006825 - 1 - Область изобретения Настоящее изобретение

006825
Область изобретения
Настоящее изобретение, главным образом, относится к получению биологически активных молекул, которые существуют в виде неактивных предшественников и in vivo расщепляются протеазами с
получением зрелых биологически активных молекул.
Конкретнее, изобретение относится к получению каспаз и цитокинов, которые продуцируются in
vivo из соответствующих предшественников саморасщеплением, расщеплением другими каспазами или
расщеплением, например, протеазой каспазой-1, также известной как интерлейкин-1-превращающий
фермент (ICE). Примерами цитокинов, продуцирующихся подобным образом, служат интерлейкин-1β и
интерлейкин-18.
Предпосылки изобретения
Каспазы представляют собой семейство цистеиновых протеаз, которые расщепляют свои белкимишени за остатком Asp. Из одиннадцати описанных каспаз каспаза-1 и, возможно, каспазы -4, -5 и -11,
как предполагается, в первую очередь, вовлечены в процессинг провоспалительных цитокинов, тогда как
другие играют решающую роль в инициации и исполнении апоптоза, или запрограммированной клеточной гибели. Каспазы имеют несколько общих черт, в том числе то, что они синтезируются в виде каталитически неактивных зимогенов, активирующихся, главным образом, расщеплением после специфических внутренних остатков Asp, присутствующих в междоменных линкерах, а также способность расщеплять свои субстраты после остатков Asp. В результате, некоторые зрелые активные каспазы, в особенности, полученные из каспаз с длинным продоменом, могут процессировать и активировать самих себя и
другие неактивные зимогены каспаз. Основываясь на первичной структуре, проапоптотические каспазы
можно разделить на два класса: класс I, включающий каспазы -2, -8, -9 и -10, которые содержат длинный
N-концевой продомен, и класс II, включающий каспазы -3, -6 и -7 с коротким или отсутствующим продоменом. Эксперименты по расщеплению in vitro говорят о том, что каспазы II класса требуют для своего протеолитического процессинга наличия активированных каспаз I класса (12).
Другая классификация каспаз разделяет их по специфичности участка расщепления (13). Здесь каспазы I группы содержат консенсусный участок WEHD (каспазы -1, -4 и -5), каспазы II группы - консенсусный участок DexD (каспазы -2, -3 и -7), а каспазы III группы - консенсусный участок (IVL)ExD (каспазы -6, -8 и -9). Оптимальным участком для каспазы-8 является LETD (14).
Интерлейкин-18 (IL-18), первоначально описанный как интерферон-γ (IFN-γ)-индуцирующий фактор, представляет собой недавно охарактеризованный цитокин, имеющий общие структурные черты с
семейством белков IL-1 (1-4). IL-18 первоначально был выделен и впоследствии клонирован из печени
мышей, получавших обработанные теплом Propionobacterium acnes (P.acnes), с последующим введением
липополисахарида (LPS) (2, 5). Также недавно описано клонирование человеческого IL-18 (3).
Как и IL-12, IL-18 продуцируется активированными макрофагами, такими как купферовские клетки
печени и другие немигрирующие макрофаги (3). IL-18 является ранним индуктором ответа Th1, костимулирует продукцию IFN-γ, как и TNF-γ, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего
фактора и IL-2 (6). В дополнение, он усиливает пролиферацию Т-клеток, вызванную антителами против
CD3, и повышает клеточную цитотоксичность, обусловленную естественными киллерами, путем увеличения экспрессии Fas-лиганда (6, 7).
В отличие от большинства других цитокинов, демонстрирующих структуру, свернутую в четыре
спирали, IL-18 и IL-1β имеют β-складчатую листовую структуру (7). Подобно IL-1β, IL-18 синтезируется
в виде биологически неактивного предшественника (proIL-18), лишенного сигнального пептида (3).
Предшественники IL-1β и IL-18 расщепляются каспазой-1 (IL-1β-превращающий фермент или ICE), которая расщепляет после остатка аспарагиновой кислоты в позиции Р1. Образованные зрелые цитокины
легко высвобождаются из клетки (8, 9). Исследования на мышах, дефицитных в отношении каспазы-1,
продемонстрировали важную роль зрелого IL-18 как индуктора IFN-γ и ответов Th1. Инъекция таким
мышам Р.acnes и LPS приводила к низким уровням циркулирующего IFN-γ по сравнению с мышами дикого типа (8, 9). Инъекция IL-18 восстанавливала LPS-индуцированный уровень IFN-γ у мышей, дефицитных по каспазе-1 (9), что служит дальнейшим подтверждением представления о том, что каспаза-1
вовлечена в продукцию активного IL-18. Другие каспазы, особенно те, что расщепляют внутриклеточные
белки, ассоциированные с апоптозом, были по крайней мере в 100 раз менее активны, чем каспаза-1 (9).
Подобные исследования с IL-18-дефицитными мышами выявили его роль в активности NK-клеток и индукции цитокинов (10).
Рекомбинантный IL-1β и мышиный IL-18, экспрессированный в Е. coli, могут быть подвергнуты
рефолдингу с получением полностью активных цитокинов. Попытки экспрессировать зрелую форму человеческого IL-18 в Е. coli или в других хозяевах не привели к получению полностью активного цитокина. По причине его потенциального терапевтического использования, например, при злокачественных
новообразованиях или в любых условиях, когда желательна индукция продукции интерферона-γ, возникает потребность в создании эффективной системы экспрессии для продукции зрелого, биологически
активного человеческого IL-18.
-1-
006825
Сущность изобретения
Настоящее изобретение позволяет получать молекулы, которые в процессе их формирования в природе продуцируются в форме биологически неактивного предшественника и становятся активными после расщепления их предшественника. Последнее не может быть легко осуществлено in vitro.
Настоящее изобретение, таким образом, относится к способу продукции биологически активной
молекулы из ее биологически неактивного предшественника мутацией ее нативного участка расщепления с получением участка, чувствительного к расщеплению обычной протеазой, и расщеплением мутантной молекулы с получением биологически активной молекулы.
Биологически активная молекула представляет собой цитокин, предпочтительно выбранный из IL1β и IL-18.
В данных цитокинах предпочтительным нативным участком расщепления является участок расщепления каспазой-1.
Обычная протеаза, привлеченная для расщепления, может быть выбрана из тромбина, энтерокиназы, субтилизина, гененазы (genenase™; New England Biolabs, Beverly MA, USA), протеазы человеческого
риновируса 3С и протеазы фактора Ха. Когда для расщепления привлекается каспаза, предпочитают каспазу-8.
Применяемый в предпочтительном осуществлении настоящего изобретения способ включает
трансфекцию клеток-хозяев вектором, содержащим ДНК, кодирующую неактивный предшественник
биологически активной молекулы, мутированный в его участке расщепления каспазой-1 с образованием
участка, расщепляемого протеазой, культивирование трансфицированных клеток-хозяев, экспрессирующих указанный предшественник, и выделение биологически активной молекулы после обработки протеазой, причем указанная биологически активная молекула представляет собой цитокин.
