ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ
реклама
1 Отчет докторанта кафедры общей физиологии Санкт-Петербургского университета Телушкина П.К. о работе за 2007 год. Научный руководитель – академик А.Д. Ноздрачев. За отчетный период диссертации на тему в соответствии с планом докторской “Обмен в головном мозге при инсулиновой гипогликемии” были исследованы показатели энергетического и азотистого обмена у крыс при инсулиновой гипогликемии. Резюме: Неоднократно перенесенная тяжелая инсулиновая гипогликемия у крыс приводит к увеличению активности аминотрансфераз, глутаминазы и глутаматдегидрогеназы в печени, увеличению активности протеаз в тканях, увеличению уровня свободных жирных кислот, мочевины и мочевой кислоты в сыворотке крови. Обнаруженные изменения свидетельствуют об активации глюконеогенеза у животных, подвергнутых гиперинсулинизации. В головном мозге наблюдается уменьшение интенсивности гликолиза и гликогенолиза, активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ и существенные изменения активности ферментов нуклеотидного обмена и обмена медиаторных аминокислот. Выявленные изменения преимущественно связаны с гипогликемией и активацией контринсулярного аппарата и могут иметь существенное значение в патогенезе постгипогликемической энцефалопатии. ВВЕДЕНИЕ Глюкоза является основным пластическим и энергетическим субстратом в нервной ткани (Ames, 2000). Гипогликемия приводит к гибели нейронов, нарушению функции мозга и развитию постгипогликемической энцефалопатии, патохимия которой требует изучения (Auer, 1986; Телушкин, Ноздрачев, 1999). Практически важно, что гипогликемия является основным 2 осложнением инсулинотерапии сахарного диабета и в процессе лечения пациентов с сахарным диабетом, а также при инсуломе поджелудочной железы наблюдается неоднократно (Amiel, 1996; Bolli, Fanelli, 1999; Marks, Teale, 1999; Балаболкин, 2000; Inouye et al., 2002; Cryer et al., 2003). Возможные нарушения обмена в мозге и в организме в целом при неоднократной гипогликемии исследованы недостаточно. Изменения биохимических показателей при введении высоких доз инсулина являются результатом гиперинсулинемии, гипогликемии и активации контринсулярного аппарата (Amiel, 1996; Bolli, Fanelli, 1999; Балаболкин, 2000).Разнонаправленные регуляторные влияния могут вызывать серьезные нарушения мобилизации и утилизации энергетически важных субстратов. Вероятность развития таких нарушений увеличивается при неоднократном воздействии. Метаболический стресс, связанный с предшествующими эпизодами гипогликемии, может создавать неблагоприятный метаболический фон для протекания последующих гипогликемических состояний. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Опыты выполнены на белых беспородных крысах самцах массой 180220 г. Все животные содержались на стандартном пищевом рационе и перед каждым опытом были лишены пищи течение 18-24 часов. Животные были разделены на 5 групп: 1-ая группа - интактные животные (контроль); 2-ая – крысы, находящиеся в состоянии гипогликемической комы (ГГК); 3-я – животные, обследованные через 48 часов после купирования ГГК; 4-ая – крысы, перенесшие 7 ГГК с интервалом в двое суток и забитые во время последней из серии ком; 5-ая – крысы, перенесшие 7 ГГК и забитые через 48 часов после купирования последней комы. Гипогликемическую кому (утрата постуральных рефлексов, содержание глюкозы в крови около 1.0–2.0 ммоль/л) вызывали внутримышечной инъекцией инсулина в дозе 40 ЕД на кг массы, купирование проводили введением коматозным животным 3 мл 40% раствора глюкозы в желудок. После купирования комы крысы находились в 3 условиях свободного доступа к пище в течение суток; воду получали без ограничения во всех условиях эксперимента. В крови определяли концентрацию глюкозы (Прохорова, 1982), а в сыворотке крови содержание кетоновых тел (Тодоров, 1961), свободных жирных кислот (СЖК), мочевины и мочевой кислоты (Меньшиков, 1987). В больших полушариях мозга (БПМ) и стволе мозга (СМ), а также в печени и скелетных мышцах (мышцы медиальной поверхности бедра) определяли уровень гликогена (Прохорова, 1982). Интенсивность гликолиза и гликогенолиза в головном мозге и печени исследовали по скорости накопления лактата в инкубационной среде, используя в качестве субстратов глюкозу, глюкозо-6-фосфат (Г6Ф) и гликоген (Панин и др., 1982). Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ, КФ 1.1.1.27), сукцинатдегидрогеназы (СДГ, КФ 1.3.99.1), глутаматдегидрогеназы (ГДГ, КФ 1.4.1.3), глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Г6Ф-ДГ, КФ 1.1.1.49), глутатионредуктазы (ГР, КФ 1.6.4.2), НАДФ-изоцитратдегидрогеназы (НАДФ-ИЦДГ, КФ 1.1.1.42), НАДФ-малатдегидрогеназы (НАДФ-МДГ, КФ 1.1.1.40), аспартатаминотрансферазы аланинаминотрансферазы (АЛТ, (АСТ, КФ КФ 2.6.1.2) 2.6.1.1) и определяли спектрофотометрически (Прохорова, 1982). Глутаминазную активность (ГЛТ, КФ 3.5.1.2) и аденозинмонофосфатдезаминазную активность (АМФ-Д, КФ 3.5.4.6) оценивали по накоплению аммиака (Телушкин и др., 2001). В печени активности ГДГ, СДГ, ГЛТ, АМФ-Д и аминотрансфераз определяли в 10% гомогенате ткани, в головном мозге – в суммарной фракции митохондрий, полученной методом дифференциального центрифугирования (Прохорова, 1982). Интенсивность гликолиза и активности ЛДГ, Г6Ф-ДГ, ГР, НАДФ-ИЦДГ и НАДФ-МДГ в головном мозге и печени исследовали в супернатанте, полученном после центрифугирования 10% гомогената при 14000 g в течение 15 мин. Активность нейтральных и кислых протеаз в гомогенатах мозга, печени и скелетных мышц определяли соответственно при рН 7.6 и рН 3.2 по накоплению тирозина, используя в качестве субстрата 4 денатурированный мочевиной гемоглобин (Мурти и др., 1985). Количество белка определяли по Лоури. Статистическую обработку проводили с применением t-критерия Стъюдента. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ Содержание глюкозы в крови у крыс в состоянии 1-ой и 7-ой ГГК было практически одинаковым (табл. 1). У крыс 4-ой группы концентрация СЖК в сыворотке крови увеличивалась кетоновых тел не отличался от на 22%, нормы. У (p<0.001), а уровень животных остальных экспериментальных групп оба показателя были значительно снижены. Содержание мочевины в сыворотке крови в состоянии первой ГГК остается нормальным, а через 48 часов после купирования уменьшается на 37% (p<0.01). У крыс, перенесших серию ГГК, в состоянии последней комы уровень мочевины значительно повышен (на 63%, p<0.001). Концентрация мочевой кислоты в сыворотке уменьшается на 20% (p<0.01) у животных в состоянии первой ГГК и увеличивается на 17% (p<0.01) через 48 часов после купирования. У крыс 4-ой группы показатель повышен на 16% (р<0.01) по сравнению с нормой и остается высоким через 48 часов после купирования последней комы. Количество гликогена в печени и скелетной мышце крыс в состоянии первой ГГК было снижено соответственно на 25% и 41%, а через 48 часов после купирования комы значительно увеличивалось (во всех случаях р<0.05) по сравнению с контролем. У животных 4-ой и 5-ой групп изменений уровня полисахарида в печени и мышце не выявлено. Количество гликогена в БПМ и СМ у крыс (табл. 1) в состоянии однократной ГГК уменьшалось соответственно на 55% и 45% (в обоих случаях р<0.01) и не отличалось от уровня контроля у животных других групп. Скорость образования лактата в печени у крыс в состоянии первой ГГК при использовании в качестве субстратов глюкозы и Г6Ф не изменялась, а интенсивность гликогенолиза снижалась на 33% (p<0.01) по сравнению с 5 контролем (табл. 2). У животных 4-ой группы интенсивность накопления лактата при использовании глюкозы и гликогена в качестве исходных субстратов увеличивалась в 1.5 раза (в обоих случаях р<0.01), изменений скорости накопления лактата при использовании в качестве субстрата Г6Ф не выявлено. В период реадаптации после ГГК в печени не обнаружено существенных различий интенсивности гликолиза и гликогенолиза по сравнению с контролем. У животных 2-ой, 3-ей и 5-ой экспериментальных групп скорость накопления лактата в БПМ и СМ при использовании в качестве субстрата глюкозы и Г6Ф не отличалась от контроля. У животных, забитых в состоянии последней из серии ГГК, при использовании всех субстратов обнаружено уменьшение интенсивности дихотомического распада углеводов в исследованных отделах мозга (на 25-69% по сравнению с контролем, р<0.05). Изменений активностей ЛДГ, СДГ и ГДГ в печени животных 2-ой, 3-ей и 5-ой экспериментальных групп не выявлено (табл. 3). У крыс, перенесших серию ком, в состоянии последней комы активности ЛДГ, СДГ и ГДГ в печени оказались увеличенными соответственно на 22%, 48% и 24% (во всех случаях р<0.01) по сравнению с контролем. У животных в состоянии 1-ой ГГК в печени увеличивается активность ГР на 7% (р<0.05) и НАДФ-МДГ на 21% (р<0.01). Через 48 часов после купирования 1-ой комы повышена активность ГР и Г6Ф-ДГ и НАДФ-МДГ соответственно на 16%, 28% и 17% (во всех случаях р<0.001). У животных 4-й и 5-ой экспериментальных групп наблюдается еще более значительное увеличение активности этих ферментов. В головном мозге животных во всех условиях эксперимента изменений активности ЛДГ, СДГ и ГДГ не выявлено (табл. 4). У крыс 2-ой и 4-ой группы наблюдается уменьшение активности Г6Ф-ДГ в БПМ на 50% и в СМ на 30-35% (во всех случаях р<0.01). У животных 4-ой группы в БПМ уменьшается также активность