ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА» ФАКУЛЬТЕТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ На правах рукописи Викулина Анна Сергеевна ПЕРОКСИДАЦИЯ ЛИПИДОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЦИТОХРОМА C И ЕГО КОМПЛЕКСА С АНИОННЫМИ ЛИПИДАМИ И ЕЕ РОЛЬ В АПОПТОЗЕ 03.01.02 – Биофизика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: академик РАН, проф., д.б. н., Владимиров Юрий Андреевич Москва, 2015 Оглавление 1. ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................................ 6 1.1. Актуальность работы ..................................................................................................................... 6 1.2. Цели и задачи................................................................................................................................... 7 1.3. Положения, выносимые на защиту ............................................................................................... 9 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ...................................................................................................... 11 2.1. Молекулярно-биологические основы апоптоза ......................................................................... 11 2.1.1. Апоптоз как один из механизмов клеточной смерти .................................................................... 11 2.1.2. Некроз и апоптоз .............................................................................................................................. 12 2.1.3. Молекулярные механизмы апоптоза .............................................................................................. 14 Цитохром c: строение, свойства и биологические функции..................................................... 21 2.2. 2.2.1. Класс цитохромов ............................................................................................................................ 21 2.2.2. Строение и физико-химические свойства цитохрома c ................................................................ 22 2.2.3. Цитохром c в клетке......................................................................................................................... 24 Взаимодействие цитохрома c с анионными липидами ............................................................. 27 2.3. 2.3.1. Липидный состав клетки, анионные липиды и кардиолипин ...................................................... 27 2.3.2. Образование комплекса цитохрома c с анионными липидами .................................................... 31 2.3.3. Комплекс цитохрома c с АЛ как пероксидаза ............................................................................... 34 2.4. Методы исследования процессов липидной пероксидации ..................................................... 46 2.4.1. Методы обнаружения свободных радикалов ..................................................................................... 47 2.4.2. Хромато-масс-спектрометрическое определение продуктов пероксидации липидов .............. 52 2.4.2. Биофизические модели мембран .................................................................................................... 54 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ...................................................... 57 3.1. Реагенты ......................................................................................................................................... 57 3.2. Культуры клеток и используемый биологический материал.................................................. 60 2 3.3. Аппаратура .................................................................................................................................... 64 3.4. Изучение взаимодействия цитохрома c и его комплекса с кардиолипином с липидными гидропероксидами ...................................................................................................................................... 66 Реакции разложения гидропероксидов липидов под действием цитохрома c и его комплекса с 3.4.1. анионными липидами .................................................................................................................................... 66 Реакции пероксидации БКЛ пероксидом водорода в присутствие цитохрома c ....................... 73 3.4.2. 3.5. Определение гидропероксидов липидов методом активированной хемилюминесценции .. 74 3.4.1. Родамин-активированная хемилюминесценция при окислении Fe2+ гидропероксидами липидов .......................................................................................................................................................................... 74 3.4.2. Люминол-активированная хемилюминесценция в реакции восстановления органических и липидных гидропероксидов под действием микропероксидазы ............................................................... 76 3.6. Получение комплекса цитохрома c с кардиолипином в гидрофобном растворителе ........... 79 3.7. Получение малых однослойных липосом методом экструзии ................................................. 80 3.8. Получение полиэлектролитных пленок методом послойной адсорбции ................................ 81 3.9. Адсорбция липидов на поверхности полиэлектролитных пленок .......................................... 82 3.9.1. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия (ЛСКМ) .................................................... 82 3.9.2. Выбор условий формирования липидного бислоя на поверхности полиэлектролитных пленок 82 3.9.3. 3.10. Транспорт белков через липидный бислой из раствора в полиэлектролитные пленки............. 83 Определение пероксидазной активности комплекса цитохрома c с ТОКЛ липидного монослоя хемилюминесцентным методом ............................................................................................... 84 3.11. Методы выделения, разделения и определения липидов клеточных культур и тканей животных ..................................................................................................................................................... 85 3.11.1. Экстракция липидов и определение содержания фосфолипидов в образце .......................... 85 3.11.2. Определение суммарного содержания белка (для тканей животных) ................................... 86 3.11.3. Разделение липидов методом тонкослойной 2D хроматографии ........................................... 87 3.11.4. Обработка липидного экстракта тканей смесью фосфолипаз А1 и А2 с последующим отделением жирных кислот методом твердофазной экстракции ............................................................... 88 4. 3.11.5. Разделение липидов методом ВЭЖХ ........................................................................................ 89 3.11.6. Масс-спектрометрическое определение липидов .................................................................... 90 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ................................................................................. 94 3 Молекулярные механизмы реакций пероксидации, катализируемых цитохромом c и его 4.1. комплексом с анионными липидами ........................................................................................................ 94 4.1.1. Взаимодействие цитохрома c и его комплекса с кардиолипином с органическими гидропероксидами .......................................................................................................................................... 94 4.1.2. Реакции взаимодействия цитохрома c и его комплекса с кардиолипином с анионными липидами и их гидропероксидами ................................................................................................................ 98 4.1.3. Хемилюминесцентные методики определения гидропероксидов липидов ............................. 110 Комплекс цитохрома c с кардиолипином в гидрофобном окружении .................................. 119 4.2. 4.2.1. Получение комплекса цитохрома c с кардиолипином в среде гидрофобного растворителя .. 120 4.2.2. Активность комплекса цитохрома c с кардиолипином в липидном монослое ........................ 124 4.2.3. Разработка модели клетки на основе липидного бислоя для изучения мембранно- ассоциированных процессов ....................................................................................................................... 126 Роль реакций пероксидации липидов под действием комплекса цитохрома c с анионными 4.3. липидами в развитии апотоза ................................................................................................................. 131 4.3.1. Механизм биосинтеза липидных медиаторов из кардиолипина митохондрий под действием цитохрома c в процессе апоптоза ................................................................................................................ 132 4.3.2. Пероксидация кардиолипина и других липидов в процессе апоптоза клеток мозга при церебральной ишемии-реперфузии после остановки сердца ................................................................... 141 4.3.3. Пероксидация липидов в процессе апоптоза клеток мозга substantia nigra при болезни Паркинсона ................................................................................................................................................... 150 4.3.4. Деградационная стадия апоптоза. Роль пероксидации липидов в формировании фагоцитарных сигналов «съешь меня» ................................................................................................................................ 152 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ...................................................................................................................160 6. ВЫВОДЫ ..............................................................................................................................162 7. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................163 4 Список сокращений Цит с – цитохром с; АЛ – анионные липиды; ФЛ – фосфолипиды; КЛ – кардиолипин; ТОКЛ – 1,1',2,2'-тетраолеилкардиолипин; БКЛ – кардиолипин, выделенный из сердца быка; Цит-АЛ – комплекс цитохрома с с анионными липидами; Цит-КЛ – комплекс цитохрома с с кардиолипином; ФС – фосфатидилсерин; ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты; ЛК – линолевая кислота; ЛК-ООН – гидропероксид линолевой кислоты; ПХ – пероксидаза из корней хрена; MP – микропероксидаза; ПОЛ – перекисное окисление липидов; АФК – активные формы кислорода; ХЛ – хемилюминесценция; ВЭЖХ-МС – высокоэффективная жидкостная спектрометрическим детектированием ФБ – фосфатный буферный раствор; ББ – боратный буферный раствор. ЛНП – липопротеины низкой плотности 5 хроматография с масс- 1. Введение 1.1. Актуальность работы Апоптоз - генетически запрограммированная смерть клетки, один из механизмов ее гибели наряду с некрозом, необходимый для развития многоклеточного организма и участвующий в поддержании тканевого гомеостаза [1]. В то же время, нарушения апоптоза лежат в основе патогенеза многих заболеваний: ингибирование апоптоза приводит развитию раковых опухолей [2], аутоиммунных болезней [3] и нейропрофилеративных заболеваний [4] (шизофрения); с усилением апоптоза связывают развитие СПИДа [5], нейродегенеративных заболеваний (болезнь Альцгеймера [6], паркинсонизм [7]), ишемических повреждений [8, 9] (инсульт, инфаркт миокарда) и пр. [10] Современные биофизические и медицинские исследования в области апоптоза направлены, в основном, на изучение его молекулярных механизмов, понимание которых позволит разработать эффективные способы контроля над этим процессом и, в конечном счете, управлять самой клеточной смертью. На настоящий момент известно, что апоптоз представляет собой многостадийный процесс биологически регулируемых последовательных событий, берущий свое начало в митохондриях, при этом ключевым моментом в развитии апоптоза принято считать образование комплекса между белком цитохромом c и анионным липидом митохондриальной мембраны кардиолипином, приводящее к образованию пор во внешней митохондриальной мембране и последующему высвобождению митохондриального цитохрома c в цитозоль [11, 12]. Было также показано, что комплекс Цит-КЛ обладает пероксидазной активностью и участвует в процессе пероксидации липидов [13, 14]. Точные молекулярные механизмы действия комплекса Цит-КЛ не были установлены, однако известно, что реакции пероксидации липидов под действием комплекса митохондриальной Цит-КЛ мембраны приводят к [15-17]. Вопрос нарушению о целостности существовании других биологических функций процесса пероксидации липидов под действием 6 комплекса цитохрома c с кардиолипином, а также другими анионным липидами остается открытым (рис. 1). Рис. 1. Процесс пероксидации липидов в апоптозе. Пояснения в тексте. Ответы на эти вопросы позволят уточнить механизм и значимость процесса пероксидации липидных мембран в апоптозе, что, в свою очередь, является важным шагом для понимания и регулирования механизмов клеточной смерти. 