Федеральная целевая программа «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014—2020 годы» Соглашение 14.626.21.0003 от 17.11.2014 на период 2014 - 2016 гг. Тема: Создание на основе полногеномного анализа и метаболической инженерии промышленных штаммов микроорганизмов суперпродуцентов незаменимых аминокислот и их использование в технологиях производства кормовых добавок для сельского хозяйства Руководитель проекта: заместитель директора ФГУП ГосНИИгенетика по научной работе, д.б.н., профессор А.С. Яненко Науки о жизни Участники проекта Получатель субсидии: ФГУП ГосНИИгенетика • ГосНИИгенетика - ведущий научный центр РФ в области промышленной биотехнологии, органично сочетающий фундаментальные исследования по генетике микроорганизмов с прикладными работами по созданию индустриальных штаммов и разработке инновационных биотехнологий. ГосНИИгенетика ежегодно выполняет НИР в области биотехнологии на сумму Индустриальный партнёр: ЗАО «Завод Премиксов №1» - осуществляет внебюджетное финансирование работ в объеме 40 млн.рублей. Сфера деятельности: производство премиксов для всех видов животных, птицы и рыбы; Организация производства лизин-сульфата и сопутствующих продуктов на основе глубокой переработки зерна. Соисполнители: ФИЦ Биотехнологии РАН Задачи в проекте: секвенирование и анализ геномов базового и мутантных штаммов Brevibacterium flavum – продуцентов лизина, идентификация модификаций генома, приводящих к повышению продукции лизина на основе сравнительной геномики. РХТУ имени Д.И. Менделеева, кафедра биотехнологии - разработка биотехнологии утилизации побочных продуктов переработки зерна пшеницы, образующихся в лизиновом производстве. Соглашение №<номер> 14.626.21.0003 ФЦП ИР 2014-2020 2 Цели и задачи проекта Цель: Создание научно-технического задела в области конструирования на основе полногеномного анализа и метаболической инженерии промышленных штаммов микроорганизмов-суперпродуцентов незаменимых аминокислот, предназначенных для производства кормовых добавок для сельского хозяйства. Задачи: Разработать методы реконструкции генома бактерий Corynebacterium/ Brevibacterium на основе полногеномного секвенирования с помощью метаболической инженерии Создать промышленный штамм-продуцент лизина мирового уровня Разработать технологический процесс изготовления лизина сульфата важнейшей кормовой добавки для животных и птицы Использовать побочные продукты переработки пшеницы (пентозаны) для получения белковой кормовой добавки В результате реализации проекта будет заложена основа создания эффективной кормовой базы для развития отечественного животноводства и птицеводства на основе продуктов биотехнологии. Соглашение №<номер> 14.626.21.0003 ФЦП ИР 2014-2020 3 Ожидаемые результаты проекта 1. Промышленный штамм-продуцент лизина мирового уровня, продуцирующий 210 г лизина\л за 50 час культивирования 2. Технология изготовления кормовой добавки с содержанием лизина сульфата не менее 75% (превышает мировые аналоги) из зерна пшеницы 3. Разработать технологический процесс изготовления белковой кормовой добавки на основе побочные продуктов переработки пшеницы (пентозанов) На основе результатов проекта Индустриальный партнер впервые в России и мировой практике проекта создаст производство незаменимой аминокислоты лизина на основе продуктов переработки зерна пшеницы Соглашение №<номер> 14.626.21.0003 ФЦП ИР 2014-2020 4 Перспективы практического использования • Индустриальный партнер обеспечит внедрение (промышленное освоение) результатов ПНИЭР не позднее 2019 года посредством использования созданного штамма –суперпродуцента лизина и технологии синтеза лизина с использованием штамма на создаваемом в настоящее время заводе по производству лизина по адресу: Белгородская область, Шебекенский район, тер. Биотехнологический центр, Проектная мощность завода: 55 тыс. тонн аминокислотной кормовой добавки в год на сумму 2 млрд. руб. в год. Соглашение №<номер> 14.626.21.0003 ФЦП ИР 2014-2020 5 Гены C. glutamicum, влияющие на конверсию глюкозы в L-лизин Свыше 60 генов контролируют синтез лизина 6 Результаты