Кинетический механизм узнавания и превращения АР
реклама
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН На правах рукописи Канажевская Любовь Юрьевна Кинетический механизм узнавания и превращения АР-сайтов в ДНК АР-эндонуклеазой 1 человека в процессе эксцизионной репарации оснований 03.01.04 - биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель: д.х.н., профессор О. С. Федорова НОВОСИБИРСК – 2015 Содержание Список сокращений ...................................................................................................................5 Введение .....................................................................................................................................7 1. Структурные и кинетические особенности АРЕ1 человека в процессе эксцизионной репарации оснований ..............................................................................................................10 1.1. АР-сайты в ДНК и эксцизионная репарация оснований ..............................................10 1.2. Особенности структуры и функций апуриновых/апиримидиновых эндонуклеаз семейства ExoIII и EndoIV ......................................................................................................12 1.2.1. АР-эндонуклеазы прокариот Xth (ExoIII) и Nfo (EndoIV) ........................................13 1.2.2. АР-эндонуклеазы сахаромицетов Apn1 и Apn2 .........................................................16 1.2.3. Эндонуклеаза Rrp1 из Drosophila melanogaster...........................................................18 1.2.4. APN-1 и EXO-3 из C. elegans ........................................................................................19 1.2.5. Основная эндонуклеаза млекопитающих АРЕ1 .........................................................21 1.2.5.1. Репарационная активность АРЕ1 ..............................................................................25 1.2.5.2. Участие АРЕ1 в инцизионной репарации нуклеотидов .........................................27 1.2.5.3. Регуляторная функция АРЕ1 .....................................................................................28 1.2.5.4. Биологическая роль АРЕ1 .........................................................................................30 1.2.6. Запасная эндонуклеаза млекопитающих АРЕ2 ..........................................................31 1.3. Структурные детерминанты АР-эндонуклеазной активности АРЕ1 ..........................33 1.3.1. Поиск и специфическое узнавание АР-сайтов в ДНК ...............................................33 1.3.2. Строение активного центра АРЕ1................................................................................35 1.3.3. Координация иона Mg2+ и его роль в катализе ...........................................................41 1.3.4. Механизм каталитической реакции АРЕ1 ..................................................................51 1.3.5. Кинетические параметры АР-эндонуклеазной реакции, катализируемой АРЕ1 ....57 1.4. Заключение к обзору ........................................................................................................67 2. Материалы и методы ...........................................................................................................71 2.1. Синтез и очистка олигодезоксирибонуклеотидов .........................................................71 2.2. Синтез и очистка олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих .................................72 природный АР-сайт .................................................................................................................72 2.3. Субстраты для изучения эндонуклеазной активности фермента АРЕ1 ......................72 2.4. Введение метки [32P] по 5'-концу олигодезоксирибонуклеотидов ..............................73 2.5. Сайт-направленный мутагенез остатка Asn-212 АРЕ1 .................................................74 2.6. Наработка и очистка рекомбинантных белков ..............................................................74 2.7. Проверка АР-эндонуклеазной активности фермента ...................................................76 2.8. Регистрация накопления продуктов разрезания [32Р]-меченых ДНК-субстратов белком АРЕ1 методом гель-электрофореза ..........................................................................76 2.9. Определение величин констант KM и kcat для WT АРЕ1и Y171F-P173L-N174K АРЕ1 в стационарных условиях .......................................................................................................77 2 2.10. Регистрация предстационарной кинетики взаимодействия АРЕ1 с ДНК методом «остановленной струи» ...........................................................................................................78 2.11. Количественная обработка данных предстационарной кинетики. Определение кинетического механизма и констант скорости элементарных стадий процесса .............79 2.12. Определение значений констант KM и kcat для WT АРЕ1 по теории графов ............81 2.13. Регистрация кинетики взаимодействия мутантных форм N212D и N212A с 2-aPuсодержащими субстратами .....................................................................................................82 2.14. Изучение стабильности комплексов АРЕ1 с продуктами превращения специфических субстратов .....................................................................................................82 3. Изучение кинетического механизма узнавания и превращения поврежденной ДНК АР-эндонуклеазой 1 человека ................................................................................................84 3.1. Конформационная динамика и кинетика процесса удаления АР-сайтов из ДНК белком WT АРЕ1 в условиях BER .........................................................................................84 3.1.1. Изменение собственной флуоресценции АРЕ1 при связывании с ДНК ..................84 3.1.2. Регистрация конформационных переходов в молекуле АРЕ1 при взаимодействии с природным АР-сайтом, F-аналогом и G-лигандом ...........................................................85 3.1.3. Определение минимального кинетического механизма и количественных параметров взаимодействия фермента АРЕ1 с АР-, F-субстратом и G-лигандом............89 3.1.4. Анализ накопления продуктов разрезания [32Р]-меченых АР- и F-субстратов белком АРЕ1 методом гель-электрофореза ..........................................................................93 3.2. Конформационная динамика ДНК-субстратов в ходе взаимодействия с WT АРЕ1 .94 3.2.1. Регистрация изменений интенсивности флуоресценции остатка 2-aPu, встроенного в ДНК-субстраты и лиганды в ходе их взаимодействия с WT АРЕ1 ...........95 3.2.2. Определение кинетических параметров, описывающих конформационную динамику ДНК-субстратов в процессе их превращения белком АРЕ1 .............................97 3.2.3. Анализ накопления продуктов разрезания белком АРЕ1 [32Р]-меченых 2-aPuсодержащих субстратов методом гель-электрофореза ......................................................100 3.2.4. Регистрация изменений интенсивности флуоресценции остатков Trp фермента в ходе взаимодействия с 2-aPu-содержащими субстратами ................................................101 3.2.5. Кинетические параметры превращения 2-aPu-содержащих субстратов белком АРЕ1, регистрируемого по изменению флуоресценции остатков Trp фермента ...........104 3.3. Исследование влияния консервативного остатка Asn-212 на отдельные стадии процесса, катализируемого АРЕ1 ........................................................................................106 3.3.1. Регистрация конформационных переходов в активном центре мутантной формы N212D АРЕ1 в ходе взаимодействия с поврежденной ДНК в предстационарных условиях..................................................................................................................................107 3.3.2. Определение минимального кинетического механизма и количественных параметров взаимодействия N212D АРЕ1 с АР- и F-содержащей ДНК ..........................110 3.3.3. Регистрация кинетики разрезания F(2-aPu)-субстрата белком N212D АРЕ1 методом стационарной флуориметрии ................................................................................112 3.3.4. Анализ накопления продуктов разрезания [32Р]-меченых АР- и F-субстратов мутантной формой N212D АРЕ1 методом гель-электрофореза .......................................113 3 3.3.5. Кинетический механизм взаимодействия мутантной формы N212A АРЕ1 со специфическими субстратами: предстационарная кинетика, стационарная флуориметрия, гель-электрофорез и количественный анализ ..........................................115 3.4. Исследование влияния тройной мутации Y171F-P173L-N174K на взаимодействие АРЕ1 с ДНК............................................................................................................................120 3.5. Стационарная кинетика превращения АР-и F-содержащей ДНК ферментом WT АРЕ1, а также его мутантной формой Y171F-P173L-N174K АРЕ1 .................................123 4. Обсуждение полученных результатов .............................................................................126 4.1. Предстационарная кинетика взаимодействия WT АРЕ1 с АР- и F-сайтом ..............127 4.2. Конформационная динамика АР- и F-содержащих ДНК-субстратов в ходе их превращения белком АРЕ1 ...................................................................................................129 4.3. Зависимость от положения флуоресцентной метки скорости превращения 2-aPuсодержащих ДНК-субстратов белком АРЕ1.......................................................................132 4.4. Регистрация процесса заполнения бреши в области АР-сайта по флуоресценции молекул фермента и ДНК-субстратов .................................................................................137 4.5. Роль консервативного остатка Asn-212 в каталитическом механизме АРЕ1 ...........139 4.6. Влияние тройной мутации Y171F-P173L-N174K на каталитические свойства АРЕ1 .................................................................................................................................................143 Заключение.............................................................................................................................146 Выводы ...................................................................................................................................149 Список использованной литературы ...................................................................................151 4 Список сокращений В настоящей работе использованы символы и сокращения в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного Союза чистой и прикладной химии (IUPAC) и Международного Союза биохимиков (IUB), а также следующие обозначения: 2-aPu - 2-аминопурин; 8-oxoG - 7,8-дигидро-8-оксогуанин; APE1 - апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза человека 1; APE2 - апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза человека 2; Apn1 - апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 (S. cerevisiae); AP-сайт - апуриновый/апиримидиновый сайт; ATP - аденозин-5'-трифосфат; BER - эксцизионная репарация оснований; BSA - бычий сывороточный альбумин; dCMP - дезоксицитидин-5'-монофосфат; DHU - 5,6-дигидроуридин; DTT - дитиотреитол; E3330 - 3-(2-(5,6-диметокси-3-метил-1,4-бензохиноил))-2-ил-пропеновая кислота; EMSA - метод анализа электрофоретической подвижности белков и белково-нуклеиновых комплексов; EndoIV (Nfo) - эндонуклеаза IV; ExoIII (Xth) - экзонуклеаза III; F - (3-гидрокситетрагидрофуран-2-ил)-метил фосфат, тетрагидрофуран; FEN1 - флэп-эндонуклеаза 1; F-сайт - F-содержащий нуклеотид; HEPES - N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота; IPTG - изопропил-1-тио-β-D-галактопиранозид; L1 - рестрикционная эндонуклеаза ретротраспозона L1; Lig1 - ДНК-лигаза 1; Lig3 - ДНК-лигаза 3; MMS - метилметансульфонат; MD - молекулярная динамика; 5 NIR - инцизионная репарация нуклеотидов; Nth - ДНК-гликозилаза/β-лиаза; OGG1 - 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза; pBQ - п-бензохинон; PCNA - ядерный антиген пролиферирующих клеток; PNKP - полинуклеотидкиназа/3'-фосфатаза; Pol β - ДНК-полимераза β; Ref-1 - окислительно-восстановительный фактор 1; RFC - фактор репликации C; RPA - репликативный белок А; Rrp1 - белок рекомбинационной репарации 1; SSB - одноцепочечный разрыв в ДНК; TEA - триэтиламин; Tris - трис-(гидроксиметил)аминометан; UDG - урацил-ДНК-гликозилаза; WT - дикий тип (фермента); XRCC1 - фактор, участвующий в репарации повреждений ДНК, вызванных УФ-излучением или алкилирующими агентами; α-dA - α-аномер 2'-дезоксиаденозина; АФК - активные формы кислорода; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; дцДНК - двуцепочечная ДНК ПААГ - электрофорез в полиакриламидном геле; ПЦР - полимеразная цепная реакция; Редокс-активность - окислительно-восстановительная активность; РСА - рентгеноструктурный анализ; УФ-излучение - ультрафиолетовое излучение; ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота; 6 Введение Задачи современной энзимологии сосредоточены на установлении взаимосвязей между структурой и функциями ферментов, осуществляющих катализ. Особый интерес представляют события, происходящие в активном центре фермента после связывания субстрата и до высвобождения продукта реакции. Методы стационарной кинетики, при всем их удобстве и универсальности, не позволяют регистрировать и анализировать промежуточные стадии каталитического цикла. Для детального изучения механизмов ферментативных процессов применяются предстационарные кинетические подходы, которые позволяют регистрировать промежуточные стадии реакции в режиме реального времени [1-4]. Широкое распространение методов предстационарной кинетики стало возможным благодаря развитию новых методов быстрого смешивания реагентов [5, 6], появлению новых флуоресцентных проб [7], а также совершенствованию программного обеспечения, используемого для количественной обработки кинетических данных [8, 9]. В отличие от кинетики Михаэлиса-Ментен, наблюдение за событиями, происходящими в активном центре в условиях одного оборота фермента, требует высоких концентраций белка. Поэтому развитие предстационарных подходов также связано с появлением удобных и доступных способов наработки рекомбинантных ферментов. Метод «остановленной струи», в котором регистрируется зависимость оптического сигнала фермента либо субстрата от времени, является одним из наиболее распространенных струевых методов для изучения кинетики быстропротекающих процессов [10]. Наблюдение за изменением интенсивности флуоресценции собственных флуорофоров белка либо флуоресцентных групп, встроенных в субстрат, позволяет регистрировать промежуточные состояния фермент-субстратного комплекса, начиная с миллисекундного диапазона времени. Благодаря своим широким возможностям, метод «остановленной струи» был выбран для изучения кинетического механизма действия АР-эндонуклеазы 1 человека в процессе эксцизионной репарации оснований (BER, от англ. base excision repair) [11]. АР-эндонуклеаза 1 (АРЕ1/НАР1/Ref-1) является одним из ключевых ферментов репарации ДНК в клетках человека [12, 13]. В процессе BER, АРЕ1 специфически связывает апуриновые/апиримидиновые сайты (АР-сайты), образующиеся в ДНК после удаления окисленного основания ДНК-гликозилазой, и гидролизует 5'-фосфодиэфирную связь АР-сайта с образованием 3'-гидроксила и 5'-фосфата. После этого ДНК-полимераза удаляет 5'-дезоксирибозофосфат (dRp) и застраивает образовавшуюся брешь, а ДНКлигаза лигирует концы разрыва, восстанавливая интактную последовательность ДНК. 7 Известно, что по механизму BER репарируется значительная часть АР-сайтов эндогенного и экзогенного происхождения [14]. Поэтому правильное функционирование фермента АРЕ1 в процессе эксцизионной репарации оснований является залогом сохранения генетической информации и защищает клетку от злокачественного перерождения. К моменту начала работы имелись данные о структуре АРЕ1, но не было единого мнения о молекулярно-кинетическом механизме ферментативного процесса; не были установлены функции отдельных аминокислот в осуществлении стадий узнавания, связывания и катализа. Поэтому, детальное исследование механизма действия АРЕ1 представляло важную фундаментальную задачу. Целью настоящей работы было установление молекулярно-кинетического механизма превращения ДНК под действием фермента АРЕ1 в процессе эксцизионной репарации оснований; выяснение роли конформационной динамики фермента и ДНКсубстрата и роли отдельных аминокислот активного центра в протекании данного процесса. В ходе исследования решались следующие задачи: • Исследовать изменение конформаций АРЕ1 и ДНК-субстратов в ходе каталитического цикла методом «остановленной струи» путем регистрации интенсивности флуоресценции остатков триптофана фермента и 2-аминопурина субстрата в зависимости от времени и их концентрации. • Провести количественную обработку экспериментальных данных методом нелинейной регрессии, установить кинетический механизм ферментативного процесса и определить константы скорости элементарных стадий. • Исследовать влияние положения флуоресцирующего остатка 2-аминопурина в последовательности модельных субстратов на скорость и эффективность превращения белком АРЕ1 дикого типа. • Проанализировать влияние мутаций некоторых аминокислот активного центра АРЕ1 в составе мутантных форм Y171F-P173L-N174K АРЕ1, N212A АРЕ1 и N212D АРЕ1 на скорость и эффективность узнавания, связывания и превращения специфических субстратов. • Провести сравнение данных, полученных методом «остановленной струи», с результатами моделирования методом молекулярной динамики пространственных структур ДНК-субстратов и комплексов АРЕ1 с F(2-aPu)-субстратом. 8 Основные положения, выносимые на защиту: 1. Молекулярно-кинетический механизм процесса удаления природного АР-сайта из ДНК белком АРЕ1 включает 5 стадий: связывание АР-сайта с образованием неспецифического комплекса, его изомеризацию в специфический комплекс, сопровождаемую изменением конформации фермента, взаимную подстройку активного центра АРЕ1 и АР-сайта для достижения каталитически активного состояния, гидролиз фосфодиэфирной связи, высвобождение продукта реакции из комплекса с ферментом. 2. Нековалентные взаимодействия между аминокислотами активного центра и лабильной ОН-группой, связанной с атомом С1' природного АР-сайта, вносят существенный вклад в установление конформации, оптимальной для катализа. 3. Эффективность образования каталитически-активного комплекса зависит от способности двойной спирали поврежденной ДНК к изгибанию под действием фермента, которая, в свою очередь, зависит от особенностей строения основания, расположенного с 5-стороны от АР-сайта. 4. Замена остатка Asn-212 в активном центре АРЕ1 на аспартат либо аланин драматически снижает скорость разрыва 5'-фосфодиэфирной связи АР- либо Fсайта и, при этом, практически не влияет на сродство фермента к субстрату. 5. Одновременная замена трех аминокислот активного центра АРЕ1 в составе мутантной формы Y171F-P173L-N174K АРЕ1 приводит к снижению скорости катализа на четыре порядка, по сравнению с ферментом дикого типа, но сохраняет способность фермента связывать поврежденную ДНК. 9 1. Структурные и кинетические особенности АРЕ1 человека в процессе эксцизионной репарации оснований (Обзор литературы) 1.1. АР-сайты в ДНК и эксцизионная репарация оснований ДНК человека, содержащая около 3109 пар оснований и 21011 ковалентных связей, представляет собой огромную мишень для различного рода повреждающих факторов, таких как ультрафиолетовое и ионизирующее излучение, химические агенты, а также ошибки репликации. апуриновые/апиримидиновые Сайты, сайты не (АР-сайты) содержащие относятся оснований, к или распространенным повреждениям ДНК. АР-сайт в составе ДНК может существовать в нескольких таутомерных формах, причем циклическая полуацетальная форма включает два аномера, α и β (Рис. 1). Большинство АР-сайтов образуется после удаления модифицированных оснований ДНК-гликозилазами [15]. Реже АР-сайты могут возникать путем спонтанной апуринизации гетероциклических оснований [16]. Предполагается, что в течение дня геномная ДНК обычной клетки претерпевает до 10000 апуринизаций, что может приводить к закреплению мутаций, злокачественному перерождению и гибели клетки [1719]. Рис. 1. Строение АР-сайта. Природный АР-сайт может находиться в форме α- и β-аномеров циклического полуацеталя, а также в ациклических формах альдегида и ацеталя. Эксперименты in vitro показали, что в растворе преобладают полуацетальные формы АР-сайта, тогда как на ациклические формы приходится около 1% [20]. Поскольку АР-сайты не несут генетической информации, они должны репарироваться до начала репликации и транскрипции ДНК. Устранение этих повреждений в клетках осуществляется, в том числе, при участии ферментов эксцизионной репарации оснований [11]. Чаще всего АР-сайт выступает в качестве промежуточного интермедиата BER после удаления модифицированного основания 10 специфической ДНК-гликозилазой (Рис. 2). На следующем этапе АР-эндонуклеаза 1 (АРЕ1) гидролизует фосфодиэфирную связь с 5'-стороны от АР-сайта, в результате чего в последовательности ДНК возникает разрыв с гидроксильной группой на 3'-конце и фосфатом на 5'-конце. Рис. 2. Схематическое изображение различных путей реализации процесса BER в клетках человека [21]. В некоторых случаях удаление окисленного основания и гидролиз фосфодиэфирной связи осуществляется одним и тем же ферментом, бифункциональной ДНК-гликозилазой [22]. При этом на 5'-конце разрыва остается фосфатная группа, а на 3'конце ненасыщенный ациклический остаток сахара, который затем удаляется белком АРЕ1. В случае, когда участвующая в репарации ДНК-гликозилаза не обладает лиазной активностью, остаток АР-сайта на 3'-конце разрыва удаляется с помощью dRp-лиазной активности ДНК-полимеразы β. Далее Polβ застраивает днонуклеотидную брешь, а Lig3 сшивает концы. Путь репарации ДНК, предполагающий замену одного нуклеотида, называют короткозаплаточным. Однако, в определенных условиях, репарация АР-сайтов может протекать по альтернативному длиннозаплаточному пути [23] (Рис. 2). При этом после гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи поврежденной цепи белком АРЕ1 с 3'-концом разрыва связывается комплекс ферментов, включающий Polδ/ε, PCNA и RFC, который осуществляет синтез с вытеснением 5'-конца ДНК. В результате образуется свисающий конец ДНК длиной в среднем 2−20 нуклеотидов [24], который затем удаляется 11 эндонуклеазой FEN1. Выбор пути BER in vivo зависит от множества факторов, таких как природа повреждения [25, 26], соотношение концентраций ферментов – участников обоих механизмов в клетке [27-29], фаза клеточного цикла [30], а также концентрация АТР на стадии лигирования концов разрыва [24]. BER-репарация является высоко-консервативным механизмом удаления повреждений у различных организмов от бактерий до человека [31, 32]. Как следует из экспериментов in vitro минимальный комплекс ферментов, необходимых для удаления урацила из ДНК, включает UNG, APE1, Polβ и Lig3 [33]. Дальнейшие исследования процесса in vivo показали, что каждый из ферментов BER не взаимодействует с поврежденной ДНК по отдельности, а действует в составе высокоорганизованного мультиферментного комплекса [34, 35], причем АРЕ1 может служить фактором, инициирующим сборку комплекса белков длиннозаплаточного пути BER [36]. Следует отметить, что на отдельных этапах процесса в составе комплекса обнаруживаются не только белки, непосредственно катализирующие превращение ДНК, но также и факторы, участвующие в регуляции репликации и транскрипции (PCNA, RPA, XRCC1, RFC и др.) [37, 38]. Снижение активности или отсутствие каждого из участвующих в BER ферментов в большей или меньшей степени губительно для клетки [39-41]. Установлена взаимосвязь мутаций в генах ферментов эксцизонной репарации с нейродегенеративными [42] и онкологическими заболеваниями [43]. 1.2. Особенности структуры и функций апуриновых/апиримидиновых эндонуклеаз семейства ExoIII и EndoIV Репарационные эндонуклеазы принимают участие в большинстве механизмов удаления повреждений из ДНК. Во избежание дестабилизации геномной ДНК, АРэндонуклеазы должны с высокой точностью определить свой субстрат, прежде чем осуществить разрыв фосфодиэфирной связи. Идентификация повреждения – это важная задача для любого фермента репарации, которая приобретает особенную остроту в процессах, протекающих с участием эндонуклеаз, поскольку продуктом АР- эндонуклеазной активности является разрыв цепи ДНК, вероятно даже более токсичный для клетки, чем предшествующее повреждение [44]. С помощью современных методов исследования белков, таких как рентгеноструктурный анализ, различные биохимические и биологические подходы, для многих эндонуклеаз удалось установить механизм реакции, субстратную специфичность, пространственную структуру и роль отдельных аминокислот в узнавании, связывании и превращении АР-содержащей ДНК [45]. Более того, было обнаружено, что некоторые эндонуклеазы способны проявлять активность также в 12 отношении поврежденной РНК [46]. Накопленные знания позволяют, в том числе, ответить на вопросы: «Как регулируется активность эндонуклеаз в клетке?» «Какова роль этих ферментов в процессах репликации и транскрипции ДНК?» 1.2.1. АР-эндонуклеазы прокариот Xth (ExoIII) и Nfo (EndoIV) Существование ферментов, связывающих АР-сайты в ДНК E. coli было впервые показано Вальтером Верли в работе 1972 года [47]. Последующие эксперименты выявили, что в клетках E. сoli присутствует два фермента со схожей экзо- и эндонуклеазной активностями: ExoIII и EndoIV [48-50]. Несмотря на то, что оба эти фермента катализируют разрыв АР-содержащей ДНК по SN2 гидролитическому механизму, их структурная организация значительно отличается. По этой причине ферменты ExoIII и EndoIV послужили родоначальниками двух отдельных семейств эндонуклеаз (Таблица 1). Одним из ключевых различий между белками этих семейств является зависимость активности от типа иона металла, который выступает в роли кофактора. Члены семейства EndoIV содержат три иона Zn2+ в активном центре, в то время как эндонуклеазы семейства ExoIII используют ион Mg2+ [51, 52]. Ферменты семейства ExoIII представлены во всех живых царствах, тогда как структурные гомологи EndoIV не были найдены у растений, млекопитающих и других позвоночных. Таблица 1. Краткая характеристика особенностей структуры и функций эндонуклеаз семейства ExoIII и EndoIV. Эндонуклеазы семейства Эндонуклеазы семейства ExoIII EndoIV Особенности структуры 4-слойный α/β-мотив типа β-бочонок типа «ТИМ»* центрального домена «сэндвич» Металл-кофактор Mg Особенности взаимодействия с АР-сайтом Выворачивают АР-сайт из двойной спирали ДНК Zn Выворачивают из двойной спирали ДНК АР-сайт и противоположное основание комплементарной цепи Репарационная активность: АР-эндонуклеазная + + 3'−5'-экзонуклеазная + + 3'-фосфатазная + - 3'-фосфодиэстеразная + + NIR-активность -(**) + * «ТИМ» - название структурного мотива триозофосфатизомеразы, в которой он был впервые обнаружен. ** NIR-активность не была обнаружена ни у одного из ферментов семейства ExoIII, за исключением АРЕ1 человека. 13 АР-эндонуклеаза, названная ExoIII или Xth, является основной эндонуклеазой E. сoli, на долю которой приходится около 90% клеточной эндонуклеазной1 активности. Кроме того, Xth является важной 3'-фосфодиэстеразой, а также проявляет 3'−5'экзонуклеазную активность в отношении двуцепочечной ДНК, удаляя «тупые» и «свисающие» концы ДНК [53]. Интересно, что уровень 3'−5'-экзонуклеазной активности Xth сопоставим с уровнем ее эндонуклеазной активности [54, 55]. Таким образом, эффективно удаляя 3'-фосфат и 3'-фосфогликоляты, эндонуклеаза Xth генерирует 3'-ОН группу и, тем самым, делает возможным репарационный синтез ДНК-полимеразой. Установлено также, что фермент Xth способен гидролизовать и одноцепочечную поврежденную ДНК [56]. В некоторых случаях Xth проявляет активность рибонуклеазы Н гидролизуя РНК в ДНК-РНК гибридах. Данные рентгеноструктурного анализа (РСА) свидетельствуют о том, что в структуре Xth имеется 4-слойный α/β-мотив типа «сэндвич», аналогичный структурам ДНКазы I и РНКазы Н [52]. Пространственная структура белка характеризуется псевдосимметрией относительно двух центральных β-складок и концевых α-спиралей (Рис. 3А). По краям α/β-домена асимметрично располагаются петли, образующие положительно заряженный желобок, который обеспечивает специфическое связывание фермента с АР-содержащей ДНК. Интересно, что кристаллическая структура Xth кроме иона-кофактора Mn2+ в активном центре также содержит молекулу dCMP, что наводит на мыль об участии основания, стоящего напротив АР-сайта, в специфическом связывании субстрата. Для осуществления гидролиза фосфодиэфирной связи с 5'-стороны от АР-сайта в активном центре Xth возникает сеть донорно-акцепторных взаимодействий между Asp-229, His-259 и молекулой воды, которая выступает в качестве атакующего нуклеофила. Роль иона Mg2+, вероятнее всего, состоит в поляризации разрываемой Р−О3' связи и в стабилизации переходного состояния фермент-субстратного комплекса [52]. Ключевая роль Xth в репарации окислительных повреждений ДНК была подтверждена экспериментами на клетках, в которых отсутствовал ген xth. Указанные мутантные клетки демонстрировали гиперчувствительность к воздействию пероксида водорода [57]. Также было установлено, что мутантные по гену xth клетки более чувствительны к повреждениям ДНК, вызванным УФ- и ионизирующим излучением, чем к алкилирующему агенту MMS [58]. Наблюдаемая закономерность связана с тем, что в клетках E. coli действует и другая репарирующая эндонуклеаза EndoIV. 1 Здесь и далее термин «эндонуклеазная активность» подразумевает АР-эндонуклеазную активность. 14 Рис. 3. Пространственная структура белков Xth (A) и Nfo (Б). Ион магния в активном центре Xth изображен в виде зеленой сферы. Три иона цинка в структуре Nfo изображены в виде серых сфер. Структуры взяты из работ [59, 60]. Эндонуклеаза EndoIV (Nfo) была обнаружена в ходе экспериментов на клетках, мутантных по гену xth, которые, тем не менее, сохраняли АР-эндонуклеазную активность даже в присутствии ЭДТА [61]. Nfo представляет собой небольшой (30 кДа) Zn2+-зависимый фермент, на который приходится не более 10% эндонуклеазной активности в клетках дикого типа. Однако при накоплении в клетке супероксид-анионов уровень экспрессии Nfo увеличивается почти в 20 раз, т.е. фермент является индуцируемым в ответ на окислительный стресс [62]. Интересно, что Nfo способен гидролизовать фосфодиэфирный остов ДНК не только вблизи АР-сайта, но также и некоторых модифицированных оснований (α-dA, 5,6-дигидроурацил и др.) [63, 64]. Такой вид активности не характерен для описанного выше белка Xth и позволяет Nfo участвовать в процессе инцизионной репарации нуклеотидов (NIR, от англ. nucleotide incision repair) [65]. Кроме эндонуклеазной активности Nfo также проявляет 3'фосфодиэстеразную активность, что позволяет ему удалять 3'-блокирующие группы в одноцепочечных разрывах, в том числе, возникающих вследствие активности АР-лиаз [66]. Данная функция чрезвычайно важна для формирования правильной структуры 3'- и 5'-концов разрыва, т.к. это является необходимым условием для синтеза цепи ДНК с помощью ДНК-полимеразы. Структурные данные, полученные в лаборатории Дж. Тэйнера [51], свидетельствуют о том, что Nfo представляет собой моносубъединичный α/β-белок, элементы вторичной структуры которого организованы в β-бочонок, содержащий восемь параллельных β-складок (Рис. 3Б). Снаружи бочонок окружен восемью α-спиралями. Данный структурный мотив является высоко консервативным и часто встречающимся структурным элементом ферментов. Свое название, ТИМ-бочонок, он получил от 15 сокращенного названия триозофосфатизомеразы, в которой был впервые обнаружен [67]. Прочное связывание поврежденной ДНК с белком Nfo одновременно обеспечивается положительно заряженной поверхностью серповидного желобка на С-конце ТИМбочонка, остатками Arg-37 и Lys-86, а также тремя ионами Zn2+. Указанные функциональные группы образуют сеть положительного электростатического потенциала, которая эффективно связывает отрицательно заряженный остов ДНК. Ионы металла также участвуют в осуществлении катализа: два иона цинка координируют молекулу воды, которая выступает в качестве атакующего нуклеофила, а третий ион стабилизирует уходящую 3'-гидроксильную группу. Показано, что мутации аминокислот, координирующих ионы металла, приводят к снижению каталитической активности Nfo [68]. Как и многие репарирующие эндонуклеазы, Nfo распознает субстрат путем выворачивания АР-сайта из двойной спирали ДНК. Однако, в отличие от ферментов семейства ExoIII, специфическое связывание АР-содержащей ДНК белком Nfo обеспечивается дополнительным выворачиванием противоположного основания комплементарной цепи в активный центр [51]. При этом образуется 90º-ный изгиб остова ДНК в месте повреждения. После выворачивания АР-сайта консервативные остатки активного центра заполняют брешь, образовавшуюся в структуре субстрата. Следует отметить, что природа гетероциклического основания, расположенного напротив АРсайта, по-видимому, не влияет на эффективность катализа Nfo [64]. Анализ структуры комплекса Nfo с продуктом реакции свидетельствует о значительных изменениях конформации самого фермента при связывании с субстратом [51]. 1.2.2. АР-эндонуклеазы сахаромицетов Apn1 и Apn2 Исследования эндонуклеазной активности экстрактов клеток S. cerevisiae позволили в 1988 г. обнаружить белок, обладающий 3'-фосфодиэстеразной активностью [69]. Последующие работы показали, что очищенный фермент проявляет активность в отношении АР-сайтов, субстратов NIR, а также различных 3'-блокирующих групп (фосфаты, фосфогликоляты, альдегиды и dRp) [69, 70]. Таким образом, субстратная специфичность основной эндонуклеазы дрожжей, названной Apn1, практически совпадает со специфичностью белка Nfo. Сравнительный анализ последовательностей Apn1 и Nfo также свидетельствует о высокой степени их гомологии [71]. Основное отличие дрожжевой эндонуклеазы состоит в наличии С-концевого домена длиной в 80 аминокислот, отсутствующего у Nfo. Как было показано, данная аминокислотная последовательность является сигналом ядерной локализации Apn1 [72]. Для проявления каталитической активности ферменту Аpn1, так же, как и Nfo, требуется присутствие трех 16 ионов Zn2+ в активном центре, которые, тем не менее, не участвуют в формировании третичной структуры белка. Высокая степень гомологии последовательностей прокариотического и эукариотического ферментов указывает на фундаментальную роль этих ферментов в репарации ДНК. В отличие от Nfo, на долю Apn1 приходится более 95% эндонуклеазной активности клеток S. сerevisiae. Другими словами, данный фермент постоянно присутствует в дрожжевой клетке, а не индуцируется под действием окислительных агентов. Низкие значения константы Михаэлиса (от 1 до 10 нМ для различных субстратов), полученные в ходе биохимических исследований, свидетельствуют о высоком сродстве Apn1 к повреждению [69]. При этом попытки получить кристалл Apn1, пригодный для РСА, к настоящему моменту не увенчались успехом. Поэтому главным методом установления структуры активного центра Apn1 и роли отдельных аминокислот в катализе остается сайт-направленный мутагенез. В частности, было показано, что замена консервативного остатка Glu-158 на глицин значительно снижает каталитическую активность Apn1, однако позволяет мутантному ферменту эффективно связывать субстрат [73]. Аналогичная аминокислота Glu-145 в структуре Nfo находится в составе одной из R-петель, участвующих в связывании субстрата. Соответственно, мутация E145G приводила к потере ДНК-связывающей способности белка [74]. На основании этих данных, а также результатов мутагенеза других консервативных аминокислот, авторы работы [73] предположили, что несмотря на высокую структурную гомологию, механизм связывания и превращения поврежденной ДНК эндонуклеазами Apn1 и Nfo может отличаться. Поскольку основная эндонуклеаза дрожжей, Apn1, относится к семейству EndoIV, поиск второй эндонуклеазы проводили по структурной гомологии ферменту АРЕ1 человека, который принадлежит к семейству ExoIII. В результате была клонирована и охарактеризована эндонуклеаза Apn2/ETH1, состоящая из 520 аминокислот [75]. Особенностью структуры Apn2 является наличие С-концевого домена, схожего с доменом в структуре АРЕ2 человека, но отсутствующего у ExoIII. Удаление этого домена из аминокислотной последовательности не наносит вреда ферментативной активности in vitro, однако дефектный белок не может гидролизовать АР-сайты in vivo [76]. Таким образом, указанный домен Apn2, вероятнее всего, участвует в белок-белковых взаимодействиях, обеспечивая функционирование Apn2 в составе мультиферментного репарационного комплекса. В отличие от Apn1, уровень 3'-фосфодиэстеразной и 3'−5'экзонуклеазной активности Apn2 намного превосходит уровень эндонуклеазной, что свидетельствует о возможных различиях в субстратной специфичности этих белков in vivo [76, 77]. В то время как клетки, лишенные Apn2, фенотипически не отличаются от 17 обычных клеток, клетки, мутантные по обоим генам apn1Δapn2Δ, демонстрируют более высокую чувствительность к алкилирующим и окисляющим агентам, чем клетки apn1Δ [78]. В недавнем исследовании было показана роль Apn1 и Apn2 в предотвращении накопления двуцепочечных разрывов в хромосомной ДНК in vivo [79]. Таким образом, полученные к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что Apn1 является основной эндонуклеазой, участвующей в репарации АР-сайтов, в то время как активность в отношении 3'-блокирующих групп проявляют в равной степени обе АР-эндонуклеазы. Следует отметить, что в клетках дрожжей Schizosaccharomyces pombe, которые филогенетически считаются более близкими к клеткам млекопитающих, наблюдается обратное распределение ролей между белками Apn1 и Apn2 [80]. 1.2.3. Эндонуклеаза Rrp1 из Drosophila melanogaster Одновременно с открытием репарирующих АР-эндонуклеаз в клетках дрожжей и человека группой американских исследователей был клонирован и охарактеризован новый фермент из Drosophila melanogaster, обладающий 3'−5'-экзонуклеазной и эндонуклеазной активностями [81]. Белок, состоящий из 579 аминокислот, был назван рекомбинантным репарирующим белком 1 (Rrp1) вследствие его способности катализировать рекомбинацию ДНК in vitro. На основании высокой степени гомологии Сконцевого домена (252 аминокислоты) Rrp1 с С-концевым доменом экзонуклеазы III из E. сoli, фермент был отнесен к структурному семейству ExoIII [81]. В дальнейшем были охарактеризованы АР-эндонуклеазная, 3'−5'-экзонуклеазная, 3'-фосфодиэстеразная и 3'фосфатазная активности Rrp1 [82, 83]. В частности, результаты работы [83] свидетельствуют о том, что фосфатазная активность Rrp1 в 25 раз слабее, чем фосфодиэстеразная или АР-эндонуклеазная и в 56 раз слабее, чем 3'−5'-экзонуклеазная активность в отношении одного и того же субстрата. Интересно, что проявление 3'−5'экзонуклеазной активности зависит от последовательности 3'-концевого участка ДНК. Так, Rrp1 предпочтительнее гидролизует фосфодиэфирную связь между 3'- пиримидиновым и 5'-пуриновым нуклеотидом либо между двумя пуринами, в то время как скорость разрыва цепи между двумя тимидиновыми нуклеотидами снижена в 250 раз [84]. При этом, несмотря на высокую гомологию последовательностей ExoIII и Rrp1, их субстратная специфичность сильно отличается [85]. Причиной этого могут быть особенности расположения аминокислотных остатков в области связывания нуклеотидовмишеней, отличные от структуры ExoIII. Однако, ввиду отсутствия кристаллической структуры Rrp1, невозможно подтвердить или опровергнуть эту гипотезу. 18 Уникальная особенность белка Rrp1 связана с его N-концевым доменом, состоящим из 421 аминокислоты, который не имеет структурной гомологии ни с одним из известных ферментов. Именно с этой областью связывают способность Rrp1 к переносу цепей ДНК и ренатурации одноцепочечной ДНК in vitro [86]. Анализ вторичной структуры белка методами частичного протеолиза и кругового дихроизма показал, что Rrp1 существует в виде асимметричного мономера, C-концевой домен которого представляет собой глобулярный белок, богатый α-спиралями и β-складками. N-концевая область фермента, богатая заряженными аминокислотными остатками (13% Lys, 18% Glu), напротив, не имеет четкой структурной организации, а состоит из хаотично расположенных витков [87]. Возможно получение кристаллов Rrp1 высокого разрешения затрудняется именно наличием протяженного неструктурированного участка на N-конце белка. Следует отметить, что большинство белков семейства ExoIII имеют на своем Nконце аналогичный слабо организованный домен [88]. Причем длина и последовательность этого домена уникальна для каждого из ферментов. Авторы работы [87] предполагают, что описанная структурная организация N-концевой области Rrp1 позволяет белку взаимодействовать с обширной областью ДНК в процессе отжига. Установлено, что мутантная форма фермента Rrp1-C274, у которой отсутствует Nконцевой участок, сохраняет все виды активности, характерные для полноразмерного белка, кроме 3'−5'-экзонуклеазной в отношении дцДНК [87]. Следовательно, N-концевая область Rrp1 каким-то образом участвует в проявлении экзонуклеазной активности белка. 1.2.4. APN-1 и EXO-3 из C. elegans Пришедшее к середине 90-х гг. понимание того, насколько важными для сохранения генетической информации клетки являются АР-эндонуклеазы, послужило толчком к продолжению поиска белков семейств ExoIII и EndoIV в клетках высших организмов. С использованием фаговой библиотеки в геноме C. elegans была найдена последовательность на 40,4% совпадающая с последовательностью гена apn1 из S. cerevisiae и на 44,9% с геном nfo E. coli [89]. Обнаруженный ген, названный apn-1, должен был кодировать белок массой около 30 кДа, предположительно обладающий активностями фермента Nfo. В следующей работе тем же коллективом авторов было показано, что экстракты из эмбрионов нематоды действительно обладают АРэндонуклеазной активностью [90]. Однако полученные результаты не давали ответа на вопрос: связана ли активность экстрактов в отношении АР-сайтов с активностью белка APN-1 или в клетках C. elegans действуют и другие эндонуклеазы. Дальнейшие исследования клеток нематоды доказали существование второй эндонуклеазы, EXO-3, 19 относящейся к семейству экзонуклеазы ExoIII [91]. Новый Mg2+-зависимый фермент проявлял сильную АР-эндонуклеазную и 3'-диэстеразную активности. Однако авторы не обнаружили у белка EXO-3 значимой 3'−5'-экзонуклеазной активности, а также способности катализировать разрыв цепи ДНК рядом с окисленными основаниями [92]. С другой стороны, рекомбинантный фермент APN-1 в экспериментах in vitro демонстрировал широкий спектр активностей, характерных для эндонуклеаз семейства EndoIV, включая активность в отношении субстратов NIR репарации [93]. На основании этих данных можно предположить, что в клетках C. elegans белки APN-1 и EXO-3 функционируют независимо друг от друга и, либо участвуют в различных процессах репарации ДНК, либо экспрессируются на разных этапах жизненного цикла организма. В отсутствие структурных данных, о пространственной конфигурации APN-1 можно судить, опираясь только на гомологичность последовательности APN-1с последовательностями EndoIV из прокариот и Apn1 из дрожжей. Известно, что Nконцевой домен длиной 118 аминокислот не имеет гомологии с соответствующими доменами EndoIV или Apn1 и не участвует в репарационных активностях APN-1. В последовательности этого домена удалось идентифицировать только короткий фрагмент, предположительно ответственный за локализацию белка в ядре [93]. Наличие уникального N-концевого домена, который часто не имеет четкой структурной организации, характерно для многих эндонуклеаз обоих семейств. Моделирование структуры APN-1 с использованием известной рентгеновской структуры EndoIV показало, что фермент главным образом состоит из α-спиралей и β-складок (Рис. 4). ДНК-связывающий центр содержит три иона Zn2+, координированный консервативными аминокислотными остатками. Одним из таких остатков является Glu-261, замена которого на Gly предположительно должна приводить к нарушению координации одного из атомов цинка и, как следствие, к сужению кармана активного центра. К сожалению, эксперименты с рекомбинантным белком, несущим замену Е261G, не проводились. Однако в экспериментах in vivo было показано, что клетки, экспрессирующие мутантную форму Рис. 4. Модель пространственной структуры APN-1 из C. elegans, построенная с применением известной структуры EndoIV (1QTWA и 1QUM) [93]. Ионы металла обозначены желтым цветом. Аминокислотные остатки, координирующие ионы металла показаны фиолетовым цветом. Красным обозначены консервативные остатки, участвующие в координации Zn2+. 20 фермента, не способны противостоять повреждениям, вызываемым блеомицином, и демонстрируют высокий уровень спонтанных мутаций [93]. На основании этих данных был сделан вывод, что APN-1 действительно утрачивает каталитическую активность при замене Glu-261 на глицин. Как обсуждалось выше остатки, соответствующие Glu- 261 Glu-145 в EndoIV и Glu-158 в Apn1, также являются критическими для проявления эндонуклеазной активности. Исследования активности APN-1 и EXO-3 in vivo также свидетельствуют об отличиях в субстратной специфичности этих ферментов. Первоначально было установлено, что экспрессия генов apn-1 и exo-3 в клетках дрожжей, лишенных собственных репарирующих эндонуклеаз Apn1 и Apn2, защищает клетки от повреждений, вызываемых MMS и H2O2 [91]. С другой стороны, в экстрактах клеток, мутантных по генам apn1Δapn2Δ, экспрессия EXO-3 полностью восстанавливает устойчивость к блеомицину, в то время как в экстрактах клеток, экспрессирующих APN-1 сохраняется высокая степень чувствительности к этому агенту. Таким образом, ферменты APN-1 и EXO-3, вероятнее всего, специализируются на разных повреждениях ДНК. Авторы работы [94] использовали РНК-интерференцию для подавления экспрессии гена apn-1 in vivo. Такой подход позволил детально изучить биологическую роль APN-1 на различных стадиях жизненного цикла нематоды. В частности, супрессия гена apn-1 заметно повышает уровень спонтанных мутаций в клетке. Кроме того, была обнаружена задержка в развитии мутантных эмбрионов. Полученные данные также свидетельствуют о важном значении 3'−5'-экзонуклеазной активности APN-1. Поскольку в клетках C. Elegans, повидимому, отсутствуют гомологи гликозилазы OGG1, удаляющей 8-оксогуанин из ДНК, должен существовать альтернативный механизм защиты от повреждений, индуцируемых пероксидом водорода. Результаты работы [94] свидетельствуют о том, что активность белка APN-1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов может служить тем самым механизмом, предотвращающим ошибочное встраивание 8-oxoGTP в ДНК. Предполагается также, что 3'-диэстеразная активность APN-1 позволяет клеткам нематоды обходиться без еще одного участника BER-репарации, полинуклеотидкиназы/3'фосфатазы PNKP, которая удаляет блокирующую фосфатную группу на 3'-конце разрыва ДНК [94]. 1.2.5. Основная эндонуклеаза млекопитающих АРЕ1 О дезоксирибонуклеазной активности фермента, выделенного из линии раковых клеток HeLa, сообщалось еще в 1981 году [95]. Авторы этой работы показали, что выделенный белок массой приблизительно 32−41 кДа способен разрезать цепь ДНК с 5'21 стороны от АР-сайта в присутствии ионов Mg2+. Однако клонировать ген АРэндонуклеазы из клеток человека, названной АРЕ1 или АРЕХ1, удалось только спустя 10 лет [96-98]. Наличие эндонуклеазы АРЕ1 в клетках мыши и коровы указывает на то, что этот фермент характерен для всех млекопитающих [99, 100]. Интересно, что практически в это же время фермент АРЕ1 был независимо идентифицирован как белок клеточного ядра Ref-1, способный регулировать активность транскрипционного фактора АР-1 [101]. Таким образом, уже с момента открытия было известно о разнообразии функций АРЕ1, детальное исследование которых продолжается до сих пор [102]. Путем картирования было установлено, что ген ape1 состоит из пяти экзонов, локализованных в хромосоме 14q11.2 [103, 104]. Продуктом экспрессии гена является глобулярный белок массой 35,5 кДа, состоящий из 318 аминокислот (pI 8,3). C-концевая последовательность АРЕ1 (аминокислоты с 60 по 318) демонстрирует гомологию с ферментом ExoIII из E. coli (28%ное совпадение последовательностей). В пространственной структуре белка аминокислоты С-концевого домена составляют активный центр, ответственный за репарационную активность АРЕ1. Кроме того, в недавнем исследовании сродства АРЕ1 к транслоказам внешней мембраны митохондрии было высказано предположение о том, что аминокислоты 289−318 на С-конце АРЕ1 являются сигналом для направления белка в межмембранное пространство митохондрии [105]. В то же время первые 60 аминокислот N-концевого домена составляют уникальную последовательность без определенной пространственной организации. Таким образом, структура АРЕ1 сочетает в себе плотно упакованный глобулярный домен на С-конце и подвижный N-концевой участок, что было доказано методом частичного протеолиза [106]. Интересно, что неупорядоченная Nконцевая область АРЕ1 является высоко консервативной среди млекопитающих, Zebrafish, Drosophila, Xenopus, и Dictyostelium, но не имеет гомологии с аналогичными последовательностями у прокариот [107]. Установлено, что аминокислотные остатки 2−7 (PKRGKK) N-концевой области АРЕ1 являются сигналом ядерной локализации [108]. Кроме того, N-концевой домен играет важную роль в регуляторной функции АРЕ1 (окислительно-восстановительная активность, далее «редокс-активность») и проявлении ферментом NIR-активности (см. далее) [109, 110]. Важно отметить, что посттрансляционная модификация имеет большое значение как для проявления активности белком АРЕ1, так и для его внутриклеточной локализации. В частности, фосфорилирование может ингибировать эндонуклеазную активность и усиливать редокс-активность АРЕ1 [111, 112]. Также было показано, что ацетилирование N-концевых остатков лизина (Lys-6 и Lys-7) обеспечивает супрессию гена паратериоидного гормона путем взаимодействия АРЕ1 с белком nCaRE [113]. 