Необязательно способ может быть усовершенствован тем, что осуществляют слияние кДНК в рамку считывания после последовательности, кодирующей глутатион-S-трансферазу (GST), и экспрессированные молекулы слияния перед обработкой протеазой задерживают на гранулах глутатион-агарозы.
Настоящее изобретение также описывает кДНК, кодирующую неактивный предшественник биологически активной молекулы, мутированный в нативном участке его расщепления каспазой-1 с образованием участка, расщепляемого протеазой, которую необязательно подвергают слиянию с последовательностью, кодирующей GST. Указанная биологически активная молекула представляет собой цитокин,
выбранный из IL-1β и IL-18.
Согласно настоящему изобретению может быть также осуществлен способ получения и/или очистки рекомбинантного гибридного полипептида или белка слияния. Точнее, фрагмент ДНК, кодирующий
молекулу белка, подлежит слиянию с фрагментом ДНК, кодирующим связывающий белок с использованием в качестве линкерной последовательности ДНК, кодирующей пептидную последовательность, которая распознается и разрезается каспазой. ДНК слияния включают в состав вектора клонирования, который используется для трансформации подходящих клеток. После экспрессии гибридный полипептид
очищают посредством контакта с лигандом или субстратом, к которому обладает специфической аффинностью связывающий белок, например аффинной хроматографией.
В предпочтительном осуществлении данного способа связывающим белком служит GST, а участок
расщепления представляет собой участок расщепления каспазы-8.
Изобретение также относится к биологически активным молекулам, полученным вышеописанным
способом.
Экспрессия зрелого IL-18 в E. coli ведет к возникновению белка, лишенного биологической активности. Дальнейшие попытки провести правильный рефолдинг полипептидного остова IL-18, экспрессированного в E. coli, были безуспешными. Человеческий IL-18 и человеческий IL-1β экспрессируются in
vivo как их предшественники proIL-18 и proIL-1β, которые расщепляются каспазой-1 с получением биологически активных зрелых IL-18 и IL-1β, соответственно. Однако каспаза-1 коммерчески недоступна.
Настоящее изобретение относится к простому способу получения биологически активных молекул в E.
coli, в частности цитокина и, более конкретно, человеческого IL-18. С этой целью конструировали кДНК,
кодирующую человеческий proIL-18, в котором участок расщепления каспазой-1 мутирован с образованием участка расщепления коммерчески доступным белком, например фактором Ха. Для упрощения
манипуляций мутантную кДНК proIL-18 подвергали слиянию с последовательностью, кодирующей
глутатион-S-трансферазу (GST). Полученный белок слияния GST-proIL-18, содержащий участок расщепления фактором Ха, экспрессировали в E. coli и связывали на гранулах глутатион-агарозы. Зрелый человеческий IL-18, проявляющий высокую биологическую активность, освобождали с гранул обработкой
фактором Ха.
Сходным образом в последовательности ДНК, кодирующей человеческий IL-1β, участок расщепления каспазой-1 мутировали с образованием участка расщепления фактором Ха. Для упрощения манипуляций мутантную кДНК proIL-1β подвергали слиянию в рамку считывания с последовательностью, кодирующей глутатион-S-трансферазу (GST). Полученный белок слияния GST-proIL-1β, содержащий уча-2-
006825
сток расщепления фактором Ха, экспрессировали в E. coli и связывали на гранулах глутатион-агарозы.
Зрелый человеческий IL-1β освобождали с гранул обработкой фактором Ха.
Когда для расщепления применяли каспазу-8, выполняли сходную процедуру, с той разницей, что
участок расщепления каспазой-1 человеческого IL-18 или человеческого IL-1β мутировали с образованием участка расщепления каспазой-8. Впоследствии, слияние с последовательностью, кодирующей GST, и
дальнейшие стадии процедуры проводили, как описано выше.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 проиллюстрировано клонирование кДНК, кодирующей мутантный человеческий proIL-18
(proIL-18IEGR). Эту кДНК клонировали в три стадии PCR с использованием метода перекрывающихся
праймеров. Дорожки представляют собой: М, маркеры размеров ДНК, отмеченные с левой стороны; 1,
ДНК длиной в 498 нп, полученная в первой PCR; 2, ДНК длиной в 551 нп, полученная во второй PCR; 3,
ДНК длиной в 600 нп, полученная в третьей PCR и кодирующая человеческий proIL-18IEGR.
На фиг. 2 показана структура экспрессирующей плазмиды pGEX-pro-IL-18IEGR. (а) Фланкирующие
нуклеотидные последовательности BamH I/EcoR I фрагмента кДНК длиной в 600 нп, кодирующего человеческий proIL-18IEGR. Сайты рестрикции BamH I и EcoR I, а также участок связывания фактора Ха показаны скобками. Незакрашенной стрелкой отмечен участок расщепления фактором Ха. (b) Схематическое
представление pGEX-2TK. Также показаны сайты рестрикции. Закрашенной стрелкой обозначен участок
лигирования ВаmН I/EcoR I во вставке.
На фиг. 3 показан SDS-PAGE грубых белковых экстрактов E. coli, экспрессирующей белок слияния
GST-proIL-18IEGR. Дорожки представляют собой: 1 клетки, трансформированные исходной плазмидой
pGEX-2TK без индукции; 2 клетки, трансформированные исходной плазмидой pGEX-2TK и индуцированные 0,1 мМ изопропилтиогалактозида (IPTG). Ожидаемая полоса (26 кДа) глутатионтио-редуктазы
(GST) обозначена стрелкой слева. Дорожкам 3-7 соответствуют клетки, трансформированные плазмидой
pGEX-proIL-18IEGR и неиндуцированные (дорожка 3) или индуцированные IPTG в течение обозначенного
времени. Полоса (43 кДа), помеченная стрелкой справа, соответствует размеру белка слияния GST-proIL18IEGR.
На фиг. 4 показан SDS-PAGE (10% акриламид) белка слияния GST-proIL-18IEGR после очистки на
глутатион-агарозе. Супернатант обработанных ультразвуком бактерий (см. фиг. 3, дорожку 7) подвергали аффинной очистке на глутатион-агарозе. Дорожки представляют собой: 1 маркеры молекулярной массы (отмеченные в кДа с левой стороны); 2 aффинно очищенный GST-proIL-18IEGR. Гель окрашивали кумасси голубым.
На фиг. 5 показан SDS-PAGE (12% акриламид) очищенного человеческого IL-18. Белок слияния
GST-proIL-18IEGR задерживали на гранулах глутатион-агарозы и инкубировали с фактором Ха в качестве
протеазы в соотношении с субстратом 1:50 (маc./маc.); супернатант анализировали через 6 ч. Дорожка 1,
маркеры молекулярной массы, помеченной в кДа с левой стороны; дорожка 2. Человеческий IL-18 в супернатанте от гранул глутатион-агарозы. Гель окрашивали кумасси голубым.