1.2. Цели и задачи Целью данной работы является изучение молекулярных механизмов реакций пероксидации липидов под действием комплекса цитохрома c с анионными липидами и исследование роли этого процесса в апоптозе. В ходе работы были поставлены следующие задачи: 1. Изучить молекулярные механизмы реакций липидной пероксидации под действием комплекса Цит-АЛ методом активированной хемилюминесценции в сочетании со спектральными методами исследования. 2. Сравнить пероксидазные свойства комплекса Цит-АЛ в водном окружении, полученного в результате взаимодействия цитохрома c с многослойными липосомами анионного липида или с монослоем липида 7 методом люминол-активированной хемилюминесценции. Разработать новые системы для изучения комплекса Цит-АЛ в гидрофобном окружении. 3. Выявить роль реакций пероксидации липидов под действием комплекса Цит-КЛ в биосинтезе липидных медиаторов в клетках, подверженных апоптозу, методом хромато-масс-спектрометрии. 4. Установить роль реакций пероксидации липидов под действием комплекса Цит-КЛ в тканях животных с ишемическими повреждениями и с нейродегенеративными заболеваниями (болезнь Паркинсона) методом ВЭЖХМС. 5. Установить роль пероксидации анионного липида фосфатидилсерина на последней (фагоцитарной) стадии апоптоза с использованием хромато-массспектрометрии. 6. Разработать методики экспрессного определения первичных продуктов реакций пероксидации липидов, их гидропероксидов, в химических системах и биологических объектах для медицинских исследований. Научная новизна работы. Для описания процесса пероксидации липидов под действием цитохрома c и его комплекса с АЛ предложено использовать две реакции. Описаны возможные схемы этих реакций. Определена пероксидазная активность комплекса Цит-КЛ в монослое липида. Комплекс Цит-КЛ впервые получен в гидрофобном растворителе. Показано, что комплекс Цит-КЛ в гидрофобном растворителе обладает пероксидазной активностью. Установлено, что реакции пероксидации липидов под действием комплекса Цит-КЛ играют роль не только при инициации апоптоза, но и приводят к биосинтезу окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов. Показано, что реакции пероксидации липидов под действием комплекса Цит-КЛ приводят к биосинтезу окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов, при болезни Паркинсона и при церебральной ишемии, вызванной остановкой сердца с последующей реперфузией. Установлено, что профагоцитарная активность фосфатидилсерина примерно в 50 раз выше по сравнению с неокисленным. 8 Практическая ценность работы. Открытие нового механизма биосинтеза окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов, важно для клинической практики: понимание механизма биосинтеза медиаторов воспаления для тех или иных заболеваний поможет выбирать оптимальную и наиболее эффективную схему лечения. Был установлен механизм биосинтеза липидных медиаторов при болезни Паркинсона и церебральной ишемии, вызванной остановкой сердца с последующей реперфузией, в последнем случае показана эффективность ингибитора действия пероксидации лекарственного кардиолипина. вещества Разработана и XJB-5-131, апробирована высокочувствительная методика (10-8 М) определения гидропероксидов липидов крови - маркера многих апоптоз-инициированных патологий. 1.3. Положения, выносимые на защиту 1. Пероксидация липидов под действием цитохрома c и его комплекса с анионными липидами осуществляется путем протекания двух реакций: собственно, пероксидации липидов под действием активных форм кислорода и реакции разложения гидропероксидов липидов с образованием липидных радикалов. 2. Комплекс Цит-КЛ впервые получен в неполярном растворителе. Соотношение липид:белок в комплексе в хлороформ-метанольной смеси найдено равным 77±11. 3. Реакции пероксидации кардиолипина под действием цитохрома c не только приводят к инициации апоптоза, нарушая целостность митохондриальной мембраны, но и могут сопровождаться последующими реакциями гидролиза окисленных жирных кислот Ca2+-независимыми фосфолипазами, что приводит к образованию окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов. 4. Биосинтез окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов, при церебральной ишемии, вызванной остановкой сердца с 9 последующей реперфузией происходит согласно предложенному выше механизму из окисленного кардиолипина. 5. Биосинтез окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов, при болезни Паркинсона происходит согласно предложенному выше механизму из окисленного кардиолипина. 6. Про-фагоцитарная активность окисленного фосфатидилсерина примерно в 50 раз выше, чем для неокисленного ФС. Личное участие автора заключалось в проведении всех экспериментов, результаты которых представлены в диссертационной работе, за исключением культивации клеток и описания клеточного ответа, а также операций, проводимых с животными; лично автором были проведены обработка и интерпретация всех полученных данных. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы были также представлены на симпозиуме с международным участием «Проблемы конференции медицинской «Второй биофизики» съезд (Москва, аналитиков России» 2012), (Москва, международной конференции «Ломоносов-2015» (Москва, 2015). 10 всероссийской 2013) и 2. Обзор литературы 2.1. Молекулярно-биологические основы апоптоза 2.1.1. Апоптоз как один из механизмов клеточной смерти Вопрос о гибели клеток, ее причинах, механизмах и возможных путях контроля этого процесса, является, пожалуй, одним из центральных вопросов современной медицинской и биологической науки. Последние десятилетия знания о механизмах клеточной смерти непрерывно расширялись и уточнялись, в результате чего первоначально простая концепция, противопоставляющая два механизма – некроз и апоптоз [1] - была несколько изменена. Были открыты новые формы клеточной смерти, которые, как и апоптоз, заложены (запрограммированы) в генетическом коде клетки. Последние достижения в этой области детально рассмотрены в ряде обзоров [18-20]. Все эти механизмы объединены под общим названием «программируемая клеточная смерть», хотя стоит отметить, что в ранних работах этот термин был синонимичен термину «апоптоз». Некроз при этом стали называть непрограммируемой клеточной смертью. Классификация механизмов клеточной смерти представлена в таблице 1. Программируемая клеточная смерть (ПКС) Апоптоз одноядерных клеток (ПКС I КаспазоНепрограммируемая зависимый клеточная смерть – механизм типа) Программированный некроз (ПКС III типа) Митотическая катастрофа некроз Сенессенс (клеточное старение) Аутофагия (ПКС II типа) Каспазонезависимые Параптоз механизмы Энтоз Таблица 1. Механизмы клеточной смерти. 11 Некроз можно описать как неспецифическое набухание клетки и ее мембранных органелл, которое завершается нарушением их целостности. В результате разрывов в плазматической мембране содержимое клетки оказывается во внеклеточном пространстве. Если некроз происходит в организме многоклеточного животного, развивается воспалительный процесс. Принципиальным отличием ПГК является то, что в процессе смерти плазматическая мембрана клетки, как правило, сохраняет свою целостность, и остатки клеток могут быть поглощены макрофагами или соседними клетками. Это означает, что в случае ПГК отсутствует генерализованный ответ организма в виде воспалительной реакции [21]. В составе программируемой клеточной гибели принято выделять три основных типа: апоптоз, аутофагическую гибель и программированный некроз. Митотическая катастрофа, энтоз, параптоз и сенессенс также иногда выделяются в самостоятельные формы клеточной смерти, хотя чаще рассматриваются как варианты апоптоза [18-21]. Поскольку основными видами клеточной смерти по-прежнему считаются некроз и апоптоз, рассмотрим эти механизмы подробнее. 2.1.2. Некроз и апоптоз Некротическая и апоптотическая формы клеточной гибели одинаковы по своему результату (прекращение биологической активности клетки и ее удаление из организма), но отличаются по молекулярно-биохимическим, морфологическим и клиническим критериям [22]. Рис. 2. Изображения (A) здоровой, (B) апоптотической и (C) некротической фибросаркомы, полученные методом просвечивающей электронной микроскопии. На рис. В стрелкой указано клеточное ядро; на рис. С звездочкой отмечен макрофаг (снизу) Шкала: 1 мкм. [23]. 12 Морфологические различия некроза и апоптоза были подробно изучены во многих работах [23-29], рис. 2 иллюстрирует эти различия на примере фибросаркомы – клетки злокачественной опухоли. В отличие от некроза, апоптоз поражает единичные клетки и делает это избирательно. Апоптотические клетки, в отличие от некротических, не обнаружены в соприкосновении друг с другом, они располагаются по одиночке или небольшими группами и разбросаны по всей ткани, воспалительного процесса при этом не наблюдается [24-26]. Митохондрии при некрозе набухают и разрушаются, при апоптозе большинство митохондрий мало изменено по сравнению с нормой. Ядра при некрозе мало изменены, при апоптозе по периферии, под мембраной ядра, конденсируется хроматин, при этом образуются четко очерченные плотные массы различной формы и размеров, а ядро может разрываться на два или несколько фрагментов. Клетка при некрозе набухает, а затем может произойти разрыв цитоплазматической мембраны. При апоптозе клетка сжимается, на ее поверхности образуются так называемые «бородавки», что приводит к фрагментации клетки и формированию окруженных мембраной апоптотических телец, состоящих из цитоплазмы и плотно расположенных органелл, с фрагментами ядра или без них [27-29] [23]. Помимо морфологических изменений, существует и ряд биохимических показателей апоптоза: фрагментация ДНК; активация специфических сериновых протеиназ, называемых каспазами; появление на поверхности клеток фосфатидилсерина, выход цитохрома с из митохондрий и др [23, 30]. Основными методами определения этих маркеров являются проточная получивший широкое цитофлуориметрия и вестерн-блот анализы. Отдельного рассмотрения заслуживает распространение метод анализа апоптоза по связыванию флуоресцентно меченного аннексина V-FITC и красителя пропидий иодида (PI). Аннексин V специфично и с высокой афинностью связывается с фосфатидилсерином, который появляется на поверхности апоптотических и некротических клеток; PI проникает только в клетки с поврежденной мембраной. Таким образом, 13 апоптотические клетки окрашиваются только аннексином V, поскольку они сохраняют целостность мембраны на ранних стадиях апоптоза, в то время как некротические клетки окрашиваются обоим реагентами (рис. 3). Рис. 3. Пример анализа апоптотических клеток, окрашенных аннексином VFITC и пропидий иодидом PI методом проточной цитометрии. Клетки линии HL60 инкубировали в отсутствие (слева) и в присутствии хлорноватистой кислоты (справа) в течение суток. Аннексин V/PI-/- – живые клетки; аннексин V/PI+/- – апоптотические клетки; аннексин V/PI+/+ – некротические клетки [30]. Активация защитных антиоксидантных ферментативных систем, таких как глутатионпероксидаза, каталаза, супероксиддисмутаза и др., также может служить косвенным признаком развития апоптоза [31]. В отличие от некроза, сопровождающегося симптоматикой, апоптоз не имеет выраженной клинической клинических проявлений. Апоптоз распространяется только на отдельные клетки, а некроз развивается на территории ткани и даже целого органа; после апоптоза восстанавливаются клетки, аналогичные погибшим, в то время как на месте некроза обычно разрастается рубцовая соединительная ткань; как уже упоминалось, апоптоз не сопровождается характерными для некроза воспалительными реакциями [4]. 