22 Последующее деацетилирование АРЕ1 приводит к диссоциации комплекса и активации экспрессии соответствующего гена. Наиболее изученным видом модификации АРЕ1 является убиквитинирование. В большинстве случаев убиквитин обнаруживается присоединенным к одному из остатков Lys-24, Lys-25 либо Lys-27 [114]. Предполагается, что убиквитинирование является сигналом для выхода АРЕ1из ядра, а также связано с реализацией регуляторных функций фермента [115]. Интересные результаты по влиянию окислителей и восстановителей на активность АРЕ1 были получены авторами работы [116]. Было обнаружено, что в присутствии Н2О2 происходит окисление некоторых аминокислотных остатков, в том числе Cys-310, и это служит сигналом к ингибированию репарационной активности АРЕ1. В то же время в присутствии восстановителя (20 мМ DTT) фермент проявлял высокий уровень АР-эндонуклеазной активности. Таким образом, окислительно-восстановительная модификация представляет еще один уровень регуляции активности АРЕ1 в клетке. Пространственная структура АРЕ1 характеризуется наличием двух симметричных доменов, состоящих из внутреннего β-слоя, который включает шесть антипараллельных βцепей, и внешних α-спиралей (Рис. 5). Вместе эти два домена образуют 4-слойный α/βмотив типа «сэндвич», характерный для всех эндонуклеаз семейства ExoIII [117]. Результаты детального биоинформационного анализа последовательности АРЕ1 подтверждают принадлежность этого фермента также к суперсемейству катионзависимых фосфодиэстераз, которое включает нуклеазы (ДНКаза I, РНКаза Н, L1), инозитолфосфатазы и сфингомиелиназы [118, 119]. Предполагается, что все эти ферменты Рис. 5. Сравнение пространственной структуры ДНКазы I в комплексе с ДНК (зеленый цвет) со структурами свободных белков АРЕ1 и ExoIII. Мотивы, представляющие собой αспирали и β-складки, окрашены синим и пурпурным цветами, соответственно. Желтые стрелки указывают на петлевые мотивы, характерные для АРЕ1 и ExoIII, но отсутствующие в структуре ДНКазы I [117]. 23 произошли от одного предшественника, однако в процессе эволюции приобрели различную субстратную специфичность, сохранив общий механизм разрыва фосфодиэфирных связей в нуклеиновых кислотах, белках и фосфолипидах [120]. В частности, ДНКаза I узнает и гидролизует специфическую последовательность ДНК, но не способна узнавать и связывать АР-сайты [121]. Как видно из Рис. 5, глобулярные домены ДНКазы I, АРЕ1 и ExoIII имеют сходную структурную организацию. Сравнение координат атомов центральных β-складок АРЕ1 с ExoIII и ДНКазой I показывает, что среднеквадратичное отклонение Сα-атомов составляет всего лишь 0,85 и 1,16 Å, соответственно [117]. В то же время, в структурах этих белков есть и существенные отличия. В частности, с наружной стороны α/β-домена АРЕ1 и ExoIII располагаются петлевые и α-спиральные участки, которые отсутствуют у ДНКазы I. Речь идет о последовательностях α5, α8 и α11, отмеченных желтыми стрелками на Рис. 5. Установлено, что указанные участки последовательности стабилизируются за счет гидрофобных и электростатических взаимодействий между консервативными аминокислотами [117]. Например, стэкинговое взаимодействие Leu-179 и Leu-182 и солевой мостик между Arg181 и Glu-154 обеспечивают стабильность и необходимую ориентацию петлевой области α5 в структуре АРЕ1. С появлением данных о кристаллической структуре АРЕ1 с ДНКсубстратом в активном центре стало ясно, что консервативные аминокислотные остатки из петель и спиралей α5, α8 и α11 участвуют в узнавании и связывании поврежденной ДНК [122]. В частности, остатки Met-270, Met-271 из спирали α11 фиксируют двойную спираль АР-содержащей ДНК со стороны малой бороздки, а Asn-226, Lys-227, Lys-228 и Asn-229 взаимодействуют с рибозо-фосфатным остовом со стороны большой бороздки. Интересно, что протяженность внешних спирально-петлевых доменов в структуре ExoIII превышает их размер в АРЕ1, что, по-видимому, и объясняет более широкую субстратную специфичность бактериального фермента. В то же время, такие внешние элементы структуры практически отсутствуют у ДНКазы I [119]. Как было показано в работе С. Кела с соавторами [123], перенос одной из специфических петель ExoIII, αМ, в соответствующее положение последовательности ДНКазы I наделяет фермент способностью связывать АР-сайты и катализировать гидролиз их 5'-фосфодиэфирной связи. Таким образом, структурные особенности АРЕ1, ExoIII и ДНКазы I демонстрируют, как в процессе эволюции один и тот же белок приобретает различные специфические функции. Строение активного центра, координация иона металла и механизм катализа АРЕ1 более подробно будут рассмотрены в следующем разделе обзора. 24 1.2.5.1. Репарационная активность АРЕ1 Гомологов бактериальной эндонуклеазы EndoIV в клетках млекопитающих обнаружить не удалось. Предполагается, что фермент АРЕ1 обеспечивает более 95% клеточной эндонуклеазной активности в отношении АР-сайтов (Рис. 6) [12]. АРэндонуклеазная активность АРЕ1 играет ключевую роль в процессе эксцизионной репарации оснований [13]. АРЕ1 способна гидролизовать не только природный АР-сайт, но также его разнообразные циклические и ациклические аналоги в любом нуклеотидном контексте с большей или меньшей степенью эффективности [124]. Как и ExoIII, АРЕ1 проявляет АР-эндонуклеазную активность в отношении одноцепочечных ДНК [125]. Кроме АР-эндонуклеазной АРЕ1 обладает заметной 3'-фосфодиэстеразной активностью в отношении 3'-фосфатов и 3'-фосфогликолятов, что было показано в экспериментах на Рис. 6. Схема химического превращения, катализируемого эндонуклеазой АРЕ1. клеточных экстрактах [126, 127]. Данные 3'-блокирующие группировки препятствуют удлинению праймера ДНК-полимеразой и лигированию разрыва ДНК-лигазой. Поэтому они, в отсутствие репарации, могут приводить к возникновению одноцепочечных разрывов в ДНК. Биохимические исследования также подтвердили важную роль 3'репарационной активности АРЕ1 [128]. Исключение составляет удаление 3'-фосфатных группировок из ДНК со свисающими либо тупыми 3'-концами. В этих случаях активность АРЕ1 крайне низка [129]. Как было установлено позднее, эти блокирующие группы удаляются с участием полинуклеотидкиназы/3'-фосфатазы PNKP в ходе АРЕ1независимой эксцизионной репарации оснований [130]. В отличие от ортолога ExoIII, 3'−5'-экзонуклеазная активность АРЕ1 снижена на 23 порядка, по сравнению с АР-эндонуклеазной [131]. В работах, проводившихся под руководством О.И. Лаврик, было показано, что в условиях избытка АРЕ1 по отношению к субстрату модифицированные аналоги нуклеотидов удаляются более эффективно, чем 25 неправильно спаренные основания на 3'-конце одноцепочечного разрыва [132]. При этом оптимальные условия для проявления 3'−5'-экзонуклеазной активности отличаются от таковых для эндонуклеазной, и характеризуются пониженной концентрацией солей в буферном растворе. Интересно, что эффективность экзонуклеазной реакции, катализируемой АРЕ1, коррелирует с термической стабильностью поврежденных дуплексов ДНК [133]. В частности, чем выше температура плавления ДНК-субстрата, тем ниже степень образования продуктов такой реакции. Предполагается, что биологическая роль 3'−5'-экзонуклеазной активности АРЕ1 заключается в корректировании ошибок, допускаемых Polβ в ходе репарационного синтеза [134]. Результаты исследования взаимного влияния активности АРЕ1 и Polβ показали, что в условиях избытка АРЕ1 полимераза β не ингибирует ее экзонуклеазную активность, тогда как АРЕ1 заметно стимулирует синтез с вытеснением цепи ДНК с участием Polβ [27]. Полученные данные также свидетельствуют в пользу гипотезы о корректирующей функции 3'−5'- экзонуклеазной активности АРЕ1 в процессе эксцизионной репарации оснований. Способность АРЕ1 гидролизовать РНК была обнаружена в экспериментах in vitro довольно давно [135], однако значение этой активности для клетки остается до конца не выясненным. Возможно, связывая и разрезая РНК по АР-сайтам, АРЕ1 участвует в удалении поврежденных мРНК, которые несут потенциально ошибочную информацию [46], причем связывание АРЕ1 с РНК невозможно в отсутствие первых тридцати трех аминокислот N-концевого домена белка [136]. Кроме того, в работе [136] было показано, что взаимодействие с белком NPM1 регулирует РНК-связывающую активность АРЕ1, а также его локализацию внутри ядра. В недавней работе С. Ли с соавторами сообщается о способности АРЕ1 катализировать разрыв цепи в кодирующей области мРНК гена c-myc между парами нуклеотидов UA и CA [137]. Временное ингибирование экспрессии гена аре1 приводило к увеличению времени полураспада и достижения постоянного уровня мРНК гена c-myc в клетках HeLa. Дальнейшие эксперименты показали, что субстратами для АРЕ1 являются также мРНК гена CD44, микроРНК miR-21 и miR-10b, а также РНК некоторых вирусов, причем фермент может разрезать молекулы РНК даже в отсутствие ионов Mg2+ [138]. Этим же коллективом авторов была проанализирована роль различных аминокислотных остатков активного центра АРЕ1, участвующих в процессировании молекул РНК [139]. В результате было показано, что введение мутаций в ключевые остатки Asn-68, Asp-70, Tyr-171, Asp-210, Phe-266, Asp-308 и His-309 значительно снижает эндорибонуклеазную активность АРЕ1, в то время как, мутантная форма D283N АРЕ1 сохраняет обычный уровень РНК-гидролизующей активности. Интересно, что наличие 2'-ОН группы рибозы у нуклеотида-мишени является необходимым условием 26 осуществления реакции. На основании этих данных авторы предположили, что хотя эндорибонуклеазная активность АРЕ1 обеспечивается тем же активным центром, что и другие репарационные активности, механизм катализа в случае РНК имеет существенные отличия. Таким образом, результаты последних исследований свидетельствуют о важной роли АРЕ1 в регуляции уровня транскрипции мРНК гена c-myc, а, возможно, и других генов. 1.2.5.2. Участие АРЕ1 в инцизионной репарации нуклеотидов Так же как Nfo из E. coli и Apn1 из дрожжей, белок АРЕ1 способен гидролизовать 5'-фосфодиэфирную связь рядом с некоторыми модифицированными основаниями и повреждениями, в том числе, рядом с 5,6-дигидроуридином (DHU), 5-гидрокси-2'уридином, α-dA и бензо-этено-экзоциклическими аддуктами нуклеотидов (pBQ-dN) [64, 140]. Установлено, что такого рода активность является частью репарационного механизма NIR, который протекает без участия ДНК-гликозилаз [65, 141]. Процесс инцизионной репарации нуклеотидов инициируется АР-эндонуклеазой (Nfo, Apn1, APE1), которая гидролизует фосфодиэфирную связь ДНК с 5'-конца от повреждения. Образовавшуюся на 3'-конце разрыва гидроксильную группу узнает и связывает ДНКполимераза, в то время как оставшийся на 5'-конце поврежденный нуклеотид не может быть удален dRp-лиазой. длиннозаплаточному пути Поэтому с процесс участием NIR неизбежно флэп-эндонуклеазы протекает FEN1. по Результаты молекулярного моделирования комплекса АРЕ1 с ДНК, содержащей pBQ-dС, в частности, свидетельствуют о том, что специфическое связывание объемных экзоциклических аддуктов в активном центре обеспечивается водородными связями с боковыми радикалами Arg-185, Asp-189 и α-аминогруппой Ala-175 [142]. Интересно, что оптимальные условия для проявления ферментом АРЕ1 BER- и NIR-активности заметно отличаются. Если АР-эндонуклеазная активность АРЕ1 максимальна в интервале рН 7,8−8,2, то NIR-активность заметнее всего проявляется при рН 6,4−6,8 [110]. Что касается ионов металла, то для проявления АР-эндонуклеазной активности АРЕ1 необходима концентрация ионов Mg2+ около 5 мМ, в то время как активность в отношении окисленных пиримидинов полностью ингибируется при концентрации MgCl2 выше 2 мМ. Кроме того, в отличие от NIR-активности, BER-активность АРЕ1 может реализовываться в широком диапазоне концентраций KCl (25−200 мМ). Следует отметить, что оптимальные условия для проявления NIR-активности совпадают с таковыми для 3'−5'экзонуклеазной активности [143]. Полученные результаты, включая факт возрастания собственной флуоресценции АРЕ1 при титровании раствором MgCl2, позволили авторам 27 работы [110] сделать вывод об аллостерической природе АРЕ1. Вероятно, фермент может существовать в двух различных конформациях, равновесие между которыми регулируется концентрацией ионов металла. На основании этих данных можно предположить, что проявление BER- либо NIR-активности in vivo регулируется рН среды, концентрацией ионов магния и ионной силой раствора. Биологическое значение NIR-репарации для клеток остается неизвестным, однако в последних исследованиях приводятся доказательства того, что данный репарационный путь может реализовываться in vivo. Вначале было показано, что продукт NIR-активности АРЕ1, содержащий на 5'-конце разрыва DHU, подвергается дальнейшей 5'-3'экзонуклеолитической деградации в экстрактах из клеток HeLa [110]. Затем появились убедительные данные, демонстрирующие репарацию α-dA с участием АРЕ1 в живой клетке [144]. В этой же работе сообщается о том, что бактериальный ортолог АРЕ1 Nfo способен защищать клетки, лишенные гликозилазной активности, от окислительных повреждений ДНК, но не от алкилирующих агентов. Таким образом, участие белка АРЕ1 в NIR репарации, вероятнее всего, служит запасной функцией, защищающей клетку от некоторых окислительно-восстановительных повреждений ДНК. 1.2.5.3. Регуляторная функция АРЕ1 Как уже упоминалось выше (см. разд. 1.2.5, стр. 22), АРЕ1 была независимо обнаружена как белковый фактор, стимулирующий ДНК-связывающую активность транскрипционного фактора АР-1 (Fos/Jun) [101]. Окислительно-восстановительная функция АРЕ1 (редокс-активность) сосредоточена в N-концевой области белка, так называемом домене Ref-1 [109] и не связана с репарационной активностью фермента [145]. Взаимодействие между гетеродимером Fos-Jun и белком АРЕ1 обеспечивается консервативными остатками цистеина (Cys-65 и Cуs-93), при этом АРЕ1 выступает в качестве восстановителя [146]. Следует отметить, что проявление редокс-активности характерно только для АРЕ1 млекопитающих. Причем предполагается, что именно остаток Cys-65 является ключевым для данной функции фермента, поскольку замена соответствующего остатка Thr-58 на цистеин в zAPE1 из Zebrafish наделяет мутантный белок позвоночного регуляторной редокс-активностью [147]. В результате проявления редокс-активности остатки цистеина окисляются образуя дисульфидный мостик. Механизм окислительно-восстановительной реакции с участием двух тиольных групп белка хорошо изучен для таких ферментов как тиоредоксин [148]. Обычно в активном центре таких белков имеется характерная последовательность Cys-X-X-Cys. Уникальность редокс-активности АРЕ1 заключается в отсутствии указанного мотива. Более того, по 28 данным РСА остатки цистеина 65 и 93 располагаются не на поверхности белковой глобулы, а являются частью внутренних β-слоев АРЕ1 [117]. Однако, из семи остатков Cys фермента именно указанные два находятся ближе всего друг к другу, на расстоянии 9 Å. По эти причинам механизм редокс-активности долгое время оставался до конца невыясненным. В недавней работе была изучена способность АРЕ1 изменять свою конформацию при проявлении редокс-активности [149]. Авторы использовали известный ингибитор АРЕ1 E3330, который снижает редокс-активность, но не влияет на репарационную активность фермента [150]. Полученные данные свидетельствуют о том, что АРЕ1 не только изменяет конформацию при связывании с Е3330, но даже претерпевает частичную денатурацию N-концевого домена. В результате остатки Cys, ответственные за редокс-активность АРЕ1 становятся более доступными и экспонированными в раствор. Предполагается, что такая конформационная перестройка позволяет остаткам Cys-65 и Cys-93 выступать в роли нуклеофила и акцептора при взаимодействии АРЕ1 с белковыми факторами. Многочисленные исследования показали, что АРЕ1 способна модулировать окислительно-восстановительный статус целого ряда транскрипционных факторов, таких как Egr-1, NF-κβ, p53, CREB, HIF-1α, PEBP-2 и TTF-1 (подробно рассматривается в обзоре [151]). Биологическая роль таких взаимодействий активно изучалась в последнее десятилетие. Оказалось, что АРЕ1 является одним из важнейших окислительновосстановительных регуляторов, который поддерживает транскрипционные факторы в их активной восстановленной форме, и тем самым влияет на уровень экспрессии генов, рост и пролиферацию клеток, ангиогенез, механизмы ответа на окислительный стресс [107]. В частности, АРЕ1 участвует в активации белка р53, одного из важнейших регуляторов процессов репарации ДНК и супрессора развития опухолей [152, 153]. Установлено, что АРЕ1 может усиливать ДНК-связывающую активность р53 двумя способами: 1) путем восстановления р53 за счет своей редокс-активности; 2) путем редокс-независимого физического взаимодействия с С-концевой областью р53, что обеспечивает его тетрамеризацию [152, 154]. Возможно, что редокс-независимое взаимодействие этих двух белков обеспечивается протяженной отрицательно заряженной областью, которая была обнаружена на поверхности АРЕ1 методом РСА [117]. Другой важной регуляторной функцией АРЕ1 является редокс-зависимая стабилизация α-субъединицы фактора, индуцируемого гипоксией, HIF-1. При возникновении гипоксии HIF-1α поступает в ядро клетки, где образует комплекс с β-субъединицей. Образовавшийся гетеродимер связывается со специфическими промоторными последовательностями ДНК и, тем самым, регулирует экспрессию определенных генов [155]. Предполагается, что активность 29 HIF-1 при гипоксии снижает экспрессию генов, участвующих в репарации мисматчей и гомологичной рекомбинации [156]. Кроме того, известно, что опухолевые клетки лучше растут и размножаются в условиях гипоксии [157]. Таким образом, вследствие своей редокс-активности эндонуклеаза АРЕ1 участвует в регуляции многих клеточных процессов, и это делает ее перспективной мишенью для противоопухолевой терапии. 1.2.5.4. Биологическая роль АРЕ1 Подтверждением ключевой роли АРЕ1 во многих клеточных процессах является тот факт, что ни одна из множества попыток создать организм, мутантный по гену аре1, не увенчалась успехом. Организм, лишенный этого фермента, погибает на начальных стадиях эмбрионального развития [158, 159]. По этой причине для изучения молекулярных мишеней АРЕ1 внутри клетки используются стратегии комплементации 2 и РНК-интерференции. В частности, эксперименты по транс-комплементации штаммов E. coli, лишенных собственных АР-эндонуклеаз (ExoIII и EndoIV), показали что АРЕ1 человека способна полностью восстанавливать устойчивость таких клеток к алкилирующему агенту MMS и лишь частично к пероксиду водорода [97]. Похожие результаты были получены при изучении клеток яичника китайского хомячка, которые экспрессировали мутантную форму фермента АРЕ1, содержащую замены E96Q и D210N [160]. Данная форма фермента эффективно связывается с ДНК, но не способна катализировать гидролиз фосфодиэфирной связи. Было установлено, что клетки, экспрессирующие мутантную форму АРЕ1, в большей степени чувствительны к воздействию MMS, чем к Н2О2. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли АРЕ1 в удалении АР-сайтов, которые являются основным интермедиатами репарации алкилированных оснований in vivo. При этом фермент проявляет меньшую активность в отношении 3'-блокирующих групп, которые чаще всего возникают под действием пероксида водорода. Длительное ингибирование активности АРЕ1 в различных линиях клеток человека с помощью малых интерферирующих РНК приводит к накоплению АРсайтов в геномной ДНК, замедлению пролиферации клеток и активации апоптотических процессов [41]. В этой связи следует упомянуть работу С. Митра с соавторами [161], в которой исследовалась жизнеспособность клеток мышиных фибробластов генотипа аре1¯/¯. Источником АРЕ1 в таких клетках была плазмидная ДНК, содержащая ген аре1 между последовательностями LoxP. Связывание рекомбиназы Cre с упомянутыми последовательностями приводило к удалению гена аре1. Авторам удалось показать, что 2 Стратегия, предусматривающая замещение или дополнение определенной функции клетки за счет ферментов из другого организма. 30 удаление АРЕ1 из клеток фибробластов вызывает их апоптоз в течение 24 часов. Однако совместная инъекция гена аре1 дикого типа (далее «WT») блокирует апоптотические процессы и обеспечивает выживание клетки. Авторы также вводили в клетки, лишенные АРЕ1, мутантные формы фермента, у которых отсутствовала эндонуклеазная либо регуляторная активность. Интересно, что любая из мутантных форм, вводимая в клетку отдельно, не могла восстановить их жизнеспособность, и только совместное введение двух мутантных форм АРЕ1 позволяло клеткам фибробластов нормально развиваться. Данный результат убедительно доказывает, что и репарационная и регуляторная активности белка являются чрезвычайно важными для клетки. 1.2.6. Запасная эндонуклеаза млекопитающих АРЕ2 В 2000-м году была опубликована работа, в которой сообщалось об обнаружении второй репарационной эндонуклеазы в клетках человека [162]. Фермент, названный АРЕ2 (АРЕХ2), оказался гомологом ExoIII из E. coli так же, как и основная эндонуклеаза АРЕ1. Таким образом, до настоящего момента в клетках млекопитающих не было обнаружено эндонуклеаз семейства EndoIV. Белок АРЕ2 имеет относительно большую массу 57,3 кДа и содержит 518 аминокислот. Анализ последовательности показал, что АРЕ2 наиболее близок к эндонуклеазе Apn2 из S. cerevisiae. В частности, в С-концевой области АРЕ2 содержится уникальная последовательность, которая есть и у Apn2, но отсутствует у Аpn1 и АРЕ1. Имеющиеся факты позволяют выделить Apn2 и АРЕ2 в отдельное подсемейство среди ExoIII-подобных эндонуклеаз. Выравнивание последовательностей нуклеазных доменов АРЕ2 и АРЕ1 показало, что АРЕ2 содержит в активном центре те же каталитически значимые аминокислоты, что и АРЕ1 (Asn-68, Glu-96, Tyr-171, Asp-210, Asn-212, Asp-283, Asp-308 и His-309). Разница в строении активных центров этих белков, по данным гомологичного моделирования структуры, заключается в отсутствии у АРЕ2 гидрофобного кармана (Phe-266, Trp-280 и Leu-282), участвующего в связывании вывернутого из двойной спирали ДНК АР-сайта [163]. Эксперименты по внутриклеточной локализации АРЕ2 показывают, что полноразмерный белок преимущественно локализован в ядре, в то время как его мутантная форма, лишенная 176 аминокислот на С-конце, остается в цитоплазме [162]. При этом удаление N-концевого участка последовательности не препятствует локализации АРЕ2 в ядре. Таким образом, аналогично белку Apn2, специфическая Сконцевая последовательность АРЕ2 отвечает за его внутриклеточную локализацию. Дальнейшие исследования показали, что АРЕ2 в небольших количествах присутствует и в митохондриях [164]. Новые данные также свидетельствуют, что С-концевая 31 последовательность белка содержит PCNA-связывающий мотив. Более того, с использованием сканирующей иммуно-флуоресцентной микроскопии в работе [164] удалось зарегистрировать надмолекулярные комплексы АРЕ2 с белком PCNA в ядре клеток HeLa, что может свидетельствовать об участии АРЕ2 в BER-репарации in vivo. Изучение активности и субстратной специфичности АРЕ2 представляло сложную задачу ввиду того, что рекомбинантный белок токсичен для клеток E. coli [162]. Тем не менее П. Бурковичу с соавторами [165] удалось получить высокоочищенный рекомбинантный белок АРЕ2 из клеток дрожжей S. cerevisiae и охарактеризовать его активность. Оказалось, что in vitro АРЕ2 обладает слабой АР-эндонуклеазной, более выраженной 3'-фосфодиэстеразной и сильной 3'−5'-экзонуклеазной активностями. Низкая селективность АРЕ2 по отношению к АР-сайтам, по-видимому, объясняется отсутствием описанного выше специфического гидрофобного кармана. Действительно, авторам работы [163] удалось создать мутантный белок АРЕ2 (C260W/S274L), содержащий в активном центре копию гидрофобного кармана из ExoIII, АР-эндонуклеазная активность которого была значительно выше, чем у белка дикого типа. В проявлении 3'−5'-экзонуклеазной активности фермент демонстрирует высокую специфичность по отношению к неправильно спаренным нуклеотидам, расположенным на укороченном 3'-конце двуцепочечной ДНК [163]. На основании полученных данных авторы предположили, что АРЕ2 участвует в удалении 3'-блокирующих групп, а также может выполнять корректирующую функцию в ходе репарационного синтеза ДНК. Однако, в целом, репарационная активность АРЕ2 значительно снижена по сравнению с активностью АРЕ1, что наводит на мысль о возможной роли АРЕ2 в других клеточных процессах. Действительно, авторы одного из последних исследований показали, что АРЕ2 может участвовать в активации клеточного ответа на возникновение повреждений в ДНК и окислительный стресс [166]. В предложенном авторами механизме белок PCNA связывается с образующимися под действием Н2О2 одноцепочечными разрывами в ДНК. Затем АРЕ2 в комплексе с PCNA катализирует 3'−5'-экзонуклеазную реакцию, в результате которой образуется протяженный одноцепочечный участок. Связывание RPА с оцДНК привлекает белки ATR-зависимого сигнального каскада и комплекса RAD9-HUS1RAD1 [167], и это служит сигналом для активации BER-репарации. Таким образом, АРЕ2 служит связующим звеном между BER-репарацией и контрольными точками клеточного цикла. Эксперименты с трансгенными организмами и клетками показывают, что биологическая роль АРЕ2 скорее всего не связана с эксцизионной репарацией. Несмотря на то, что мыши, дефектные по гену аре2, демонстрировали задержку развития, лишенные 32 АРЕ2 эмбриональные стволовые клетки, не проявляли повышенной чувствительности к пероксиду водорода, блеомицину и ионизирующему излучению [168]. Установлено, что удаление гена аре2 из лимфоцитов клеточной линии СН12F3 не влияет на их чувствительность к MMS [169]. К тому же АРЕ2 проявляет очень слабую способность к восстановлению репарационной активности клеток E. сoli и S. сerevisiae, лишенных собственных АР-эндонуклеаз [162]. 1.3. Структурные детерминанты АР-эндонуклеазной активности АРЕ1 1.3.1. Поиск и специфическое узнавание АР-сайтов в ДНК Несмотря на значительное количество повреждений, возникающих в клеточной ДНК, число нормальных нуклеотидов на многие порядки превышает число поврежденных. Установление механизмов поиска поврежденных оснований и АР-сайтов ферментами репарации является важной научной проблемой. Общие принципы поиска нуклеотидов-мишеней ДНК-связывающими ферментами основываются на различных видах диффузии [170-172]. Так, различают дистрибутивный и процессивный механизмы поиска. В случае дистрибутивного механизма происходит частая ассоциация и диссоциация белка и ДНК с помощью трехмерной диффузии. Процессивный механизм поиска реализуется путем скольжения фермента по протяженному участку ДНК за cчет одномерной диффузии. Для многих ферментов репарации, в частности ДНК-гликозилаз, был доказан процессивный механизм поиска повреждения [173]. Поскольку неспецифическое взаимодействие белков с ДНК имеет электростатическую природу, эффективность одномерной диффузии будет снижается с повышением ионной силы раствора [174]. В работе С. Страусс с соавторами [175] изучалась процессивность АРЕ1 человека с использованием протяженных конкатемерных ДНК, которые содержали АРсайт через каждые 25 нуклеотидов. Предполагалось, что в случае реализации дистрибутивного механизма распределение длин нуклеотидов-продуктов разрезания АРЕ1 будет иметь случайный характер. Если же АРЕ1 действует процессивно, то в смеси продуктов должны преобладать короткие 25-звенные фрагменты ДНК. В качестве меры процессивности авторы брали отношение количества 25-звенного продукта к 50-звенному. Разделение радиоактивно меченых продуктов АР-эндонуклеазной реакции в полиакриламидном геле показывает, что на начальных временах (до 10 мин) указанное отношение составляло 2:1, но с течением времени оно увеличивалось и через 60 мин после смешивания фермента и субстрата достигало предельных значений 7:1 и 8:1. На основании полученных данных был сделан вывод о том, что поиск повреждения в ДНК белком АРЕ1 осуществляется в квазипроцессивной манере: после связывания со 33 случайным участком ДНК фермент может последовательно катализировать превращение АР-сайтов на участке протяженностью ~200 пар нуклеотидов, прежде чем произойдет диссоциация комплекса АРЕ1 с ДНК. Термин «квазипроцессивность» был использован потому, что истинно процессивные белки, в частности ДНК-полимеразы, способны проходить несколько тысяч пар оснований, оставаясь связанными с ДНК-субстратом. Вопрос о том, каким образом АРЕ1 узнает повреждение в последовательности ДНК до сих пор остается открытым. Изначально существовало несколько гипотез, объясняющих специфическое связывание АРЕ1 с АР-сайтами. Исходя из структуры комплекса эндонуклеазы ExoIII с субстратом было сделано предположение, что АРЕ1 также может узнавать и специфически связывать основание, стоящее напротив АР-сайта, которое находится во внеспиральном положении (см. Рис. 7) [52]. Однако введение второго АР-сайта напротив первого АР-сайта снижает эндонуклеазную активность АРЕ1 всего в 2,5 раза, по сравнению с обычным субстратом [124]. Кроме того, замена природного нуклеотида напротив АР-сайта на неполярный аналог пурина, который за счет сильных стэкинговых взаимодействий остается внутри двойной спирали ДНК, не приводила к снижению активности белка [176]. Полученные данные указывают на то, что основание, стоящее напротив АР-сайта не важнó для узнавания АР-сайтов белком АРЕ1. Авторы первой кристаллической структуры АРЕ1 высказали предположение о специфических гидрофобных взаимодействиях между боковым радикалом Phe-266 и вывернутым из спирали АР-сайтом в процессе поиска повреждения [117]. Но и эта гипотеза не находит экспериментального подтверждения, поскольку мутантный фермент, у которого Phe-266 заменен на аланин, продолжает связывать и гидролизовать АРсодержащую ДНК [176]. Более того, было показано, что АРЕ1 способна связывать даже ДНК, содержащую однонуклеотидную брешь [177]. Наконец, проявление белком АРЕ1 эндонуклеазной активности в отношении различных аналогов АР-сайта (тетрагидрофуран, пирролидин, пропан и т.д.) свидетельствует о том, что ни сам АР-сайт, ни нуклеотид напротив него не играют ключевой роли в специфическом связывании АРЕ1 с субстратами. В последнее время все больше исследователей склоняется к гипотезе о том, что искажение структуры самой ДНК в области АР-сайта служит маркером для специфического связывания репарационного фермента. Пространственные структуры двуцепочечных ДНК, содержащих АР-сайт, полученные методами ЯМР и молекулярной динамики свидетельствуют об их уникальных свойствах [178]. С одной стороны, поврежденная двойная спираль в целом сохраняет каноническую В-форму, но при этом структура ДНК в области АР-сайта существенно искажена. В частности, наблюдаются 34 30º-ный изгиб оси спирали, нарушение стэкинга соседних с АР-сайтом оснований, а главное, повышенная гибкость и эластичность участка ДНК на расстоянии 2−3 нуклеотида с 5'- и 3'-стороны от повреждения [179]. Установлено, что дезоксирибоза АРсайта может находиться как внутри, так и снаружи двойной спирали, и это зависит от природы основания, стоящего напротив повреждения в интактной цепи ДНК [180]. В случае, когда напротив АР-сайта стоит пуриновый нуклеотид (АР/Pu), апиримидиновая дезоксирибоза занимает преимущественно внеспиральное положение, в то время как апуриновый сайт напротив пиримидинового нуклеотида (AP/Py) большую часть времени находится внутри спирали [181]. Внеспиральное положение АР-сайта АР/Pu пары стабилизируется за счет нетипичного сближения пуринового основания, стоящего напротив повреждения, с основанием, расположенным с 3'-стороны от АР-сайта в поврежденной цепи так, что между ними образуется водородная связь (Рис. 7). Возникновение необычных водородных связей и стэкинговых взаимодействий в области АР-сайта, по-видимому, обеспечивает стабилизацию его изогнутой конформации. Рис. 7. Фрагмент структуры ДНК дуплекса с АР-сайтом напротив цитозина (С20), полученной методом молекулярной динамики [181]. АР-сайт (АР) и соседние основания выделены цветом. Сближенное положение оснований С20 и А8 приводит к возникновению между ними атипичной водородной связи. Интересно, что АРЕ1 также способна образовывать комплекс с ДНК, содержащей однонуклеотидную брешь [182], в структуре которой наблюдается аналогичная деформация [177]. Результаты симуляции структуры комплекса АРЕ1 с ДНК-субстратом методом молекулярной динамики также свидетельствуют о ключевом значении гибкости поврежденной ДНК для специфического связывания ферментом [183]. Таким образом, имеющиеся данные позволяют с высокой долей вероятности предполагать, что подверженность АР-содержащей ДНК структурным флуктуациям и ее способность принимать уникальную изогнутую конформацию являются специфическими маркерами для связывания белком АРЕ1. 1.3.2. Строение активного центра АРЕ1 Структурные и функциональные особенности АР-эндонуклеаз, рассмотренные в разделе 1.2., свидетельствуют о том, что эти белки прошли серьезный эволюционный отбор, сохранив важные структурные элементы, которые позволяют быстро и эффективно гидролизовать фосфодиэфирную связь. Следствием такой «оптимизации» является 35 высокая степень консервативности аминокислот активного центра между АР- эндонуклеазами разных типов организмов [184]. Как уже упоминалось выше, четвертичная структура АРЕ1 содержит характерный 4-слойный α/β-домен, состоящий из двух центральных β-складок, которые снаружи окружены α-спиралями и спиральными петлями. Первые попытки установить значимые аминокислоты активного центра АРЕ1 были предприняты в 1995 г. путем сравнения ее последовательности с известной кристаллической структурой ортолога ExoIII [185]. Так были обнаружены консервативные остатки His-309, Asp-283, Asp-308 и Glu-96, предположительно находящиеся в активном центре фермента. Затем методом сайт-направленного мутагенеза было установлено, что именно остатки His-309, Asp-283 и Glu-96 являются ключевыми для проявления эндонуклеазной активности белком АРЕ1, причем последний, вероятнее всего, участвует в координации иона Mg2+ [135]. Примерно в то же время другим коллективом авторов было показано, что остаток Asn-212 также играет ключевую роль в катализе, поскольку замена его на аланин полностью ингибирует эндонуклеазную активность фермента и даже лишает его способности связывать АР-содержащую ДНК [186]. Д. Вилсон III со соавторами изучали эндонуклеазную активность АРЕ1 на ДНК субстратах, содержащих синтетический аналог АР-сайта, тетрагидрофуран (F-сайт), в различных положениях 18звенной ДНК [124]. Было установлено, что для эффективного катализа АРЕ1 необходимо, чтобы субстрат содержал, как минимум, четыре пары оснований с 5'-конца и три пары оснований с 3'-конца от F-сайта. Появившаяся в 1997 г. кристаллическая структура свободного фермента (PDB ID3: 1BIX;) подтвердила, что ДНК-связывающий центр АРЕ1 располагается на поверхности белковой глобулы и окружен выступающими петлевыми участками, которые включают фрагменты α-спиралей α5, α8 и α11 [117] (Рис. 8А). Активный центр АРЕ1 богат полярными и гидрофобными аминокислотами, в том числе Tyr-171 и Glu-96, которые располагаются на верхнем крае β-складчатой структуры и связаны между собой водородной связью. Из рентгеноструктурных данных следует, что каталитически значимый остаток His-309, действуя как основание, мог бы активировать молекулу Н2О для нуклеофильной атаки на 5'-фосфодиэфирную связь АР-сайта. При этом карбоксильная группа Asp-283 может перераспределять электронную плотность на имидазольном кольце гистидина для стабилизации положительного заряда (Рис. 8Б). Это предположение возникает из того факта, что остатки Asp-283 и His-309 соответствуют остаткам Asp-229 и His-259 в 3 PDB ID – идентификационный номер структуры во Всемирном банке данных белковых структур (http://www.rcsb.org). 36 активном центре гомолога ExoIII, где они образуют «каталитическую триаду» с молекулой воды [52]. Б Рис. 8. (А) Структура доменов АРЕ1 в ленточном представлении. Α-спирали и β-цепи последовательно пронумерованы от N-конца к С-концу. (Б) Ранние представления о механизме генерации атакующего нуклеофила для атаки на фосфодиэфирную связь субстрата [117]. Следует также отметить, что карман активного центра АРЕ1 богат карбоксильными и амидными группами, которые представлены консервативными аминокислотами Asn-68, Asp-210, Asn-212 и Asp-70. Боковые радикалы этих аминокислот образуют между собой сеть водородных связей, которая должна стабилизировать переходное состояние субстрата. Фиксация двойной спирали поврежденной ДНК обеспечивается внешними петлевыми мотивами, которые также в большом количестве содержат полярные аминокислоты (Рис. 8А). Среди них Asn-226, Lys-227, Lys-228 и Asn-229, относящиеся к спирали α8, которые обеспечивают обширный контакт активного центра с фосфатными группами ДНК-субстрата (аналогично спирали αМ в структуре ExoIII [52]). Анализ структуры АРЕ1 показывает, что взаимодействие петлевой области α5 (остатки 176−181) с субстратом осуществляется путем проникновения в большую бороздку ДНК, тогда как участок α11 (остатки 267−277), расположенный между цепями β10 и β11, вероятнее всего связывается с малой бороздкой. Авторы структуры 1BIX обращают особое внимание на остаток Lys-98, который является частью петлевой области, которая гомологична одной из петель ДНКазы I. Соответствующий остаток Arg-41 в структуре ДНКазы I взаимодействует с малой бороздкой ДНК, в то время как Lys-98 располагается рядом с металл-связывающим центром АРЕ1 и, предположительно, образует водородную связь с Asp-70. В недавних работах была исследована роль Lys-98 в проявлении BER- и NIRактивности белком АРЕ1 [187]. Оказалось, что замена этого остатка на аланин заметно 37 снижает 3'−5'-экзонуклеазную и NIR-активность, но не влияет на способность фермента гидролизовать субстраты в условиях BER и на 3'-фосфодиэстеразную активность. В работе [188] изучали влияние замены К98А в последовательности АРЕ1 на кинетический механизм реакции в условиях BER и NIR. Было установлено, что в кинетической схеме для мутантного фермента появляется дополнительная стадия изомеризации комплекса фермента с продуктом, которой не было в механизме для WT АРЕ1. Кроме того, скорость разрыва фосфодиэфирной связи F-содержащего субстрата для К98А АРЕ1 снижается в 6 и 200 раз в условиях BER и NIR, соответственно. Из полученных данных авторы сделали вывод, что удаление Lys-98 не только снижает сродство АРЕ1 к субстрату, но также ухудшает каталитические свойства фермента. Позднее были опубликованы кристаллические структуры комплекса АРЕ1 с 11звенной двуцепочечной F-содержащей ДНК и продуктом ее гидролиза, что позволило детально рассмотреть область контакта фермента и субстрата (PDB ID: 1DE8, 1DE9) [122]. В Приложении 1 представлены ключевые параметры рентгеновских структур АРЕ1, имеющихся во Всемирном банке данных белковых структур к настоящему времени. Новые рентгеновские структуры подтвердили данные биохимического анализа [189] о том, что поверхность взаимодействия АРЕ1 с субстратом охватывает обе цепи ДНК, занимая площадь ~500 Å2. Оказалось, что связанная в активном центре двойная спираль ДНК-субстрата сильно деформирована. В частности, наблюдается ~35º изгиб и смещение на 5 Å оси ДНК в точке повреждения. При этом средне-квадратичное отклонение Рис. 9. Взаимодействие боковых аминокислот АРЕ1 с АРсодержащей ДНК [59]. Нуклеотиды пронумерованы последовательно, начиная с 5'-конца поврежденной цепи. Межнуклеотидные фосфатные группы показаны в виде серых 38 координат Сα-атомов свободного фермента от АРЕ1 окружностей. в комплексе с ДНК составляет всего ~0,7 Å. На основании этих данных авторы делают вывод о том, что структура фермента предформирована для связывания субстрата и не изменяет конформацию при взаимодействии с ДНК. Так же как и в предыдущей работе, авторам новой структуры не удалось определить точные координаты первых тридцати девяти аминокислот подвижного N-концевого домена АРЕ1. Было установлено, что остатки Gly-127 и Tyr-128 связываются со вторым межнуклеотидным фосфатом с 5'стороны от АР-сайта со стороны малой бороздки, расширяя ее приблизительно на 2 Å (Рис. 9). Как было показано в более позднем исследовании [190] замена Tyr-128 на аланин приводит к 15-кратному снижению константы ассоциации белка с АР-сайтом, что указывает на важную роль этой аминокислоты в специфическом узнавании АР-сайта. Следует отметить, что малобороздочные взаимодействия характерны для ферментов, имеющих в структуре 4-слойный α/β-мотив типа «сэндвич» [52, 191]. Связывание с малой бороздкой ДНК приводит к образованию слабого неспецифического комплекса за счет электростатических взаимодействий между положительно заряженными остатками белка и отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК. В таком комплексе фермент может скользить вдоль цепи ДНК в поисках повреждения [192]. Боковой радикал Arg-177 из петлевого участка α5, проникает в ДНК со стороны большой бороздки и образует водородную связь с 3'-фосфатной группой АР-сайта. Авторы подчеркивают, что остаток Arg-177, также как и весь петлевой мотив α5, не имеют аналогов в структурах ExoIII и ДНКазы I и могут определять специфические функции АРЕ1, отсутствующие у гомологов. По данным рентгеновской структуры [122] на 5'-стороне повреждения атомы кислорода гидролизуемой фосфатной группы взаимодействуют с боковыми радикалами Asn-174 и Asn-212. На 3'-стороне повреждения Trp-280 взаимодействует с 3'-фосфатной группой АР-сайта, а цепь из положительно заряженных остатков Asn-222, Asn-226 и Asn229 координирует две фосфатные группы того же участка ДНК. Авторы одной из более поздних работ исследовали каталитические свойства мутантных форм АРЕ1, содержащих замены в упомянутых остатках аспарагина 222, 226 и 229, которые являются частью спирально-петлевого мотива α8 [193]. Было установлено, что замена Asn-226 и Asn-229 на треонин (N226T) и изолейцин (N229I) приводит к увеличению константы Михаэлиса в 6 и 3 раза, соответственно, что свидетельствует о снижении сродства мутантного фермента к субстрату. В то же время значение kcat, в случае замены N229I, возрастает почти в 2 раза, по сравнению с WT АРЕ1. При этом методом задержки в геле не удается зарегистрировать комплексов N226T и N229I АРЕ1 с АР-содержащей ДНК. Таким образом, замена этих аминокислот на незаряженные и неполярные лишает АРЕ1 способности эффективно 39 связывать субстрат, однако увеличивает скорость катализа. Методами генетической инженерии авторы работы [193] создали библиотеку различных вариантов АРЕ1, содержащих случайные замены остатков петли α8 с 222 по 229. Оказалось, что ~2×105 различных мутантных форм фермента способны восстанавливать устойчивость клеток E. coli, лишенных собственных эндонуклеаз, к алкилирующему агенту MMS. Секвенирование показало, что активные клоны АРЕ1 содержат в положениях 222−229 только аминокислоты с отрицательно заряженными либо полярными боковыми радикалами, что подтверждает ключевую роль водородных связей между сахарофосфатным остовом ДНК-субстрата и аминокислотами петли α8. В биохимической работе [194] была предпринята попытка конкретизировать роль упомянутых взаимодействий на отдельных этапах каталитического цикла АРЕ1. Для этого авторы определяли кинетические параметры эндонуклеазной активности, сродство к субстрату и гидролизованному продукту реакции следующих мутантных форм АРЕ1: N226A, N229A, R177A, N226A/N229A и R177A/N226A. Значения KM и Vmax для белков, мутантных по Asn-226 либо Asn-229, были выше, чем для WT АРЕ1, аналогично результатам предыдущего исследования. Таким образом, исчезновение водородных связей между ферментом и фосфатными группами на 3'-стороне АРсайта приводит к росту числа оборотов фермента (Рис. 10). Такое же влияние на активность АРЕ1 производит замена Arg177 на аланин, как было показано в работе [122]. Более того, даже введение двойной приводило мутации к N226A/N229A снижению не скорости Mut разрезания субстрата ( Vmax = 1,65 с-1, Рис. 10. Нековалентные взаимодействия между остатками Asn-226, Asn-229 (красный цвет), Arg177 (синий цвет) АРЕ1 и фосфатными группами 3'-области АР-сайта (голубой цвет) [194]. Зеленым цветом представлена последовательность ДНК. Штрихами отмечены водородные связи и их длина. WT Vmax = 1,38 с-1), то есть указанные остатки непосредственно в катализе не участвуют. Полученные методом ЕМSA значения константы диссоциации, Kd, комплекса фермента с 43-звенной F-содержащей ДНК снижаются линейно в ряду WT (0,31 нМ), N226A (0,55 нМ), N229A (1,33 нМ), R177A (2,15 нМ), N226A/N229A (2,20 нМ) АРЕ1. Хуже всего связывается с субстратом двойной мутант R177A/N226A (31 нМ). На основании этих данных был сделан вывод, что чем ближе располагается боковой радикал к АР-сайту, тем большей эффект на сродство АРЕ1 к ДНК-субстрату оказывает его удаление. Интересно, 40 что авторам не удалось зарегистрировать связывания какой-либо из мутантных форм АРЕ1 с ДНК-продуктом, содержащим одноцепочечный разрыв на 5'-конце F-сайта, в то время как WT АРЕ1 образует детектируемый в полиакриламидном геле комплекс с продуктом реакции [194]. Этот результат наглядно демонстрирует, что остатки Asn-226, Asn-229 и Arg-177 играют ключевую роль не только в связывании ДНК-субстрата, но также удерживают в активном центре ДНК-продукт, не позволяя ему быстро диссоциировать из комплекса с белком. Биологическая роль комплексообразования с продуктом реакции состоит в предотвращении высвобождения токсичного интермедиата прежде, чем он будет передан следующему участнику BER репарации. Данные, полученные в работах [122, 193, 194] свидетельствует в пользу гипотезы о том, что эволюция АРЕ1 движется не в направлении достижения ферментом максимальной скорости и числа оборотов реакции, а в направлении улучшения координации АРЕ1 с другими белками BER и оптимизации репарационного пути в целом. Важным свойством АРЕ1 является способность выворачивать дезоксирибозу АРсайта из цепи ДНК в активный центр, что обеспечивает большую площадь контакта фермента и субстрата, а также исключает связывание неповрежденных нуклеотидов. Как обсуждалось в предыдущем разделе, в ранних работах высказывалось предположение, что внеспиральный АР-сайт сам по себе является специфическим маркером для связывания с АРЕ1. Однако детальное изучение субстратной специфичности АРЕ1 вместе с развитием представлений о структуре АР-содержащей ДНК в растворе доказали, что закрепление АР-сайта в гидрофобном кармане, окаймленном остатками Phe-266, Trp-280 и Leu-282, происходит уже после специфического связывания фермента с поврежденным участком ДНК. Важно отметить, что активный центр АРЕ1 способен связывать как α-, так и βаномер АР-сайта [195]. Оставшееся после выворачивания АР-сайта пространство внутри двойной спирали заполняет остаток Met-270, который проникает в ДНК-субстрат со стороны малой бороздки. Таким образом, тесное взаимодействие петлевых доменов АРЕ1 с ДНК стабилизирует внеспиральное положение АР-сайта и обеспечивает прочность фермент-субстратного комплекса. 