на правах рукописи УДК 577.3 БАШКИРОВ ПАВЕЛ ВИКТОРОВИЧ
реклама
на правах рукописи УДК 577.3 БАШКИРОВ ПАВЕЛ ВИКТОРОВИЧ Деление мембранных нанотрубок, опосредованное белком динамином. Специальность 03.00.02. – биофизика автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва 2007 Работа выполнена в Институте физической химии и электрохимии им. А. Н. Фрумкина РАН. Научный руководитель: член-корреспондент РАН, доктор химических наук Юрий Александрович Чизмаджев. Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук Константин Вольдемарович Шайтан, доктор физико-математических наук Валерий Иванович Иванов. Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН. Защита состоится «____» г. в ___ час. ___ мин. на заседании дис- сертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте по адресу: 141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., д. 9, МФТИ. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ. Автореферат разослан «____» _______________ 2007 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических наук В. Е. Брагин 2 Введение. Актуальность исследования. Деление клеточной мембраны – это такое топологическое преобразование, в результате которого происходит формирование новых мембранных структур. Оно лежит в основе фундаментальных клеточных процессов, таких как митоз, эндоцитоз, деление органелл и многих других. Для сохранения замкнутости объемов делящихся структур деление соединяющего их мембранного перешейка должно сопровождаться формированием, так называемой, структуры полуделения (Kozlovsky and Kozlov, 2003), когда внутренний монослой перешейка локально сливается, а внешний остается интактным. Эти перестройки сопряжены с большими изгибными деформациями мембраны. В клеточных системах они создаются специализированными белковыми структурами, собирающимися на поверхности перешейка (Lee amd Schekman, 2004), который при этом зачастую представляет собой цилиндрическую мембранную нанотрубку (НТ) (Lollike and Lindau, 1999). Динамин является одним из ключевых белков, опосредующих деление мембран в различных клеточных системах (van der Bliek and Meyerowitz, 1991; Chen et. al., 1991). Существуют предположения, что именно он за счет энергии гидролиза ГТФ разрывает мембранную НТ, деформируя ее соответствующим образом (Sever et. al., 2000). Блокировка ГТФазной активности динамина in vivo приводит к остановке эндоцитоза на стадии деления мембраны. При этом хорошо видно, что белок образует плотные полимерные спирали или стопки колец вокруг мембранных НТ, удерживающих отпочковывающиеся везикулы (Takei et. al. 1995). Известно, что такая полимеризация запускает кооперативный гидролиз ГТФ (Tuma and Collins, 1995), так что его скорость увеличивается в тысячи раз, причем молекулы белка одной спирали практически одновременно гидролизуют ГТФ. Считается, что выделяющаяся при этом энергия расходуется на деформирование и деление мембранной НТ (Song and Schmid, 2003). О механизме превращения химической энергии в механическую работу известно мало, при этом существующие на сегодняшний день представления зачастую противоречивы. Большинство из предложенных гипотез были основаны на результатах анализа взаимодействия динамина с модельными липидными мембранами. Динамин проявляет механическую активность in vitro: так было показано, что он формирует длинные НТ из липидных везикул, навиваясь вокруг них спиралью (Carr and Hinshaw, 1997). При последующем добавлении в систему ГТФ происходит расщепление НТ на небольшие липосомы (Sweitzer and Hinshaw, 1998). Предполагают, что расщепление нанотрубок в таких системах происходит в результате структурных изменений динаминовой спирали, таких как ее сужение, удлинение или скручивание (Sweitzer and Hinshaw, 1998; Stowell et. al., 1999; Roux et. al., 2006). Однако до сих пор остается неразрешенным вопрос, каким образом такие трансформации спирали обеспечивают быструю, локальную и безутечечную перестройку бислоя, необходимую для формирования везикул. В клетке динамин функционирует в присутствии ГТФ. Протяженные динаминовые структуры, которые образовывались in vitro на поверхности НТ (Takei et. al., 1995), формируются in vivo только при блокировании гидролиза ГТФ. Следовательно, функциональная белковая единица, опосредующая деление, относительно коротка и нестабильна. К сожалению, высокая скорость деления и низкая разрешающая способность использующихся экспериментальных методов серьезно усложняют идентификацию деформаций НТ, вызываемых динамином. Дело в том, что элек3 тронная микроскопия, которая являлась важнейшим инструментом в исследовании взаимодействия динамина с мембранами, даёт статическую картину и не позволяет следить за делением в режиме реального времени. В нашей лаборатории была разработана методика вытягивания липидных трубок из плоской бислойной липидной мембраны (БЛМ) с помощью стеклянной микропипетки (Frolov et. al., 2003). Было показано, что в зависимости от длины трубки она может находиться в одной из двух форм: катеноидальная микротрубка (МТ) или цилиндрическая нанотрубка. Особенности формирования таких трубок позволяют вести непрерывное наблюдение за изменениями ионной проводимости их внутренних каналов. Поэтому, полученные таким образом НТ могут быть использованы для исследования быстрых процессов деления мембран динамином. Учитывая ключевое значение динамина в широком круге клеточных процессов, детальное изучение данной проблемы представляется весьма актуальным. Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в исследовании механизма деления клеточных мембран с использованием модельной системы “липидная нанотрубка (НТ) – клеточный белок деления динамин”. В ходе работы были поставлены следующие задачи: 1) Расширить экспериментальные возможности метода формирования мембранных НТ. Разработать способ измерения равновесного радиуса НТ. Исследовать его зависимость от липидного состава мембраны НТ. Разработать метод определения модуля изгиба и латерального натяжения мембраны НТ. 2) Исследовать взаимодействие динамина с НТ. Найти необходимые условия, при которых происходит сорбция динамина на НТ. Для исследования сорбции использовать метод второй гармоники и флуоресцентную микроскопию. Выяснить, как динамин влияет на радиус и стабильность НТ, имеющих разный модуль изгиба мембраны. 3) Исследовать особенности процесса деления НТ динамином в присутствии ГТФ. Выяснить, что происходит с динаминовой спиралью в результате гидролиза ГТФ. Проверить, протекает ли деление НТ в данной модельной системе без утечки. 4) На основе анализа полученных и литературных данных предложить и обосновать механизм деления НТ динамином. Новизна исследования и его научно-прикладное значение. В процессе выполнения работы были разработаны экспериментальные методы, позволяющие проводить измерения как геометрических размеров липидных нанотрубок (радиус и длину), так и механических параметров ее мембраны (модуль изгиба и латеральное натяжение), а также изучать их зависимость от липидного состава мембраны. Данные методы отличаются от встречающихся в литературе тем, что дают возможность исследовать характеристики сильно изогнутых мембран, радиус кривизны которых сравним с их толщиной. Практическая ценность этих методов заключается в том, что они позволяют делать оценки жесткости мембран наноскопических липосом, все шире используемых в медицине в качестве переносчиков лекарств. 