ГР на 15% и НАДФ-ИЦДГ на 14% (в обоих случаях р<0.05). В восстановительном периоде после купирования последней 6 из серии гипогликемических ком, обнаружено умеренное, но статистически достоверное (P<0.05) уменьшение активности ГР и НАДФ-МДГ в СМ и НАДФ-ИЦДГ в БПМ. Изменений активности аминотрансфераз (табл. 3) в печени крыс, находящихся в состоянии 1-ой ГГК и через 48 часов после ее купирования не выявлено. У животных 4-ой и 5-ой групп наблюдается увеличение активности этих ферментов на 11-22% (р<0.05). Активность ГЛТ у крыс в состоянии 1-ой ГГК не отличалась от уровня контроля, а через 48 часов после купирования снижалась на 51% (p<0.001). У крыс 4-ой и 5-ой групп активность ГЛТ увеличивалась соответственно на 19% и 40% (в обоих случаях р<0.05). Активность АМФ-Д близка к норме у животных 2-ой, 3-ей и 4-ой групп и уменьшена на 33% (p<0.01) через 48 часов после купирования последней комы. Изменений активности аминотрансфераз экспериментальных групп не выявлено (табл. 4). в мозге крыс всех Активность ГЛТ в исследованных отделах мозга большинстве случаев понижалась (на 10-30% по сравнению с контролем), активность фермента была нормальной только СМ у крыс 3-ей группы. Для АМФ-Д, напротив, типичным было увеличение активности (на 15-30%), исключение составляли лишь животные 3-ей группы. В печени и скелетной мышце крыс в состоянии 1-ой ГГК активность нейтральных протеаз уменьшалась (табл. 5) соответственно на 31% и 18% (в обоих случаях р<0.01), в скелетной мышце показатель оставался сниженным и через 48 часов после купирования комы (на 25%, р<0.001). В состоянии комы у крыс, перенесших серию ком обнаружено увеличение активности кислых протеаз в печени на 41% (р<0.001) и в СМ на 25% (р<0.01). У животных 5-ой группы увеличивалась активности кислых протеаз в печени (на 20%, р<0.05), в скелетной мышце активность кислых и нейтральных протеаз повышалась соответственно на 18% и 9% (в обоих случаях р<0.05), а в СМ - на 28% и 20% (в обоих случаях р<0.05). 7 ОБСУЖДЕНИЕ Инсулин является гормоном широкого анаболического спектра действия и регулирует экспрессию большого количества генов (O`Brien et al., 2001). Изменения большинства исследованных показателей в печени и крови у экспериментальных животных в состоянии 1-ой ГГК вызваны непосредственным действием инсулина. Снижение концентрации СЖК в крови обусловлено ингибированием липолиза, а уменьшение содержания кетоновых тел – снижением уровня исходных субстратов для их синтеза и торможением кетогенеза под действием инсулина (Timothy, 1996). С эффектами инсулина связаны изменения азотистого обмена, выявленные у этих животных (Charlton, Nair, 1998). В частности, изменения концентрации конечных продуктов азотистого обмена в крови и активности протеаз в печени и скелетных мышцах у крыс, находящихся в состоянии 1-ой ГГК и через 48 часов после ее купирования в целом отражают репрессию катаболизма аминокислот и способствуют увеличению потенциальных возможностей протеиносинтеза (Charlton, Nair, 1998). Уменьшение гликогенолиза в печени крыс в состоянии 1-ой ГГК также может быть вызвано действием инсулина (Gastaldelli et al., 2001). Вместе с тем количество гликогена в печени и в скелетной мышце уменьшается, т.е. гипогликемия даже на фоне гиперинсулинемии приводит к увеличению распада гликогена, а стимулирующее влияние инсулина на процессы синтеза гликогена у животных, лишенных пищи в течении 18-24 часов из-за дефицита исходного субстрата не сопровождается накоплением полисахарида в органах. Изменения метаболизма у экспериментальных животных, перенесших серию ГГК и находящихся в состоянии комы (4-ая группа), весьма значительны и связаны, по-видимому, преимущественно с активацией контринсулярного аппарата, неизменно наблюдаемой при гипогликемии (Bolli, Fanelli, 1999; Балаболкин, 2000). При этом в плазме крови увеличивается уровень глюкагона, катехоламинов и гормона роста, нарастает 8 секреция адренокортикотропина и глюкокортикоидов, а также вазопрессина и окситоцина (Amiel, 1996). Все перечисленные гормоны стимулируют липолиз в жировой ткани и кетогенез в печени, тогда как инсулин является ингибитором этих процессов (Timothy, 1996). Таким образом, увеличение уровня СЖК и сохранение нормального уровня кетоновых тел в крови у крыс 4-ой группы отражает активацию контринсулярного аппарата. То же касается и показателей азотистого обмена. Основным контринсулярным гормоном является глюкагон, его катаболическое действие реализуется в печени (Charlton, Nair, 1998). Глюкагон увеличивает активность глутаминазы в гепатоцитах, повышает включение азота глутамина в мочевину, а также захват аминокислот печенью (Nissim et al.,1999). При этом