1.3.3. Координация иона Mg2+ и его роль в катализе Так же как и другим членам семейства ExoIII, для проявления каталитической активности ферменту АРЕ1 необходимо присутствие ионов Mg2+. Однако до сих пор нет единого мнения об их количестве в активном центре АРЕ1 и механизме координации. Известно, что фермент способен разрезать двуцепочечную ДНК по АР-сайту в диапазоне концентраций MgCl2 от 0,01 до 15 мМ [95, 110], причем зависимость активности АРЕ1 от 41 концентрации ионов металла имеет сигмоидальный характер, резко возрастая в интервале 1−10 мМ MgCl2, что может указывать на аллостерическую природу АРЕ1 [110] (Рис. 11). Рис. 11. Зависимость эндонуклеазной активности АРЕ1 от концентрации Mg2+ в условиях BER (пунктирная линия) либо NIR (сплошная линия) репарации [110]. Действительно, путем регистрации собственной флуоресценции белка авторы работы [110] показали, что добавление ионов магния индуцирует конформационный переход в молекуле АРЕ1. Следует отметить, что эндонуклеаза АРЕ1 способна превращать субстраты, содержащие ациклические аналоги АР-сайта (1,2-этандиол, 1,3-пропандиол) в отсутствие ионов магния всего лишь в 20−30 раз менее эффективно, чем в присутствии 10 мМ MgCl2 [196]. Кроме того, фермент образует прочные комплексы с поврежденной ДНК в 1 мМ ЭДТА [189], а последующее добавление ионов магния восстанавливает его способность к разрезанию субстрата. В дальнейшем, это свойство позволило изучать кинетику стадии связывания АРЕ1 с субстратами различной степени специфичности. Полученные данные указывают на то, что, во-первых, ион металла не участвует в специфическом связывании ДНК-субстрата, во-вторых, играет не самую главную роль на стадии непосредственного разрыва фосфодиэфирной связи. Сравнительный анализ последовательностей АР-эндонуклеаз из клеток E. coli или млекопитающих обнаружил высоко консервативный мотив LQETK (LQE96TK98 в hAPE1), участвующий в координации иона металла [98, 119]. К настоящему времени достаточно подробно изучена активность мутантных форм АРЕ1, несущих замены аминокислот Glu-96 и Lys-98. В частности, было установлено, что замена Glu-96 на аланин приводит к 400-кратному снижению каталитической активности, которая частично восстанавливается добавлением высоких концентраций Mg2+ (5−10 мМ MgCl2) [185]. В работе [196] была подробно исследована роль остатков Glu-96, Asp-70, Asp-308 и Asp-210 в координации металла и специфическом связывании дезоксирибозы АР-сайта. Так же как и в предыдущей работе, замена Glu-96 на аланин приводила к 600-кратному снижению активности фермента. В то же время активность мутантной формы E96Q АРЕ1 характеризовалась снижением активности более, чем на три порядка, по сравнению с WT 42 АРЕ1. Эти данные свидетельствует о том, что координацию иона металла обеспечивает не только Glu-96, но также и другой невыявленный остаток, содержащий карбоксильную группу (предположительно Asp-70 или Asp-308). Введение мутаций в другие аминокислоты, которые предположительно могли бы участвовать в координации металла, в меньшей степени влияли на эффективность разрезания АР-содержащей ДНК, за исключением Asp-210 (снижение активности на 4 порядка). Важно, что в отсутствие ионов Mg2+ эндонуклеазная активность мутантов E96A и E96Q полностью ингибируется. Таким образом, авторы предполагают, что Glu-96, кроме координации металла, имеет и другую значимую функцию. Например, может образовывать водородную связь с расположенным в непосредственной близости каталитически значимым остатком Tyr-171, тем самым стабилизируя выгодную для катализа конформацию активного центра. Интересные результаты по мутации аминокислот мотива LQE96TK98 были получены в работе Т. Изуми с соавторами [197]. Сначала в ген аре1, содержащий мутацию E96A, методами генетической инженерии были введены случайные мутации. Полученными плазмидами затем трансформировали клетки E. coli генотипа xth¯/nfo¯, лишенные собственных АР-эндонуклеаз. После обработки клеток алкилирующим агентом MMS были отобраны устойчивые клоны, из которых снова выделяли плазмиду для последующего секвенирования. Оказалось, что эндонуклеазную активность сохранили двойные мутанты, содержащие замены E96A и K98R. Кинетический анализ в стационарных условиях показал, что двойного мутант и WT АРЕ1 имеют близкие значения kcat, равные 1,76 и 1,80 с-1, соответственно. При этом значение КМ для E96A/ K98R АРЕ1 в 6 раз превышает КМ для WT АРЕ1, указывая на ослабление специфического сродства фермента к ДНК-субстрату. Другими словами, введение второй мутации по Lys98 невыясненным образом восстанавливает металл-связывающий центр фермента. Авторы предположили, что поскольку аргинин является более сильным основанием, чем лизин, активный двойной мутант вовсе не нуждается в ионе металла для удерживания поврежденной ДНК в активном центре. Однако, зависимость активности E96A/ K98R АРЕ1 от концентрации ионов магния практически совпадает с аналогичной зависимостью для WT АРЕ1, что делает эту гипотезу неправдоподобной. Вероятным объяснением обнаруженного феномена может быть способность АРЕ1 принимать альтернативную каталитически активную конформацию, которая не видна в кристаллической структуре фермента дикого типа. Для установления причин наблюдаемой внутренней супрессии необходимы дополнительные структурные исследования. Первая кристаллическая структура АРЕ1 1BIX содержала ион Sm2+ в качестве кофактора [117]. По данным этой рентгеновской структуры каждая молекула белка 43 связывает в активном центре один ион металла, где он окружен полярными аминокислотами. Ближе всего к иону металла расположены боковые радикалы Glu-96 (2,35 Å), Asp-70 (2,86 Å) и Asp-308 (4,50 Å). По аналогии со структурой ДНКазы I авторы предположили, что Mg2+ координируется с одной стороны остатком Glu-96, а с другой взаимодействует с 5'-фосфатной группой АР-сайта, стабилизируя переходное состояние фермент-субстратного комплекса. Полученная методом РСА структура АРЕ1 с продуктом реакции в активном центре (PDB ID: 1DE9) позволила определить контакты иона металла с поврежденной ДНК [122]. Оказалось, что Mg2+ находится рядом с 5'-фосфатом АР-сайта и, по-видимому, взаимодействует с одним из атомов кислорода гидролизуемой фосфатной группы, стабилизируя уходящую 3'-гидроксильную группу путем прямого контакта либо через молекулу воды первой гидратной оболочки металла (Рис. 12). Новые данные также подтверждают гипотезу о координации иона металла остатком Glu-96. Следует, однако, отметить, что из трех пространственных структур, опубликованных в работе [122], именно структура, содержащая ион Mn2+ в активном центре (PDB ID: 1DE9), имеет довольно низкое разрешение (3 Å), что может вносить некоторую погрешность в интерпретацию результатов. Рис. 12. Пространственная структура активного центра АРЕ1 в комплексе с ДНК-субстратом [122]. Показаны ключевые аминокислотные остатки (белый цвет), АРсайт и фланкирующие его нуклеотиды (оранжевый цвет), ион металла (зеленый цвет). Точечными розовыми линиями показаны возможные водородные связи, зелеными – кулоновские взаимодействия. Авторы другой рентгеновской структуры АРЕ1 1E9N [198] указывают на то, что все описанные выше кристаллы выращивались в слабокислой среде (рН 6,2−6,5), где эндонуклеазная активность фермента значительно снижена. По этой причине ими была предпринята попытка закристаллизовать белок при значении рН, оптимальном для осуществления катализа. На Рис. 13А представлены профили рН зависимости АРэндонуклеазной и ДНК-связывающей активностей АРЕ1, полученные в работе [198]. Очевидно, что оптимальным для проявления обеих активностей является значение рН 7,5. На первом этапе работы авторы кристаллизовали АРЕ1 в кислых условиях (форма I). 44 Структура формы I имела достаточно высокое разрешение, 1,95 Å, за исключением некоторых областей последовательности (остатки 1−42, 102−122, 123−127). Для восстановления пространственной структуры неразрешенных участков авторы использовали опубликованную ранее структуру АРЕ1 1BIX [117]. Затем белок кристаллизовали в буфере с рН 7,5 в присутствии Pb(OAc)2. Новая структура АРЕ1 в нейтральной среде (форма II) имела разрешение 2,2 Å. Тем не менее, в структуре формы II (PDB ID: 1E9N) также имелись участки низкой электронной плотности в области аминокислот 1−43, и 124−125, недостаточной для количественного анализа. Низкая электронная плотность в указанных участках структуры АРЕ1, скорее всего, связана с Рис. 13. (А) Зависимость АР-эндонуклеазной (■) и ДНК-связывающей (○) активностей АРЕ1 от рН среды. (Б) Структура активного центра АРЕ1 с двумя ионами Pb2+ (розовый цвет), полученная при рН 7,5. Точечными линиями показаны электростатические взаимодействия между аминокислотами, ионами металла и водой (красный цвет) [198]. повышенной подвижностью как боковых радикалов аминокислот, так и белковой цепи в целом. Для построения модели пространственной структуры формы II на участках с низкой электронной плотностью авторы использовали данные формы I. Интересно, что полученная в кислых условиях форма I характеризуется наличием одного иона Pb2+, в то время как в активном центре формы II связывается сразу два иона свинца. В результате была предложена новая модель каталитического центра АРЕ1, который одновременно содержит два иона металла. Как следует из структуры, изображенной на Рис. 13Б, расположение одного из ионов свинца полностью совпадает с положением металла во всех ранее опубликованных пространственных структурах АРЕ1. Авторы условно обозначали область связывания первого иона Pb2+, окруженную заряженными остатками Glu-96 и Asp-70, сайтом А. Кроме того, металл в сайте А координирован молекулой воды, которая, в свою очередь, образует водородные связи с боковыми радикалами Asn-68 и Asp-308. Второй сайт связывания металла (сайт Б) в структуре формы II располагается 45 между остатками Asp-210, Asn-212 и His-309 (Рис. 13Б). Причем авторы предполагают, что имидазольное кольцо His-309 непосредственно координирует ион магния, что, однако, не согласуется с общими принципами координации металлов [199, 200]. Металл в сайте Б также контактирует с остатком Tyr-171 через молекулу воды. Ионы свинца находятся на расстоянии 5,1 Å друг от друга, но между ними не наблюдается водородной связи через карбоксильную группу, которая характерна для ферментов, имеющих два иона металла в активном центре [201]. Пространственные координаты аминокислотных остатков, которые участвуют в координации ионов металла в структуре формы II, совпадают с расположением этих остатков в структурах 1BIX и 1DE9 [117, 122]. Это означает, что, вопервых, структура сайта А не зависит от природы связанного металла (Sm2+, Mn2+ или Pb2+), а, во-вторых, сайт Б является предформированным для связывания металла. Теоретически сайт Б должен располагаться ближе к разрываемой связи, чем сайт А, поэтому предполагается, что металл в сайте Б участвует в стабилизации гидроксил-аниона для атаки на фосфат-мишень. Для подтверждения гипотезы об участии двух ионов металла в катализе, авторы регистрировали уровень АР-эндонуклеазной активности АРЕ1 в реакционной смеси, содержащей одновременно CaCl2 и MgCl2 в суммарной концентрации 10 мМ. Известно, что ион Ca2+ не является кофактором АРЕ1 и ингибируют ее активность. В результате была получена зависимость активности белка от отношения [Ca2+]/[Mg2+], которая имеет двухфазный характер: возрастает при высоких и падает при низких значениях указанного отношения. Аналогичные колоколообразные зависимости были показаны для ферментов с двумя центрами связывания металла с разными константами сродства к каждому из центров [202, 203]. Сопоставляя опубликованные ранее данные по сайт-направленному мутагенезу АРЕ1 с новой структурой активного центра авторы работы [198] пришли к следующим выводам: 1) роль ионов магния заключается в стабилизации специфической конформации ДНК-субстрата, удобной для нуклеофильной атаки на 5'-фосфат; 2) генерация атакующего нуклеофила, а также стабилизация уходящей группы могут осуществляться по Mg2+-независимому механизму. Однако, последнее утверждение противоречит экспериментальным данным, которые демонстрируют зависимость скорости распада комплекса АРЕ1 с продуктом реакции от концентрации ионов металла [204]. В одной из недавних работ по молекулярному моделированию структуры (MD) АРЕ1 с ДНК-субстратом, также сообщается о существовании двух стабильных сайтов связывания металла внутри активного центра фермента [205]. Разница заключается в том, что по данным MD-симуляции в каталитическом превращении участвует один ион Mg2+, который перемещается из сайта Б в сайт А в ходе реакции. 46 Поскольку структуры АРЕ1, полученные методом РСА, дают противоречивые результаты, исследование координации металла в активном центре было продолжено методом [25Mg] ЯМР. Авторы работы [206] изучали связывание АРЕ1 с металлом в отсутствие ДНК, а также тройные комплексы АРЕ1 с субстратом и ионом Mg2+ при температурах, близких к 0ºС, в высушенных образцах. Предполагается, что при низких температурах не происходит заметного накопления продуктов реакции (<5%), что позволяет регистрировать спектры ЯМР комплексов АРЕ1 с поврежденной ДНК и металлом в активном центре. В качестве контроля использовали спектры мутантной формы E96Q/D210N АРЕ1, в которой были заменены ключевые аминокислоты, участвующие в координации ионов металла в сайтах А и Б, что исключало связывание Mg2+. Количественная обработка полученных спектров свидетельствует о существенной разупорядоченности ближайшего окружения металла, что могло стать результатом одновременного связывания двух ионов металла в активном центре фермента. Для выяснения причины наблюдаемого двойного резонанса была использована мутантная форма E96Q АРЕ1, в которой затруднено связывание металла в сайте А. В случае, если в активном центре все же существует второй металл-связывающий центр Б, спектры ЯМР для такой мутантной формы белка должны были содержать одиночный сигнал от Mg2+, координированного в сайте Б. Однако, сопоставление полученного спектра для E96Q АРЕ1 со спектром двойного мутанта E96Q/D210N, который заведомо не содержал ионов магния, не выявило значимых различий. Другими словами, данные ЯМР подтверждают существование единственного сайта связывания металла в активном центре АРЕ1, а специфику наблюдаемых спектров WT АРЕ1 с Mg2+ авторы объясняют статической разупорядоченностью лигандов в координационной сфере иона металла. Способность металл-связывающего центра АРЕ1 вмещать атом свинца, ионный радиус которого в два раза больше радиуса магния, свидетельствует в пользу гипотезы о его пластичности [198]. При этом наличие большего свободного пространства вокруг иона Mg2+ допускает вариации во взаимном расположении координирующих лигандов (цис-, транс-). Все рассмотренные выше структуры АРЕ1 содержали в качестве кофактора различные двухвалентные металлы-заменители (Sm2+, Mn2+, Pb2+), поскольку ион Mg2+ изоэлектронен с ионом Na+ и это затрудняет их разделение в структурах белков. Кроме того, долгое время не удавалось получить кристалл фермента достаточного разрешения с ионом магния в активном центре, ввиду неполной занятости сайтов связывания металла в растворе исследуемых белков. С другой стороны, следует учитывать, что ионы свинца ингибируют активность АРЕ1 in vitro со значением IC50 0,61 мкМ [207], что может быть причиной неадекватной картины координации иона металла в структуре, содержащей 47 свинец. В 2011 г. в банке данных пространственных структур была зарегистрирована структура АРЕ1 с ионом Mg2+ (PDB ID: 3u8u), однако статья, описывающая эту структуру, так и не была опубликована. Недавно сразу две группы исследователей сообщили о новых кристаллических структурах АРЕ1 с природным кофактором Mg2+ без ДНК (PDB ID: 4LND) [208], а также с ДНК-продуктом в активном центре (PDB ID: 4IEM) [184]. Обе структуры имеют достаточно высокое разрешение 1,92 и 2,4 Å, соответственно, но попрежнему не дают информации о расположении в пространстве аминокислот 1−43. В обеих структурах обнаруживается только один ион магния в активном центре. В структуре комплекса АРЕ1 с продуктом реакции координацию металла обеспечивают ближайший остаток Glu-96, атом кислорода 3'-гидроксильной уходящей группы, 5'фосфатная группа, а также молекула воды, которые вместе образуют тетраэдр (Рис. 14А). Еще две молекулы Н2О, взаимодействующие с боковыми радикалами Asp-70 и Asn-68, занимают недостающие положения в координационной сфере Mg2+. Рис. 14. (А) Координация иона металла в кристаллической структуре комплекса АРЕ1 с ДНКпродуктом, полученной с использованием Mg2+ в качестве кофактора [188]. Ион магния (зеленый цвет) координирован тремя молекулами воды (красный цвет), остатком Glu-96 и концевыми группами разорванной цепи ДНК. (Б) Структура активного центра АРЕ1 с ионом Mg2+, но без ДНК-субстрата [208]. Пунктирные линии изображают вероятные водородные связи. Авторы структуры свободного фермента [208] показали, что в отсутствие ДНК группы, координирующие металл, образуют идеальный октаэдр, который включает две карбоксильные группы Glu-96 и Asp-70 и четыре молекулы воды (Рис. 14Б). Боковые радикалы Asn-68 и Asp-308 обеспечивают поляризацию связей в молекулах Н2О из координационной сферы металла. Расстояние между ионом магния и координирующими лигандами (карбоксильные группы и вода) соответствует известным значениям для других Mg-зависимых ферментов [200]. Кроме того, согласно результатам, полученным в работе [209], при низких концентрациях MgCl2 (0,5−1 мМ) эндонуклеазная активность мутантных форм D70R и D308A значительно снижается, по сравнению с WT АРЕ1. Этот факт свидетельствует о важной роли остатков Asp-70 и Asp-308 в координации металла. 48 Между тем, прямая координация Mg2+ карбоксильной группой Asp-70 ставится под сомнение авторами, исследовавшими активность мутантных форм D70А и D70R АРЕ1, поскольку любая из замен снижает активность фермента только в 26 раз [196]. Таким образом, структуры c природным кофактором Mg2+ уточняют расположение иона магния в сайте связывания А, но не подтверждают наличие второго иона металла в сайте Б. Как следует из Рис. 14Б, второй сайт связывания металла с большей вероятностью занимает молекула воды, которая участвует в образовании сети водородных связей между боковыми радикалами Asp-210, Asn-212 и His-309. Расстояние между контактирующими остатками (≥ 2,5 Å) в структуре свободного фермента 4LND, а также геометрия их координации, не подходят для связывания второго иона Mg2+ [208]. Сравнение структуры активного центра свободного фермента 4LND со структурой 4IEM комплекса фермента с продуктом ЕР, содержащим разрыв в одной из цепей, показывает, что при связывании с ДНК положение консервативных аминокислотных остатков практически не меняется, за исключением Glu-96, плоскость карбоксильной группы которого оказывается повернутой на 90º. В структуре свободного фермента один из атомов кислорода карбоксильной группы Glu-96 участвует в координации металла, а другой образует водородную связь с молекулой воды. При связывании с ДНК-продуктом один из упомянутых атомов кислорода остается связанным с ионом магния, в то время как другой образует новую связь с 3'-ОН группой продукта. При этом ион Mg2+ в комплексе ЕР смещается на 2,2 Å относительно свободного фермента. Сравнение структур 4IEM и 4LND позволяет заключить, что ион металла не меняет значительно своего положения при осуществлении каталитических функций, которые, вероятнее всего, включают закрепление гидролизуемой фосфатной группы в нужном положении, поляризацию разрываемой связи Р−О и стабилизацию 3'-гидроксильной уходящей группы [59, 208]. Недавно были опубликованы новые рентгеноструктурные данные, характеризующие координацию иона металла в активном центре АРЕ1 [210]. В работе сообщается о трех новых кристаллических структурах свободного фермента, а также АРЕ1 в комплексе с Mg2+ и Mn2+ PDB ID: 4QHD, 4QHE и 4QH9, соответственно, которые были получены с самым высоким разрешением 1,65 Å, 1,4 Å и 2,17 Å. Для того, чтобы внести ясность в вопрос о количестве ионов металла в активном центре, а также уточнить роль аминокислотных остатков в первичном связывании металла, авторы провели детальное сравнение трех полученных моделей. Строго говоря, проводить адекватное сравнение структур можно лишь в случае, если они имеют одинаковую кристаллическую форму. Поэтому получение кристаллов свободного фермента и фермента в комплексе с металлами, имеющих одинаковую группу симметрии, представляло сложную 49 практическую задачу. На первом этапе работы было установлено, что замена Cys-138 на аланин повышает растворимость АРЕ1 и облегчает его кристаллизацию даже в отсутствие ионов металла. При этом уровень АР-эндонуклеазной активности мутантной формы C138A АРЕ1 соответствовал уровню активности WT АРЕ1. Поэтому для кристаллизации каждого комплекса использовали указанную мутантную форму, в последовательности которой к тому же отсутствовали первые 40 аминокислот с N-конца. Полученные кристаллы имели одну и ту же группу симметрии P21212 с одинаковыми параметрами ячейки, за исключением параметра b, который составлял 141 Å для свободного фермента, 140 Å для комплекса АРЕ1-Mn2+ и 137,5 Å для комплекса АРЕ1-Mg2+. Наложение трех структур показало, что снижение значения параметра b при связывании иона металла белком АРЕ1 является результатом смещения поверхностных спиральных и петлевых элементов глобулы, содержащих остатки 77-86, 98-102 и 106-113. На основании этих данных авторы предположили, что связывание кофактора в активном центре вызывает изменение конформации фермента. Что касается координации иона металла, то новые структуры также обнаруживают единственный сайт связывания двухвалентного металла в активном центре АРЕ1, где он образует водородные связи с остатками Glu-96, Asp-70 и молекулами воды (Рис. 15). Интересно, что в случае комплекса АРЕ1-Mg2+ сайт связывания демонстрирует заметное разупорядочение. Это означает, что один и тот же Рис. 15. Строение металл-связывающего центра свободного АРЕ1 (А), а также комплексов АРЕ1-Mn2+ (Б) и АРЕ1-Mg2+ (В, Г) по данным [210]. На каждом рисунке белковая цепь окрашена в серый цвет, а важнейшие боковые радикалы в желтый. Атомы кислорода показаны красным, ион марганца зеленым, а ион магния розовым цветом. Пунктирные линии обозначают расстояние между атомами. атом магния с определенной долей вероятности может находиться в двух различных положениях внутри активного центра фермента. Авторы определили, что два предполагаемых места локализации Mg2+ (сайты А и Б) находятся на расстоянии 0,7 Å друг от друга (Рис. 15В и Г). Важно отметить, что указанные сайты не соответствуют описанным на стр. 45-46 сайтам связывания А и Б в структуре АРЕ1 1E9N, содержащей два иона металла в активном центре. В новой структуре 4QH9 Mg2+ в сайте А, который он занимает с вероятностью 35%, координирован, главным образом, карбоксильной группой Glu-96, в то время как в сайте Б, которому соответствует вероятность 65%, ион металла в 50 равной степени связан как с Glu-96, так и с Asp-70. Авторы указывают на то, что расстояние между атомом О глутамата и ионом металла в сайте А составляет 2 Å, в то время как в сайте Б 2,4 Å. Основное отличие между сайтами связывания А и Б заключается в пространственной ориентации карбоксильной группы Glu-96, которая поворачивается примерно на 90º. Остальные каталитически значимые аминокислоты активного центра, в том числе Asp-210, Asn-212 и His-309 не изменяют своего положения при связывании иона металла. Полученные данные согласуются с результатами анализа АРЕ1 методом [25Mg] ЯМР [206], которые также продемонстрировали существенную разупорядоченность ближайшего окружения иона металла. Таким образом, новые структурные данные свидетельствуют в пользу гипотезы об участии одного иона металла в катализе, а также подтверждают высказывавшееся ранее [206] предположение о пластичности металл-связывающего центра АРЕ1. 1.3.4. Механизм каталитической реакции АРЕ1 Эндонуклеазы семейства ExoIII катализируют разрыв 5'-фосфодиэфирной связи АР-сайта в ДНК путем кислотно-основного гидролиза, протекающего по SN2-механизму. Для реализации этого механизма в активном центре должны произойти следующие события: 1) образование нуклеофильной группы; 2) нейтрализация и ориентация отрицательно заряженных атомов кислорода 5'-фосфата; 3) формирование пентакоординированного переходного состояния; 4) стабилизация фосфомоноэфирной уходящей группы. Чаще всего ферменты, катализирующие разрыв фосфодиэфирной связи, действуют по одно- или двухстадийному механизму. В одностадийном механизме, который, в частности, реализуется рестриктазами второго типа, активированная молекула воды атакует фосфатную группу с образованием нестабильного пентакоординированного переходного комплекса, который затем распадается с разрывом цепи ДНК [211]. В случае двухстадийного механизма в качестве атакующего нуклеофила выступает один из аминокислотных остатков фермента, образуя ковалентную связь с фосфатной группой мишени [212]. На второй стадии с участием молекулы воды происходит распад интермедиата и высвобождение продуктов реакции из активного центра. Несмотря на многочисленные исследования, роль атакующего нуклеофила в катализируемой АРЕ1 человека реакции продолжает оставаться предметом дискуссий. По аналогии со структурами гомологов ExoIII и ДНКазы I в качестве атакующего нуклеофила может выступать молекула Н2О, активированная атомом N1 имидазольного кольца гистидина, электронная плотность на котором перераспределяется благодаря взаимодействию с карбоксильной группой аспартата [52, 213]. Структурные данные подтверждают, что 51 боковые радикалы Asp-283 и His-309 располагаются на близком расстоянии и практически в одной плоскости в активном центре АРЕ1 [117]. Таким образом, His-309 мог бы играть роль основания, которое оттягивает протон от молекулы воды, создавая гидроксил-ион для атаки на фосфодиэфирную связь. Введение мутаций по указанным остаткам полностью элиминирует эндонуклеазную активность фермента [185], сохраняя способность связывать ДНК-субстрат [177], что также свидетельствует об их значимой роли в катализе. Однако результаты исследования кристаллической структуры комплекса АРЕ1 с ДНК показала, что в активном центре пара Asp-283/His-309 скорее всего непосредственно взаимодействует не с молекулой воды, а с одним из атомов кислорода гидролизуемой фосфатной группы путем образования водородной связи с атомом N1 Рис. 16. Предполагаемый механизм разрыва фосфодиэфирной связи АР-сайта ферментом АРЕ1, основанный на рентгеноструктурных данных 1DEW, 1DE8 и 1DE9 [122]. протонированного гистидина (Рис. 16) [122]. Роль этого взаимодействия заключается в ориентации и поляризации разрываемой связи Р−О. Амидные группы Asn-174 и Asn-212 также образуют водородные связи с атомами кислорода 5'-фосфатной группы АР-сайта, стабилизируя переходное состояние фермент-субстратного комплекса. В данном механизме нуклеофильная атака на фосфодиэфирную связь обеспечивается остатком Asp210, который поляризует Н−О связь в молекуле воды. При этом ион Mg2+ стабилизирует уходящую 3'-ОН-группу путем прямого либо опосредованного (через молекулу воды) взаимодействия. Авторы рентгеновской структуры АРЕ1 с двумя ионами Pb2+ в активном центре (1E9N), полученной для рН 7.5, предложили новый механизм превращения, в котором один из ионов металла генерирует нуклеофил (ОН−) для атаки на фосфодиэфирную связь [198]. Депротонирование боковых радикалов аминокислот при нейтральных значениях рН делает возможным связывание второго иона металла в активном центре (сайт Б). Поскольку в этом случае все ключевые остатки оказываются вовлеченными в 52 координацию Mg2+, то главным претендентом на осуществление нуклеофильной атаки становится сам ион металла. Суперпозиция структур 1E9N и 1DE8 [122] позволила авторам построить модель предкаталитического комплекса АРЕ1 с ДНК и двумя ионами металла в активном центре (Рис. 17). В модельной структуре Mg2+ из сайта Б, координированный остатками Asp-210, Asn-212 и His-309, располагается очень близко Рис. 17. Схематическое изображение модели комплекса АРЕ1 с АР-содержащей ДНК. Стрелками показана нуклеофильная атака гидроксид-аниона на фосфодиэфирную связь субстрата. МеА и МеВ обозначают сайты связывания иона металла А и Б, соответственно [198]. к двум неэтерифицированным атомам кислорода фосфатной группы мишени, поэтому, вероятнее всего, стабилизирует гидроксид-анион для осуществления нуклеофильной атаки на фосфодиэфирную связь субстрата. Кроме того, ион магния в сайте Б участвует в нейтрализации отрицательного заряда, возникающего на фосфорановой группировке переходного состояния 2+ расположениеMg фермент-субстратного комплекса. В то же время, в сайте связывания А на расстоянии 2,7 Å от атома кислорода 3'-ОН- группы свидетельствует о его роли в удерживании продуктов реакции в активном центре. Предложенный каталитический механизм с участием двух ионов металла аналогичен механизму, установленному для ДНК-полимеразы I из E. coli [214]. Дальнейшее изучение комплекса АРЕ1 с ДНК методом молекулярной динамики показало, что каталитический разрыв фосфодиэфирной связи АР-сайта может осуществляться и по совершенно иному механизму. Авторы работы [183] определяли минимум потенциальной энергии для иона магния, находящегося в комплексе с АРЕ1 и АР-содержащей ДНК. Результаты MD-симуляции структуры свидетельствуют о существовании трех локальных минимумов для Mg2+, два из которых располагаются рядом с предполагаемым сайтом Б (292,2 ккал/моль и -283,1 ккал/моль) и один соответствует сайту связывания А (-281,4 ккал/моль). Авторы указывают на то, что расстояние между ионами магния в модельной системе составляет 5,7 Å, тогда как типичное расстояние между ионами металла в фосфатазах не превышает 4,0 Å. Более того, если проводить MD-симуляцию комплекса 53 АРЕ1 с ДНК и двумя ионами металла в активном центре, то в течение 500 пс два иона расходятся на расстояние 7,6−7,7 Å. На основании этих данных был сделан вывод, что два иона металла не могут одновременно находиться внутри активного центра АРЕ1 в присутствии ДНК-субстрата. С другой стороны, во время симуляции комплекса АРЕ1 с неповрежденной ДНК и одним ионом Mg2+, помещенным в сайт Б либо А, металл сохранял свое положение либо перемещался в сайт Б в ходе минимизации. Преимуществом метода молекулярной динамики является возможность наблюдать движение атомов в активном центре в процессе минимизации, тогда как метод РСА дает только статичную информацию о расположении атомов до либо после реакции. Симуляция комплекса АРЕ1 с искусственно разрезанным субстратом и ионом металла в сайте Б показала, что в ходе минимизации Mg2+ мигрирует из сайта Б в сайт А, проходя расстояние в 4,6 Å [183]. Положение 5'-фосфата остается неизменным, в то время как 3'концевой фрагмент продукта реакции смещается на 2,6 Å, чтобы занять положение, наблюдаемое в кристаллической структуре 1DE9. К концу симуляционного интервала ион металла переходит на противоположную сторону разрыва ДНК, где его координируют аминокислоты Asn-68, Asp-70, Glu-96, Asp-308 и атом кислорода 5'-концевой фосфатной группы. Смещение 3'-концевого фрагмента продукта делает обратную реакцию невозможной. Было замечено, что движение иона металла зависит от результирующего заряда боковых радикалов аминокислот активного центра. Если Asp-210 и His-309 были по отдельности протонированы перед началом минимизации, Mg2+ не смещается в ходе симуляции. Карбоксильная группа Glu-96, координирующая ион металла, двигалась вместе с ним во всех симуляциях, в то время как ключевой остаток Asn-212, стабилизирующий ДНК-субстрат посредством водородной связи с атомом кислорода 5'фосфата, не менял своего положения в ходе симуляций. Полученные результаты стали основой для нового каталитического механизма, который предполагает, что один ион 54 Рис. 18. Схематическое изображение положения иона Mg2+ и нековалентных взаимодействий в активном центре АРЕ1 до (слева) и после (справа) разрыва фосфодиэфирной связи [183]. Mg2+ в ходе превращения субстрата в продукт перемещается из более погруженного в активный центр сайта связывания Б в сайт А, расположенный ближе к поверхности белка (Рис. 18). При этом один из атомов кислорода карбоксильной группы Asp-210 выступает в качестве акцептора протона, активируя молекулу воды для нуклеофильной атаки на фосфатную группу. Предполагается, что движущими силами для перемещения иона металла в сайт А служат смещение нового 3'-конца продукта, дополнительный протон, полученный Asp-210 от молекулы воды, а также инверсия фосфатной группы в процессе катализа, о которой сообщалось в более ранних исследованиях [122]. Молекулярное моделирование комплекса АРЕ1 с АР-содержащей ДНК, а также с двумя либо с одним ионом Mg2+, было впоследствии использовано для уточнения механизма действия АРЕ1 тем же коллективом авторов [205]. Симуляция структуры комплекса АРЕ1 с нерасщепленным субстратом показала, что металл, помещенный в сайт А, дестабилизирует фермент-субстратный комплекс, в то время как один металл в сайте Б или два иона металла закрепляют субстрат в положении, наблюдаемом в кристаллической структуре 1DE8 [122]. В 2004 г. Ф. Страусс с соавторами предложили двухстадийный механизм катализа АРЕ1, в котором в качестве атакующего нуклеофила выступает Tyr-171 [215]. В основе предположения лежали результаты анализа влияния рН и имидазола на активность эндонуклеазы АРЕ1, мутантной по Tyr-171. Имидазол является сильным основанием, поэтому добавление его в реакционную смесь должно приводить к депротонированию доступных гидроксильных групп, в частности, переводить боковой радикал тирозина в 55 фенолятную форму. Было показано, что добавление имидазола действительно стимулирует эндонуклеазную активность WT АРЕ1 (272%), а также мутантной формы Y171А АРЕ1 (71%), однако не влияет на активность мутантной формы Y171F, в которой тирозин заменен на фенилаланин. Аналогичное влияние на активность различных форм фермента оказывало повышение значения рН раствора с 7.4 до 10.1. Полученные данные косвенно подтверждают ключевую роль фенолятной формы Tyr-171 в превращении субстрата в продукт. Таким образом, в случае АРЕ1 мог бы реализовываться двухстадийный механизм катализа. В 2009 г. авторы работы [215] предприняли дополнительное исследование механизма АРЕ1, в котором анализировали продукты превращения ферментом АРЕ1 ДНК-субстратов, содержащих фосфотиоатную группу на 5'-стороне F-сайта [216]. ДНК и РНК с фосфотиоатной группировкой нередко используются для изучения стереохимии ферментативных реакций, поскольку при проведении реакции в растворе Н218О получаются хиральные продукты. Последующая обработка продуктов гидролиза таких субстратов ДНК-лигазой Т4 в случае реализации одно- либо двухстадийного механизма должна приводить к исчезновению либо сохранению метки 18 О в ДНК. Ранее было показано, что ДНК, содержащая фосфотиоатную группу на 5'-стороне F-сайта, гидролизуется АРЕ1 в 20 раз медленнее, чем субстрат с обычной фосфатной группой [124]. Продукты взаимодействия фосфотиоатсодержащих субстратов АРЕ1 и ДНК-лигазой были проанализированы с помощью ESITOF масс-спектрометрии. Оказалось, что в случае АРЕ1 реализуется ассоциативный одностадийный механизм катализа, в котором в качестве атакующего нуклеофила выступает активированная молекула воды, а не гидроксильная группа фермента. Корме того, было установлено, что АРЕ1 действует стереоспецифично и взаимодействует только с Rp стереоизомером фосфотиоатного субстрата, но не Sp стереоизомером. Полученные данные позволили авторам предположить, что именно остаток His-309 действует как акцептор протона молекулы воды, генерируя нуклеофил. Эта гипотеза подтверждается результатами [25Mg] ЯМР анализа АРЕ1, свидетельствующими о том, что остаток His-309 при нейтральных значениях рН находится в депротонированной форме, что позволяет ему выступать в роли основания [206]. В то же время остаток Tyr-171, вероятно, участвует в ориентации АР-сайта в удобной для катализа конформации. В свете полученных результатов обобщенный механизм катализа должен выглядеть следующим образом. Связывание с ДНК-субстратом и ионом металла переводит АРЕ1 в каталитически активную форму. Двухвалентный катион, по-видимому, вызывает возмущение в молекулярном окружении Tyr-171, которое позволяет этому остатку ориентировать АРсайт и фосфатную группу для катализа. В это время Glu-96 связывается с Mg2+, который 56 также взаимодействует с неэтерифицированным атомом О 5'-фосфата, обеспечивая образование положительного заряда на атоме фосфора. Нуклеофильная атака молекулы воды на фосфатную группу приводит к возникновению пентакоординированного переходного состояния и, затем, к вытеснению 3'-уходящей группы и разрыву фосфодиэфирной связи [216]. В последние 2 года были опубликованы две новые кристаллические структуры АРЕ1 с природным кофактором Mg2+ (4LND и 4IEM), которые показали, что в генерации атакующего нуклеофила, вероятнее всего, участвуют другие аминокислоты, нежели предполагавшиеся ранее [184, 208]. Новые данные указывают на то, что имидазольное кольцо His-309 находится на расстоянии более чем 3,5 Å от предполагаемого положения Н2О-нуклеофила, что затрудняет их нековалентное взаимодействие. В то же время предполагаемый сайт связывания металла Б в этих структурах содержит молекулу воды, которая координирована остатками Asp-210 и Asn-212. Расстояние и геометрия расположения указанных остатков свидетельствует о том, что с высокой вероятностью именно Asp-210 и Asn-212 активируют Н2О для нуклеофильной атаки на 5'-фосфат АРсайта. Сравнивая активные центры структурно негомологичных белков АРЕ1 человека и Nfo E. coli, авторы работы [184] заметили, что предполагаемая «каталитическая триада» (Asp-210, Asn-212 и Н2О) в АРЕ1 расположена аналогично двум ионам Zn2+ в Nfo, участие которых в генерации гидроксид-аниона для атаки на субстрат уже было доказано. К тому же, по результатам MD симуляции боковые радикалы Asp-210 и Asn-212 действительно образуют сеть водородных связей, располагаясь на расстоянии 2,65 и 2,83 Å от молекулы воды, соответственно [188]. 1.3.5. Кинетические параметры АР-эндонуклеазной реакции, катализируемой АРЕ1 Фосфодиэфирные связи в ДНК и РНК чрезвычайно устойчивы к спонтанному гидролизу, что, в частности, объясняется сильным электростатическим отталкиванием между отрицательно заряженными атомами кислорода фосфатных групп и окружающими нуклеофилами. Ферменты, катализирующие разрыв цепи ДНК и РНК, способны ускорять эту реакцию до 1016 раз, что достигается разделением одного высокоэнергетического химического превращения на несколько отдельных стадий с низкой энергией активации [217]. Таким образом, ферментативный катализ представляет собой многоступенчатый процесс, призванный осуществить данное химическое превращение с минимальными затратами энергии. На Схеме 1 механизм ферментативной реакции представлен в общем виде. 57 Схема 1 E – фермент, S – субстрат, ES…ESi – промежуточные фермент-субстратные комплексы, ЕР – комплекс фермента с продуктом, Р − продукт реакции, Ka – равновесная константа ассоциации комплекса ES, ki, k-i – константы скорости промежуточных стадий механизма, Kd – равновесная константа диссоциации комплекса ЕР. Теоретически каждая из промежуточных стадий с наименьшей константой скорости может являться лимитирующей, т.е. определять скорость всего процесса. Известно, что у разных ферментов лимитирующими могут быть совершенно разные стадии механизма, в частности, образование специфического комплекса между ферментом и субстратом, его химическое превращение или высвобождение продукта реакции из активного центра. Во многих работах исследовалась скорость и эффективность реакции разрыва ДНК, катализируемой АРЕ1 человека, и влияние различных факторов на ее протекание. Однако вопрос о том, какая из стадий механизма лимитирует процесс, остается открытым, вследствие наличия большого количества нередко противоречащих друг другу данных. Кинетические исследования катализируемой АРЕ1 реакции свидетельствуют о высокой скорости и эффективности превращения субстрата. Действительно, при взаимодействии АРЕ1 с 18-звенным дуплексом ДНК, содержащим синтетический аналог АР-сайта F в одной из цепей, в буфере с 10 мМ MgCl2 при 37ºС значения констант KM и kcat составляют 16 нМ и 4,5 с-1, соответственно [124]. Если вместо дезоксирибозы АР-сайта встраивать в последовательность ДНК-субстрата остатки 1,2-этандиола либо 1,3пропандиола, то число оборотов фермента снижается не более, чем в 2,3 раза, что говорит о несущественной роли рибозного кольца в катализе [129, 199]. С другой стороны, 20кратное снижение скорости разрезания ДНК, содержащей фосфотиоатную группу на 5'стороне АР-сайта, позволяют предположить, что стадия непосредственного разрыва фосфодиэфирной связи является лимитирующей в этом процессе [124]. Первый кинетический механизм реакции был предложен в работе Ф. Страусс с сотрудниками [218]. Механизм соответствовал модели Бриггса-Холдейна (Схема 2), причем самой быстрой стадией являлся распад комплекса фермент-продукт ЕDNANicked. Схема 2 KM = (koff + k2)/kon, k2 = kcat, k3 >> k2 E – фермент, DNAAbasic – субстрат, EDNAAbasic – промежуточный фермент-субстратный комплекс, Е DNA Nicked – комплекс фермента с продуктом, DNANicked − продукт реакции, kon, koff – константы скорости образования и распада комплекса EDNAAbasic, k2 – константа скорости разрыва фосфодиэфирной связи субстрата, k3 – константа диссоциации комплекса Е DNANicked. 58 В работе [218] были определены количественные параметры связывания и превращения субстрата белком АРЕ1 с использованием 49-звенных дцДНК, которые содержали природный АР-сайт в 21-м положении с 5'-конца последовательности. Реакции проводили в условиях избытка субстрата в присутствии 5 мМ MgCl2 при 25 ºС. Было установлено, что в указанных условиях значения KM и kcat составляют 100 нМ и 10 с-1, соответственно. kon Для изучения стадии связывания ( E S ES ) АРЕ1 с ДНК-субстратом реакцию koff проводили в условиях, соответствующих псевдо-первому порядку реакции. С использованием дополнительного лиганда-ловушки, который ингибирует активность свободного, не связанного с субстратом, фермента были установлены значения констант kon = 5×107 М-1с-1 и koff ≈ 0,04 с-1. Таким образом, равновесная константа диссоциации комплекса (ЕS) составила 0,8 нМ. Следует отметить, что в более позднем исследовании [190] Ф. Страусс с сотрудниками, значение константы Kd для связывания WT АРЕ1 со специфическим субстратом было пересмотрено и составило 4,0 ± 0,7 нМ. В работе [218] было также отмечено, что в случае, если бы лимитирующей стадией процесса было высвобождение продукта реакции из активного центра фермента или какая-то другая стадия, следующая за разрывом фосфодиэфирной связи, то кинетические кривые накопления продукта реакции имели бы двухфазный характер со скачком (от англ. burst) на начальном участке. Полученные кинетические зависимости не выявили указанного эффекта. Кроме того, если предположить, что лимитирующей является стадия гидролиза фосфодиэфирной связи, то отношение kcat/KM = 2,8×108 М-1с-1 должно характеризовать кажущуюся константу скорости связывания субстрата второго порядка. В самом деле, разница между указанным отношением и значением константы kon составляет менее одного порядка. Однако, в 1998 г. Б. Дэмпл с соавторами впервые показали существование прочного комплекса между АРЕ1 и продуктом реакции [177]. Для этого предварительно гидролизованный 51-звенный F-содержащий субстрат (1 нМ) смешивали с ферментом (0−16 нМ) в буфере, содержащем 1 мМ ЭДТА, и выдерживали на льду в течении 10 мин. Количество связанной с ферментом ДНК определяли методом задержки в геле (EMSA). Значение константы диссоциации (Kd) комплекса WT АРЕ1 с продуктом реакции составило 4 нМ, что говорит о его прочтности. В этой же работе было показано, что константа Kd для комплекса АРЕ1 с 51-звенной F-содержащей ДНК составляет 3 нМ. Таким образом, сродство АРЕ1 к ДНК-субстрату и гидролизованному продукту практически совпадают, что ставит под сомнение гипотезу о быстром распаде комплекса ЕР. В следующей работе тех же авторов [204] исследовалось влияние ионов Mg2+ на 59 стабильность комплексов АРЕ1 с продуктом реакции. Добавление большого избытка немеченого субстрата к смеси АРЕ1 с [32Р]-меченым продуктом и 1 мМ ЭДТА (либо 1 мМ MgCl2) инициировало диссоциацию комплекса (ЕS). Количество оставшегося комплекса регистрировали через определенные промежутки времени с применением метода EMSA (Рис. 19). Было показано, что в начальный момент времени количество связанного с белком ДНК-продукта не зависит от присутствия ионов металла в растворе. Это означает, Обозначения MgCl2 0 мМ 1 мМ WT ■ ○ D308A + ∆ APE1 Рис. 19. Диссоциация комплекса WT и D308A APE1 с [32Р]-меченым продуктом реакции в отсутствие и в присутствии 1 мМ MgCl2. Распад комплекса ЕР инициировали добавлением 100кратного избытка «холодного» субстрата после инкубации смеси при 0 ºС в течение 10 мин. Количество связанной ДНК определяли методом задержки в геле. что кофактор не влияет на общее сродство фермента к продукту реакции, однако диссоциация комплекса ЕР в присутствии 1 мМ MgCl2 протекает медленнее, чем в его отсутствие. При этом характер диссоциации комплекса мутантной формы D308A с продуктом реакции был обратным, т.е. добавление ионов металла ускоряло его диссоциацию. Авторы предположили, что Asp-308 обеспечивает прочное связывание металла с ферментом, который, в свою очередь, образует прочный комплекс с поврежденной ДНК. Введение мутации по указанному остатку нарушает это взаимодействие и ослабляет комплексообразование с ДНК. Данные по влиянию иона Mg2+ на связывание и каталитическую активность АРЕ1, полученные в работе [204], указывают на то, что именно стадия распада комплекса с продуктом ЕР является наиболее медленной и определяет скорость всего процесса при средних и низких концентрациях иона металла (1−3 мМ). В то же время при высоких концентрациях ионов магния (≥ 5 мМ) скорость распада комплекса возрастает, и это может приводить к смене лимитирующей стадии. Дальнейшее исследование механизма связывания субстрата белком АРЕ1 было продолжено в работе [219], где были использованы условия одного оборота фермента Сравнение кинетических параметров, полученных для WT и D308A АРЕ1, обнаружило дополнительную стадию механизма, предшествующую катализу. В соответствии с уточненной Схемой 3 связывание иона металла в активном центре вызывает изменение конформации фермента, которое, в случае мутантного белка, протекает настолько медленно, что может оказывать влияние на скорость всего процесса. 60 Схема 3 В работе [175], посвященной исследованию процессивности АРЕ1 (см. стр. 33), также определяли кинетические параметры гидролиза 25-звенных ДНК, содержащих АРсайт. Значения констант KM и kcat составили 120 ± 50 нМ и 6,0 ± 0,3 с-1, что согласуется с соответствующими константами для 49-звенного субстрата, опубликованными в работе [218]. Прочность комплекса фермента с субстратом, выражаемое равновесной константой Kd, определяли в условиях одного оборота фермента. Полученное значение 1,2 нМ также коррелировало с аналогичной величиной для к 49-звенного субстрата. На основании этих данных авторы работы [175] делают вывод, что скорость превращения субстрата ферментом АРЕ1 не зависит от его длины. Данная гипотеза находит подтверждение в результатах других экспериментов, которые показывают, что значение константы kcat для разрезания гетерогенной 24-звенной дцДНК (6,7 с-1), содержащей природный АР-сайт, белком АРЕ1 соотносится с kcat для плазмидной ДНК с 1-2 АР-сайтами (2−7 с-1) [192]. Следует однако отметить, что по данным того же исследования kcat для 14-звенной АРсодержащей ДНК, последовательность которой содержала только А:Т пары, составляет 0,27 с-1, что в 16 раз меньше скорости разрезания 18-звенного субстрата, которая была установлена в работе [124]. Стационарная кинетика, описывающаяся уравнением Михаэлиса, при всех своих достоинствах, не позволяет установить многие детали механизма реакции. Для изучения отдельных событий, которые происходят в активном центре в процессе узнавания субстрата ферментом и в ходе каталитического цикла, используются методы нестационарной кинетики. В работе [220] эндонуклеазная активность АРЕ1 была впервые охарактеризована с использованием предстационарной кинетики. За протеканием реакции следили по изменению анизотропии флуоресценции красителя родамина, связанного через амино-линкер с поврежденной цепью 25-звенного F-содержащего субстрата. Эксперименты по равновесному связыванию АРЕ1 с ДНК позволили получить новое значение Kd = 11 ± 2 нМ. Гидролиз специфического субстрата в условиях, когда концентрация субстрата в 2 и более раза превышала концентрацию фермента, изучали методом «quench-flow», который позволяет быстрое смешивание реагентов с возможностью останавливать реакцию уже через 2 мс. С использованием [32Р]-меченого субстрата были зарегистрированы серии кинетических кривых, в которых концентрация F-содержащей ДНК менялась от 80 до 2000 нМ, в то время как концентрация АРЕ1 оставалась постоянной. Данные, полученные в условиях многооборотной реакции, обнаружили резкий скачок на начальном участке кривой (0−10 мс), соответствующий 61 быстрому образованию продукта реакции, за которым следовала более медленная фаза роста (Рис. 20А). При этом скорость образования продукта на предстационарном участке кривых возрастала с ростом концентрации ДНК. Такое поведение кинетических кривых Рис. 20. (А) Накопление продуктов разрезания 25-звенной F-содержащей ДНК белком АРЕ1 в условиях многооборотной реакции. Реакционные смеси содержали 200 нМ АРЕ1 и 500 (○), 1000 (□) либо 2000 (∆) нМ ДНК. Сплошные линии соответствуют результатам количественной обработки данных. (Б, В) Предстационарная кинетика взаимодействия АРЕ1 с субстратом, полученная в условиях одного оборота фермента. Реакционные смеси содержали 0,02 мкМ ДНК и 0,04−6 мкМ белка. Панель (В) представляет увеличенную часть панели (Б) в интервале времени 0−0,06 c [220]. свидетельствует о том, что первый оборот ферментативной реакции происходит очень быстро, а скорость следующих циклов катализа ограничивается какой-либо из посткаталитических стадий процесса, препятствующей быстрому высвобождению продуктов из активного центра АРЕ1. Несмотря на то, что количественную обработку начального участка зависимостей (Рис. 20В) осложняло относительно малое количество накопившегося продукта, приблизительная оценка показала, что скорость первого оборота реакции при концентрации АРЕ1 200 и 500 нМ превышает 200 с-1. При этом, стационарная скорость линейной фазы кривых составляет 2,3 с-1. Из предстационарного участка зависимостей, представленных на рисунке 20А, следует, что амплитуда скачка была меньше, чем начальная концентрация фермента. Наблюдаемый эффект мог быть следствием того, что не весь белок был активным в условиях эксперимента. Однако, изучив стехиометрию связывания их белка с субстратом в присутствии 20 мМ ЭДТА, авторы пришли к выводу, что как минимум 90% фермента находится в активной форме. Другим возможным объяснением может быть существование внутреннего равновесия между комплексами фермента с субстратом ES и фермента с продуктом EP, которое возникает из-за обратимости данного ферментативного процесса (Схема 4). Для проверки этой гипотезы предстационарная кинетика разрезания специфического субстрата была Схема 4 62 исследована в условиях одного оборота фермента (избыток АРЕ1 над субстратом). Полученные кинетические зависимости имели двухфазный характер с ярко выраженным скачком на начальной стадии процесса (Рис. 20Б и В). Видно, что общая скорость процесса линейно возрастает с ростом концентрации белка, достигая 70% конверсии субстрата за 2 мс при САРЕ1 ≥ 2 мкМ. Высокая скорость превращения субстрата не позволила авторам точно определить максимальную скорость оборота фермента, которая предположительно должна составлять не менее 850 с-1. Учитывая, что наблюдаемая скорость реакции в данном случае включает и скорость связывания субстрата и скорость его превращения в активном центре АРЕ1 (стадии a и b Схемы 4), можно заключить, что именно связывание АРЕ1 с ДНК является лимитирующей стадией в этом диапазоне концентраций. Зависимость начальной скорости фазы скачка от концентрации фермента позволило определить значение кажущейся константы скорости бимолекулярной реакции образования фермент-субстратного комплекса 3,5×108 M-1с-1, которая соответствует диффузионно-контролируемому пределу для взаимодействия белков с ДНК [221, 222], и константы скорости распада комплекса, равной 47 с-1. Этот результат согласуется с данными, полученными ранее в стационарных условиях [124, 218]. Двухфазная природа кинетических кривых, наблюдавшаяся в экспериментах по предстационарной кинетике, по мнению авторов работы [220], свидетельствует в пользу гипотезы об обратимости всего процесса (Рис. 20В). Авторы предполагают, что для адекватного описания экспериментальных данных минимальная кинетическая модель взаимодействия АРЕ1 с поврежденной ДНК должна включать еще одну стадию. Это, в частности, следует из проведенного моделирования кинетических кривых в условиях одного оборота фермента в соответствии со Схемой 4. Модельные зависимости демонстрируют снижение общего количества ДНК-продукта в «конечной точке» реакции с ростом концентрации фермента, что противоречит экспериментальным данным. Данное различие можно преодолеть, если добавить в кинетическую схему дополнительную стадию сразу после образования комплекса ЕР, но до его распада, которая бы ограничивала скорость обратного процесса. Однако природа этой стадии до сих пор остается неизвестной. Следует отметить, при использовании метода «quench-flow» для быстрой остановки реакции к смеси фермента и субстрата в определенный момент времени добавляется тушитель, который может денатурировать белок (мочевина, NaOH) либо хелатировать ионы металла-кофактора (ЭДТА). Для эффективного ингибирования скорость инактивации фермента под действием тушителя должна быть выше скорости ферментативного процесса. В противном случае, регистрируемая глубина протекания реакции в момент времени t будет больше истинной глубины. Таким образом, константа 63 скорости инактивации АРЕ1 0,2 М раствором NaOH, используемым в качестве тушителя в работе [220], должна превышать 850 с-1. Однако авторы не приводят экспериментальных данных, подтверждающих эффективность выбранного тушителя. Поэтому, нельзя исключить возможность, что данный подход переоценивает скорость первого оборота АРЕ1. Результаты недавних исследований [223, 224], проведенных Тимофеевой Н.