4 Было показано, что варьированием липидного состава или значения, прикладываемого к мембранной трубке электрического напряжения, можно менять геометрический размер НТ. Обнаруженные свойства мембранных трубок важны для выяснения роли липидного бислоя в управлении процессами экзо- и эндоцитоза. Впервые исследована кинетика взаимодействия НТ с клеточным белком динамином. При физиологических значениях концентраций, динамин за время ~ 10 с сжимает НТ до радиусов, сравнимых с толщиной липидного монослоя, что существенно меньше, чем предполагалось ранее. Показано, что радиус, до которого динамин сжимает НТ, определяет возможность ее деления белком в присутствии ГТФ и регулируется жесткостью мембраны. Впервые сделана оценка энергии, выделяемой динамином при полимеризации в спираль: она оказалась сравнима с энергией, выделяемой при гидролизе ГТФ. Показано, что вопреки существующим предположениям гидролиз ГТФ не приводит ни к увеличению шага белковой спирали, ни к ее дальнейшему сжатию. Мы считаем, что в результате гидролиза ГТФ происходит лишь разъединение ее витков, вследствие чего спираль теряет жесткость. Показано, что в зависимости от первоначального радиуса и длины участка спирали, гидролизовавшего ГТФ, возможно как расширение, так и сужение с последующим делением НТ. Полученные данные позволяют не только ответить на многие вопросы, связанные с делением мембранных НТ динамином, но и судить о роли липидного бислоя в этом процессе. Они заставляют пересмотреть существующие на сегодняшний день предположения о самом механизме деления мембран динамином и конформационных изменениях белка, происходящих при этом. Апробация диссертационной работы. Основные результаты, изложенные в диссертационной работе, докладывались и обсуждались на конференции молодых ученых ИФХЭ РАН (2007); на конференции “Laboratory of Cellular and Molecular Biophysics Annual Scientific Retreat” (Бетесда, США; 2006, 2007), на 50-ом съезде американского биофизического общества (Солт-Лейк Сити, США; 2006), на международной конференции “EMBO workshop on Cell Membrane Organization and Dynamics” (Бильбао, Испания; 2006) и на научных семинарах лаборатории биоэлектрохимии ИФХЭ РАН (Москва; 2004-2007). Публикации. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 5 печатных работах. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов исследования, глав результатов работы и их обсуждения, выводов. Работа изложена на страницах, включает иллюстраций. Библиография включает работ. 5 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Формирование мембраны. Бислойную липидную мембрану (БЛМ) формировали по методу РудинаМюллера на 100 мкм отверстии в тефлоновой пленке, разделяющей два отсека специальной ячейки, заполненной электролитом (0.1 мМ KCl, 10 мМ HEPES, pH 7.0). Отверстие обрабатывалось раствором фосфолипидов (“Avanti Polar Lipids Inc.”, США) в смеси октан/декан 1/1 (оба “Sigma”, США) в концентрации 10 мг/мл и высушивалось в аргоне. После погружения ячейки в раствор электролита на отверстие кисточкой наносилась капля раствора фосфолипидов в сквалане (“Sigma”, США) с концентрацией 10-30 мг/мл, из которой в течение нескольких минут спонтанно образовывалась БЛМ. При этом растворитель и лишний липид уходили в объёмную фазу, окружающую БЛМ, – мениск. В экспериментах использовались следующие фосфолипиды: 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфолхолин (ДОФХ), 1-олеоил-2-гидрокси-snглицеро-3-фосфохолин (ОФХ), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (ДОФЭ), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фософсерин (ДОФС), 1-олеоил-2-гидрокси-sn-3фосфосерин (ОФС), флуоресцентно меченый 1,2-диолеоил-sn-3-фосфоэтаноламинN-(лизамин родамин B сульфонил) (ДОФЭ-Родамин) и холестерин в соотношениях, указанных в тексте. Формирование мембранных трубок. Для формирования и исследования электрических свойств мембран и мембранных трубок использовали установку (рис.1), состоящую из пэтч-пипетки, универсального генератора PAR-175 (“Princeton Applied Research”, США), пэтч-кламп усилителя EPC-7 (“Heka”, Германия), четырехполосного фильтра F-900 (“Frequency Devices”, США) и осциллографа OS-1420 (“GOULD”, Англия). Для изменения положения пипетки использовали контроллеры движения Model 860-C2 (“Newport”, США) и микроконтроллер движения Model ESA-CSA (“Newport” , США), последний - для высокоточного (шаг 50 нм) перемещения по вертикали. В процессе формирования БЛМ на хлорсеребряные электроды посредством пэтч-кламп усилителя подавался пилообразный сигнал с генератора и измерялся емкостной ток мембраны в режиме фиксации потенциала. Процесс образования липидного бислоя фиксировался по резкому увеличению емкости и одновременно по исчезновению изображения в микроскопе (толщина БЛМ ~ 4нм – много меньше длины волны видимого света). Затем с помощью микроманипулятора к мембране подводили пэтч-пипетку, так что между кончиком микропипетки и мембраной формировался плотный контакт (сопротивление контакта 1—10 Гом) (рис. 1б), что было видно по резкому уменьшению емкостного тока. Для разрушения мембраны под пипеткой скачком менялось гидростатическое давление, что приводило к появлению тока проводимости. После этого, отводя пипетку от плоской мембраны, вытягивали мембранную трубку (рис. 1в ,г). Затем к электродам прикладывали постоянную разность потенциалов, и измеряли ток проводимости через мембранную трубку. Плавное изменение длины трубки осуществлялось с помощью микроконтроллера. Показания индикатора микроконтроллера, значения приложенного к концам трубки электрического напряжения и измеряемого тока через нее оцифровали и записывали на жесткий диск компьютера с помощью АЦП L-305/L-1210 (“L-card”, Россия). Частота опроса 1кГц. Сигнал предварительно пропускали через фильтр низких частот F-900; частота среза 0,5 кГц. Показания 6 микроконтроллера позже пересчитывались в значение вертикального смещения кончика пипетки L относительно своего низшего положения с помощью построенной для этой цели калибровочной кривой. Рис. 1. Формирование мембранной нанотрубки (НТ). а – плоская БЛМ. б – формирование плотного контакта между пэтч-пипеткой и БЛМ с последующим разрушением мембраны под пипеткой. вформирование мембранной катеноидальной микротрубки (МТ) в начале отведения пипетки от БЛМ. г – образование мембранной НТ в результате коллапса МТ при достижении критической длины. Для визуализации НТ использовали флуоресцентную микроскопию (рис. 6а) на основе инвертированного микроскопа Olympus IX-70 (Olympus Inc., Япония). В этом случае НТ вытягивали пэтч-пипеткой из гигантских однослойных липосом (ГОЛ), содержащих 3 мольных % ДОФЭ-Родамина. ГОЛ получали методом электроформации (Ангелова) на платиновых электродах в 200 мМ растворе глюкозы и 10 мМ Hepes при pH = 7,0. После образования ГОЛ на электродах этот раствор с помощью перфузионного насоса меняли на раствор электролита (100 мМ KCl и 10 мМ Hepes, pH = 7,0). Изображение НТ снималось и записывалось на жесткий диск компьютера с помощью CCD-камеры (Intesified VE1000SIT