе десорбции. Ионы с большей
скоростью дрейфуют быстрее ионов, обладающих меньшей скоростью, и, следовательно,
перемещаются дальше от точки десорбции. После некоторого времени задержки (tdelay)
прикладываемое импульсное напряжение создает электрическое поле и ускоряет ионы. В
результате ионы с меньшей начальной скоростью оказываются в точке с большей
напряженностью электрического поля, получают больше энергии от электрического поля
и достигают детектор в то же время, что и ионы с большей начальной скоростью, но
получившие меньшее ускорение, при условии, что время задержки и величина
электрического импульса выбраны правильно. В целом, если условия поведения
эксперимента поддерживаются постоянными, то
•
Оптимальное время задержки зависит от m/z, т.е. эффективная фокусировка
ионов в области детектора осуществляется только для узкого диапазона m/z.
Для фокусировки ионов с более высокими массами (~20000Да) требуется
увеличение времени задержки. Для ионов низких и средних масс (100010000 Да) время задержки приблизительно пропорционально
•
m z.
Ионы с большими массами будут лучше фокусироваться с увеличением
амплитуды выталкивающего импульса при сохранении постоянным времени
задержки.
•
Время задержки уменьшается с увеличением амплитуды выталкивающего
импульса.
Так как область масс, которые можно сфокусировать, расширяется при увеличении
амплитуды выталкивающего импульса, то полезно выбирать самое большое значение
выталкивающего импульса и самое короткое время задержки, которые поддерживаются
спектрометром в интересуемой области масс.
Революционным решением проблемы улучшения разрешения спектрометров (для
области малых и средних масс) стало использование отражателя (рефлектрона, ионного
зеркала), предложенное Б.А.Мамыриным 5.
Времяпролетный масс-спектрометр с рефлектроном.
Рис.2
В рефлектроне при помощи электростатического поля ионы отражаются под
небольшим углом в направлении детектора рефлектрона. Из группы ионов с одной массой
частицы с большей кинетической энергией проникают глубже внутрь отражающего поля
рефлектрона, тем самым, затрачивая больше времени на замедление и последующее
ускорение. Первыми достигая ионного зеркала, они последними покидают его и догоняют
более медленные ионы в фокальной плоскости, в которой располагается детектор.
Такой принцип приводит к значительному увеличению разрешения
времяпролетных приборов с рефлектроном по сравнению с линейными спектрометрами и
увеличивает точность определения масс. Сперва появились рефлектроны с одним
однородным отражающим полем (одноступенчатые рефлектроны). В них достигалась
фокусировка по энергии только первого порядка, для получения второго порядка
фокусировки, который необходим для высокого разрешения при большом энергетическом
разбросе, используются двухступенчатые рефлектроны, в которых прикладывается второе
однородное поле. В таком рефлектроне ионы замедляются на первой ступени рефлектрона
и отражаются и точно фокусируются на второй ступени 6.
Так же как и для линейной конфигурации, отношение массы к заряду может быть
вычислено из времени пролета.
, где const(U,UR) –
калибровочная постоянная, зависящая от напряжений ускорения и рефлектрона и t0,reflect время задержки детектирующей электроники в моде рефлектрона.
Рефлектроны, в отличие от метода времени задержки, дают фокусировку, которая
не зависит от массы. Однако они не могут быть использованы для анализа больших
протеинов, так как метастабильный распад ионов усложняет вид времяпролетного
спектра: пики уширяются, изменяется их форма (появляются горбы и плечи на склонах
пиков), появляются дополнительные пики от фрагментных ионов. Метастабильные ионы
– это ионы, которые образуются из возбужденного молекулярного иона во время его
полета в бесполевом пространстве. Такие ионы имеют ту же скорость, что и родительские,
но меньшую массу и, следовательно, меньшую кинетическую энергию. В результате они
находятся в отражающем поле рефлектрона меньшее время и приходят на детектор
раньше родительских ионов, но позже ионов, обладающих той же массой с самого начала.