2.1.3. Молекулярные механизмы апоптоза Апоптоз представляет собой каскадный процесс, который реализуется в несколько стадий, называемых сигнальная (индукторная), эффекторная и деградационная фазы. Каждая из них будет подробно рассмотрена ниже. 14 А. Сигнальная и эффекторная фазы Инициация апоптоза может происходить посредством внешних (внеклеточных) или внутриклеточных факторов. Соответственно, существует два сигнальных пути индукции апоптоза: внешний, или рецептор-зависимый путь, и внутренний, или митохондриальный путь [32], схематично показанные на рис. 4 [33]. Рис. 4. Схема внутреннего и внешнего путей апоптоза [33]. Объяснение в тексте. При внешнем пути развития, сигнал апоптоза воспринимается так называемыми рецепторами смерти, расположенными на поверхности клеточной мембраны. Все известные на сегодняшний день рецепторы, принимающие сигналы смерти, относятся к суперсемейству TNF-рецепторов (tumor necrosis factor receptor, или кратко TNFR) и имеют схожее строение. Наиболее изученными рецепторами смерти являются CD95 (также известный как FAS или APO-1), TNFR1 (также называемый p55) и DR3 (death receptor). Они представляют собой трансмембранные белки, характеризующиеся наличием общей последовательности из 80 аминокислот в цитоплазматическом домене. Данная последовательность называется доменом смерти (англ. death domain или кратко DD) и является необходимой для трансдукции сигнала апоптоза [34]. 15 Внеклеточные участки рецепторов смерти взаимодействуют с тримеризованными лигандами – гликопротеинами различной природы (CD95L, TNF, Apo3L, Apo2L и т. п.). Лиганд «сшивает» 3 молекулы рецептора, и активированные таким образом рецепторы передают сигнал внутриклеточным белкам-адаптерам. Для рецептора CD95 (FAS/APO-1) адаптером является белок FADD (FAS-associated DD-protein), а для TNFR1 и DR3 адаптером является TRADD (TNFR1-associated DD-protein) [35]. Адаптеры, ассоциированные с рецепторами смерти, вступают во взаимодействие с эффекторами — пока еще неактивными прокаспазами. В результате цепочки формируются взаимодействия агрегаты, «лиганд-рецептор-адаптер-эффектор» называемые апоптосомами, или сигнальными комплексами, индуцирующими смерть, и активирующими специфические ферменты - инициирующие каспазы (-2; -8 и -10) [36]. Примером апоптосомы может служить комплекс FasL-Fas-FADD-прокаспаза-8, в котором активируется каспаза-8 [37]. Активированные инициирующие каспазы далее запускают каспазный каскад во второй, эффекторной фазе апоптоза. Большинство форм апоптоза у млекопитающих протекает по внутреннему пути, а не через рецепторы клеточной гибели. Такой сигнальный путь апоптоза реализуется в результате выхода апоптогенных белков - цитохрома c; прокаспаз −2, −3 и −9 и флавопротеина AIF (apoptosis inducing factor) - из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму клетки и называется митохондриальным [37, 38]. Данный процесс может индуцироваться рядом факторов, таких как повреждение митохондриальной ДНК, радиационное воздействие, цитотоксичное действие некоторых веществ, укорочение до критического уровня теломеров и пр. Механизм инициированного таким образом выхода апоптогенных белков может заключаться либо в разрыве мембраны митохондрии, либо в результате образования в ней проводящих каналов [16]. Разрыв наружной митохондриальной мембраны, по-видимому, происходит при увеличении объема (набухании) матрикса митохондрий под 16 действием давления со стороны внутренней мембраны, площадь которой значительно больше, чем площадь мембраны наружной. В первую очередь, это может быть связано с нарушением внутриклеточного гомеостаза ионов Ca 2+, высвобождение которых [39, 40] приводит к активации митохондриальной фосфолипазы А2 [41, 42] и последующему увеличению ионной проницаемости внутренней мембраны, которое в свою очередь приводит к активному набуханию митохондрий. Впервые этот процесс наблюдался Ю.А. Владимировым в 1973 году [43], а также был независимо описан Хантером и сотрудниками в 1976-1978 [44-46]. Другой причиной нарушения целостности мембраны и набухания матрикса считают перекисное окисление липидов [4750]. Наиболее вероятным процессом, митохондриальной кардиолипином и мембраны, появление считают у приводящим пероксидации липидов взаимодействие мембранносвязаннного c с цитохрома c цитохрома пероксидазной активности [51-54]. Данное событие имеет решающее значение для выполнения программы апоптоза [55, 56]. Особенности формирования комплекса цитохрома c с кардиолипином и появление у него пероксидазной активности будут подробно рассмотрены в далее. Не связанное с набуханием матрикса образование пор во внешней мембране обусловлено действием белков семейства Bcl-2 – основных регуляторов митохондриального пути апоптоза [57, 58]. К этому семейству относятся апоптотические белки Bax и Bak – белки цитоплазмы, способные встраиваться в наружную мембрану митохондрий и олигомеризоваться, образуя в мембране каналы [59]. Активация Bax может быть вызвана другим проапоптотическим белком Bid. Впрочем, обрезанная форма Bid (t-Bid), возможно, способна формировать каналы независимо от Bax. Одновременное присутствие Bax и белка внешней мембраны порина, или VDAC (voltage dependent anionic channel) приводит к еще более эффективному раскрытию пор мембраны [60]. 17 Антиапоптотические белки Bcl-2 и Bcl-xL того же семейства Bcl-2 конкурируют с проапоптотическими белками и блокируют процесс открывания пор [61]. Индукторная фаза митохондриального пути апоптоза формированием вышедшим в цитоплазму цитохромом c завершается и белком APAF-1 апоптосомы (apoptosis protease activating factor-1) [60]. Предварительно, APAF-1 претерпевает конформационные изменения в результате реакции, протекающей с затратой энергии АТФ. В итоге, происходит олигомеризация 7 субъединиц трансформированного белка APAF-1 с участием цитохрома c и прокаспазы-9 [62]. Образовавшаяся апоптосома активирует каспазу-9, которая, в свою очередь, связывает и активирует прокаспазу-3 с образованием эффекторной каспазы-3 [63]. При активировании каспаз не имеет значения, находится ли цитохром с в окисленном или в восстановленном состоянии. Высвобождающийся из межмембранного пространства митохондрий флавопротеин AIF является эффектором апоптоза, действующим независимо от каспаз [63]. В течение эффекторной фазы различные инициирующие пути конвертируются в один общий путь апоптоза [34]. Основными эффекторами апоптоза являются ферменты, расщепляющие белки по остаткам аспартата каспазы. В тканях млекопитающих идентифицировано 14 различных видов каспаз, все они выполняют различные физиологические функции. Часть из них не участвует в апоптозе (−1, −4, −5, −11, −13, −14). Каспазы апоптоза разделяют на инициаторные (−2, −8, −10, −9, −12) и эффекторные (−3, −6, −7). Инициаторные каспазы активируют эффекторные каспазы, которые в свою очередь провоцируют и непосредственно участвуют в трансформации клетки [64]. Они активируют ферменты эндонуклеазы, гидролизуют белки ядерной ламины, разрушают цитоскелет, и расщепляют белки, регулирующие клеточную адгезию. Другой важной функцией эффекторных каспаз является инактивация белков, блокирующих апоптоз. В частности, расщепляется ингибитор DFF (DNA fragmentation factor), препятствующий активации апоптозной ДНКазы CAD. Разрушению подвергаются и антиапоптозные белки семейства Bcl-2 [34, 63]. 18 Б. Деградационная фаза апоптоза Вне зависимости от изначального инициирующего воздействия, итогом апоптотической программы является фрагментация клетки на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной. Фрагменты погибшей клетки обычно очень быстро, в среднем за 90 минут, фагоцитируются макрофагами либо соседними клетками, минуя развитие воспалительной реакции [65]. Поскольку часть данной диссертационной работы была посвящена изучению сигнальных механизмов фагоцитоза апоптотических клеток, ниже эта стадия будет рассмотрена подробнее. Фосфатидилсерин как фагоцитарный «съешь меня» сигнал Анионный фосфолипид фосфатидилсерин (рис. 5) составляет до 10% от общего количества фосфолипидов в плазматической мембране и мембранах эндоплазматического ретикулума. Рис. 5. Строение молекулы фосфатидилсерина. R1 и R2 – ацильные остатки жирных кислот. При нормальном функционировании здоровой клетки фосфатидилсерин находится на внутренней поверхности ее плазматической мембраны и играет важную роль в ряде внутриклеточных реакций [22], однако, при апоптозе молекулы фосфатидилсерина под действием фермента скрамблазы [66] экстернализуются на внешнюю сторону клеточной мембраны. При этом электронейтральный фосфолипидный монослой плазматической мембраны приобретает отрицательный заряд, и поверхность клетки модифицируется, а сам экстернализованный ФС служит сигналом «съешь меня» для макрофагов [67]. 19 Аналогично, ФС, экстернализованный на поверхность при активации тромбоцитов, распознается белками свертывания крови [22]. Несмотря на то, что ФС уже давно известен как сигнал «съешь меня», механизм его распознавания фагоцитами изучен не до конца, его исследованию и уточнению посвящено много работ. Основные современные гипотезы и концепции о способах распознавания фосфатидилсерина рецепторами подробно описаны в обзоре [57]. По-видимому, основным механизмом распознавания ФС является его связывание с мостиковыми белками, которые, в свою очередь, связаны с рецепторами. Так, основной из них, ФС-рецептор, который был описан в работе [68], распознает фосфатидилсерин через мостиковый белок аннексин I, который во время апоптоза перемещается из цитозоля клетки к обогащенным фосфатидилсерином участкам внешней стороны плазматической мембраны [69]. Были обнаружены и другие рецепторы, способные распознавать ФС аналогичным образом [57]. Кроме того, существуют также и другие «съешь меня» сигналы для фагоцитов и соответствующие им рецепторы. Например, предполагается, что окисленный по ацильной цепи фосфатидилсерин распознается рецепторами-мусорщиками, CD36 и SR-PSox (рецептор на ФС и рецептор на окисленные липопротеины и цитокин CXCL16) [70, 71]. Совсем недавно было обнаружено, что и другой метаболит ФС, лизо-фосфатидилсерин, связывается с G2A рецепторами фагоцитов [72, 73]. Таким образом, фагоциты имеют несколько типов рецепторов для распознавания мертвых клеток, что вызывает вопрос о цели такой очевидной избыточности. Еще одно противоречие концепции о ФС, как об универсальном «съешь меня» сигнале, наблюдается в том, что во время нормальной физиологической активности некоторые типы клеток, включая макрофаги, лимфоциты и эндотелиальные клетки экстернализуют ФС в количествах, достаточных для их обнаружения, но все же не подвергаются удалению [74]. Кроме того, хотя фосфатидилсерин экстернализуется и апоптотическими, и 20 некротическими клетками (хотя и в разной степени) [75], последствия их захвата фагоцитами кардинально различны [76]. Это поднимает вопрос о том, является ли появление на клеточной поверхности фосфатидилсерина единственным универсальным предвестником фагоцитоза, как полагалось ранее, или есть другие лиганды, также исполняющие роль активаторов фагоцитоза, такие как окисленный и лизо-ФС. 2.2. Цитохром c: строение, свойства и биологические функции 2.2.1. Класс цитохромов Цитохромы представляют собой небольшие глобулярные гем-содержащие белки, участвующие в электронном транспорте. В зависимости от типа гема, ковалентно связанного комплекса атома железа с протопорфирином, в классе цитохромов принято выделять несколько типов: a, b, c, d, f и o [77]. В силу различного строения гема, каждый из типов цитохромов имеет свои характеристические максимумы спектров поглощения [78]. Обладая способностью переносить электроны, цитохромы участвуют во многих биологических процессах, выполняя различные функции. Наиболее важными представителями класса цитохромов являются цитохром P450 (структурно относящийся к типу b), играющий важную роль в обмене стероидов, желчных кислот, ненасыщенных жирных кислот, фенольных метаболитов, а также в нейтрализации ксенобиотиков [79, 80]; цитохром c оксидаза (трансмембранный белковый комплекс цитохромов a и a3 и двух медьсодержащих центров) - комплекс IV дыхательной цепи митохондрий; коэнзим Q – цитохром c редуктаза, составными субъединицами которой выступают цитохромы типов b и c – комплекс III дыхательной цепи и др. [79, 80]. Отдельного рассмотрения заслуживает митохондриальный белок цитохром c, принимающий участие в переносе электронов дыхательной цепи, а также играющий ключевую роль в развитии апоптоза [81, 82]. 