MIT, США). Аппликация динамина и ГТФ. Использовалось два способа добавления динамина и ГТФ к мембранным нанотрубкам. В первом случае чистый? динамин или динамин с ГТФ добавляли в раствор электролита до формирования НТ. Конечная концентрация белка и нуклеотида при этом была 0.04 мг/мл и 1мМ соответственно. Во втором случае динамин и ГТФ апплицировали непосредственно на НТ. Для этого их добавляли с помощью микропипеток, которые вплотную подводились к нанотрубкам. Одна из пипеток была заполнена раствором динамина в концетрации 0.4 мг/мл, другая, если было необходимо, ГТФ в концентрации 10 мМ. Разница гидростатического давления на границе кончика пипетки с раствором равнялась нулю, таким образом, могли существовать только диффузионные потоки белка или нуклеотида. Для локализации и определения размера диффузионного облака вокруг кончика пипетки мы добавляли в раствор 7 внутри пипетки флуоресцентно меченые 40-ка нанометровые полиэтиленгликоливые шарики (биды). Пипетки с динамином и ГТФ подводили к НТ так, чтобы НТ оказывалась внутри окрашенной диффузионной области. Когда это было необходимо, пипетки отводились от НТ, и объемные концентрации белка или ГТФ около НТ довольно быстро становились пренебрежимо малыми. Измерение адсорбции динамина на поверхности БЛМ. Метод, который мы использовали для исследования адсорбции динамина на БЛМ, основан на электрострикции мембраны (Соколов и Кузьмин, 1984), в результате которой ее емкость C квадратично зависит от трансмембранного потенциала U: C = C0 + αU 2 (I). Если динамин сорбируется на поверхность отрицательно заряженной мембраны, то его добавление только с одной стороны симметричной БЛМ приведет к возникновению трансмембранного напряжения Vt на ней, так как белок скомпенсирует часть отрицательного заряда на одной из сторон БЛМ и нарушит равенство поверхностных зарядов ее монослоев. Прикладывая при этом к мембране переменное электрическое поле U0sin(ωt) и измеряя амплитуду второй гармоники емкостного тока, находим значение Vt согласно уравнению: I 2ω = αωU 02Vt sin ωt (II), которое получено в предположении, что ω >> 1. Мы использовали генератор сигнала низких частот модель ГЗ – 102 (СССР) для прикладывания переменного синусоидального напряжения к БЛМ с, ω = 300 Гц, и U0 = 300 мВ; пэтч-кламп усилитель EPC-7 (“Heka”, Германия) использовали для компенсации емкости мембраны C0 и измерения емкостного тока, который, в свою очередь, шел на вход фазочувствительного усилителя LI-575 (Synchotrach, Япония). Полученный с выхода фазочувствительного усилителя сигнал, соответствующий амплитуде тока второй гармоники, оцифровывали и записывали на жесткий диск компьютера с помощью АЦП L-305/L-1210 (“L-card”, Россия). В начале каждого эксперимента, перед добавлением динамина, снималась калибровочная зависимость Vt от амплитуды I2ω, которая аппроксимировалась линейной функцией. Для этого наряду с переменным напряжением U0sin(ωt) к мембране прикладывали постоянную разность потенциалов Vt, которую варьировали от -50 до 50 мВ с шагом 5 мВ. Таким образом, после аппликации динамина, согласно измеренному значению амплитуды тока второй гармоники, находили величину трансмембранного напряжения, возникающего за счет адсорбции динамина. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Связь равновесного радиуса НТ с механическими параметрами БЛМ. Для нахождения значения равновесного радиуса НТ решали задачу о минимизации функционала свободной поверхностной энергии мембранного цилиндра, связанного с резервуаром липида (мениском) и имеющего постоянную длину lNT. В нашем случае связь НТ с мениском осуществлялась посредством плоской БЛМ, а длина НТ определялась положением кончика пипетки. Согласно предварительным оценкам, радиусы вытягиваемых из БЛМ нанотрубок сравнимы с толщиной бислоя 8 (Frolov et. al., 2003), поэтому свободную энергию НТ находили как сумму свободных энергий ее внутреннего и внешнего монослоя. На рисунке 2 представлено схематическое изображение НТ в виде двух коаксиальных бесконечно тонких цилиндров, соответствующих нейтральным поверхностям внутреннего и внешнего монослоев НТ. Расстояние между этими цилиндрами фиксировано и равно h – толщине гидрофобной прослойки мембраны. Согласно приближению Хельфриха (Helfrich, 1973), функционал свободной поверхностной энергии мембраны W зависит от числа молекул поверхности мембраны n, площади поверхности A и ее кривизны J: W = W (n, A, J ) (1), Вариация энергии, соответственно, имеет вид: dW = µdn + σdA + BdJ (2), где µ – химический потенциал молекулы в мембране,σ – латеральное натяжение мембраны, а B − действующий на нее изгибающий момент, который Рис.2. Схематическое изображение мембранной НТ, представленной в виде двух коаксиальных бесконечно тонких цилиндров одинаковой длины lNT, соответствующих внешнему и внутреннему монослою НТ, радиусы которых равны, соответственно, re и ri. для малых отклонений кривизны J от своего спонтанного значения J0 определяется выражением B = Ak (J − J 0 ) , где k – модуль изгиба монослоя. В тоже время из экстенсивности W, n и A следует, что: W = µn + σA (3). Из уравнений (2) и (3) получаем: µ = µ0 + a0 k (J − J 0 )2 − a0σ 2 (4), где µ0 – стандартный химический потенциал молекулы липида, а a0 – площадь, приходящаяся на одну молекулу липида. В соответствии с уравнениями (3) и (4) выражение свободной поверхностной энергии НТ, изображенной на рисунке 2, будет иметь вид: W = µ 0 ni + µ 0 ne + Ai k (J i − J 0 )2 + Ae k (J e − J 0 )2 + µN 2 2 (5), где нижний индекс i соответствует внутреннему монослою, e – внешнему, а N – число молекул в мениске, для которого выполняется соотношение: N + ni + ne = N 0 = const (6). 9 Путем несложных преобразований с использованием выражений (4) и (6) уравнение (5) можно переписать в ином виде: W = σ p Ai + σ p Ae − Ai k 2 k k k 2 2 J 0 − Ae J 02 + Ai ( J i − J 0 ) + Ae ( J e − J 0 ) + µN 0 2 2 2 2 (7), где латеральное натяжение плоского монослоя σp дается формулой: µ −µ k 2 σp = 0 + J0 (8). a0 2 Для цилиндра A = 2πrlNT, Ji = -1/ri и Je = 1/re, где ri и re – радиусы внешнего и внутреннего монослоя НТ, причем re - ri = h = const. В равновесии dW = 0, так что варьирование выражения (7) по ri, позволяет получить соотношение, определяющее связь внутреннего радиуса НТ с механическими параметрами мембраны: 1 1 4σ + = 0 (9), 2 2 ri (ri + h ) K где σ0 = 2σp – натяжение бислоя, K = 2k – модуль изгиба бислоя, а h – его толщина. Из уравнения (9) видно, что значение внутреннего радиуса НТ не зависит от значения спонтанной кривизны монослоев мембраны. Экспериментальное определение радиуса НТ. Зависимость радиуса НТ от липидного состава БЛМ. Для точного определения значения радиуса мембранной нанотрубки проводили анализ зависимости проводимости НТ от ее длины. Измеряемая в эксперименте проводимость G состоит из проводимости нанотрубки GNT и фоновой проводимости Gbg, связанной с электрической утечкой в месте контакта мембраны со стеклянной пэтч-пипеткой и проводимостью плоской БЛМ (см рис.1), G = GNT + Gbg. Длина нанотрубки lNT равна разности между измеряемым вертикальным смещением кончика пипетки L относительно его самого нижнего положения (смотри материалы и методы) и параметром Lbg, равным расстоянию между плоской БЛМ и