На фиг. 6 показано исследование биологической активности человеческого IL-18. Человеческий IL18 в обозначенных дозах добавляли к культурам не прилипающих к пластику мышиных спленоцитов
(5х106 клеток/лунка) в присутствии конканавалина А (0,125 мкг/мл) и полимиксина В (1 мкг/мл). Супернатант исследовали на предмет наличия интерферона-гамма посредством ELISA. Уровень интерферонагамма, индуцированный IL-18 (100 нг/мл) в отсутствии Con А, составлял 160 пг/мл.
На фиг. 7 показана в схематичной форме процедура очистки hIL-18 с использованием каспазы-8.
На фиг. 8 показана последовательность GST-pro-hIL-18LETD. Рамкой отмечен участок расщепления
каспазой-8. Подчеркнутая последовательность представляет зрелый hIL-18.
На фиг. 9 показан окрашенный кумасси голубым SDS-PAGE (10% акриламидный гель), отражающий очистку белка слияния GST-pro-hIL-18LETD на глутатион-агарозе. Супернатант разрушенных клеток
рекомбинантной E. coli JM109, экспрессирующей GST-pro-hIL-18LETD, аффинно очищали на глутатионагарозе и обрабатывали каспазой-8 на твердой фазе. Супернатант, полученный после обработки, концентрировали и разделяли по размерам молекул на Superdex-75. Дорожки представляют собой: 1 маркеры
молекулярной массы (обозначена в кДа с левой стороны); 2 супернатант разрушенных клеток; 3 аффинно
очищенный GST-pro-hIL-18LETD; 4 глутатион-агарозная смола после твердофазной обработки каспазой-8
в течение 4 ч; 5 концентрированный результат обработки каспазой-8 в течение 4 ч; 6 фракция чистого
hIL-18 с Superdex-75.
Подробное описание изобретения
Согласно настоящему изобретению получена кДНК, кодирующая человеческий proIL-18, в котором
участок расщепления каспазой-1 мутирован с образованием участка фактора Ха. Можно использовать
другие мутации с образованием участков, подходящих для других протеаз.
Примеры возможных участков расщепления и подходящих протеаз включают
Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser (SEQ ID NO:1), последовательность, расщепляемую между аминокислотами Arg и Gly протеазой тромбином;
-3-
006825
Ile-Glu-Gly-Arg- (SEQ ID NО:2), последовательность, расщепляемую после остатка Arg протеазой
фактором Ха;
Asp-Asp-Asp-Lys- (SEQ ID NО:3), последовательность, расщепляемую после остатка Lys протеазой
энтерокиназой;
His-Tyr- (SEQ ID NО:4), последовательность, расщепляемую после остатка Туr протеазой субтилизином в его варианте Genenase™ (New England Biolabs);
Tyr-His- (SEQ ID NО:5), последовательность, расщепляемую после остатка Туr протеазой субтилизином в его варианте Genenase™ (New England Biolabs);
Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro (SEQ ID NO:6), последовательность, расщепляемую после остатка
Gln протеазой человеческого риновируса 3С.
Подобным образом, получена кДНК, кодирующая человеческий proIL-1β, в котором участок расщепления каспазой-1 мутирован с образованием участка фактора Ха. Можно использовать другие мутации с образованием участков, подходящих для других протеаз.
Примеры возможных участков расщепления и подходящих протеаз включают
Ile-Glu-Gly-Arg- (SEQ ID NO:2), последовательность, расщепляемую после остатка Arg протеазой
фактором Ха;
Asp-Asp-Asp-Lys- (SEQ ID NО:3), последовательность, расщепляемую после остатка Lys протеазой
энтерокиназой;
Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro (SEQ ID NO:6), последовательность, расщепляемую после остатка
Gln протеазой человеческого риновируса 3С.
Выбор мутации зависит от следующих параметров: участок расщепления, образованный мутацией,
должен быть очень специфичным, чтобы избежать нежелательного расщепления в других участках полипептидного остова proIL-18 или proIL-1β; протеаза должна проявлять высокий уровень специфичности
в отношении сконструированного участка расщепления; протеаза должна быть легко доступна, например, из коммерческих источников; и мутация не должна вызывать большие изменения во вторичной или
третичной структуре proIL-18 или proIL-1β. Использование фактора Ха, энтерокиназы или субтилизина
является предпочтительным перед другими протеазами, поскольку полученные в результате IL-18 или
IL-1β не имеют мутированных аминокислот. Использование фактора Ха наиболее предпочтительно, поскольку оно требует наиболее консервативных мутаций, таким образом понижая риск изменения вторичной или третичной структуры proIL-18 или proIL-1β и риск того, что расщепление не будет иметь
место. Использование фактора Ха или энтерокиназы является предпочтительным перед другими протеазами, поскольку полученные в результате IL-18 или IL-1β не имеют мутированных аминокислот.
Для того чтобы сконструировать кДНК, кодирующую человеческий мутантный proIL-18 (proIL18IEGR), в котором участок расщепления каспазой-1 мутирован с образованием участка расщепления фактором Ха, в кДНК человеческого proIL-18 вводили следующие мутации: L33I; S35G и D36R. Эти мутации составили последовательность IEGR, распознаваемую фактором Ха.
Вектор, экспрессирующий человеческий proIL-18IEGR, конструировали следующим образом. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) здорового донора стимулировали бактериальным
липополисахаридом (LPS). Из клеток выделяли общую РНК. РНК подвергали обратной транскрипции и
полученную ДНК использовали в качестве шаблона в полимеразной цепной реакции (PCR). Мутацию
вводили в последовательность с использованием перекрывающихся праймеров в три стадии PCR (фиг. 1).
Полученный продукт PCR длиной в 600 нп, кодирующий мутантный человеческий proIL-18, клонировали в клонирующий вектор ТА (pGEM-T easy, Promega) и последовательность его ДНК подтверждали
ДНК-секвенированием. Полученную плазмиду pGEM-T-proIL-18IEGR расщепляли EcoR I и ВаmН I и
фрагмент длиной 600 нп, кодирующий человеческий proIL-18IEGR, субклонировали в прокариотическом
экспрессирующем векторе pGEX-2TK, содержащем последовательность гена GST (Pharmacia). Полученный экспрессирующий вектор, содержащий последовательность гена человеческого proIL-18IEGR, подвергали слиянию в рамку считывания к 3'-концу гена GST (фиг. 2).
Затем проводили экспрессию и очистку GST-proIL-18IEGR. Свежую единичную колонию E. coli
JM109, трансформированную плазмидой pGEM-T-proIL-18IEGR, выращивали при встряхивании при 37°С
до достижения оптической плотности 0,6 при 600 нм. Затем экспрессию белка индуцировали изопропилтиогалактозидом (IPTG) и культивировали далее при 37°С в течение 3 ч. С помощью SDS-PAGE общего
бактериального белка была выявлена индукция белка массой 43 кДа, по размерам соответствующего
GST-proIL-18IEGR (фиг. 3). Все последующие стадии выделения GST-proIL-18IEGR проводили при 4°С.