21 2.2.2. Строение и физико-химические свойства цитохрома c Согласно общепринятой классификации, предложенной Амблером, группа цитохромов типа c включает в себя четыре класса, отличающихся по количеству и положению входящих в состав белка гемов, а также по их восстановительному потенциалу [77]. Митохондриальный цитохром c млекопитающих и человека относится к классу I цитохромов c и является наиболее распространенным и хорошо изученным представителем всей группы цитохромов c, поэтому в литературе его название чаще всего одноименно названию всей белковой группы. Следуя этой терминологии, в данной работе под «цитохромом c» понимается митохондриальный цитохром c млекопитающих и человека класса I цитохромов типа c [77]. Гем цитохрома c представляет собой комплекс атома железа с протопорфирином IX и образует ковалентную связь с белком через молекулы цистеина Cys-14 и Cys-17 в экваториальной плоскости гема, а также через молекулы гистидина His-18 и метионина Met-80 напрямую с атомом железа в осевой плоскости гема. Оба цистеиновых и гистидиновый остатки, участвующие в образовании связи между гемом и белковой частью молекулы, соединены между собой последовательностью –Cys-Xaa-Xaa-Cys-His– (Xaa – другая АК) [83]. Важно, что все шесть координационных связей атома железа при этом оказываются занятыми (рис. 6). Рис. 6. Строение гема молекулы цитохрома c [84]. В состав цитохрома c входят ~ 100-120 аминокислот (в зависимости от источника выделения белка), наиболее распространен цитохром c, содержащий 22 104 аминокислотных остатков. Молекулярная масса цитохрома c составляет 12,2 – 12,4 кДа. В аминокислотной последовательности преобладают положительно заряженные группы, что обуславливает щелочные свойства и pI белка около 10 [83]. Молекула цитохрома c содержит в своем составе пять α-спиралей: α1 и α5 представляют собой N- и C-конец соответственно. Три оставшихся (α2 ,α3 и α4) расположены между концевыми α-спиралями, при этом α4-спираль, загибающаяся по направлению к C-концу, содержит Met-80, связанный с гемом (рис. 7) [77]. Рис. 7. Строение глобулы молекулы цитохрома c [77]. Третичная структура цитохрома c может быть различной в зависимости от микроокружения белка. Цитохром c, выполняющий несколько функций в клетке, может быть связан с мембраной или плавать в межмембранном пространстве и, соответственно, имеет различную третичную структуру в мембранно-связанном или свободном состоянии. На рис. 7 изображена глобула молекулы цитохрома c в несвязанном состоянии. Согласно данным из различных источников, диаметр молекулы цитохрома c в водной среде составляет 3,1-3,6 нм. При его интеграции в липидную мембрану происходит частичное разворачивание белковой глобулы [85]. Электронный спектр цитохрома c обусловлен π→π* переходом связанного с атомом железа порфирина и характеризуется максимумом поглощения при 23 413 нм (γ-, полоса Соре, ε = 1,05·105 М-1см-1) и двумя максимумами (α- и β-) при 550 (ε = 29,1 мМ-1см-1) и 521 нм (ε = 15,5 мМ-1см-1), соответственно [77]. Восстановительный потенциал для цитохрома c, выделенного из сердца лошади, был найден равным 260 мВ (относительно стандартного водородного электрода) [86]. Рассмотренные выше особенности строения и физико-химические свойства цитохрома c обусловливают его биологическое значение и основные функции, которые будут рассмотрены в следующем разделе. 2.2.3. Цитохром c в клетке Цитохром c синтезируется в цитоплазме в виде неактивного апоцитохрома, после чего транспортируется в межмембранное пространство митохондрий, где к нему присоединяется гем. Количество цитохрома c в организме значительно варьирует у отдельных видов животных и в различных органах одного вида, также оно изменяется с возрастом. Меньше всего цитохрома c содержат мышцы новорожденных. Начиная с грудного возраста, содержание цитохрома с в организме человека постоянно повышается и в период 20–30 лет достигает максимума, затем до 50 лет происходит снижение, в более позднем возрасте снова наблюдается повышение количества цитохрома с в организме. Количество цитохрома с изменяется и при различных заболеваниях – оно понижено при хронической гипохромной анемии, злокачественных новообразованиях и при острой кровопотере [12, 87]. Одной из важных функций цитохрома с в живом организме является его участие в клеточном дыхании. А. Электронный транспорт дыхательной цепи В клетках эукариот дыхательная цепь расположена во внутренней мембране митохондрий, у дышащих бактерий – в цитоплазматической мембране и специализированных структурах – мезосомах, или тилакоидах. Компоненты дыхательной цепи встроены в митохондриальную мембрану в виде 4 белково24 липидных комплексов: НАДН-КоQН2-редуктаза (комплекс I), сукцинат-КоQредуктаза (комплекс II), КоQН2-цитохром c-редуктаза (комплекс III) и цитохром с-оксидаза (комплекс IV), показанные на рис. 8. Рис. 8. Митохондриальная дыхательная цепь [88]. Перенос электронов между комплексами осуществляется за счет диффузии относительно небольших молекул: в липидной фазе мембран – это коэнзим Q (убихинон), а в водной фазе – цитохром с. Шестикоординационная структура активного центра позволяет цитохрому с свободно переносить электроны между III и IV дыхательными комплексами, восстанавливая железо из состояния Fe3+ в Fe2+ на III дыхательном комплексе и отдавать электрон IV комплексу (при этом железо вновь окисляется и приобретает состояние Fe +3) [89]. Б. Антиоксидантная активность цитохрома c Помимо вышеописанной функции, окисленная форма цитохрома с способна окислять супероксидный радикал с образованием молекулярного кислорода [90]: O2•− + Cyt-Por-Fe3+ → O2 + Cyt-Por-Fe2+, где Сyt-Por-Fe3+ - окисленная форма цитохрома (ферро-цитохром с), Сyt-Por-Fe2+ – восстановленная форма цитохрома (ферри-цитохром с), Cyt – белковая часть молекулы цитохрома с, Por – порфириновое кольцо гема. При этом возможно спектрофотометрически проследить динамику восстановления цитохрома и, при отсутствии иных восстановителей, оценить 25 скорость образования супероксидного радикала. С этой целью часто используют ацетилированный аналог цитохрома с, у которого ацетилировано 60% лизиновых остатков и который не может связываться ни с мембранами, ни с цитохром-связывающими местами комплексов дыхательной цепи [91]. Эта реакция позволяет рассматривать окисленную форму цитохрома с в качестве своего рода антиоксиданта [12, 92], поскольку первичный свободный радикал, супероксид, превращается в молекулу кислорода. В известном смысле это более эффективный антиоксидант, чем супероксиддисмутаза, поскольку последняя переводит супероксидный радикал в отнюдь не безобидное соединение, H2O2, которое способно продуцировать весьма активные радикалы: либо гидроксилрадикал в реакции Фентона, что требует наличия свободного двухвалентного железа, а это – предмет дискуссии [93]: Fe2+ + 2H2O2 → Fe3+ + H2O + O2 либо радикалы белковой природы в реакциях с участием пероксидаз [94-97]: Px-Por-Fe3+ + H2O2 → Px•-Por-Fe4+=O + H2O, где Px-Por-Fe3+ - пероксидаза, Px - апопротеин, Por – порфириновое кольцо гема, Px• - радикал аминокислотного остатка - тирозина или триптофана, Px•-PorFe4+=O – Соединение 1. Подробно молекулярный механизм этой реакции рассмотрен в разделе 2.3.3А. Таким образом, в известной прооксидантом, тогда как цитохром ситуации СОД может оказаться с – вполне безобидная ловушка супероксидных радикалов. Кроме описанных двух функций, цитохром с участвует в процессе запрограммированной смерти клетки – апоптозе. В. Пероксидазная функция и апоптоз В работе [51] было показано, что количество цитохрома c в цитозоле возрастает c увеличением содержания кардиолипина в мембране митохондрии. Схожие результаты были получены в работах [52] и [53]. Позже было показано, что мембранносвязанный цитохром c проявляет пероксидазную активность и может окислять как сам кардиолипин, так и другие липиды во внутренней 26 мембране митохондрии, в результате чего происходит формирование проводящих каналов во внешней мембране и выход цитохрома c в цитозоль [54]. Еще один интересный эффект был обнаружен при воздействии на клетки γ-облучением (один из проапоптотических факторов), при этом наблюдалось накопление гидропероксидов избирательно в кардиолипине. Катализатором этого процесса служил цитохром c [55]. В работе [56] было показано, что кардиолипин является единственным фосфолипидом, подвергающимся раннему окислению при апоптозе. Сказанное свидетельствует о том, что цитохром c, связанный в комплекс с кардиолипином и проявляющий пероксидазную активность, инициирует запуск апоптоза. Сам процесс образования комплекса и те свойства, которые цитохром c приобретает в связанном с кардиолипином состоянии, играют таким образом ключевую роль в развитии апоптотической программы. Взаимодействию цитохрома c с кардиолипином в частности и с анионными липидами в целом было посвящено много работ, основные результаты которых будут подробно рассмотрены в следующей главе. 2.3. Взаимодействие цитохрома c с анионными липидами 2.3.1. Липидный состав клетки, анионные липиды и кардиолипин Фосфолипиды представляют собой главный липидный компонент клеточных мембран. Молекула фосфолипида содержит остаток фосфорной кислоты, соединенную с ней добавочную группу атомов различной химической природы (рис. 9, 10) и гидрофобные жирнокислотные остатки (рис. 11). Продукты гидролиза фосфолипидов, катализируемого ферментами класса фосфолипаз, называются лизофосфолипиды (рис. 9). В мембранах содержатся фосфолипиды двух типов - глицерофосфолипиды и сфингофосфолипиды. В состав глицерофосфолипидов входят глицерин, жирные кислоты, фосфорная кислота и обычно азотсодержащие соединения. В зависимости от строения полярной «головки», принято выделять несколько классов глицерофосфолипидов. 27 Рис. 9. Строение преобладающих в организме животных фосфолипидов [98]. Рис. 10. Строение менее распространенных в организме фосфолипидов [98]. Нейтральные фосфолипиды имеют отрицательно заряженную фосфатную группу и положительно заряженную аминогруппу, что в сумме вызывает электрически нейтральное состояние. К ним относятся фосфатидилхолин (старое название - лецитин) и фосфатидилэтаноламин (кефалин). Эти две группы фосфоглицеридов метаболически связаны друг с другом и являются главными липидными компонентами мембран клеток в плане стабилизации их двухслойности. Анионные фосфолипиды имеют отрицательно заряженную фосфатную группу. К ним относятся фосфатидилсерин и фосфатидилинозитол, а также 28 менее распространенные в клетках эукариот фосфатидилглицерол, фосфатидная кислота и кардиолипины. Липидный состав плазматической мембраны и мембран различных клеточных органелл представлен на рис. 11 [98]. Рис. 11. Липидный состав клетки млекопитающих [98]. PC - фосфатидилхолин, PE - фосфатидилэтаноламин, PI - фосфатидилинозитол, PS фосфатидилсерин, CL - кардиолипин, SM - сфингомиелин, Chol - холестерол, BMP - бис(моноацилглицеро)фосфат. Разнообразие жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов, крайне велико. У человека жирные кислоты характеризуются следующими особенностями: - четное число углеродных атомов в цепи; - отсутствие разветвленной цепи; - наличие двойных связей только в цис-конформации. По строению ЖК неоднородны и отличаются длиной цепи и количеством двойных связей. К насыщенным ЖК относится пальмитиновая (С16:0), стеариновая (С18:0) и арахиновая кислоты (С20:0). К мононенасыщенным – пальмитоолеиновая (С16:1) и олеиновая (С18:1). Указанные ЖК находятся в большинстве пищевых жиров и в жире человека. Полиненасыщенные ЖК содержат от 2 и более двойных связей, разделенных метиленовой группой. Помимо отличий по количеству двойных 29 связей, кислоты различаются положением двойных связей, которое отчитывается относительно начала (δ-) или конца цепи (ω-ненасыщенные ЖК) [99]. Основные представители жирных кислот в клетках эукариот представлены на рис. 12. Рис. 12. Строение основных жирных кислот млекопитающих и человека [98]. Кардиолипин впервые был выделен в 1942 году из говяжьего сердца и получил свое название благодаря этому. Этот фосфолипид входит в состав в основном внутренней мембраны митохондрий эукариотических клеток, занимает порядка 20-40% от всех фосфолипидов внутренней митохондриальной мембраны, при этом в составе клеточных мембран кардиолипин не обнаружен [98]. Кардиолипин обладает интересной и необычной структурой, представляя собой единственный в клетках эукариот двойной фосфолипид (дифосфатидилглицерол). Молекула имеет четыре хвоста жирных кислот и два остатка фосфорной кислоты (рис. 10): именно наличие в молекуле 4 жирнокислотных остатков приводит к большому многообразию молекулярных видов кардиолипина. 30 При физиологическом рН один из остатков фосфорной кислоты депротонирован и молекула заряжена отрицательно [100]. У дрожжей, растений и животных процесс синтеза кардиолипина протекает в митохондриях. Исходным веществом при синтезе кардиолипина в организме служит глицерол-3-фосфат, из которого синтезируется сначала фосфатидная кислота, затем фосфатидилглицерол, и, наконец, под действием фермента кардиолипин синтазы, и сам кардиолипин. Синтез кардиолипина стимулируется ионами Со2+ и Mg2+ и подавляется ионами Са2+ и снижением количества АТФ в клетке, а также гипотиреозом [101]. Кардиолипин играет большую роль во многих митохондриальных процессах, таких как транспорт электронов, AДФ/ATФ транслокация, ионная проницаемость и транспорт белка. Кроме того, некоторые дыхательных ферменты внутренней митохондриальной мембраны связаны с кардиолипином мембраны, и их активность зависит от наличия КЛ [102, 103]. Было показано, что для поддержания ферментативной активности цитохром с-оксидазы (комплекса IV) необходимы 2 связанные с ней молекулы кардиолипина. Для поддержания четвертичной структуры и функциональной активности комплекса III также необходим кардиолипин [104]. 