экспрессия гена глутаминазы осуществляется параллельно с экспрессией генов ключевых ферментов глюконеогенеза и синтеза мочевины (Watford, 1993). Увеличение уровня глюкокортикоидов в крови даже в физиологических пределах также приводит к увеличению распада белков и использования углеродных скелетов аминокислот в процессе глюконеогенеза (Horber, Haymond, 1990). В ходе настоящего исследования обнаружено существенное увеличение содержания мочевины в крови и активности ГЛТ, ГДГ, аминотрансфераз и СДГ в печени в состоянии комы у крыс, перенесших серию ком. Такие изменения у экспериментальных животных 4-ой группы отражают увеличение катаболизма белков и повышают потенциальные возможности глюконеогенеза из аминокислот в печени. Фактором, способствующим активации глюконеогенеза, является и выявленное в настоящем исследовании нарастание уровня СЖК в состоянии комы у крыс, перенесших серию ком. Высокая концентрация СЖК в плазме необходима для осуществления глюконеогенеза и выхода глюкозы из печени (Staehr et al., 2003). Следует подчеркнуть, что инсулин не препятствует активации глюконеогенеза в печени, особенно при высокой концентрации СЖК в крови (Staehr et al., 2003). Гормон ингибирует преимущественно гликогенолиз, а не глюконеогенез (Adkins et al., 2003; Gastaldelli et al., 2001) 9 и инсулиновая гипогликемия может приводить к активации образования глюкозы (Edgerton et al., 2002). Увеличение гликолиза в печени животных 4-ой группы, в отличии от животных 2-ой группы, может быть связано со стимуляцией инсулином экспрессии гена глюкокиназы, увеличинием скорости фосфорилирования глюкозы и включения ее в пути обмена (Ferre et al., 2001) при многократном воздействии высоких доз гормона. Действием инсулина обусловлено и значительное увеличение активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ в печени крыс, перенесших серию ГГК (O`Brien, 2001). В то же время активация гликогенолиза не может быть отнесена к инсулиновым эффектам (Staehr et al., 2003). Следует отметить, что у этих животных изменения процесса in vitro не сопровождались снижением концентрации гликогена в печени. Механизм таких изменений остается неясным. Можно предполагать, что увеличение скорости образования лактата in vitro, которое в данном случае свидетельствует, в сущности, о повышении активности фосфорилазы, обусловлено превалированием действия контринсулярных гормонов (адреналина и глюкагона). Однако, при изучаемом экспериментальной воздействии активация фермента не сопровождается реальным распадом гликогена in vivo, т.к. повышенный глюконеогенез обеспечивает поддержание достаточно высокой продукции фосфорных эфиров гексоз. Через 48 часов после купирования последней комы (5-я группа) также проявляется некоторое увеличение интенсивности азотистого обмена. Признаки усиления катаболизма азотсодержащих соединений у этих животных представляются особенно явными в сравнении с животными, обследованными в период реституции после 1-ой ГГК. По-видимому, усиление катаболизма белков при многократно повторяющейся инсулиновой гипогликемии катаболизма является достаточно аминокислот, стойким. интенсивное Стабильное использование усиление их для глюконеогенеза может в конечном итоге нарушать субстратное обеспечение протеиносинтеза. 10 Таким образом, при многократном воздействии высоких доз инсулина метаболическая реакция на введение гормона обусловлена активацией контринсулярного аппарата, а собственно инсулиновые эффекты не являются доминирующими. В результате увеличиваются возможности энергообеспечения за счет СЖК, кетоновых тел и аминокислот. В то же время, в отношении показателей азотистого обмена неоднократно перенесенная гипогликемия вызывала комплекс патохимических изменений, сходный с таковым при сахарном диабете. Т.е., гипогликемия, возникающая в ходе лечения сахарного диабета, способна увеличивать нарушения, характерные для этого заболевания. Уменьшение количества гликогена в мозге животных в состоянии ГГК (2-ая группа) обнаруживалось и ранее многими исследователями, оно обусловлено увеличением использования гликогена как источника энергии при нейрогликопении (Auer, 1986; Brown, 2004). Отсутствие изменений уровня полисахарида в мозге крыс, перенесших серию ком, свидетельствует о нарушении утилизации гликогена при многократной гипогликемии. Снижение скорости накопления лактата при использовании всех трех субстратов в исследованных отделах мозга у крыс, забитых в состоянии последней из серии ГГК, по-видимому, вызвано уменьшением скорости фосфофруктокиназной реакции (Magen et al., 1995) и предполагает использование в качестве источника энергии неглюкозных субстратов, в качестве которых могут выступать