исследовательской работы, полученные в 2015 г. Схема конструирования продуцента лизина 3 глюкоза 2 ацетат аланин 4 1. Усиление путей биосинтеза лизина; пируват 2. Усиление синтеза предшественников; 2 аммоний оксалоацетат 1 треонин метионин 3. Усиление транспорта сахаров в клетку; 4. Блокирование боковых метаболических путей; аспартат 4 1 лизин 5 5. Усиление транспорта лизина из клетки; бактериальная клетка внешняя среда Соглашение №<номер> 14.626.21.0003 ФЦП ИР 2014-2020 7 Схема конструирования ПЦР и секвенирование Соглашение №<номер> ФЦП ИР 14.626.21.0003 2014-2020 8 Этапы конструирования Исходный штамм Этап 1 – усиление путей биосинтеза лизина Этап 2 – усиление синтеза предшественников лизина Этап 3 – усиление транспорта сахаров в клетку Соглашение №<номер> Генетические изменения lysC – мутации, приводящие к заменам Ala279Thr и Ser317Ala и обеспечивающие устойчивость аспартаткиназы к ингибированию лизином и треонином; hom – мутация, приводящая к замене Gly148Ala и ослаблению активности гомосериндегидрогеназы; pyc – мутация, приводящая к замене Ala455Gly; pck – делеция, приводящая к инактивации гена; icd – мутация в старт-кодоне, снижающая активность гена. lysC – усиление активности гена за счет замены промотора; ddh - усиление активности гена за счет замены промотора; lysA - усиление активности гена за счет замены промотора; dapB - усиление активности гена за счет замены промотора. pyc - усиление активности гена за счет замены промотора; ppc - усиление активности гена за счет замены промотора и введения мутации, приводящей к устойчивости фермента к ингибированию; tkt-оперон (zwf, opcA, tal, tkt, pgl) - усиление активности генов за счет замены промотора; fbp - усиление активности гена за счет замены промотора; aspB - усиление активности гена за счет замены промотора. ptsH – делеция, приводящая к блокированию активности ФТС; iolR (Cgl0157) – мутация, приводящая к инактивации гена; ppgK - усиление активности гена за счет замены промотора; murE – мутация, приводящая к ослаблению активности гена; cspB – делеция, приводящая к инактивации гена. 14.626.21.0003 ФЦП ИР 2014-2020 9 ∆iolR Транспорт глюкозыppgK ∆ptsH ∆cspB murE ∆ pbpA Пентозофосфатный путь tkt-оперон fbp Гликолиз Усиление Ослабление ∆ Удаление lysC ∆ pck hom Биосинтез лизина dapB aspB pyc ppc ЦТК Icd ddh lysA Выброс лизина 10 Мутантные штаммы, полученные в работе Штамм Результаты работы в 2015 г. Генотип Родительский штамм Н44 ∆pck 90 Н40 ∆pck, icd Н44 Н404 ∆pck, icd, sod-lysC Н40 Н56 ∆pck, icd, sod-lysC, sod-tkt Н404 Н60 ∆pck, icd, sod-lysC, sod-tkt, sod-ddh Н56 Н65 ∆pck, icd, sod-lysC, sod-tkt, sod-ddh, leuС-dapB Н60 Н67 ∆pck, icd, sod-lysC, sod-tkt, sod-ddh, leuС-dapB, eftu-fbp Н65 Н77 ∆pck, icd, sod-lysC, sod-tkt, sod-ddh, leuС-dapB, eftu-fbp, sod-lysA Н67 Н57-1 ∆pck, icd, sod-lysC, sod-ddh Н404 Н64 ∆pck, icd, sod-lysC, sod-ddh, sod-tkt Н57-1 Н66-1 ∆pck, icd, sod-lysC, sod-ddh, leuС-dapB Н57-1 Н69-1 ∆pck, icd, sod-lysC, sod-ddh, sod-dapB Н57-1 Н66 ∆pck, icd, sod-lysC, sod-ddh, sod-tkt, leuС-dapB Н64 Н71-1 ∆pck, icd, sod-lysC, sod-ddh, leuС-dapB, sod-lysA Н66-1 Н75 ∆pck, icd, sod-lysC, sod-ddh, leuС-dapB, sod-lysA, sod-tkt Н71-1 Н75-1 ∆pck, icd, sod-lysC, sod-ddh, leuС-dapB, sod-lysA, sod-tkt, sod-pyc Н75 Н79 ∆pck, icd, sod-lysC, sod-tkt, sod-ddh, leuС-dapB, eftu-fbp, sod-lysA, sod-pyc Н75-1 Н75-2 ∆pck, icd, sod-lysC, sod-ddh, leuС-dapB, sod-lysA, sod-tkt, ppc Н75 Н75-3 ∆pck, icd, sod-lysC, sod-ddh, leuС-dapB, sod-lysA, sod-tkt, aspB Н75 Н69 ∆pck, icd, sod-lysC, sod-tkt, sod-ddh, sod-dapB Н60 Н74 ∆pck, icd, sod-lysC, sod-tkt, sod-ddh, sod-dapB, eftu-fbp Н69 Н76 ∆pck, icd, sod-lysC, sod-tkt, sod-ddh, sod-dapB, eftu-fbp, sod-lysA Н74 90 Соглашение №<номер> ФЦП ИР 14.626.21.0003 2014-2020 11 Результаты работы в 2015 г. Сравнительная оценка продуктивности полученных мутантов экспериментах в колбочных а) Рост мутантных штаммов на разных средах Рис.1 в) Удельная продуктивность мутантных штаммов Рис.2 Соглашение №<номер> ФЦП ИР 14.626.21.0003 2014-2020 12 Продуктивность штамма Н115 в 3 л ферментере 250 Лизин, г/л; Рост, ед. ОП 