Меняя напряжение рефлектрона можно зарегистрировать все фрагментные ионы и
получить их массы. На этом принципе основан метод Post Source Decay7.
Рефлектроны также имеют меньшую чувствительность и хуже отношение сигнала
к шуму по сравнению с линейной модой.
Чувствительность времяпролетного МАЛДИ спектрометра определяется
минимальным количеством молекул образца, которое еще дает детектируемый ионный
сигнал в масс-спектре. Обычно чувствительность находится в диапазоне наномолей для
малых пептидов (доходит до фемтомолей) и в диапазоне микромолей для более тяжелых
протеинов. Чувствительность прибора сильно зависит от качества приготовления образца.
Разрешение – это возможность различать ионы с разными отношениями заряда к
массе. Возможность различать один от другого два иона с похожими отношениями m/z
прямо связана с возможностью разделить два пика, соответствующие этим ионам, в массспектре. Обычно разрешение определяется как R=m/∆m, где ∆m-разность масс между
соседними пиками, которые разрешены и m-масса первого пика (или средняя масс двух
пиков). Хотя это определение дано для двух пиков, возможно определять разрешение и
для одного пика, как это делается в случае МАЛДИ времяпролетных измерений. В этом
случае ∆m – это ширина пика на половине высоты пика соответствующей массы.
Разрешение времяпролетного масс-спектрометра определяется как
m
1 t
= ⋅ , где m∆m 2 ∆t
масса или m/z иона, ∆m – это ширина пика на половине высоты, t – время пролета иона, ∆t
- полная ширина сигнала на половине высоты. Это выражение следует из уравнения
времяпролетного спектрометра.
Как упоминалось выше, разрешающая способность времяпролетных масс-спектрометров
ограничена, в основном, тремя параметрами:
1. Распределения времени ионизации и времени детектирования ∆tI,D: они обычно не
изменяются при данных условиях эксперимента, их влияние уменьшается с
увеличением времени полета, т.е. для более высоких масс, большей области дрейфа
L или меньшей величины ускоряющего потенциала U:
2. Из модели распространения сверхзвуковой струи, применяемой для описания
десорбции нейтралей, в которой все десорбируемые молекулы имеют одинаковую
скорость v и распределение скорости ∆v, следует, что начальное (термическое)
распределение скорости приводит к дополнительной относительной ошибке (‘turnaround-time”):
, где U/d есть напряженность поля
в области локализации молекулы. Влияние m и U обратно по сравнению с ошибкой от
разброса по времени ионизации и детектирования.
3. Энергетическое распределение, обусловленное начальной скоростью и разбросом
положения места ионизации внутри ионного источника, постоянно и не зависит от
массы и длины дрейфа:
⎛ ∆t ⎞
⎛ ∆E ⎞
⎜ ⎟ = CE ⋅ ⎜
⎟
⎝ t ⎠E
⎝U ⎠
Полная относительная ошибка может быть вычислена по следующей формуле для
линейной моды спектрометра:
и
для моды рефлектрона, где
относительной ошибкой обусловленной энергетическим распределением можно
пренебречь по сравнению с двумя другими факторами из-за фокусирующих свойств
рефлектрона.
На практике разрешение зависит от конструкции прибора, типа образца, процедуры
приготовления образца и мощности лазера, которая используется:
•
Однородное распределение на мишени малых кристаллов образца обычно дает
наилучшие результаты, также важна высокая чистота материала матрицы.
•
Обычно используется мощность лазерного излучения, немного превосходящая
порог появления ионов. Использование лазерного излучения большой мощности
следует избегать, так как это вызывает 1) разрушение образца, что увеличивает
образование фрагментных ионов и 2) изменяет место положения образования
ионов в источнике, что приводит к смещению центра тяжести регистрируемой
массы в область более высоких масс. Оба эти эффекта приводят к уменьшению
интенсивности сигнала, неправильному положению центра масс пика и уменьшают
разрешение.