как кетоновые тела плазмы крови, так и кетоновые тела, образующиеся в мозге в ходе окисления аминокислот с разветвленным радикалом (валина, лейцина, изолейцина) (Honegger et al., 2002; Greene et al., 2003). Угнетение гликолитической энергопродукции имеет более существенное значение в нарушении функций мозга, чем изменение общего энергетического статуса нервной ткани (Lipton, Robacker, 1983; Lipton, 1991; Ames, 2000). Процессы гликолиза и гликогенолиза эффективно осуществляются в астроцитах и гликоген мозга сосредоточен преимущественно в этих клетках (Magistretti, Pellerin, 1996). Астроциты 11 осуществляют метаболическую гликолитическая поддержку энергопродукция имеет нейронов, в существенное частности, значение в зависимом от работы Na+, K+-АТФазы удалении К+ из внеклеточной жидкости и поддержании, тем самым, мембранного потенциала покоя нейронов, а также в обеспечении Na+–зависимого захвата глутамата астроцитами и уменьшении его концентрации в межклеточном пространстве (Pellerin, Magistretti, 1994). Гликолитическая энергопродукция играет особую роль в транспорте Са2+ в клетках мозга (Erecinska et al., 1996). Образующийся в ходе гликолиза и гликогенолиза лактат выделяется в межклеточное пространство, захватывается нейронами и используется ими в качестве энергетического субстрата (Ames, 2000; Brown, 2004). Продукция молочной кислоты астроцитами имеет значение в регуляции концентрации Н+ во внеклеточной жидкости; Н+ уменьшает сродство NMDA-рецепторов к аспартату и глутамату (Tombaugh, Sapolsky, 1993). Лактат препятствует развитию эксайтотоксических эффектов глутамата (Ros et al., 2001), предупреждает нарушения обмена аминокислот, падение уровня АТФ и способствует выживанию нейронов в отсутствии глюкозы (Zeevalk, Nicklas, 2000). Концентрация глутамата и, особенно, аспартата в межклеточной жидкости в мозге при тяжелой гипогликемии значительно увеличивается, что связано с нарушениями энергетического обмена, сопровождается изменениями ионного гомеостаза и приводит к эксайтотоксической гибели нейронов (Auer, 1986; Телушкин, Ноздрачев, 1999). Нарушение использования гликогена в мозге рассматривают как один из существенных патохимических маркеров в развитии энцефалопатий различного генеза (Magistretti, Pellerin, 1996; Brown, 2004). Снижение скорости образования лактата при использовании гликогена в качестве исходного субстрата обнаружено в стволе мозга через 48 часов после купирования последней ГГК. Т.е., нарушения распада гликогена в стволовых структурах мозга у животных, многократно подвергнутых воздействию 12 гипогликемических доз инсулина, сохраняется длительное время после купирования ГГК. Изменения НАДФ-зависимых дегидрогеназ в головном мозге крыс, перенесших серию ГГК, направлены исключительно в сторону снижения их активности и наиболее выражены в отношении Г6Ф-ДГ. Такие изменения следует рассматривать как неблагоприятные. Неоднократное воздействие гипогликемии на мозг приводит к активации процессов перекисного окисления липидов в нервной ткани (Телушкин, 1998). Уменьшение активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ может быть связано с окислением сульфгидрильных групп белковой части молекул ферментов активными формами кислорода и азота (Gerlach et al., 1994), что в свою очередь снижает возможности антиоксидантных систем. Выявленное в данном эксперименте увеличение активности протеаз, по-видимому, также свидетельствует возникновения окислительного стресса, поскольку действие на геном продуктов перекисного окисления приводит к индукции протеолитических ферментов (Halliwel, 1992). Снижение активности ГЛТ может иметь значение для уменьшения продукции аммиака в мозге при гипогликемии, поскольку в условиях дефицита глюкозы глутамат, образующийся в глутаминазной реакции, преимущественно подвергается окислительному дезаминированию с образованием аммиака, что также способствует повреждению клеток ( Honegger et al.,2002). К числу неблагоприятных изменений относится существенное увеличение активности АМФ-Д в мозге животных, перенесших серию ГГК. Такие изменения могут приводить к нарастанию продукции аммиака, увеличению расрада пуриновых нуклеотидов, снижению возможность регенерации АТФ из-за уменьшения общего количества адениловых нуклеотидов, а также к снижению уровня аденозина в нервной ткани. Аденозин является нейропротектором и снижение его уровня способствует повреждению клеток мозга (Sapolsky, 2001). 