2.3.2. Образование комплекса цитохрома c с анионными липидами Митохондриальный с цитохром образует мембранно-связанный комплекса состоящий из молекулы цитохрома и прилегающего участка липидного бислоя мембраны. Гипотеза о структуре такого комплекса была впервые предложена Брауном и сотрудниками в 1977 году [105, 106]. Они изучали свойства липосом, состоящих из кардиолипина и фосфатидилхолина в молярном соотношении 1:4. При добавлении к таким липосомам цитохрома с (в молярном соотношении липид:белок 100:1) последний присоединялся к липидным везикулам, при этом в данной фракции соотношение кардиолипина и фосфатидилхолина было таким же, как в исходном препарате - 1:4. Диаметр везикул с цитохромом с был найден одним и тем же. 31 Полосы поглощения гема, включая 695 нм, не изменялись при связывании Цит с с везикулами Молекулы кардиолипина собирались при этом вместе, образуя в зоне связывания цитохрома с более вязкую зону. Данные ЯМР и ЭПР указывали, кроме того, что гем цитохрома с обращен наружу от липидного слоя мембран. Совокупность этих данных и позволила предложить известную схему (рис. 13) [105]. Рис. 13. Цитохром с прикреплен к поверхности мембраны, содержащей кардиолипин [105]. Комплекс образуется в основном благодаря притяжению отрицательно заряженных головок кардиолипина к положительно заряженным группам на поверхности белка. Одна из четырех жирнокислотных цепей молекулы кардиолипина проникает в гидрофобную зону белковой глобулы. Все авторы, изучавшие взаимодействие однослойных липосом, содержащих кардиолипин, считают основой взаимодействия электростатическое притяжение положительно заряженных остатков лизина на поверхности белка с отрицательными зарядами на гирдрофильной «голове» молекулы кардиолипина [14, 48, 105, 107-114]. Заряд цитохрома с при нейтральном рН составляет +8е, что обеспечивает сильное притяжение к отрицательно заряженным липидам [115]. Цитохром с не взаимодействует с незаряженными липидами, а также и с заряженными, но в среде с высокой ионной силой [14, 108, 109, 116]. Путем изучения взаимодействия спин-меченных белка и фосфолипидов было показано, что на поверхности цитохрома с существует несколько центров связывания с мембранами, включающие в себя остатки Lys-72 и Lys-73 [108] [109], Lys-86 и Lys-87 [117]. Участие всех этих остатков в связывании было затем подтверждено в опытах с мутантными формами цитохрома с дрожжей; авторы выявили пятый центр связывания Arg-91 [118]. На основании 32 исследований по связыванию цитохрома с с однослойными липосомами, содержащими кардиолипин и флуоресцентную метку, было показано существование еще одного участка связывания Цит с с поверхностью мембран: он включает в себя остатки Lys-22, Lys-25, Lys-27, а также His-26 и His-33, которые принимают участие в связывании при pH <7. Поскольку эти остатки находятся на стороне глобулы цитохрома с, противоположной первому участку связывания, фосфолипидные липосомы в присутствии цитохрома с сливаются при рН<7, что было показано по возрастанию эксимеризации пиреновой метки [118]. Гидрофобные взаимодействия между неполярными остатками молекул липида и неполярными областями молекулы цитохрома с (обычно в глубине белковой глобулы) также участвуют в связывании этого белка с липидными мембранами, о чем говорит факт неполного блокирования связывания белка высокими концентрациями солей. При этом принято считать, что гидрофобные взаимодействия обусловлены внедрением по меньшей мере одной жирнокислотной цепи в толщу белковой глобулы [108, 119]. На взаимодействие цитохрома с с липидом также оказывает влияние наличие двойных связей в молекуле липида: сила взаимодействия возрастает с увеличение количества двойных связей [14]. В работе Г. О. Степанова и сотр. связывание Цит с с кардиолипином на твердой подложке изучалось методом поверхностного плазмонного резонанса [120]. При сравнении анионных липидов была изучена корреляция между степенью связывания цитохрома с с подложкой, покрытой монослоем кардиолипина, с одной стороны, и увеличением в растворе триптофановой флуоресценции белка и пероксидазной активности в присутствии определенных концентраций липидов – с другой. Нельзя сказать, что корреляция была полной. Пероксидазная активность и триптофановая флуоресценция комплекса цитохрома с с кардиолипином возрастали в ряду: фосфатидилхолин (ФХ) < фосфатидилсерин (ФС) < кардиолипин (КЛ) < фосфатидная кислота (ФК). Константа связывания цитохрома с с монослоем липида возрастала в ряду: 33 ФК18:0/18:0 < ФК18:1/18:1 < ФС18:1/18:1 < ФС18:0/18:0 < ТОКЛ18:1/18:1/18:1/18:1 < ТМКЛ14:0/14:0/14:0/14:0. Таким образом, кардиолипины обладали наибольшим сродством к цитохрому с, причем насыщенность жирнокислотной цепи большой роли не играла. В заключение раздела отметим работу Нантеса и сотрудников, которые обнаружили, что цитохром c, содержащий двухвалентное железо, лучше взаимодействует с липидом, чем окисленная форма цитохрома [121]. При связывании цитохрома с с мембранами, содержащими анионные липиды, в том числе кардиолипин, происходит изменение третичной и вторичная структуры белковой молекулы. Это было показано методом циркулярного дихроизма в области поглощения пептидной связи (190-230 нм) [121] и методом ИК спектроскопии в области поглощения связи >NH·∙· (Амид I и Амид II) [113, 122]. В комплексе с анионными фофолипидами у цитохрома с количество α-спиралей уменьшается, тогда как количество β-структур при этом увеличивается. Этот эффект проявляется в большей степени для окисленного Цит с по сравнению с восстановленной формой [122], а также при связывании цитохрома с с кардиолипином по сравнению с другими анионными липидами [113]. В работе Bernad и сотр. [123] было показано, что цитохром с взаимодействует с липидами не только электростатически, но и гидрофобно. Схематично вышеописанные конформационные изменения мембранносвязанного цитохрома c показаны на рис. 14 [105]. Рис. 14. Конформационные изменения, происходящие с молекулой цитохрома c при связывании с кардиолипин-содержащей мембраной [105]. 2.3.3. Комплекс цитохрома c с АЛ как пероксидаза Одно из важнейших свойств, появляющихся у цитохрома c при его связывании в комплекс с анионными липидами – его пероксидазная активность. 34 Именно эта пероксидаза – комплекс Цит-КЛ – участвует в реакциях пероксидации липидов в митохондриях и инициирует запуск апоптотической программы. А. Классические пероксидазы и механизм их действия Пероксидазы — ферменты класса оксидоредуктаз, катализирующие реакции оксидазного и пероксидазного окисления неорганических и органических соединений перекисью водорода, а также органическими гидропероксидами. Каталитическая активность большинства пероксидаз определяется наличием в молекуле гем-белкового комплекса, хотя у некоторых пероксидаз гем отсутствует. Гем-содержащие пероксидазы (КФ 1.11.1.X, где X определяется природой биологического восстановителя) подразделяются на 2 суперсемейства: пероксидазы растений и пероксидазы животных [124]. На сегодняшний день из всех пероксидаз растительного происхождения наиболее распространенной и изученной формой является пероксидаза из корней хрена. Молекула ПХ состоит из одной полипептидной цепи, содержащей 308 аминокислотных остатков, связанной ковалентно с восьмью олигосахаридными цепями и содержит также нековалентно связанный гем железопротопорфирин IX. Исполняя роль активного центра, он участвует в разложении или активации перекиси водорода, в результате чего возникают радикалы соответствующих субстратов. При рН ниже 3 и выше 12 гем-белковый комплекс пероксидазы из корней хрена разрушается. Пероксидаза из корней хрена проявляет высокую специфичность по отношению к пероксиду водорода: в качестве первого субстрата в реакциях, катализируемых ПХ, не могут выступать органические перекиси. Вероятно, это связано со строением активного центра этого фермента, куда может проходить небольшая по размерам молекула H2O2, но не проходят большие молекулы органических гидроперекисей [125]. Схемы реакций, катализируемых различными пероксидазами и некоторыми каталазами, одинаковы. Ниже приведены основные реакции, 35 составляющие пероксидазный цикл и взятые из обзора [126] (номера реакций, использованные на схеме в цитируемой статье, сохранены): H2O2 + Px-Por-Fe3+ AH + Px•-Por-Fe4+=O H2O + Px•-Por-Fe4+=O (Compound 1), AH• + Px-Por-Fe4+=O (Compound 2), AH + Px-Por-Fe4+=O AH• + Px-Por-Fe3+ (пероксидаза), Где Px – белковая часть пероксидазы, Por – порфирин, точкой обозначен неспаренный электрон свободного радикала, AH – субстрат окисления. В результате этих трех реакций каталитический цикл замыкается, т.к. образуется исходная молекула пероксидазы. Продуктом реакции на схеме служат свободные радикалы субстрата, что, вероятно, имеет место не всегда. Расщепление H2O2 идет по механизму его двухэлектронного восстановления и получило название гетеролитического. Реакция 1 практически необратима (k1/k-1 > 108). Для всех изученных систем соблюдается соотношение k2>>k3; следовательно, лимитирующей стадией процесса является стадия 3, на которой происходит распад каталитически активного комплекса С2. Соединения С1 и С2 были обнаружены спектроскопически [127]. Пероксидазы существуют в виде нескольких форм (изоферментов, или изоэнзимов), состав и соотношение между которыми зависят от состояния растения. При исследовании различных изоферментов пероксидазы из корней хрена было установлено, что все они обладают не только пероксидазными, но и оксидазными свойствами, катализируя окисление целого ряда соединений за счет неактивированного молекулярного кислорода, причем соотношение между пероксидазной и оксидазной функцией зависит от природы изофермента [125]. Вопрос о существовании одного или нескольких активных центров для двух этих реакций до сих пор остается открытым [128-135]. Пероксидазы животных изучены гораздо хуже, чем растительные пероксидазы. Это связано, в первую очередь, с более сложной процедурой 36 выделения этих ферментов из организмов животных (в особенности, млекопитающих) и получения ферментативных препаратов. Хотя на сегодняшний день не существует единой классификации пероксидаз животных, принято выделять четыре основных группы гемсодержащих пероксидаз, а также несколько групп ферментов, не содержащих гем [136, 137]. Цитохром с в комплексе с кардиолипином в силу особенностей строения при этом рассматривается отдельно. К классическим гем-содержащим пероксидазам животных принято относить следующие группы ферментов: - миелопероксидазы; - простагландин-H-синтазы; - NADPH-оксидазы; - двойные оксидазы, представляющие собой гибрид миелопероксидазы с NADPH-оксидазой [136, 137]. Группа миелопероксидаз включает в себя целый ряд гомологичных по строению ферментов, к которым относятся, собственно, одноименная миелопероксидаза, лактопероксидаза и тиреоидная пероксидаза. Миелопероксидаза является одной из самых изученных эндогенных пероксидаз млекопитающих. В основном этот фермент содержится в лизосомах белых кровыных клеток нейтрофилов (до 5% сухого веса клетки), а также в моноцитах и некоторых типах тканевых макрофагах [138]. Миелопероксидаза имеет массу 150 кДа. Этот фермент состоит из двух идентичных, соединенных между собой дисульфидной связью, димеров, каждый из которых содержит гликозилированную тяжелую α-субъединицу (57 кДа) с ковалентно связанным гемом (протопорфирин IX с ионом железа в центре) и негликозилированную легкую β-субъединицу (12 кДа) [139]. В присутствии перекиси водорода миелопероксидаза окисляет анион хлора до гипохлорита, обладающего сильным антибактериальным действием за счет вызываемого оксидативного стресса [137]: H2O2 + Cl− → H2O + OCl−. 