А. в Лаборатории модификации биополимеров ИХБФМ СО РАН, позволили предложить новую интерпретацию наблюдаемых закономерностей. Предстационарную кинетику АРЕ1 изучали методом «остановленной струи» в буферах, оптимальных для протекания процессов NIR и BER, с использованием 30-звенных дуплексов ДНК, содержащих 5,6дигроуридин (DHU), АР-сайт и F-сайт, в качестве модельных повреждений [223]. Путем регистрации изменения интенсивности флуоресценции остатков Trp фермента в ходе его взаимодействия с ДНК-субстратами было установлено, что специфические конформационные переходы в структуре WT АРЕ1 происходят в интервале времени от 0,002 до 0,2 c. Несмотря на то, что амплитуда изменений флуоресцентного сигнала Trp была крайне мала, кинетические кривые для АР- и F-субстрата удалось количественно описать четырехстадийной схемой, которая включала две обратимые стадии связывания АРЕ1 с субстратом, необратимую стадию гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи и обратимый распад комплекса фермент-продукт. Полученные данные свидетельствовали о высокой скорости процесса (krАР = 97 с-1, krF = 68 с-1) и существовании прочного комплекса между АРЕ1 и продуктами реакции (Kd(ЕР) = 4,8×10-7 М). Вследствие того, что интенсивность флуоресценции Trp в конце реакции не возвращалась на начальный уровень, взаимодействие DHU-субстрата с WT АРЕ1 было описано двумя обратимыми стадиями связывания. При этом, по данным разделения [32Р]-меченых продуктов в денатурирующем ПААГ для разрыва поврежденной цепи DHU-субстрата белку требуется более 5000 с. В работе [224] было продолжено исследование взаимодействия АРЕ1 с DHUсубстратом в условиях NIR- и BER-репарации. Было показано, что накопление продуктов превращения [32Р]-меченых DHU-субстратов имеет трехфазный характер (Рис. 21). На временах < 20 с на кинетических кривых наблюдалось быстрое скачкообразное накопление продукта, за которым следовали две более медленные фазы (20−200 с и > 2000 с). Важно, что в обоих буферах величина «скачка» составляла около 15% от концентрации исходного DHU-субстрата. Как было установлено в ходе экспериментов по 64 Рис. 21. Превращение DHU-содержащего субстрата ферментом APE1 (1 мкМ) в буферах BER (А) и NIR (Б). Концентрации субстрата приведены на правой оси. На левых врезках изображены начальные участки кинетических кривых, соответствующие окончанию фазы 1 – скачка в накоплении продуктов расщепления на отрезке времени до 20 с. На правых врезках изображены участки кинетических кривых, соответствующие фазе 2, наблюдаемой на временах 20 < t < 2000 с. Фаза 3 соответствует медленному накоплению расщепленной ДНК от 2000 с [224]. связыванию АРЕ1 с неповрежденным дуплексом ДНК, активность фермента достигала 100%. Поэтому наблюдаемый скачок в накоплении продуктов реакции авторы объяснили тем, что АРЕ1 может существовать двух формах Е1 и Е2, из которых только одна способна быстро образовывать каталитически активный комплекс с субстратом. Менее активная форма Е2 может непосредственно участвовать в формировании начального фермент-субстратного комплекса либо может находиться в равновесии с более активной формой Е1. Таким образом, в ходе второй, более медленной фазы, накопление продукта происходит за счет преобразования формы Е2 в форму Е1. При этом, скорость третьей фазы ограничивается скоростью распада комплекса фермент-продукт. Для того, чтобы соотнести скачки в накоплении продуктов реакции, наблюдаемые методом гель-электрофореза, с изменением конформации комплекса АРЕ1−DHU изучали взаимодействие АРЕ1 с DHU-субстратами, содержащими флуоресцентную метку 2-aPu с 3'- либо 5'-стороны от повреждения. Кинетические кривые, полученные методом «остановленной струи» в сочетании с регистрацией интенсивности флуоресценции 2-aPu, имели трехфазный характер, причем выделенные фазы роста флуоресцентного сигнала соответствовали отдельным фазам накопления продукта по данным электрофоретического анализа. Совокупность полученных данных позволила предложить обобщенный механизм превращения DHU-субстрата белком АРЕ1 (Схема 5). Следует отметить, что значения Схема 5 65 констант скорости, соответствующих второй фазе флуоресцентных кривых для (2aPu)DHU-субстрата (k2EP isom ) были меньше констант скорости второй стадии (kbindinact), выделенной на кривых накопления [32Р]-меченых продуктов (Рис. 21). Поэтому авторы считают, что вторая фаза кинетических кривых, полученных методом «остановленной струи» лимитируется медленным изменением конформации комплекса ЕР, а не процессом, который лимитирует вторую стадию на Рис. 21, т.е. реакциями с участием неактивной формы фермента Е2. Таким образом, данные полученные в работах [223, 224] показали, что лимитирующей стадией процесса NIR является диссоциация фермента из комплекса с продуктом. При этом, скорость превращения DHU-субстрата в условиях NIR сопоставима со свидетельствует скоростью о превращения биологической АР-субстрата значимости процесса в условиях инцизионной BER, что репарации нуклеотидов. Позднее было опубликовано кинетическое исследование взаимодействия АРЕ1 с природным АР-сайтом в нестационарных условиях в присутствии различных металловкофакторов (Mg2+, Mn2+, Ni2+) [225]. Эксперименты проводили методом «quench-flow» с использованием в качестве субстратов 30-звенных дцДНК, содержащих природный АРсайт (АР), восстановленный АР-сайт (АР-Red, 2'-дезоксирибит) либо F-сайт (F) при 37ºС. В результате была определена скорость превращения каждого из субстратов белком АРЕ1 с различными кофакторами, выражаемая константой kchemistry. Следует отметить, что авторам не удалось точно определить значение константы при использовании в качестве кофактора ионов магния, поскольку реакция проходила слишком быстро. Максимальное значение kchemistry, которое можно определить выбранным методом составляет 700 с-1, поэтому предполагается, что скорость разрезания природного АР-сайта была еще выше. Эти данные согласуются с результатами, полученными в работе [220]. В случае, если кофактором служили ионы Mn2+ и Ni2+, значения kchemistry для природного АР-сайта составляли 329 и 155 с-1, соответственно, что согласуется с результатами качественной оценки влияния различных металлов на активность АРЕ1 [185]. Важным на наш взгляд является то, что авторы обнаружили достоверное снижение скорости катализа АРЕ1 в ряду субстратов: АР-Red ≥ AP > F. Для того, чтобы установить не является ли наблюдаемая зависимость скорости катализа от природы повреждения следствием изменения механизма реакции при смене металла-кофактора, были сконструированы «медленные» субстраты, позволяющие снизить значение kchemistry до экспериментально регистрируемого в присутствии Mg2+. Для этого в неповрежденную цепь напротив первого (ММ1), второго (ММ2), третьего (ММ3) и четвертого нуклеотида (ММ4) с 5'конца от АР-сайта встраивали непарные гетероциклические основания. Известно, что 66 мисматчи, расположенные с 5'-стороны от повреждения, могут приводить к снижению эффективности разрезания субстрата [124]. Как и следовало ожидать, ингибирующее действие мисматча было наиболее заметно, когда он располагался непосредственно на 5'стороне повреждения либо на расстоянии одного нуклеотида от него. В Таблице 2 приведены значения константы kchemistry, полученные для каждого из субстратов в предстационарных условиях. Видно, что для субстратов типа ММ1 и ММ2 скорость разрезания F-содержащей ДНК была в 1,5 раза ниже, чем для ДНК, содержащей восстановленный АР-сайт. Таким образом, дополнительные эксперименты подтверждают влияние структуры повреждения на скорость катализа АРЕ1. Таблица 2. Зависимость скорости превращения субстратов белком АРЕ1 от положения мисматча [225]. Субстрат АР АР-Red F ММ1 156 ± 29 163 ± 21 116 ± 29 kchemistry (с-1) ММ2 ММ3 312 ± 29 ≥700 307 ± 24 ≥700 194 ± 32 575 ± 65 ММ4 ≥700 ≥700 ≥700 1.4. Заключение к обзору Представленные в обзоре литературные данные свидетельствуют о том, что АРэндонуклеазы участвуют во всех репарационных процессах и во многих случаях являются жизненно необходимыми для клетки. Эти ферменты имеют значительные отличия в структуре и механизме катализа, что говорит об отсутствии общего предка и независимой эволюции эндонуклеаз семейства ExoIII и EndoIV. По имеющимся к настоящему времени сведениям, ферменты семейства ExoIII получили большее распространение у высших организмов, в частности, млекопитающих и насекомых, тогда как белки семейства EndoIV важны для клеток простейших. На наш взгляд, особенно впечатляющими являются различия между АРЕ1 человека и EndoIV из E. coli, поскольку эти белки, относящиеся к разным структурным семействам, в конечном итоге катализируют одни и те же химические превращения. В частности, АРЕ1 для удаления АР-сайта из ДНК требуется один или два иона Mg2+, в то время как EndoIV использует три иона Zn2+. В ходе специфического связывания оба фермента выворачивают АР-сайт из ДНК, вызывая значительный изгиб ее фосфодиэфирного остова, но только EndoIV способна одновременно выворачивать и основание, стоящее напротив повреждения. Наложение кристаллических структур комплексов АРЕ1 и EndoIV с ДНК показывает, что, несмотря на указанные отличия, пространственное расположение АР-сайта и окружающих его нуклеотидов в активном центре этих ферментов практически совпадает, причем часть каталитически значимых остатков АРЕ1 выполняет те же функции, что и два иона цинка в 67 активном центре EndoIV, а стереохимия каталитической реакции совпадает для обоих ферментов [184]. Таким образом, параллельная эволюция двух разных белков, результатом которой является их общая субстратная специфичность, подтверждает важнейшую роль процесса удаления АР-сайтов из ДНК для функционировании клетки. Уникальность АР-эндонуклеазы АРЕ1 заключается в том, что помимо репарационной функции этот белок играет важную роль в регуляции транскрипции. Способность химически восстанавливать разнообразные белковые факторы делает АРЕ1 участником многих внутриклеточных процессов, протекающих не только в ядре, но и в цитоплазме и митохондриях. В последние пятнадцать лет активно изучается взаимосвязь активности этого фермента с развитием и прогрессированием различных заболеваний. В частности, установлено, что уровень экспрессии АРЕ1 в раковых клетках заметно возрастает после их облучения или обработки химиопрепаратами, которые индуцируют множественные повреждения в геномной ДНК [226, 227]. Другими словами, устойчивость опухолевых клеток к воздействию терапии во многом зависит от активности ферментов репарации самой клетки. Эти наблюдения послужили основой для развития нового подхода к лечению онкологических заболеваний, который подразумевает ингибирование активности АРЕ1 и других ферментов BER в клетке. Одновременное воздействие химических агентов и ингибиторов АРЕ1 приводит к гибели раковых клеток [228]. В настоящее время несколькими группами исследователей ведется поиск эффективных ингибиторов эндонуклеазной и редокс-активностей АРЕ1. После проведения скрининга из большого числа органических соединений было отобрано несколько кандидатов, которые обладали ингибирующей активностью в отношении АРЕ1. Однако эти соединения имеют ряд существенных недостатков, таких как, недостаточно высокое сродство к АРЕ1, токсичность для клеток, множественные биологические мишени. Для создания эффективного ингибитора необходимо установить точный механизм каталитической реакции, а также факторы влияющие на его скорость. Данные, полученные методом рентгеноструктурного анализа, внесли существенный вклад в установление структуры и механизма действия АРЕ1. Сравнение структур свободного фермента со структурами комплексов АРЕ1 с ДНК позволило установить механизм узнавания и связывания субстрата в активном центре. Кроме того, были определены аминокислоты, участвующие в координации иона металла и генерации атакующего нуклеофила. Было показано, что для АРЕ1 специфическим маркером повреждения является особая разупорядоченность структуры ДНК в области АР-сайта. В то же время, кристаллографические данные ставят перед исследователями новые вопросы. В частности, разные кристаллические структуры свидетельствуют о разном количестве 68 ионов Mg2+, необходимых АРЕ1 для проявления активности. В последнее время было предпринято немало попыток решить этот вопрос, но до сих пор нельзя с уверенностью сказать один или два иона магния участвует в катализе. К сожалению, несмотря на высокую информативность, метод РСА не учитывает движения молекул, которым сопровождается любая химическая реакция. Изменение конформации фермента и субстрата, движение реагирующих молекул, стабильность промежуточных интермедиатов - все это определяет скорость и эффективность ферментативного процесса. Установление механизма реакции и количества промежуточных комплексов также как и определение лимитирующей стадии под силу только кинетическим методам исследования. К моменту начала настоящей работы в литературе имелись данные стационарной кинетики Михаэлиса, которые свидетельствовали о высокой скорости (kcat = 4−10 с-1) и эффективности (kcat/KM = (0,5−2,8)×108 М-1с-1) превращения, катализируемого АРЕ1. Также были известны кинетические параметры для мутантных форм АРЕ1, несущих замены в ключевых аминокислотах активного центра. В то же время, из-за быстрого протекания реакции, долгое время не удавалось исследовать взаимодействие АРЕ1 с субстратом в условиях одного оборота фермента и определить какая из промежуточных стадий является лимитирующей в этом процессе. Тот факт, что положение аминокислотных остатков в активном центре АРЕ1 не слишком отличается в структурах свободного фермента и его комплекса с поврежденной ДНК, привел исследователей к выводу о жесткости и малой подвижности структуры АРЕ1 [45, 122]. Однако результаты исследования белка с использованием современных биохимических подходов и метода ЯМР ставят под сомнение гипотезу о том, что АРЕ1 и другие АР-эндонуклеазы не претерпевают заметного изменения конформации при связывании с ДНК-субстратом [110, 206, 229]. Поскольку конформационные переходы чаще всего сопровождают конкретные стадии каталитического цикла, промежуточные состояния фермент-субстратного комплекса могут быть зарегистрированы предстационарными кинетическими методами в сочетании с флуориметрической детекцией конформационной динамики фермента и субстрата. Так, в недавних работах [223, 224] было показано, что в условиях NIR белок АРЕ1 способен изменять свою конформацию в ходе связывания с поврежденной и неповрежденной ДНК, а в комплексах с 30-звенными субстратами, содержащими DHU, AP-сайт или F-сайт, подвергается изменениям конформации перед стадией гидролиза 5’-фосфодиэфирной связи, что свидетельствует об «индуцированной конформационной подгонке» молекулы фермента. Для более детального изучения конформационных переходов в молекулах АРЕ1 и ДНК-субстратов в процессе BER-репарации требовалось дальнейшее изучение 69 процесса в предстационарных условиях. Целью настоящей работы было установление молекулярно-кинетического механизма превращения ДНК под действием фермента АРЕ1 в процессе эксцизионной репарации оснований, выяснение роли отдельных аминокислот активного центра и конформационной динамики фермента и ДНК-субстрата в протекании каталитического процесса. 70 2. Материалы и методы В работе были использованы акриламид, N,N'-метиленбисакриламид, ацетонитрил, DMF Швейцария); (Fluka, трис-(гидроксиметил)-аминометан, агароза, мочевина, дрожжевой экстракт, триптон (Amresco, США); DTT, BSA, Stains-All (Sigma-Aldrich, США); 2-меркаптоэтанол (Ferax, Германия); глицерин, пиперидин, перхлорат лития, хлорид магния, хлорид калия, агар (Panreac, Испания); ЭДТА (AppliChem, Германия); Coomassie G-250 (Serva, Германия); IPTG (Fermentas, Латвия). Кроме того, в работе были использованы отечественные реактивы степени чистоты «о.с.ч.». Все буферные растворы готовились на дважды дистиллированной воде. Плазмиды pXC53, содержащие ген WT аре1 либо мутантной формы Y171F-P173LN174K, были любезно предоставлены профессором Ф. Р. Страусс (Northeastern University, США). Плазмиды pET11a, содержащие гены WT аре1, а также мутантной формы N212A АРЕ1, были любезно предоставлена к.х.н. Ковалем В. В. (ИХБФМ СО РАН, Новосибирск). 2.1. Синтез и очистка олигодезоксирибонуклеотидов Использованные в настоящей работе олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы в Лаборатории бионанотехнологии ИХБФМ СО РАН стандартным фосфитамидным методом на автоматическом синтезаторе ASM-700 («БИОССЕТ», Россия) с использованием защищенных мономеров (Glen Research Corporation, США). Последовательности олигонуклеотидов представлены в Таблице 3. Олигонуклеотиды очищали с помощью ВЭЖХ на ионообменной колонке (Nucleosil 100-10 N(CH3)2) и последующей обращенно-фазовой хроматографией (Nucleosil 100-10 C18) (Macherey-Nagel, Германия). Чистоту олигонуклеотидов проверяли с помощью гельэлектрофореза в 20%-ном денатурирующем ПААГ с последующим окрашиванием красителем «Stains-all» (Sigma-Aldrich Corporation, USA). Концентрацию олигонуклеотидов определяли спектрофотометрически, исходя из оптической плотности растворов на длине волны 260 нм в электронных спектрах поглощения и коэффициентов молярной экстинкции, рассчитанных в приближении метода «ближайших соседей» [230]. Последовательность синтезированных олигонуклеотидов была подтверждена массспектрометрией. Для этого регистрировали MALDI-TOF спектры каждого из олигонуклеотидов с помощью MALDI-TOF масс-спектрометра Autoflex III (Bruker Daltonics, Германия) под управлением программного пакета flexControl 2.4 в отражательном (рефлекторном) режиме с генерацией отрицательно заряженных ионов. 71 (Масс-спектрометрический анализ выполнен сотрудником ИХБФМ СО РАН к.х.н. Ковалем В. В.). 2.2. Синтез и очистка олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих природный АР-сайт АР-содержащие олигодезоксирибонуклеотиды получали из олигонуклеотидов d(CTCTCUCCTTCC), d(CTCTCU(2-aPu)CTTCC) и d(CTCT(2-aPu)UСCTTCC), как описано в работе [231]. Для этого 10 о.е dU-содержащего олигонуклеотида обрабатывали урацил-ДНК-гликозилазой (100 ед. акт., СибЭнзим, Россия) в 150 мкл буфера следующего состава: 20 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 0,1 мг/мл BSA. Реакционную смесь выдерживали 14 часов при 37°С. Продукты реакции разделяли с помощью высокоэффективной жидкостной обращенно-фазовой хроматографии на колонке Eclipse (Agilent, США) в буферном растворе 0,1 М TEA-Ac (pH 7.0) и линейном градиенте 0–20% ацетонитрила. После упаривания ацетонитрила продукт переводили в литиевую соль на картридже Sep-Pak Plus C18 (Waters, США). Для этого олигонуклеотид растворяли в 2 мл воды. Картридж Sep-Pak Plus C18 промывали 2 мл 0,05 М раствора LiClO4 в 50%-ном СH3CN, а затем 4 мл 0,05 М раствора LiClO4. Раствор олигонуклеотида продавливали через картридж, промывали 2 мл 0,05 М раствора LiClO4, а затем смывали с картриджа 2 мл 0,05 М раствора LiClO4 в 50%-ном СH3CN. После этого раствор упаривали при температуре 40°С. Олигонуклеотид растворяли в 60 мкл дважды дистиллированной воды. Концентрацию олигонуклеотидов определяли описанным выше спектрофотометрическим методом. Целостность и чистоту полученных АР-содержащих олигонуклеотидов устанавливали путем обработки 10% пиперидином при 95°C в течение 20 мин либо ферментом АРЕ1 при 25°C в течение 10 мин (в присутствии комплементарной цепи ДНК). Далее продукты реакции разделяли в 20%-ном денатурирующем ПААГ с последующим окрашиванием геля красителем «Stains-all». В качестве контролей использовали Fсодержащий и исходные U-содержащие олигонуклеотиды. Очищенные олигонуклеотиды, содержащие АР-сайт, хранили при температуре -20°C. В работе [231] показано, что олигонуклеотид, содержащий AP-сайт, стабилен при хранении в течение недели при 37°C. Таким образом, можно считать, что в условиях настоящей работы такие олигонуклеотиды стабильны. 2.3. Субстраты для изучения эндонуклеазной активности фермента АРЕ1 Дуплексы ДНК для изучения эндонуклеазной активности АРЕ1 получали путем гибридизации олигонуклеотидов, содержащих повреждение, с комплементарными неповрежденными олигонуклеотидами в эквимолярных количествах (Таблица 3). В 72 кратких обозначениях субстратов используется одно- или двухбуквенный символ, обозначающий вид повреждения. Кроме того, если в субстрате присутствует 2аминопурин, то его символ добавляется справа или слева от символа повреждения Таблица 3. Структура ДНК-субстратов, продуктов и лигандов, использованных в настоящей работе. Краткое обозначение* Последовательность олигодезоксирибонуклеотидов AP-, F-субстрат либо G-лиганд AP(2-aPu)- либо F(2-aPu)-субстрат (2-aPu)AP- либо (2-aPu)F-субстрат F-продукт F(2-aPu)-продукт (2-aPu)F-продукт Структура поврежденных и флуоресцентных нуклеотидов: * Х – дезоксигуанозин (G), природный АР-сайт (AP) либо его синтетический аналог тетрагидрофуран (F), Y – 2-аминопурин (2-aPu). согласно положению в последовательности олгинонуклеотида (5'→3'). ДНК-дуплекс, представляющий собой неспецифический субстрат для АРЕ1 (G-лиганд), получали путем гибридизации олигонуклеотидов d(CTCTCGCCTTCC) и d(GGAAGGCGAGAG), один из которых содержал гуанин на месте повреждения. 2.4. Введение метки [32P] по 5'-концу олигодезоксирибонуклеотидов Введение метки [32P] по 5'-концу нефосфорилированных олигонуклеотидов проводили согласно стандартной методике [232]. Для этого 30 мкл раствора, содержащего 20 пмоль ДНК, 30 пмоль [γ-32P]-ATP (уд. акт. 3,3×10-3 мКи/пмоль, Биосан, Россия), 20 ед. акт. Т4-полинуклеотид киназы (СибЭнзим, Россия) в буфере 0,05 М Tris-HCl (pH 7.6), 73 0,01 М MgCl2, 5 мМ DTT, выдерживали в течение часа при 37°C. [32P]-меченый олигонуклеотид отделяли от невключившегося АТР электрофорезом в 20%-ном денатурирующем ПААГ. Радиоактивную полосу выявляли радиоавтографией и затем вырезали из геля. Меченый олигонуклеотид переносили в водный раствор методом пассивной элюции, при встряхивании пробирки с кусочком геля и 150 мкл воды в течение 2 ч. Далее олигонуклеотид осаждали 10-кратным избытком 2% раствора LiClO4 в ацетоне. Полученный осадок трижды промывали 200 мкл ацетона, сушили под вакуумом и растворяли в 100 мкл дважды дистиллированной воды. Концентрация полученного раствора меченого олигонуклеотида не превышала 1,5×10-7 М. 2.5. Сайт-направленный мутагенез остатка Asn-212 АРЕ1 Введение замены аспарагина-212 на аспартат в гене ape1 проводили по стандартной методике Agilent Technologies (США) с использованием плазмиды pET11aАРЕ1. Для этого в Лаборатории медицинской химии ИХБФМ СО РАН были синтезированы следующие праймеры: 5' primer – 5'GGTCAATTTCTTCATGTGCCACATCGAGGTCTCCACACAGC 3' primer – 5'GCTGTGTGGAGACCTCGATGTGGCACATGAAGAAATTGACC Продукты ПЦР-амплификации визуализировали этидий-бромидом после разделения в 1% агарозном геле. Для удаления «материнской» плазмиды реакционную смесь обрабатывали ферментом DpnI (Fermentas, Латвия) в течение 3 ч при 37°C. Оставшимися ДНКпродуктами трансформировали электрокомпетентные клетки Eco10. Для выделения мутантной плазмиды использовали набор «NucleoSpin Plasmid Easy Pure» (MachereyNagel, Германия). Присутствие мутации N212D в последовательности плазмиды были подтверждены с помощью секвенирования. 2.6. Наработка и очистка рекомбинантных белков Для выделения рекомбинантного белка WT АРЕ1 компетентные клетки E. coli штамма BL21/DE3 pLysS трансформировали плазмидой pXC53 с помощью электропоратора E. coli Pulser (Bio-Rad, США). Трансформированные клетки хранили при -70°C. Для наработки белка трансформированные клетки растили в 300 мл среды 2×YT, содержащей 100 мкг/мл ампицилина, при 37°C до оптической плотности А595 = 0,6−0,7. После индукции экспрессии гена добавлением 0,4 мМ IPTG культуру инкубировали в течение 2 ч при 37°C. Затем клетки осаждали центрифугированием (12000 об/мин, 10 мин, 4°C), и полученный осадок ресуспендировали в 30 мл буфера ТЕ (10 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 1 мМ ЭДТА). Для лизирования клеток к суспензии добавляли фенилметилсульфонилфторид (1 мМ) и лизоцим (0,5 мг/мл) и оставляли на льду при 74 постоянном перемешивании на 30 мин. Далее к суспензии добавляли NaCl до концентрации 1 М, инкубировали еще 20 мин, после чего проводили обработку ультразвуком (10 раз по 30 с, 22 ГГц) при 0−1°C. Полученный клеточный лизат центрифугировали (15000 об/мин, 15 мин, 4°C). Для удаления ДНК к супернатанту добавляли полиэтиленимин до концентрации 0,01%. Раствор выдерживали 20 мин на льду при постоянном перемешивании, а затем снова центрифугировали (10000 об/мин, 15 мин, 4°C). Для осаждения белков к супернатанту постепенно добавляли (NH4)2SO4 до получения насыщенного раствора (516 г/л) и инкубировали 2 ч при 0°C. Осадок белков после центрифугирования растворяли в 50 мл буферного раствора А (25 мМ KH2PO4, pH 7.5). Полученный раствор наносили на катионообменную колонку объемом 5 мл (HiTrap SP HP, GE Healthcare, Великобритания), которую затем промывали 10 мл буферного раствора А. Целевой белок элюировали с колонки 10 мл буферного раствора Б (25 мМ KH2PO4 (pH 7.5), 1 M NaCl) со скоростью 2 мл/мин. Полученный раствор разбавляли в 10 раз буфером А и наносили на катионообменную колонку объемом 5 мл Heparin HP (GE Healthcare, США). Перфузионную хроматографию (PerSeptive Biosystems) проводили в буфере А и линейном градиенте 0–1 М NaCl с регистрацией оптической плотности на длине волны 280 нм. Следует отметить, что все процедуры хроматографической очистки проводили при температуре 0−4°C. Степень очистки полученного белка определяли с помощью гель-электрофореза по Лэммли с последующим окрашиванием раствором Coomassie G-250 (Рис. 22). Фракцию, содержащую целевой белок диализовали в буфере следующего состава: 50 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 100 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT, 50% глицерин. Мутантные формы фермента АРЕ1 выделяли аналогично с использованием соответствующих плазмид. Все растворы очищенных белков хранили при -20°C. Концентрацию белков определяли по оптической плотности раствора фермента в 0,1×ТЕ буфере в присутствии 6 М гуанидиний-хлорида на длине волны 280 нм на спектрофотометре UV-2100 (Shimadzu, Япония). Коэффициент молярной экстинкции белка на длине волны 280 нм определяли по формуле ε = (NTyr×1280 + NTrp×5690) М-1 см-1, где N – число остатков тирозина или триптофана в Рис. 22. Проверка чистоты WT АРЕ1 после хроматографии. Дорожка 1: маркеры массы белков; дорожка 2: WT АРЕ1 (М = 35,5 кДа). последовательности. Для АРЕ1 коэффициент экстинкции составляет 5,52×104 М-1см-1. 75 2.7. Проверка АР-эндонуклеазной активности фермента Активность фермента проверяли в реакции с F-субстратом. Для этого реакционную смесь, содержащую 0,08 о.е. F-субстрата (Таблица 3, разд. 2.3), 9,6 мкМ АРЕ1, 50 мM HEPES/KOH (pH 7.5), 20 мM KCl, 10 мM MgCl2 и 2 мM DTT, инкубировали 1,5 ч при 25°С. В качестве контроля в тех же условиях отдельно инкубировали F-субстрат (дор. 1) и смесь олигонуклеотида d(CTCTCFCCTTCC) с АРЕ1 (дор. 3). Перед нанесением на денатурирующий ПААГ к пробам добавляли по 5 мкл раствора Рис. 23. Проверка активности АРЕ1 с помощью гель-электрофореза. Дорожка 1: F-субстрат; дорожка 2: Fсубстрат + АРЕ1; дорожка 3: d(CTCTCFCCTTCC) + АРЕ1. красителей, содержащего 7 М мочевину, 0,1 % бромфеноловый синий (BF) и 0,1 % ксиленцианол (XC). Полученный гель визуализировали с помощью красителя «Stains-all» (Рис. 23). После отмывки геля в дорожке 1 наблюдались две полосы, соответствующие 12-звенным комплементарным олигонуклеотидам. В нижней части дорожки 2 наблюдалась широкая полоса голубого цвета, соответствующая 6-звенному продукту эндонуклеазной активности АРЕ1. 2.8. Регистрация накопления продуктов разрезания [32Р]-меченых ДНК-субстратов белком АРЕ1 методом гель-электрофореза Накопление продуктов разрезания меченых по 5'-концу специфических субстратов ферментом АРЕ1 анализировали путем разделения их в 20%-ном денатурирующем ПААГ. Для этого 12 мкл раствора [32P]-меченого субстрата в буфере BER, содержащем 50 мM HEPES/KOH (pH 7.5), 20 мM KCl, 10 мM MgCl2 и 2 мM DTT (далее буфер BER), быстро смешивали с 12 мкл раствора АРЕ1 в том же буфере при 25ºС. Для WT АРЕ1, а также всех его мутантных форм, концентрация фермента и субстрата в реакторе составляла 1,5 мкМ, за исключением «тройного мутанта» Y171F-P173L-N174K (концентрация реагентов 3 мкМ) и мутанта N212A APE1 в реакциях с AP(2-aPu)- и F(2-aPu)-субстратами (концентрация реагентов 2 мкМ). Концентрация меченого субстрата в реакционной смеси была менее 1×10-7 М. После быстрого смешивания реагентов для остановки реакции через определенные промежутки времени из реактора отбирали аликвоты объемом 2 мкл, которые помещали в предварительно подготовленные пробирки, содержащие 2 мкл раствора 7 М мочевины, 0,1% BF и 0,1% XC. В качестве контроля стабильности поврежденной ДНК использовали раствор 1,5 мкМ субстрата в буфере BER, 76 выдержанный при 25ºС в течение такого же времени, что и реакционная смесь. Продукты реакции разделяли 20%-ным денатурирующим ПААГ. Электрофорез проводили при комнатной температуре и напряжении 50 В/см. Полученные гели высушивали, а затем визуализировали с помощью радиоденситометра «Molecular Imager FX» (Bio-Rad, США) либо радиоавтографировали на рентгеновскую пленку СP-BU New (Agfa, Бельгия). Количественную обработку радиоавтографов выполняли с помощью программного пакета Gel-Pro Analyzer 4.0 (Media Cybernetics, США). Степень расщепления субстратов рассчитывали как отношение интегральной интенсивности полосы, соответствующей продукту, к сумме интегральных интенсивностей полос, соответствующих продукту и исходному субстрату. Для оценки константы скорости разрезания субстрата начальные участки экспериментальных зависимостей аппроксимировали линейной функцией, угол наклона которой определял начальную скорость (V0). Схематически механизм накопления продукта, регистрируемого методом «гель-электрофореза», можно представить как PAGE kinc Kd PAGE = V0/[ES], Ka= [ES]/[E][S], е0=[E] + [ES], E S EP E P . Предполагая, что k inc PAGE а s0= [S] + [ES], было получено уравнение (1) для оценки величины константы k inc : 1 PAGE kinc 2 1 1 4e0 s0 2V0 e0 s0 e0 s0 Ka Ka , (1) где V0 – начальная скорость, определяемая углом наклона линейного участка зависимости; е0 и s0 – начальные концентрации фермента и субстрата, Ka – равновесная константа сродства фермента к соответствующему субстрату, значение которой для каждого субстрата установлено методом «остановленной струи» (см. разд. 3.1.3), [ES] – равновесная концентрация каталитического комплекса. 2.9. Определение величин констант KM и kcat для WT АРЕ1и Y171F-P173L-N174K АРЕ1 в стационарных условиях Измерение параметров стационарной кинетики проводили в буфере BER при 25ºС с использованием АР- и F-субстратов. Зависимости степени накопления [32Р]-меченых продуктов АР-эндонуклеазной активности фермента от времени были получены для 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 1500 нМ субстрата. Диапазон концентраций субстрата варьировали в зависимости от вида фермента и типа повреждения. Концентрация WT АРЕ1 составляла 0,5 нМ для АР-субстрата и 1 нМ для F-субстрата. В случае «тройного мутанта» концентрация белка в стационарных экспериментах была 15 нМ, а концентрация ДНК варьировалась в диапазоне 200–1200 нМ. Для каждой пары фермент−субстрат по 77 начальным участкам полученных зависимостей определяли начальную скорость V0. Далее строили зависимость V0 от концентрации субстрата в двойных обратных координатах [233]. Погрешность определения стационарных кинетических параметров не превышала 25%. 2.10. Регистрация предстационарной кинетики взаимодействия АРЕ1 с ДНК методом «остановленной струи» Для определения максимумов в спектрах поглощения и испускания флуоресценции остатков триптофана APE1 регистрировали спектры возбуждения и испускания флуоресценции фермента (1,5 мкМ) в буфере BER (разд. 2.8) на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian, Австралия). Было установлено, что максимум возбуждения (λex) остатков Trp составляет 280 нм, максимум испускания (λem) – 330 нм. Для исследования предстационарной кинетики взаимодействия ферментов с субстратами на микрообъемном спектрометре остановленной струи SX.18MV (Applied Photophysics, Великобритания) регистрировали зависимость интенсивности флуоресценции остатков триптофана в белках либо 2-aPu в ДНК-субстратах от времени после быстрого смешивания фермента с субстратом. Флуоресценцию остатков Trp возбуждали на длине волны 280 нм и регистрировали на длинах волн более 320 нм с помощью светофильтра WG-320 (Schott, Германия). Флуоресценцию 2-aPu возбуждали на длине волны 310 нм и наблюдали на длинах волн более 370 нм, используя светофильтр LG-370 (Corion, США). Для исключения наложения сигналов от разных флуорофоров в случае, когда ДНК-субстрат содержал основание 2-aPu, флуоресценцию Trp регистрировали с помощью светофильтра Р10-340F (Corion, США), который пропускает полосу света шириной 10 нм на длине волны 340 нм. Мертвое время прибора составляет 1,38 мс. Все эксперименты проводились в буфере BER при 25ºC в условиях, близких к условиям «одного оборота фермента». При наблюдении за флуоресценцией остатков Trp фермента концентрация белка в реакционной смеси составляла 1,5 мкМ, а концентрация ДНК-субстрата изменялась от 0,5 мкМ до 3,0 мкМ. Исключение составляет случай взаимодействия мутанта N212A АРЕ1 с АР- и F-субстратами, когда концентрация фермента была 3,0 мкМ, а концентрация субстрата варьировалась в пределах 1,0–4,0 мкМ. В ходе регистрации флуоресценции 2aPu концентрация субстратов в реакционной ячейке составляла 1,5 мкМ, а концентрация ферментов варьировалась в пределах 0,3–3,0 мкМ. Каждая кинетическая кривая в концентрационных сериях является результатом усреднения пяти экспериментальных кривых. 78 При облучении белков ультрафиолетовым светом происходит окисление остатков ароматических аминокислот, сопровождающееся снижением интенсивности флуоресценции (выгоранием белка). Указанный эффект становился заметным на кинетических кривых, полученных методом «остановленной струи» по флуоресценции остатков Trp белка, когда время регистрации превышало 10 c. Для корректировки выгорания белка на кинетических кривых выбирали участок, на котором интенсивность флуоресценции изменялась одинаково для всех концентраций одного субстрата. Как правило, такой участок располагался в конце кинетической кривой после завершения каталитического цикла. Выбранный участок аппроксимировали экспоненциальной функцией (2) с помощью программы OriginPro 8 (OriginLab Corp., США), y A1 exp( x / t1 ) y0 (2) где y – текущее значение интенсивности флуоресценции в рассматриваемой области, x – время, соответствующее значениям интенсивности флуоресценции на рассматриваемом участке кинетической кривой, t1 – характеристическое время выгорания. Рассчитанные из первого уравнения коэффициенты A1, t1 и y0 далее применяли для обработки всей кинетической кривой по уравнению (3): F ( y y0 ) exp(t / t1 ) A1 y0 A1 1 , (3) где y – значение интенсивности Trp флуоресценции в каждый момент времени t. 2.11. Количественная обработка данных предстационарной кинетики. Определение кинетического механизма и констант скорости элементарных стадий процесса Для определения количества промежуточных состояний фермент-субстратного комплекса, регистрируемых методом «остановленной струи», каждую кинетическую кривую аппроксимировали суммой экспонент по уравнению (4): F a1 exp(k1*t ) a2 (1 exp(k 2*t )) ... ai exp(ki*t ) C , (4) где F –интенсивность флуоресценции в момент времени t, ai – коэффициент, ki *– характеристическая константа скорости каждой фазы. Исходя из предположения, что каждая фаза снижения или роста флуоресценции соответствует как минимум одной промежуточной стадии механизма, минимальная сумма экспонент, удовлетворительно описывающая кинетическую кривую, будет соответствовать числу переходных состояний фермент-субстратного комплекса. Далее получали зависимости констант скорости ki от концентрации фермента либо субстрата. По форме полученных зависимостей судили об обратимости каждой стадии механизма. Величины характеристических констант скорости 79 использовали в качестве начальных значений для количественной обработки данных методом нелинейной регрессии с помощью программы DynaFit (BioKin, США) [8]. В данной программе используется численное интегрирование системы дифференциальных и алгебраических уравнений (уравнения (5−8)), описывающих предполагаемый кинетический механизм процесса, который состоит из обратимых и необратимых стадий (Схема 6). Схема 6 ∑ 𝑖 𝑑[𝐸𝑆𝑖 ] = 𝑘𝑖−1 [𝐸𝑆𝑖−1 ] + 𝑘−(𝑖+1) [𝐸𝑆−(𝑖+1) ] − (𝑘𝑖+1 + 𝑘−𝑖 )[𝐸𝑆𝑖 ] 𝑑𝑡 (5) 𝑑[𝐸𝑃] = 𝑘𝑖+1 [𝐸𝑆𝑖 ] 𝑑𝑡 (6) 𝑒0 = [𝐸] + ∑[𝐸𝑆𝑖 ] (7) 𝑖 𝑠0 = [𝑆] + ∑𝑖[𝐸𝑆𝑖 ] + [𝐸𝑃] + [𝑃], (8) где Е – фермент, S – субстрат, ESi – промежуточные фермент-субстратные комплексы, ЕР – комплекс фермента с продуктом, Р – продукт, е0 и s0 – начальные концентрации фермента и субстрата. Интенсивность флуоресценции (Fc), регистрируемая в момент времени t, представляет собой сумму фоновой флуоресценции (Fb), флуоресценции свободного фермента (F0) и флуоресценции каждого из интермедиатов реакции (Fi), определяемой произведением удельной амплитуды флуоресценции i-го интермедиата (fi) на его концентрацию [ESi] (уравнения 9−11). 𝑖 𝐹𝑐 = 𝐹𝑏 + ∑ 𝐹𝑖 (𝑡) (9) 𝑖=0 𝐹0 (𝑡) = 𝑓0 [𝐸] (10) 𝐹𝑖 (𝑡) = 𝑓𝑖 [𝐸𝑆𝑖 ] (11) 80 Экспериментальные последовательно различные кинетические обрабатывали, кинетические кривые используя схемы, которые включали от одной до трех обратимых стадий изомеризации комплекса. фермент-субстратного Релевантность выбранного механизма реакции и констант скорости оценивали по разности между значениями экспериментальной и теоретической кривой, полученной в результате оптимизации параметров. Ошибка определения величин кинетических параметров инструментальную погрешность методом образом, включала ошибку, оптимизации нелинейной так и параметров регрессии. обобщенная как Таким погрешность определения величин констант находилась в Рис. 24. Верхняя панель: пример обработки кинетической кривой четырех- (черная линия) либо пятистадийным механизмом (красная линия). Нижняя панель: отклонение соответствующих теоретических кривых от экспериментальных. пределах 20%. В качестве примера на Рис. 24 представлен график отклонения теоретической кривой от экспериментальной, полученный в результате оптимизации параметров в соответствии с 4- либо 5-стадийным механизмом. 2.12. Определение значений констант KM и kcat для WT АРЕ1 по теории графов Для оценки значений кинетических параметров Михаэлиса-Ментен из кинетических констант, полученных методом «остановленной струи» использовали метод графов [234]. По данным предстационарной кинетики взаимодействие WT АРЕ1 с АРсубстратом описывается четырехстадийным механизмом, в то время как для F-субстрата минимальный механизм включает пять стадий (Схема 7 в разд. 3.1.3). Для того чтобы получить выражения, связывающие параметры стационарной кинетики с константами, полученными в предстационарных условиях, для каждого механизма записывали базовые определители всех промежуточных состояний фермент-субстратного комплекса. В общем случае (Схема 6 в разд. 2.11) стационарная скорость ферментативной реакции с помощью метода графов определяется следующим выражением: 𝑣= 𝑘𝑖+1 ∙ 𝐷𝐸𝑆𝑖 ∙ 𝑒0 , ∑𝑆 𝐷𝑆 (12) 81 где DS – базовые определители всех состояний фермента, DESi – базовый определитель промежуточного состояния фермента, приводящего к образованию продукта, ki+1 – константа скорости стадии, приводящей к образованию продукта. После проведения преобразований для 4-стадийной схемы были получены следующие выражения: 𝐾𝑀 = 𝑘−1 𝑘3 + 𝑘−1 𝑘−2 + 𝑘2 𝑘3 𝑘1 (𝑘2 + 𝑘−2 + 𝑘3 ) (13) 𝑘2 𝑘3 𝑘2 + 𝑘−2 + 𝑘3 (14) 𝑘𝑐𝑎𝑡 = В случае 5-стадийной кинетической схемы выражения имеют более сложный вид: 𝐾𝑀 = 𝑘−1 𝑘−2 (𝑘−3 + 𝑘4 ) + 𝑘3 𝑘4 (𝑘−1 +𝑘2 ) 𝑘1 (𝑘3 (𝑘2 + 𝑘4 ) + (𝑘2 + 𝑘−2 )(𝑘−3 + 𝑘4 )) (15) 𝑘2 𝑘3 𝑘4 (𝑘3 (𝑘2 + 𝑘4 ) + (𝑘2 + 𝑘−2 )(𝑘−3 + 𝑘4 ) (16) 𝑘𝑐𝑎𝑡 = 2.13. Регистрация кинетики взаимодействия мутантных форм N212D и N212A с 2aPu-содержащими субстратами Стационарную кинетику взаимодействия мутантных форм N212D и N212A со специфическими субстратами изучали флуориметрическим методом на приборе Cary Eclipse (Varian, Австралия). Для этого 40 мкл 3 мкМ раствора белка в буфере BER смешивали с 40 мкл ДНК-субстрата, концентрацию которого варьировали от 0,5 до 3 мкМ, в термостатированной при 25°С кювете, после чего помещали в прибор и регистрировали флуоресцентный сигнал 2-aPu, начиная с 30 c. Флуоресценцию 2-aPu возбуждали на длине волны 310 нм и наблюдали на длине волны 370 ± 5 нм. Количественный анализ данных, полученных при различных концентрациях ДНК проводили методом нелинейной регрессии с помощью программы DynaFit, как описано выше. 2.14. Изучение стабильности комплексов АРЕ1 с продуктами превращения специфических субстратов Для определения константы диссоциации комплекса фермента с продуктами эндонуклеазной реакции (Kdtitr) проводили флуоресцентное титрование WT АРЕ1, N212D АРЕ1, N212A АРЕ1 либо Y171F-P173L-N174K АРЕ1 смесью олигонуклеотидов, представляющих собой продукт разрезания F-содержащих ДНК-субстратов, в равновесных условиях. В ходе эксперимента к 80 мкл 1,5 мкМ раствора фермента в буфере BER последовательно добавляли по 0,5 мкл F-, F(2-aPu)- либо (2-aPu)F-продукта (Таблица 3, разд. 2.3) в концентрации 120 мкМ. Смесь белка с таким лигандом 82 выдерживали в течение 30 с, после чего на флуориметре Cary Eclipse регистрировалась интенсивность Trp флуоресценции в максимуме спектра испускания (330 нм). Таким образом, были получены зависимости интенсивности флуоресценции белка от концентрации гидролизованного продукта. Каждая кривая титрования представляет собой усредненный результат трех независимых экспериментов. Количественную обработку полученных данных проводили с помощью программы OriginPro 8 (OriginLab Corp., США). Регистрируемая интенсивность флуоресценции F может быть выражена как 𝐹 = 𝐹𝑏 + 𝑓𝐸 [𝐸] + 𝑓ЕР [𝐸𝑃], (17) где Fb – фоновая флуоресценция, fE и fР – удельные интенсивности флуоресценции свободного белка и комплекса фермента с продуктом ЕР. Используя общее выражение для константы диссоциации Kdtitr = [EP]/[E][P], а также уравнения материального баланса, было получено уравнение, связывающее интенсивность флуоресценции F и константу диссоциации: F F0 f EP e0 f E f EP 2 K titr d p0 e 0 2 4 K d e0 K dtitr p0 e0 , (18) где е0 и р0 – общая концентрация АРЕ1 и продукта, Kdtitr – равновесная константа диссоциации комплекса ЕР. 83 3. Изучение кинетического механизма узнавания и превращения поврежденной ДНК АР-эндонуклеазой 1 человека (Результаты) 3.1. Конформационная динамика и кинетика процесса удаления АР-сайтов из ДНК белком WT АРЕ1 в условиях BER В процессах белково-нуклеинового узнавания, как правило, происходит взаимная подстройка структуры белка и ДНК-субстрата, которая может протекать в несколько стадий и, в конечном итоге, должна приводить к образованию каталитически активного интермедиата. Такое поведение ферментативных систем описывается моделью «индуцированного соответствия» [235]. Поскольку каждая стадия ферментативной реакции сопровождается изменениями конформации белка и субстрата, то это свойство используется для изучения механизмов катализа и определения его кинетических характеристик [236-238]. Конформационные переходы в молекуле фермента могут быть зарегистрированы по изменению интенсивности флуоресценции остатков триптофана (и в меньшей степени остатков тирозина), а в ДНК – путем введения в молекулу флуоресцирующих аналогов оснований. Стадии узнавания субстратов ферментами должны протекать на малых временах, поэтому для их изучения используются специальные методы, в частности, «струевые», позволяющие регистрировать процессы в миллисекундном диапазоне времени [239]. В настоящей работе для решения поставленных задач основным методом исследования был выбран метод «остановленной струи», сочетающий быстрое смешивание реагентов в струе с возможностью регистрации конформационных переходов в реагирующих молекулах в режиме реального времени. 3.1.1. Изменение собственной флуоресценции АРЕ1 при связывании с ДНК На первом этапе работы для регистрации конформационных переходов в молекуле АРЕ1 использовали собственную флуоресценцию остатков триптофана фермента. Аминокислотная последовательность АРЕ1 включает семь остатков триптофана, причем остаток Trp-267 располагается в ДНК-связывающей петле α11, а Trp-280 непосредственно участвует в формировании каталитического центра фермента. Поэтому можно было ожидать, что локальное окружение этих остатков будет меняться в ходе взаимодействия АРЕ1 с ДНК, что, в свою очередь, должно приводить к изменению интенсивности их флуоресценции. Для проверки этого предположения сначала регистрировали спектр испускания флуоресценции свободного фермента в буфере, содержащем 50 мM HEPES/KOH (pH 7.5), 20 мM KCl, 10 мM MgCl2 и 2 мM DTT (далее буфер BER). Затем к 84 раствору белка добавляли ДНК-дуплекс, содержащий неповрежденный G-лиганд (Таблица 3, разд. 2.3), и снова регистрировали спектр испускания АРЕ1. Как следует из Рис. 25, неспецифическое взаимодействие АРЕ1 с ДНК приводит к снижению максимума в спектре испускания флуоресценции. Другими словами, при связывании с ДНК изменяется конформация фермента, что в свою очередь, вызывает изменение интенсивности его флуоресценции. Таким образом, выбранный подход может быть использован для изучения конформационной динамики АРЕ1. Рис. 25. Спектр испускания флуоресценции свободного АРЕ1 (сплошная линия) и комплекса АРЕ1 с G-лигандом (пунктирная линия). λex= 280 нм, [APE1] = [G-лиганд] = 1,5 мкM. 3.1.2. Регистрация конформационных переходов в молекуле АРЕ1 при взаимодействии с природным АР-сайтом, F-аналогом и G-лигандом Выбор длины ДНК-субстратов и лигандов для изучения эндонуклеазной активности АРЕ1 был обусловлен несколькими факторами. Во-первых, в исследовании [223], выполненном в нашей лаборатории, было показано, что разрезание 30-звенной АРсодержащей ДНК белком АРЕ1 происходит слишком быстро (константа необратимой стадии разрыва фосфодиэфирной связи субстрата kr = 97 с-1), чтобы зарегистрировать накопление продукта методом «остановленной струи». Во-вторых, фермент образовывал стабильный комплекс с продуктом реакции (KdЕР = 4,8×10-7 М), что затрудняло количественную обработку кинетических данных. Кроме того, прочное связывание АРЕ1 ДНК-субстратом и продуктом приводит к проявлению 3'−5'-экзонуклеазной активности фермента, что может влиять на значения определяемых кинетических параметров эндонуклеазной активности. Ранее для изучения механизма действия ДНК-гликозилаз методом «остановленной струи» успешно применялись короткие олигонуклеотидные дуплексы, длина которых была минимально возможной для связывания с ферментом [236, 237, 240]. Из литературных данных известно, что поверхность контактов между АРЕ1 и ДНК охватывает восемь нуклеотидов, включая повреждение, а для проявления активности ферменту требуется 4 нуклеотида с 5'-стороны и 3 нуклеотида с 3'-стороны от АР-сайта [122, 124]. С учетом изложенного выше, для исследования кинетического механизма АРЕ1 методом «остановленной струи» в условиях BER нами были сконструированы 85 короткие 12-звенные дуплексы ДНК (Таблица 3, разд. 2.3), которые содержали повреждение в одной из цепей и являлись термодинамически стабильными в условиях проводимых экспериментов. Пробные эксперименты показали, что превращение таких ДНК-субстратов протекает с более низкой скоростью, по сравнению с 30-звенными дуплексами. Кроме того, продукты превращения коротких субстратов легче диссоциируют из комплекса с ферментом. В настоящей работе в качестве модельных повреждений ДНК для изучения эндонуклеазной активности АРЕ1 были выбраны апуриновая/апиримидиновая дезоксирибоза, или природный АР-сайт, а также (3-гидрокситетрагидрофуран-2-ил)-метил фосфат (далее F-сайт), который представляет собой химически стабильный аналог природного АР-сайта (Таблица 3, разд. 2.3). F-сайт, у которого отсутствует С1'гидроксильная группа, широко используется в качестве модельного повреждения для исследования репарационных процессов, поскольку, в отличие от природного АР-сайта, не подвержен спонтанному β-элиминированию [46, 241]. В настоящей работе F-аналог был использован в качестве специфического субстрата для АРЕ1 наряду с природным АРсайтом. Для регистрации конформационных переходов в молекуле АРЕ1 в процессе взаимодействия с ДНК-субстратами в условиях одного оборота фермента использовали метод «остановленной струи». Для этого в один из шприцов прибора помещали раствор, содержащий 1,5 мкМ АРЕ1 в буфере BER (см. разд. 2.8), а в другой шприц – раствор субстрата в этом же буфере. После быстрого (~1,5 мс) смешивания реагентов в смесительной камере прибора раствор попадал в оптическую кювету, где регистрировалась зависимость интенсивности флуоресценции остатков Trp от времени. Поскольку изменения на флуоресцентных кривых наблюдались как на малых, так и на больших временах, то для повышения точности измерения каждую кривую регистрировали в двух временных интервалах: 0,001−0,5 с и 0,001−25 с. В результате были получены серии кинетических кривых для различных концентраций АР- и Fсубстрата (Рис. 26). Полученные зависимости имеют сложный характер, что свидетельствует о значительных изменениях локального окружения остатков Trp в процессе взаимодействия АРЕ1 с ДНК. При этом в контрольных экспериментах, где регистрировали флуоресценцию АРЕ1 в буферном растворе в отсутствие ДНК, не наблюдалось значимых изменений сигнала (данные не приводятся). 