Типичное разрешение для времяпролетного МАЛДИ спектрометра, работающего в
линейной моде, есть 5000 - 6000, а в моде рефлектрона оно достигает значений в три четыре раза больших.
Важной характеристикой масс-спектрометров также является точность, с которой
можно определить массу. Точность определения масс зависит от типа образца,
конструкции спектрометра, процедуры приготовления образца и метода калибровки оси
масс прибора. Точность определения массы обычно определяется как относительная
ошибка в процентах (%) или в «частях на миллион» (ppm). Например, моноизотопная
масса пептида брадикинина есть 1060.5692 Да, и если для него была померена масса
1060.6201Да, то точность измерения массы будет:
(1060.6201-1060.5692)/1060.5692 = 4.8x10-5 or 48 ppm or 0.005%
Сейчас современные приборы дают возможность получать спектры масс с точностью,
лежащей в области десятков и единиц ррм.
На точность определения масс сильно влияет разрешение прибора. Ниже
приведены два спектра протонированного иона пептида брадикинина (суммарная
формула: C50H73N15O11), которые были получены с разрешением m/∆m равным 1000 и
5000.
Рис. 3а
Рис. 3б
Такие сложные формы спектров связаны с тем, что большинство существующих в
природе элементов имеют более одного изотопа. Профиль пика на рис.3а определяется
суммарным
вкладом
соответствующие
распределения
изотопному
изотопа
распределению
13
С,
тогда
разделены
как
на
на
рис.3б
отдельные
пики,
сигналы
(расстояние между пиками составляет примерно 1 Да, что соответствует разнице масс
между изотопами С12 и С13). Более тяжелые изотопы азота и кислорода тоже вносят вклад
в изотопное распределение, но наибольший вклад дает изотоп
13
С, так как в
высокомолекулярных соединениях более 50% молекулярной массы вещества приходится
на углерод, а также изотоп 13С имеет наибольшую вероятность распространения. Первый
пик на Рис.3б соответствует моноизотопной массе иона. Моноизотопная масса – это
масса, рассчитанная суммированием точных атомных масс наиболее распространенных
(легких) изотопов элементов (т.е. только один изотоп каждого элемента включается в
полную массу). Моноизотопные массы определяются восьмью – девятью значащими
цифрами. Так как моноизотопная масса брадикинина - 1060.5692 Дa, то точность ее
определения 0.1ррм, а средняя масса (сумма средних атомных весов всех элементов иона)
- 1061.24Да (шесть значащих цифр) и точность ее определения ограничивается 100 ррм.
С увеличением массы органической молекулы увеличивается вероятность
присутствия изотопов 13С и тяжелых изотопов других элементов. Вероятность
распространения изотопа 13С в природе более 1%, т.е. для любых 100 атомов углерода
один из них будет 13С. Брадикинин содержит 50 атомов углерода, и как видно из рис.3б,
приблизительно 40% молекул брадикинина содержат изотоп 13С. Вероятность того, что в
молекуле, содержащей 50 атомов углерода, будет 0 атомов 13С – около 60%, 1 атом 13С –
около 30%, 2 атома – около 10 %. Когда количество углеродов увеличится до 131, как в
пептиде мелиттин, вероятность того, что каждая молекула будет иметь изотоп 13С,
становится больше 100% , и пик 13С становится наиболее интенсивным в спектре (см.
Рис.4). Молекулы инсулина и цитохрома С имеют 254 и 558 атомов углерода, для них
моноизотопные пики будут иметь относительные интенсивности 15% и 0.03%
соответственно. Как видно, с увеличением массы относительная интенсивность
моноизотопного пика уменьшается, и получить сигнал от него становится трудным. В
этом случае лучше использовать среднюю массу. На рис.4 приведены изотопные
распределения и усредненные профили для мелиттина, и цитохрома С, снятые с разными
разрешениями.