самым нижним положением кончика пипетки, lNT = L – Lbg. Считая, что форма НТ слабо отличается от цилиндрической и предполагая, что при движении пипетки меняется только lNT, мы аппроксимировали экспериментальную зависимость G от L гиперболической функцией, следующего вида: G= λ L − Lbg + Gbg (10), 2 πrNT здесь λ - проводимость НТ единичной длины, λ = , где ρ - удельное сопротивлеρ ние раствора электролита, а rNT – радиус люмена НТ (далее – просто радиус НТ). Из найденного в процессе аппроксимации параметра λ и определяли значение радиуса НТ. Для 100 мМ раствора KCl удельное сопротивление ρ равно 1 Ом·м. На рисунке 3а приведены экспериментальная зависимость проводимости НТ от ее длины и аппроксимирующая эту зависимость функция, построенная по формуле (10). Для всех имеющихся данных эта функция хорошо описывала подобную зависимость – среднеквадратичное отклонение не превышало 5 пС. Погрешность аппроксимации составляла 0.4 пС, доверительная вероятность 0.99. В каждом отдельном эксперименте погрешность определения радиуса НТ не превышала 5%. Было показано, что радиусы НТ, вытянутых из одной и той же БЛМ, не различались в пре10 делах погрешностей, что было ожидаемым, так как согласно формуле (9) равновесное значение rNT определяется исключительно механическими параметрами бислоя. Кроме того, было найдено, что в пределах используемых скоростей движения пипетки (от 0.05 мкм/c до 0.4 мкм/с) разброс вычисляемых значений радиусов НТ не превышал точности их определения, что говорит о квазистационарности процесса изменения длины НТ на таких скоростях. Рис.3. а – аппроксимация экспериментальной зависимости проводимости G от положения кончика пипетки L гиперболической функцией (10). Точки соответствуют дискретным моментам регистрации G и L. Сплошной линией изображена аппроксимирующая функция, при λ = 60.8 пСм/мкм, Lbg = 11.1 мкм, Gbg = 1.7 пСм. б – радиус НТ, вытянутых из фосфолипидных мембран (ДОФХ:ДОФЭ 2:1) с разным содержанием холестерина (кривая 1); радиус НТ, вытянутых из фосфолипидных мембран (ДОФХ:ДОФЭ 2:1) с разным содержанием смеси холестерин:ОФХ 1:1 (кривая 2); по оси абсцисс отложена концентрация холестерина в БЛМ, а по оси ординат радиус НТ. Используя разработанный метод определения радиусов НТ, мы провели исследование влияния липидного состава на значения радиуса. Все эксперименты проводились в эквивалентных условиях (t = 250С, 100 мМ KCl, pH = 7.0, прикладываемое к концам НТ напряжение U = 50 мВ). Минимальным радиусом обладали НТ, которые вытягивались из мембран, состоящих только из фосфолипидов ДОФХ:ДОФЭ в соотношении 2:1. Среднее значение радиуса таких НТ составляло всего 2 нм. Однако размер НТ существенно увеличивался при добавлении к таким мембранам холестерина. На рисунке 3б кривая 1 отображает зависимость радиуса НТ от мольной концентрации холестерина в фосфолипидной мембране. Увеличение радиуса НТ с ростом концентрации холестерина в мембране, в первую очередь, вызвано тем, что холестерин, как это хорошо известно, увеличивает модуль изгиба фосфолипидных мембран за счет конденсирующего эффекта, оказываемого им на жирнокислотные хвосты липидов. Добавка к фосфолипидным мембранам смеси лизолипид:холестерин в соотношении 1:1 приводила к еще более значительному росту радиуса НТ, вытягиваемых из таких мембран. На кривой 2 рисунка 3б представлены значения, которые принимает радиус НТ, в зависимости от содержания смеси ОФХ:Холестерин 1:1 в фосфолипидной мембране ДОФХ:ДОФЭ 2:1. Радиус НТ, состоящей на 80 % из лизолипида и холестерина, составляет 20 нм, что в десять раз больше радиуса фосфолипидной НТ. Таким образом, добавка смеси лизолипида с холестерином к фосфолипидным мембранам приводит к существенному увеличению диапазона радиусов, вытягиваемых из БЛМ нанотрубок. Так, варьируя липидный состав БЛМ, мы показали, что радиус НТ может принимать значения от 2 до 20 нм. 11 Влияние электрического напряжения, приложенного к концам НТ, на ее размер, форму и проводимость. Измерение механических параметров НТ. В нашей системе для определения радиуса НТ нужно проводить измерения текущего через нее электрического тока, для чего необходимо прикладывать разность потенциалов U к НТ. Здесь стоит отметить, что в экспериментальной системе, которая отображена на рисунке 1, разность потенциалов на БЛМ равна прикладываемой к электродам (мы не учитываем сопротивление пипетки). Дело в том, что электрическое сопротивление в месте контакта мембраны со стеклянной пипеткой много меньше сопротивления самой мембраны и мениска. Таким образом, трансмембранный потенциал меняется вдоль НТ от 0 у кончика пипетки до прикладываемого значения U у плоской БЛМ. Согласно уравнению электрокапилярности Липпмана: C0Vt 2 σ = σ0 − (11), 2 где σ – натяжение БЛМ, а C0 – ее удельная емкость. Как следует из уравнения (II), электрическое поле приводит к уменьшению латерального натяжения мембраны НТ вдоль трубки. Таким образом, форма НТ будет отклоняться от цилиндрической согласно формуле (9). Для нахождения новой формы НТ снова решали вариационную задачу о нахождении минимума функционала ее свободной поверхностной энергии. Единственное отличие здесь заключается в том, что мембрану представляли не в виде двух коаксиальных цилиндров, а в виде одного с нейтральной поверхностью, лежащей на границе раздела монослоев. Это связано с тем, что трансмембранный потенциал невозможно “поделить” между монослоями. Для симметричной мембраны J0 = 0, поэтому выражение свободной поверхностной энергии dW элемента мембраны площадью dA будет иметь вид: ⎛ C0Vt 2 ⎞ K ⎟⎟dA + J 2 dA dW = ⎜⎜ σ 0 − (12), 2 ⎠ 2 ⎝ здесь K – модуль изгиба бислоя. В предположении, что C0Vt2 << σ0 (это верно вплоть до 200 мВ, так как латеральное натяжение БЛМ около 1дин/см, а удельная емкость 1 мкФ/см2), отклонение формы НТ от цилиндра будет малым. Введем значение радиуса НТ как функцию y(x), где x – координата вдоль оси НТ: y ( x) = r + z ( x) (13), где r – радиус нейтральной поверхности бислоя, а z(x) – малое отклонение от него. Тогда элемент площади нейтральной поверхности НТ будет равен: 2 dA = 2πy ( x ) 1 + ( y ′( x) ) dx а кривизна будет определяться выражением: J ( x) = 1 2 y( x) 1 + ( y′( x) ) − y′′( x) (14), (15). (1 + ( y′( x)) ) 3 2 2 Распределение напряжения вдоль НТ будет иметь вид: ∫ (r + z (q)) dq V ( x) = U ∫ (r + z (q)) dq x t 0 l NT −2 (16), −2 0 12 откуда видно, что Vt(0) = 0, а Vt(lNT) = U. Свободная энергия всей НТ записывается как: l NT l NT dW W= ∫ dx = ∫ f ( x)dx (17), dx 0 0 и минимизируется с помощью стандартного уравнения Эйлера-Лагранжа: ∂f d ∂f d 2 ∂f − + 2 =0 (18). ∂z dx ∂z ′ dx ∂z ′′ Раскладывая функцию f(x) по z(x) до второго порядка и предполагая, что Vt(x) не зависит от формы трубки, получаем дифференциальное уравнение: C0Vt 2 ( x) K K K σ 0 − 2 + 3 z ( x) − − σ 0 rz ′′( x) + z ′′( x) + Krz ( 4 ) ( x) = 0 (19). 2r 2 2r r Если в уравнение (19) подставить z(x) = 0 и Vt(x) = 0, то получившееся соотношение будет определять связь равновесного радиуса нейтральной поверхности НТ с механическими параметрами БЛМ: 1 2σ 0 = (20). 