Бактерии собирали центрифугированием, ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем ингибиторы протеаз. Бактерии лизировали обработкой ультразвуком, добавляли Triton X-100 до
конечной концентрации 1% и смешивали очищенный лизат с гранулами глутатион-агарозы (Pharmacia).
Гранулы отмывали и анализировали их аликвоту с помощью SDS-PAGE. При этом была обнаружена
единственная полоса на 43 кДа, соответствующая белку слияния GST-proIL-18IEGR (фиг. 4). Гранулы затем обрабатывали фактором Ха и собирали супернатант. SDS-PAGE супернатанта характеризовался
большой полосой примерно на 18 кДа, что согласовывалось с ожидаемой массой зрелого человеческого
-4-
006825
IL-18. Кроме того, наблюдалась дополнительная, более слабая полоса на 19,5 кДа (фиг. 5). Анализ белковой последовательности полос на 18 и 19,5 кДа в обоих случаях показал наличие ожидаемой N-концевой
последовательности зрелого человеческого IL-18. Полоса на 43 кДа, соответствующая белку слияния
GST-proIL-18IEGR, еще присутствовала на SDS-PAGE гранул глутатион-агарозы после их обработки протеазой, что отражало неполное расщепления (не показано).
Рекомбинантный человеческий IL-18 тестировали в отношении биологической активности на мышиных спленоцитах на основании их способности индуцировать экспрессию интерферона-гамма. Инкубация не связанных с поверхностью мышиных спленоцитов только с человеческим IL-18 выявила малую
продукцию IFN-гамма, что наводило на мысль о необходимости костимулятора. Только Con A при 0,125
мкг/мл не вызывал индукции IFN-γ на значимом уровне. Когда не связанные с поверхностью спленоциты
инкубировали с Con А и IL-18, полученным согласно настоящему изобретению, достигали индукции
IFN-γ, зависимой от дозы (фиг. 6).
Для того чтобы сконструировать кДНК, кодирующую человеческий мутантный proIL-1β (proIL1βEGR), в котором участок расщепления каспазой-1 мутирован с образованием участка расщепления фактором Ха, в кДНК человеческого proIL-1β вводят следующие мутации: Y113I, V114G, H115R и D116R.
Эти мутации составляют последовательность IEGR, распознаваемую фактором Ха.
Чтобы сконструировать вектор, экспрессирующий человеческий proIL-1βIEGR, осуществляют следующие стадии. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) здорового донора стимулируют
бактериальным липополисахаридом (LPS). Из клеток выделяют общую РНК. РНК подвергают обратной
транскрипции и полученную ДНК используют в качестве шаблона в полимеразной цепной реакции
(PCR) с праймерами, соответствующими кодирующей последовательности человеческого IL-1β. Полученный продукт PCR клонируют в клонирующий вектор ТА, например «pGEM-T easy» от Promega, и
затем подвергают сайт-специфическому мутагенезу подходящими олигонуклеотидами. Последовательность полученного вектора подтверждают ДНК-секвенированием. Полученную плазмиду pGEM-T-proIL1βIEGR расщепляют надлежащими ферментами рестрикции и фрагмент длиной примерно 820 нп, кодирующий человеческий proIL-1βIEGR, субклонируют в прокариотическом экспрессирующем векторе
pGEX-2TK, содержащем последовательность гена GST (Pharmacia). Полученный экспрессирующий вектор содержит последовательность гена человеческого proIL-1βIEGR, подвергнутого слиянию в рамку считывания с 3'-концом гена GST.
Экспрессию и очистку GST-proIL-1βIEGR проводят сходным образом. Свежую единичную колонию
E. coli JM109, трансформированную плазмидой pGEM-T-proIL-1βIEGR, выращивают при встряхивании
при 37°С до достижения оптической плотности 0,6 при 600 нм. Затем экспрессию белка индуцируют
изопропилтиогалактозидом (IPTG) и культивируют далее при 37°С в течение 3 ч. С помощью SDS-PAGE
общего бактериального белка выявляют индукцию белка массой ~52 кДа по размерам соответствующего
GST-proIL-1βIEGR. Все последующие стадии выделения GST-proIL-1βIEGR проводят при 4°С. Бактерии
собирают центрифугированием, ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем ингибиторы протеаз. Бактерии лизируют обработкой ультразвуком, добавляют Triton X-100 до конечной концентрации 1% и смешивают очищенный лизат с гранулами глутатион-агарозы (Pharmacia). Гранулы отмывают и анализируют их аликвоту с помощью SDS-PAGE на присутствие белка слияния GST-proIL1βIEGR массой ~52 кДа. Затем гранулы обрабатывают фактором Ха и собирают супернатант, содержащий
зрелый человеческий IL-1β.
В другом осуществлении настоящего изобретения экспрессию и очистку полипептида проводят посредством продукции белка слияния, содержащего участок расщепления каспазой. Плазмиду, экспрессирующую связывающий пептид в слиянии с интересующим белком, можно мутировать так, что
участок расщепления каспазой будет введен в позиции, удобной для очистки активного полипептида.
Участки распознавания каспазы составляют 4 аминокислоты, последней из которых является аспарагиновая кислота. В целом, каспазы проявляют более высокую и отличную от обычно используемых
протеаз специфичность участков расщепления и имеют значительные преимущества перед ранее описанными протеазами, будучи удобными для расщепления пептидов слияния. Пример процедуры очистки
приведен на фиг. 7.
Предпочтительные участки расщепления для каждой каспазы описаны в литературе (Ann. Rev. Biochem.,
1999, 68:383-424). Все они обычно содержат остаток Asp в позиции P1.
Описанную выше плазмиду pGEM-T-proIL-18IEGR модифицировали с получением другого мутантного человеческого proIL-18 (proIL-18LETD, см. фиг. 8), в котором участок расщепления фактором Ха мутируют с образованием участка расщепления каспазой-8. Это позволяет использовать для расщепления
каспазу-8.
Другим преимуществом использования каспазы является ее высокая эффективность в отношении
выхода и времени расщепления. Было обнаружено, что при сравнении количества белка IL-18, полученного от pGEM-T-proIL-18IEGR и pGEM-T-proIL-18LETD, количество фермента и время, необходимые для
получения 1 мг hIL-18, уменьшаются. Процедура приводит к продукции белка с ожидаемым размером
(фиг. 9) и биологической активностью.
-5-
006825
Каспаза-8 не является единственной применимой каспазой, и, в зависимости от наличия или отсутствия участка расщепления специфической каспазой в интересующем в плане очистки белке или от любых других критериев, можно использовать мутации, соответствующие участкам расщепления любой
другой каспазой.
Каспазу можно отделить от интересующего белка с использованием стандартных способов очистки,
таких как, например, гель-фильтрация или ионообменная хроматография.