200 150 Лизин Рост 100 50 0 0 10 20 30 40 50 60 Время, час Соглашение №<номер> 14.626.21.0003 ФЦП ИР 2014-2020 13 Результаты работы в 2015 г. Секвенирование геномов базового и мутантного штаммов B.flavum и сравнительный анализ Сравнение результатов секвенирования позволило выявить 377 отличий в геномах базового и мутантного штаммов. Рис. Фрагмент сиквенса штамма B.flavum-90 Соглашение №<номер> 14.626.21.0003 ФЦП ИР 2014-2020 14 Результаты исследовательской работы, полученные в 2015 г. 8. Проведен скрининг штаммов дрожжей, утилизирующих пентозаны (Табл.) Коллекция Культура Ксилоза Табл. Арабиноза РХТУ Saccharomyces cerevisiae --- --- РХТУ Pichia membranifaciens --- --- Отобрано 6 культур из коллекций кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева и ВКПМ: C. tropicalis (РХТУ), P. guilliermondii (ВКПМ), L. scottii ОН-1 (ВКПМ), C. maltose (РХТУ), C. utilis Y-3348 (ВКПМ), T. cutaneum (РХТУ). РХТУ Rhodotorula glutinis +-- --- РХТУ Candida tropicalis +++ +++ РХТУ Candida utilis -++ --- РХТУ Candida maltosa +++ ++- РХТУ Candida guilliermondii +++ --+ РХТУ Trichosporon cutaneum ++- +++ РХТУ Endomycopsis fibuligera --+ -+- ВКПМ Pichia fermentans --- +++ ВКПМ Pichia guilliermondii +++ --+ ВКПМ Leucosporidium scottii OH-1 +++ +-+ ВКПМ Leucosporidium scottii kc-1 ++- --+ ВКПМ Leucosporidium scottii kc-2 +++ --- ВКПМ Leucosporidium scottii +++ +-- ВКПМ Candida utilisВСБ-651 -++ +-+ ВКПМ Candida utilis П-1 +++ +-- ВКПМ Candida utilisY-3348 +-+ +++ ВКПМ Candida utilis Y-624 +++ +-- 9. Проведено глубинное культивирование выбранных штаммов. По совокупности факторов, определяющих продуктивность культуры (активность роста, накопление биомассы, степень потребления РВ, олиго- и полисахаридов пентозан-содержащего сырья, способность потреблять отдельные пентозы (ксилозу и арабинозу)) для дальнейшей работы отобраны L. scottii ОН-1, C. utilisY-3348 Соглашение №<номер> ФЦП ИР 2014-2020 15 7 Планируемое опытно-промышленное производство лизина из зерна пшеницы зерно помол мука отруби клейковина глюкозный сироп гидролизат клейковины штамм-продуцент крахмал глюкоза культуральная жидкость лизин сульфат H2SO4 сушка лизин сульфат Индустриальный партнер - Завод премиксов №1 Первый в России завод по производству аминокислот из зерна пшеницы с помощью ферментации 17 Состояние выполнения запланированных индикаторов № п/п Единица измерения Наименование Значения на 2015 год Запланировано Достигнуто 0 0 Процентов 33,4 44,8 Млн.руб. 17,0 13,520883 Единиц 1 1 2 2 1 6 46 44,4 0 0 1 1 0 0 1 1 Индикаторы 1 2 Число завершенных проектов исследований и разработок, готовых к переходу в стадию опытно-конструкторских работ (опытнотехнологических работ) Доля исследователей в возрасте до 39 лет в общей численности исследователей-участников проекта 3 Объем привлеченных внебюджетных средств 4 Число патентных заявок, поданных по результатам проекта Число публикаций по результатам проекта в научных журналах, индексируемых в базе данных Scopus или в базе данных "Сеть науки" (WEB of Science) Показатели Количество мероприятий по демонстрации и популяризации результатов и достижений науки, в которых приняла участие и 1 представила результаты проекта организация - исполнитель проекта 5 Единиц Единиц Единиц 2 Средний возраст исследователей - участников проекта, не более 3 Число диссертаций на соискание ученых степеней, защищенных по результатам проекта Единиц 4 Количество использованных при проведении исследований разработок в рамках проекта уникальных научных установок Единиц 5 6 Лет и Количество использованных при проведении исследований и разработок объектов зарубежной инфраструктуры сектора исследований и разработок Количество центров коллективного пользования научным оборудованием, научное оборудование которых использовалось при проведении исследований и разработок в рамках проекта Соглашение №<номер> 14.626.21.0003 Единиц Единиц ФЦП ИР 2014-2020 18 Спасибо за внимание! Докладчик: Заместитель директора ФГУП «ГосНИИгенетика» по научной работе, д.б.н., профессор А.С. Яненко Соглашение №<номер> 14.626.21.0003 ФЦП ИР 2014-2020 19