2 r K Выражение (20) очень похоже на (9), и если учесть, что σ0 = 2σp, а K = 2k, то легко получить уравнение, связывающее внутренний радиус НТ и радиус r нейтральной поверхности: 1 1⎛ 1 1 ⎞ ⎟ = ⎜⎜ 2 + 2 2 ⎝ ri (ri + h )2 ⎟⎠ r (21). Подставляя (20) в (19) получаем: Krz ( 4) ( x) + Kz ( x) C0Vt 2 ( x) − =0 2 r3 (22). Разложение Vt(x) имеет вид: Ux ⎛⎜ 2 2 Vt ( x) ≈ 1 − ∫ z (q)dq + ⎜ l NT ⎝ xr 0 l NT r x ⎞ ⎟ z ( q ) dq ∫0 ⎟ ⎠ l NT (23). Не учитывая члены следующего порядка малости типа U2z(x), оставляем в скобках из выражения (23) только 1; после подстановки (23) в (22) получаем уравнение, определяющее форму НТ: Kz ( x ) C0U 2 x 2 − =0 Krz ( x) + 2 2l NT r3 ( 4) (24). Общее решение однородной части (24) представляет собой гармоническую функцию, амплитуда которой экспоненциально затухает с характерной длиной, равной 2r . Частное решение уравнения (28) имеет вид: C0U 2 r 3 2 z ( x) = 2 x 2l NT K (25). Таким образом, находим, что при наложении разности потенциалов к концам НТ, ее форму в первом приближении можно считать параболической. Следует отметить, что в этом случае сохраняется гиперболическая зависимость ее проводимости от длины. Сопротивление R такой трубки для z(x)<<r определяется выражением: 13 l NT l NT ρl NT ⎛ C0U 2 r 2 ⎞ ρ ⎛ 2 z ( x) ⎞ ⎜1 − ⎟⎟ ≈ − = 1 R= ∫ dx ⎜ ⎟ (26), 2 2 ∫ 2 ⎜ π π r 3 K r r ( ) + ( ) π r z x ⎝ ⎠ ⎝ ⎠ 0 0 откуда видно, что оно линейно зависит от длины. Теперь найдем связь между измеряемым радиусом rNT нанотрубки, ее механическими параметрами и прикладываемому к концам НТ напряжению. Во-первых, определяемый экспериментально радиус НТ (см. Экспериментальное определение радиуса НТ) соответствует радиусу люмена некоторого эффективного мембранного цилиндра, имеющего ту же проводимость и длину, что и НТ. Во-вторых, согласно уравнению (26) равновесный радиус нейтральной поверхности такого цилиндра reff будет зависеть от прикладываемого к концам НТ напряжения следующим образом: ρdx 1 1 C0U 2 = − reff2 r2 3K (27), где r – равновесный радиус нейтральной поверхности цилиндрической НТ (когда U = 0), или, с учетом (20): 1 2σ 0 C0U 2 = − reff2 K 3K (28). И, в-третьих, как следует из уравнения (21), равновесный радиус эффективного цилиндра связан с измеряемым rNT выражением: ⎞ 1 1⎛ 1 1 ⎟ ⎜ = + 2 ⎜⎝ (rNT + a )2 (rNT + a + h )2 ⎟⎠ reff2 (29). Здесь учтено, что ri = rNT + a, где a – толщина слоя полярных головок липидов во внутреннем монослое, равная 0.5 нм. Таким образом, окончательное выражение, связывающее измеряемый радиус люмена НТ с механическими параметрами БЛМ и прикладываемым напряжением, имеет вид: 1 1 4σ 0 2C0U 2 + = − 3K (rNT + a )2 (rNT + a + h )2 K (30). Следовательно, с ростом U должно происходить увеличение измеряемых значений радиусов НТ. Такая зависимость представлена на рисунке 4а. Построение зависимости левой части выражения (30), которая определяется экспериментально, от квадрата приложенного к НТ напряжения, как это изображено на рисунке 4б, дает возможность по углу наклона найти модуль изгиба K мембраны, а по точке пересечения с осью ординат - латеральное натяжение σ0. Ниже приведена таблица найденных значений K и σ0 для БЛМ различного липидного состава. Из таблицы видно, что жесткость фосфолипидных БЛМ увеличивается с ростом концентрации в них холестерина. В то же время ее латеральное натяжение практически не меняется и равно примерно 1 дин/см, что совпадает с величиной, найденной методом выдувания (Черномордик и др., 1987). Однако модули изгиба мембран, измеренные нами на НТ, оказались в два раза меньше полученных на гигантских липосомах (Bo and Waugh, 1989; Rawicz et. al., 2000; Henriksen et. al., 2004;). Это несоответствие, скорее всего, вызвано тем, что радиусы структур, для которых определяют модули изгиба мембран, отличаются на порядки. Поэтому если мы имеем дело с многокомпонентной мембраной, и значение спонтанных кривизн этих компонент сильно различаются, как в случае ДОФХ и ДОФЭ (Leikin et. al., 1996; Chen and Rand, 1997), то липидные составы внешнего и внутреннего монослоев НТ будут разными. 14 Это, в свою очередь, должно приводить к уменьшению жесткости мембраны НТ (Kozlov and Helfrich, 1992). Что касается фосфолипидных мембран, содержащих лизолипид и холестерин, то, насколько нам известно, подобных измерений ранее не проводилось. Модуль изгиба таких мембран измерен нами впервые. Видно, что он аномально высок, что, скорее всего, связано с плотной упаковкой холестерина с лизолипидом в бислое. В работах (Ramsammy et. al., 1983) было показано, что они могут образовывать между собой водородные связи. Рис.4. а – зависимость измеряемого rNT от приложенного к концам НТ напряжения. б – определение механических параметров бислоя из зависимости правой части уравнения (30) от квадрата приложенного к НТ напряжения. ДОФХ:ДОФЭ 2:1 + Холестерин Хол % K, Дж·10-20 σ, дин/см 0 3.6 ± 0.3 1.2±0.4 5 4.6 ± 0.6 1.0±0.2 10 5.8 ± 0.6 1.1±0.3 15 6.8 ± 0.7 1.1±0.2 ДОФХ:ДОФЭ 2:1+Хол:ОФХ 1:1 Хол:ОФХ% K, Дж·10-20 σ, дин/см 0 3.6 ± 0.3 1.2±0.4 10 12.8±1.6 0.9±0.2 20 35.3±3.3 0.9±0.3 40 76.4±5.6 0.8±0.2 Таблица 1. Зависимость механических параметров БЛМ от ее липидного состава. Отметим, что зависимость радиусов НТ от концентрации лизолипидов и холестерина в бислое может иметь определенное биологическое значение. Согласно последним исследованиям внутриклеточного и межклеточного транспорта (Duman et. al, 2003; Rustom et. al., 2004), цилиндрические мембранные образования играют важную роль в этом процессе. Эффективность такого транспорта зависит от проницаемости мембранных трубок, а значит, от их размеров. Можно предположить, что холестерин и лизолипид используются клетками в качестве модуляторов селективности клеточных мембранных НТ. Исследование механизма деления клеточной мембраны в модельной системе «НТ + ГТФаза динамин». Взаимодействие НТ с динамином. Для исследования деления мембранной НТ белком динамином, ее вытягивали из БЛМ, содержащих 15-30 % отрицательно заряженных липидов (фосфотидилсерин, ФС). Использовались мембраны двух липидных композиций - ДОФХ:ДОФЭ:ДОФС:Холестерин 27.5:27.5:15:30 и ДОФХ:ДОФЭ:ОФС:Холестерин 30:30:20:20, имеющих практически одинаковую плотность поверхностного заряда, но разное значение модуля изгиба, 17±3 kT и 15 150±20 kT соответственно, что позволяло получать НТ двух типов: с радиусом люмена 6.1±0.5 нм и 21±0.5 нм (далее такие трубки с r = 21 нм будем называть широкими или шНТ). Для подтверждения факта адсорбции динамина на поверхность БЛМ, содержащих ФС, использовали метод измерения второй гармоники трансмембранного потенциала (см. Материалы и Методы). Было обнаружено, что регистрируемый эффект возникал только при высоком содержании ДОФС в мембране, более 80%. На рисунке 5а показано, что добавление динамина с одной из сторон БЛМ (ДОФС:Холестерин 85:15) в конечной концентрации 0.04 мг/мл приводит к возникновению трансмембранного потенциала равного 10 мВ; характерное время адсорбции составляло минуты. Эффект кратковременной аппликации динамина к поверхности БЛМ посредством перфузионной пипетки изображен на рисунке 5б; он демонстрирует, что процесс адсорбции белка на плоскую мембрану обратим. Рис.5. а – возникновение трансмембранного потенциала на БЛМ (липидный состав ДОФС:Хол 85:15) при добавлении с одной из ее сторон динамина с конечной концентрацией 0.04 мг/мл, момент добавления белка отмечен стрелкой. б – обратимость сорбции динамина на БЛМ (липидный