37 Лактопероксидаза известна как компонент антибактериальной защиты грудной и слюнных желез. Относительно недавно ее присутствие было идентифицировано и в респираторном тракте млекопитающих, в том числе и человека [140]. Тиреоидная пероксидаза — ключевой фермент в процессе биосинтеза тиреоидных гормонов и один из трех главных антигенов при аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы. Тиреопероксидаза локализуется в фолликулярных клетках, где обычно осуществляются важнейшие этапы синтеза тиреоидных гормонов — окисление и органификация йода. Этот фермент катализирует окисление йода, йодирование остатков тирозина и соединение йодтирозинов с образованием йодтиронинов Т4 и Т3. Таким образом, тиреоидная пероксидаза играет ключевую роль в биосинтезе тиреоидных гормонов и необходима для нормального функционирования щитовидной железы [141]. Фермент простагландин-Н-синтаза (PGHS) катализирует превращение арахидоновой кислоты в простагландин Н2, который является исходным соединением в биосинтезе простагландина, тромбоксана и простациклина в организме млекопитающих, в том числе человека. PGHS имеет два активных центра, в которых протекает циклооксигеназная (окисление арахидоновой кислоты до простагландина G2) и пероксидазная (восстановление перекисной группы простагландина G2 до спиртовой) реакции. В результате двух реакций образуется простагландин Н2. Интересно отметить тот факт, что PGHS подвергается необратимой инактивации в ходе катализируемых им реакций, представляя собой, по сути, «ферментсамоубийцу» [142]. Фермент NADPH (никотинамидадениндинуклеотидфосфат)-оксидаза, содержащийся в плазматической мембраны, восстанавливает молекулярный кислород во внеклеточном пространстве до супероксида, окисляя при этом цитозольный NADPH до NADP+. У животных найдено пять изоформ (NOX-1-5) этого фермента, выполняющих разные функции в разных тканях и органах. 38 Изоэнзимы NOX различаются по своей структуре, поэтому механизмы их активации тоже разные. Например, для запуска работы NOX-5 в сперматозоидах необходимы свободные ионы Ca2+, в то время как NOX-1 слизистой желудка работает самостоятельно и постоянно. Двойная оксидаза, природный гибрид миелопероксидазы и NADPHоксидазы, обеспечивает биосинтез тироксина - гормона щитовидной железы. Барьерные свойства слизистых оболочек полости рта, прямой кишки, гениталий, а также трахеи и бронхов в значительной мере обусловлены этой оксидазой. Помимо гем-содержащих пероксидаз в организмах животных существуют также пероксидазы, представителями не содержащие таких пероксидаз в своем являются составе гем. Главными глутатионпероксидазы, защищающие организм от окислительного повреждения путем восстановления перекисей липидов в соответствующие спирты и восстановления пероксида водорода до воды. Глутатионпероксидаза, выделенная из эритроцитов быка имеет молекулярную массу около 84 кДа. Структурно ферменты данного семейства представляют собой селеносодержащие тетрамерные гликопротеины. В активном центре фермента находится остаток аминокислоты селеноцистеина. Атом селена находится в степени окисления −1 и окисляется пероксидом до SeOH. Далее SeOH соединяется с молекулой глутатиона (GSH), образуя связь Se-SG и соединяется с другой молекулой глутатиона. При этом регенерируется Se− и образуется побочный продукт GS-SG дисульфид глутатиона [143]: 2GSH + ROOH → GS-SG + ROH + H2O. Существует несколько изоферментов, которые кодируются разными генами. Изоферменты отличаются по локализации в клетке и субстратной специфичности. Глутатионпероксидаза GPx1, наиболее распространенная форма фермента, обнаружена в цитоплазме практически всех тканей млекопитающих; субстратом GPx1 является пероксид водорода. Глутатионпероксидаза GPx4 имеет большое значение в метаболизме пероксидов липидов; GPx4 также экспрессируется практически во всех клетках млекопитающих на более низких 39 уровнях. Глутатионпероксидаза GPx2 экспрессируется в кишечнике и является внеклеточным ферментом, как и GPx3, которая в основном встречается в плазме. У человека были идентифицированы восемь изоформ глутатионпероксидазы [143]. Б. Особенности пероксидазного действия комплекса цитохрома c с анионными липидами К сожалению, применительно к цитохрому c термин «пероксидазная активность» иногда употребляется и в случае окисления веществ кислородом воздуха, если при этом образуются пероксиды. В данной работе под «пероксидазной активностью» цитохрома c будет пониматься только его способность катализировать окисление органических соединений в присутствии H2O2 или органических перекисей [13]. Свободный цитохром c обладает очень низкой пероксидазной активностью, но она резко возрастает при его связывании с анионными липидами на поверхности мембран. Важно отметить, что, будучи активатором пероксидазной активности цитохром c, природный кардиолипин (как и другие липиды, содержащие цепи полиненасыщенных жирных кислот) является также и основным субстратом пероксидазной реакции, в результате которой образуются продукты, типичные для липидной пероксидации (моноэпоксиды линолевой кислоты [144] и др.). Несмотря на то, что сам факт активации пероксидазной активности цитохрома с кардиолипином можно считать твердо установленным, механизм этой активации остается неясным. Причина низкой пероксидазной активности свободного цитохрома c заключается в том, что все шесть координационных связей каталитически активного атома трехвалентного железа гема у этого белка заняты, в отличие от настоящих пероксидаз, таких как миелопероксидаза или пероксидаза хрена, где одна связь свободна, и именно по этой связи идет присоединение первого субстрата пероксидазы – H2O2 [53]. В спектре цитохрома с наличие шестой координационной связи атома гемового железа с атомом серы метионина 40 проявляется в максимуме поглощения в области 695 нм. Разрыв связи >Fe∙∙∙S(Met80) в молекуле цитохрома с считается необходимым (но, повидимому, недостаточным) условием появления пероксидазной активности у цитохрома с. На рис. 15 (кривая 1) показано изменение поглощения в области 695 нм у цитохрома с по мере добавления к нему кардиолипина. Видно, что это снижение поглощения находится в очень хорошем соответствии с появлением пероксидазной активности в системе цитохром с/кардиолипин (кривая 2). Рис. 15. Разрушение связи >Fe···S(Met80) и рост пероксидазной активности цитохрома с по мере увеличения соотношения кардиолипин-цитохром с в растворе. 1 - относительное уменьшение А695, характеризующее разрушение связи >Fe···S(Met80). 2 - амплитуда ХЛ-сигнала, характеризующая пероксидазную активность цитохрома [87]. Разрыв связи >Fe∙∙∙S(Met80) проявляется не только в исчезновении полосы поглощения света при 695 нм, но и в изменении спектра циркулярного дихроизма (CD) в области поглощения гема. В работе [116] было изучено взаимодействие цитохром с с везикулами бычьего кардиолипина методом измерения циркулярного дихроизма в области полосы Соре (400-450 нм). Изменение спектра CD наблюдалось при 416 нм, что можно объяснить смещением Met80 от осевой координации по отношению к гемовому железу. Сходные результаты были получены в работах [121, 145]. Необходимо подчеркнуть, что разрыв связи >Fe∙∙∙S(Met80) не является следствием какого-то специфического взаимодействия одной из молекул кардиолипина с гемом, метионином 80 или аминокислотными остатками, находящимися рядом, а может быть отражением общего изменения вторичной 41 либо третичной структуры белковой глобулы. Он наблюдается при изменении рН, температуры [146], химических модификациях цитохрома с [147] и, наконец, при его связывании с кардиолипином или липосомами, содержащими кардиолипин [14]. Такой вывод следует также из результатов изучения спектров флуоресценции цитохрома с [148]. Несмотря на то, что цитохром с содержит один остаток триптофана и четыре остатка тирозина, он практически не флуоресцирует при возбуждении в максимумах поглощения соответствующих аминокислот, т.е. при 280-289 и 275 нм. Однако при добавлении избытка гуанидинхлорида появляется как флуоресценция триптофанового (максимумы при 230 и 260 нм), так и тирозиновых остатков (максимум при 203 нм) (рис. 16). Рис. 16. Флуоресценция триптофановых и тирозиновых остатков в комплексе цитохрома с с кардиолипином. Кривые построены по результатам измерения спектров мутантных форм Цит с, у которых соответствующие остатки были заменены на остатки нефлуоресцирующих аминокислот. А – Разложение УФспектра цитихрома с на тирозиновую и триптофановую составляющие. 1 – флуоресценция исходного цитохрома с одним триптофановым и четырьмя тирозиновыми остатками; 2 – флуоресценция мутантной формы цитохрома с, не содержащей тирозиновых остатков; 3 – разность кривых 1 и 2, показывающая суммарный спектр флуоресценции четырех остатков тирозана в белке. Б – Флуоресценция различных тирозиновых остатков в цитохроме с: 1 - Tyr48, 2 - Tyr67, 3 - Tyr74, 4 - Tyr97 [149]. Объяснение этого факта заключается в том, что в нативном цитохроме с все 5 упомянутых остатков расположены близко к гему, и их флуоресценция потушена благодаря индуктивно-резонансному переносу энергии на нефлуоресцирующий хромофор. Под действием гуанидинхлорида молекула 42 цитохрома с разворачивается и ароматические группы, ответственные за флуоресценцию, выходят за пределы радиуса Ферстера, благодаря чему переноса энергии не происходит. При добавлении к цитохрому с кардиолипина или липосом, содержащих кардиолипин, также появляется флуоресценция остатков тирозина и триптофана, но в меньшей степени, чем в 8М гуанидинхлориде [149]. Разрыв связи Fe…S(Met) сам по себе не может полностью объяснить активирующего действия кардиолипина на пероксидазную активность цитохрома c. Изменение микроокружения гема, которое облегчает диффузию H2O2 к реакционному центру - еще одна причина увеличения пероксидазной активности цитохрома c при образовании его комплекса с кардиолипином. Систематические исследования пероксидазной активности мембранносвязанного цитохрома c в лаборатории В. Кагана были начаты в 2006 году с использованием образования продуктов пероксидазной реакции методом ЭПР и спектрофлуорометрии [14]. Пероксидазная активность цитохрома с увеличивалась при образовании комплекса во много десятков раз [14]. Правда, даже и в этом состоянии она значительно ниже, чем у истинных пероксидаз, если субстратом служит пероксид водорода [148]. Очень важно, что окислителем в пероксидазной реакции, катализируемой комплексом цитохрома с с кардиолипином, может служить не только H2O2, но и гидропероксид органического соединения, такого как трет- бутилгидропероксид, а также гидропероксид жирной кислоты [150]. В общем виде эта реакция может быть описана уравнением: ROOH + АH ROH + AHox, где субстратом окисления AH могут быть различные органические соединения, включая флуорогенный зонд ампекс ред и хемилюминесцентный зонд люминол [13, 14, 151], Цит-АЛ - комплекс цитохрома с с анионными липидами, RООН – пероксид водорода, органический гидропероксид или гидропероксид липида. 43 В работе [152] было показано, что различные липидные гидропероксиды (LOOH) на три порядка величины более эффективны в реакции окисления красителя ампекс ред, чем H2O2 или трет-бутилгидропероксид в реакции: LOOH + АH LOH + АHox. С биологической точки зрения наиболее интересным представляется случай, когда окислению подвергаются молекулы липидов: в такой реакции цитохром с в комплексе с анионными липидами может быть назван липопероксидазой: ROOH + LH ROH + LHox, где LH – цепь полиненасыщенной жирной кислоты (ПНЖК). Для наиболее распространенного случая использования пероксида водорода в качестве первого субстрата, эта реакция примет вид H2О2 + LH H2О + LHox. Можно предположить, что молекулярный механизм этой реакции во многом совпадает с механизмом для классических пероксидаз и, в случае использования пероксида водорода и молекулы липида в качестве перового и второго субстрата окисления, соответственно, описывается реакциями: HOOH + Tir-Por-Fe3+ (Цит c) → HO• + ОН- + Tir•-Por-Fe3+ (Compound 2), HO• + ОН- + Tir•-Por-Fe3+ → Н2O + Tir•-Por-Fe4+=O (Compound 1), Tir•-Por-Fe4+=O + LH → L• + H+ + Tir•-Por-Fe3+, Tir•-Por-Fe3+ + LH → L• + H+ + Tir-Por-Fe3+ (Цит c), где Tir – тирозиновый остаток, Por – порфириновое кольцо цитохрома c. В случае комплекса цитохрома с с кардиолипином образование белкового свободного радикала под действием H 2 O2 было непосредственно продемонстрировано методом ЭПР при низких температурах [14, 56]. При этом было показано, что сигнал ЭПР (принадлежащий, по-видимому, тирозиновому остатку) вырастал на два порядка величины в присутствии кардиолипина [14]. В работе [153] было показано образование compound 1 из карбоксиметилированого цитохрома c после взаимодействия с Н2О2. При этом 44 спектр поглощения compound 1 карбоксиметилированого цитохрома c был похож на спектр поглощения compound 1 классической ПХ. Пероксидация липидов под действием цитохрома c происходит с образовавнием радикалов липидов, запускающих далее каскад цепных реакций перекисное окисление полиненасыщенных жирных кислот [154]. Механизм протекания этих реакций довольно хорошо изучен (рис. 17) [155, 156]. Рис. 17. Общая схема молекулярного механизма окисления полиненасыщенных жирных кислот [155, 156]. 45 В ходе процесса перекисного окисления липидов образуется большое число конечных продуктов: спирты, простые эфиры, диеновые коньюгаты, альдегиды и т.