Средняя масса
Моноизотопная
масса
Средняя масса
Интенсивность, отн.ед.
Интенсивность, отн.ед.
Моноизотопная
масса
Рис.4
Обычно величина разрешения, необходимого для того, чтобы получить изотопное
распределение в спектре, с перекрыванием изотопных пиков на высоте ~10% от полной
высоты, определяется как удвоенное значение m/z, т.е. для разделения изотопов иона с
массой 10000 Да необходимо разрешение m/∆m равное 20000. Эта величина, в настоящее
время, является предельной для времяпролетных масс-спектрометров.
Калибровка.
Калибровка масс-спектрометра – это важнейший шаг для определения молекулярного
веса иона неизвестного образца. Калибровка времяпролетных масс-спектрометров
основана на использовании основного уравнения: t ∝ m , или
z
m/z = At2+B
Обычно для определения калибровочных постоянных А и В измеряются времена прилета
ионов двух стандартных веществ, массы ионов которых хорошо известны. Существует
два вида калибровки: внутренняя и внешняя.
При внутренней калибровке один или более стандартных веществ смешиваются с
неизвестным веществом. Эта смесь затем смешивается с раствором матрицы для МАЛДИ
анализа. В идеале стандарты выбираются так, чтобы их массы были выше и ниже массы
исследуемого вещества. Один стандарт также может использоваться для калибровки, если
он дает в спектре интенсивные пики как от однократно заряженных ионов, так и от
двукратно заряженных ионов.
При внешней калибровке приготовление стандартов и образца проводится
раздельно. Сперва регистрируется масс спектр стандартов, а затем без изменения какихлибо параметров записывается спектр неизвестного вещества. Очень важно, чтобы все
параметры эксперимента, которые могут влиять на изменение времени полета ионов,
оставались неизменными. Константы калибровки вычисляются из спектра стандартов и
применяются к неизвестному спектру.
Казалось бы, что точность определения масс для обоих методов должна быть
одинаковой, если все параметры поддерживаются постоянными. Но небольшие отличия в
лазерной мощности и в приготовлении образцов могут изменить процесс десорбции и,
следовательно, уменьшать точность измерения для внешней калибровки по сравнению с
внутренней. Использование внутренней калибровки тоже имеет свои недостатки.
Например, концентрация внутренних стандартов должна подбираться таким образом,
чтобы интенсивности сигналов всех компонентов находились в одном динамическом
диапазоне. Может оказаться необходимым сделать несколько проб с различными
концентрациями стандартов. Также внутренние стандарты могут мешать ионизации
исследуемого вещества. В случае, когда скорость получения результата и расход
материалов образца являются критичными предпочтительнее использовать внешнюю
калибровку. В случае, когда концентрации подобраны правильно и стандарты не
подавляют ионизацию исследуемого образца (и не взаимодействуют с ним), внутренняя
калибровка является более точным методом, так как исключаются всевозможные
флуктуации, связанные с нестабильностью инструмента.
Важность матрицы.
Для того чтобы десорбировать нелетучую и термонестабильную молекулу
неповрежденной, необходимо ввести энергию в систему так, чтобы предотвратить
термический распад. Для этих целей идеально подходит лазер, характеризуемый
короткими импульсами света высокой интенсивности. До открытия метода МАЛДИ
исследуемые образцы напрямую подвергались воздействию лазерным излучением для
перевода их в газовую фазу (лазерная десорбция) для масс-спектрометрического анализа.
Однако этот метод позволяет исследовать только низкомолекулярные соединения, так как
энергия, необходимая для десорбции ионов, приводит и к фрагментации молекул.
Введение матрицы в эксперимент позволяет решить эту проблему:
Матрица сильно поглощает лазерное излучение на длине волны, на которой
исследуемый образец имеет только слабое поглощение; термическая релаксация
возбужденных молекул матрицы приводит к испарению матрицы и в то же время
переводит нелетучие молекулы образца в газовую фазу без значительного возбуждения и
фрагментации.