В заключение, описанный здесь способ позволяет получать из E. coli очищенные, биологически активные человеческие белки, такие как IL-18 и IL-1β. Оказывается, что для правильного фолдинга этих
цитокинов требуется их экспрессия вначале в форме предшественников и затем расщепление до их зрелой формы.
Человеческий IL-18 в этом отношении отличается от мышиного IL-18, который может экспрессироваться в бактериальных клетках в виде зрелого, биологически активного цитокина.
Теперь изобретение будет проиллюстрировано следующими, не ограничивающими его, примерами.
Пример 1. Конструирование плазмиды, кодирующей человеческий proIL-18 с участком фактора Ха.
РМВС получали из периферической крови здорового добровольца разделением на градиенте плотности Ficoll-Paque PLUS (Pharmacia). Затем РМВС дважды отмывали ледяным PBS, содержащим 2%
FBS, и ресуспендировали до 2,5х106 клеток/мл в среде RPMI-1640, дополненной фетальной бычьей сывороткой (FBS), 2 мМ L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина (RPMI-10).
Культуру стимулировали LPS (1 мкг/мл, 3 ч, 37°С). Общую РНК экстрагировали из клеток с помощью
TriPure™ Isolation Reagent (Boehringer Mannheim) согласно инструкции производителя.
кДНК proIL-18IEGR конструировали путем трехстадийной PCR с использование метода перекрывающихся праймеров. Различные праймеры создавали на основе кДНК человеческого proIL-18 (GenBank accession no. D49950, (3)).
Для первой PCR прямым праймером являлся следующий:
5'-AACATCGAAGGTCGTTACTTTGGCAAGCTTGAATC-3' (SEQ ID NO:7), a обратным праймером
был 5'-CGCGAATTCCTAGTCTTCGTTTTGAACAGT-3' (SEQ ID NO:8). Сайт Eco RI входил в состав обратного праймера. Шаблоном служила подвергнутая обратной транскрипции общая клеточная РНК, выделенная из РВМС, стимулированных LPS. Условия термоцикла были следующими: 10 циклов (94°С, 30 с;
55°С, 30 с и 68°С, 2 мин), после чего следовали 25 циклов (94°С, 30 с; 55°С, 30 с и 68°С, 125 с/цикл). Полученный продукт PCR длиной 498 нп амплифицировали на следующей стадии PCR, используя перекрывающийся прямой праймер
5'-TGGCAATGAAATTTATTGACAATACGCTTTACTTTATAGCTGAAGATGATGAAAACATCGA
AGGTCGTTACTTTG-3' (SEQ ID NO:9) и тот же, что на предыдущей стадии, обратный праймер. Условия
термоцикла были следующими: 30 циклов (94°С, 30 с; 56°С, 30 с и 72°С, 1 мин). Полученный продукт
длиной 551 нп амплифицировали на третьей стадии PCR, используя перекрывающийся прямой праймер
5'-CGTGGATCCATGGCTCTGAACCAGTAGAAGACAATTGCATCAACTTTGTGGCAATGAAATT
TATTGAC-3' (SEQ ID NO:10) и тот же, что на предыдущей стадии, обратный праймер. В состав прямого
праймера входил сайт ВаmН I. Условия термоцикла были теми же, что и на предыдущей стадии. Полученный продукт PCR длиной 0,6 тыс.нп (фиг. 1) очищали посредством набора High Pure™ для очистки
продуктов PCR (Boehringer Mannheim) и лигировали в состав вектора pGEM-T Easy с получением плазмиды pGEM-proIL-18IEGR. Продуктами лигирования трансформировали компетентные клетки JM109
(Promega Corporation). На всем протяжении работы использовали стандартные протоколы клонирования (11).
Плазмиду pGEM-proIL-18IEGR проверяли на наличие правильной вставки путем обработки ферментами рестрикции и ДНК-секвенирования. Плазмиду обрабатывали ВаmН I и EcoR I. Полученную ВаmН
I/EcoR I ДНК, кодирующую человеческий proIL-18IEGR, подвергали электрофорезу в 1,0% агарозе и выделяли из геля полосу, соответствующую 0,6 тыс.нп, посредством QIAquick Gel Extraction Kit (DIAGEN,
Germany). Эту ДНК лигировали в состав экспрессирующего вектора pGEX-2TK (Pharmacia), который
был линеаризован с помощью ВаmН I и EcoR I. Полученной рекомбинантной плазмидой pGEX-proIL18IEGR (фиг. 2) трансформировали штамм E. coli JM109 и подтверждали последовательность полученного
вектора обработкой ферментами рестрикции и ДНК-секвенированием.
Пример 2. Экспрессия и очистка белка слияния GST-proIL-18IEGR.
50 мл инкубировавшейся в течение ночи культуры из свежей единичной колонии E. coli JM109,
трансформированной плазмидой pGEX-proIL-18IEGR, растворяли в 450 мл среды LB, содержащей 100
Ед/мл ампициллина и выращивали при встряхивании при 37°С до достижения оптической плотности при
600 нм, равной 0,6. Затем экспрессию белка индуцировали добавлением IPTG до конечной концентрации
0,1 мМ и дальнейшим культивированием в течение 3 ч при 37°С. Бактерии осаждали путем центрифугирования (5000хg, 5 мин, 4°С) и быстро ресуспендировали в 1:100 от первоначального объема ледяного
фосфатно-солевого буфера (PBS; 150 мМ NaCl, 16 мМ Na2HPO4, 4 мМ NaH2PO4, рН 7,3), содержащего
ингибиторы протеаз (лейпептин 1 мкг/мл, пепстатин А 1 мкг/мл, апротинин 2 мкг/мл, PMSF 0,2 мМ и
EDTA 5 мМ). Клетки лизировали на льду мягкой обработкой ультразвуком (4 импульсами по 15 с). Добавляли Triton X-100 до конечной концентрации 1% и смесь держали на льду в течение 5 мин. Очищенный
от осадка лизат (14000хg, 15 мин, 4°С) смешивали с 50% суспензией гранул глутатион-агарозы (2 мл,
-6-
006825
Pharmacia) и инкубировали смесь при мягком встряхивании при 4°С в течение 3 ч. Гранулы осаждали
центрифугированием (500хg, 5 мин), дважды отмывали 10 объемами буфера для лизиса (1% Triton X-100
в PBS), дважды - 10 объемами 20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl и дважды - 10 объемами 20 мМ
трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 2,0 мМ CaCl2 (буфер расщепления) . Все стадии выполняли при 4°С.
Пример 3. Расщепление белка слияния и очистка зрелого человеческого IL-18.