86 Рис. 26. Изменение интенсивности флуоресценции остатков Trp фермента в процессе взаимодействия WT АРЕ1 с АР-субстратом (А) и F-субстратом (Б). Реакции проводили в буфере BER (см. разд. 2.8) при 25ºС. Концентрация белка во всех экспериментах составляла 1,5 мкМ. Концентрацию субстратов варьировали от 0,5 до 4,0 мкМ, как указано справа от каждого графика. Кинетические кривые были вручную распределены по оси ординат для удобства визуализации. Гладкие линии черного цвета представляют результат количественной обработки экспериментальных данных по Схеме 7 (разд. 3.1.3). Как следует из формы флуоресцентных кривых, каталитический цикл включает несколько стадий, причем их количество для АР- и F-субстратов не совпадает. Как правило, фазы снижения и роста флуоресцентного сигнала, наблюдаемые на кинетической кривой, соответствуют образованию отдельных промежуточных интермедиатов ферментативного процесса. Однако, в случае, если фаза изменения флуоресцентного сигнала занимает большой промежуток времени, то она может включать несколько стадий каталитического цикла. На кинетических кривых, описывающих взаимодействие АРЕ1 с АР-субстратом, можно выделить четыре фазы, первая из которых, вероятнее всего, соответствует стадии образования первичного фермент-субстратного комплекса ES. Далее следует более выраженное снижение интенсивности флуоресценции в интервале до 0,04 с, которое следует относить к переходу комплекса ES в каталитически активное состояние. Третья (0,2−1 с) и четвертая (1−5 с) фазы соответствуют стадиям превращения субстрата в продукт и распаду комплекса фермент-продукт EP, в результате чего интенсивность флуоресценции восстанавливается до начального уровня. За пределами 10-секундного интервала вплоть до 2000 с не наблюдается изменений интенсивности флуоресценции остатков Trp. Важно отметить, что изменения величины флуоресцентного сигнала АРЕ1 демонстрируют явную зависимость от концентрации ДНК, что подтверждает релевантность их применения для кинетического анализа процесса. Гидролиз фосфодиэфирной связи F-субстрата белком АРЕ1 сопровождается бóльшим числом конформационных переходов, хотя общий вид зависимостей для обоих типов повреждений хорошо согласуется. Так, по аналогии с АР-субстратом, связывание 87 фермента с F-аналогом сопровождалось снижением интенсивности флуоресценции на начальном участке кривых. Далее в интервале 0,03−0,2 с следовала фаза слабого возрастания флуоресцентного сигнала, которая становилась наиболее выраженной при концентрациях субстрата ≥2 мкМ. По-видимому, закрепление F-сайта в активном центре АРЕ1 в оптимальной для катализа конформации требует дополнительной геометрической подстройки боковых радикалов аминокислот. Накопление продуктов реакции начинается после 1 с вместе со значительным возрастанием интенсивности флуоресценции, которая к выходит на плато после 10 с, что свидетельствует об установлении равновесия между комплексом фермент-продукт и свободным белком. В целом, исходя из полученных данных, для гидролиза F-сайта белку АРЕ1 требуется больше времени, чем для разрезания природного АР-сайта. Действительно, в случае АР-субстрата весь процесс протекает за 1,5 с, тогда как в случае F-субстрата изменения флуоресцентного сигнала продолжаются до 5−8 с. Из этих данных можно сделать вывод о высокой селективности активного центра АРЕ1 по отношению к структуре субстрата. Таким образом, использование коротких поврежденных ДНК-дуплексов позволило в предстационарных условиях впервые зарегистрировать все стадии каталитического цикла АРЕ1 на одной флуоресцентной кривой. Для того, чтобы подтвердить, что обнаруженные изменения флуоресцентного сигнала свидетельствуют о конформационных переходах в АРЕ1 и действительно отражают специфическое взаимодействие с АР-содержащей ДНК, методом «остановленной струи» было исследовано взаимодействие АРЕ1 с неповрежденной ДНК (G-лиганд) (Рис. 27). Предполагалось, что фермент будет только неспецифически связывать такую ДНК, что должно отразится на поведении флуоресцентного сигнала АРЕ1. Форма кинетических кривых, полученных для различных концентраций G-лиганда, заметно отличалась от кинетических кривых для АР- и F-субстратов. Связывание АРЕ1 с неповрежденной ДНК сопровождалось скачкообразным возрастанием интенсивности флуоресценции в интервале времени до 0,1 с, которое соответствует фазе снижения интенсивности флуоресценции белка, наблюдаемой в случае специфических субстратов. Поскольку интенсивность флуоресценции остатков Trp зависит от гидрофобности/гидрофильности локального окружения, можно предположить, что взаимодействие АРЕ1 с интактной последовательностью ДНК сопровождается перестройками в структуре белка, которые не характерны для специфического взаимодействия с повреждением. Этим объясняется разное поведение флуоресцентного 88 Рис. 27. Изменение интенсивности флуоресценции остатков Trp фермента в процессе взаимодействия WT АРЕ1 с неповрежденным G-лигандом. Реакции проводили в буфере BER (см. разд. 2.8) при 25ºС. Концентрация АРЕ1 в реакционной смеси составляла 1,5 мкМ. Концентрация G-лиганда указана справа от кривых. Во вставке те же экспериментальные данные представлены в логарифмической шкале. Гладкие линии черного цвета представляют результат количественной обработки экспериментальных данных по двум первым равновесиям Схемы 7 (разд. 3.1.3). сигнала на начальном участки кривой для АР-субстрата и G-лиганда. Кроме того изменения интенсивности флуоресценции в случае G-лиганда имеют относительно небольшую амплитуду. 3.1.3. Определение минимального кинетического механизма и количественных параметров взаимодействия фермента АРЕ1 с АР-, F-субстратом и G-лигандом Для оценки начальных значений констант скорости, описывающих равновесие между комплексом фермент-продукт и свободным АРЕ1, был проведен дополнительный эксперимент по флуоресцентному титрованию фермента продуктами превращения Fсубстрата. Для этого в стационарных условиях регистрировали флуоресценцию остатков триптофана при добавлении F-продукта (Таблица 3, разд. 2.3) к 1,5 мкМ АРЕ1 (Рис. 28). Под термином «продукт» здесь и далее подразумевается дуплекс ДНК с разрывом на 5'-конце повреждения, состоящий из трех олигонуклеотидов. Следует отметить, что при 25ºС и в используемых солевых условиях короткий ДНК-дуплекс, содержащий одноцепочечный разрыв, нестабилен и, с определенной долей вероятности, существует в виде смеси олигонуклеотидов. Однако одноцепочечных добавление в Рис. 28. Зависимость интенсивности флуоресценции остатков Trp WT АРЕ1 от концентрации F-продукта. [P] – концентрация ДНК. 89 раствор фермента приводит к смещению равновесия в сторону образования комплекса. Как видно из Рис. 28, интенсивность флуоресценции белка снижается с ростом концентрации F-продукта. Обработка полученной зависимости по одностадийному механизму Е + Р ЕР позволила определить стабильность комплекса фермент- продукт, выражаемую константой равновесия Kdtitr = (1,0 ± 0,1)×10-6 М. Величина константы свидетельствует о том, что фермент способен образовывать прочный комплекс с продуктом реакции. Этот результат согласуется с литературными данными, в которых было показано, что АРЕ1 продолжает удерживать гидролизованную ДНК в активном центре по окончании каталитического цикла [122, 177]. Если сравнивать полученное значение Kdtitr со значением константы равновесия комплекса фермент-продукт 4,8×107 М, опубликованным ранее для 30-ных поврежденных ДНК [223], то можно заключить, что уменьшение длины субстрата в 2,5 раза приводит к двукратному снижению стабильности комплекса ЕР. Количественная обработка полученных экспериментальных зависимостей включала несколько этапов. Сначала каждую кинетическую кривую аппроксимировали суммой экспонент для установления количества элементарных стадий процесса. При этом по зависимости характеристических констант скорости от концентрации субстрата судили об обратимости или необратимости каждой из стадий. Далее, с помощью программного пакета DynaFit, определяли величины констант скорости прямых и обратных реакций предполагаемого механизма. Начальные значения констант скорости прямых реакций механизма оценивали по времени полупревращения интермедиата, соответствующего каждой фазе на флуоресцентной кривой. Оптимизация значений параметров системы дифференциальных уравнений методом нелинейной регрессии позволила определить минимальную кинетическую схему, удовлетворительно описывающую экспериментальные кривые. Термин «минимальная кинетическая схема» здесь и далее обозначает механизм с минимальным числом промежуточных комплексов, согласуются экспериментальными с для которого теоретические данными (см. разд. кривые 2.11). лучше Так, всего гидролиз фосфодиэфирной связи природного АР-сайта белком АРЕ1 описывался четырехстадийным механизмом (Схема 7). Первичное связывание фермента с АР-субстратом приводит к образованию комплекса ES и описывается константами скорости k1 и k-1. Последующая специфическая подстройка структуры АРЕ1 и ДНК соответствует второму равновесию с прямой и обратной константами k2 и k-2. Третья необратимая стадия механизма (kirr, от англ. irreversible) характеризует непосредственный разрыв фосфодиэфирной связи субстрата, за которым следует диссоциация комплекса фермент90 Схема 7** * Над каждой стадией механизма приведены краткие обозначения того субстрата/лиганда, для которого эту стадию удалось зарегистрировать методом «остановленной струи». ** Здесь и далее во всех кинетических схемах, характеризующих АР-эндонуклеазную активность АРЕ1: E – фермент, S – субстрат, Р – продукт, ES – первичный неспецифический комплекс между АРЕ1 и поврежденной ДНК, ES' и ES'' – специфические фермент-субстратные комплексы, EP – комплекс фермента с продуктом, kirr – константа скорости стадии разрыва 5'-фосфодиэфирной связи субстрата (каталитическая стадия), Kd – равновесная константа диссоциации комплекса фермент-продукт. продукт ЕР (Kd). В случае F-субстрата кинетическая схема содержит дополнительную стадию изомеризации фермент-субстратного комплекса ES', описываемую константами k3 и k-3. В этом случае каталитически активным становится комплекс ES'', образование которого предшествует разрыву цепи F-субстрата. Значения констант скорости и равновесия, полученные в ходе количественной обработки данных, приведены в Таблице 4. Значения константы скорости k1 для взаимодействия АРЕ1 с АР- и F-сайтом порядка 1×108 М-1с-1 приближаются к диффузионно контролируемому пределу скорости, что согласуется с литературными данными [218, 220]. Общее сродство АРЕ1 к субстрату (Ka) определяли с помощью уравнения (14), используя величины констант равновесия K1, K2 и K3 каждой из стадий, предшествующих стадии необратимого разрыва связи (Таблица 4): N j i K a K j i 1 j 1 где K j kj k j , (14) для N-стадийного механизма. Здесь и далее константа ассоциации Ka отражает «сродство фермента к субстрату», а с другой стороны характеризует стабильность или прочность ферментсубстратного комплекса. 91 Таблица 4. Константы скорости и равновесия элементарных стадий процесса, описывающие взаимодействие WT АРЕ1 с АР-, F- и G-содержащей ДНК, соотвествующего Схеме 7.* WT АРЕ1/ AP-субстрат F-субстрат G-лиганд (8,9 ± 0,5) 107 (2,0 ± 0,1) 108 (7,4 ± 0,5) 105 6,0 ± 0,7 14,6 ± 0,2 17,4 ± 0,6 (1,5 ± 0,1) 106 (1,4 ± 0,1) 106 (4,3 ± 0,4) 104 3,2 ± 0,1 5,6 ± 0,2 0,17 ± 0,01 k-2, с 1,8 ± 0,1 28,6 ± 0,3 0,76 ± 0,02 K2 1,8 ± 0,2 0,19 ± 0,02 0,22 ± 0,02 k1, M-1 с-1 k-1, с-1 K1 , M -1 k2, с-1 -1 -1 6,6 ± 0,3 -1 0,15 ± 0,01 k3, с k-3, с 44 ± 4 K3 -1 kirr, с 3,2 ± 0,1 2,1 ± 0,1 Kd , M (1,0 ± 0,1) 10 -6 (5,5 ± 0,2) 10-6 Ka, M-1 (4,1 ± 0,2) 107 (1,3 ± 0,1) 108 (5,2 ± 0,2) 104 * Указанная в таблице погрешность определения констант соответствует стандартному отклонению теоретической кривой от экспериментальной. Полученные значения суммарной константы ассоциации Ka для АР- и F-субстрата составляют (4,1 ± 0,2) 107 и (1,3 ± 0,1) 108, соответственно. Таким образом, фермент обладает высоким сродством к обоим типам повреждения. Следует отметить, что величины константы равновесия K1, характеризующей первичное связывание фермента с субстратом, для АР- и F-субстрата практически совпадают. Основной вклад в разницу значений суммарной константы сродства Ka для этих субстратов вносят константы равновесия второй (K2) и третьей (K3) стадий механизма, соответствующие последующей изомеризации фермент-субстратного комплекса ES. Изменения интенсивности флуоресценции остатков Trp, соответствующие стадии трансформации комплекса ES в комплекс ES'', скорее всего, отражают тонкую подстройку геометрии активного центра к структуре повреждения, которая не требуется в случае природного АР-сайта. Можно предположить, что в ходе превращения F-субстрата белку требуются дополнительные перестройки для того, чтобы расположить 5'-фосфатную группу F-сайта в положении, удобном для нуклеофильной атаки. Стадия необратимого разрыва фосфодиэфирной связи субстрата характеризуется самым низким значением константы скорости в механизме, причем значение kirr для АР-субстрата (3,2 с-1) в 1,5 раза выше, чем для F-субстрата (2,1 с1 ). Таким образом, в используемых нами условиях третья стадия (и константа скорости kirr) определяет скорость всего процесса. 92 Сравнение значений константы скорости стадии разрыва фосфодиэфирной связи (kirr) с аналогичной константой, полученной в работе [223], свидетельствует о 30-кратном снижении скорости превращения субстратов при переходе от 30-звенных дуплексов к 12звенным. Тем не менее, даже в случае коротких субстратов катализируемое АРЕ1 превращение протекает с очень высокой скоростью. Методом нелинейной регрессии для стадии диссоциации комплекса ЕР удается определить только значение константы равновесия Kd, а не значения прямой и обратной констант скорости. Исходя из значений Kd, приведенных в Таблице 4, можно заключить, что комплекс АРЕ1 с продуктами превращения АР- и F-субстратов диссоциирует относительно легко, причем стабильность комплекса ЕР в случае природного АР-сайта в 5 раз превышает его стабильность в случае F-сайта. В целом значения констант Kd, полученных методом «остановленной струи» и флуоресцентного титрования, согласуются друг с другом. Что касается неспецифического взаимодействия АРЕ1 с G-лигандом, то в соответствии с результатами количественной обработки данных, этот процесс описывается двумя обратимыми стадиями связывания (Схема 7). Важно отметить, что, в отличие от АР- и F-субстрата, комплекс ES' в случае G-лиганда, вероятнее всего, не является специфическим. Полученное значение константы k1 = (7,4 ± 0,5) 105 М-1с-1 более чем на 2 порядка ниже соответствующих значений для связывания поврежденной ДНК. При этом, общее сродство АРЕ1 к неповрежденной ДНК, выражаемое величиной константы равновесия Ка, снижено в 800 и 2500 раз, относительно сродства к природному АР-сайту и его F-аналогу. Тем не менее, даже при образовании комплекса с неспецифическим G-лигандом происходит изменение конформации фермента, свидетельствующее о протекании первичной стадии узнавания ДНК. 3.1.4. Анализ накопления продуктов разрезания [32Р]-меченых АР- и F-субстратов белком АРЕ1 методом гель-электрофореза Для того, чтобы проверить правильность соотнесения наблюдаемых конформационных переходов с конкретной стадией каталитического цикла, было исследовано взаимодействие АРЕ1 с АР- и F-субстратами, содержащими радиоактивную метку [32Р] на 5'-конце поврежденной цепи. Для этого 1,5 мкМ фермента добавляли к 1,5 мкМ субстрата, после чего через определенные промежутки времени останавливали реакцию добавлением к аликвотам реакционной смеси раствор 7 М мочевины. Подготовленные пробы разделяли в денатурирующем ПААГ и анализировали радиоавтографическим методом. Данные радиоавтографов свидетельствовали о быстром превращении в продукты обоих типов субстратов (Рис. 29А). В частности, конверсия примерно 95% АР-субстрата происходит 93 менее чем за 5 с, а для превращения F-субстрата требуется менее 10 с (Рис. 29Б). Таким образом, результаты, полученные с помощью гель-электрофореза, согласуются с данными предстационарной кинетики, подтверждая обнаруженную закономерность снижения скорости катализа при переходе от природного АР-сайта к синтетическому F-аналогу. Рис. 29. Анализ накопления продуктов разрезания [32Р]-меченых АР- и F-субстратов ферментом АРЕ1 методом гель-электрофореза. (А) Радиоавтограф разделения продуктов взаимодействия WT АРЕ1 с АР- и F-субстратами в денатурирующем ПААГ. Реакцию проводили при 25⁰С в буфере BER (см. разд. 2.8). Концентрация АРЕ1 и ДНК в реакционной смеси составляла 1,5 мкМ. В случае АР-субстрата (верхняя панель) в нулевой точке без добавления фермента наблюдалось небольшое затемнение на уровне 6-звенной ДНК, которое соответствует продукту спонтанного гидролиза, характерного для природного АР-сайта. (Б) Зависимость накопления продуктов реакции от времени. Гладкие кривые соответствуют теоретической подгонке экспериментальных данных. Погрешность экспериментальных точек определяли как стандартное отклонение в трех независимых экспериментах. 3.2. Конформационная динамика ДНК-субстратов в ходе взаимодействия с WT АРЕ1 На следующем этапе работы исследовали конформационную подвижность ДНКсубстратов в процессе превращения, катализируемого ферментом АРЕ1. Основная идея заключалась в том, что двойная спираль поврежденной ДНК так же, как и белок, может изменять свою конформацию в ходе каталитического цикла. Регистрация конформационных переходов в молекуле ДНК-субстрата могла бы дать дополнительную информацию о природе отдельных стадий предложенного нами кинетического механизма. Поскольку ДНК сама по себе не обладает флуоресцентными свойствами, в качестве флуоресцентной метки, чувствительной к изменениям структуры ДНК был выбран изомер аденина, 2-аминопурин (2-aPu). Фотофизические свойства этого флуорофора хорошо изучены и зависят от полярности растворителя [242, 243]. Флуоресценция 2-aPu в растворе тушится гидрофобным окружением и усиливается при переходе в более гидрофильную среду. Будучи встроенным в последовательность ДНК, 2-aPu не нарушает стэкинга оснований двойной спирали и, при этом, способен образовывать стабильную пару с цитозином [244, 245] (подробнее см. разд. 4.3 Обсуждения полученных 94 результатов). Описанные свойства сделали 2-aPu удобной спектроскопической меткой для детекции конформационных переходов в ДНК и РНК. Спектры возбуждения и испускания флуоресценции 2-aPu не перекрываются со спектром возбуждения АРЕ1, что позволяет возбуждать и регистрировать флуоресценцию 2-aPu в присутствии АРЕ1. 3.2.1. Регистрация изменений интенсивности флуоресценции остатка 2-aPu, встроенного в ДНК-субстраты и лиганды в ходе их взаимодействия с WT АРЕ1 Для решения поставленной задачи остаток 2-aPu встраивали в 5-е либо 7-е положение относительно 5'-конца поврежденного олигонуклеотида, что давало возможность наблюдать за изменениями локального окружения на обоих концах разрыва. В неповрежденной цепи напротив 2-aPu находился остаток цитидина (Таблица 3, разд. 2.3). После быстрого смешивания фермента с субстратом или лигандом регистрировали изменения интенсивности флуоресценции остатков 2-aPu от времени. Оптимальное время регистрации определяли из предварительных экспериментов, в которых за изменением сигнала следили в течение 2000 с. Следует отметить, что связывание АРЕ1 с неповрежденной ДНК сопровождались небольшим ростом флуоресценции 2-aPu в интервале 1−20 мс, который был сравним с уровнем шума и не зависел от концентрации белка (данные не приводятся). По этой причине количественная обработка этих данных не дала достоверных результатов. Совершенно иное поведение демонстрировали кинетические кривые флуоресценции 2-aPu, полученные в условиях одного оборота фермента, при смешивании АРЕ1 со специфическими субстратами (Рис. 30). Рис. 30. Изменение интенсивности флуоресценции остатков 2-aPu субстрата в процессе взаимодействия WT АРЕ1 с АР(2-aPu)- (А) и (2-aPu)АР-субстратом (Б). Реакцию проводили при 25⁰С в буфере BER (см. разд. 2.8). Концентрация ДНК во всех экспериментах составляла 1,5 мкМ. Концентрацию АРЕ1 варьировали от 0,3 до 3 мкМ, как указано справа от каждого графика. Гладкие линии черного цвета представляют результат количественной обработки экспериментальных данных по Схеме 8. 95 Так, взаимодействие АРЕ1 с природным АР-сайтом сопровождалось резким возрастанием интенсивности флуоресценции 2-aPu в интервале 5−500 мс в случае, когда флуорофор находился с 3'-стороны от АР-сайта (Рис. 30А). Если остаток 2-aPu располагался с 5'стороны от АР-сайта, то аналогичный рост флуоресцентного сигнала происходил в промежутке времени 0,2−10 с (Рис. 30Б). Таким образом, изменения конформации ДНКсубстратов с различным расположением 2-aPu имеют схожий характер и амплитуду, однако наблюдаемый процесс сильно смещается во временной шкале в зависимости от положения остатка 2-aPu. Учитывая фотофизические свойства используемой флуоресцентной метки, возрастание интенсивности флуоресценции должно отражать переход 2-aPu из гидрофобного окружения в гидрофильное. Действительно, необратимое разрезание ДНК-субстрата ферментом приводит к образованию коротких олигонуклеотидов, несущих флуоресцентную метку на 5'- либо 3'-конце. Поэтому наблюдаемый переход, вероятнее всего, соответствует высвобождению продуктов реакции из активного центра АРЕ1. Аппроксимация полученных кинетических кривых суммой экспонент позволила выделить на них три фазы, которые, по-видимому, включают связывание АРЕ1 с субстратом с образованием специфического ферментсубстратного комплекса, превращение его в комплекс фермент-продукт и высвобождение продуктов из активного центра фермента. Кинетические кривые, зарегистрированные методом «остановленной струи» для F(2-aPu)- и (2-aPu)F-субстратов, свидетельствуют о многостадийном характере изменения конформации ДНК в ходе превращения под действием фермента АРЕ1 (Рис. 31). Независимо от положения флуоресцентной метки на кинетических кривых наблюдалась фаза быстрого снижения интенсивности флуоресценции, за которой следовала фаза более медленного роста. В случае F(2-aPu)-субстрата первый переход происходил в интервале 10−150 мс (Рис. 31А), тогда как для (2-aPu)F-субстрата между 50 мс и 1 с (Рис. 31Б). Изменение конформации F-субстрата, сопровождающееся падением интенсивности флуоресценции 2-aPu, должно соответствовать переходу флуорофора в более гидрофобную среду. Поэтому данный переход следует относить к стадии формирования каталитически активного комплекса, которая предшествует стадии превращения субстрата в продукт. Этот процесс может сопровождаться более глубоким погружением поврежденной ДНК в карман активного центра АРЕ1. Последующий рост флуоресцентного сигнала, наблюдаемый в интервале времени 0,2−5 с для F(2-aPu)субстрата и 1−100 с для (2-aPu)F-субстрата, вероятнее всего, отражает накопление продуктов реакции и диссоциацию комплекса ЕР. Таким образом, изменения конформации F-содержащих субстратов, обнаруженные при взаимодействии с WT АРЕ1, 96 Рис. 31. Изменение интенсивности флуоресценции остатков 2-aPu субстрата в процессе взаимодействия WT АРЕ1 с F(2-aPu)- (А) и (2-aPu)F-субстратом (Б). Реакцию проводили при 25⁰С в буфере BER (см. разд. 2.8). Концентрация ДНК во всех экспериментах составляла 1,5 мкМ. Концентрацию АРЕ1 варьировали от 0,3 до 3,0 мкМ, как указано справа от каждого графика. Гладкие линии черного цвета представляют результат количественной обработки экспериментальных данных по Схеме 8. включают четыре этапа: первичное связывание АРЕ1 с субстратом с образованием комплекса ES, изомеризация фермент-субстратного комплекса в каталитически активный, превращение его в комплекс EP и распад комплекса фермент-продукт. Важно отметить, что так же, как и в случае природного АР-сайта, протяженность конформационных переходов в молекулах F(2-aPu)- и (2-aPu)F-субстратов во времени зависит от положения флуорофора. В частности, процесс разрезания F(2-aPu)-субстрата, по данным предстационарной кинетики, завершается через 10 с после начала, в то время как в случае (2-aPu)F-субстрата выход флуоресцентного сигнала на плато происходит только после 100 с. Наблюдаемая закономерность может объясняться двумя причинами. Во-первых, встраивание остатка 2-aPu с 5'-стороны от повреждения может замедлять ферментативную реакцию, каким-либо образом затрудняя превращение субстрата. Во-вторых, размещая 2aPu по разные стороны от повреждения, можно наблюдать за конформационной динамикой разных участков субстрата, в структуре которых перестройки могут происходить независимо друг от друга. При этом общая скорость катализа должна оставаться постоянной. 3.2.2. Определение кинетических параметров, описывающих конформационную динамику ДНК-субстратов в процессе их превращения белком АРЕ1 Для определения начальных значений константы диссоциации комплекса ЕР изучали сродство АРЕ1 к продуктам реакции, содержащим 2-aPu метку с 3'- либо 5'стороны от повреждения. Для этого в стационарных условиях проводили флуоресцентное 97 титрование АРЕ1 F(2-aPu)- и (2-aPu)F-продуктами (Таблица 3, разд. 2.3). На Рис. 32 представлены зависимости интенсивности флуоресценции остатков Trp АРЕ1 от концентрации F(2-aPu)- и (2-aPu)F-продукта. Обработка экспериментальных данных по схеме одностадийного связывания позволила установить величины равновесной константы Kdtitr(F(2-aPu)) = (3,7 ± 0,5)×10-6 М и Kdtitr((2aPu)F) = (3,2 ± 0,4)×10-6 М. Разница в полученных значениях Kdtitr не превышала эксперимента, поэтому можно стабильность комплекса АРЕ1 ошибки считать, с что продуктом реакции не зависит от расположения 2-aPu относительно F-сайта. При этом, если сравнивать стабильность комплексов WT АРЕ1 с 2-aPuсодержащими дуплексами и дуплексами без 2-aPu Рис. 32. Зависимость интенсивности флуоресценции остатков Trp WT АРЕ1 от концентрации F(2-aPu)- либо (2aPu)F-продукта. [P] – концентрация ДНК. (Рис. 28, разд. 3.1.3), то наблюдалось 3,5-кратное увеличение значения Kdtitr при встраивании флуоресцирующего нуклеотида в ДНК-субстрат рядом с F-сайтом. Для описания динамики конформационных превращений ДНК-субстратов в ходе исследуемого каталитического процесса проводили количественную обработку кинетических кривых, представленные на Рис. 30 и 31, как описано в разделе 3.1.3. С помощью процедуры оптимизации значений параметров системы дифференциальных уравнений методом нелинейной регрессии был определен минимальный кинетический механизм процесса для каждого из субстратов (Схема 8). Схема 8 Количество конформационных переходов, зарегистрированных для АР(2-aPu)- и (2aPu)АР-субстратов, соответствует трем стадиям механизма: связыванию АРЕ1 с поврежденной ДНК с образованием комплекса ES, необратимому разрезанию субстрата и диссоциации комплекса ЕР. В случае F(2-aPu)- и (2-aPu)F-субстратов кинетические кривые описываются, как минимум, четырьмя стадиями, причем дополнительное изменение конформации ДНК наблюдается на стадии, предшествующей катализу 98 (выделена красным цветом на Схеме 8). Константы скорости прямых и обратных стадий механизма приведены в Таблице 5. Кинетика стадий связывания АРЕ1 с поврежденной Таблица 5. Кинетические параметры, описывающие конформационные переходы в 2-aPuсодержащих субстратах при взаимодействии с WT АРЕ1, которые были получены в ходе регистрации флуоресценции остатков 2-аPu. Обозначения констант скорости и равновесия соответствует отдельным стадиям Схемы 8.* Краткое обозначение субстрата: AP(2-aPu) k1 2-aPu -1 -1 ,M с K12-aPu, M-1 k22-aPu, с-1 k-22-aPu, с-1 K22-aPu kirr2-aPu, с-1 Kd2-aPu, M Ka2-aPu, M-1 (а) (2-aPu)AP (4,9 ± 0,2) × 10 k-12-aPu, с-1 Флуоресценция 2-aPu 7 3,1 ± 0,1 F(2-aPu) 7 (2-aPu)F 7 (2,6 ± 0,2) × 10 (1,9 ± 0,1) × 10 (3,5 ± 0,1) × 106 7,0 ± 0,2 38 ± 2 11 ± 1 (5,0 ± 0,5) 10 7,5 ± 0,5 (3,2 ± 0,3) 105 1,3 ± 0,1 2,1 ± 0,2 0,56 ± 0,03 3,6 ± 0,3 2,3 ± 0,2 5 6,8 ± 0,4 0,50 ± 0,03 -7 1,5 ± 0,1 -6 0,080 ± 0,005 -6 (2,0 ± 0,1) × 10 (1,9 ± 0,1) × 10 (1,1 ± 0,1) × 10 (3,8 ± 0,2) × 10-6 (1,6 ± 0,1) × 107 (3,7 ± 0,2) × 106 (2,2 ± 0,1) × 106 (1,1 ± 0,1) × 106 * Указанная в таблице погрешность определения констант соответствует стандартному отклонению теоретической кривой от экспериментальной. N ** j i Равновесная константа ассоциации определялась выражением K a K j для N-стадийного i 1 j 1 механизма, где K j kj . k j ДНК, регистрируемая по флуоресценции 2-aPu, согласуется с кинетикой, наблюдаемой по флуоресценции остатков Trp белка (Таблица 4, разд. 3.1.3.). Сравнение значений константы Ka2-aPu для АР(2-aPu)-субстрата со значением K12-aPu для F(2-aPu)-субстрата показывает, что при переходе от АР-сайта к F-сайту стабильность первичного комплекса ES снижается в 32 раза. Указанная разница отчасти нивелируется вкладом константы равновесия второй стадии изомеризации фермент-субстратного комплекса (K22-aPu) так, что суммарные константы сродства АРЕ1 к АР(2-aPu)- и F(2-aPu)-субстратам (Ka2-aPu) отличаются уже в 7,3 раза. Наблюдаемая закономерность является особенностью 2-aPuсодержащих субстратов, поскольку во всех случаях исследования кинетики ДНКсубстратов без 2-aPu KaF, напротив, приблизительно на порядок превышала KaАР. Значения констант скорости необратимой стадии, kirr2-aPu, которая соответствует фазе роста интенсивности флуоресценции на кинетических кривых, обнаруживают явную зависимость скорости катализа от природы повреждения и положения флуоресцентной метки. Так, самая высокая скорость разрыва фосфодиэфирной связи наблюдается для АР(2-aPu)-субстрата (6,8 с-1). Важно отметить, что это значение более чем в 2 раза 99 превышает kirr для АР-субстрата (Таблица 4, разд. 3.1.3.). Далее следуют F(2-aPu)-субстрат (1,5 с-1) и (2-aPu)АР-субстрат (0,5 с-1). Превращение (2-aPu)F-субстрата характеризуется самым низким значением kirr2-aPu = 0,08 с-1. Таким образом, скорость превращения комплекса фермент-субстрат в комплекс фермент-продукт снижается в 4−6 раз при переходе от природного АР-сайта к его F-аналогу и в 14−18 раз при перемещении 2-aPuметки с 3'-стороны на 5'-сторону повреждения. Величина константы равновесия завершающей стадии механизма свидетельствует о том, что наиболее стабильным является комплекс АРЕ1 с продуктом превращения АР(2-aPu)-субстрата (Kd2-aPu = (2,0 ± 0,1) × 10-7 М), а быстрее всех должен диссоциировать комплекс с продуктом (2-aPu)Fсубстрата (Kd2-aPu = (3,8 ± 0,2) × 10-6 М). Данные, полученные методом «остановленной струи» подтверждают наше предположение о конформационной подвижности ДНКсубстрата в ходе каталитического цикла. Регистрируемые в предстационарных условиях изменения флуоресцентного сигнала 2-аминопурина свидетельствуют о многоступенчатом характере процесса. 3.2.3. Анализ накопления продуктов разрезания белком АРЕ1 [32Р]-меченых 2-aPuсодержащих субстратов методом гель-электрофореза Взаимодействие WT АРЕ1 c 2-aPu-содержащей поврежденной ДНК, содержащей [32P]-метку на 5'-конце, было исследовано методом гель-электрофореза в условиях, аналогичных условиям метода «остановленной струи». Реакцию останавливали через определенные промежутки времени добавлением раствора 7 М мочевины. Глубину протекания реакции определяли путем сканирования радиоавтографов разделения продуктов в денатурирующем ПААГ (Рис. 33А). Время первой экспериментальной точки на кинетических зависимостях ограничивалось возможностями применяемого метода смешивания реагентов. Зависимости степени превращения от времени для каждого из субстратов подтверждают данные быстрой кинетики (Рис. 33Б). В частности, превращение АР(2-aPu)- и F(2-aPu)-субстратов под действием эндонуклеазы АРЕ1 происходит менее чем за 3 с. При этом превращение субстратов с 2-aPu-меткой на 5'конце повреждения проходит на 85% за 30 с. Время полупревращения ДНК-субстратов по данным гель-электрофореза хорошо согласуется с константами скорости стадии разрыва фосфодиэфирной связи, kirr, что свидетельствует в пользу адекватности соотнесения наблюдаемых изменений интенсивности флуоресценции с конкретными стадиями каталитического цикла. Использование флуоресцентной метки, встроенной в ДНК позволило обнаружить не только конформационную подвижность субстратов, но также и зависимость скорости процесса от положения 2-аминопурина. Смещение 100 конформационных переходов в ДНК в сторону больших значений по оси времени, которое наблюдалось на кинетических кривых для (2-aPu)АР- и (2-aPu)F-субстратов (см. Рис. 33. Анализ накопления продуктов разрезания белком АРЕ1 [32Р]-меченых 2-aPuсодержащих субстратов методом гель-электрофореза (А) Радиоавтограф разделения продуктов взаимодействия АРЕ1 с 2-aPu-содержащими субстратами в денатурирующем ПААГ. Реакцию проводили при 25⁰С в буфере BER (см. разд. 2.8). Концентрация фермента и ДНК в реакционной смеси составляла 1,5 мкМ. В случае АР-субстрата в нулевой точке без добавления фермента наблюдалось небольшое затемнение на уровне 6-звенной ДНК, которое соответствует продукту спонтанного гидролиза, характерного для природного АР-сайта. (Б) Зависимость накопления продуктов реакции от времени. Гладкие кривые соответствуют теоретической подгонке экспериментальных данных. Погрешность экспериментальных точек определяли как стандартное отклонение в трех независимых экспериментах. Рис. 30, 31, разд. 3.2.1), подтверждается результатом разделения [32Р]-меченых продуктов реакции в денатурирующем ПААГ. Эти данные убедительно доказывают, что встраивание 2-aPu с 5'-стороны АР-сайта действительно затрудняет превращение таких субстратов. 3.2.4. Регистрация изменений интенсивности флуоресценции остатков Trp фермента в ходе взаимодействия с 2-aPu-содержащими субстратами Для получения дополнительной информации о механизме каталитического превращения 2-aPu-содержащих субстратов предстационарную кинетику их взаимодействия с WT АРЕ1 регистрировали по изменению флуоресцентного сигнала остатков Trp фермента. Чтобы исключить вклад флуоресценции 2-аминопурина в изменение интенсивности флуоресценции Trp эксперименты проводили с применением специального светофильтра, выделяющего полосу шириной 10 нм на длине волны 340 нм. В ходе работы в условиях, близких к условиям одного оборота фермента, смешивали 1,5 мкМ АРЕ1 и 0,5−4 мкМ 2-aPu-содержащих поврежденных дуплексов ДНК (Таблица 3, разд. 2.3). Кинетические кривые, характеризующие взаимодействие АРЕ1 с природным АР-сайтом, соседствующим с 2-aPu либо с 5-, либо с 3-стороны, свидетельствуют о множественных изменениях конформации фермента в ходе каталитического цикла (Рис. 34). Прежде всего, следует отметить, что общий характер изменения флуоресцентного 101 Рис. 34. Изменение интенсивности флуоресценции остатков Trp фермента в процессе взаимодействия WT АРЕ1 с АР(2-aPu)- (А) и (2-aPu)АР-субстратом (Б). Реакцию проводили при 25⁰С в буфере BER (см. разд. 2.8). Концентрация АРЕ1 во всех экспериментах составляла 1,5 мкМ. Концентрацию субстратов варьировали от 0,5 до 4,0 мкМ, как указано справа от каждого графика. Гладкие линии черного цвета представляют результат количественной обработки экспериментальных данных по Схеме 9. сигнала во времени согласуется с поведением флуоресцентных кривых, описывающих превращение субстратов без 2-aPu (Рис. 26, разд. 3.1.2). В частности, на кинетических кривых отчетливо видны фазы последовательного снижения и роста интенсивности флуоресценции белка, которые имеют выраженную зависимость от концентрации ДНКсубстратов. Такая согласованность, с одной стороны, говорит о хорошей воспроизводимости результатов кинетических экспериментов, а с другой, свидетельствует о том, что встраивание 2-aPu рядом с АР-сайтом не оказывает драматического влияния на протекание ферментативного процесса. При этом, данные по конформационной динамике АРЕ1, полученные в ходе взаимодействия с 2-aPu-содержащими субстратами, имеют свои особенности, которые дают новую информацию об отдельных стадиях механизма. На флуоресцентных кривых, полученных для АР(2-aPu)-субстрата, можно выделить три фазы. Первая фаза характеризуется тушением флуоресцентного сигнала Trp в интервале 1−8 мс и соответствует погружению субстрата в активный центр. Во второй фазе (0,02−0,2 с), по-видимому, начинает образовываться продукт реакции, диссоциация которого из комплекса с АРЕ1 приводит к возрастанию и выходу на плато интенсивности флуоресценции на третьей фазе (Рис. 34А). Качественная оценка времени полупревращения τ1/2 на стадии роста Trp флуоресценции дает значение около 0,07 с. Аналогичная оценка для фазы роста на кинетических кривых для АР-субстрата, не содержащего 2-aPu (Рис. 26А, разд. 3.1.2), дает значение порядка 0,3 с. Таким образом, фаза образования комплекса EP для АР(2-aPu)-субстрата регистрируется на временах, в 4 раза превышающих аналогичное время для АР-субстрата. Это подтверждает необычайно быстрое превращение АР(2-aPu)-субстрата, наблюдавшееся по флуоресценции остатков 2102 aPu (Рис. 30А, разд. 3.2.1). Интересной особенностью серии кинетических кривых, изображенной на Рис. 34А, является несоответствие интенсивности флуоресценции в начале и в конце каталитического цикла. Исходя из общих представлений о протекании ферментативных реакций, фермент после взаимодействия с субстратом должен диссоциировать из комплекса с продуктом в неизменном виде. Поэтому и регистрируемый флуоресцентный сигнал молекулы белка по окончании процесса должен возвращаться к своему начальному значению, что и наблюдалось при взаимодействии АРЕ1 с АР- и F-субстратами. Однако в случае АР(2-aPu)-субстрата реакция с АРЕ1 протекает настолько быстро, что даже время автоматического быстрого смешивания (~1,5 мс) не достаточно мало для того, чтобы зарегистрировать начальные стадии процесса. Этим, вероятнее всего, объясняется более низкий уровень интенсивности флуоресценции остатков Trp фермента на начальном этапе взаимодействия, по сравнению с фазой распада комплекса фермент-продукт. Взаимодействие АРЕ1 с (2-aPu)АР-субстратом характеризуется бóльшим числом конформационных переходов в молекуле белка. Дополнительная фаза колоколообразного изменения интенсивности Trp флуоресценции наблюдается в промежутке 0,03−0,2 с и, скорее всего, соответствует специфической изомеризации фермент-субстратного комплекса (Рис. 34Б). Следует отметить, что в случае АР(2-aPu)-субстрата в том же временном интервале наблюдалась фаза накопления продуктов, что говорит об общем снижении скорости процесса при переносе флуоресцентной метки из 3'-положения в 5'положение. В остальном кинетические кривые, описывающие разрезание (2-aPu)АРсубстрата, имеют те же особенности, что и кривые для АР(2-aPu)-субстрата. Превращение субстратов, содержащих в качестве повреждения F-аналог природного АР-сайта, фланкированный с 3'- либо 5'-стороны остатком 2-аминопурина, также было исследовано с точки зрения конформационной динамики АРЕ1. Зависимости интенсивности флуоресценции остатков Trp регистрировали в тех же условиях, что и зависимости для природного АР-сайта, только в случае (2-aPu)F-субстрата интервал регистрации конформационных переходов был продлен до 200 с. В целом форма полученных зависимостей (Рис. 35) соответствовала форме кривых для (2-aPu)АРсубстрата. Как и ожидалось, специфическое связывание фермента с субстратами характеризовалось двухфазным снижением интенсивности флуоресценции в интервале 1−100 мс для F(2-aPu)- и 1−700 мс для (2-aPu)F-субстрата. Затем следовал более протяженный рост интенсивности флуоресценции Trp, соответствующий накоплению продуктов реакции и диссоциации их из комплекса с ферментом. Интервал времени, охватывающий конформационные переходы в молекуле АРЕ1 в ходе превращения (2103 aPu)F-субстрата (Рис. 35Б), хорошо согласуется с временным интервалом конформационных переходов в молекуле ДНК, регистрируемых по флуоресценции 2-aPu (Рис. 31Б). Рис. 35. Изменение интенсивности флуоресценции остатков Trp фермента в процессе взаимодействия WT АРЕ1 с F(2-aPu)- (А) и (2-aPu)F-субстратом (Б). Реакцию проводили при 25⁰С в буфере BER (см. разд. 2.8). Концентрация АРЕ1 во всех экспериментах составляла 1,5 мкМ. Концентрацию субстратов варьировали от 0,5 до 4,0 мкМ, как указано справа от каждого графика. Гладкие линии черного цвета представляют результат количественной обработки экспериментальных данных по Схеме 9. 3.2.5. Кинетические параметры превращения 2-aPu-содержащих субстратов белком АРЕ1, регистрируемого по изменению флуоресценции остатков Trp фермента Определение минимального кинетического механизма и констант скорости элементарных стадий процесса проводили по стандартной методике, описанной в разделе 3.1.3. Для всех субстратов, кроме АР(2-aPu), минимальный кинетический механизм состоит из четырех стадий (Схема 9). Конформационные переходы в молекуле АРЕ1 в ходе Схема 9 взаимодействия с АР(2-aPu)-субстратом с высокой степенью достоверности описывается трехстадиийной схемой. Вследствие высокой скорости процесса на кинетических кривых было сложно четко разделить первые две стадии связывания АРЕ1 с ДНК, к которым относится образование первичного неспецифического комплекса ES и его последующее 104 превращению в комплекс ES'. По этой причине константы скорости прямой и обратной реакций первой стадии (k1* и k-1*) в Таблице 6 сочетают в себе кинетические параметры двух первых равновесий Схемы 9. Значение константы k1*, определяемой по флуоресценции остатков Trp, для АР(2-aPu)-субстрата на порядок превышает это значение для трех других субстратов. Такая зависимость хорошо согласуется со значениями константы k12-aPu, установленной по флуоресценции 2-aPu (Таблица 5). Общее сродство АРЕ1 к 2-aPu-содержащим субстратам, определяемое по конформационной динамике фермента (KaTrp), меняется от 1,5×106 до 3,8×106 М-1. Причем с субстратами, содержащими 2-aPu с 3'-стороны от повреждения, АРЕ1 способен образовывать более прочный комплекс, чем с 5'-2-aPu субстратами. Как следует данных по флуоресценции белка (Рис. 34, 35, разд. 3.2.4), изомеризация предкаталитического комплекса АРЕ1 с (2-aPu)АР-, F(2aPu)- и (2-aPu)F-субстратами сопровождается дополнительным конформационным переходом (~0,1 c), выраженность которого на кинетических кривых зависит от концентрации ДНК. В нашем кинетическом механизме этот переход соответствует стадии, предшествующей разрыву фосфодиэфирной связи субстрата, и характеризуется константами k2Trp и k-2Trp. Значения константы k2Trp для F(2-aPu)- и (2-aPu)F-субстратов составляют 12 и 13 с-1, что соответствует τ1/2 около 0,055 c. Таблица 6. Параметры, описывающие кинетический механизм взаимодействия WT АРЕ1 с 2-aPuсодержащими субстратами, которые были получены в ходе регистрации флуоресценции остатков Trp фермента. Обозначения констант скорости и равновесия соответствует отдельным стадиям Схемы 9. Краткое обозначение субстрата: AP(2-aPu) -1 -1 (а) k1*, M с Флуоресценция Trp (2-aPu)AP 8 F(2-aPu) 7 (2-aPu)F 7 (1,9 ± 0,1) × 107 (2,1 ± 0,1) × 10 (1,0 ± 0,1) × 10 (1,2 ± 0,1) × 10 54 ± 2,8 61 ± 3 47 ± 2 77 ± 3 (1,6 ± 0,1) 105 (2,6 ± 0,2) 105 (2,5 ± 0,2) 105 k2Trp, с-1 9,3 ± 0,7 12 ± 1 13 ± 1 k-2Trp, с-1 1,1 ± 0,1 0,71 ± 0,05 1,9 ± 0,1 K2Trp 8,5 ± 0,8 17 ± 2 6,8 ± 0,7 k-1*, с-1 K1*Trp, M-1 kirrTrp, с-1 5,7 ± 0,5 0,37 ± 0,02 2,8 ± 0,2 0,080 ± 0,004 KdTrp, M (1,0 ± 0,1) × 10-6 (4,2 ± 0,3) × 10-6 (7,5 ± 0,6) × 10-7 (4,1 ± 0,2) × 10-6 KaTrp, M-1 (б) (3,8 ± 0,2) × 106 (1,5 ± 0,1) × 106 (2,2 ± 0,1) × 106 (1,9 ± 0,1) × 106 (а) (б) k1* = K1·k2, см. Схему 9. N j i Равновесная константа ассоциации определялась выражением K a K j для N-стадийного i 1 j 1 механизма, где K j kj . k j 105 Для сравнения, на кинетических кривых 2-aPu флуоресценции вторая стадия механизма описывает конформационный переход в структуре F(2-aPu)- и (2-aPu)F-субстратов с константами 7,5 и 1,3 с-1, соответственно. Упомянутое изменение конформации ДНК (0,1−0,5 с), вероятнее всего, происходит из-за сближения флуорофора с активным центром фермента, поскольку интенсивность флуоресценции 2-aPu при этом снижается (Рис. 31, разд. 3.2.1). Анализируя конформационные переходы в молекулах АРЕ1 и 2-aPuсодержащих субстратов можно заключить, что в ходе взаимной подстройки структур фермента и субстрата определенное изменение конформации АРЕ1 вызывает конформационный переход в структуре ДНК, что удалось напрямую показать с использованием метода «остановленной струи». Анализ констант скорости третьей необратимой стадии, kirrTrp, свидетельствует о разбросе значений, который зависит как от природы повреждения, так и от положения флуоресцирующего нуклеотида. Так, быстрее всего, по данным, полученным из конформационной динамики белка, происходит разрезание АР(2-aPu)-субстрата (5,7 с-1). Ненамного медленнее АРЕ1 превращает F(2-aPu)-субстрат и 2-aPu7 (2,8 с-1). Субстраты (2aPu)АР и (2-aPu)F, содержащие остаток 2-aPu с 5'-стороны от повреждения, характеризуются наиболее низкими значениями kirrTrp, равными 0,37 с-1 и 0,08 с-1. Другими словами, перенос остатка 2-aPu с 5'-стороны АР-сайта на 3'-сторону приводит к 15кратному снижению скорости превращения такого субстрата. В случае F-аналога скорость превращения субстрата отличается почти в 35 раз в зависимости от положения флуоресцентной метки. Таким образом, данные по конформационной динамике ДНКсубстратов в ходе каталитического цикла подтверждают результаты исследования конформационных переходов в молекуле АРЕ1. Как было установлено, скорость необратимой стадии механизма снижается в ряду AP(2-aPu) > F(2-aPu) ≥ (2-aPu)AP > (2aPu)F. Последнее равновесие Схемы 9 характеризует обратимую диссоциацию комплекса АРЕ1 с продуктом реакции. В зависимости от типа субстрата значения KdTrp меняются от 7,5×10-7 до 4,2×10-6 М. При этом, сохраняется тенденция к увеличению стабильности комплекса ЕР при переходе от природного АР-сайта к F-аналогу. 3.3. Исследование влияния консервативного остатка Asn-212 на отдельные стадии процесса, катализируемого АРЕ1 Asn-212 является одной из ключевых аминокислот активного центра, обеспечивающих каталитическую активность АРЕ1. С помощью рентгеноструктурного анализа было показано, что в составе фермент-субстратного комплекса этот консервативный остаток располагается в непосредственной близости от 5'-фосфатной 106 группы АР-сайта [122]. Амидная группа Asn-212 может образовывать водородную связь с атомом кислорода гидролизуемой фосфатной группы субстрата и, тем самым, стабилизировать пентакоординированное переходное состояние. Однако впоследствии в литературе появились новые интерпретации роли Asn-212 в каталитическом механизме АРЕ1. В частности, авторы [198], предложившие структуру АРЕ1 с двумя ионами Mg2+ в активном центре, полагают, что боковой радикал Asn-212, так же, как и остатки Asp-210 и His-309, участвует в координации иона металла в сайте связывания Б. Новые кристаллические структуры свободного фермента и его комплекса с продуктом реакции указывают на то, что, вероятнее всего, именно аминокислоты Asn-212 и Asp-210, взаимодействуя с молекулой воды, генерируют нуклеофил для атаки на фосфодиэфирную связь [184, 208]. Результаты работы [186], в которой изучалось влияние различных мутаций по Asn-212 на активность АРЕ1, свидетельствуют об участии этого остатка как в связывании, так и в превращении поврежденной ДНК. В частности, замена бокового радикала Asn-212 на глутамат либо аспартат приводила к 300- и 900-кратному снижению эндонуклеазной активности фермента, в то время как замена N212A полностью ингибировала активность АРЕ1. Было показано, что мутантная форма N212Q АРЕ1 полностью теряет способность связываться с АР-сайтами, но образует детектируемое количество комплекса с неповрежденной ДНК. В настоящей работе для более точного установления роли Asn-212 на отдельных этапах каталитического цикла методом «остановленной струи» были исследованы две мутантные формы АРЕ1, в которых Asn212 был заменен на аланин либо аспартат. 3.3.1. Регистрация конформационных переходов в активном центре мутантной формы N212D АРЕ1 в ходе взаимодействия с поврежденной ДНК в предстационарных условиях Взаимодействие мутантной формы N212D АРЕ1 (далее «мутант N212D») с поврежденной ДНК исследовали с применением описанных выше 12-звенных дуплексов ДНК, содержащих природный АР-сайт либо его F-аналог в шестом положении последовательности (Таблица 3, разд. 2.3). Конформационную динамику мутанта N212D регистрировали по флуоресценции остатков Trp белка. Для наблюдения за изменением конформации ДНК-субстрата в ходе каталитического цикла в седьмое положение последовательности поврежденных олигонуклеотидов встраивали 2-аминопурин. Место введения флуоресцентной метки в ДНК было выбрано с учетом проведенных ранее экспериментов. Как было показано для WT АРЕ1 (см. разд. 3.2), встраивание остатка 2aPu с 5'-стороны АР-сайта увеличивает время одного оборота фермента, в то время как 2107 aPu, расположенный с 3'-стороны от повреждения не влияет на скорость процесса. Поскольку введение замен по Asn-212 само по себе должно приводить к снижению активности АРЕ1, было решено использовать только субстраты, содержащие 2-aPu в 7-ом положении с 5'-конца (AP(2-aPu) и F(2-aPu)), во избежание дополнительного снижения скорости превращения субстратов. Регистрацию конформационных переходов в молекуле N212D АРЕ1 в ходе связывания и превращения субстратов проводили в условиях, приближенных к условиям однооборотной реакции. В качестве контроля регистрировали изменение интенсивности флуоресценции остатков Trp фермента при взаимодействии с неповрежденным Gлигандом. Начальные участки полученных зависимостей характеризовались небольшим тушением флуоресцентного сигнала, которое не зависело от концентрации лиганда (данные не приводятся). Зависимости интенсивности флуоресценции остатков Trp фермента в интервале времени от 1 мс до 2000 с, полученные при взаимодействии N212D АРЕ1 с поврежденной ДНК, представлены на Рис. 36А и Б. Ввиду того, что перегибы на кинетических кривых наблюдались как на коротких, так и на длинных временах, данные собирали во временных диапазонах: 0,001−1 с и 0,001−2000 с. Полученные данные свидетельствуют об изменении конформации N212D АРЕ1 в процессе взаимодействия с ДНК. Следует отметить, что в целом вид флуоресцентных зависимостей согласуется для АР- и F-субстратов. Аналогичным образом, но с использованием флуоресценции 2-aPu, регистрировали конформационные переходы в молекулах ДНК-субстратов. На кинетических кривых, характеризующих взаимодействие N212D АРЕ1 с АР(2-aPu)- и F(2aPu)-субстратами, также имеется несколько переходов (Рис. 36В, Г), характер которых соответствовал специфическим взаимодействиям между ферментом и субстратом. Для проведения анализа кинетические кривые были разделены на отдельные фазы возрастания и тушения флуоресцентного сигнала, что соответствовало конформационным переходам в структуре белка на различных стадиях процесса. Поведение зависимостей на начальном участке (0,001−2 с) свидетельствовало о том, что связывание поврежденной ДНК мутантом N212D осуществляется в две стадии. При этом, из-за того, что скорость образования первичного неспецифического комплекса ES очень высока, метод «остановленной струи» позволяет регистрировать лишь окончание этого процесса, которое выражается в небольшом возрастании 2-aPu флуоресценции в интервале 1−50 мс (Рис. 36В, Г). Вторая фаза характеризует погружение вывернутого АР-сайта и соседних нуклеотидов в гидрофобный карман активного центра АРЕ1, которое сопровождается снижением интенсивности как Trp, так и 2-aPu флуоресценции. На третьей фазе кинетических кривых наблюдается рост интенсивности флуоресценции обоих 108 Рис. 36. Взаимодействие мутантной формы N212D АРЕ1 с АР- и F-субстратами. (А, Б) Конформационные переходы в молекуле белка регистрировали по изменению интенсивности флуоресценции остатков Trp. Реакцию проводили при 25⁰С в буфере BER (см. разд. 2.8). Концентрация мутанта N212D во всех экспериментах составляла 1,5 мкМ. Концентрацию субстратов варьировали от 0,5 до 3,0 мкМ. (В, Г) Конформационные переходы в молекулах ДНКсубстратов регистрировали по изменению интенсивности флуоресценции остатков 2аминопурина. Концентрация субстратов во всех экспериментах составляла 1,5 мкМ. Концентрацию белка варьировали от 0,5 до 3,0 мкМ. Синими точками на панелях А и В показано накопление продукта реакции от 0 до 100%, регистрируемое гель-электрофорезом в той же временной шкале. Гладкие линии черного цвета представляют результат количественной обработки экспериментальных данных. флуорофоров в промежутке времени между 30 и 2000 с, после чего интенсивность флуоресценции уже не изменяется. Учитывая фотофизические свойства Trp и 2-aPu, интенсивность флуоресценции которых возрастает при переходе в более гидрофильное окружение, третья фаза процесса была отнесена к гидролизу 5'-фосфодиэфирной связи субстрата и высвобождению продуктов реакции из активного центра. Как следует из Рис. 36В, значение интенсивности флуоресценции 2-aPu по оси ординат, наблюдаемое в конце процесса, заметно превышает начальный уровень флуоресцентного сигнала. Эта разница, которая имела место и для WT АРЕ1, объясняется тем, что в начале процесса флуоресцентная метка находится внутри двойной спирали субстрата в стэкинге с соседними основаниями, а после превращения в продукт становится частью короткого 5или 6-звенного одноцепочечного олигонуклеотида. Другими словами, локальное 109 окружение 2-aPu, от которого зависит интенсивность его флуоресценции, не совпадает в начале и в конце реакции. Интересен тот факт, что в случае F(2-aPu)-субстрата флуоресценция 2-аминопурина не достигала предельного значения за время регистрации кривой, а непрерывный рост флуоресцентного сигнала продолжался до 4000 с (Рис. 36Г). Наблюдаемый эффект может следствием высокой стабильности комплекса ферментпродукт, а также слишком низкой скорости каталитической стадии. Таким образом, форма флуоресцентных кривых, наблюдаемая для мутанта N212D АРЕ1 схожа с формой кривых, полученных для WT АРЕ1 (Рис. 26, разд. 3.1.2). Однако скорость протекания отдельных стадий каталитического цикла значительно снижена при замене аминогруппы Asn-212 на карбоксильную. 