Введение матрицы уменьшает количество межмолекулярных связей кроме связей
между молекулами матрицы и образца, так как берется избыток матрицы по сравнению с
анализируемым веществом. Что приводит к уменьшению энергии десорбции.
Матрица является как источником протонов (регистрация положительных ионов),
так и депротонирующим агентом (регистрация отрицательных ионов) в фазе твердого
раствора или в газовой фазе и, следовательно, играет важную роль в процессе образования
ионов.
Все эти эффекты необходимы успешного применения метода МАЛДИ, и их
объединение приводит к большому выходу неповрежденных ионов молекул образца8 и
увеличению чувствительности метода до субпикомольного диапазона.
Итак, основные требования к материалу матрицы заключаются в его высокой
способности поглощать лазерное излучение; кристаллизоваться с включением в структуру
молекул анализируемого вещества; инертности по отношению к анализируемому
веществу; хорошей растворимости в растворителях, используемых для растворения
образца; низкой летучести в условиях вакуума.
Чаще всего в качестве матриц используются твердотельные (в виде порошков)
слабые органические кислоты. Наиболее широкое применение нашли синапиновая
кислота (SA) – для исследования пептидов и больших протеинов (10-150 кДа), альфациано-4-гидроксикоричная кислота (CHCA) – для пептидов (<10 кДа), лепидов и
углеводов и 2,5-дигидроксибензойная кислота (DHB) – для пептидов, протеинов,
углеводов, полимеров и других органических молекул, но также используются и многие
другие матрицы. Обычно раствор матрицы в подходящем растворители (концентрация ~
10 мг/мл) готовится ежедневно, поскольку он светочувствителен и подвержен
фоторазложению, но может храниться короткое время в защищенном от света месте. В
качестве растворителей наиболее часто используются вода, этанол, ацетон, ацетонитрил,
тетрагидрофуран, хлороформ и т.д. Матрицы в сухом виде более стабильны, но
рекомендуется хранить их в темном холодном месте. Если при хранении цвет порошка
матрицы изменился, необходимо рекристаллизовать матрицу до ее использования.
Приготовление образцов.
Приготовление образца является важнейшим моментом для проведения успешного
МАЛДИ анализа. Существует много способов приготовления образца. Наиболее простым
и чаще всего успешным остается метод, предложенный Ф.Хилленкампом с М. Карасом1 в
1988 году. Этот метод получил название метода высушенных капель (dried-droplet
метод).
Раствор анализируемого вещества в растворителе, который хорошо смешивается с
растворителем матрицы, добавляется к рабочему раствору матрицы. Молярное
соотношение матрица/исследуемое вещество должно составлять от 100 : 1 до 50000 : 1 и
оптимизироваться для каждого нового образца. После получения гомогенного раствора,
0.5 – 2 мкл его наносится на специальную мишень из нержавеющей стали и высушивается
на воздухе. Во время высушивания происходит кристаллизация матрицы с включением
молекул анализируемого вещества в кристаллическую решетку или же молекулы
вещества размещаются по поверхности быстро образующихся кристаллов матрицы.
Образование и размер кристаллов зависит от природы матрицы и растворителя.