состав ДОФС:Хол 85:15). Динамин добавляли посредством перфузионной пипетки, концентрация белка в пипетке составляла 0.4 мг/мл. Время начала аппликации белка отмечено стрелкой вниз, время прекращения – стрелкой вверх. Данные, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии, свидетельствуют о том, что динамин сорбируется на поверхности НТ, мембрана которой содержит ДОФС. На рисунке 6а представлены последовательно сделанные фотографии НТ, вытянутой из гигантской униламелярной липосомы до добавления динамина и после кратковременной его аппликации. Липидный состав липосомы был таков: ДОФС:ДОФХ:ДОФЭ:Хол:ДОФЭ-родамин 15:27.5:24.5:30:3, причем родамин использовался в качестве флуоресцентной метки. Из сравнения фотографий видно, что динамин сорбируется и формирует на поверхности НТ белковую структуру, которая сжимает трубку. Для исследования динамики этого процесса мы измеряли проводимость внутренних каналов НТ и шНТ. Для определения эффекта, оказываемого динамином на геометрию НТ, мы добавляли его (концентрация 0.4 мг/мл) посредством перфузионной пипетки, которую подводили к НТ на расстояние не более 2 мкм (см. Материалы и Методы). Постепенное уменьшение проводимости свидетельствовало о сужении трубки, предположительно вызванным сжатием ее динаминовой спиралью. В течение десятков секунд проводимость достигала нового стационарного уровня (рис. 6б). В аналогичных эксперимен16 тах с шНТ характер изменения проводимости сохранялся, но только становился более медленным (см. рис 6б). Кроме изменения стационарного уровня проводимости, адсорбция динамина влияла на устойчивость НТ к уменьшению ее длины: так, если длину свободной НТ можно было укоротить практически до 0, то после аппликации динамина НТ рвалась (см. рис 6б) при достижении некоторой длины, отличной от 0. Рост проводимости свидетельствовало том, что белок только частично покрывал поверхность трубки. После того как длина НТ достигала некоторого значения, дальнейшее укорочение становилось невозможным - трубка рвалась в ответ на механическое воздействие. Рис.6.Поджатие НТ динамином. а - динамин добавили к флуоресцентно меченной НТ между 0 с и 5 с посредством перфузионной пипетки. Концентрация белка в пипетке 0.4мг/мл. Состав мембраны ДОФС:ДОФХ:ДОФЭ:Хол:ДОФЭ-родамин 15:27.5:24.5:30:3. Масштаб 5 мкм. б – уменьшение проводимости НТ (черная кривая) и шНТ (серая кривая) в результате кратковременной добавки к ним динамина; последующая попытка укоротить НТ приводит к ее разрыву (проводимость резко падает до фонового уровня Gbg). Правая ось ординат соответствует относительной проводимоG − Gbg сти нанотрубки, которая находится из соотношения Gотн = , левая ось ординат соотGinit − Gbg ветствует длине НТ (верхняя кривая справа от пунктирной линии), ось абсцисс – время, для НТ единица шкалы 1 с, а для шНТ 10 с. Так как во время локальной перфузии белка степень покрытия нанотрубки динамином сильно варьировалась, в другой серии экспериментов НТ вытягивали в присутствии динамина (концентрация 4 мкМ) в растворе электролита. Показано, что в используемых концентрациях динамин не оказывал влияния на проводимость НТ. Напротив, проводимость НТ начинала постепенно уменьшаться сразу после ее образования (см. рис 7а). Это подтверждает тот факт, что динамин собирается в спираль только на мембранах, имеющих достаточную кривизну (Yoshida et. al., 2004). После того как проводимость НТ достигает стабильного уровня, ее реакция на уменьшение длины НТ исчезает. Это свидетельствовало о том, что динамин полностью покрывал НТ, образуя на ее поверхности стабильную белковую спираль, способную навязывать НТ большую кривизну. При этом сохранялась возможность дальнейшего удлинения НТ (рис. 7б). После того как пэтч-пипетка отводилась от БЛМ, и, тем самым, вытягивался новый свободный участок НТ, динамин довольно быстро собирался на нем и сжимал его (рис. 7б). Зная длину вытянутого участка трубки (она в точности равнялась смещению пипетки), мы нашли, что независимо от его длины значение радиуса люмена, до которого сжималась НТ, составляло 2.5±0.5 нм (SD, n=4), в то время как для шНТ эта величина была равна 12±2 нм (SD, n=4). Соответственно, ди17 намин вызывал уменьшение проводимости нанотрубки в три раза (см. рис.8в, два левых столбца); усреднение проводилось по 15 экспериментам с НТ и 9 экспериментам с шНТ. Меняя липидный состав мембраны, мы обнаружили, что конечный размер сжатой динамином нанотрубки зависит от жесткости мембраны. Это говорит о том, что энергия, выделяемая белком в процессе его полимеризации, не намного превосходит изгибную энергию НТ. Тем не менее, для сжатия нанотрубок до столь малых радиусов она должна быть существенной. В случае шНТ, найденное нами значение оказалось порядка 10 kBT на одну молекулу динамина. При вычислении мы предполагали, что упаковка динамина на поверхности шНТ аналогична той, что наблюдалась на нанотрубках того же размера в других экспериментальных системах(Zhang and Hinshaw, 2001). Таким образом, можно сделать заключение, что в отсутствии ГТФ динамин кластеризуется на поверхности липидных нанотрубок, формируя жесткую структуру, которая достаточно сильно их сжимает, причем степень поджатия определяется жесткостью их мембраны. Деления НТ без ГТФ не происходит. Рис.7. а – влияние динамина на формирование НТ (динамин присутствует в растворе электролита в концентрации 0.04 мг/мл), серая кривая отображает поведение НТ в отсутствии белка, проводимость НТ нормирована относительно начальной проводимости. б – изменение проводимости сжатой динамином НТ после ее удлинения; пунктирная линия отмечает начало уменьшения проводимости НТ только за счет сжатия белком вновь вытянутого участка. Взаимодействие НТ с динамином в присутствии ГТФ. Инициировать деление можно было ГТФ, который добавляли двумя способами: либо с помощью перфузионной пипетки после адсорбции динамина на НТ, либо введением в раствор электролита одновременно с динамином до формирования НТ (см. Материалы и Методы). В первом случае исследовали эффект, который оказывал гидролиз ГТФ на динаминовую спираль. Добавление нуклеотида к сжатым динамином НТ и шНТ приводило к быстрому росту их проводимости (см. рис. 8а). Относительная проводимость шНТ при этом обычно достигала нового стационарного уровня, который был ниже 1 (см. рис. 8в, центральная пара столбцов). Причем она быстро возвращалась к исходному значению после удаления ГТФ из раствора (см. рис. 8а). В 6 из 6 экспериментов деления шНТ после добавления ГТФ не наблюдалось, а НТ, напротив, в 3 18 из 3 случаев рвалась. После предварительного роста ее проводимость мгновенно падала до 0, что и соответствовало ее разрыву. Время роста менялось от эксперимента к эксперименту, относительная проводимость НТ при этом успевала вырасти примерно вдвое (см. рис. 8в, центральная пара столбцов). Структурный анализ на основе электронной микроскопии показал, что гидролиз ГТФ может приводить к изменению шага и/или радиуса динаминовой спирали, что согласно существующим предположениям, должно вызывать дальнейшее сужение и деление нанотрубки (Sweitzer and Hinshaw, 1998; Stowell et. al., 1999). Однако обнаруженный нами рост проводимости нанотрубки не вписывается в рамки этих предположений. Стоит