Гранулы глутатион-агарозы со связанным белком слияния GST-proIL-18IEGR инкубировали (6 ч,
23°С) с фактором Ха (New England Biolabs) в 1 мл буфера расщепления, используя протеазу в соотношении к субстрату 1:50 (маc./маc.), при постоянном перемешивании на ротаторе. На этой стадии освобождается зрелый человеческий IL-18. Гранулы осаждали центрифугированием при 500хg в течение 5 мин
при 4°С и отмывали 5 раз 2 мл ледяного PBS. Супернатант и все объемы отмывки объединяли, очищали
от осадка центрифугированием (14000хg, 15 мин, 4°С) и концентрировали путем ультрафильтрации
(Centricon-10, Amicon). Аликвоты белка, так же как и гранулы до и после обработки, подвергали электрофорезу в 0,1% SDS-12% полиакриламидном геле с последующей окраской кумасси голубым. При
электрофорезе супернатанта получили большую полосу примерно на 18 кДа, что согласовывалось с ожидаемой массой зрелого человеческого IL-18. Кроме того, наблюдалась малая полоса на 19,5 кДа (фиг. 5).
При анализе N-концевой последовательности белка из двух полос получили последовательность
YFGK....., что согласовывалось с таковой зрелого человеческого IL-18. Очищенный белок стерилизовали,
пропуская через фильтр 0,2 мкм, и хранили при -70°С.
Пример 4. Исследование биологической активности человеческого IL-18.
Активность человеческого IL-18 выявляли, как описано в (2). В кратком изложении, селезенки нормальных мышей линии С3Н/HeJ выделяли, измельчали и помещали в буфер Джея (Gey buffer; 0,144 М
NH4Cl в 0,017 М трис-HCl, рН 7,2) для разрушения эритроцитов. Лейкоциты дважды отмывали RPMI-5 и
затем ресуспендировали в RPMI-10. Для получения не прилипающих к пластику клеток клеточные суспензии инкубировали (60 мин, 37°С) в 100 мм пластиковых чашках (Becton Dickinson Ltd., UK). He сорбировавшиеся клетки аккуратно отбирали, центрифугировали и ресуспендировали в RPMI-10. Жизнеспособные клетки подсчитывали при помощи исключающего мертвые клетки теста - окраски трипановым синим - и концентрацию клеток доводили до 5х106 клеток/мл. При помощи этой процедуры избавлялись от большей части неспецифических эстераза-положительных клеток. Суспензию не прилипающих к пластику клеток (0,15 мл) помещали в 96-луночный плоскодонный культуральный планшет для
микротитрования (NUNCLON™, Дания). IL-18 в различных концентрациях, полимиксин (1 мкг/мл) и
Con A (0,125 мкг/мл) добавляли в лунки в 50 мкл RPMI-10. Планшеты инкубировали в течение 24 или 48 ч
при 37°С в 5% CO2. После инкубации супернатанты собирали и определяли титры мышиного IFN-γ посредством ELISA. При инкубации не прилипающих к пластику мышиных клеток селезенки только с человеческим IL-18 выявляли малую продукцию IFN-γ, что указывало на необходимость костимуляции.
Добавления одного Con А в концентрации 0,125 мкг/мл не индуцировало значительного уровня IFN-γ.
Когда не прилипающие спленоциты инкубировали с Con А и человеческим IL-18, полученным в настоящем изобретении, получали зависимую от дозы индукцию IFN-γ (фиг. 6).
Пример 5. Конструирование плазмиды, кодирующей человеческий proIL-1β с участком фактора Ха.
РМВС получали из периферической крови здорового добровольца разделением на градиенте плотности
Ficoll-Paque PLUS (Pharmacia). Затем РМВС дважды отмывали ледяным PBS, содержащим 2% FBS, и ресуспендировали до 2,5х106 клеток/мл в среде RPMI-1640, дополненной фетальной бычьей сывороткой (FBS), 2
мМ L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина (RPMI-10). Культуру стимулировали
LPS (1 мкг/мл, 3 ч, 37°С). Общую РНК экстрагировали из клеток с помощью TriPure™ Isolation Reagent (Boehringer Mannheim). 1 мг общей РНК использовали для RT-PCR с помощью однопробирочного теста Titan для
RT-PCR (Boehringer Mannheim) согласно инструкции производителя.
кДНК proIL-1β клонировали путем PCR со смысловым и обратным праймерами, созданными на основе кДНК человеческого proIL-1β (GenBank accession no. M15330). Смысловой праймер соответствовал
нуклеотидам 87-107 последовательности M15330, предшествующим участку расщепления BamH I. Обратный праймер соответствовал нуклеотидам 896-876 последовательности M15330, предшествующим
участку EcoR I. Шаблоном служила подвергнутая обратной транскрипции общая клеточная РНК, выделенная из РВМС, стимулированных LPS. Условия термоцикла были следующими: 10 циклов (94°С, 30 с;
55°С, 30 с и 68°С, 2 мин), после чего следовали 25 циклов (94°С, 30 с; 55°С, 30 с и 68°С, 125 с/цикл).
Полученный продукт PCR длиной 830 нп очищали посредством набора High Pure™ для очистки
продуктов PCR (Boehringer Mannheim) и лигировали в состав вектора pGEM-T Easy с получением плазмиды pGEM-proIL-lβ. Плазмиду подвергали сайт-специфическому мутагенезу с применением олигонуклеотида ACATGGGATAACGACGCTATTGAAGGCCGGGCACCTGTACGA (SEQ ID NO:11), соответствующего нуклеотидам 405-452 мРНК человеческого IL-1β и несущего мутации Y113I, V114E, H115G и
D116R.
Полученную плазмиду pGEM-proIL-1βIEGR из единичной колонии проверяли на наличие правильной вставки путем обработки ферментами рестрикции и ДНК-секвенирования. Плазмиду обрабатывали
ВаmН I и EcoR I. Полученную BamH I/EcoR I ДНК, кодирующую человеческий proIL-1βIEGR, подвергали
-7-
006825
электрофорезу в 1,0% агарозе и выделяли из геля полосу, соответствующую 0,82 тыс.нп, посредством
QIAquick Gel Extraction Kit (DIAGEN, Germany). Эту ДНК лигировали в состав экспрессирующего вектора pGEX-2TK (Pharmacia), который был линеаризован с помощью BamH I и EcoR I. Полученной рекомбинантной плазмидой pGEX-proIL-1βIEGR трансформировали штамм E. coli JM109 и подтверждали
последовательность полученного вектора обработкой ферментами рестрикции и ДНК-секвенированием.
Пример 6. Экспрессия и очистка белка слияния GST-proIL-1βIEGR.
50 мл инкубировавшейся в течение ночи культуры из свежей единичной колонии E. coli JM109,
трансформированной плазмидой pGEX-proIL-1βIEGR, растворяли в 450 мл среды LB, содержащей 100 Ед/мл
ампициллина, и выращивали при встряхивании при 37°С до достижения оптической плотности при 600 нм,
равной 0,6. Затем экспрессию белка индуцировали добавлением IPTG до конечной концентрации 0,1 мМ
и дальнейшим культивированием в течение 3 ч при 37°С. Бактерии осаждали путем центрифугирования
(5000хg, 5 мин, 4°С) и быстро ресуспендировали в 1:100 от первоначального объема ледяного фосфатносолевого буфера (PBS; 150 мМ NaCl, 16 мМ Na2HPO4, 4 мМ NaH2PO4, pH 7,3), содержащего ингибиторы
протеаз (лейпептин 1 мкг/мл, пепстатин А 1 мкг/мл, апротинин 2 мкг/мл, PMSF 0,2 мМ и EDTA 5 мМ).