Рис.5
Основное правило приготовления образцов – это сперва найти растворитель, в котором
полностью растворяется анализируемое вещество (аналит), затем подобрать растворитель
для выбранной матрицы, который будет смешиваться с растворителем аналита. В
некоторых случаях подходящие растворители хорошо известны. При анализе пептидов и
протеинов в качестве растворителя используется 0.1% раствор трифторуксусной кислоты
(TFA) в воде, а для олигонуклеотидов чистая деионизованная вода. А в качестве
растворителя для матриц берут соответственно смесь ацетонитрила с 0.1%TFA и смесь
ацетонитрила с водой. То в какой пропорции растворители находятся в смеси, может
сильно влиять на выход ионов в МАЛДИ эксперименте. Полный протокол приготовления
образца должен включать относительные концентрации растворителей. Для того чтобы
избежать преждевременное выпадение матрицы в осадок, раствор исследуемого вещества
всегда добавляется к насыщенному раствору матрицы (типичное отношение объемов 1:10)
Получение небольших и однородных кристаллов матрица/анализируемое вещество
способствует процессу ионизации, приводит к уменьшению сигнала от матрицы и
стабильному и повторяемому выходу ионов исследуемого вещества. Неоднородная
кристаллизация заставляет искать так называемые «сладкие пятна» (“sweet spots”) на
поверхности кристалла для получения стабильного сигнала, а также влияет на
повторяемость МАЛДИ результатов от образца к образцу. Эти проблемы наиболее ярко
выражены в образцах с низким относительным содержанием исследуемого вещества или с
высоким уровнем загрязнений.
При работе с биологическими соединениями часто используются буферные
растворы, соли, поверхностно-активные вещества. Эти соединения оказываются в
растворе анализируемого образца и могут повлиять на качество спектра. Метод МАЛДИ
более толерантен к присутствию примесей, чем другие методы. Если примеси
присутствуют в небольших количествах, качество спектра, обычно, не ухудшается, а
иногда чувствительность может возрасти за счет образования ионов [M+катион]+. В таких
случаях (т.е. небольшого количества примесей) образцы можно анализировать без
предварительной очистки. Однако, если это возможно, лучше всего удалить соли и
примеси до кристаллизации.
Ниже приведена пошаговая процедура метода «высушенных капель» для
протеинов:
1. Приготовить раствор анализируемого образца с концентрацией 100 пмоль/мкл в
смеси 0.1% TFA с водой 1:1. (Вспомогательная формула: MW [kDa]/10 дает
концентрацию в мг/мл, где MW[kDa]- молекулрная масса белка в кДа, т.е. для
белка мелиттин с массой 2.845кДа концентрация 100 пмоль/мкл соответствует
концентрации 0.28мг/мл). Так приготовленные образцы могут длительное время
храниться при температуре минус 200С.
2. Приготовить рабочий раствор анализируемого образца: развести раствор
образца до концентрации 10пмоль/мл.
3. Приготовить свежий насыщенный раствор матрицы: 10-20 мг порошка матрицы
смешать с 1мл растворителя (в данном случае тот же, что и для исследуемого
вещества) в 1.5мл эппендорфе и центрифугировать.
4. Поместить 5мкл супернатанта раствора матрицы в маленький эппендорф и
добавить 5мкл рабочего раствора аналита, в результате полученное отношение
матрица/аналит будет 5000:1. Тщательно перемешать до получения однородного
раствора.
5. Нанести 0.5-2 мкл полученной смеси на пластину масс-спектрометра.
6. Высушить при комнатной температуре.
Дополнительно кристалл матрица/аналит может быть вымыт для уменьшения нелетучих
солей, которые могут сегрегироваться на поверхности кристаллов. Для этого на
поверхность образца на 10-30 секунд наносится капля холодной (40С) подкисленной воды,
которая затем стряхивается или отсасывается с образца.
В случае если для растворения аналита и матрицы используются разные растворители, то
раствор образца делают более (~ в 10 раз) концентрированным, но берут раствора
матрицы приблизительно в 10 раз больше. Преимуществом такого подхода является то,
что финальный раствор, в котором смесь матрица/аналит кристаллизуется, почти такой же
как и раствор самой матрицы, а также дополнительное растворение образца приводит к
уменьшению влияния примесей на МАЛДИ спектры.
Этот метод самый простой и дает хорошие результаты для многих типов образцов.
Нанесенные таким способом образцы стабильны и могут храниться дни в холодильнике
или в вакууме до проведения масс анализа. Однако может оказаться, что нужно пробовать
другие методы приготовления образцов.