д. Процесс ПОЛ может самоусиливаться по механизму цепной реакции. Цитохром c способен разлагать гидропероксиды различной природы (пероксид водорода, трет-бутилгидропероксид и другие органические гидропероксиды ROOH и гидропероксиды липидов LOOH), вероятно, согласно гомолитическому механизму [14, 148, 150]: ROОН RO•, LOОН LO•. 2.4. Методы исследования процессов липидной пероксидации К моменту появления свидетельств связи окисидативного стресса с в патологическими процессами в организме человека, основополагающие методы анализа окислительного стресса в продуктах питания уже сформировались [157]. Большинство методик для биологических объектов (препаратов крови, тканей) не создавались «с нуля», а адаптировались, исходя из приложений для пищевых продуктов, съедобных масел, жиров. Поэтому основная масса исследований на начальном этапе концентрировалась на работе со свободными и этерифицированными жирными кислотами и продуктами вторичного окисления (продукты разложения гидропероксидов липидов). Однако, не смотря на продолжающееся активное применение этих маркеров в пищевой промышленности, анализ не приводит к положительным корреляциям в исследованиях биологической и клинической направленности. Исследования роли окисления липидов в живых организмах развиваются одновременно по множеству направлений. Изучают: • задействованные механизмы, сигнальные системы; • эффективные методы предотвращения, управления или подавления окислительного стресса; • возможность создания баз данных по количественным содержаниям биомаркеров, характерных для здоровых и пораженных систем; 46 • предсказательный потенциал различных биомаркеров окислительного стресса. Решение подобного комплекса задач требует сбора огромного количества разноплановой показателей, информации которые – ученые неудивительно, что связывают окислительным с существуют десятки стрессом. Существующие методы можно разделить на 4 группы в зависимости от измеряемого параметра: • адсорбция кислорода; • потеря исходного субстрата; • формирование гидропероксидов (как первичного продукта окисления); • формирование вторичных продуктов окисления (получаемых при разложении гидропероксидов) [158]. Особое значение для фундаментальных исследований имеет группа методов, позволяющих детктировать первичные продукты реакций пероксидации липидов – радикалы. 2.4.1. Методы обнаружения свободных радикалов А. Электронный парамагнитный резонанс Суть явления электронного парамагнитного резонанса заключается в резонансном поглощении электромагнитного излучения неспаренными электронами. Если на орбитали имеется парное количество электронов, то заселенность энергетических уровней будет одинакова и количество поглощенной энергии СВЧ электронами будет равно количеству излученной энергии. Поглощение энергии веществом, помещенным в магнитное поле, будет заметно только в том случае, когда на орбитали будет находиться один электрон - в случае атомов переходных металлов и свободных радикалов, - тогда можно будет говорить о больцмановском распределении электронов между энергетическими уровнями. Метод электронного парамагнитного резонанса представляет собой прямой метод анализа радикалов. Он позволяет не только обнаруживать, но и 47 идентифицировать многие радикалы путем анализа сверхтонкой структуры сигналов ЭПР. Однако в биологических системах он часто оказывается недостаточно чувствительным из-за крайне низкой стационарной концентрации радикалов в клетках и тканях. Обнаружить непосредственно методом ЭПР радикалы, образующиеся при взаимодействии ионов Fe2+ с гидропероксидами липидов, удалось только в проточной системе с большим расходом реактивов [159] или с использованием спиновых ловушек [160]. Последние могут, однако, влиять на протекающие в системе биохимические реакции или разрушаться в ходе некоторых из них. По сравнению с ЭПР, метод хемилюминесценции обладает тем преимуществом, что, во-первых, он обычно не связан с изменением хода процессов в растворах, клетках или даже целых тканях, где регистрируется свечение, а во-вторых, весьма чувствителен при обнаружении именно высокореакционных радикалов [161]. Б. Хемилюминесцентный анализ Хемилюминесцентный метод анализа основан на явлении хемилюминесценции. Этот вид свечения не требует внешнего источника возбуждения, а возникает за счет энергии, выделяющейся при протекании химических процессов [162, 163]. Хемилюминесцентные реакции могут быть использованы для определения широкого круга соединений, которые не участвуют непосредственно в реакциях хемилюминесценции, а связаны с потреблением или производством одного из ее компонентов. Чаще всего хемилюминесценция сопровождает радикально-цепные реакции, в том числе окислительно-восстановительные процессы, протекающие по свободнорадикальному механизму. Собственная хемилюминесценция (ХЛ), сопровождающая биохимические реакции в клетках и тканях, обладает, как правило, очень низкой интенсивностью и получила название «сверхслабого свечения». Это является главным препятствием на пути к широкому использованию собственной хемилюминесценции в аналитических целях. 48 В присутствии определенных соединений (получивших в литературе название активаторов ХЛ), хемилюминесценция при реакциях активных форм кислорода и пероксидации липидов может быть усилена в тысячи и сотни тысяч раз. По механизму действия активаторы распадаются на две четко различающиеся группы, которые можно соответственно назвать химическими и физическими активаторами. Химические активаторы ХЛ - это соединения, вступающие в реакции с активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии. Наблюдаемое при этом явление хемилюминесценции связано с переходом молекул в основное состояние из возбужденного, что приводит к высвечиванию фотонов: активатор + радикалы → продукт* → продукт + hν. Люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион, или 3-аминофталевый гидразид) – широко распространенный хемилюминогенный зонд для свободных радикалов кислорода (рис. 18). В реакции разложения пероксида водорода ионами железа (реакция Фентона) люминол увеличивает интенсивность хемилюминесценции в более чем на четыре порядка величины. Будучи довольно мощным активатором, люминол, к сожалению, обладает низкой селективностью. В его присутствии хемилюминесценция наблюдается не только при реакциях радикалов кислорода, но и в реакциях липидных радикалов. Так, например, в подвергнутых перекисному окислению митохондриях или липосомах люминол увеличивает интенсивность хемилюминесценции в несколько десятков раз, хотя он оказался практически неактивным в реакции пероксидации жирных кислот, катализируемой ферментом липооксигеназой [164]. 49 Рис. 18. Наиболее распространенные химические и физические активаторы ХЛ. Известно, что пероксидазы катализируют реакцию окисления люминола пероксидом водорода. Для люминола классической принято считать схему реакций, в которой под действием образующегося в реакции между первым субстратом (пероксидом водорода) и пероксидазой радикала гидроксила, происходит образование радикала люминола, который затем вступает в реакцию с присутствующим в системе супероксидным радикалом, образуя внутреннюю перекись (диоксид). Ее разложение приводит к образованию возбужденной молекулы 3-аминофталата [161]. Переход этой молекулы в основное состояние сопровождается испусканием кванта света. В то же время, хемилюминесценция люминола возможна и в отсутствие супероксидного радикала, что свидетельствует о существовании альтернативной схемы реакций [165]. Молекула люцигенина (динитрата 10,10'-диметил-9,9'-биакридиния) (рис. 18) также является активатором хемилюминесценции. В силу высокой чувствительности люцигенина в качестве ХЛ-зонда на супероксидный радикал, люцигенин-активируемая хемилюминесценция нашла широкое применение во многих методах определения ферментов различной природы. Однако, механизм реакций, ответственных за хемилюминесценцию люцигенина, на настоящий момент не до конца изучен [161]. Физические активаторы, называемые иногда сенсибилизаторами, не вступают в химические реакции и 50 не влияют на ход реакций, сопровождающихся хемилюминесценцией, но, тем не менее, многократно усиливают интенсивность хемилюминесценции. Интенсивность свечения в большой степени зависит от квантового выхода люминесценции продукта реакции, т.е. от того, какая часть возбужденных молекул продукта перейдет в основное, невозбужденное состояние с испусканием фотона. Обычно эта доля невелика, всего десятые или даже сотые доли процента. Но если все молекулы продукта передадут энергию электронного возбуждения молекулам активатора, то интенсивность свечения будет теперь определяться уже квантовым выходом люминесценции активатора, который в идеале приближается к единице. К физическим активаторам можно отнести некоторые люминесцирующие соединения, усиливающие ХЛ при цепном окислении липидов. Комплекс редкоземельного иона европия (Eu3+) c антибиотиком хлортетрациклином усиливает ХЛ при окислении липидов почти в 1000 раз. Красители ряда родаминов и кумаринов также усиливают ХЛ. Одно из производных кумарина, применяемое при создании лазеров под условным названием кумарин С-525 (рис. 18), усиливает хемилюминесценцию, сопровождающую цепное окисление липидов, более чем в 1500 раз, в то же самое время это вещество практически не влияет на хемилюминесценцию в реакции Фентона. Следовательно, этот краситель является селективным усилителем хемилюминесценции, связанной с реакциями перекисного окисления липидов. Очень важно, что кумарины, хотя и увеличивают интенсивность хемилюминесценции, не изменяют кинетику реакции и не влияют на количество накопленного во время реакции малонового диальдегида. В основе действия кумаринов лежит физический процесс процесса переноса (миграции) энергии с молекулы продукта хемилюминесцентной реакции (например, кетона (L=O)) на активатор (А) [166]: LOO• + LOO• → LOH + L=O* + O2, L=O* → L=O + hν1 (j1 = 10-4), L=O* + А → L=O + А* (перенос энергии), 51 А* → А + hν2 (j2 = 10-2 - 10-1). Интенсивность свечения в присутствии активатора во много раз выше, чем без него, по той причине, что квантовый выход j2 люминесценции активатора выше квантового выхода j1 люминесценции продукта реакции [166]. 2.4.2. Хромато-масс-спектрометрическое определение продуктов пероксидации липидов За последнее десятилетие поиск липидных биомаркеров различных заболеваний получил новый виток с развитием технологии HPLC-MS и в особенности HPLC-MSn. Режимы SIM/SRM (single ion/single reaction monitoring) позволяют определять не только общую структуру, но и конкретное расположение функциональных групп и энантиометрию продуктов окисления даже в таких сложных объектах, как мембраны клеток, сыворотка и плазма крови [167]. Проблема состоит в том, что стандартный квадрупольный MS-анализатор недостаточен для анализа липидных фракций биологических объектов. Для этой задачи используют тройной квадруполь в режиме MRM, тандемные и времяпролетные MS детекторы. Подобные хроматографические системы все еще коммерчески затратны и недоступны подавляющему большинству клиник и лабораторий [168]. Для идентификации индивидуальных фосфолипидов в липидных экстракты из клеток и тканей используются мягкие ионизационные техники – электроспрей (ESI) и матрично-активированная лазерная ионизация (MALDI). Определение проводится как в положительной, так и в отрицательной моде регистрации ионов, при этом для большинства методов предпочтение отдается последней [169-171]. Мягкие условия ионизации позволяют продуцировать в основном однозарядные ионы [M-H]- без изменения структуры молекулымишени. В случае масс-спектрометрии кардиолипинов в зависимости от условий ионизации могут быть образованы как ионы [M-H]-, так и [M-2H]2- [172-175]. Количественный анализ требует предварительного разделения липидов с использованием высокоэффективной 52 жидкостной хроматографии на хроматографической колонки (ВЭЖХ) или двумерной высокоэффективной тонкослойной хроматографии (2D-ВЭЖХ). В зависимости от природы неподвижной и подвижной фаз, можно достичь разделения липидов по классам, как правило, с использованием нормально-фазового разделения, или по степени их окисленности с использованием обращенно-фазовой хроматографии. Типичный вид хроматограммы липидного экстракта, полученной с использованием нормально-фазовой силикагельной колонки, приведен на рис. 19 В данном случае проводили градиентное элюирование с использованием растворителя А - хлороформ:метанол:гидроксид аммония 80:19:0,5 (по объему) и растворителя Б - хлороформ:метанол:вода:гидроксид аммония 60:34:5,5:0,5 (по объему). Использовали линейный градиент от 50 до 100% (Б) за первые 14 минут, с 14 по 25 минуту элюирование проводили 100% (Б), после чего с 25 по 30 минуту линейно снижали (Б) от 100 до 50% и, наконец, регенерировали колонку элюированием 50% (Б) в течение 15 минут. Использовали стандартную для колонок размером 1 - 4 мм (наполнение 3 – 5 мкм) скорость 1 мл/мин. В этих условиях окисленные и неокисленные молекулярные виды в пределах одного класса липидов будут элюированы вместе (в одном хроматографическом пике) [175]. Рис. 19. Нормально-фазовая хроматограмма липидного экстракта (по оси х – время в минутах). 