13 В состоянии гипогликемической комы, развивающейся впервые, изменения активности ферментов в головном мозге минимальны, а колебания уровня субстратов напрямую связаны с падением уровня глюкозы в крови (Телушкин, Ноздрачев, 1999). Совершенно иной характер носят изменения у крыс, многократно переносивших гипогликемические состояния. В этом случае в головном мозге развивается комплекс патохимических изменений, включающий в себя уменьшение интенсивности гликолиза и гликогенолиза, снижение активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ, инициацию процессов перекисного окисления липидов и протеаз, нарушения обмена пуриновых нуклеотидов и медиаторных аминокислот. Обнаруженные изменения (в отличие от изменений, наблюдаемых в печени) не могут рассматриваться как адаптационные и/или связанные с непосредственным действием инсулина на нервную ткань и свидетельствуют о стабильном нарушении метаболизма в мозге. Комплекс выявленных изменений связан с неоднократно перенесенной гипогликемией и является существенным элементом патогенеза постгипогликемической энцефалопатии. 14 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Балаболкин М.И. Диабетология. М.: Медицина, 2000. 672 с. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. М.: Медицина, 1987. 368 с. Мурти В., Пракаш Г.С., Субраманям К. Активность кислых и нейтральных протеаз в различных отделах головного мозга крыс; распределение в глии и нейронах // Нейрохимия. 1985. № 1. С. 52-55. Панин Л.Е., Третьякова Т.А., Русских Г.С., Войцеховская Е.Э. Особенности регуляции ключевых ферментов гликолиза и пентозофосфатного пути в тканях с различной функциональной специализацией // Вопр. мед. химии. 1982. № 2. C. 26-30. Прохорова М.И. Методы биохимических исследований: Липидный и энергетический обмен. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1982. 272 с. Телушкин П.К. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов, активность НАДФ-зависимых дегидрогеназ и протеаз в мозге крыс при многократном введении инсулина // Пробл. эндокринол. 1998. № 3. С. 35-38. Телушкин П.К., Ноздрачев А.Д. Гипогликемия и мозг: метаболизм и механизмы повреждения нейронов // Успехи физиол. наук. 1999. № 4. С. 14-27. Телушкин П.К., Ноздрачев А.Д., Потапов П.П. Активность ферментов дезаминирования в мозге крыс в восстановительном периоде после инсулиновой гипогликемии // Пробл. эндокринол. 2001. № 5. С. 43-45. Тодоров Й. Клинические лабораторные исследования в педиатрии. София, 1961. 607 c. Adkins A., Basu R., Persson M., Dicke B., Shah P., Vella A., Schwenk W.F., Rizza R. Higher insulin concentrations are required to suppress gluconeogenesis than glycogenolysis in nondiabetic humans // Diabetes. 2003. V. 52. P. 2213-2220. Ames III, A. CNS energy metabolism as related to function // Brain Res. Reviews. 15 2000. V. 34. P. 42-68. Amiel S.A. Studies in hypoglycaemia in children with insulin-dependent diabetes mellitus // Horm. Res. 1996. V. 45. P. 285-290. Auer R.N. Hypoglycemic brain damage // Stroke. 1986. V.17. P. 699 - 708. Bolli G.B., Fanelli C.G. Physiology of glucose counterregulation to hypoglycemia // Endocrinol. Metab. Clin. 1999. V. 28. P. 467-493. Brown A.M. Brain glycogen re-awakened // J. Neurochem. 2004. V. 89. P. 537552. Charlton M., Nair K.S. Protein metabolism in insulin-dependent diabetes mellitus // J. Nutrition. 1998. V. 128. P. 323-327. Cryer P.E., Davis S.N., Shamoon H. Hypoglycemia in diabetes // Diabetes Care. 2003. V. 26. P. 1902-1912. Edgerton D.S., Cardin S., Pan C., Neal D., Farmer B., Converse M., Cherrington A.D. Effects of insulin deficiency or excess on hepatic gluconeogenic flux during glycogenolytic inhibition in the conscious dog // Diabetes. 2002. V. 51. P. 3151-3162. Erecinska M., Nelson D., Silver I.A. Metabolic and energetic properties of isolated nerve ending particles (synaptosomes) // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1277. P. 13-34. Ferre P., Foretz M., Azzout-Marniche D., Becard D., Foufelle F. Sterol-regulatoryelement-binding protein 1c mediates insulin action on hepatic gene expression // Biochem. Soc. Trans. 2001. V. 29. P. 547-552. Gastaldelli A., Toschi E. , Pettiti M., Frascerra S., Quiñones-Galvan A., Sironi A.M., Natali A., Ferrannini E. Effect of physiological hyperinsulinemia on gluconeogenesis in nondiabetic subjects and in type 2 diabetic patients // Diabetes. 2001. V. 50. P. 1807-1812. Gerlach M., Ben-Shachar D., Riederer P., Youdim M.B.H. Altered brain metabolism of iron as a cause of neurodegenerative diseases? Neurochem. 1994. V. 63. P. 793-807. // J. 16 Greene A.E., Todorova M.T., Seyfried T.N. Perspectives on the metabolic management of epilepsy through dietary reduction of glucose and elevation of ketone bodies // J. Neurochem. 2003. V. 86. P. 529-537. Halliwel B. Reactive oxygen species and the central nervous system // J. Neurochem. 