Клетки лизировали на льду мягкой обработкой ультразвуком (4 импульсами по 15 с). Добавляли Triton
X-100 до конечной концентрации 1% и смесь держали на льду в течение 5 мин. Очищенный от осадка
лизат (14000хg, 15 мин, 4°С) смешивали с 50% суспензией гранул глутатион-агарозы (2 мл, Pharmacia) и
инкубировали смесь при мягком встряхивании при 4°С в течение 3 ч. Гранулы осаждали центрифугированием (500хg, 5 мин), дважды отмывали 10 объемами буфера для лизиса (1% Triton Х-100 в PBS), дважды - 10 объемами 20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl и дважды - 10 объемами 20 мМ трис-HCl, рН 8,0,
150 мМ NaCl, 2,0 мМ CaCl2 (буфер расщепления). Все стадии выполняли при 4°С.
Пример 7. Расщепление белка слияния и очистка зрелого человеческого IL-1β.
Гранулы глутатион-агарозы со связанным белком слияния GST-proIL-1βIEGR инкубировали (6 ч,
23°С) с фактором Ха (New England Biolabs) в 1 мл буфера расщепления, используя протеазу в соотношении к субстрату 1:50 (маc./маc.), при постоянном перемешивании на ротаторе. На этой стадии освобождается зрелый человеческий IL-1β. Гранулы осаждали центрифугированием при 500хg в течение 5 мин
при 4°С и отмывали 5 раз 2 мл ледяного PBS. Супернатант и все объемы отмывки объединяли, очищали
от осадка центрифугированием (14000хg, 15 мин, 4°С) и концентрировали путем ультрафильтрации
(Centricon-10, Amicon). Аликвоты белка, так же как и гранулы до и после обработки, подвергали электрофорезу в 0,1% SDS-12% полиакриламидном геле с последующей окраской кумасси голубым. При
электрофорезе супернатанта получили большую полосу примерно на 17 кДа, что согласовывалось с ожидаемой массой зрелого человеческого IL-1β. Очищенный белок стерилизовали, пропуская через фильтр
0,2 мкм, и хранили при -70°С.
Пример 8. Конструирование плазмиды кодирующей человеческий proIL-18 с участком расщепления
каспазой-8.
Рекомбинантную плазмиду pGEX-pro-IL-18IEGR из примера 1 модифицировали вставкой амплифицированного путем PCR фрагмента ДНК с участком расщепления каспазой-8 (LETD). В кратком изложении, pGEX-pro-IL-18IEGR обрабатывали ферментами рестрикции ВАМ HI в позиции 951 и Hind III в позиции 1074, отрезая порцию ДНК, содержащую Pro-домен, участок расщепления фактором Ха (IEGR) и три
аминокислоты от N-конца hIL-18.
Ту же плазмиду использовали как шаблон для амплификации в PCR путем введения мутированного
участка LETD в состав располагающегося ниже праймера atgcAAG CTT GCC ААА GTA GTC GGT ТТС
CAG GTT ТТС АТС АТС ТТС AGC ТАТ АА (SEQ ID NO:12). Фрагмент PCR очищали с использованием
набора для «получения высокоочищенного продукта» ("high pure product purification"; Boehringer Mannheim),
после чего сходным образом нарезали посредством ВАМ HI и Hind III с получением вставки длиной 123 нп.
Открытый вектор и вставку разделяли на агарозном геле и экстрагировали с использованием коммерческого набора «Jet Sorb» (Genomed). Лигирование проводили в течение ночи, используя лигазу Т4 (New
England Biolabs, Beverly MA, США), и трансформировали продуктами лигирования компетентные клетки
E. coli DH5a. Выделяли и субкультивировали несколько колоний и получали препараты Miniprep посредством набора «Qiagen». Чтобы секвенировать существенную часть рекомбинантной плазмиды, все препараты Miniprep подвергали амплификации путем PCR (Perkin Elmer Gene Amp- AmpiTaq DNA polymeraze).
Окончательную трансформацию проводили на компетентных бактериях E. coli JM109, следуя способу
TSS (Chung, С.Т. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2172-2175).
Пример 9. Экспрессия и очистка белка слияния GST-proIL-18LETD.
Используя плазмиду, сконструированную согласно приведенному выше примеру 8, экспрессию
белка GST-proIL-18LETD проводили в флаконах при встряхивании и 5-литровых ферментерах, по существу, так же, как описано выше в примере 2.
Пример 10. Расщепление белка слияния с использованием каспазы-8 и очистка зрелого человеческого IL-18.
Гранулы глутатион-агарозы со связанным белком слияния GST-proIL-18LETD инкубировали (6 ч,
23°С) с каспазой-8 (calbiochem) в 1 мл буфера расщепления (описанном в примере 6), используя соотно-8-
006825
шение протеаза:субстрат 1:1200 (маc./маc.), при постоянном перемешивании на ротаторе или роллере.
Гранулы осаждали центрифугированием при 500хg в течение 5 мин при 4°С и отмывали 5 раз 2 мл ледяного PBS. Супернатант и все объемы отмывки объединяли, очищали от осадка центрифугированием
(14000хg, 15 мин, 4°С) и концентрировали путем ультрафильтрации (Centricon-10, Amicon). Концентрированную после обработки смесь разделяли по размерам молекул на Superdex-75 (Pharmacia), чтобы отделить hIL-18 (18 кДа) от высокомолекулярных продуктов расщепления и оставшегося протеолитического фермента (гетеродимер каспазы-8, 29 кДа, и гетеротетрамеры, 58 кДа).
В различных фракциях Superdex-75 анализировали ферментную активность каспазы-8 с использованием набора для анализа каспазы-8 и флуорогенного субстрата Ac-IETD-AMC (BIOMOL), и эта активность наблюдалась в фракциях, соответствующих молекулярной массе 55 кДа (соответствующих гетеротетрамеру каспазы-8); так было показано, что каспаза-8 очень хорошо отделилась от фракций, содержащих hIL-18 (18 кДа).
Фракции после гель-фильтрации, содержащие высокоочищенный hIL-18 массой 18 кДа, объединяли, концентрировали на Centricon-10 (Amicon), в конце стерилизовали, пропуская через 0,22 мкм фильтр,
и хранили при -80°С.
Аликвоты белка, так же как и гранулы до и после обработки, подвергали электрофорезу в 0,1%
SDS-12% полиакриламидном геле с последующей окраской кумасси голубым (фиг. 9). При электрофорезе фракции супернатанта наблюдали полосу на 18 кДа, что согласовывалось с ожидаемой массой зрелого
человеческого IL-18. Анализ фракции гранул показал, что не происходит полного расщепления, поскольку на гранулах остался связанный белок-предшественник. Более того, во фракции гранул осталось некоторое количество расщепленного IL-18.