Общее количество образца необходимое для MALDI анализа зависит от:
типа образца: для пептидов – 1 пмоль/мишень, для белков 5 пмоль/мишень, для
гликопротеинов 10 пмоль/мишень,
молекулярного веса: чем он больше, тем больше должно быть вещества,
чистоты и метода приготовления.
Для “легких” образцов достаточно 10 пмоль /мишень, для “трудных” количество
вещества должно быть увеличено. В случае протеинов, их концентрация в финальном
растворе должна быть < 10 пмоль /мишень, т.к. большие протеины препятствуют
кристаллизации матрицы и могут полностью подавить МАЛДИ сигнал.
Уменьшение концентрации – это способ получить лучший результат в МАЛДИ.
Общее правило для образцов неизвестной концентрации – начинать с его оригинальной
концентрации и попробовать отношения 1:1 и 1:9 его смеси с матрицей. Так как
одновременно на одну мишень МАЛДИ можно нанести много образцов, рекомендуется
попробовать серию разбавлений (до 5 шагов) в одно время, и, найдя лучшую степень
разбавления, оптимизировать для нее процедуру приготовления образца.
Проведение анализа.
После нанесения образца на пластину МАЛДИ, она вставляется в массспектрометр и система откачивается.
Короткий световой импульс лазера поглощается молекулами матрицы и разрушает
ее кристаллическую структуру. Часть молекул отрывается от поверхности и образует
высокотемпературны суперплотный газ (зона шлейфа), в котором кроме молекул, ионов и
ассоциатов матрицы присутствуют молекулы анализируемого соединения. Поскольку
энергия лазера поглощается матрицей, молекулы образца оказываются в зоне шлейфа, в
газовой фазе, практически без приращения внутренней энергии, т.е. с сохранением
исходной структуры.
Рис.6
Положительная ионизация молекул анализируемого вещества чаще всего происходит в
результате захвата протона (Н+) или другого катиона (Na+, K+), или в результате потери
электрона. Отрицательная ионизация происходит в результате захвата электрона или
потери протона.
Нейтральные молекулы и частицы плазмы откачиваются насосами, а
образовавшиеся ионы вытягиваются и ускоряются высоким потенциалом (~ 25 кВ) по
направлению к анализатору, причем положительные или отрицательные ионы могут
регистрироваться при простой смене полярности выталкивающего электрода. После того
как детектора достигнет наиболее тяжелый ион, производится новый лазерный импульс, и
весь процесс ионизации и регистрации ионов повторяется. Спектры после каждого
лазерного импульса суммируются до получения качественной информации о
молекулярной массе соединения. Важным моментом эксперимента является возможность
направлять каждый последующий импульс в новую точку образца.
В современных масс-спектрометрах существуют предустановленные режимы,
оптимизированные для каждого диапазона масс. Чаще всего достаточно выбрать один из
таких режимов и дальнейшая настройка прибора сводится к подбору корректной
мощности лазерного излучения, которая, в идеале, должна незначительно превышать
пороговую мощность появления МАЛДИ сигнала.
Метод МАЛДИ используется, прежде всего, для установления точной
молекулярной массы соединения. К сожалению, в случае тяжелых веществ определить его
точную массу очень трудно. В качестве примера, на рисунке 7 приведен спектр сыворотки
бычьего альбумина, снятого в линейной моде. Максимальный пик принадлежит
протонированному молекулярному иону, более тяжелый пик обусловлен димером, а более
легкие – второму и третьему ионам. Как видно, разрешение для тяжелых белков очень
небольшое (R~100).
И хотя для легких белков можно получить спектры с гораздо лучшим разрешением и
точностью определения масс, этого для успешной идентификации белка недостаточно,
поскольку слишком большое количество белков имеют приблизительно равные значения
молекулярных масс. В тоже время, набор пептидов (см. Рис.8), полученных в ходе
ферментативного гидролиза исследуемого белка (чаще всего трипсинолиза) уникален.