3.3.2. Определение минимального кинетического механизма и количественных параметров взаимодействия N212D АРЕ1 с АР- и F-содержащей ДНК Для оценки стабильности комплекса N212D АРЕ1 с продуктами реакции белок титровали смесью олигонуклеотидов, которые представляли собой продукты гидролиза F- и F(2-aPu)-субстратов (Таблица 3, разд. 2.3). Для определения значений равновесной константы Kdtitr полученные зависимости обрабатывали, используя экспоненциальную функцию (Рис. 37). Значения комплексов констант фермента с F- диссоциации и F(2-aPu)- продуктами составили (2,3 ± 0,5)×10-6 М и (6,3 Рис. 37. Зависимость интенсивности флуоресценции остатков Trp N212D АРЕ1 от концентрации либо F- либо F(2-aPu)продукта. [P] – концентрация ДНК. ± 0,4)×10-6 М, соответственно. Таким образом, сродство мутанта N212D к ДНК-продукту, не содержащему 2-aPu, снижено в 3 раза, а к продукту, содержащему 2-aPu, – почти на порядок, по сравнению WT АРЕ1. Для количественного описания наблюдаемых конформационных переходов каждую концентрационную серию анализировали, используя метод нелинейной регрессии, как описано в разделах 2.11 и 3.1.3. Поскольку изменения интенсивности флуоресцентного сигнала, соответствующие стадиям связывания и разрезания субстратов, в случае мутантного фермента были разделены большим временным интервалом (Рис. 36), то расчет кинетических параметров изомеризации предкаталитического ферментсубстратного комплекса проводили отдельно от других стадий по участкам кривых на временах от 0,001 до 5−10 с. По результатам количественной обработки был предложен 110 кинетический механизм процесса, который включал две обратимые стадии связывания, одну необратимую стадию превращения субстрата в продукт и равновесие, описывающее распад комплекса фермент-продукт (Схема 10). Релевантность определяемых констант Схема 10 оценивали по отклонению теоретической кривой от экспериментальной. Таблица 7 объединяет кинетические параметры, характеризующие эндонуклеазную активность N212D АРЕ1, полученные на основе измерения флуоресценции остатков Trp и 2-aPu. Важно отметить, что кинетические параметры для одних и тех же стадий механизма, определенные с использованием разных флуорофоров, согласуются между собой. Таблица 7. Кинетические параметры эндонуклеазной активности N212D АРЕ1 в отношении АР- и F-субстратов, определяемые по флуоресценции Trp фермента и 2-aPu, встроенного в ДНКсубстрат. Константы скорости соответствуют отдельным стадиям Схемы 10.* N212D АРЕ1 k1, M-1 с-1 k-1, с-1 -1 Флуоресценция Trp Флуоресценция 2-aPu AP F AP(2-aPu) F(2-aPu) (2,3 ± 0,1) × 106 (5,4 ± 0,2) × 106 (2,2 ± 0,3) × 107 (7,8 ± 0,1) × 107 7,6 ± 0,4 4,9 ± 0,1 62 ± 3 61 ± 5 K1 , M (3,0 ± 0,3) × 10 (1,1 ± 0,1) × 10 (3,6 ± 0,6) × 10 (1,3 ± 0,1) × 106 k2, с-1 6,7 ± 0,3 5,0 ± 0,2 4,8 ± 0,3 2,3 ± 0,1 2,3 ± 0,1 3,7 ± 0,1 0,68 ± 0,01 0,35 ± 0,01 2,9 ± 0,2 1,4 ± 0,1 7,1 ± 0,5 6,6 ± 0,5 -1 k-2, с K2 -1 kirr, с 5 6 5 0,0058 ± 0,0004 0,0049 ± 0,0003 0,0050 ± 0,0004 ND -6 -6 -6 Kd , M (1,2 ± 0,1) × 10 (3,3 ± 0,3) × 10 (2,7 ± 0,2) × 10 ND Ka, M-1 ** (6,8 ± 1,4) × 105 (1,5 ± 0,2) × 106 (2,5 ± 0,6) × 106 (8,3 ± 1,3) × 106 * Указанная в таблице погрешность определения констант соответствует стандартному отклонению теоретической кривой от экспериментальной. ** Равновесную константу ассоциации Ka определяли как произведение K1×K2, K i k i . k i Значения констант скорости прямой реакции первой стадии механизма (см. Схему 10), которая характеризует связывание мутанта N212D с АР- и F-субстратом, отличаются приблизительно на порядок, если сравнивать результаты регистрации флуоресценции Trp и 2-aPu. Однако величина равновесной константы образования комплекса ES (K1), определяемой отношением k1/k-1, совпадает для обоих типов флуорофоров. Значения константы K1 указывают на то, что стабильность комплекса ES для F-аналога на порядок выше, чем для природного АР-сайта, что согласуется с данными, полученными для WT АРЕ1. Последующая изомеризация комплекса ES на второй стадии механизма 111 описывается константой равновесия K2, значения которой, измеряемые по флуоресценции 2-aPu, в 2,5−6 раз превышают соответствующие значения, определяемые по флуоресценции Trp. Несмотря на указанное различие, степень образования комплекса ES' для, которую для разных флуорофоров можно приблизительно оценить как K1 × K2 × C /(1 + K1 × C + K1 × K2 × C) (где С – начальная концентрация фермента либо субстрата), изменяется в интервале 20−30 %. Поэтому полученные величины констант равновесия можно считать достоверными. Значение константы скорости третьей необратимой стадии для АР-субстрата составляет 0,0058 ± 0,0004 с-1, что в 550 раз ниже значения kirr для WT АРЕ1. Разрыв фосфодиэфирной связи F-субстрата происходит со сравнимой скоростью (kirrF = 0,0049 ± 0,0003 с-1). Значения равновесной константы Kd,Trp, характеризующей распад комплекса ЕР, отличаются в 2,5 раза для АР- (1,2 мкМ) и F-субстрата (3,3 мкМ), что хорошо согласуется со значениями Kd,Trp для WT АРЕ1. Таким образом, данные по конформационной динамике белков указывают на то, что замена Asn-212 на аспартат не влияет на удерживание продуктов реакции в активном центре АРЕ1, но драматически снижает скорость разрыва поврежденной цепи ДНК. 3.3.3. Регистрация кинетики разрезания F(2-aPu)-субстрата белком N212D АРЕ1 методом стационарной флуориметрии Как уже упоминалось выше, при взаимодействии N212D АРЕ1 с F(2-aPu)субстратом, на кинетических кривых полученных методом «остановленной струи», отсутствовала фаза выхода интенсивности флуоресценции 2-aPu на плато, соответствующая окончанию каталитического цикла (Рис. 36Г, разд. 3.3.1). Такая форма флуоресцентных кривых не позволяет определить значения констант kirr и Kd Схемы 10 методом нелинейной регрессии. Для того, чтобы зарегистрировать окончание ферментативного процесса по флуоресценции 2-aPu, белок и субстрат вручную Рис. 38. Изменение интенсивности флуоресценции 2-aPu в процессе взаимодействия N212D АРЕ1 с F(2-aPu)-субстратом, измеренное с помощью стационарной флуориметрии. Концентрация белка 112 2aPu в кювете составляла 1,5 мкМ. Значения констант kinc и количественной обработки полученных кривых по Схеме 11. K d2aPu определяли путем смешивали в кювете, а затем регистрировали интенсивность флуоресценции с помощью стандартного флуориметра в интервале времени 0,5–800 мин, что предполагает достижение системой стационарного состояния (см. разд. 2.13 Материалов и методов). Как следует из зависимостей, представленных на Рис. 38, экспоненциальный рост флуоресцентного сигнала, который сопровождает образование продуктов реакции и переход флуорофора в гидрофильную среду раствора, продолжался до ~250 мин. Полученные гиперболические зависимости обрабатывали по упрощенной Схеме 11, поскольку используемый подход не дает информации о стадиях предкаталитической изомеризации фермент-субстратного комплекса. Полученное значение константы 2aPu скорости kinc = (4,0 ± 0,3)×10-4 с-1 для F(2-aPu)-субстрата было на порядок ниже константы скорости необратимой стадии kirr для F-субстрата (0,0049 с-1), установленной в предстационарных условиях. Для выяснения причины такого различия был проведен анализ скорости превращения F(2-aPu)-субстрата мутантом N212D методом гельэлектрофореза (см. разд. 3.3.4). В то же время константа диссоциации комплекса ЕР, K d2aPu , составляет (7,1 ± 0,6)×10-6 M, что хорошо согласуется со значением Kdtitr (6,3 мкМ), определенной с помощью флуоресцентного титрования мутантного белка F(2aPu)-продуктом (Рис. 38). Таким образом, данные стационарной флуориметрии подтверждают результаты, полученные методом «остановленной струи», и указывают на снижение прочности комплекса N212D с продуктами превращения F-содержащих субстратов. Схема 11 3.3.4. Анализ накопления продуктов разрезания [32Р]-меченых АР- и F-субстратов мутантной формой N212D АРЕ1 методом гель-электрофореза Начальную скорость скорости гидролиза фосфодиэфирной связи специфических субстратов рассчитывали из кинетических кривых, полученных путем разделения радиоактивно меченых ДНК-субстратов в денатурирующем ПААГ. Как следует из зависимости степени накопления продуктов реакции от времени (Рис. 39), превращение АР-содержащих субстратов мутантом N212D АРЕ1 происходит значительно быстрее, чем субстратов, содержащих F-аналог АР-сайта. Оценочные значения констант скорости разрыва цепи АР- и F-субстрата, рассчитанные по уравнению (1) (см. разд. 2.8), отличаются друг от друга почти в 10 раз (Таблица 8). Эти результаты подтверждают 113 Рис. 39. Анализ накопления продуктов разрезания [32Р]-меченых АР- и F-субстратов мутантной формой N212D АРЕ1 методом гель-электрофореза. Зависимость степени накопления продуктов разрезания AP- (▼), F- (●), AP(2-aPu)- ( ) и F(2-aPu)-субстратов (○) белком N212D АРЕ1 от времени. Реакции проводили в буфере BER (см. разд. 2.8) при 25ºС. Концентрация фермента и ДНК в реакционной смеси составляла 1,5 мкМ. Гладкие кривые получены на основании теоретической подгонки экспериментальных данных с помощью уравнения (1). Погрешность экспериментальных точек определяли как стандартное отклонение в трех независимых экспериментах. Таблица 8. Константы скорости каталитической стадии процесса превращения специфических субстратов мутантной формой N212D APE1, определяемые по результатам разделения [32Р]меченых продуктов реакции в денатурирующем ПААГ (Рис. 39).* k PAGE inc -1 ,с Субстрат AP F AP(2-aPu) F(2-aPu) N212D APE1 0,0028 3,0 × 10-4 0,0024 1,8 × 10-4 PAGE * Погрешность оценки значений kinc не превышала 25%. данные предстационарной кинетики, свидетельствующие о снижении скорости катализа при использовании в качестве субстрата циклического F-аналога. В то же время значения PAGE kinc для АР(2-aPu)-субстрата и АР-субстрата без флуоресцентной метки практически совпадают. Это означает, что встраивание 2-aPu с 3'-стороны от АР-сайта не препятствует протеканию процесса. Для сравнения проводили сравнение кинетических кривых, полученных по изменению интенсивности флуоресценции в N212D АРЕ1 и ДНКсубстратах и методом гель-электрофореза при разделении продуктов разрезания АР- и АР(2-aPu)-субстратов. Такое сопоставление (Рис. 36А, В, разд. 3.3.1) наглядно показывает, что фазы возрастания интенсивности флуоресценции остатков Trp и 2-aPu соответствуют накоплению продуктов превращения радиоактивно меченых субстратов. 114 3.3.5. Кинетический механизм взаимодействия мутантной формы N212A АРЕ1 со специфическими субстратами: предстационарная кинетика, стационарная флуориметрия, гель-электрофорез и количественный анализ Для более глубокого понимания роли Asn-212 в функционировании активного центра АРЕ1 изучали активность мутантной формы N212A АРЕ1 (далее «мутант N212A»), у которой в положении 212 не было полярного бокового радикала. Методом «остановленной струи» в сочетании с регистрацией флуоресценции остатков Trp фермента либо 2-aPu субстрата были получены серии кинетических кривых в интервале концентраций белка либо ДНК 0,5−4,0 мкМ. В ходе взаимодействия N212A АРЕ1 с АР- и F-субстратами на начальном участке кривых (0,001−0,2 с) наблюдалась фаза снижения интенсивности флуоресценции Trp (Рис. 40А, Б), которая, по-видимому, соответствовала стадиям связывания и специфической изомеризации фермент- субстратных комплексов. Следует отметить, что аналогичный конформационный переход в случае N212D АРЕ1 занимал намного больше времени (0,001−1 с). Следующий конформационный переход в молекуле белка происходил в промежутке между 150 и 1500 с и выражался в небольшом росте флуоресцентного сигнала. После 1500 с интенсивность флуоресценции более не Рис. 40. Взаимодействие мутантной формы N212А АРЕ1 с АР- и F-субстратами. (А, Б) Конформационные переходы в молекуле белка регистрировали по изменению интенсивности 115 флуоресценции остатков Trp. Концентрацию субстратов варьировали от 0,5 до 3,0 мкМ. (В, Г) Конформационные переходы в молекулах ДНК-субстратов, регистрируемые по изменению интенсивности флуоресценции остатков 2-аминопурина. Концентрацию белка варьировали от 0,5 до 3,0 мкМ. Гладкие линии черного цвета представляют результат количественной обработки экспериментальных данных. изменялась. Указанная фаза небольшого роста интенсивности флуоресценции Trp согласуется по времени с фазой возрастания флуоресцентного сигнала на кинетических кривых для мутанта N212D (Рис. 40А, В), которая соответствует стадии разрыва фосфодиэфирной связи субстрата. Однако, в случае замены Asn-212 на аланин, из-за малой амплитуды нельзя с уверенностью утверждать, что рост интенсивности флуоресценции белка в интервале 150−1500 с также соответствует накоплению продукта реакции. Количественная обработка данных показала, что минимальное число стадий механизма, адекватно описывающих кинетические кривые, равно четырем, что соответствует Схеме 10 (разд. 3.3.2), реализуемой также и для N212D АРЕ1. Результаты оптимизации значений кинетических параметров для мутанта N212A суммированы в Таблице 9. Значения констант скорости прямых реакций k1 и k2, характеризующих связывание АР- и F-субстратов в активном центре мутанта N212A достоверно превышают соответствующие значения для N212D АРЕ1. Как следует из величины константы скорости k2, связывание F-субстрата с мутантом N212A происходит в три раза быстрее, чем с N212D АРЕ1. Таблица 9. Кинетические параметры эндонуклеазной активности N212А АРЕ1 в отношении АР- и F-субстратов, определяемые по флуоресценции Trp фермента и 2-aPu, встроенного в ДНКсубстрат. Константы скорости соответствуют отдельным стадиям Схемы 10.* N212A АРЕ1 k1, M-1 с-1 k-1, с-1 -1 Флуоресценция Trp Флуоресценция 2-aPu AP F AP(2-aPu) F(2-aPu) (3,2 ± 0,1) × 107 (7,4 ± 1,0) × 107 (2,1 ± 0,1) × 107 (3,1 ± 0,2) × 107 35 ± 1 28 ± 2 15 ± 0,5 26 ± 0,1 K1 , M (9,1 ± 0,5) × 10 (2,6 ± 0,5) × 10 (1,4 ± 0,1) × 10 (1,2 ± 0,1) × 106 k2, с-1 13,0 ± 0,7 18 ± 1 7,8 ± 0,4 6,6 ± 0,3 4,6 ± 0,2 9,7 ± 0,3 0,78 ± 0,04 6,1 ± 0,2 2,8 ± 0,3 1,9 ± 0,2 -1 k-2, с K2 -1 kirr, с 5 0,0023 ± 0,0001 -6 6 6 10 ± 1,0 1,1± 0,1 -4 ND ND -6 (4,5 ± 0,2) × 10 Kd , M (3,6 ± 0,4) × 10 (0,7 ± 0,1) × 10 ND ND Ka, M-1 ** (2,5 ± 0,4) × 106 (4,9 ± 1,4) × 106 (1,5 ± 0,2) × 107 (1,3 ± 0,2) × 106 * Указанная в таблице погрешность определения констант соответствует стандартному отклонению теоретической кривой от экспериментальной. ** Равновесную константу ассоциации Ka определяли как произведение K1×K2, K i ki . k i 116 Соответственно и значения равновесных констант, характеризующих сродство N212A АРЕ1 к специфическим субстратам и равных KaN212A/AP = (2,5 ± 0,3)×106 М-1 и KaN212A/F = (4,9 ± 0,4)×106 М-1, в среднем в три раза выше, чем для N212D АРЕ1. Конформационный переход, соответствующий третьей фазе на кинетических кривых (Рис. 40А, Б), вероятно относится к третьей необратимой стадии в Схеме 10 (разд. 3.3.2). Полученные значения константы скорости данной стадии, kirr, для АР- и F-субстрата составляют 0,0023 и 4,5×104 с-1, что в 2,5−10 раз ниже констант скорости разрыва цепи мутантом N212D АРЕ1. Для более точного выяснения природы конформационного перехода, описываемого константой k3, взаимодействие N212A АРЕ1 с АР-субстратом было исследовано методом гель-электрофореза (Рис. 41). Установлено, что в течение 33 мин инкубации ДНКсубстратов с мутантом N212A (что соответствует временной шкале регистрации кинетических кривых методом «остановленной струи») превращается только 20% АРсубстрата и 10% F-субстрата с константами PAGE kinc 4,4×10-5 с-1 и 2,3×10-5 с-1, соответственно (Таблица 10). Таким образом, фаза небольшого возрастания интенсивности флуоресценции Trp на кривых, полученных в предстационарных условиях (Рис. 40А, Б), на самом деле Рис. 41. Анализ накопления продуктов разрезания [32Р]-меченых АР- и F-субстратов мутантной формой N212D АРЕ1 методом гель-электрофореза. Зависимость степени накопления продуктов разрезания AP- (▼), F- (●), AP(2-aPu)- ( ) и F(2-aPu)-субстратов (○) белком N212A АРЕ1 от времени по данным гель-электрофореза в денатурирующем ПААГ. Реакции проводили в буфере BER (см. разд. 2.8) при 25ºС. Концентрация фермента и ДНК в реакционной смеси составляла 1,5 мкМ. Гладкие кривые соответствуют теоретической подгонке экспериментальных данных. Погрешность экспериментальных точек определяли как стандартное отклонение в трех независимых экспериментах. Таблица 10. Константы скорости каталитической стадии превращения специфических субстратов мутантной формой N212А APE1, определяемые по результатам разделения [32Р]-меченых продуктов реакции в денатурирующем ПААГ (Рис. 41). k PAGE inc -1 ,с Субстрат AP F N212A APE1 4,4 × 10-5 2,3 × 10-5 117 AP(2-aPu) F(2-aPu) 4,1 × 10-5 1,4 × 10-5 PAGE * Погрешность оценки значений kinc не превышала 25%. отражает только начало процесса образования продукта. А реальная скорость превращения АР- и F-субстратов мутантом N212A APE1 снижена в 68000 раз по сравнению с ферментом дикого типа. Если сравнивать между собой данные по конформационной динамике обоих мутантных форм АРЕ1, то можно заключить, что переход от N212D к N212A еще сильнее снижает скорость каталитической стадии, но ускоряет специфическое связывание субстрата. Что касается конформационной динамики ДНК-субстратов, сопровождающей их взаимодействие с мутантом N212A АРЕ1, то соответствующие зависимости 2-aPu флуоресценции от времени имели сложный многостадийный характер (Рис. 40В, Г). Связывание АР(2-aPu)-субстрата сопровождалось слабым ростом интенсивности флуоресценции в интервале 1−10 мс и ярко выраженным тушением сигнала в промежутке времени от 10 мс до 1 с. Начиная со 150 с на кинетических кривых начинался рост флуоресценции 2-aPu большой амплитуды, который продолжался до окончания регистрации зависимостей (4000 с). Дальнейшую регистрацию флуоресценции 2-aPu не проводили, поскольку на таких больших временах реакцию уже нельзя считать однооборотной. Кинетические кривые, представленные на Рис. 40В, не поддавались адекватной количественной обработке по Схеме 10 (разд. 3.3.2). Для определения количественных параметров стадий, описывающих связывание N212A АРЕ1 с АР(2-aPu)субстратом, полученные зависимости были ограничены 7 с и обработаны по укороченной Схеме 12. Схема 12 Значения констант скорости прямых и обратных реакций, характеризующих конформационную динамику АР(2-aPu)-субстрата, согласуются с соответствующими значениями, установленными по конформационной динамике белка (см. колонки 1 и 3 Таблицы 9). По флуоресценции 2-aPu, также как и по флуоресценции Trp, наблюдалось быстрое и эффективное связывание субстратов мутантом N212A. Для наблюдения стадий превращения комплекса ES' в комплекс фермент-продукт и последующего распада комплекса ЕР фермент смешивали с АР(2-aPu)-субстратом и регистрировали флуоресцентный сигнал остатков 2-aPu в течение 1000 мин методом стационарной флуориметрии. В результате была получена серия кинетических кривых для 118 концентраций N212A АРЕ1 от 0,5 до 3,0 мкМ (Рис. 42). Экспоненциальные зависимости были обработаны по упрощенной Схеме 11 (см. разд. 3.3.3), что позволило определить Рис. 42. Изменение интенсивности флуоресценции 2-aPu при взаимодействии N212A АРЕ1 с АР(2-aPu)-субстратом, измеренное с помощью стационарной флуориметрии. Концентрация белка 2aPu в кювете составляла 1,5 мкМ. Значения констант kinc и K d2aPu определяли путем количественной обработки полученных кривых по Схеме 11. 2aPu константу скорости разрыва фосфодиэфирной связи субстрата kinc = (4,9 ± 0,2)×10-5 с-1. Полученное значение хорошо согласуется со скоростью катализа, определяемой методом PAGE гель-электрофореза kinc = 4,1×10-5 с-1 (Рис. 41, Таблица 10). Кроме того, результаты стационарной флуориметрии говорят о существовании более или менее стабильного комплекса N212A АРЕ1 с продуктами реакции, которое выражается константой диссоциации K d2aPu = (1,2 ± 0,1)×10-6 М. Кинетические кривые, описывающие взаимодействие N212A АРЕ1 с F(2-aPu)субстратом, имели не совсем обычный вид (Рис. 40Г). На начальном участке кривых (1−50 мс) не было зарегистрировано возрастания интенсивности флуоресценции 2-aPu, характерного для всех 2-aPu-содержащих субстратов. Связывание фермента с F(2-aPu)субстратом, напротив, сопровождалось продолжительным многоступенчатым падением интенсивности флуоресценции. Качественная оценка полученных зависимостей указывает на наличие как минимум трех перегибов, соответствующих отдельным стадиям изомеризации фермент-субстратного комплекса. Однако амплитуда конформационных переходов в отдельных случаях была слишком малой для их адекватного количественного анализа. Результатом обработки флуоресцентных зависимостей в интервале времени 0,001−10 с стал кинетический механизм, включающий две обратимые стадии связывания (Схема 12). Соответствующие значения констант скорости прямых и обратных реакций хорошо согласуются с величинами, установленными по флуоресценции остатков Trp фермента (колонки 3 и 4 Таблицы 9, разд. 3.3.5). Попытка измерить скорость образования 119 продуктов реакции по флуоресценции 2-aPu в стационарных условиях не дала результатов, поскольку флуоресцентные кривые имели недостаточно выраженную зависимость от концентрации N212A АРЕ1, чтобы определить константу скорости с достаточной точностью. Для того, чтобы оценить скорость разрыва фосфодиэфирной связи F(2-aPu)-субстрата анализировали накопление радиоактивно меченых продуктов PAGE реакции гель-электрофорезом. Было установлено значение константы скорости kinc = 1,4×10-5 с-1, из которого следует, что скорость превращения F(2-aPu)-субстрата мутантом N212A АРЕ1 на порядок ниже, чем ферментом N212D АРЕ1, и пренебрежимо мала по сравнению с WT АРЕ1. 3.4. Исследование влияния тройной мутации Y171F-P173L-N174K на взаимодействие АРЕ1 с ДНК Данные, имеющиеся в литературе указывают на то, что боковой радикал Tyr-171 участвует в координации 5'-фосфатной группы АР-сайта и играет важную роль в реализации всего ферментативного процесса [198, 216]. Мутации Tyr-171 снижают скорость и эффективность превращения ДНК-субстратов [190]. Для регистрации стадий связывания АРЕ1 с субстратами отдельно от стадии образования продуктов реакции в последовательность аминокислот активного центра были введены три замены Y171F, P173L и N174K. Кинетику взаимодействия мутантной формы Y171F-P173L-N174K АРЕ1 (далее «тройной мутант») изучали методом «остановленной струи» в условиях, аналогичных условиям применявшимся для фермента дикого типа. Зависимости интенсивности флуоресценции остатков триптофана от времени для различных концентраций ДНК-субстрата представлены на Рис. 43. Форма кинетических кривых для АР- и F-субстратов практически совпадает, за исключением более продолжительного падения Trp флуоресценции на больших временах, наблюдаемого в случае F-аналога. Рис. 43. Изменение интенсивности флуоресценции остатков Trp в процессе взаимодействия Y171F-P173L-N174K АРЕ1 с АР- (А) и F-субстратами (Б). Реакции проводили в буфере BER 120 (см. разд. 2.8) при 25ºС. Концентрация фермента в реакционной смеси составляла 3,0 мкМ. Концентрация ДНК указана справа от каждой кривой. Гладкие линии черного цвета представляют результат количественной обработки экспериментальных данных по Схеме 13. Несмотря на малую амплитуду изменения сигнала на каждой кривой можно различить двухфазное снижение интенсивности флуоресценции в интервалах 100−1000 с для АРсубстрата (100−1500 с для F-субстрата) и 0,001−100 с для субстратов обоих типов. Более длительная регистрация флуоресценции остатков Trp приводит к уменьшению отношения сигнал/шум вследствие выгорания флуоресцентных групп белка. Основное отличие флуоресцентных зависимостей, полученных для «тройного мутанта», от кинетических кривых для WT АРЕ1 заключается в отсутствии фазы роста интенсивности флуоресценции и возвращения ее на начальный уровень в случае мутантного белка. Такое поведение флуоресцентных кривых может, с одной стороны, означать отсутствие детектируемой каталитической активности у мутантного фермента, а с другой, свидетельствовать о существовании прочного комплекса между «тройным мутантом» и продуктом реакции. По результатам количественной обработки данных был предложен механизм взаимодействия «тройного мутанта» со специфическими субстратами, включающий две обратимых стадии: связывание фермента с ДНК-субстратом с образованием неспецифического комплекса (ЕMutS) и его последующая изомеризация в комплекс (ЕMutS)' (Схема 13). Схема 13 В Таблице 11 приведены значения констант скорости, характеризующих отдельные стадии механизма. В среднем, одновременная замена трех аминокислот активного центра АРЕ1 приводит к снижению значений констант скорости прямых и обратных реакций на три порядка, что согласуется со значениями k1 и k-1, полученными ранее для мутантной формы Y171F АРЕ1 [190]. Общее сродство «тройного мутанта» к АР- и F-субстрату определяли как отношение констант скорости образования и распада комплекса (ЕMutS). Полученные значения равновесной константы ассоциации для обоих видов повреждений Таблица 11. Константы скорости и равновесия элементарных стадий процесса, описывающие взаимодействие Y171F-P173L-N174K АРЕ1 с АР- и F-субстратом в соответствии со Схемой 13.* Y171F-P173L-N174K АРЕ1/ AP-субстрат F-субстрат k1, M с (1,8 ± 0,1) 10 3 (5,4 ± 0,2) 103 k-1, с-1 (1,5 ± 0,1) 10-3 (2,1 ± 0,1) 10-3 k2, с-1 (2,2 ± 0,1) 10-4 (1,5 ± 0,1) 10-4 k-2, с-1 (5,4 ± 0,2) 10-3 (1,1 ± 0,1) 10-3 Ka, M-1** (1,2 ± 0,1) 106 (2,6 ± 0,3) 106 -1 -1 121 * Указанная в таблице погрешность определения констант соответствует стандартному отклонению теоретической кривой от экспериментальной. ** Равновесная константа ассоциации определяется выражением Ka= k1/k-1. сравнимы между собой, хотя Ka для F-содержащей ДНК в 2 раза выше, чем для АРсодержащей ДНК. Если сравнивать с WT АРЕ1, то замена трех аминокислот снижает сродство фермента к субстрату не более чем на 2 порядка. Для прямой регистрации продуктов разрезания АР- и F-субстратов «тройным мутантом» АРЕ1 соответствующие реакционные смеси, содержащие [32Р]-меченую ДНК, разделяли гель-электрофорезом. Как следует из полученных радиоавтографов (Рис. 44А), Рис. 44. (А) Радиоавтограф разделения продуктов взаимодействия Y171F-P173L-N174K АРЕ1 с АР- и F-субстратами в денатурирующем ПААГ. Концентрация фермента и ДНК в реакционной смеси составляла 3 мкМ. В случае АР-субстрата в нулевой точке без добавления фермента наблюдалось небольшое затемнение на уровне 6-звенной ДНК, которое соответствует продукту спонтанного гидролиза, характерного для природного АР-сайта. (Б) Зависимость накопления продуктов реакции от времени. Гладкие кривые соответствуют теоретической подгонке экспериментальных данных. Погрешность экспериментальных точек определяли как стандартное отклонение в трех независимых экспериментах. мутантный фермент сохраняет способность гидролизовать специфические субстраты, хотя накопление 6-звенного продукта реакции становится заметным только после 10−15 мин инкубации. Для полного расщепления эквимолярного количества АР-содержащей ДНК такому белку требовалось 100−150 мин, тогда как при использовании F-содержащей ДНК за то же время разрезалось около 70% субстрата (Рис. 44Б). Однако, несмотря на низкую скорость превращения субстратов, через 2,5 часа степень накопления продуктов достигала 90%. Значения константы скорости разрезания АР- и F-субстратов рассчитывали по уравнению (1) (разд. 2.8). В результате проведенной оценки из данных гель-электрофореза PAGE PAGE были получены значения kinc (АР) = 1,0×10-4 с-1 и kinc (F) = 1,6×10-4 с-1. Таким образом, скорость разрыва фосфодиэфирной связи специфических субстратов с участием «тройного мутанта» в 2×104 раз ниже, чем для WT АРЕ1. Сравнивая результаты 122 электрофоретического анализа с данными предстационарной кинетики можно заключить, что деформация активного центра АРЕ1, вызываемая заменой боковых радикалов Tyr-171, Pro-173 и Asn-174, приводит также к изменению локального окружения флуоресцирующих остатков (Trp и Tyr), что, в свою очередь, сказывается на возможности изучать конформационные переходы в молекуле белка. Возможно, что в структуре «тройного мутанта» снижается подвижность ключевого флуоресцирующего остатка Trp280, поэтому регистрируются лишь слабые изменения интенсивности флуоресценции на фоне высокого уровня шума. Для изучения способности «тройного мутанта» связывать продукт ферментативной реакции проводили его флуоресцентное титрование F-продуктом (Таблица 3, разд. 2.3), как описано в разделе 3.1.3. Количественная обработка зависимости, представленной на Рис. 45 в соответствии со схемой Е + Р ЕР, позволила определить константу диссоциации комплекса фермент-продукт Kd titr = (2,8 ± 0,5)×10-6 М. Это значение в 3 раза ниже аналогичной константы для WT АРЕ1. Таким образом, есть мутантный белок сохраняет Рис. 45. Зависимость интенсивности флуоресценции остатков триптофана Y171F-P173L-N174K АРЕ1 от концентрации олигонуклеотидного дуплекса, представляющего собой продукт разрезания F-субстрата. [P] – концентрация ДНК. способность удерживать ДНК-продукт, хотя и менее прочно, по сравнению с WT АРЕ1. 3.5. Стационарная кинетика превращения АР-и F-содержащей ДНК ферментом WT АРЕ1, а также его мутантной формой Y171F-P173L-N174K АРЕ1 Кинетику взаимодействия WT АРЕ1, а также мутантной формы Y171F-P173LN174K, с АР- и F-субстратами дополнительно исследовали в стационарных условиях. Для этого зависимость начальной скорости от концентрации ДНК-субстратов линеаризовали в двойных обратных координатах (Рис. 46) [233]. В результате были определены константы KM и kcat для фермента дикого типа и «тройного мутанта» (Таблица 12). В случае WT АРЕ1 значения константы Михаэлиса для природного АР-сайта и F-аналога отличаются в пределах погрешности эксперимента и составляют 93 и 98 нМ, соответственно. Полученные константы хорошо согласуются с литературными данными, из которых следует, что значения KM могут меняться от 16 нМ при 37ºС до 100−120 нМ при 25ºС [124, 175, 218]. Таким образом, новые результаты подтверждают высокое сродство АРЕ1 к специфическим субстратам, которое снижается в 2,4 раза при переходе от WT АРЕ1 к 123 «тройному мутанту» (KMMut = 220 нМ). По данным стационарной кинетики общая скорость превращенния F-субстрата (kcat = 1 с-1) в 2,8 раза ниже скорости превращения АРсубстрата (2,8 с-1), что хорошо согласуется с разницей в константах необратимой стадии Рис. 46. Зависимость начальной скорости от концентрации АР-и F-субстратов для WT АРЕ1 (А, Б), а также «тройного мутанта» (В), представленная в двойных обратных координатах. Эксперименты проводили в стационарных условиях с 0,5 нМ (А), 1 нМ (Б) либо 15 нМ фермента (В). Реакции проводили в буфере BER (разд. 2.8) при 25ºС. Концентрацию субстратов варьировали от 10 до 2000 нМ (подробнее см. разд. 2.9). Каждая точка представляет собой результат усреднения трех экспериментальных значений. Погрешность определения стационарных кинетических параметров не превышала 25%. процесса kirr, установленной методом «остановленной струи». При этом, по сравнению со значениями kcat, имеющимися в литературе [124, 192, 218], скорость превращения коротких 12-звенных ДНК-субстратов на 50 и 70 % ниже, чем 25- и 49-звенных субстратов, что является дополнительным подтверждением релевантности данных, полученных нами в предстационарных условиях. В условиях, используемых для изучения кинетики Михаэлиса, накопление продуктов взаимодействия «тройного мутанта» с ДНКсубстратами достоверно наблюдали только в случае природного АР-сайта. Таблица 12. Стационарные кинетические параметры, характеризующие взаимодействие WT и Y171F-P173L-N174K APE1 с АР- и F-субстратами. Фермент/Субстрат KM, нM kcat, с-1 kcat/KM,M-1с-1 KMSF, нM* kcatSF, с-1 kcatSF/KMSF,M-1с-1 WT APE1 / AP 93 2,8 3107 55 1,3 2,27107 98 1,0 46 0,6 WT APE1 / F 1107 1,3107 Y171F-P173L220 ND ND ND N174K 1,5310-4 0,63103 APE1 / AP * Значения констант KMSF и kcatSF рассчитывали по теории графов [234] с использованием констант скорости промежуточных стадий, полученных методом «остановленной струи» по уравнениям (12-16) (Таблица 4, разд. 3.1.3 и 2.12). Превращение F-содержащей ДНК «тройным мутантом» протекало неизмеримо медленно. Значение каталитической константы составило 1,5310-4 с-1, что в 5 раз ниже соответствующей константы для мутантной формы АРЕ1, которая содержала единственную замену Y171F [190]. Если сравнить кинетические параметры, полученные в 124 стационарных условиях для «тройного мутанта» и Y171F АРЕ1 [190], то можно предположить, что замены P173L и N174K больше влияют на стадию разрыва фосфодиэфирной связи АР-сайта, чем на связывание белка с субстратом. Для того чтобы сравнить кинетические параметры, полученные в стационарных условиях с константами, полученными в предстационарных условиях методом «остановленной струи», данные, представленные в Таблице 4 (разд. 3.1.3), использовали для оценки значений KMSF и kcatSF по теории графов (см. разд. 2.12) [234]. Полученное значение константы Михаэлиса для АР-субстрта было на 40 % меньше той величины, что была установлена экспериментально (Таблица 12). Тем не менее, закономерности взаимодействия АРЕ1 с различными видами повреждений, наблюдавшиеся в стационарных условиях, сохраняются и в значениях, определенных методом графов. Так, подтверждается двукратное снижение скорости катализа при переходе от природного АРсайта к F-аналогу. Таким образом, проведенная оценка подтверждает достоверность значений кинетических параметров, рассчитанных нами на основании предстационарных кинетических данных. 125 4. Обсуждение полученных результатов Большая часть исследований кинетики удаления АР-сайтов из ДНК под действием АРЕ1 человека в условиях BER была проведена в стационарных условиях [124, 175, 218]. Первая работа [220], ставившая своей целью изучить кинетический механизм АРЕ1 в предстационарных условиях, показала, что взаимодействие фермента с субстратом не может быть адекватно описано простой схемой Бриггса-Холдейна (см. Схему 2 в разд. 1.3.5), поскольку каталитический цикл кроме стадий связывания и превращения поврежденной ДНК содержит также промежуточные стадии, которые могут протекать достаточно медленно и оказывать влияние на скорость всего процесса. Один из главных выводов, сделанных авторами работы [220], заключался в том, что константа скорости разрыва фосфодиэфирной связи АР-сайта белком АРЕ1 (в случае 25-звенной ДНК) может достигать 850 c-1, что не позволяет регистрировать кинетику процесса методом «quenchflow». При этом стационарная константа скорости реакции ограничивается величиной 2−10 с-1, предположительно, из-за наличия дополнительного «медленного» конформационного перехода, который предшествует стадии распада комплекса ферментпродукт [220]. Таким образом, несмотря на большое количество данных, существовала необходимость в исследовании роли конформационной динамики в каталитическом механизме АРЕ1 человека. Поэтому конформационных переходов в в молекуле настоящей фермента работе и для исследования ДНК-субстрата в ходе каталитического цикла был использован метод «остановленной струи» в сочетании с флуориметрической детекцией, который позволяет регистрировать промежуточные стадии процесса, начиная с момента времени ~1,5 мс. Параллельно в нашей лаборатории изучали эндонуклеазную активность АРЕ1 в условиях NIR-репарации [223]. В ходе работы для сравнения были получены данные в условиях BER для 30-звенных Fсодержащих ДНК, которые свидетельствовали о высокой скорости процесса (kr = 68 с-1) и существовании прочного комплекса между ферментом и продуктами реакции (Kp = 4.8×10-7 M). Все это затрудняло регистрацию конформационных переходов, соответствующих стадиям превращения субстрата в продукт и распада комплекса ЕР в миллисекундном диапазоне времени. Поэтому, для решения задач настоящего исследования были выбраны короткие 12-звенные ДНК-субстраты, содержащие в качестве повреждения природный АР-сайт либо его синтетический аналог - тетрагидрофуран. Применение ДНК-субстратов минимальной длины, которые, тем не менее, могут узнаваться и специфически связываться белком АРЕ1 и не допускают скольжения фермента по цепи ДНК в поисках повреждения, позволяет с высокой 126 точностью регистрировать конформационные переходы, ответственные за специфическую изомеризацию фермент-субстратного комплекса. Как было установлено на начальном этапе работы, превращение укороченных ДНК-субстратов протекает медленнее, чем 30звенных, что делает возможной детекцию каждой из промежуточных стадий каталитического цикла в рамках одной кинетической кривой. 4.1. Предстационарная кинетика взаимодействия WT АРЕ1 с АР- и F-сайтом Кинетические кривые, характеризующие изменение интенсивности флуоресценции остатков Trp фермента, убедительно доказывают, что активный центр АРЕ1 претерпевает изменения конформации в ходе взаимодействия с АР- и F-содержащей ДНК. После образования продуктов реакции комплекс ЕР распадается, что выражается в интенсивном росте флуоресцентного сигнала и достижении им начального уровня на конечном участке кинетической кривой (Рис. 26, разд. 3.1.2). Количественная обработка экспериментальных зависимостей показала, что минимальный кинетический механизм процесса удаления природного АР-сайта из ДНК с участием фермента АРЕ1 включает четыре стадии и три отдельных промежуточных комплекса АРЕ1 с ДНК (Схема 7). Изменения конформации, соответствующие одному циклу превращения АР-субстрата, наблюдаются в интервале времени 0,001−3 с, что является оптимальным для регистрации предстационарной кинетики методом «остановленной струи». В случае химически стабильного F-сайта ферментативный процесс требует большего времени (~10 с) и сопровождается бóльшим числом конформационных переходов в молекуле АРЕ1 на стадиях предкаталитической изомеризации фермент-субстратного комплекса. По этой причине кинетическая схема, описывающая превращение F-субстрата, содержит пять промежуточных стадий. Можно с уверенностью утверждать, что зарегистрированные изменения конформации белка характеризуют специфическое взаимодействие АРЕ1 с повреждением, поскольку флуоресцентные кривые для неповрежденного G-лиганда не обнаружили подобных изменений сигнала (Рис. 27, разд. 3.1.2). Значения констант скорости необратимой стадии kirr составили 3,2 и 2,1 с-1 для АР- и F-субстрата, соответственно, что согласуется с высокой скоростью катализа, установленной для ДНК-субстратов большей длины [223, 224]. Как видно, скорость разрыва фосфодиэфирной связи в случае природного АР-сайта в 1,5 раза выше, чем в случае F-аналога. Наблюдаемое различие также подтверждается кинетическими данными, полученными в стационарных условиях и описанными с помощью схемы Михаэлиса-Ментен, из которых следует, что значения kcat для АР- и Fсубстрата отличаются в 2,8 раза (Таблица 12). Вместе с тем, сродство АРЕ1 к поврежденной ДНК, выражаемое константой ассоциации Ка, не снижается, а, наоборот, 127 возрастает в 3 раза при переходе от АР-сайта к F-сайту. Другими словами, скорость и эффективность первичного связывания фермента и субстрата, а также стадии гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи с образованием комплекса ЕР, не меняется при смене типа повреждения. Значения константы равновесия Kd, характеризующей диссоциацию комплекса ЕР, меняются от 0,83 до 5,5 мкМ (Таблица 4, разд. 3.1.3), что в 1,7−3 раза выше значений, установленных ранее в аналогичных условиях для 30-звенных ДНК-субстратов [223]. Наиболее стабильный комплекс образовывался при флуоресцентном титровании АРЕ1 F-содержащим продуктом, тогда как по данным предстационарной кинетики этот комплекс был в 6 раз менее стабильным. Таким образом, использование коротких ДНКсубстратов способствовало быстрому высвобождению продуктов из активного центра фермента, облегчая регистрацию ключевых стадий каталитического цикла. Снижение скорости оборота фермента при взаимодействии АРЕ1 с F-сайтом, вероятнее всего, является результатом появления дополнительного конформационного перехода в молекуле белка, который на кинетических кривых выражается в небольшом росте Trp флуоресценции в интервале 25−100 мс (Рис. 26Б) и описывается третьей обратимой стадией с константами k3(F)= 6,6 с-1 и k-3(F)= 0,15 c-1 (Схема 7). Кинетические кривые, полученные методом «остановленной струи», дают информацию о количестве конформационных переходов в молекуле белка, предшествующих каталитической стадии. Однако они не могут дать исчерпывающей информации о природе каждого из наблюдаемых изменений конформации АРЕ1. Из данных рентгеноструктурного анализа [122, 208] известно, что трансформация первичного комплекса АРЕ1 с поврежденной ДНК в каталитически активный должно сопровождаться определенными событиями, среди которых встраивание специфических петель белка в малую и большую бороздки ДНК, изгибание оси двойной спирали субстрата, выворачивание АР-сайта в гидрофобный карман активного центра. Детальный анализ конформационной динамики АРЕ1 при взаимодействии с поврежденной и неповрежденной ДНК позволил предположить, что дополнительное изменение конформации белка, регистрируемое по флуоресценции остатков Trp для F-субстрата, отражает процесс выворачивания тетрагидрофурана из двойной спирали субстрата и его закрепление в активном центре фермента. Учитывая, что один из консервативных остатков Trp в активном центре АРЕ1 располагается на расстоянии 4 Å от С1' атома рибозы F-сайта, можно ожидать, что изменения в его локальном окружении будут вносить существенный вклад в общий флуоресцентный сигнал белка. В пользу выдвинутого предположения также свидетельствуют данные, полученные с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса (SPR) [246]. Как было показано на модельных олигопептидах, остаток Trp-280 специфически 128 интеркалирует между основаниями АР-содержащей ДНК, занимая свободное пространство, которое образуется в результате апуринизации одного из нуклеотидов. Экспериментальные данные, полученные на данном этапе работы методами «остановленной струи» и электрофореза в полиакриламидном геле, свидетельствуют о том, что в случае F-содержащей ДНК достижение каталитически активного состояния фермент-субстратным комплексом требует дополнительного изменения конформации АРЕ1 [247]. При этом, превращение АР-содержащего субстрата протекает в 1,5 раза быстрее и требует меньшего количества конформационных переходов белка на стадиях, предшествующих катализу. Таким образом, несмотря на широкий спектр аналогов АРсайта, которые могут специфически связываться и удаляться белком АРЕ1, нековалентные взаимодействия между аминокислотами активного центра и лабильной ОН-группой, связанной с С1' атомом природного АР-сайта, вносят существенный вклад в установление конформации, оптимальной для катализа. Если обратиться к данным о кристаллических структурах АРЕ1 в комплексе с субстратом либо продуктом реакции [122, 184], то вероятными участниками таких контактов со стороны фермента могли бы быть Phe-266, Trp-280 и Leu-282, которые, предположительно, участвуют в стабилизации АР-сайта во внеспиральном положении, а также атом О карбонильной группы основной цепи Ala-230, который располагается на расстоянии водородной связи с гидроксильной группой αэпимера природного АР-сайта. Однако данная идея является гипотетической, поскольку все имеющиеся к настоящему времени структуры АРЕ1 с ДНК содержат в качестве повреждения F-аналог АР-сайта, лишенный ОН-группы в положении С1'. 4.2. Конформационная динамика АР- и F-содержащих ДНК-субстратов в ходе их превращения белком АРЕ1 Динамическое изменение конформации АРЕ1, наблюдаемое по флуоресценции остатков Trp, позволило количественно описать новые промежуточные стадии каталитического цикла. Однако для установления взаимосвязи между обнаруженными конформационными переходами и конкретными физическими процессами, происходящими внутри фермент-субстратного комплекса, необходимо также получить информацию о конформационной динамике другого участника процесса - поврежденной ДНК. Поэтому в настоящей работе изучали конформационную подвижность ДНКсубстратов в ходе их превращения под действием АРЕ1. Для каждого из модельных 12звенных субстратов, содержащих флуоресцентную метку 2-aPu с 5'- либо 3'-стороны от повреждения, были зарегистрированы серии кинетических кривых в условиях одного оборота фермента. Полученные данные свидетельствуют о том, что молекула ДНК129 субстрата при взаимодействии с WT АРЕ1 претерпевает несколько заметных изменений конформации в интервале времени от 1 мс до 100 с, в зависимости от типа повреждения и положения флуорофора (Рис. 30, 31, разд. 3.2.1). Количественная обработка экспериментальных кривых показала, что конформационные переходы в молекуле АРсодержащей ДНК описываются трехстадийной кинетической схемой, а замена природного АР-сайта на F-аналог добавляет четвертую стадию к механизму реакции (Схема 8, разд. 3.2.2). Установлено, что дополнительная стадия на кривых в случае F-содержащих субстратов описывает изомеризацию фермент-субстратного комплекса на пути к каталитически активному комплексу. Изменения флуоресцентного сигнала 2-aPu во времени хорошо согласуются с общими представлениями о превращении поврежденной ДНК, катализируемого эндонуклеазой АРЕ1. В частности, тушение флуоресценции на начальном участке кривых соответствует погружению поврежденной цепи субстрата в гидрофобный карман активного центра, а интенсивный рост сигнала на больших временах относится к стадии распада комплекса фермент-продукт и перемещению 2-aPu в гидрофильное окружение раствора. Подтверждением вышесказанного являются результаты экспериментов по разделению в денатурирующем ПААГ [32Р]-меченых продуктов реакции. Если сравнить данные радиоавтографов (Рис. 33, разд. 3.2.3) с флуоресцентными кривыми, то становится ясно, что время полупревращения каждого из ДНК-субстратов соответствует фазе роста 2-aPu флуоресценции на предстационарных кинетических кривых и необратимой стадии трансформации комплекса ES' в комплекс ЕР (kirr2-aPu) в Схеме 8 (разд. 3.2.2). Для наглядности подобное сопоставление для превращения (2-aPu)F-субстрата представлено на Рис. 47. Рис. 47. Сравнение кинетики гидролиза (2-aPu)F-субстрата белком АРЕ1, полученной методом «остановленной струи» по флуоресценции остатков Trp фермента и 2-aPu субстрата с накоплением [32Р]-меченых продуктов в денатурирующем ПААГ. Представленные кривые соответствуют концентрации АРЕ1 и ДНК 1,5×10-6 М. Значения констант скорости элементарных стадий механизма, соответствующего конформационной динамике ДНК, в целом согласуются с кинетическими параметрами, полученными по флуоресценции белка (Таблицы 5 (разд. 3.2.2) и 6 (разд. 3.2.5)). При этом между субстратами с различным положением флуоресцентной метки 2-aPu и разными 130 типами повреждения имеются существенные отличия в значениях константы kirr2-aPu. Наибольшее значение константы скорости стадии разрыва 5'-фосфодиэфирной связи АРсайта было зарегистрировано для АР(2-aPu)-субстрата (7,1 с-1). Медленнее всего происходило стабильный превращение аналог (2-aPu)F-субстрата АР-сайта. В (0,08 с-1), соответствии с содержащего кинетическими химически параметрами, установленными в предстационарных условиях, скорость превращения специфических субстратов белком АРЕ1 изменяется в следующем ряду: АР(2-aPu) > F(2-aPu) > (2-aPu)АР > (2-aPu)F. Обнаруженная зависимость указывает на наличие двух независимых факторов, которые влияют на скорость превращения модельных субстратов. Во-первых, использование синтетического F-аналога вместо природного АР-сайта приводит к 6-кратному снижению константы скорости лимитирующей стадии. Аналогичное влияние природы повреждения на скорость реакции наблюдалось в ходе регистрации остатков Trp фермента. Вторым фактором является положение флуоресцентной метки, поскольку встраивание 2-aPu с 5'стороны повреждения в 14−18 раз снижает скорость катализа, по сравнению с расположением его с 3'-стороны от АР-сайта. Такой эффект может возникать вследствие стерических затруднений, которые препятствуют быстрому образованию каталитически активного комплекса в случае субстратов с 5'-2-aPu. Для адекватного сравнения конформационных переходов фермент-субстратного комплекса, регистрируемых по флуоресценции белка и ДНК, для каждого из 2-aPuсодержащих субстратов методом «остановленной струи» была зарегистрирована предстационарная кинетика по флуоресценции остатков Trp белка. Применение специального светофильтра позволило избежать наложения флуоресценции от разных меток. Таким образом, один и тот же каталитический процесс удалось изучить по конформационной динамике АРЕ1 и ДНК. Полученные зависимости имеют форму, характерную для специфических взаимодействий между АРЕ1 и АР-сайтом (Рис. 34, 35 в разд. 3.2.4). Для каждого из 2-aPu-содержащих субстратов кинетическая схема включает 4 стадии, за исключением АР(2-aPu)-субстрата, превращение которого описывается 3стадийной схемой (Схема 8, разд. 3.2.2). Также как и при регистрации флуоресценции остатков 2-aPu субстрата, скорость осуществления отдельных стадий процесса, наблюдаемая по флуоресценции белка, зависит от природы повреждения и положения 2aPu. В частности, наиболее быстрое и эффективное связывание наблюдается для АР(2aPu)-субстрата с константой ассоциации (3,8 ± 0,2)×106 М-1. Связывание трех других субстратов в активном центре АРЕ1 сопровождалось быстрым снижением интенсивности Trp флуоресценции, за которым следовала фаза небольшого роста, наиболее заметная для 131 субстратов, содержащих 2-aPu-метку с 5'-стороны от повреждения. Следует отметить, что именно субстраты с 5'-2-aPu характеризуются самой низкой стабильностью ферментсубстратных комплексов со значением KaTrp около 1,5×106 М-1. После достижения минимального значения интенсивности флуоресценции на кривых начинается интенсивный и протяженный рост сигнала, который соответствует необратимому разрыву 5'-фосфодиэфирной связи АР-сайта с образованием комплекса ЕР. Константы скорости соответствующей стадии механизма kirrTrp меняются от 5,7 с-1 для АР(2-aPu)-субстрата до 0,08 с-1 для (2-aPu)F-субстрата. Важно, что зависимость скорости катализа от природы повреждения и положения флуорофора для каждого из субстратов, наблюдаемая по конформационной динамике белка, полностью совпадает с зависимостью, установленной по конформационной динамике ДНК-субстратов. 