отметить, что его скорость сравнима с наблюдаемыми трансформациями динаминовой спирали под воздействием гидролиза ГТФ. Действительно, рост проводимости вызван скорее изменением организации динамина в спирали, чем десорбцией его с мембраны, которая согласно ряду работ существенно медленнее (Tuma and Collins, 1995). Кроме того, сжимающая способность белковой спирали быстро восстанавливается после удаления ГТФ из системы (см. рис. 8а). Следовательно, изменения ее структуры все же происходят, но они не направлены на сужение НТ. В цитоплазме клетки динамин всегда находится вместе с ГТФ. Поэтому во второй серии экспериментов исследовали взаимодействие белка с нанотрубками в присутствии ГТФ. Одновременная аппликация динамина (0.04 мг/мл) и ГТФ (1 мМ) приводила к такому же скачкообразному делению НТ (см. рис. 8б) – проводимость НТ менее чем за 1 мс падала до 0 (см. рис. 9б). Обрыв НТ наблюдался в 11 из 14 таких экспериментов. Поджатие НТ перед этим если и наблюдалось, то было незначительным: на рисунке 8в черный столбец из правой пары соответствует значению относительной проводимости НТ, которое она достигала перед делением. Когда вместо ГТФ использовали его негидролизуемый аналог ГТФγS, динамин не рвал НТ, а сжимал их так же, как делал это без ГТФ (в 4 из 4 экспериментов). В отличие от НТ в присутствии ГТФ и динамина шНТ оставалась стабильной, при этом она слегка поджималась (см. рис. 8б). Поджатие было примерно вдвое слабее, чем в присутствии одного динамина (см. рис 8в). Стоит отметить, что уровень относительной проводимости, который достигала шНТ, не зависел от способа введения ГТФ – после динамина или одновременно с ним (см. рис. 8в). Длину такой шНТ можно было спокойно уменьшать практически до 0, трубка не рвалась. Полученные данные свидетельствует о том, что гидролиз ГТФ препятствует образованию протяженной жесткой белковой структуры и, тем самым, не позволяет динамину сжимать НТ и шНТ по всей длине. Далее было показано, что деление НТ в этих условиях не сопровождалось формированием проводящих дефектов в ее мембране. Для этого в верхний отсек ячейки, изображенный на рисунке 1, погружали третий электрод, с помощью которого следили за электрической утечкой мембраны. В момент обрыва НТ никаких всплесков ее проводимости не было. Это говорит о том, что деление НТ идет через образование структуры полуделения, что возможно только после того, как НТ будет сжата так, что ее внутренний монослой сможет локально перезамкнуться. Следовательно, динаминовая спираль, конформационные изменения в которой приводят к делению НТ, очень короткая. В противном случае мы наблюдали бы значительное уменьшение проводимости нанотрубки перед ее делением. 19 Рис.8. Влияние динамина и ГТФ на относительную проводимость нанотрубок. а – добавление ГТФ к сжатым динамином нанотрубкам приводит к росту проводимости как НТ (черная кривая), так и шНТ (серая кривая). НТ всегда рвалась после некоторого периода роста ее проводимости, в то время как шНТ оставалась стабильной и снова быстро сжималась после удаления ГТФ. б – одновременная аппликация динамина и ГТФ вызывала быстрое деление НТ (черная кривая) и слабое поджатие шНТ (серая кривая), длину шНТ можно было свободно варьировать. в – характерные уровни проводимости, которые достигают НТ (черные столбцы) и шНТ (серые толбцы) после инкубации с динамином; после добавления ГТФ к нанотрубкам, сжатым динамином; после инкубации одновременно с динамином и ГТФ (для НТ в последних двух случаях имеется в виду проводимость, предшествующая ее разрыву). Для регистрации формирования на поверхности НТ таких коротких динаминовых структур был проведен ряд экспериментов с короткими НТ. Для этого, в присутствии динамина (0.04 мг/мл) и ГТФ (1 мМ) нанотрубку сразу после формирования быстро укорачивали до 400 ± 200 нм длины (см. рис. 9а). В 18 из 18 экспериментов делению короткой НТ всегда предшествовали медленные волнообразные флуктуации ее проводимости (см. рис. 9а), тогда как в отсутствии ГТФ колебания проводимости не наблюдались. Из анализа изменения проводимости НТ в этих экспериментах можно выделить два процесса: медленный (десятки секунд), соответствующий обратимому изменению геометрии НТ (сужение/расширение участка НТ), и быстрый (доли миллисекунд), соответствующий непосредственно делению НТ. Мы считаем, что быстрый процесс напрямую не связан с конформационными изменениями динаминовой спирали, так как они никогда не наблюдались в экспериментах с шНТ, а распределение времен жизни НТ в этих условиях было довольно широким (см. рис. 9в). Кроме того, маловероятно, что первое же конформационное изменение всегда приводит к делению НТ. Поэтому медленным процессам, описанным выше, скорее всего, соответствуют конформационные изменения динаминовой спирали на поверхности НТ. Можно предположить, что жесткость динаминовой спирали определяется только латеральным (т.н. стэкинг) взаимодействием плотно примыкающих друг к 20 другу витков, о котором известно, что оно ответственно не только за самосборку спирали, но и ускорение гидролиза ГТФ. Тогда, согласно нашим данным, кооперативный гидролиз ГТФ должен приводить к разъединению витков, в результате чего спираль теряет жесткость и перестает фиксировать форму НТ. Более того, с помощью электронной микроскопии ранее было показано, что в присутствии ГТФ динамин формирует нерегулярную спираль, имеющую большое количество протяженных участков с неплотной упаковкой динамина (Stowell et. al., 1999). Это объясняет как наблюдаемое расширение сжатых динамином нанотрубок после добавления к ним ГТФ (см. рис. 8а), так и колебания проводимости коротких НТ (см. рис. 9а), которые отражают динамическое равновесие спирали между “жестким” и “мягким” состояниями. Из анализа амплитуды этих колебаний мы нашли, что в присутствии ГТФ (1 мМ) спираль содержит от 3 до 5 жестких витков. Рис. 9. Деление короткой НТ динамином в присутствии ГТФ. а – Делению коротких НТ предшествуют волнообразные колебания ее проводимости. б – Одновременное измерение проводимости НТ (черная кривая) и проводимости утечки сквозь стенку НТ (серая кривая). Сноска наверху изображает деление с большим временным разрешением. в – Гистограмма времен жизни коротких НТ в присутствии динамина и ГТФ. Механизм деления НТ ГТФазой динамином. Нами показано, что, с одной стороны, гидролиз ГТФ необходим для деления НТ, но, с другой, его энергия расходуется не на дальнейшее сужение и деление мембраны НТ, а на разъединение витков динаминовой спирали, в результате чего последняя теряет жесткость. Так как динамин вызывал деление только НТ, а шНТ оставалась стабильной, мы считаем, что именно значение радиуса, который динамин навязывает нанотрубке до гидролиза ГТФ, определяет возможность ее дальнейшего деления. В теоретической работе (Kozlovsy and Kozlov, 2003) было показано, что образование структуры полуделения, а вслед за этим и само деление возможно, если радиус кривизны внутреннего монослоя станет меньше 2 нм (радиус люмена ~ 1.5 нм). Поэтому динаминовая спираль сама по себе (без ГТФ) не способна поделить НТ, т.