Масс-спектр можно представить в табличном виде, т.е. как набор пар значений
моноизотопных масс и интенсивностей, и используя такой набор данных можно
идентифицировать белок с помощью наиболее распространенного метода peptide mass
fingerprinting9, пользуясь базами данных в Интернете. К сожалению, этим методом нельзя
определить белок в смеси белков.
Для определения веществ меньших масс часто достаточно информации о его
точной массе и изотопном распределении.
Например, на рис.9 легко определить пики, соответствующие ионам пустых фуллеренов –
С82, С84, С86 и т.д. (хорошо видно четыре изотопа) и пики, соответствующие ионам
Gd@C2n (на изотопное распределение углерода накладывается изотопное распределение
гадолиния).
При наличии фрагментации, вещество можно определить и по набору характеристических
фрагментных ионов.
Таким образом, МАЛДИ масс-спектроскопия является мощным инструментом для
получения информации о точной массе молекул, необходимой для их идентификации, а
также для проверки результатов химического синтеза веществ. Из знания точных масс
молекулярного иона и фрагментов и их изотопного распределения можно получить
информацию о составе и структуре исследуемого вещества. Так как МАЛДИ является
очень чувствительным методом, то его также широко применяют для обнаружения
искомых веществ очень малых концентраций в исследуемых образцах, что является очень
важным, например, при исследовании загрязнений окружающей среды.
Контрольные вопросы.
1. Что такое МАЛДИ масс-спектроскопия и в чем заключается ее принципиальное
отличие от других методов масс-спектроскопии? Назовите параметры, от которых
зависит успех МАЛДИ.
2. Что такое чувствительность и точность МАЛДИ, в каких единицах они измеряются
и от чего зависят?
3. Что такое разрешение и от чего оно зависит в МАЛДИ эксперименте?
4.
В чем отличия линейного масс-спектрометра и масс-спектрометра с ионным
отражающим зеркалом (рефлектроном)? Назовите их преимущества и недостатки.
5. Вычислите время дрейфа ионов с массой 1000Да в линейном масс-спектрометре,
если известно, что ускоряющее напряжение равно 25кВ, расстояние между
ускоряющими пластинами - 1 см, а длина дрейфа – 1м.
6. Что такое калибровка масс-спектрометра? Какие типы калибровок Вы знаете?
Назовите их преимущества и недостатки.
7. Что такое изотопное распределение? Как изменяется изотопное распределение с
увеличением числа атомов углерода? Как оно проявляется в масс-спектрах при
хорошем и плохом разрешениях?
8. Объясните важность матрицы и назовите принципы, исходя из которых, ее следует
выбирать.
9. На что влияет изменение мощности лазерного излучения? Как правильно выбирать
необходимую мощность.
10. Как производится подготовка образца, как должен выглядеть хорошо
приготовленный образец.
Литература.
1
M. Karas, F. Hillenkamp, Anal. Chem. 60, 2299 (1988)
2
K. Tanaka, H. Waki, Y. Ido, S. Akita, Y. Yoshida, T. Yoshida, Rapid Commun. Mass
Spectrom. 2, 151, (1988).
3
А.Т.Лебедев «Масс-спектрометрия в органической химии». Москва, Бином, 2003, с 496.
4
Wiley and McLaren , Rev. Sci. Instr. 26, 1150 (1955).
5
Б.А.Мамырин, В.И.Каратаев, Д.В.Шмикк, В.А.Загулин, Журнал экспер. и теор. физики,
64, 82 (1973).
6
B.A. Mamyrin, Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 131, 1 (1994)
7
D.Spengler, D.Kirsh, R.Kaufmann, J.Phys.Chem., 1992, 96, 9678
9
D.J.Pappin, P.Hojrup, A.J.Bltasby, Curr Biol., 1993, 3, 327-332