1992. V. 59. P. 1609-1623. Honegger P., Braissant O., Henry H., Boulat O., Bachmann C., Zurich M.-G., Pardo B. Alteration of amino acid metabolism in neuronal aggregate cultures exposed to hypoglycaemic conditions // J. Neurochem. 2002. V. 81. P. 11411151. Horber F. F., Haymond M. W. Human growth hormone prevents the protein catabolic side effects of prednisone in humans // J. Clin. Invest. 1990. V. 86. P. 265-272. Inouye K., Shum K., Chan O., Mathoo J., Matthews S.G., Vranic M. Effects of recurrent hyperinsulinemia with and without hypoglycemia on counterregulation in diabetic rats // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2002. V. 282. P.1369-1379. Lipton P., Robacker K. Glycolysis and brain function: [K+] stimulation of protein synthesis and K+ uptake require glycolysis // Fed. Proc. 1983. V. 42. P. 2875-2880. Lipton P. Glycolysis is necessary for normal synaptic transmission in guinea-pig hippocampal slices // Soc. Neurosci. Abstr. 1991.V. 17. P. 1155. Magen A., Koren-Schwartzer N., Chen-Zion M., Beitner R. Effect of insulininduced hypoglycemia on cytoskeleton-bound and cytosolic phosphofructokinase and the levels of glucose 1,6-bisphosphate in rat brain // Biochem. Mol. Med. 1995. V. 56. P. 94-98. Magistretti P.J, Pellerin L. Cellular mechanisms of brain energy metabolism: Relevance to functional brain imaging and to neurodegenerative disorders // Ann. NY Acad. Sci. 1996. V. 777. P. 380¯387. Marks V., Teale J.D. Hypoglycemia: factitious and felonious // Endocrinol. Metab. 17 Clin. 1999. V. 28. P. 579-601. Nissim I., Brosnan M., Yudkoff M., Nissim I., Brosnan J.T. Studies of hepatic glutamine metabolism in the perfused rat liver with 15N-labeled glutamine // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 28958-28965. O`Brien R.M., Streeper R.S., Ayala J.E., Stadelmaier B.T., Hornbuckle L.A. Insulin-regulated gene expression // Biochem. Soc. Trans. 2001. V. 29. P. 552-558. Pellerin L., Magistretti P.J. Glutamate uptake into astrocytes stimulates aerobic glycolysis: a mechanism coupling neuronal activity to glucose utilization //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 10625-10629. Ros J., Pecinska N., Alessandri B., Landolt H., Fillenz M. Lactate reduces glutamate-induced neurotoxicity in rat cortex // J. Neurosci. Res. 2001. V. 66. P. 790-794. Sapolsky R.M. Cellular defenses against excitotoxic insults // J. Neurochem. 2001. V. 76. P. 1601-1611. Staehr P., Hother-Nielsen O., Landau B.R., Chandramouli V., Holst J.J., BeckNielsen H. Effects of free fatty acids per se on glucose production, gluconeogenesis, and glycogenolysis // Diabetes. 2003. V. 52. P. 260-267. Timothy G.R. Obesity. Fat cells // Endocrinol. Metab. Clin. 1996. V.25. P. 847867. Tombaugh G.C., Sapolsky R.M. Evolving concepts about role of acidosis in ischemic neuropathology // J. Neurochem. 1993. V.61. P. 793-803. Watford M. Hepatic glutaminase expression: relationship to kidney-type glutaminase and to the urea cycle // FASEB J. 1993. V. 7. P. 1468-1474. Zeevalk G.D., Nicklas W.J. Lactate prevents the alterations in tissue amino acids, decline in ATP, and cell damage due to aglycemia in retina // J. Neurochem. 2000. V.75. P. 1027-1034. 18 Таблица 1 Содержание энергетических субстратов, продуктов азотистого обмена в крови и гликогена в органах крыс при гиперинсулинизации (M±m) Показатель 1 группа 2 группа Глюкоза, 5.37±0.12 1.36±0.14*** 3 группа 4 группа 5 группа 5.63±0.17 1.76±0.23*** 5.47±0.15 ммоль/л СЖК, 409±15 235±34*** 125±11*** 501±13*** 245±16*** 34.8±1.6 18.6±2.3*** 13.1±2.0*** 36.9±2.5 25.7±1.0*** 4.6±0.8 4.6±0.2 2.9±0.3** 7.5±0.4*** 4.4±0.7 210±4 168±3** 245±5** 244±14* 250±10* 25.9± 1.6 17.1±1.8** 49.3±2.5*** 26.7±1.3 25.5±1.7 1,32±0,08 0,59±0,10** 1,39±0,10 1,10±0,09 1,28±0,04 1.47±0.06 0.80±0.12** 1.45±0.07 1.23±0.11 1.56±0.05 мкмоль/л Кетоновые тела, мг/л Мочевина (ммоль/л) Мочевая кислота (мкмоль/л) Гликоген печени, мг/г Гликоген БП, мг/г Гликоген СТ , мг/г Гликоген 9.5±0.6 5.6±0.4*** 14.7±0.5*** 11.2±0.9 13.0±1.9 скелетных мышц, мг/г Примечание. Здесь и в табл. 2, 3, 4, 5: 1) в каждой группе по 6-8 животных; 2) статистически достоверные по сравнению с контролем изменения обозначены: * - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001. 