4.3. Зависимость от положения флуоресцентной метки скорости превращения 2-aPuсодержащих ДНК-субстратов белком АРЕ1 Как следует из данных предстационарной кинетики для обоих флуорофоров, скорость катализа заметно снижается при встраивании остатка 2-aPu с 5'-стороны от АРлибо F-сайта. В то же время расположение 2-aPu в последовательности субстрата с 3'стороны от повреждения не влияет, а в отдельных случаях даже увеличивает скорость катализа. Для выяснения возможных причин обнаруженной закономерности следует обратиться к результатам компьютерного моделирования пространственных структур 12звенных поврежденных дуплексов ДНК с 2-аминопурином и без него. Моделирование методом молекулярной динамики было проведено сотрудником ИХБФМ СО РАН д.ф.м.н. Воробьевым Ю.Н. [248]. Как следует из анализа полученных структур двойная спираль ДНК-субстратов, содержащих остаток 2-aPu с 3'-стороны от АР-сайта, в целом, сохраняет В-форму (Рис. 48А, В). Модельная структура АР(2-aPu)-субстрата имеет меньший изгиб оси спирали в области повреждения и меньшие значения rmsd4, по сравнению с субстратом без 2-aPu. При этом отдельные нуклеотиды АР(2-aPu)-субстрата демонстрируют необычно высокую подвижность, как следует из данных по термической флуктуации (rmsf5) ближайших к АР-сайту нуклеотидов. На основании этих данных можно предположить, что структура АР(2-aPu)-субстрата очень подвижна и может легко деформироваться под действием так называемых «петель специфичности» молекулы АРЕ1 [122], а значит быстро образовывать каталитически активный комплекс. В согласии 4 rmsd – среднеквадратичное отклонение. В молекулярной динамике характеризует отклонение модельной структуры от В-формы ДНК. 5 rmsf - среднеквадратичное отклонение, характеризующее степень внутренней подвижности гетероциклических оснований ДНК, их деформируемость. 132 Рис. 48. Усредненные пространственные структуры АР(2-aPu)- (А), (2-aPu)АР- (Б), F(2-aPu)(В) и (2-aPu)F-субстрата (Г). Желтым цветом показана ось спирали ДНК. Для каждого из дуплексов стрелками отмечено положение АР-, F-сайта, 2-aPu и цитозина (С19), стоящего напротив повреждения в комплементарной цепи. Неканонические водородные связи показаны пунктирными линиями. Числа соответствуют длине связей в ангстремах. Данные опубликованы в работе [248]. с данным предположением превращение АР(2-aPu)-субстрата характеризуется высокой константой скорости каталитической стадии, значение которой вдвое превышает kirr для АР-субстрата без 2-aPu (Таблица 4 в разд. 3.1.3, Таблица 5 в разд. 3.2.4). 133 По данным моделирования [248] угол наклона оси спирали и значения rmsd практически не отличаются для F(2-aPu)- и F-субстрата. Однако подвижность остова и оснований F(2-aPu)-субстрата снижена, по сравнению с F- и АР(2-aPu)-субстратом. По данным, полученным методом «остановленной струи», скорость катализа в случае F(2aPu)-субстрата снижена в 4,5 раза по сравнению с АР(2-aPu)-субстратом (Таблица 5, разд. 3.2.2). Вероятно, встраивание 2-aPu с 3'-стороны от F-сайта затрудняет проникновение «специфических петель» АРЕ1 со стороны малой и большой бороздки ДНК в области 3'фосфатной группы АР-сайта в процессе формирования каталитически активного комплекса. В случае если остаток 2-aPu располагается с 5'-стороны от повреждения, моделирование указывает на необычно большой изгиб (~60º) оси спирали в точке повреждения, который сопровождается сильным искажением структуры ДНК (Рис. 48Б, Д). Такой изгиб в сторону большой бороздки ДНК приводит к сужению полости, существующей между АР-сайтом и основанием С19 комплементарной цепи. Более того, в случае (2-aPu)F-субстрата чрезмерное сжатие области повреждения приводит к выворачиванию С19 из двойной спирали. С другой стороны, данные по термическим флуктуациям свидетельствуют о заметной жесткости структур с 5'-2-aPu, особенно (2aPu)АР-субстрата. По данным предстационарной кинетики, полученным в настоящей работе, константа скорости разрыва поврежденной цепи kirr(2-aPu)АР в 6,4 ниже соответствующей константы для АР-субстрата. В случае (2-aPu)F-субстрата значение kirr снижается более чем в 40 раз. Таким образом, встраивание флуоресцентного аналога аденина с 5'-стороны от АР-сайта затрудняет достижение фермент-субстратным комплексом каталитически активной конформации и снижает скорость образования продуктов. С другой стороны, указанное расположение 2-aPu метки в последовательности АР- и F-субстрата практически не влияет на скорость и эффективность образования первичного комплекса ES, но замедляет его последующую изомеризацию в каталитически активный комплекс ES'. Используя только флуоресцентные кинетические кривые, полученные методом «остановленной струи», невозможно достоверно отделить стадию разрезания фосфодиэфирной связи субстрата от стадии распада комплекса АРЕ1−продукт. Поэтому нельзя было исключать возможность снижения скорости катализа субстратов с 5'-2-aPu вследствие высокой прочности комплекса ЕР, распад которого мог стать лимитирующей стадией процесса. Для проверки данной гипотезы было проведено флуоресцентное титрование АРЕ1 продуктами разрезания F-субстрата, содержащего 2-aPu с 5'- либо с 3'стороны от повреждения. Полученные значения Kdtitr для обоих типов продуктов были 134 близки в пределах ошибки измерения (~3,5 × 10-6 М) и соответствовали 3,5-кратному снижению стабильности комплекса ЕР, по сравнению с продуктом без 2-aPu (Kdtitr = 1,0 × 10-6 М). Таким образом, данные флуоресцентного титрования не подтвердили существования прочного комплекса между АРЕ1 и 2-aPu-содержащими продуктами реакции. В работе [124] имеются сведения о том, что встраивание мисматчей с 5'-стороны от F-сайта приводит к 4-кратному снижению скорости превращения 18-звенных субстратов. Используемый в настоящей работе в качестве флуоресцентной метки 2-аминопурин представляет собой структурный изомер аденина, который способен образовывать неканонические пары с другими гетероциклическими основаниями [242, 249]. С применением ядерного магнитного резонанса было показано, что при размещении в дуплексе ДНК остатка 2-aPu напротив цитозина между этими основаниями образуются две водородные связи (Рис. 49). Геометрию подобных вторичной неканонических структуры пар, РНК, характерную принято для называть «качающейся» (wobble geometry) [250]. Поэтому, можно Рис. 49. Предполагаемая структура неканонической пары 2-aPu:C [249]. считать, что пара 2-aPu:С, встраиваемая в последовательность субстрата с 5'- либо 3'стороны от повреждения, является аналогом мисматча. Кинетические характеристики взаимодействия АРЕ1 с (2-aPu)АР- и (2-aPu)F-субстратами, установленные в ходе настоящей работы, свидетельствуют о заметном снижении скорости превращения таких субстратов, по сравнению с субстратами, не содержащими 2-aPu. Таким образом, полученные данные не только согласуются с результатами работы [124], но также, в совокупности с результатами молекулярного моделирования, дают новую информацию относительно влияния таких 5'-мисматчей на отдельные стадии каталитического цикла. По данным молекулярного моделирования в структурах (2-aPu)АР- и (2-aPu)Fсубстратов пары нуклеотидов, расположенные с 5'-стороны от повреждения, подвержены значительно большему искажению, по сравнению с 3'-областью. В то же время, из данных РСА известно, что взаимодействия между АРЕ1 и 5'-областью АР-сайта обеспечивают специфическое узнавание субстрата [122, 209]. В частности, остатки Arg-73, Ala-74 и Lys78 последовательно координируют три фосфатные группы неповрежденной цепи, а боковые радикалы Gly-127 и Tyr-128 расширяют малую бороздку ДНК на 2 Å, обеспечивая заякоривание изогнутой структуры ДНК. Поэтому, замедленное протекание предкаталитических стадий в случае субстратов с 5'-2-aPu, вероятно, объясняется 135 нарушением контактов АРЕ1 с большой бороздкой ДНК и ослаблением взаимодействий между дезоксирибозой АР-сайта и Trp-280. Данные предстационарной кинетики указывают на то, что низкая скорость превращения (2-aPu)АР- и (2-aPu)F-субстратов связана с ослабленной способностью фермента должным образом ориентировать 5'-фосфатную группу АР-сайта для протекания каталитической стадии. Такое предположение хорошо согласуется с современной концепцией специфического узнавания и связывания поврежденной ДНК белком АРЕ1. Известно, что эндонуклеаза АРЕ1 обладает чрезвычайно высокой специфичностью по отношению к АР-сайтам и некоторым поврежденным основаниям. При этом активность фермента практически не зависит от нуклеотидного контекста окружающих оснований обеих цепей ДНК [176]. Как было установлено, ни структура апуриновой дезоксирибозы [124], ни ее внеспиральное положение [117], ни брешь [176], образующаяся в дцДНК рядом с АР-сайтом после удаления поврежденного основания, не являются ключевыми детерминантами специфического узнавания белком АРЕ1. Новые факты указывают на то, что при связывании с АРЕ1 конформация АР-содержащей ДНК заметно меняется под действием специфических спирально-петлевых доменов фермента [183, 196]. С другой стороны, уникальность структуры самой дцДНК, содержащей АРсайт, состоит в особой гибкости и подвижности поврежденного участка, о чем свидетельствуют данные ЯМР и молекулярного моделирования [180, 251]. Сопоставление имеющихся данных позволило выдвинуть гипотезу о том, что АРЕ1 дискриминирует специфические субстраты по их способности принимать изогнутую конформацию под действием фермента [45]. Структура неспецифической ДНК неспособна принимать такую конформацию, которая позволяет АР-содержащей ДНК погружаться в активный центр АРЕ1. В то же время, и конформация фермента претерпевает определенные изменения в ходе связывания поврежденной ДНК, что указывает на реализацию модели «индуцированного соответствия» [235]. Обнаруженная в ходе настоящей работы зависимость скорости оборота АРЕ1 от положения флуоресцентной метки и природы повреждения также свидетельствует о ключевой роли гибкости и пластичности ДНКсубстрата в осуществлении катализа. Чем жестче структура, тем труднее она превращается ферментом. Таким образом, данные предстационарной кинетики, регистрируемой по флуоресценции остатков Trp белка и 2-aPu субстрата, служат дополнительным доказательством того, что не только фермент, но и ДНК-субстрат должен обладать подвижностью структуры в области АР-сайта. 136 4.4. Регистрация процесса заполнения бреши в области АР-сайта по флуоресценции молекул фермента и ДНК-субстратов Специфическое связывание АРЕ1 с F(2-aPu)- и (2-aPu)F-субстратами описывается двумя равновесными стадиями механизма, в то время как комплекс АРЕ1 с АР(2-aPu)субстратом трансформируется в предкаталитический комплекс за одну стадию. Дополнительный конформационный переход (k2, k-2 в Таблицах 5 разд. 3.2.2 и 6 разд. 3.2.5) на кинетических кривых F-содержащих субстратов выражается в небольшом возрастании интенсивности Trp-флуоресценции и снижении интенсивности 2-aPuфлуоресценции (Рис. 31 (разд. 3.2.1) и 35 (разд. 3.2.4)). В случае (2-aPu)АР-субстрата наблюдается промежуточная ситуация: по флуоресценции Trp соответствующий переход регистрируется в интервале 0,04−0,2 с, но на кривых 2-aPu-флуоресценции выражен очень слабо (Рис. 30Б (разд. 3.2.1) и 34Б (разд. 3.2.4)). Таким образом, стадия дополнительной изомеризации фермент-субстратного комплекса становится более выраженной при переходе от «быстрых» субстратов к «медленным». Если сравнивать с субстратами без 2aPu, то аналогичный переход присутствует на кинетических кривых по флуоресценции белка для F-субстрата (Рис. 26, разд. 3.1.2), но не обнаруживается на кривых для АРсубстрата. Для лучшего понимания природы наблюдаемого перехода для одного и того же субстрата кинетические кривые по флуоресценции АРЕ1 сопоставляли с кривыми по флуоресценции 2-aPu. Как следует из сравнения двух кривых (Рис. 50), характеристические времена второй фазы для разных флуорофоров пересекаются, но не совпадают (см. также значения констант k2 и k-2 в Таблицах 5 (разд. 3.2.2), 6 (разд. 3.2.5)). На основании этих данных можно предположить, что конформационный переход в Рис. 50. Сопоставление предстационарных кинетических кривых для (2-aPu)F-субстрата, регистрируемых по флуоресценции Trp (зеленый цвет) и 2-aPu (фиолетовый цвет). Для каждой кривой вертикальные пунктирные линии ограничивают конформационный переход, соответствующий второй стадии Схем 8 и 9 (k2, k2) из разд. 3.2.2 и 3.2.5. Представленные кривые соответствуют концентрации АРЕ1 и ДНК 1,5×10-6 М. молекуле АРЕ1 вызывает определенное изменение конформации ДНК-субстрата, которое сопровождается тушением флуоресценции 2-aPu. В результате описанных трансформаций фермент-субстратный комплекс становится каталитически активным, что приводит к 137 накоплению продукта на следующей стадии процесса. Выводы, сделанные на основании качественного анализа флуоресцентных кривых, подтверждаются результатами количественной обработки. В частности, для (2-aPu)F-субстрата значение константы скорости прямой реакции k2, определяемое по конформационной динамике фермента (13 с-1) значительно превышает соответствующее значение, определяемое конформационной динамикой ДНК (1,3 с-1). Для соотнесения наблюдаемых переходов с конкретными физическими событиями, происходящими в активном центре фермента, следует обратиться к общим представлениям о структуре АРЕ1, а также данным, полученным методом «остановленной струи» для других ферментов репарации. Известно, что взаимодействие АР-эндонуклеаз с ДНК сопровождается сильным изгибанием двойной спирали в области повреждения, благодаря которому АР-сайт выворачивается из ДНК и размещается в кармане активного центра. Дальнейшая стабилизация предкаталитического комплекса обеспечивается встраиванием специфических аминокислотных остатков в брешь, образовавшуюся в ДНК после выворачивания АР-сайта. Схожим образом действуют и ДНК-гликозилазы. Как показали исследования ДНК-гликозилазы Fpg из E. coli, проведенные к.х.н. Кузнецовым Н.А. в Лаборатории модификации биополимеров ИХБФМ СО РАН, метод «остановленной струи» позволяет независимо регистрировать процессы изгибания ДНК-субстрата и заполнения бреши. На кинетических кривых этим стадиям соответствуют последовательные рост (τ1/2 ~10 мс) и падение (τ1/2 ~1 с) интенсивности флуоресценции 2-aPu [252]. Сопоставление результатов для Fpg с данными, полученными в настоящей работе, позволяет заключить, что дополнительное снижение интенсивности флуоресценции 2-aPu (τ1/2 от 0,09 до 0,5 с) отражает процесс заполнения бреши, который сопровождает закрепление поврежденной ДНК в кармане активного центра АРЕ1. Следует отметить, что реакция, катализируемая Fpg, протекает значительно медленнее, чем превращение субстратов эндонуклеазой АРЕ1, и может занимать до 1000 c. Это объясняет более быструю изомеризацию комплекса ES в случае фермента АРЕ1. Поскольку при использовании метода «остановленной струи» регистрация конформационных переходов ограничивается мертвым временем прибора (~1,5 мс), характерная фаза роста флуоресценции 2-aPu, соответствующая стадии изгибания и выворачивания повреждения из ДНК, не была зарегистрирована на кривых для АРЕ1. Высказанное нами предположение о природе второй стадии кинетического механизма согласуется с ранее опубликованными данными о встраивании флуоресцирующего остатка Trp-280 в свободное пространство, которое остается в ДНК после апуринизации одного из нуклеотидов. Авторы работы [246] считают, что остаток Trp-280, расположенный в непосредственной близости от АР-сайта, может играть 138 ключевую роль в узнавании повреждения. По этой причине связывание АРЕ1 с жесткими субстратами, структура которых заметно искажена, по сравнению с АР-субстратом, может потребовать дополнительной подстройки структуры активного центра с участием Trp-280, что и регистрируется по флуоресценции Trp белка. 4.5. Роль консервативного остатка Asn-212 в каталитическом механизме АРЕ1 Боковой радикал Asn-212 относится к ключевым аминокислотам активного центра АРЕ1 и непосредственно участвует в катализе. О высокой консервативности остатка Asn212 свидетельствует наличие остатка Asn-153 со схожими функциями в активном центре эндонуклеазы ExoIII из E. coli [52]. Комбинированный биоинформационный скрининг полиморфизмов гена аре1 показал, что биологически значимые мутации N212K и N212H могут приводить к разрушению активного центра фермента [253]. Кроме того, введение точечных мутаций по Asn-212 приводит к ингибированию активности АРЕ1 [184, 186]. В свете этих данных представлялось важным изучить влияние мутации остатка Asn-212 на промежуточные стадии каталитического цикла АРЕ1. Для достижения поставленной цели были сконструированы две мутантные формы фермента, в одной из которых остаток Asn212 был заменен на аспартат, а в другой на аланин. Таким образом, мутантная форма N212D АРЕ1 вместо амидной содержала терминальную карбоксильную группу, а форма N212A АРЕ1 была вовсе лишена полярного бокового радикала. Для определения кинетических параметров взаимодействие мутантных форм АРЕ1 с АР- и F-субстратами регистрировали методом «остановленной струи» в сочетании с детекцией флуоресценции остатков Trp фермента либо 2-aPu субстрата. Полученные серии кинетических кривых для различных концентраций фермента и субстрата свидетельствуют о том, что обе мутантные формы АРЕ1 так же как и ДНК-субстраты претерпевают изменения конформации в ходе превращения поврежденных дуплексов ДНК в широком диапазоне времени (до 4000 с) (Рис. 36 (разд. 3.3.1), 40 (разд. 3.3.5)). Важно отметить, что перегибы на флуоресцентных кривых для разных флуорофоров, соответствующие отдельным стадиям процесса, хорошо согласуются между собой по шкале времени. Результаты количественной обработки данных свидетельствуют о реализации четырех-стадийного механизма с тремя промежуточными комплексами для обоих мутантов (Схема 10, разд. 3.3.2). В целом оба белка способны узнавать и специфически связывать АР-сайты в ДНК, что приводит к образованию промежуточного комплекса ES', который на следующем этапе трансформируется в комплекс ЕР. Тем не менее, в величинах скорости и эффективности протекания каждой из стадий имеются существенные отличия. Стабильность комплексов обоих мутантов с природным АР-сайтом и его F-аналогом 139 отличается в 2,5−3 раза, что совпадает с зависимостью эффективности связывания фермента с ДНК от природы повреждения, которая была показана для WT АРЕ1 (Таблицы 4 (разд. 3.1.3), 7 (разд. 3.3.2) и 9 (разд. 3.3.5)). Интересно, что конформационные переходы на кривых Trp флуоресценции (Рис. 36А, Б (разд. 3.3.1) и 40А, Б (разд. 3.3.5)), соответствующие стадиям связывания и изомеризации комплекса ES, для N212A АРЕ1 протекают быстрее (1−100 мс), чем для N212D (0,001−1 с). Результаты качественной оценки также коррелируют с разницей в значениях констант k2Trp и КаTrp для двух мутантных форм АРЕ1 (Таблицы 7 (разд. 3.3.2) и 9 (разд. 3.3.5)). Из значений констант ассоциации следует, что специфический комплекс N212D АРЕ1 с АР-субстратом в 60 раз менее стабилен, чем такой же комплекс с WT АРЕ1, тогда как случае мутанта N212A сродство к АР-содержащей ДНК снижается только в 16 раз по сравнению с WT АРЕ1 (КаWT > КаN212A > КаN212D). По-видимому, отсутствие полярного бокового радикала не осложняет, а наоборот, облегчает связывание поврежденной ДНК в активном центре фермента. Для объяснения обнаруженной закономерности следует обратиться к результатам MD-симуляции пространственных структур комплексов WT, N212D и N212A АРЕ1 с F(2-aPu)-субстратом, выполненной сотрудником ИХБФМ СО РАН к.х.н. Ковалем В. В. [254]. По данным молекулярной динамики в структуре WT АРЕ1 боковой радикал Asn-212 располагается в непосредственной близости от F-сайта и может образовывать водородную связь с одним из атомов О гидролизуемой 5'-фосфатной группы, а также с остатком Asp-210 (Рис. 51А). Такая конфигурация остатков не противоречит гипотезе о каталитической триаде Asn-212−Asp-210−Н2О, выдвигаемой рядом авторов [184, 208]. Замена Asn-212 на аспартат приводит к заметному искажению металл-связывающего центра (Рис. 51Б). При этом сеть описанных водородных связей между Asp-212, Asp-210 и 5' О атомом сохраняется, однако ее конфигурация существенно изменена. В случае замены амидной группы в положении 212 на аланин координация иона Mg2+, напротив, соответствует ферменту дикого типа, а описанная сеть водородных связей исчезает, что вызывает расширение кармана активного центра с 3,1 до 5,6 Å (Рис. 51В). Таким образом, изменения, наблюдаемые в структуре активного центра N212D АРЕ1, могут затруднять специфическую изомеризацию комплекса ES в комплекс ES', что приводит снижению величин кинетических параметров специфического комплекса стадий N212A АРЕ1 связывания. Быстрое с ДНК-субстратами, образование вероятнее всего, обусловлено двумя факторами: 1) расширением кармана активного центра фермента, которое приводит к увеличению его доступности для поврежденной ДНК и облегчает первичное связывание, 2) правильной координацией иона металла аминокислотами мутанта N212A. 140 Рис. 51. Увеличенная часть структуры WT (А), N212D (Б) и N212A АРЕ1 (В), содержащая активный центр (результаты MD-симуляции) [254]. Во всех структурах ион Mg2+ (зеленый цвет) координирован карбоксильными группами Glu-96 и Asp-308, а также фосфатной группой мишени и тремя молекулами воды. Ион металла перемещался вместе с координирующими группами на протяжении всего цикла симуляции. Пунктирными линиями обозначены расстояния между координирующими остатками и Mg2+. Атомы, составляющие аминокислоты, ДНК и воду окрашены в соответствии с их типом (бежевый, С; синий, N; красный, О; белый, Н; оранжевый, Р). Следует отметить тот факт, что на кинетических кривых обеих мутантных форм, регистрируемых по флуоресценции 2-aPu, первый перегиб выражается в небольшом росте сигнала в интервале от 1 до 10−50 мс. Наиболее заметно флуоресценция 2-aPu возрастает на кривых для комплекса N212A АРЕ1 с F(2-aPu)-субстратом (Рис. 40В (разд. 3.3.5)). Согласно литературным данным для ДНК-гликозилазы Fpg, которые рассматриваются на стр. 137, изгибание спирали ДНК-субстрата в области АР-сайта в ходе первичного связывания ферментом должно сопровождаться увеличением доступности соседствующего с повреждением остатка 2-aPu для полярных молекул воды, то есть, увеличением гидрофильности окружения. Это, в свою очередь, приводит к возрастанию интенсивности флуоресценции 2-aPu на начальном участке кривой. Несмотря на то, что АРЕ1 также вызывает изгиб остова ДНК-субстрата, характерный рост 2-aPu флуоресценции не наблюдался на кинетических кривых для WT АРЕ1 вследствие высокой скорости процесса. Введение замен в одну из ключевых аминокислот активного центра привело к снижению скорости связывания с субстратами, что вероятно и позволило зарегистрировать процесс изгибания 2-aPu-содержащих субстратов мутантами N212A и N212D АРЕ1 на начальных участках кинетических кривых. Кинетические параметры, полученные методами «остановленной струи» и гельэлектрофореза, свидетельствуют о значительном снижение скорости каталитической стадии для обеих мутантных форм АРЕ1. В случае N212D АРЕ1 конформационный переход, соответствующий стадии необратимого гидролиза фосфодиэфирной связи субстратов, регистрируется в промежутке времени 40−1000 с вместо 0,2−2 с для WT АРЕ1. Константа скорости каталитической стадии kirr в случае замены Asn-212 на аспартат снижается в среднем в 550-раз, по сравнению с WT АРЕ1. Разделение [32Р]меченых продуктов методом гель-электрофореза показывает, что превращение 141 субстратов, содержащих АР-сайт, мутантом N212D требует 20−30 мин, в то время как для превращения F-содержащих субстратов требуется 150−200 мин. На основании данных по моделированию соответствующего комплекса можно предположить, что N212D АРЕ1 сохраняет способность ориентировать гидролизуемую фосфатную группу для достижения конформации, удобной для нуклеофильной атаки молекулой воды, которую активируют остатки Asp-210 и Asp-212. Несколько иная картина наблюдается при замене Asn-212 на аланин. Такая замена практически полностью ингибирует каталитическую активность мутанта N212A. Флуоресцентные кривые, полученные методом «остановленной струи», свидетельствуют о том, что за быстрым двух-стадийным связыванием следует медленный конформационный переход, который не поддается адекватной количественной обработке. С использованием методов стационарной флуориметрии и гель-электрофореза удается зарегистрировать низкую каталитическую активность фермента в отношении АР- и Fсубстрата, которая описывается наблюдаемой константой скорости 4,4 × 10-5 и 1,4 × 10-5 с1 , соответственно. Это означает, что скорость разрезания 12-звенных поврежденных дуплексов ДНК мутантом N212A снижена примерно в 70000-100000 раз, по сравнению с WT АРЕ1. Таким образом, из данных предстационарой кинетики следует, что замена Asn212 на аланин слабо влияет на ДНК-связывающую способность АРЕ1, однако препятствует эффективному гидролизу фосфодиэфирной связи. Как следует из MDсимуляции расположение остатков, координирующих ион металла, не слишком отличается для комплексов N212A и WT АРЕ1 с F(2-aPu)-субстратом. При этом значительные перестройки наблюдаются в окружении остатков Ala-212 и Asp-210, что приводит к исчезновению важных нековаленных взаимодействий внутри активного центра. Сопоставляя полученные нами данные с результатами моделирования можно заключить, что ингибирование активности мутанта N212A АРЕ1 в большей степени связано с исчезновением полярной амидной группы, чем с нарушением координации Mg2+. В случае N212D АРЕ1 присутствие в активном центре другой полярной группы (карбоксильной вместо амидной) позволяет белку осуществлять разрезание ДНКсубстрата, но осложняет формирование специфического комплекса из-за перестройки металл-связывающего центра. Результаты, полученные в ходе исследования нестационарной кинетики двух мутантных форм АРЕ1 служат дополнительным подтверждением гипотезы о ключевой роли Asn-212 и Asp-210 в генерации атакующего нуклеофила. 142 4.6. Влияние тройной мутации Y171F-P173L-N174K на каталитические свойства АРЕ1 Консервативные аминокислоты Tyr-171 и Asn-174 располагаются в активном центре АРЕ1 и играют важную роль в проявлении эндонуклеазной активности фермента [117]. Рентгеновские структуры АРЕ1 с одним ионом металла в активном центре свидетельствуют о том, что Tyr-171 и Asn-174 могут образовывать водородные связи с атомами кислорода 5'-фосфатной группы АР-сайта, стабилизируя переходное состояние фермент-субстратного комплекса [122]. По данным о кристаллической структуре АРЕ1, содержащей два иона Mg2+, остаток Tyr-171 должен участвовать в координации второго иона металла в сайте связывания Б [198]. Результаты исследований по сайтнаправленному мутагенезу подтверждают каталитическую значимость Tyr-171, поскольку замена его на аланин приводит к 3-кратному снижению константы Михаэлиса, а значение kcat при этом снижается более чем на 4 порядка [215]. Боковой радикал Pro-173 непосредственного участия в катализе не принимает, однако сравнение последовательности АРЕ1 с другими белками семейства ExoIII свидетельствует о высокой степени консервативности этого остатка в клетках многих организмов от бактерий до млекопитающих [117]. По данным РСА остаток Pro-173 создает перегиб в аминокислотной цепи, сближая боковые радикалы Tyr-171 и Asn-174 (). Кроме того, Pro-173 вместе с соседними аминокислотами обеспечивает правильное расположение в пространстве петли α5, которая проникает в ДНК со стороны большой бороздки и подобно крючку удерживает субстрат в щели активного центра АРЕ1. С учетом изложенных фактов одновременная замена трех аминокислот (Y171F-P173L-N174K) должна была полностью ингибировать каталитическую Рис. 52. Увеличенная часть структуры активного центра АРЕ1 1DEW [122] со связанной F-содержащей ДНК. Показаны Fсайт и фланкирующие его фосфатные группы (голубой цвет), а также аминокислоты Tyr171, Asn-174 и Pro-173 (бежевый цвет). активность АРЕ1, сохраняя способность к узнаванию и связыванию ДНК-субстратов. Действительно, на кинетических кривых, полученных методом «остановленной струи», наблюдаются конформационные переходы, ответственные за стадии связывания фермента с ДНК и отсутствуют переходы, соответствующие каталитической стадии (Рис. 43, разд. 3.4). С другой стороны, ингибирующий эффект введения тройной мутации нельзя считать 143 абсолютным, поскольку результаты разделения реакционных смесей в денатурирующем ПААГ демонстрируют накопление около 85% продукта на временах порядка 1,5−2 часов. Среднее значение каталитической константы для специфического субстрата составляет 1,3 × 10-4 с-1, что на 4 порядка ниже значений kcat для WT АРЕ1. Низкая скорость образования продуктов объясняет отсутствие соответствующих конформационных переходов на предстационарных кинетических кривых. Эффективность связывания АРЕ1 с поврежденной ДНК в меньшей степени зависит от введения тройной замены. Значения константы ассоциации Ka свидетельствуют о 34- и 50-кратном снижении сродства фермента к АР-и F-субстрату, соответственно. Как показало титрование продуктами ферментативной реакции, «тройной мутант» сохраняет способность образовывать комплекс с ДНК, содержащей разрыв с 5'-стороны F-сайта, однако его стабильность снижена в 3 раза по сравнению с WT АРЕ1 (Рис. 44, разд. 3.4). Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что замена боковых радикалов Tyr-171 на неполярный фенилаланин, Pro-173 на алифатический лейцин и Asn174 на лизин в активном центре АРЕ1 значительно снижает скорость каталитической стадии. При этом мутантный фермент сохраняет способность эффективно связывать поврежденную ДНК. Это подтверждает важную роль указанных аминокислот в образовании пентакоординированного переходного состояния и трансформации его в комплекс фермент-продукт. По данным, имеющимся в литературе, Tyr-171 должен участвовать в ориентации 5'-фосфатной группы АР-сайта в удобной для катализа конформации [210, 216]. Объединяя результаты, полученные в настоящей работе с литературными данными, можно предположить, что связывание с ДНК-субстратом и ионом металла переводит АРЕ1 в каталитически активную форму. Двухвалентный катион может вызывать такое возмущение в молекулярном окружении Tyr-171, которое позволяет этому остатку ориентировать АР-сайт и фосфатную группу для катализа. Таким образом, полученные в работе данные свидетельствуют о важной роли конформационных переходов в узнавании и превращении АР-сайтов ферментом АРЕ1. Использование в качестве модельного повреждения синтетического F-аналога природного АР-сайта позволило глубже понять природу каталитического механизма АРЕ1. На основе данных предстационарной кинетики, полученных для разных ДНК-субстратов и флуорофоров, можно предложить 5-стадийный молекулярно-кинетический механизм, характеризующий эндонуклеазную активность АРЕ1 (Схема 14). 144 Схема 14 На первой стадии АРЕ1 связывается с поврежденной ДНК с образованием первичного комплекса ES. Далее происходит изомеризация неспецифического комплекса в специфический комплекс ES', что сопровождается изменением конформации фермента. На третьей стадии продолжается взаимная подстройка активного центра АРЕ1 и АР-сайта для достижения каталитически активного состояния, что выражается в последовательном изменении конформации фермента и субстрата. Данный конформационный переход предположительно отражает процесс заполнения бреши в структуре АР-содержащей ДНК, который сопровождает закрепление субстрата в кармане активного центра АРЕ1. Установление каталитически выгодной конформации фермент-субстратного комплекса приводит на четвертой стадии к необратимому гидролизу 5'-фосфодиэфирной связи АРсайта. Этот процесс сопровождается согласованными изменениями конформации АРЕ1 и ДНК и приводит к образованию комплекса ЕР, который диссоциирует на заключительной стадии механизма. 145 Заключение В представленной работе изучена предстационарная кинетика превращения поврежденной ДНК АР-эндонуклеазой 1 человека в условиях эксцизионной репарации оснований (BER) с применением метода «остановленной струи». В качестве субстратов в работе были использованы короткие 12-звенные дуплексы ДНК, содержащие природный АР-сайт либо его синтетический аналог F в 6-ом положении с 5'-конца, что позволило зарегистрировать все стадии каталитического цикла на одной кинетической кривой, включая распад комплекса фермента с продуктами реакции. Установлено, что взаимодействие АРЕ1 с модельными субстратами, сопровождается изменением конформации фермента и субстрата на каждой из стадий каталитического цикла. В зависимости от типа повреждения, гидролиз фосфодиэфирной связи специфического субстрата сопровождается четырьмя либо пятью конформационными переходами в структуре АРЕ1, которые соответствуют образованию первичного комплекса ES, взаимной подстройке активного центра фермента и структуры субстрата с образованием комплексов ES' и ES'', необратимому превращению фермент-субстратного комплекса в комплекс ЕР и его распаду. Связывание фермента с неповрежденной дцДНК описывается двумя обратимыми стадиями. Согласно результатам количественной обработки экспериментальных зависимостей в случае 12-звенных ДНК-субстратов наиболее медленной является стадия разрыва фосфодиэфирной связи, которую следует считать каталитической. В ходе работы, кинетика разрезания АР-и F-субстратов была также исследована в стационарных условиях. Установленные значения kcat и KМ хорошо согласуются с литературными данными и не противоречат величинам кинетических параметров, определенных в предстационарных условиях. Как следует из значений констант скорости каталитической стадии механизма, превращенние F-субстрата происходит как минимум в 1,5 раза медленнее, чем АРсубстрата. Основное отличие между этими субстратами заключается в наличии гидроксильной группы в положении С1' природного АР-сайта, что дает возможность обратимой изомеризации рибозы в акциклическую форму. Таким образом, полученные в работе данные указывают на особую значимость подвижности структуры АР-сайта для эффективного узнавания и превращения белком АРЕ1. С использованием флуоресцентной метки 2-aPu методом «остановленной струи» зарегистрирована конформационная динамика ДНК-субстратов в ходе их взаимодействия с АРЕ1. Полученные флуоресцентные кривые свидетельствуют о подвижности структуры 146 АР- и F-субстратов и многостадийном характере изменения их конформации. По результатам количественной обработки данных был предложен 4-стадийный кинетический механизм реакции, который включает три разных промежуточных ферментсубстратных комплекса. Значения констант скорости прямых и обратных стадий механизма указывают на то, что положение флуоресцирующего аналога нуклеотида влияет на скорость и эффективность протекания процесса. Установлено, что встраивание 2-aPu с 3'-стороны от повреждения не влияет на скорость его превращения белком АРЕ1. В частности, гидролиз фосфодиэфирной связи F(2-aPu)-субстрата протекает со скоростью, сравнимой с превращением F-субстрата, не содержащего 2-aPu, а константа скорости каталитической стадии для АР(2-aPu)-субстрата более чем в 2 раза превышает это значение для АР-субстрата. В то же время, субстраты с 5'-2-aPu демонстрируют значительное снижение скорости катализа. Сравнение экспериментальных данных, полученных в настоящей работе, с результатами молекулярного моделирования 2-aPuсодержащих субстратов позволило установить следующую зависимость: чем конформационно подвижнее ДНК-субстрат, тем быстрее он превращается ферментом АРЕ1. Установленные в результате MD-симуляции значительное искажение и малая подвижность структур (2-aPu)АР- и (2-aPu)F-субстратов делает их наименее удобными для превращения белком АРЕ1 из изученных в работе. В случае (2-aPu)F-субстрата снижение скорости катализа сопровождалось появлением дополнительных конформационных переходов фермент-субстратного комплекса. Это позволило нам более детально различить изменения конформации белка и субстрата на стадиях подстройки каталитических групп активного центра к структуре сайта связывания ДНК. Результаты, полученные в настоящей работе, доказывают, что скорость образования каталитическиактивного комплекса АРЕ1 с субстратом зависит от способности двойной спирали поврежденной ДНК к изгибанию, что, в свою очередь, определяется свойствами гетероциклических оснований вблизи АР-сайта. Сопоставление данных предстационарной кинетики, регистрируемых по флуоресценции остатков Trp фермента и 2-aPu субстрата, с данными РСА позволяет нам считать конформационный переход, соответствующий изомеризации комплекса ES' в комплекс ES'', процессом встраивания боковых радикалов АРЕ1 в полость ДНК-субстрата, образующуюся после выворачивания АР-сайта. Установлено, что в ходе такой подстройки активного центра АРЕ1 и поврежденной ДНК изменение конформации фермента стимулирует конформационный переход в молекуле субстрата. В ходе работы детально исследована роль ряда консервативных аминокислот активного центра АРЕ1 в осуществлении отдельных этапов каталитического цикла. В 147 частности, показано, что одновременная замена трех аминокислот (Y171F-P173L-N174K) в активном центре АРЕ1 приводит к снижению скорости превращения АР- и F-субстратов на четыре порядка. Наиболее важным из трех заменяемых остатков для проявления эндонуклеазной активности фермента является Tyr-171. По-видимому, удаление гидроксильной группы путем замены Y171F нарушает процесс выстраивания 5'фосфатной группы АР-сайта в удобное для катализа положение. Путем введения различных замен по положению 212 установлена роль бокового радикала аспарагина-212 в осуществлении отдельных стадий каталитического цикла. Методом «остановленной струи» в сочетании с детекцией флуоресценции Trp и 2-aPu были зарегистрированы конформационные переходы в молекулах N212D, N212A АРЕ1 и ДНК-субстратов. Показано, что замена остатка Asn-212 на аланин практически полностью ингибирует каталитическую активность АРЕ1, однако сохраняет способность фермента узнавать и специфически связывать АР-сайт в ДНК со скоростью, сравнимой со WT АРЕ1. При замене Asn-212 на аспартат, напротив, нарушается специфическое связывание и замедляется достижение фермент-субстратным комплексом каталитически активного состояния. При этом, мутант N212D АРЕ1 способен осуществлять гидролиз фосфодиэфирной связи мишени в 500 раз медленнее, чем WT АРЕ1. На основании сравнения данных предстационарной кинетики, кристаллической структуры АРЕ1 и результатов молекулярного моделирования фермент-субстратных комплексов было сделано заключение, что остаток Asn-212 играет ключевую роль именно на стадии гидролиза фосфодиэфирной связи субстрата. Вероятнее всего амидная группа Asn-212 с участием карбоксильной группы Asp-210 перераспределяет электронную плотность молекулы Н2О для осуществления нуклеофильной атаки на 5'-фосфат АР-сайта. 148 Выводы 1. Методом «остановленной струи» в сочетании с флуориметрической детекцией показано, что взаимодействие апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека АРЕ1 с ДНК-субстратами оснований сопровождается согласованными конформационными переходами в молекулах фермента и ДНК. • Молекулярно-кинетический механизм процесса удаления природного АРсайта из ДНК белком АРЕ1 включает 5 стадий: связывание АР-сайта с образованием неспецифического комплекса, его изомеризацию в специфический комплекс, сопровождаемую изменением конформации фермента, взаимную подстройку активного центра АРЕ1 и АР-сайта для достижения каталитически активного состояния, гидролиз фосфодиэфирной связи, высвобождение продукта реакции из комплекса с ферментом. • В ходе специфической изомеризации фермент-субстратного комплекса в каталитически активное состояние изменение конформации фермента предшествует конформационному переходу в ДНК. • Нековалентные взаимодействия между аминокислотами активного центра и лабильной ОН-группой, связанной с атомом С1' природного АР-сайта, вносят существенный вклад в формирование конформации, оптимальной для катализа. 2. Установлено, что эффективность образования каталитически-активного комплекса зависит от способности двойной спирали поврежденной ДНК к изгибанию под действием фермента, которая, в свою очередь, зависит от особенностей строения основания, расположенного с 5-стороны от АР-сайта. 3. Путем введения точечных мутаций в активный центр фермента (Y171F-P173LN174K, N212D и N212A) проанализирована роль некоторых консервативных аминокислот АРЕ1 в осуществлении отдельных этапов каталитического цикла. • Показано, что замена аминокислот тирозина-171 на фенилаланин, пролина173 на лейцин и аспарагина-174 на лизин в активном центре АРЕ1 снижает скорость каталитической стадии на 4 порядка. При этом мутантный фермент сохраняет способность связывать поврежденную ДНК, что подтверждает важную роль указанных аминокислот в образовании переходного состояния и трансформации его в комплекс фермент-продукт. 149 • Показано, остаток аспарагина-212 играет ключевую роль именно на стадии гидролиза фосфодиэфирной связи субстрата. Замена Asn-212 на аланин практические не влияет на сродство фермента к субстрату. Полученные кинетические данные кристаллической согласуются структуры АРЕ1 с и результатами молекулярного исследования моделирования фермент-субстратных комплексов, а также предположением о ключевой роли остатка Asn-212 в генерации атакующего нуклеофила. 150 Список использованной литературы 1. Hartridge H., Roughton F. J. W. The kinetics of haemoglobin. Part II. The velocity with which oxygen dissociates from its combination with haemoglobin // Proc Roy Soc London Ser A. ‒ 1923. ‒ T. 104. ‒ C. 395-430. 2. Chance B. The enzyme-substrate compounds of catalase and peroxides // Nature. ‒ 1948. ‒ T. 161, № 4102. ‒ C. 914-7. 3. Gibson Q. H. Apparatus for the study of rapid reactions // J Physiol. ‒ 1952. ‒ T. 117, № 4. ‒ C. 49P-50P. 4. Johnson K. A. Transient-state kinetic analysis of enzyme reaction pathways // The Enzymes / Sigman D. S.Elsevier Inc., 1992. ‒ C. 1–61. 5. Johnson K. A. Rapid quench kinetic analysis of polymerases, adenosinetriphosphatases, and enzyme intermediates // Methods Enzymol. ‒ 1995. ‒ T. 249. ‒ C. 38-61. 6. Fierke C. A., Hammes G. G. Transient kinetic approaches to enzyme mechanisms // Methods Enzymol. ‒ 1995. ‒ T. 249. ‒ C. 3-37. 7. Rashidian M., Dozier J. K., Distefano M. D. Enzymatic Labeling of Proteins: Techniques and Approaches // Bioconjug Chem. ‒ 2013. 8. Kuzmic P. Program DYNAFIT for the analysis of enzyme kinetic data: application to HIV proteinase // Anal Biochem. ‒ 1996. ‒ T. 237, № 2. ‒ C. 260-73. 9. Johnson K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer // Methods Enzymol. ‒ 2009. ‒ T. 467. ‒ C. 601-26. 10. Chance B. The Stopped-flow Method and Chemical Intermediates in Enzyme Reactions - A Personal Essay // Photosynth Res. ‒ 2004. ‒ T. 80, № 1-3. ‒ C. 387-400. 11. Memisoglu A., Samson L. Base excision repair in yeast and mammals // Mutat Res. ‒ 2000. ‒ T. 451, № 1-2. ‒ C. 39-51. 12. Wilson D. M., 3rd, Barsky D. The major human abasic endonuclease: formation, consequences and repair of abasic lesions in DNA // Mutat Res. ‒ 2001. ‒ T. 485, № 4. ‒ C. 283307. 13. Demple B., Sung J. S. Molecular and biological roles of Ape1 protein in mammalian base excision repair // DNA Repair (Amst). ‒ 2005. ‒ T. 4, № 12. ‒ C. 1442-9. 14. Izumi T., Wiederhold L. R., Roy G., Roy R., Jaiswal A., Bhakat K. K., Mitra S., Hazra T. K. Mammalian DNA base excision repair proteins: their interactions and role in repair of oxidative DNA damage // Toxicology. ‒ 2003. ‒ T. 193, № 1-2. ‒ C. 43-65. 15. Drohat A. C., Maiti A. Mechanisms for enzymatic cleavage of the N-glycosidic bond in DNA // Org Biomol Chem. ‒ 2014. ‒ T. 12, № 42. ‒ C. 8367-78. 151 16. Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA // Nature. ‒ 1993. ‒ T. 362, № 6422. ‒ C. 709-15. 17. Lindahl T., Nyberg B. Rate of depurination of native deoxyribonucleic acid // Biochemistry. ‒ 1972. ‒ T. 11, № 19. ‒ C. 3610-8. 18. Hoeijmakers J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer // Nature. ‒ 2001. ‒ T. 411, № 6835. ‒ C. 366-74. 19. Friedberg E. C. DNA damage and repair // Nature. ‒ 2003. ‒ T. 421, № 6921. ‒ C. 436-40. 20. Wilde J. A., Bolton P. H., Mazumder A., Manoharan M., Gerlt J. A. Characterization of the Equilibrating Forms of the Aldehydic Abasic Site in Duplex DNA by O-17 Nmr // Journal of the American Chemical Society. ‒ 1989. ‒ T. 111, № 5. ‒ C. 1894-1896. 21. Kim Y. J., Wilson D. M., 3rd. Overview of base excision repair biochemistry // Curr Mol Pharmacol. ‒ 2012. ‒ T. 5, № 1. ‒ C. 3-13. 22. McCullough A. K., Dodson M. L., Lloyd R. S. Initiation of base excision repair: glycosylase mechanisms and structures // Annu Rev Biochem. ‒ 1999. ‒ T. 68. ‒ C. 255-85. 23. Frosina G., Fortini P., Rossi O., Carrozzino F., Raspaglio G., Cox L. S., Lane D. P., Abbondandolo A., Dogliotti E. Two pathways for base excision repair in mammalian cells // J Biol Chem. ‒ 1996. ‒ T. 271, № 16. ‒ C. 9573-8. 24. Sung J. S., Mosbaugh D. W. Escherichia coli uracil- and ethenocytosine-initiated base excision DNA repair: rate-limiting step and patch size distribution // Biochemistry. ‒ 2003. ‒ T. 42, № 16. ‒ C. 4613-25. 25. Bennett S. E., Sung J. S., Mosbaugh D. W. Fidelity of uracil-initiated base excision DNA repair in DNA polymerase beta-proficient and -deficient mouse embryonic fibroblast cell extracts // J Biol Chem. ‒ 2001. ‒ T. 276, № 45. ‒ C. 42588-600. 26. Dantzer F., Bjoras M., Luna L., Klungland A., Seeberg E. Comparative analysis of 8oxoG:C, 8-oxoG:A, A:C and C:C DNA repair in extracts from wild type or 8-oxoG DNA glycosylase deficient mammalian and bacterial cells // DNA Repair (Amst). ‒ 2003. ‒ T. 2, № 6. ‒ C. 707-18. 27. Sukhanova M. V., Khodyreva S. N., Lebedeva N. A., Prasad R., Wilson S. H., Lavrik O. I. Human base excision repair enzymes apurinic/apyrimidinic endonuclease1 (APE1), DNA polymerase beta and poly(ADP-ribose) polymerase 1: interplay between strand-displacement DNA synthesis and proofreading exonuclease activity // Nucleic Acids Res. ‒ 2005. ‒ T. 33, № 4. ‒ C. 1222-9. 28. Narayan S., Jaiswal A. S., Balusu R. Tumor suppressor APC blocks DNA polymerase betadependent strand displacement synthesis during long patch but not short patch base excision 152 repair and increases sensitivity to methylmethane sulfonate // J Biol Chem. ‒ 2005. ‒ T. 280, № 8. ‒ C. 6942-9. 29. Sukhanova M., Khodyreva S., Lavrik O. Suppression of base excision repair reactions by apoptotic 24kDa-fragment of poly(ADP-ribose) polymerase 1 in bovine testis nuclear extract // DNA Repair (Amst). ‒ 2007. ‒ T. 6, № 5. ‒ C. 615-25. 30. Fortini P., Dogliotti E. Base damage and single-strand break repair: mechanisms and functional significance of short- and long-patch repair subpathways // DNA Repair (Amst). ‒ 2007. ‒ T. 6, № 4. ‒ C. 398-409. 31. Pascucci B., Maga G., Hubscher U., Bjoras M., Seeberg E., Hickson I. D., Villani G., Giordano C., Cellai L., Dogliotti E. Reconstitution of the base excision repair pathway for 7,8dihydro-8-oxoguanine with purified human proteins // Nucleic Acids Res. ‒ 2002. ‒ T. 30, № 10. ‒ C. 2124-30. 32. Wallace S. S. Base excision repair: a critical player in many games // DNA Repair (Amst). ‒ 2014. ‒ T. 19. ‒ C. 14-26. 33. Kubota Y., Nash R. A., Klungland A., Schar P., Barnes D. E., Lindahl T. Reconstitution of DNA base excision-repair with purified human proteins: interaction between DNA polymerase beta and the XRCC1 protein // EMBO J. ‒ 1996. ‒ T. 15, № 23. ‒ C. 6662-70. 34. Hitomi K., Iwai S., Tainer J. A. The intricate structural chemistry of base excision repair machinery: implications for DNA damage recognition, removal, and repair // DNA Repair (Amst). ‒ 2007. ‒ T. 6, № 4. ‒ C. 410-28. 35. Almeida K. H., Sobol R. W. A unified view of base excision repair: lesion-dependent protein complexes regulated by post-translational modification // DNA Repair (Amst). ‒ 2007. ‒ T. 6, № 6. ‒ C. 695-711. 