к. она не обеспечивает такого плотного сжатия – радиус люмена, до которого динамин сжимает НТ, равен 2.5 ± 0.5 нм. Для того чтобы мембрана НТ начала провисать между соседними витками такой спирали, ее внутренний радиус должен стать меньше критического: rc ≈ 2 нм - при этом значении расстояние между витками (в случае плотной упаковки это 13 нм) становится равным внешнему диаметру НТ. Если же внутренний радиус НТ несколько больше rc, то для обеспечения ее локального сужения и деления необходимо 21 увеличение расстояния между любыми соседними витками. Чем больше радиус люмена, тем дальше должны расходиться витки. Следовательно, при близких к rc значениях даже незначительное увеличение расстояния между витками спирали может привести к делению НТ. Наше предположение заключается в том, что именно так и происходит деление мембраны в системе “мембранная НТ – ГТФаза динамин”. А именно, динамин сорбируется и наращивает спираль на поверхности НТ, сжимая ее под собой практически до rc. Латеральное взаимодействие витков спирали запускает кооперативный гидролиз ГТФ, который в свою очередь приводит к их разъединению. Далее, как показали теоретические расчеты (Akimov et. al., 2007), в зависимости от длины участка спирали, потерявшего жесткость, может происходить как провисание, так и расширение НТ (см. рис. 10). Расчеты проводились в предположении, что поток липида под спиралью затруднен, и площадь НТ между витками сохраняется. Стоит отметить, что чем длиннее будут участки спирали, оставшиеся жесткими, тем больше времени потребуется на увеличение расстояния между ними. За это время количество гидролизовавших ГТФ примыкающих витков может стать больше, так что заключенной в них НТ будет уже более выгодно расширяться (см. рис. 10). Это объясняет наблюдаемый нами предварительный рост проводимости НТ перед делением при добавлении ГТФ к НТ после динамина (см. рис. 8а). Рис. 10. Механизм деления НТ динамином. а – НТ, сжатая жесткой динаминовой спиралью (жесткие участки отмечены черным цветом), серыми стрелками отмечен виток, гидролизующий ГТФ. б – в результате гидролиза ГТФ один из витков перестал плотно контактировать с соседними (отмечен серым цветом). в – оставшиеся жесткими участки спирали не успевают разойтись, прежде чем число гидролизовавших ГТФ витков увеличится ( на рис. б они отмечены серыми стрелками), после этого происходит расширение НТ. г – оставшиеся жесткими участки спирали расходятся, в результате чего НТ локально сужается и формирует структуру полуделения, которая приводит к полному делнию НТ. Энергия, необходимая для сжатия НТ до rc сравнима с энергией, выделяемой в результате кооперативного гидролиза ГТФ динаминовой спиралью (см. выше). Таким образом, можно сказать, что динаминовая спираль работает по принципу заводного механизма. Выделяемая в процессе самосборки белком энергия идет на деформацию мембраны НТ, а энергия гидролиза ГТФ расходуется на размыкание витков 22 его спирали, динамин при этом возвращается практически в исходное состояние, когда он снова готов скручиваться и сжимать НТ. Нами показана тесная взаимосвязь между динамином и липидным бислоем, что имеет биологическую значимость. Чувствительный к кривизне динамин будет полимеризоваться только на поверхности сильно изогнутых мембранных перешейков и будет регулировать их проводимость и/или делить их в зависимости от геометрических и механических параметров последних. Вариацией липидного состава перешейка можно управлять процессом его деления. В присутствии ГТФ динамин может существенно менять проницаемость перешейка, периодически сжимая – разжимая его, так что флуктуации его проводимости будут типа “kiss-and-run” (Newton et. al., 2006). Суммируя все выше сказанное, мы можем сделать вывод о том, что “сотрудничество” динамина с липидными мембранами предоставляет клетке универсальный инструмент, позволяющий контролировать многие аспекты поведения мембранных НТ. ВЫВОДЫ. 1. Разработан метод определения механических параметров мембраны нанотрубки НТ (модуль изгиба, латеральное натяжение), основанный на анализе стационарной формы НТ, к концам которой приложена разность потенциалов. Показано, что жесткость многокомпонентной мембраны уменьшается с ростом ее кривизны. Это может быть связано с перераспределением липидных молекул, имеющих разное значение спонтанной кривизны, между внутренним и внешним монослоем мембраны. Когда радиус кривизны становится сравним с толщиной бислоя, модуль изгиба уменьшается вдвое. 2. Показано, что система, состоящая из отрицательно заряженной липидной нанотрубки и ГТФазы динамина, адекватно воспроизводит основные стадии деления клеточной мембраны. Динамин сжимает НТ, сорбируясь и формируя стабильную структуру на ее поверхности. Возможность деления НТ динамином в присутствии ГТФ определяется жесткостью ее мембраны, причем деление происходит без образования проводящих дефектов в стенке НТ. 3. Показано, что конформационные изменения динаминовой спирали в результате гидролиза ГТФ не вызывают ни дальнейшего ее сужения, ни увеличения ее шага. В действительности гидролиз ГТФ приводит к исчезновению стекинг-взаимодействия между витками спирали, они разъединяются, а спираль в итоге теряет жесткость. Показано, что в физиологических условиях динамин формирует на поверхности НТ спирали, имеющие всего 3-5 жестких витков. 4. Радиус, до которого динамин сжимает НТ, является критическим параметром, определяющим возможность деления, а он в свою очередь зависит от модуля изгиба мембраны. Таким образом, нами показано, что молекулы липида наравне с динамином могут выполнять регуляторную роль в процессе деления клеточной мембраны. 5. На основе полученных данных было выдвинуто предположение о механизме деления НТ динамином. Согласно ему энергия гидролиза ГТФ расходуется на разъединение витков спирали динамина. Дальнейшая эволюция НТ зависит от радиуса, до которого она была сжата динамином, а также от длины участка спирали, гидролизовавшего ГТФ. 23 РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ 1. П. В. Башкиров. “Мембранные нанотрубки в электрическом поле как система для измерения механических параметров липидного бислоя.” Биологические мембраны, 2007, том 24, № 2, с 183-192. 2. Bashkirov P. V. “Membrane Nanotubes in Electrical Field as a Model to Measure Mechanical Parameters of Lipid Bilayer” Biochemistry (Moscow), series A: Membrane and Cell Biology, 2007, Vol. 1, № 2, pp. 176-184. 3. Bashkirov P.V., Lizunov V. A., Zimmerberg J., Frolov V.A. “Membrane nanotubes pulled from planar BLM: membrane mechanics at very high curvatures.” // Biophysical Society’s 50-th Annual meeting, 18-22 Feb 2006, Salt Lake City, Utah, USA. Biophysical Journal, January 2006, Vol. 90, p. 784. 4. Frolov V. A., Bashkirov P. V., Lizunov V. A., Zimmerberg J. “Regulation of permeability through membrane nanotubes via shape transformation” // EMBO workshop on Cell Membrane Organization and Dynamics, 3-7 Jun 2006, Bilbao, Spain. Тезисы, стр. 18. 5. Akimov S. A., Bashkirov P. V., Zimmerberg J., Frolov V. A., “A possible role of curvature scaffolding in dynamin-induced fission of membrane nanotube” // Society of general physiologists 61-th annual meeting and symposium, Membrane biophysics of fusion, fission and rafts in health and disease, Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA, Sep. 5-9, 2007, proceedings p. 18a 24