Пример 11. Исследование биологической активности человеческого IL-18, полученного путем расщепления каспазой-8.
Активность человеческого IL-18 оценивали, как описано (10). В кратком изложении, клетки KG-1
культивировали в DMEM, содержащей 20% FBS. Для анализа IL-18 клетки KG-1 ресуспендировали в
концентрации 1,2х106 клеток/мл (250 мкл/лунку, 48-луночный планшет) и стимулировали mTNFα (Innogenetics) вместе с hIL-18 в различных концентрациях (несколько разведений, начиная с 80 нг/мл). Планшет инкубировали в течение 24 ч при 37°С в 5% СO2. После инкубации супернатанты собирали и определяли содержание мышиного IFN-γ посредством ELISA (rec. hIFN-γ и анти-hIFN-γ от R & D Systems).
Человеческий IL-18 индуцировал зависимую от дозы продукцию IFN-γ с активностью, идентичной
таковой у hIL-18, полученного путем конструирования участка расщепления фактором Ха.
Ссылки
1. Nakamura, K., Okamura, H., Nagata, K., Komatsu, Т., and Tamura, Т. (1993) Infect. Immun. 61, 64-70.
2. Okamura, H., Tsutsui, H., Komatsu, Т., Yutsudo, M., Hakura, A., Tanimoto, Т., Torigoe, K., Okura, Т.,
Nukada, Y., Hattori, K., Akita, K., Namba, M., Tanabe, F., Konishi, K., Fukuda, S., and Kurimoto, M. (1995)
Nature 378, 88-91.
3. Ushio, S., Namba, M., Okura, Т., Hattori, K., Nukada, Y., Akita, K., Tanabe, F., Konishi, K., Micallef,
M., Fujii, M., Torigoe, K., Tanimoto, Т., Fukuda, S., Ikeda, M., Okamura, H., and Kurimoto, M. (1996) J.
Immunol. 156, 4274-4279.
4. Bazan, J.F., Timans, J.С., and Kaselein, R.A. (1996) Nature 379, 591.
5. Okamura, H., Nagata, K., Komatsu, Т., Tanimoto, Т., Nukata, Y., Tanabe, F., Akita, K., Torigoe, K.,
Okura, Т., Fukuda, S., and Kurimoto, M. (1995) Infect. Immun. 63, 3966-3972.
6. Micallef, M.J., Ohtsuki, Т., Kohno, K., Tanabe, F., Ushio, S., Namba, M., Tanimoto, Т., Torigoe, K.,
Fujii, M., Ikeda, M., Fukuda, S., and Kurimoto, M. (1996) Eur. J. Immunol. 26, 1647-1651.
7. Tsutsui, H., Nakanishi, K., Matsui, K., Higashino, K., Okamura, H., Miyazawa, Y., and Kaneda, K.
(1996) J. Immunol. 157, 3967-3973.
8. Ghayur, Т., Banerjee, S., Hugunin, M., Butler, D., Herzog, L., Carter, A., Quintal, L., Sekut, L.,
Talanian, R., Paskind, M., Wong, W., Kamen, R., Tracey, D., and Alien, H. (1997) Nature 386, 619-623.
9. Gu, Y., Kuida, K, Tsutsui, H., Ku, G., Hsiao, K., Fleming, M.A., Hayashi, N., Higashino, K., Okamura,
H., Nakanishi, K., Kurimoto, M., Tanimoto, Т., Flavell, R.A., Sato, V., Harding, M.W., Livingston, D.J., and Su,
M.S. (1997) Science 275, 206-209.
10. Takeda, K., Tsutsui, H., Yoshimoto, Т., Adachi, O., Yoshida, N., Kishimoto, Т., Okamura, H.,
Nakanishi, K., and Akira, S. (1998) Immunity 8, 383-390.
11. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2nd
edn. Ed., Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY.
12. Villa, P., Kaufmann, S.H., and Earnshaw, W.C. (1997) Caspases and caspase inhibitors Trends
Biochem. Sci. 22 388-393.
13. Nicholson, D.W., Thornberry, N.A., (1997) Caspases: Killer proteases. Trends Biochem. Sci. 22 299-306.
14. Garcia-Calvo, M., Peterson, E.P., Rasper, D.M., Vaillancourt, J.P., Zamboni, R., Nicholson, D.W.,
Thornberry, N.A., (1999) Purification and catalytic properties of human caspase family members. Cell Death
-9-
006825
Differ. 6; (4) 362-369. Konishi, K., Tanabe, F., Taniguchi, M., Yamauchi, H., Tanimoto, Т., Ikeda, M., Orita, K.,
Kurimoto, M. (1997) A simple and sensitive bioassay for the detection of human interleukin-18/interferon-γ
inducing factor using human myelomonocytic KG-1 cells, J. Immunol. Methods 209 187-191.
Список последовательностей
- 10 -
006825
- 11 -
006825
- 12 -
006825
- 13 -
006825
- 14 -
006825
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения биологически активной молекулы из ее биологически неактивного предшественника, включающий обеспечение мутирования его нативного участка расщепления каспазой-1 с образованием участка, расщепляемого протеазой, и расщепление мутированной молекулы с получением биологически активной молекулы, причем указанная биологически активная молекула представляет собой
цитокин.
2. Способ по п.1, где цитокин выбран из IL-1β и IL-18.
3. Способ по любому из предшествующих пунктов, где протеаза выбрана из тромбина, энтерокиназы, субтилизина, гененазы (genenase™), протеазы человеческого риновируса 3С, протеазы фактора Ха и
каспазы, предпочтительно каспазы-8.
4. кДНК, кодирующая предшественник биологически активной молекулы, мутированный в нативном участке его расщепления каспазой-1 с образованием участка, расщепляемого протеазой, необязательно подвергнутый слиянию с последовательностью, кодирующей GST, причем указанная биологически активная молекула представляет собой цитокин, выбранный из IL-1β и IL-18.
5. Способ получения биологически активной молекулы, включающий трансфекцию клеток-хозяев
вектором, содержащим кДНК, кодирующую неактивный предшественник биологически активной молекулы, мутированный в нативном участке его расщепления каспазой-1 с образованием участка, расщепляемого протеазой, культивирование трансфицированных клеток-хозяев и выделение биологически активной молекулы после обработки протеазой, причем указанная биологически активная молекула представляет собой цитокин.
6. Способ по п.5, где кДНК подвергают слиянию в рамке считывания с последовательностью, кодирующей глутатион-S-трансферазу (GST), и экспрессированную молекулу слияния задерживают на гранулах глутатион-агарозы перед обработкой протеазой.
Фиг. 1
- 15 -
006825
Фиг. 2
Фиг. 3
Фиг. 4
- 16 -
006825
Фиг. 5
Фиг. 6
Фиг. 7
- 17 -
006825
Фиг. 8(а)
Фиг. 8(b)
- 18 -
006825
Фиг. 9
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 19 -