36. Tom S., Ranalli T. A., Podust V. N., Bambara R. A. Regulatory roles of p21 and apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 in base excision repair // J Biol Chem. ‒ 2001. ‒ T. 276, № 52. ‒ C. 48781-9. 37. Dianov G. L., Jensen B. R., Kenny M. K., Bohr V. A. Replication protein A stimulates proliferating cell nuclear antigen-dependent repair of abasic sites in DNA by human cell extracts // Biochemistry. ‒ 1999. ‒ T. 38, № 34. ‒ C. 11021-5. 38. Whitehouse C. J., Taylor R. M., Thistlethwaite A., Zhang H., Karimi-Busheri F., Lasko D. D., Weinfeld M., Caldecott K. W. XRCC1 stimulates human polynucleotide kinase activity at damaged DNA termini and accelerates DNA single-strand break repair // Cell. ‒ 2001. ‒ T. 104, № 1. ‒ C. 107-17. 39. Minowa O., Arai T., Hirano M., Monden Y., Nakai S., Fukuda M., Itoh M., Takano H., Hippou Y., Aburatani H., Masumura K., Nohmi T., Nishimura S., Noda T. Mmh/Ogg1 gene 153 inactivation results in accumulation of 8-hydroxyguanine in mice // Proc Natl Acad Sci U S A. ‒ 2000. ‒ T. 97, № 8. ‒ C. 4156-61. 40. Al-Tassan N., Chmiel N. H., Maynard J., Fleming N., Livingston A. L., Williams G. T., Hodges A. K., Davies D. R., David S. S., Sampson J. R., Cheadle J. P. Inherited variants of MYH associated with somatic G:C-->T:A mutations in colorectal tumors // Nat Genet. ‒ 2002. ‒ T. 30, № 2. ‒ C. 227-32. 41. Fung H., Demple B. A vital role for Ape1/Ref1 protein in repairing spontaneous DNA damage in human cells // Mol Cell. ‒ 2005. ‒ T. 17, № 3. ‒ C. 463-70. 42. Weissman L., Jo D. G., Sorensen M. M., de Souza-Pinto N. C., Markesbery W. R., Mattson M. P., Bohr V. A. Defective DNA base excision repair in brain from individuals with Alzheimer's disease and amnestic mild cognitive impairment // Nucleic Acids Res. ‒ 2007. ‒ T. 35, № 16. ‒ C. 5545-55. 43. Chow E., Thirlwell C., Macrae F., Lipton L. Colorectal cancer and inherited mutations in base-excision repair // Lancet Oncol. ‒ 2004. ‒ T. 5, № 10. ‒ C. 600-6. 44. Magnander K., Elmroth K. Biological consequences of formation and repair of complex DNA damage // Cancer Lett. ‒ 2012. ‒ T. 327, № 1-2. ‒ C. 90-6. 45. Tsutakawa S. E., Lafrance-Vanasse J., Tainer J. A. The cutting edges in DNA repair, licensing, and fidelity: DNA and RNA repair nucleases sculpt DNA to measure twice, cut once // DNA Repair (Amst). ‒ 2014. ‒ T. 19. ‒ C. 95-107. 46. Berquist B. R., McNeill D. R., Wilson D. M., 3rd. Characterization of abasic endonuclease activity of human Ape1 on alternative substrates, as well as effects of ATP and sequence context on AP site incision // J Mol Biol. ‒ 2008. ‒ T. 379, № 1. ‒ C. 17-27. 47. Paquette Y., Crine P., Verly W. G. Properties of the endonuclease for depurinated DNA from Escherichia coli // Can J Biochem. ‒ 1972. ‒ T. 50, № 11. ‒ C. 1199-209. 48. Levin J. D., Johnson A. W., Demple B. Homogeneous Escherichia coli endonuclease IV. Characterization of an enzyme that recognizes oxidative damage in DNA // J Biol Chem. ‒ 1988. ‒ T. 263, № 17. ‒ C. 8066-71. 49. Richardson C. C., Lehman I. R., Kornberg A. A Deoxyribonucleic Acid PhosphataseExonuclease from Escherichia Coli. Ii. Characterization of the Exonuclease Activity // J Biol Chem. ‒ 1964. ‒ T. 239. ‒ C. 251-8. 50. Weiss B. Endonuclease II of Escherichia coli is exonuclease III // J Biol Chem. ‒ 1976. ‒ T. 251, № 7. ‒ C. 1896-901. 51. Hosfield D. J., Guan Y., Haas B. J., Cunningham R. P., Tainer J. A. Structure of the DNA repair enzyme endonuclease IV and its DNA complex: double-nucleotide flipping at abasic sites and three-metal-ion catalysis // Cell. ‒ 1999. ‒ T. 98, № 3. ‒ C. 397-408. 154 52. Mol C. D., Kuo C. F., Thayer M. M., Cunningham R. P., Tainer J. A. Structure and function of the multifunctional DNA-repair enzyme exonuclease III // Nature. ‒ 1995. ‒ T. 374, № 6520. ‒ C. 381-6. 53. Hoheisel J. D. On the activities of Escherichia coli exonuclease III // Anal Biochem. ‒ 1993. ‒ T. 209, № 2. ‒ C. 238-46. 54. Demple B., Johnson A., Fung D. Exonuclease III and endonuclease IV remove 3' blocks from DNA synthesis primers in H2O2-damaged Escherichia coli // Proc Natl Acad Sci U S A. ‒ 1986. ‒ T. 83, № 20. ‒ C. 7731-5. 55. Demple B., Harrison L. Repair of oxidative damage to DNA: enzymology and biology // Annu Rev Biochem. ‒ 1994. ‒ T. 63. ‒ C. 915-48. 56. Shida T., Noda M., Sekiguchi J. Cleavage of single- and double-stranded DNAs containing an abasic residue by Escherichia coli exonuclease III (AP endonuclease VI) // Nucleic Acids Res. ‒ 1996. ‒ T. 24, № 22. ‒ C. 4572-6. 57. Demple B., Halbrook J., Linn S. Escherichia coli xth mutants are hypersensitive to hydrogen peroxide // J Bacteriol. ‒ 1983. ‒ T. 153, № 2. ‒ C. 1079-82. 58. Milcarek C., Weiss B. Mutants of Escherichia coli with altered deoxyribonucleases. I. Isolation and characterization of mutants for exonuclease 3 // J Mol Biol. ‒ 1972. ‒ T. 68, № 2. ‒ C. 303-18. 59. Mol C. D., Hosfield D. J., Tainer J. A. Abasic site recognition by two apurinic/apyrimidinic endonuclease families in DNA base excision repair: the 3' ends justify the means // Mutat Res. ‒ 2000. ‒ T. 460, № 3-4. ‒ C. 211-29. 60. Daley J. M., Zakaria C., Ramotar D. The endonuclease IV family of apurinic/apyrimidinic endonucleases // Mutat Res. ‒ 2010. ‒ T. 705, № 3. ‒ C. 217-27. 61. Ljungquist S., Lindahl T., Howard-Flanders P. Methyl methane sulfonate-sensitive mutant of Escherichia coli deficient in an endonuclease specific for apurinic sites in deoxyribonucleic acid // J Bacteriol. ‒ 1976. ‒ T. 126, № 2. ‒ C. 646-53. 62. Chan E., Weiss B. Endonuclease IV of Escherichia coli is induced by paraquat // Proc Natl Acad Sci U S A. ‒ 1987. ‒ T. 84, № 10. ‒ C. 3189-93. 63. Ishchenko A. A., Ide H., Ramotar D., Nevinsky G., Saparbaev M. Alpha-anomeric deoxynucleotides, anoxic products of ionizing radiation, are substrates for the endonuclease IVtype AP endonucleases // Biochemistry. ‒ 2004. ‒ T. 43, № 48. ‒ C. 15210-6. 64. Ide H., Tedzuka K., Shimzu H., Kimura Y., Purmal A. A., Wallace S. S., Kow Y. W. Alphadeoxyadenosine, a major anoxic radiolysis product of adenine in DNA, is a substrate for Escherichia coli endonuclease IV // Biochemistry. ‒ 1994. ‒ T. 33, № 25. ‒ C. 7842-7. 155 65. Ischenko A. A., Saparbaev M. K. Alternative nucleotide incision repair pathway for oxidative DNA damage // Nature. ‒ 2002. ‒ T. 415, № 6868. ‒ C. 183-7. 66. Warner H. R., Demple B. F., Deutsch W. A., Kane C. M., Linn S. Apurinic/apyrimidinic endonucleases in repair of pyrimidine dimers and other lesions in DNA // Proc Natl Acad Sci U S A. ‒ 1980. ‒ T. 77, № 8. ‒ C. 4602-6. 67. Banner D. W., Bloomer A. C., Petsko G. A., Phillips D. C., Pogson C. I., Wilson I. A., Corran P. H., Furth A. J., Milman J. D., Offord R. E., Priddle J. D., Waley S. G. Structure of chicken muscle triose phosphate isomerase determined crystallographically at 2.5 angstrom resolution using amino acid sequence data // Nature. ‒ 1975. ‒ T. 255, № 5510. ‒ C. 609-14. 68. Garcin E. D., Hosfield D. J., Desai S. A., Haas B. J., Bjoras M., Cunningham R. P., Tainer J. A. DNA apurinic-apyrimidinic site binding and excision by endonuclease IV // Nat Struct Mol Biol. ‒ 2008. ‒ T. 15, № 5. ‒ C. 515-22. 69. Johnson A. W., Demple B. Yeast DNA 3'-repair diesterase is the major cellular apurinic/apyrimidinic endonuclease: substrate specificity and kinetics // J Biol Chem. ‒ 1988. ‒ T. 263, № 34. ‒ C. 18017-22. 70. Ramotar D., Popoff S. C., Gralla E. B., Demple B. Cellular role of yeast Apn1 apurinic endonuclease/3'-diesterase: repair of oxidative and alkylation DNA damage and control of spontaneous mutation // Mol Cell Biol. ‒ 1991. ‒ T. 11, № 9. ‒ C. 4537-44. 71. Popoff S. C., Spira A. I., Johnson A. W., Demple B. Yeast structural gene (APN1) for the major apurinic endonuclease: homology to Escherichia coli endonuclease IV // Proc Natl Acad Sci U S A. ‒ 1990. ‒ T. 87, № 11. ‒ C. 4193-7. 72. Ramotar D., Kim C., Lillis R., Demple B. Intracellular localization of the Apn1 DNA repair enzyme of Saccharomyces cerevisiae. Nuclear transport signals and biological role // J Biol Chem. ‒ 1993. ‒ T. 268, № 27. ‒ C. 20533-9. 73. Jilani A., Vongsamphanh R., Leduc A., Gros L., Saparbaev M., Ramotar D. Characterization of two independent amino acid substitutions that disrupt the DNA repair functions of the yeast Apn1 // Biochemistry. ‒ 2003. ‒ T. 42, № 21. ‒ C. 6436-45. 74. Yang X., Tellier P., Masson J. Y., Vu T., Ramotar D. Characterization of amino acid substitutions that severely alter the DNA repair functions of Escherichia coli endonuclease IV // Biochemistry. ‒ 1999. ‒ T. 38, № 12. ‒ C. 3615-23. 75. Johnson R. E., Torres-Ramos C. A., Izumi T., Mitra S., Prakash S., Prakash L. Identification of APN2, the Saccharomyces cerevisiae homolog of the major human AP endonuclease HAP1, and its role in the repair of abasic sites // Genes Dev. ‒ 1998. ‒ T. 12, № 19. ‒ C. 3137-43. 76. Unk I., Haracska L., Johnson R. E., Prakash S., Prakash L. Apurinic endonuclease activity of yeast Apn2 protein // J Biol Chem. ‒ 2000. ‒ T. 275, № 29. ‒ C. 22427-34. 156 77. Unk I., Haracska L., Prakash S., Prakash L. 3'-phosphodiesterase and 3'->5' exonuclease activities of yeast Apn2 protein and requirement of these activities for repair of oxidative DNA damage // Mol Cell Biol. ‒ 2001. ‒ T. 21, № 5. ‒ C. 1656-61. 78. Bennett R. A. The Saccharomyces cerevisiae ETH1 gene, an inducible homolog of exonuclease III that provides resistance to DNA-damaging agents and limits spontaneous mutagenesis // Mol Cell Biol. ‒ 1999. ‒ T. 19, № 3. ‒ C. 1800-9. 79. Ma W., Resnick M. A., Gordenin D. A. Apn1 and Apn2 endonucleases prevent accumulation of repair-associated DNA breaks in budding yeast as revealed by direct chromosomal analysis // Nucleic Acids Res. ‒ 2008. ‒ T. 36, № 6. ‒ C. 1836-46. 80. Ribar B., Izumi T., Mitra S. The major role of human AP-endonuclease homolog Apn2 in repair of abasic sites in Schizosaccharomyces pombe // Nucleic Acids Res. ‒ 2004. ‒ T. 32, № 1. ‒ C. 115-26. 81. Sander M., Lowenhaupt K., Lane W. S., Rich A. Cloning and characterization of Rrp1, the gene encoding Drosophila strand transferase: carboxy-terminal homology to DNA repair endo/exonucleases // Nucleic Acids Res. ‒ 1991. ‒ T. 19, № 16. ‒ C. 4523-9. 82. Nugent M., Huang S. M., Sander M. Characterization of the apurinic endonuclease activity of Drosophila Rrp1 // Biochemistry. ‒ 1993. ‒ T. 32, № 42. ‒ C. 11445-52. 83. Sander M., Huang S. M. Characterization of the nuclease activity of Drosophila Rrp1 on phosphoglycolate- and phosphate-modified DNA 3'-termini // Biochemistry. ‒ 1995. ‒ T. 34, № 4. ‒ C. 1267-74. 84. Sander M., Benhaim D. Drosophila Rrp1 3'-exonuclease: demonstration of DNA sequence dependence and DNA strand specificity // Nucleic Acids Res. ‒ 1996. ‒ T. 24, № 20. ‒ C. 392633. 85. Linxweiler W., Horz W. Sequence specificity of exonuclease III from E. coli // Nucleic Acids Res. ‒ 1982. ‒ T. 10, № 16. ‒ C. 4845-59. 86. Lowenhaupt K., Sander M., Hauser C., Rich A. Drosophila melanogaster strand transferase. A protein that forms heteroduplex DNA in the absence of both ATP and single-strand DNA binding protein // J Biol Chem. ‒ 1989. ‒ T. 264, № 34. ‒ C. 20568-75. 87. Reardon B. J., Lombardo C. R., Sander M. Drosophila Rrp1 domain structure as defined by limited proteolysis and biophysical analyses // J Biol Chem. ‒ 1998. ‒ T. 273, № 51. ‒ C. 339919. 88. Barzilay G., Hickson I. D. Structure and function of apurinic/apyrimidinic endonucleases // Bioessays. ‒ 1995. ‒ T. 17, № 8. ‒ C. 713-9. 157 89. Masson J. Y., Tremblay S., Ramotar D. The Caenorhabditis elegans gene CeAPN1 encodes a homolog of Escherichia coli and yeast apurinic/apyrimidinic endonuclease // Gene. ‒ 1996. ‒ T. 179, № 2. ‒ C. 291-3. 90. Shatilla A., Ramotar D. Embryonic extracts derived from the nematode Caenorhabditis elegans remove uracil from DNA by the sequential action of uracil-DNA glycosylase and AP (apurinic/apyrimidinic) endonuclease // Biochem J. ‒ 2002. ‒ T. 365, № Pt 2. ‒ C. 547-53. 91. Shatilla A., Leduc A., Yang X., Ramotar D. Identification of two apurinic/apyrimidinic endonucleases from Caenorhabditis elegans by cross-species complementation // DNA Repair (Amst). ‒ 2005. ‒ T. 4, № 6. ‒ C. 655-70. 92. Shatilla A., Ishchenko A. A., Saparbaev M., Ramotar D. Characterization of Caenorhabditis elegans exonuclease-3 and evidence that a Mg2+-dependent variant exhibits a distinct mode of action on damaged DNA // Biochemistry. ‒ 2005. ‒ T. 44, № 38. ‒ C. 12835-48. 93. Yang X., Fan J., Ishchenko A. A., Patel D., Saparbaev M. K., Ramotar D. Functional characterization of the Caenorhabditis elegans DNA repair enzyme APN-1 // DNA Repair (Amst). ‒ 2012. ‒ T. 11, № 10. ‒ C. 811-22. 94. Zakaria C., Kassahun H., Yang X., Labbe J. C., Nilsen H., Ramotar D. Caenorhabditis elegans APN-1 plays a vital role in maintaining genome stability // DNA Repair (Amst). ‒ 2010. ‒ T. 9, № 2. ‒ C. 169-76. 95. Kane C. M., Linn S. Purification and characterization of an apurinic/apyrimidinic endonuclease from HeLa cells // J Biol Chem. ‒ 1981. ‒ T. 256, № 7. ‒ C. 3405-14. 96. Demple B., Herman T., Chen D. S. Cloning and expression of APE, the cDNA encoding the major human apurinic endonuclease: definition of a family of DNA repair enzymes // Proc Natl Acad Sci U S A. ‒ 1991. ‒ T. 88, № 24. ‒ C. 11450-4. 97. Robson C. N., Hickson I. D. Isolation of cDNA clones encoding a human apurinic/apyrimidinic endonuclease that corrects DNA repair and mutagenesis defects in E. coli xth (exonuclease III) mutants // Nucleic Acids Res. ‒ 1991. ‒ T. 19, № 20. ‒ C. 5519-23. 98. Seki S., Hatsushika M., Watanabe S., Akiyama K., Nagao K., Tsutsui K. cDNA cloning, sequencing, expression and possible domain structure of human APEX nuclease homologous to Escherichia coli exonuclease III // Biochim Biophys Acta. ‒ 1992. ‒ T. 1131, № 3. ‒ C. 287-99. 99. Seki S., Ikeda S., Watanabe S., Hatsushika M., Tsutsui K., Akiyama K., Zhang B. A mouse DNA repair enzyme (APEX nuclease) having exonuclease and apurinic/apyrimidinic endonuclease activities: purification and characterization // Biochim Biophys Acta. ‒ 1991. ‒ T. 1079, № 1. ‒ C. 57-64. 158 100. Robson C. N., Milne A. M., Pappin D. J., Hickson I. D. Isolation of cDNA clones encoding an enzyme from bovine cells that repairs oxidative DNA damage in vitro: homology with bacterial repair enzymes // Nucleic Acids Res. ‒ 1991. ‒ T. 19, № 5. ‒ C. 1087-92. 101. Xanthoudakis S., Curran T. Identification and characterization of Ref-1, a nuclear protein that facilitates AP-1 DNA-binding activity // EMBO J. ‒ 1992. ‒ T. 11, № 2. ‒ C. 653-65. 102. Vascotto C., Cesaratto L., Zeef L. A., Deganuto M., D'Ambrosio C., Scaloni A., Romanello M., Damante G., Taglialatela G., Delneri D., Kelley M. R., Mitra S., Quadrifoglio F., Tell G. Genome-wide analysis and proteomic studies reveal APE1/Ref-1 multifunctional role in mammalian cells // Proteomics. ‒ 2009. ‒ T. 9, № 4. ‒ C. 1058-74. 103. Robson C. N., Hochhauser D., Craig R., Rack K., Buckle V. J., Hickson I. D. Structure of the human DNA repair gene HAP1 and its localisation to chromosome 14q 11.2-12 // Nucleic Acids Res. ‒ 1992. ‒ T. 20, № 17. ‒ C. 4417-21. 104. Zhao B., Grandy D. K., Hagerup J. M., Magenis R. E., Smith L., Chauhan B. C., Henner W. D. The human gene for apurinic/apyrimidinic endonuclease (HAP1): sequence and localization to chromosome 14 band q12 // Nucleic Acids Res. ‒ 1992. ‒ T. 20, № 15. ‒ C. 4097-8. 105. Li M., Zhong Z., Zhu J., Xiang D., Dai N., Cao X., Qing Y., Yang Z., Xie J., Li Z., Baugh L., Wang G., Wang D. Identification and characterization of mitochondrial targeting sequence of human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 // J Biol Chem. ‒ 2010. ‒ T. 285, № 20. ‒ C. 14871-81. 106. Strauss P. R., Holt C. M. Domain mapping of human apurinic/apyrimidinic endonuclease. Structural and functional evidence for a disordered amino terminus and a tight globular carboxyl domain // J Biol Chem. ‒ 1998. ‒ T. 273, № 23. ‒ C. 14435-41. 107. Tell G., Quadrifoglio F., Tiribelli C., Kelley M. R. The many functions of APE1/Ref-1: not only a DNA repair enzyme // Antioxid Redox Signal. ‒ 2009. ‒ T. 11, № 3. ‒ C. 601-20. 108. Jackson E. B., Theriot C. A., Chattopadhyay R., Mitra S., Izumi T. Analysis of nuclear transport signals in the human apurinic/apyrimidinic endonuclease (APE1/Ref1) // Nucleic Acids Res. ‒ 2005. ‒ T. 33, № 10. ‒ C. 3303-12. 109. Xanthoudakis S., Miao G. G., Curran T. The redox and DNA-repair activities of Ref-1 are encoded by nonoverlapping domains // Proc Natl Acad Sci U S A. ‒ 1994. ‒ T. 91, № 1. ‒ C. 237. 110. Gros L., Ishchenko A. A., Ide H., Elder R. H., Saparbaev M. K. The major human AP endonuclease (Ape1) is involved in the nucleotide incision repair pathway // Nucleic Acids Res. ‒ 2004. ‒ T. 32, № 1. ‒ C. 73-81. 159 111. Yacoub A., Kelley M. R., Deutsch W. A. The DNA repair activity of human redox/repair protein APE/Ref-1 is inactivated by phosphorylation // Cancer Res. ‒ 1997. ‒ T. 57, № 24. ‒ C. 5457-9. 112. Fritz G., Kaina B. Phosphorylation of the DNA repair protein APE/REF-1 by CKII affects redox regulation of AP-1 // Oncogene. ‒ 1999. ‒ T. 18, № 4. ‒ C. 1033-40. 113. Bhakat K. K., Izumi T., Yang S. H., Hazra T. K., Mitra S. Role of acetylated human APendonuclease (APE1/Ref-1) in regulation of the parathyroid hormone gene // EMBO J. ‒ 2003. ‒ T. 22, № 23. ‒ C. 6299-309. 114. Busso C. S., Iwakuma T., Izumi T. Ubiquitination of mammalian AP endonuclease (APE1) regulated by the p53-MDM2 signaling pathway // Oncogene. ‒ 2009. ‒ T. 28, № 13. ‒ C. 161625. 115. Busso C. S., Lake M. W., Izumi T. Posttranslational modification of mammalian AP endonuclease (APE1) // Cell Mol Life Sci. ‒ 2010. ‒ T. 67, № 21. ‒ C. 3609-20. 116. Kelley M. R., Parsons S. H. Redox regulation of the DNA repair function of the human AP endonuclease Ape1/ref-1 // Antioxid Redox Signal. ‒ 2001. ‒ T. 3, № 4. ‒ C. 671-83. 117. Gorman M. A., Morera S., Rothwell D. G., de La Fortelle E., Mol C. D., Tainer J. A., Hickson I. D., Freemont P. S. The crystal structure of the human DNA repair endonuclease HAP1 suggests the recognition of extra-helical deoxyribose at DNA abasic sites // EMBO J. ‒ 1997. ‒ T. 16, № 21. ‒ C. 6548-58. 118. Dlakic M. Functionally unrelated signalling proteins contain a fold similar to Mg2+dependent endonucleases // Trends Biochem Sci. ‒ 2000. ‒ T. 25, № 6. ‒ C. 272-3. 119. Schein C. H., Ozgun N., Izumi T., Braun W. Total sequence decomposition distinguishes functional modules, "molegos" in apurinic/apyrimidinic endonucleases // BMC Bioinformatics. ‒ 2002. ‒ T. 3. ‒ C. 37. 120. Li M., Wilson D. M., 3rd. Human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 // Antioxid Redox Signal. ‒ 2014. ‒ T. 20, № 4. ‒ C. 678-707. 121. Laskowski M. S. Deoxyribonuclease I // The Enzymes / Boyer P. D. ‒ New York: Academic Press, 1971. ‒ C. 289-311. 122. Mol C. D., Izumi T., Mitra S., Tainer J. A. DNA-bound structures and mutants reveal abasic DNA binding by APE1 and DNA repair coordination // Nature. ‒ 2000. ‒ T. 403, № 6768. ‒ C. 451-6. 123. Cal S., Tan K. L., McGregor A., Connolly B. A. Conversion of bovine pancreatic DNase I to a repair endonuclease with a high selectivity for abasic sites // EMBO J. ‒ 1998. ‒ T. 17, № 23. ‒ C. 7128-38. 160 124. Wilson D. M., 3rd, Takeshita M., Grollman A. P., Demple B. Incision activity of human apurinic endonuclease (Ape) at abasic site analogs in DNA // J Biol Chem. ‒ 1995. ‒ T. 270, № 27. ‒ C. 16002-7. 125. Marenstein D. R., Wilson D. M., 3rd, Teebor G. W. Human AP endonuclease (APE1) demonstrates endonucleolytic activity against AP sites in single-stranded DNA // DNA Repair (Amst). ‒ 2004. ‒ T. 3, № 5. ‒ C. 527-33. 126. Izumi T., Hazra T. K., Boldogh I., Tomkinson A. E., Park M. S., Ikeda S., Mitra S. Requirement for human AP endonuclease 1 for repair of 3'-blocking damage at DNA singlestrand breaks induced by reactive oxygen species // Carcinogenesis. ‒ 2000. ‒ T. 21, № 7. ‒ C. 1329-34. 127. Parsons J. L., Dianova, II, Dianov G. L. APE1 is the major 3'-phosphoglycolate activity in human cell extracts // Nucleic Acids Res. ‒ 2004. ‒ T. 32, № 12. ‒ C. 3531-6. 128. Hegde M. L., Izumi T., Mitra S. Oxidized base damage and single-strand break repair in mammalian genomes: role of disordered regions and posttranslational modifications in early enzymes // Prog Mol Biol Transl Sci. ‒ 2012. ‒ T. 110. ‒ C. 123-53. 129. Suh D., Wilson D. M., 3rd, Povirk L. F. 3'-phosphodiesterase activity of human apurinic/apyrimidinic endonuclease at DNA double-strand break ends // Nucleic Acids Res. ‒ 1997. ‒ T. 25, № 12. ‒ C. 2495-500. 130. Wiederhold L., Leppard J. B., Kedar P., Karimi-Busheri F., Rasouli-Nia A., Weinfeld M., Tomkinson A. E., Izumi T., Prasad R., Wilson S. H., Mitra S., Hazra T. K. AP endonucleaseindependent DNA base excision repair in human cells // Mol Cell. ‒ 2004. ‒ T. 15, № 2. ‒ C. 209-20. 131. Wilson D. M., 3rd. Properties of and substrate determinants for the exonuclease activity of human apurinic endonuclease Ape1 // J Mol Biol. ‒ 2003. ‒ T. 330, № 5. ‒ C. 1027-37. 132. Dyrkheeva N. S., Khodyreva S. N., Sukhanova M. V., Safronov I. V., Dezhurov S. V., Lavrik O. I. 3'-5' exonuclease activity of human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 towards DNAs containing dNMP and their modified analogs at the 3 end of single strand DNA break // Biochemistry (Mosc). ‒ 2006. ‒ T. 71, № 2. ‒ C. 200-10. 133. Dyrkheeva N. S., Lomzov A. A., Pyshnyi D. V., Khodyreva S. N., Lavrik O. I. Efficiency of exonucleolytic action of apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 towards matched and mismatched dNMP at the 3' terminus of different oligomeric DNA structures correlates with thermal stability of DNA duplexes // Biochim Biophys Acta. ‒ 2006. ‒ T. 1764, № 4. ‒ C. 699706. 134. Jiricny J. An APE that proofreads // Nature. ‒ 2002. ‒ T. 415, № 6872. ‒ C. 593-4. 161 135. Barzilay G., Walker L. J., Robson C. N., Hickson I. D. Site-directed mutagenesis of the human DNA repair enzyme HAP1: identification of residues important for AP endonuclease and RNase H activity // Nucleic Acids Res. ‒ 1995. ‒ T. 23, № 9. ‒ C. 1544-50. 136. Vascotto C., Fantini D., Romanello M., Cesaratto L., Deganuto M., Leonardi A., Radicella J. P., Kelley M. R., D'Ambrosio C., Scaloni A., Quadrifoglio F., Tell G. APE1/Ref-1 interacts with NPM1 within nucleoli and plays a role in the rRNA quality control process // Mol Cell Biol. ‒ 2009. ‒ T. 29, № 7. ‒ C. 1834-54. 137. Barnes T., Kim W. C., Mantha A. K., Kim S. E., Izumi T., Mitra S., Lee C. H. Identification of Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1) as the endoribonuclease that cleaves c-myc mRNA // Nucleic Acids Res. ‒ 2009. ‒ T. 37, № 12. ‒ C. 3946-58. 138. Kim W. C., King D., Lee C. H. RNA-cleaving properties of human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1) // Int J Biochem Mol Biol. ‒ 2010. ‒ T. 1, № 1. ‒ C. 12-25. 139. Kim W. C., Berquist B. R., Chohan M., Uy C., Wilson D. M., 3rd, Lee C. H. Characterization of the endoribonuclease active site of human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 // J Mol Biol. ‒ 2011. ‒ T. 411, № 5. ‒ C. 960-71. 140. Hang B., Chenna A., Sagi J., Singer B. Differential cleavage of oligonucleotides containing the benzene-derived adduct, 1,N6-benzetheno-dA, by the major human AP endonuclease HAP1 and Escherichia coli exonuclease III and endonuclease IV // Carcinogenesis. ‒ 1998. ‒ T. 19, № 8. ‒ C. 1339-43. 141. Ishchenko A. A., Sanz G., Privezentzev C. V., Maksimenko A. V., Saparbaev M. Characterisation of new substrate specificities of Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae AP endonucleases // Nucleic Acids Res. ‒ 2003. ‒ T. 31, № 21. ‒ C. 6344-53. 142. Guliaev A. B., Hang B., Singer B. Structural insights by molecular dynamics simulations into specificity of the major human AP endonuclease toward the benzene-derived DNA adduct, pBQ-C // Nucleic Acids Res. ‒ 2004. ‒ T. 32, № 9. ‒ C. 2844-52. 143. Chou K. M., Cheng Y. C. The exonuclease activity of human apurinic/apyrimidinic endonuclease (APE1). Biochemical properties and inhibition by the natural dinucleotide Gp4G // J Biol Chem. ‒ 2003. ‒ T. 278, № 20. ‒ C. 18289-96. 144. Ishchenko A. A., Deprez E., Maksimenko A., Brochon J. C., Tauc P., Saparbaev M. K. Uncoupling of the base excision and nucleotide incision repair pathways reveals their respective biological roles // Proc Natl Acad Sci U S A. ‒ 2006. ‒ T. 103, № 8. ‒ C. 2564-9. 145. Wang Z., Ayoub E., Mazouzi A., Grin I., Ishchenko A. A., Fan J., Yang X., Harihar T., Saparbaev M., Ramotar D. Functional variants of human APE1 rescue the DNA repair defects of the yeast AP endonuclease/3'-diesterase-deficient strain // DNA Repair (Amst). ‒ 2014. ‒ T. 22. ‒ C. 53-66. 162 146. Walker L. J., Robson C. N., Black E., Gillespie D., Hickson I. D. Identification of residues in the human DNA repair enzyme HAP1 (Ref-1) that are essential for redox regulation of Jun DNA binding // Mol Cell Biol. ‒ 1993. ‒ T. 13, № 9. ‒ C. 5370-6. 147. Georgiadis M. M., Luo M., Gaur R. K., Delaplane S., Li X., Kelley M. R. Evolution of the redox function in mammalian apurinic/apyrimidinic endonuclease // Mutat Res. ‒ 2008. ‒ T. 643, № 1-2. ‒ C. 54-63. 148. Holmgren A. Thioredoxin and glutaredoxin systems // J Biol Chem. ‒ 1989. ‒ T. 264, № 24. ‒ C. 13963-6. 149. Su D., Delaplane S., Luo M., Rempel D. L., Vu B., Kelley M. R., Gross M. L., Georgiadis M. M. Interactions of apurinic/apyrimidinic endonuclease with a redox inhibitor: evidence for an alternate conformation of the enzyme // Biochemistry. ‒ 2011. ‒ T. 50, № 1. ‒ C. 82-92. 150. Luo M., Delaplane S., Jiang A., Reed A., He Y., Fishel M., Nyland R. L., 2nd, Borch R. F., Qiao X., Georgiadis M. M., Kelley M. R. Role of the multifunctional DNA repair and redox signaling protein Ape1/Ref-1 in cancer and endothelial cells: small-molecule inhibition of the redox function of Ape1 // Antioxid Redox Signal. ‒ 2008. ‒ T. 10, № 11. ‒ C. 1853-67. 151. Kelley M. R., Georgiadis M. M., Fishel M. L. APE1/Ref-1 role in redox signaling: translational applications of targeting the redox function of the DNA repair/redox protein APE1/Ref-1 // Curr Mol Pharmacol. ‒ 2012. ‒ T. 5, № 1. ‒ C. 36-53. 152. Jayaraman L., Murthy K. G., Zhu C., Curran T., Xanthoudakis S., Prives C. Identification of redox/repair protein Ref-1 as a potent activator of p53 // Genes Dev. ‒ 1997. ‒ T. 11, № 5. ‒ C. 558-70. 153. Helton E. S., Chen X. p53 modulation of the DNA damage response // J Cell Biochem. ‒ 2007. ‒ T. 100, № 4. ‒ C. 883-96. 154. Hanson S., Kim E., Deppert W. Redox factor 1 (Ref-1) enhances specific DNA binding of p53 by promoting p53 tetramerization // Oncogene. ‒ 2005. ‒ T. 24, № 9. ‒ C. 1641-7. 155. Huang L. E., Arany Z., Livingston D. M., Bunn H. F. Activation of hypoxia-inducible transcription factor depends primarily upon redox-sensitive stabilization of its alpha subunit // J Biol Chem. ‒ 1996. ‒ T. 271, № 50. ‒ C. 32253-9. 156. Bristow R. G., Hill R. P. Hypoxia and metabolism. Hypoxia, DNA repair and genetic instability // Nat Rev Cancer. ‒ 2008. ‒ T. 8, № 3. ‒ C. 180-92. 157. Cannito S., Novo E., Compagnone A., Valfre di Bonzo L., Busletta C., Zamara E., Paternostro C., Povero D., Bandino A., Bozzo F., Cravanzola C., Bravoco V., Colombatto S., Parola M. Redox mechanisms switch on hypoxia-dependent epithelial-mesenchymal transition in cancer cells // Carcinogenesis. ‒ 2008. ‒ T. 29, № 12. ‒ C. 2267-78. 163 158. Xanthoudakis S., Smeyne R. J., Wallace J. D., Curran T. The redox/DNA repair protein, Ref-1, is essential for early embryonic development in mice // Proc Natl Acad Sci U S A. ‒ 1996. ‒ T. 93, № 17. ‒ C. 8919-23. 159. Ludwig D. L., MacInnes M. A., Takiguchi Y., Purtymun P. E., Henrie M., Flannery M., Meneses J., Pedersen R. A., Chen D. J. A murine AP-endonuclease gene-targeted deficiency with post-implantation embryonic progression and ionizing radiation sensitivity // Mutat Res. ‒ 1998. ‒ T. 409, № 1. ‒ C. 17-29. 160. McNeill D. R., Wilson D. M., 3rd. A dominant-negative form of the major human abasic endonuclease enhances cellular sensitivity to laboratory and clinical DNA-damaging agents // Mol Cancer Res. ‒ 2007. ‒ T. 5, № 1. ‒ C. 61-70. 161. Izumi T., Brown D. B., Naidu C. V., Bhakat K. K., Macinnes M. A., Saito H., Chen D. J., Mitra S. Two essential but distinct functions of the mammalian abasic endonuclease // Proc Natl Acad Sci U S A. ‒ 2005. ‒ T. 102, № 16. ‒ C. 5739-43. 162. Hadi M. Z., Wilson D. M., 3rd. Second human protein with homology to the Escherichia coli abasic endonuclease exonuclease III // Environ Mol Mutagen. ‒ 2000. ‒ T. 36, № 4. ‒ C. 312-24. 163. Hadi M. Z., Ginalski K., Nguyen L. H., Wilson D. M., 3rd. Determinants in nuclease specificity of Ape1 and Ape2, human homologues of Escherichia coli exonuclease III // J Mol Biol. ‒ 2002. ‒ T. 316, № 3. ‒ C. 853-66. 164. Tsuchimoto D., Sakai Y., Sakumi K., Nishioka K., Sasaki M., Fujiwara T., Nakabeppu Y. Human APE2 protein is mostly localized in the nuclei and to some extent in the mitochondria, while nuclear APE2 is partly associated with proliferating cell nuclear antigen // Nucleic Acids Res. ‒ 2001. ‒ T. 29, № 11. ‒ C. 2349-60. 165. Burkovics P., Szukacsov V., Unk I., Haracska L. Human Ape2 protein has a 3'-5' exonuclease activity that acts preferentially on mismatched base pairs // Nucleic Acids Res. ‒ 2006. ‒ T. 34, № 9. ‒ C. 2508-15. 166. Willis J., Patel Y., Lentz B. L., Yan S. APE2 is required for ATR-Chk1 checkpoint activation in response to oxidative stress // Proc Natl Acad Sci U S A. ‒ 2013. ‒ T. 110, № 26. ‒ C. 10592-7. 167. Gembka A., Toueille M., Smirnova E., Poltz R., Ferrari E., Villani G., Hubscher U. The checkpoint clamp, Rad9-Rad1-Hus1 complex, preferentially stimulates the activity of apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 and DNA polymerase beta in long patch base excision repair // Nucleic Acids Res. ‒ 2007. ‒ T. 35, № 8. ‒ C. 2596-608. 164 168. Ide Y., Tsuchimoto D., Tominaga Y., Nakashima M., Watanabe T., Sakumi K., Ohno M., Nakabeppu Y. Growth retardation and dyslymphopoiesis accompanied by G2/M arrest in APEX2-null mice // Blood. ‒ 2004. ‒ T. 104, № 13. ‒ C. 4097-103. 169. Masani S., Han L., Yu K. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 is the essential nuclease during immunoglobulin class switch recombination // Mol Cell Biol. ‒ 2013. ‒ T. 33, № 7. ‒ C. 1468-73. 170. Berg O. G., Winter R. B., von Hippel P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 1. Models and theory // Biochemistry. ‒ 1981. ‒ T. 20, № 24. ‒ C. 6929-48. 171. Winter R. B., von Hippel P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 2. The Escherichia coli repressor-operator interaction: equilibrium measurements // Biochemistry. ‒ 1981. ‒ T. 20, № 24. ‒ C. 6948-60. 172. Winter R. B., Berg O. G., von Hippel P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 3. The Escherichia coli lac repressor-operator interaction: kinetic measurements and conclusions // Biochemistry. ‒ 1981. ‒ T. 20, № 24. ‒ C. 6961-77. 173. Zharkov D. O., Mechetin G. V., Nevinsky G. A. Uracil-DNA glycosylase: Structural, thermodynamic and kinetic aspects of lesion search and recognition // Mutat Res. ‒ 2010. ‒ T. 685, № 1-2. ‒ C. 11-20. 174. Bennett S. E., Sanderson R. J., Mosbaugh D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration // Biochemistry. ‒ 1995. ‒ T. 34, № 18. ‒ C. 6109-19. 175. Carey D. C., Strauss P. R. Human apurinic/apyrimidinic endonuclease is processive // Biochemistry. ‒ 1999. ‒ T. 38, № 50. ‒ C. 16553-60. 176. Erzberger J. P., Barsky D., Scharer O. D., Colvin M. E., Wilson D. M., 3rd. Elements in abasic site recognition by the major human and Escherichia coli apurinic/apyrimidinic endonucleases // Nucleic Acids Res. ‒ 1998. ‒ T. 26, № 11. ‒ C. 2771-8. 177. Masuda Y., Bennett R. A., Demple B. Dynamics of the interaction of human apurinic endonuclease (Ape1) with its substrate and product // J Biol Chem. ‒ 1998. ‒ T. 273, № 46. ‒ C. 30352-9. 178. Lhomme J., Constant J. F., Demeunynck M. Abasic DNA structure, reactivity, and recognition // Biopolymers. ‒ 1999. ‒ T. 52, № 2. ‒ C. 65-83. 179. Coppel Y., Berthet N., Coulombeau C., Garcia J., Lhomme J. Solution conformation of an abasic DNA undecamer duplex d(CGCACXCACGC) x d(GCGTGTGTGCG): the unpaired thymine stacks inside the helix // Biochemistry. ‒ 1997. ‒ T. 36, № 16. ‒ C. 4817-30. 165 180. Barsky D., Foloppe N., Ahmadia S., Wilson D. M., MacKerell A. D. New insights into the structure of abasic DNA from molecular dynamics simulations // Nucleic Acids Research. ‒ 2000. ‒ T. 28, № 13. ‒ C. 2613-2626. 181. Chen J., Dupradeau F. Y., Case D. A., Turner C. J., Stubbe J. DNA oligonucleotides with A, T, G or C opposite an abasic site: structure and dynamics // Nucleic Acids Res. ‒ 2008. ‒ T. 36, № 1. ‒ C. 253-62. 182. Roll C., Ketterle C., Faibis V., Fazakerley G. V., Boulard Y. Conformations of nicked and gapped DNA structures by NMR and molecular dynamic simulations in water // Biochemistry. ‒ 1998. ‒ T. 37, № 12. ‒ C. 4059-70. 183. Oezguen N., Schein C. H., Peddi S. R., Power T. D., Izumi T., Braun W. A "moving metal mechanism" for substrate cleavage by the DNA repair endonuclease APE-1 // Proteins. ‒ 2007. ‒ T. 68, № 1. ‒ C. 313-23. 184. Tsutakawa S. E., Shin D. S., Mol C. D., Izumi T., Arvai A. S., Mantha A. K., Szczesny B., Ivanov I. N., Hosfield D. J., Maiti B., Pique M. E., Frankel K. A., Hitomi K., Cunningham R. P., Mitra S., Tainer J. A. Conserved structural chemistry for incision activity in structurally nonhomologous apurinic/apyrimidinic endonuclease APE1 and endonuclease IV DNA repair enzymes // J Biol Chem. ‒ 2013. ‒ T. 288, № 12. ‒ C. 8445-55. 185. Barzilay G., Mol C. D., Robson C. N., Walker L. J., Cunningham R. P., Tainer J. A., Hickson I. D. Identification of critical active-site residues in the multifunctional human DNA repair enzyme HAP1 // Nat Struct Biol. ‒ 1995. ‒ T. 2, № 7. ‒ C. 561-8. 186. Rothwell D. G., Hickson I. D. Asparagine 212 is essential for abasic site recognition by the human DNA repair endonuclease HAP1 // Nucleic Acids Res. ‒ 1996. ‒ T. 24, № 21. ‒ C. 421721. 187. Gelin A., Redrejo-Rodriguez M., Laval J., Fedorova O. S., Saparbaev M., Ishchenko A. A. Genetic and biochemical characterization of human AP endonuclease 1 mutants deficient in nucleotide incision repair activity // PLoS One. ‒ 2010. ‒ T. 5, № 8. ‒ C. e12241. 188. Timofeyeva N. A., Koval V. V., Ishchenko A. A., Saparbaev M. K., Fedorova O. S. Lys98 substitution in human AP endonuclease 1 affects the kinetic mechanism of enzyme action in base excision and nucleotide incision repair pathways // PLoS One. ‒ 2011. ‒ T. 6, № 9. ‒ C. e24063. 189. Wilson D. M., 3rd, Takeshita M., Demple B. Abasic site binding by the human apurinic endonuclease, Ape, and determination of the DNA contact sites // Nucleic Acids Res. ‒ 1997. ‒ T. 25, № 5. ‒ C. 933-9. 190. Melo L. F., Mundle S. T., Fattal M. H., O'Regan N. E., Strauss P. R. Role of active site tyrosines in dynamic aspects of DNA binding by AP endonuclease // DNA Repair (Amst). ‒ 2007. ‒ T. 6, № 3. ‒ C. 374-82. 166 191. Weston S. A., Lahm A., Suck D. X-ray structure of the DNase I-d(GGTATACC)2 complex at 2.3 A resolution // J Mol Biol. ‒ 1992. ‒ T. 226, № 4. ‒ C. 1237-56. 192. Beloglazova N. G., Kirpota O. O., Starostin K. V., Ishchenko A. A., Yamkovoy V. I., Zharkov D. O., Douglas K. T., Nevinsky G. A. Thermodynamic, kinetic and structural basis for recognition and repair of abasic sites in DNA by apurinic/apyrimidinic endonuclease from human placenta // Nucleic Acids Res. ‒ 2004. ‒ T. 32, № 17. ‒ C. 5134-46. 193. Shen J. C., Loeb L. A. Mutations in the alpha8 loop of human APE1 alter binding and cleavage of DNA containing an abasic site // J Biol Chem. ‒ 2003. ‒ T. 278, № 47. ‒ C. 469947001. 194. Izumi T., Schein C. H., Oezguen N., Feng Y., Braun W. Effects of backbone contacts 3' to the abasic site on the cleavage and the product binding by human apurinic/apyrimidinic endonuclease (APE1) // Biochemistry. ‒ 2004. ‒ T. 43, № 3. ‒ C. 684-9. 195. de Los Santos C., El-Khateeb M., Rege P., Tian K., Johnson F. Impact of the C1' configuration of abasic sites on DNA duplex structure // Biochemistry. ‒ 2004. ‒ T. 43, № 49. ‒ C. 15349-57. 196. Erzberger J. P., Wilson D. M., 3rd. The role of Mg2+ and specific amino acid residues in the catalytic reaction of the major human abasic endonuclease: new insights from EDTAresistant incision of acyclic abasic site analogs and site-directed mutagenesis // J Mol Biol. ‒ 1999. ‒ T. 290, № 2. ‒ C. 447-57. 197. Izumi T., Malecki J., Chaudhry M. A., Weinfeld M., Hill J. H., Lee J. C., Mitra S. Intragenic suppression of an active site mutation in the human apurinic/apyrimidinic endonuclease // J Mol Biol. ‒ 1999. ‒ T. 287, № 1. ‒ C. 47-57. 198. Beernink P. T., Segelke B. W., Hadi M. Z., Erzberger J. P., Wilson D. M., 3rd, Rupp B. Two divalent metal ions in the active site of a new crystal form of human apurinic/apyrimidinic endonuclease, Ape1: implications for the catalytic mechanism // J Mol Biol. ‒ 2001. ‒ T. 307, № 4. ‒ C. 1023-34. 199. Harding M. M. Geometry of metal-ligand interactions in proteins // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. ‒ 2001. ‒ T. 57, № Pt 3. ‒ C. 401-11. 200. Harding M. M. Small revisions to predicted distances around metal sites in proteins // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. ‒ 2006. ‒ T. 62, № Pt 6. ‒ C. 678-82. 201. Yang W. An equivalent metal ion in one- and two-metal-ion catalysis // Nat Struct Mol Biol. ‒ 2008. ‒ T. 15, № 11. ‒ C. 1228-31. 202. Vipond I. B., Baldwin G. S., Halford S. E. Divalent metal ions at the active sites of the EcoRV and EcoRI restriction endonucleases // Biochemistry. ‒ 1995. ‒ T. 34, № 2. ‒ C. 697704. 167 203. Gao R., Huang S. Y., Marchand C., Pommier Y. Biochemical characterization of human tyrosyl-DNA phosphodiesterase 2 (TDP2/TTRAP): a Mg(2+)/Mn(2+)-dependent phosphodiesterase specific for the repair of topoisomerase cleavage complexes // J Biol Chem. ‒ 2012. ‒ T. 287, № 36. ‒ C. 30842-52. 204. Masuda Y., Bennett R. A., Demple B. Rapid dissociation of human apurinic endonuclease (Ape1) from incised DNA induced by magnesium // J Biol Chem. ‒ 1998. ‒ T. 273, № 46. ‒ C. 30360-5. 205. Oezguen N., Mantha A. K., Izumi T., Schein C. H., Mitra S., Braun W. MD simulation and experimental evidence for Mg(2)+ binding at the B site in human AP endonuclease 1 // Bioinformation. ‒ 2011. ‒ T. 7, № 4. ‒ C. 184-98. 206. Lipton A. S., Heck R. W., Primak S., McNeill D. R., Wilson D. M., 3rd, Ellis P. D. Characterization of Mg2+ binding to the DNA repair protein apurinic/apyrimidic endonuclease 1 via solid-state 25Mg NMR spectroscopy // J Am Chem Soc. ‒ 2008. ‒ T. 130, № 29. ‒ C. 933241. 207. McNeill D. R., Narayana A., Wong H. K., Wilson D. M., 3rd. Inhibition of Ape1 nuclease activity by lead, iron, and cadmium // Environ Health Perspect. ‒ 2004. ‒ T. 112, № 7. ‒ C. 799804. 208. Manvilla B. A., Pozharski E., Toth E. A., Drohat A. C. Structure of human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 with the essential Mg2+ cofactor // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. ‒ 2013. ‒ T. 69, № Pt 12. ‒ C. 2555–62. 209. Nguyen L. H., Barsky D., Erzberger J. P., Wilson D. M., 3rd. Mapping the protein-DNA interface and the metal-binding site of the major human apurinic/apyrimidinic endonuclease // J Mol Biol. ‒ 2000. ‒ T. 298, № 3. ‒ C. 447-59. 210. He H., Chen Q., Georgiadis M. M. High-Resolution Crystal Structures Reveal Plasticity in the Metal Binding Site of Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease I // Biochemistry. ‒ 2014. 211. Jeltsch A., Alves J., Wolfes H., Maass G., Pingoud A. Substrate-assisted catalysis in the cleavage of DNA by the EcoRI and EcoRV restriction enzymes // Proc Natl Acad Sci U S A. ‒ 1993. ‒ T. 90, № 18. ‒ C. 8499-503. 212. Gottlin E. B., Rudolph A. E., Zhao Y., Matthews H. R., Dixon J. E. Catalytic mechanism of the phospholipase D superfamily proceeds via a covalent phosphohistidine intermediate // Proc Natl Acad Sci U S A. ‒ 1998. ‒ T. 95, № 16. ‒ C. 9202-7. 213. Suck D., Oefner C. Structure of DNase I at 2.0 A resolution suggests a mechanism for binding to and cutting DNA // Nature. ‒ 1986. ‒ T. 321, № 6070. ‒ C. 620-5. 168 214. Beese L. S., Steitz T. A. Structural basis for the 3'-5' exonuclease activity of Escherichia coli DNA polymerase I: a two metal ion mechanism // EMBO J. ‒ 1991. ‒ T. 10, № 1. ‒ C. 2533. 215. Mundle S. T., Fattal M. H., Melo L. F., Coriolan J. D., O'Regan N. E., Strauss P. R. Novel role of tyrosine in catalysis by human AP endonuclease 1 // DNA Repair (Amst). ‒ 2004. ‒ T. 3, № 11. ‒ C. 1447-55. 216. Mundle S. T., Delaney J. C., Essigmann J. M., Strauss P. R. Enzymatic mechanism of human apurinic/apyrimidinic endonuclease against a THF AP site model substrate // Biochemistry. ‒ 2009. ‒ T. 48, № 1. ‒ C. 19-26. 217. Gerlt J. A. Mechanistic Principles of Enzyme-catalyzed Cleavage of Phosphodiester Bonds // Nucleases / Linn S. M. и др. ‒ NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press 1993. ‒ C. 1-34. 218. Strauss P. R., Beard W. A., Patterson T. A., Wilson S. H. Substrate binding by human apurinic/apyrimidinic endonuclease indicates a Briggs-Haldane mechanism // J Biol Chem. ‒ 1997. ‒ T. 272, № 2. ‒ C. 1302-7. 219. Lucas J. A., Masuda Y., Bennett R. A., Strauss N. S., Strauss P. R. Single-turnover analysis of mutant human apurinic/apyrimidinic endonuclease // Biochemistry. ‒ 1999. ‒ T. 38, № 16. ‒ C. 4958-64. 220. Maher R. L., Bloom L. B. Pre-steady-state kinetic characterization of the AP endonuclease activity of human AP endonuclease 1 // J Biol Chem. ‒ 2007. ‒ T. 282, № 42. ‒ C. 30577-85. 221. Berg O. G., Vonhippel P. H. Diffusion-Controlled Macromolecular Interactions // Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. ‒ 1985. ‒ T. 14. ‒ C. 131-160. 222. Halford S. E., Marko J. F. How do site-specific DNA-binding proteins find their targets? // Nucleic Acids Research. ‒ 2004. ‒ T. 32, № 10. ‒ C. 3040-3052. 223. Timofeyeva N. A., Koval V. V., Knorre D. G., Zharkov D. O., Saparbaev M. K., Ishchenko A. A., Fedorova O. S. Conformational dynamics of human AP endonuclease in base excision and nucleotide incision repair pathways // J Biomol Struct Dyn. ‒ 2009. ‒ T. 26, № 5. ‒ C. 637-52. 224. Тимофеева Н. А., Коваль В. В., Ищенко А. А., Сапарбаев М. К., Федорова О. С. Кинетический механизм действия апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека в процессе инцизионной репарации нуклеотидов // Биохимия. ‒ 2011. ‒ T. 76, № 2. ‒ C. 333344. 225. Schermerhorn K. M., Delaney S. Transient-State Kinetics of Apurinic/Apyrimidinic (AP) Endonuclease 1 Acting on an Authentic AP Site and Commonly Used Substrate Analogs: The Effect of Diverse Metal Ions and Base Mismatches // Biochemistry. ‒ 2013. ‒ T. 52, № 43. ‒ C. 7669-7677. 169 226. Moore D. H., Michael H., Tritt R., Parsons S. H., Kelley M. R. Alterations in the expression of the DNA repair/redox enzyme APE/ref-1 in epithelial ovarian cancers // Clinical Cancer Research. ‒ 2000. ‒ T. 6, № 2. ‒ C. 602-609. 227. Robertson K. A., Bullock H. A., Xu Y., Tritt R., Zimmerman E., Ulbright T. M., Foster R. S., Einhorn L. H., Kelley M. R. Altered expression of Ape1/ref-1 in germ cell tumors and overexpression in NT2 cells confers resistance to bleomycin and radiation // Cancer Res. ‒ 2001. ‒ T. 61, № 5. ‒ C. 2220-5. 228. Abbotts R., Madhusudan S. Human AP endonuclease 1 (APE1): from mechanistic insights to druggable target in cancer // Cancer Treat Rev. ‒ 2010. ‒ T. 36, № 5. ‒ C. 425-35. 229. Yu E., Gaucher S. P., Hadi M. Z. Probing Conformational Changes in Ape1 during the Progression of Base Excision Repair // Biochemistry. ‒ 2010. ‒ T. 49, № 18. ‒ C. 3786-3796. 230. Handbook of biochemistry and molecular biology / Cост. Fasman G. D. ‒ Cleveland: CRC Press, 1975. ‒ 589 с. 231. Hoehn S. T., Turner C. J., Stubbe J. Solution structure of an oligonucleotide containing an abasic site: evidence for an unusual deoxyribose conformation // Nucleic Acids Res. ‒ 2001. ‒ T. 29, № 16. ‒ C. 3413-23. 232. Molecular cloning: a laboratory manual. / Sambrook J., Russell D. W. ‒ Cold Spring Harbour, New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001. 233. Основы ферментативной кинетики. / Корниш-Боуден Э. ‒ Москва: "МИР", 1979. 234. Volkenstein M. V., Goldstein B. N. Allosteric enzyme models and their analysis by the theory of graphs // Biochim Biophys Acta. ‒ 1966. ‒ T. 115, № 2. ‒ C. 478-85. 235. Koshland D. E., Jr. The active site and enzyme action // Adv Enzymol Relat Subj Biochem. ‒ 1960. ‒ T. 22. ‒ C. 45-97. 236. Fedorova O. S., Nevinsky G. A., Koval V. V., Ishchenko A. A., Vasilenko N. L., Douglas K. T. Stopped-flow kinetic studies of the interaction between Escherichia coli Fpg protein and DNA substrates // Biochemistry. ‒ 2002. ‒ T. 41, № 5. ‒ C. 1520-8. 237. Koval V. V., Kuznetsov N. A., Zharkov D. O., Ishchenko A. A., Douglas K. T., Nevinsky G. A., Fedorova O. S. Pre-steady-state kinetics shows differences in processing of various DNA lesions by Escherichia coli formamidopyrimidine-DNA glycosylase // Nucleic Acids Res. ‒ 2004. ‒ T. 32, № 3. ‒ C. 926-35. 238. Kuznetsov N. A., Koval V. V., Zharkov D. O., Nevinsky G. A., Douglas K. T., Fedorova O. S. Kinetics of substrate recognition and cleavage by human 8-oxoguanine-DNA glycosylase // Nucleic Acids Res. ‒ 2005. ‒ T. 33, № 12. ‒ C. 3919-31. 239. Быстрые реакции в растворе. / Колдин Е. ‒ Москва: МИР, 1966. 170 240. Kuznetsov N. A., Vorobjev Y. N., Krasnoperov L. N., Fedorova O. S. Thermodynamics of the multi-stage DNA lesion recognition and repair by formamidopyrimidine-DNA glycosylase using pyrrolocytosine fluorescence-stopped-flow pre-steady-state kinetics // Nucleic Acids Res. ‒ 2012. ‒ T. 40, № 15. ‒ C. 7384-92. 241. Takeshita M., Chang C. N., Johnson F., Will S., Grollman A. P. Oligodeoxynucleotides containing synthetic abasic sites. Model substrates for DNA polymerases and apurinic/apyrimidinic endonucleases // J Biol Chem. ‒ 1987. ‒ T. 262, № 21. ‒ C. 10171-9. 242. Law S. M., Eritja R., Goodman M. F., Breslauer K. J. Spectroscopic and calorimetric characterizations of DNA duplexes containing 2-aminopurine // Biochemistry. ‒ 1996. ‒ T. 35, № 38. ‒ C. 12329-37. 243. Jean J. M., Hall K. B. 2-Aminopurine electronic structure and fluorescence properties in DNA // Biochemistry. ‒ 2002. ‒ T. 41, № 44. ‒ C. 13152-61. 244. Sowers L. C., Fazakerley G. V., Eritja R., Kaplan B. E., Goodman M. F. Base pairing and mutagenesis: observation of a protonated base pair between 2-aminopurine and cytosine in an oligonucleotide by proton NMR // Proc Natl Acad Sci U S A. ‒ 1986. ‒ T. 83, № 15. ‒ C. 54348. 245. Stivers J. T. 2-Aminopurine fluorescence studies of base stacking interactions at abasic sites in DNA: metal-ion and base sequence effects // Nucleic Acids Res. ‒ 1998. ‒ T. 26, № 16. ‒ C. 3837-44. 246. Kaneda K., Sekiguchi J., Shida T. Role of the tryptophan residue in the vicinity of the catalytic center of exonuclease III family AP endonucleases: AP site recognition mechanism // Nucleic Acids Res. ‒ 2006. ‒ T. 34, № 5. ‒ C. 1552-63. 247. Kanazhevskaya L. Y., Koval V. V., Zharkov D. O., Strauss P. R., Fedorova O. S. Conformational transitions in human AP endonuclease 1 and its active site mutant during abasic site repair // Biochemistry. ‒ 2010. ‒ T. 49, № 30. ‒ C. 6451-61. 248. Kanazhevskaya L. Y., Koval V. V., Vorobjev Y. N., Fedorova O. S. Conformational dynamics of abasic DNA upon interactions with AP endonuclease 1 revealed by stopped-flow fluorescence analysis // Biochemistry. ‒ 2012. ‒ T. 51, № 6. ‒ C. 1306-21. 249. Fagan P. A., Fabrega C., Eritja R., Goodman M. F., Wemmer D. E. NMR study of the conformation of the 2-aminopurine:cytosine mismatch in DNA // Biochemistry. ‒ 1996. ‒ T. 35, № 13. ‒ C. 4026-33. 250. Crick F. H. Codon-anticodon pairing: the wobble hypothesis // J Mol Biol. ‒ 1966. ‒ T. 19, № 2. ‒ C. 548-55. 251. Marathias V. M., Jerkovic B., Bolton P. H. Damage increases the flexibility of duplex DNA // Nucleic Acids Res. ‒ 1999. ‒ T. 27, № 8. ‒ C. 1854-8. 171 252. Kuznetsov N. A., Koval V. V., Zharkov D. O., Vorobjev Y. N., Nevinsky G. A., Douglas K. T., Fedorova O. S. Pre-steady-state kinetic study of substrate specificity of Escherichia coli formamidopyrimidine-DNA glycosylase // Biochemistry. ‒ 2007. ‒ T. 46, № 2. ‒ C. 424-35. 253. Yu E. T., Hadi M. Z. Bioinformatic processing to identify single nucleotide polymorphism that potentially affect Ape1 function // Mutat Res. ‒ 2011. ‒ T. 722, № 2. ‒ C. 140-6. 254. Kanazhevskaya L. Y., Koval V. V., Lomzov A. A., Fedorova O. S. The role of Asn-212 in the catalytic mechanism of human endonuclease APE1: stopped-flow kinetic study of incision activity on a natural AP site and a tetrahydrofuran analogue // DNA Repair (Amst). ‒ 2014. ‒ T. 21. ‒ C. 43-54. 172 Приложение 1 Таблица 1. Основные характеристики кристаллических структур АРЕ1, имеющихся в литературе. PDB ID Разрешение Группа симметрии Детали последовательности белка Число ионов металла в активном центре Кофактор 3+ 2+ Субстрат/лиганд Ссылка 6.2 Gorman M. A. et al., EMBO J,1997 1BIX 2,20 Å С2 NΔ35 APE1 1 1DE8 2,95 Å I41 NΔ40 APE1 1 − 1DE9 3,00 Å P212121 NΔ40 APE1 1 Mn2+ 1DEW 2,65 Å P21 FL(б) APE1 1 − 1E9N 2,20 Å С2 FL APE1 2 Pb2+ − 7.5 1HD7 1,95 Å С2 FL APE1 1 Pb2+ − 4.6 3U8U 2,15 Å P21 FL APE1 1 Sm , Pt Mg2+ − рН(а) 11-звенная дц Fсодержащая ДНК Смесь трех олигонуклеотидов – продуктов гидролиза 9звенной дц Fсодержащей ДНК 15-звенная дц Fсодержащая ДНК − 6.5 6.5 Mol C. D. et al., Nature, 2000 6.5 7.5 Beernink P. T. et al., JMB, 2001 Agarwal R., Naidu M. D, unpublished data, 2011 4IEM 2,39 Å FL APE1 1 Mg2+ Смесь трех олигонуклеотидов – продуктов гидролиза 11звенной дц Fсодержащей ДНК 4LND 1,92 Å С2 NΔ38 APE1 1 Mg2+ − 4QHD 1,65 Å P212121 C138A NΔ40 APE1 1 − − 4QH9 1,40 Å P212121 C138A NΔ40 APE1 1 Mg2+ − 4QHE 2,18 Å P212121 C138A NΔ40 APE1 1 Mn2+ − (а) рН, при котором проводилась кристаллизация; (б) FL – full length (полноразмерная последовательность белка). 6.0 Tsutakawa, S. E. et al., JBC, 2013 7.5 Manvilla B. A. et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2013 6.0 Georgiadis М. M. et al., Biochemistry, 2014