19 Таблица 2 Активность ферментов в печени крыс при гиперинсулинизации (M±m) Показатель 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа АСТ 5.9±0.1 5.6±0.3 6.2±0.2 6.8±0.1*** 7.2±0.2*** АЛТ 8.4±0.2 8.8±0.3 8.1±0.2 9.7±0.1*** 9.3±0.3* ГЛТ 171±13 179±6 84±12*** 203±6* 240±15** АМФ-Д 37.8±1.8 36.1±1.8 37.2±5.2 35.5±3.3 25.5±2.2** ЛДГ 573±44 582±50 644±29 698±18* 587±32 СДГ 1.47±0.06 1.51±0.08 1.38±0.21 2.17±0.29* 1.76±0.18 ГДГ 0.53±0.02 0.51±0.04 0.50±0.03 0.66±0.05* 0.49±0.04 Г6Ф-ДГ 14.3±0.4 15.8±0.7 18.1±0.6*** 38.1±1.5*** 42.9±1.2*** ГР 47.3±0.8 50.5±0.7* 54.7±1.0*** 66.9±2.3*** 67.6±1.5*** НАДФ- 89.3±4.1 81.2±3.8 85.8±5.9 93.4±4.7 95.2±5.3 47.1±2.3 57.0±2.1** 55.2±1.9* 98.5±5.6*** 117.7±4.9*** ИЦДГ НАДФМДГ Примечание: активность АСТ и АЛТ выражена в мкмоль/час/мг белка, активность ГЛТ и АМФ-Д – в нмоль/ч/мг белка, активности ЛДГ, Г6Ф-ДГ, ГР, НАДФ-ИЦДГ и НАДФ-МДГ - в нмоль/мин/мг белка, активность СДГ и ГДГ - в мкмоль/мин/г ткани. 20 Таблица 3 Интенсивность накопления лактата (нмоль/мин/мг белка) в печени и головном мозге при гиперинсулинизации (M±m) Объект Субстрат 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа Печень Глюкоза 12.7±1.2 12.3±1.1 12.1±1.4 19.0±0.8** 14.2±1.4 Г6Ф 21.2±1.8 24.6±1.7 25.4±2.0 27.8±1.3 26.6±0.6*** 16.8±2.1 23.2±1.4 Гликоген 17.3±1.0 БПМ 11.6±1.1** 18.1±0.9 Глюкоза 53.6±1.12 55.1±0.98 55.4±1.16 40.0±2.05*** 56.1±1.14 Г6Ф 64.9±2.83 25.8±0.63*** 65.8±2.47 66.1±3.97 63.6±2.05 Гликоген 19.8±2.14 20.1±1.62 СМ 21.1±1.73 10.3±2.04* 18.7±2.11 Глюкоза 57.6±0.96 55.7±1.11 55.1±1.43 37.4±1.62*** 57.4±1.31 Г6Ф 73.7±5.48 67.4±3.96 69.7±3.42 28.3±2.61*** 68.3±3.06 Гликоген 18.7±1.46 21.3±1.15 19.5±0.92 11.4±0.81*** 14.4±0.90* 21 Таблица 4 Активность ферментов в головном мозге крыс при гиперинсулинизации (M±m) Показатель Отдел 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа мозга АСТ БПМ 21.2±1.1 21.6±0.9 21.8±1.0 22.3±0.8 21.0±0.9 СМ 24.6±1.2 23.9±0.8 25.1±1.3 25.3±1.1 24.4±1.0 БПМ 8.5±0.4 8.7±0.5 8.4±0.6 9.2±0.5 СМ 10.8±0.6 10.5±0.3 11.0±0.4 10.3±0.7 10.6±0.3 БПМ 73.3±0.8 65.6±2.0** 67.1±1.3** 45.1±3.3*** 49.4±3.2*** СМ 64.7±1.3 58.3±2.0* 63.4±1.9 56.8±3.0* 55.3±2.7* БПМ 32.5±1.6 36.7±1.8 29.9±1.7 43.1±2.5** 39.6±1.9* СМ 29.3±1.2 33.6±1.5* 28.5±1.6 38.3±1.9** 37.3±1.5** БПМ 294±8 280±11 299±12 279±10 283±15 СМ 265±14 269±15 271±16 260±13 272±9 БПМ 833±35 847±87 821±27 815±31 839±54 СМ 693±30 671±90 705±53 660±49 690±59 БПМ 267±18 273±15 275±15 251±13 265±11 СМ 264±15 261±14 259±21 266±16 250±18 БПМ 11.0±0.8 4.7±1.1*** 10.5±1.0 5.5±1.2** 10.3±0.2 СМ 18.3±0.6 11.9±1.5** 16.9±1.2 12.7±1.3** 16.0±0.5 БПМ 11.0±0.2 10.3±0.5 10.9±0.3 9.3±0.6* 9.7±0.3* СМ 13.1±0.7 12.5±0.6 13.5±0.4 12.4±0.5 13.0±0.6 НАДФ- БПМ 10.2±0,3 10.9±0.4 10.7±0.3 8.8±0.4* 8.5±0.5* ИЦДГ СМ 13.2±0.6 14.3±0.5 14.0±0.4 11.3±0.7 12.3±0.6 НАДФ- БПМ 7.5±0.3 7.9±0.6 6.3±0.6 7.2±0.4 МДГ СМ 11.0±0.5 12.1±0.9 12.3±0.7 11.5±0.6 9.3±0.5* АЛТ ГЛТ АМФ-Д ЛДГ СДГ ГДГ Г6Ф-ДГ ГР 8.2±0.3 8.2±0.5 Примечание: активность ЛДГ, Г6Ф-ДГ, ГР, НАДФ-ИЦДГ, НАДФ-МДГ выражена в нмоль/мин/мг белка; активность ГЛТ, ГДГ, АМФ-Д и СДГ - в нмоль/мин/мг белка; активность АСТ и АЛТ - в мкмоль/час/мг белка. 22 Таблица 5 Активность кислых (рН 3.2) и нейтральных (рН 7.6) протеаз (нмоль тирозина/мин/г ткани) в головном мозге, печени и скелетной мышце крыс при гиперинсулинизации (M±m) Объект Про- 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа pH 3.2 29.4±0.6 29.9±1.4 29.2±0.9 28.5±0.7 28.9±1.1 pH 7.6 7.85±0.29 8.13±0.38 8.40±0.41 8.63±0.28 pH 3.2 31.0±1.7 31.8±1.3 pH 7.6 5.99±0.22 6.17±0.19 6.28±0.23 6.58±0.21 7.19±0.1** pH 3.2 52.1±3.0 51.7±1.6 52.5±1.2 73.8±3.3*** 62.3±2.4* pH 7.6 19.7±0.8 13.5±1.5** 18.3±1.4 20.8±0.7 6.68±0.43 7.17±0.47 7.31±0.47 7.00±0.19 18.0±0.5 14.7±0.9** 13.5±0.4*** теазы БПМ СМ Печень Мышца pH 3.2 pH 7.6 32.3±2.0 7.79±0.33 38.7±1.6** 39.7±2.2* 21.7±2.7 19.1±0.9 7.88±0.31* 19.8±0.5* 23 Результаты работы оформлены в виде статей: 1. П. К. Телушкин, А. Д. Ноздрачев, П. П. Потапов. “Показатели энергетического и азотистого обмена у крыс при инсулиновой гипогликемии” - направлена в редакцию журнала “Известия РАН. Серия биологическая”. 2. А.Д. Ноздрачев, П.К. Телушкин “Активность глюкозо-6-фосфатазы в печени и уровень свободных жирных кислот в крови у крыс при инсулиновой гипогликемии” – направлена в редакцию журнала “Доклады Академии наук”. В 2007 году в коллективе авторов опубликована статья: Потапов П.П., Стельмах А.Ю., Телушкин П.К., Медведева Н.Б. Изменения показателей энергетического обмена в сердце крыс при аллоксановом диабете и инсулиновой гипогликемии // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. 2007. № 1. С. 24 – 26. Направлена в печать статья: Медведева Н.Б., Телушкин П.К., Стельмах А.Ю. Показатели азотистого обмена при инсулиновой гипогликемии у крыс с аллоксановым диабетом – в редакцию журнала “Бюллетень экспериментальной биологии и медицины”. В течение 2007 года также осуществлялась работа над текстом докторской диссертации. Написаны разделы “Введение”, методы”, “Обзор литературы” и оформлены 3 из 5 глав собственных экспериментальных исследований. 30.10.07. “Материалы и П.К. Телушкин