1 – фосфатидилэтаноламин, 2 – фосфатидилинозитол, 3 – фосфатидилсерин, 4 – фосфатидилхолин, 5 – фосфатидная кислота, 6 и 7 – сфингомиелины, 8 – лизофосфатидилхолин. 53 Окисленные и неокисленные фосфолипиды обращенно-фазовая хроматография. хроматографические колонки, В заполененные этом позволяет случае шариками с разделить используют гидрофобной поверхностью, обработанной углеводородами С18 или С8. Менее гидрофобные (за счет гидрофильных окисленных групп) окисленные липиды элюируются с таких колонок быстрее, а неокисленные липиды характеризуются бόльшими временами удерживания [175]. 2.4.2. Биофизические модели мембран Тот факт, что цитохром c проявляет кардинально различные свойства в свободном и мембранно-связанном состоянии, привел к необходимости учитывать микроокружение цитохрома при исследовании его структуры и функций, что, в свою очередь, инициировало использование целого ряда различных типов модельных мембран для изучения взаимодействия цитохрома c с анионными липидами. Наиболее распространенные системы, описанные в литературе, будут рассмотрены в этом разделе. А. Наносферы комплекс цитохрома c с АЛ в водном растворе Добавление спиртового раствора кардиолипина к водному раствору цитохрома c приводит к образованию осадка протолипидного комплекса со стехиометрическим соотношением белок:липид 1:20 – 1:60 в зависимости от условий осаждения, согласно данным из различных источников. Считается, что комплекс при этом представляет собой наносферу [176]: молекула цитохрома с окружена монослоем кардиолипина. Свойства осадка были изучены методом малоуглового рассеяния рентгеновских лучей. Кривая рассеяния имела выраженные регулярные максимумы, говорящие о том, что осадок содержит микрокристаллические структуры с межплоскостными расстояниями 11,2 нм. Сравнение этой величины с толщиной двух монослоев кардиолипина, равной примерно 2,8×2 = 5,6±0,2 нм, показывает, что ячейка кристалла содержит наносферу, состоящую из молекулы цитохрома с, окруженного монослоем кардиолипина. Размер глобулы цитохрома с в этом случае составляет около 5,6 нм и заметно превышает размер цитохрома 54 в водном растворе и в кристаллах чистого цитохрома с, где белок имеет размеры 3,5-3,9 нм по разным осям (данные белковой базы данных для 3CYT и малоуглового рассеяния) [177]. Это говорит о том, что в комплексе с кардиолипином глобула цитохрома с «набухает», т.е. увеличивается в объеме. В пользу набухания глобулы также напрямую свидетельствуют результаты измерения флуоресценции тирозиновых и триптофановых остатков цитохрома c при связывании последнего с кардиолипином [87]. Растворимость такого комплекса в водных растворах зависит многих факторов, но, в целом, невелика: большая его часть спонтанно образует нерастворимый осадок. Тем не менее, для исследования ферментативных свойств комплекса Цит-КЛ концентраций порядка 10-6 М – ниже растворимости комплекса - оказывается достаточно, что позволило изучать свойства комплекса напрямую в водных растворах [176-178]. Б. Встраивание цитохрома c в монослои липидов Петер Квинн исследовал взаимодействие цитохрома c (природного и [14C] карбоксиметилированного) с монослоями фосфатидилхолина или фосфатидилэтаноламина, фосфатидной кислоты и кардиолипина на границе раздела вода/воздух путем измерения поверхностного давления, потенциала и радиоактивности [179, 180]. Проникновение цитохрома c в монослой (приводящее к росту поверхностного давления) и связывание его с монослоем (измеряемое по радиоактивности) были гораздо сильнее выражены в случае заряженных липидов: кардиолипина и фосфатидной кислоты, чем в случае электронейтрального фосфатидилхолина. Эти и другие данные показали, что связывание обусловлено преимущественно, но не исключительно, электростатическими силами, поскольку оно в значительной мере снималось, если ионная сила раствора под монослоем увеличивалась добавлением KCl [179]. Использование монослоев липидов в качестве модели мембраны (точнее, ее половины), позволило выявить ряд важных структурных особенностей комплекса цитохрома c с анионными липидами и лучше понять механизм 55 образования комплекса, однако дальнейшее использование этой модели имеет ряд серьезных ограничений, в первую очередь, связанных с неприменимостью ряда методов для анализа связанного с монослоем липида цитохрома c, в особенности – изучение его ферментативной активности как основной характеристики комплекса. В. Взаимодействие цитохрома c с липосомами Липосомы принято считать классической моделью биологической мембраны: неудивительно, что во многих работах взаимодействие цитохрома c с анионными липидами изучали именно на примере липосом кардиолипина или его смеси с фосфатидилхолином и другими липидами [181]. Отдельно следует отметить работы по изучению взаимодействия цитохрома c с гигантскими однослойными липосомами, отличающихся большей протяженностью поверхности. Последнее немаловажно, т.к. дает возможность мембране изгибаться, чего нельзя сказать о жестких везикулах с минимально возможным диаметром, какими являются даже большие липосомы [182]. Связывание цитохрома с с гигантскими липосомами, содержащими кардиолипин, наблюдали методом конфокальной микроскопии – еще одно преимущество использования гигантских липосом, видимых даже в микроскоп. С мембранами, содержащими только фосфатидилхолин, цитохром с не связывался. В этих исследованиях был показан очень важный результат: цитохром с не просто адсорбируется на поверхности липидного бислоя мембран, а как бы наматывает мембраны на себя, скручивая одну плоскую мембрану в клубок переплетенных мембран [182] и образует поры в мембране (рис. 20). Рис. 20. Образование пор во внешней митохондриальной мембране под действием Цит c (красным). Молекулы кардиолипина изображены синим цветом. А-В. Вид сбоку. Г. Вид сверху. [182]. 56 3. Материалы и методы исследования 3.1. Реагенты Липиды. Исходные растворы 1,1’,2,2’-тетраолеилкардиолипина (ТОКЛ) и кардиолипина, выделенного из сердца быка (БКЛ) с концентрацией 30 мМ готовили растворение навески натриевой соли тетраолеилкардиолипина C81H148O17P2Na2 (Avanti Polar Lipids, M 1501,98) или натриевой соли кардиолипина из бычьего сердца C81H140Na2O17P2 (Avanti Polar Lipids, M 1494,32) в метаноле СН3ОН. Раствор линолевой кислоты С17H31COOH (Sigma, М 280,45) с концентрацией 0,2 М готовили растворением 99,9% кислоты в метаноле. Растворы меньшей концентрации готовили разбавлением исходных растворов. Для приготовления липосом использовали 2-олеоил-1-пальмитоил-sn-глицеро-3фосфохолин (ФХ, Avanti Polar Lipids, M 785,6), 2-олеоил-1-пальмитоил-snглицеро-3-фосфо-1-глицерола натриевую соль (ФГ, Avanti Polar Lipids, M 771,0), холестерол (Sigma, M 386,7) и N-(NBD-аминододеканоил)-1,2-дитетрадеканоилsn-глицеро-3-фофсоэтаноламина натриевую соль (ФЭ, Avanti Polar Lipids, M 816,0; ex/em 460/535 нм). Стандарты фосфолипидов (Avanti Polar Lipids) и жирных кислот (Cayman Chemicals) для хромато-масс-спектрометрического анализа растворяли в смеси хлороформ:метанол 2:1. Белки и ферменты. 0,4 мМ раствор цитохрома c готовили растворением навески цитохрома c из сердца лошади (Sigma, 12,4 кДа) в 20 мМ фосфатном буферном растворе рН 7,4. Молярную концентрацию определяли спектрофотометрически по поглощению цитохрома c в полосе Соре (408 нм, ε = 1,05·105 М-1·см-1). 20 мг лизоцима (chicken egg white, CalBioChem, 14.3 кДа) и 20 мг α-лактальбумина (bovine milk, type II, calcium depleted, Sigma, 14.2 кДа) метили флуоресцеином в соотношении ФИТЦ:белок 1:5 в концентрации 2 мг/мл в среде карбонатного буферного раствора в течение 4 часов с последующим диализом в буферный раствор трис-HCl рН 7,4. Раствор бычьего сывороточного альбумина (Sigma, 66 кДа) с концентрацией 0,1 мг/мл готовили растворением навески белка в 57 бидистиллированной деионизованной воде. Исходный раствор микропероксидазы-11 (МР-11) (Sigma) с концентрацией 100 мкМ готовили растворением навески в фосфатном буферном растворе 20 мМ (pH 7,4). Thermomyces lanuginosus фосфолипаза А1 (Sigma) имела активность 10 ед/мг жидкости. Фосфолипаза А2, выделенная из поджелудочной железы свиньи (Sigma) - 600 ед/мг белка. Обе фосфолипазы добавляли в соответствующий инкубационный буферный раствор в количествах, указанных в методике ниже. Активаторы ХЛ. Раствор 5 мМ изолюминола C8H7N3O2 (Aldrich, М = 177,16) готовили растворением навески порошка изолюминола в бидистиллированной деионизованной воде, подщелоченной KOH до pH 10-11. 1 мМ раствор люминола C8H7N3O2 (Aldrich, М 177,16) и 5 мМ раствор изолюминола C8H7N3O2·Н2О (Aldrich, М 195) готовили растворением навески порошка люминола (изолюминола) в бидистиллированной деионизованной воде, подщелоченной KOH. Растворы кумаринов С-525 и С-334 с концентрацией 0,5 мМ готовили растворением навесок C22H18N3O2 (М 356,78) и C17H17NO3 (Sigma, М 283,32), соответственно, в метаноле. 0,5 мМ раствор родамина 6Ж готовили растворением навески порошка родамина С28Н31N2O3Cl (Sigma, М 479,01) в дистиллированной воде. Пероксиды. Раствор пероксида водорода с концентрацией 1 М готовили растворением 30% H2O2 (Aldrich, M 34,02) в бидистиллированной деионизованной воде. Растворы пероксида водорода меньшей концентрации готовили разбавлением исходного раствора. Раствор трет-бутилгидропероксида (tBuOOH) с концентрацией 1 М готовили растворением 70% t-BuOOH (Aldrich, M 90,12) в дистиллированной воде. Для ХЛ-определения растворы меньшей концентрации готовили разбавлением исходного раствора фосфатным буферным раствором 50 мМ (pH 7,4). Раствор гидропероксида линолевой кислоты, 13-гидропероксиоктадекаеновую кислоту, (13-HpODE) с концентрацией 10 мкМ готовили растворением 1 мМ 13-HpODE (Sigma, M = 312,5). Растворы меньшей 58 концентрации готовили разбавлением исходных растворов фосфатным буферным раствором 50 мМ (pH 7,4) непосредственно перед определением и в процессе снятия параллельных измерений хранили на льду. Полимеры. Гиалуроновую кислоту (Lifecore Biomedical, М 360 кДа), поли-L-лизина гидробромид HBr (Sigma, М 15-30 и М 150-300 кДа) и полиэтиленимин (Sigma) растворяли в буферном растворе трис-HCl рН 7,4. Исходные растворы с концентрациями 5 мг/мл для гиалуроновой кислоты и поли-L-лизина и 10 мг/мл для полиэтиленимина хранили при -20ºС. Растворы меньшей концентрации готовили разбавлением исходных растворов непосредственно перед их использованием. Органические растворители. Хлороформ, метанол и н-гексан для получения липосом и комплекса ЦитКЛ в гидрофобной среде были как минимум ч.д.а. Органические растворители, используемые для выделения липидов из клеток и тканей, а также для хроматографических и хромато-масс-спектрометрических исследований были чистоты ВЭЖХ. Буферные растворы. Фосфатный буферный раствор (ФБ) с концентрацией 20 мМ и различными значениями рН готовили растворением навески KH2PO4 (Chemapol, ч.д.а.) в бидистиллированной деионизованной воде. Буферный раствор трис-HCl с концентрацией 10 мМ, рН 7,4 и содержащий 15 мМ NaCl (Sigma, ч.д.а.) готовили растворением навески хлорида оксиметиламинометана (Sigma, ч.д.а.) в бидистиллированной деионизованной воде. Необходимое значение pH буферных растворов доводили при помощи твердого KOH (Chemapol, ч.д.а.) или концентрированной HCl (Chemapol, ч.д.а.), контролируя кислотность при помощи pH-метра. Боратный буферный раствор (ББ) с концентрацией 20 мМ и рН 10,0 готовили растворением навески H3BO3 (Реалхим, ч.д.а.) в бидистиллированной деионизованной воде. 100 мМ карбонатный буферный раствор рН 9,0-9,2 готовили растворением навесок Na2CO3 и NaHCO3 (Sigma, 59 ч.д.а.) в бидистиллированной деионизованной воде. Необходимое значение pH 7,4 доводили при помощи твердого KOH (Chemapol, ч.д.а., М = 56,11) или концентрированной HCl (Chemapol, ч.д.а.), контролируя кислотность при помощи pH-метра. Прочие реактивы. Раствор FeSO4 с концентрацией 10 мМ готовили растворением навески FeSO4•7H2O (Реахим, ч.д.а.) в 0,1 М HCl. Окисление полученного раствора предотвращали добавлением 1-2 гранул цинка (Реахим, ч.д.а.). 1 мМ NaH2PO4 (Sigma) и 2,5% Na2MoO4·2H2O (Sigma) и 10% аскорбиновую кислоту (Sigmа) готовили в бидистиллированной деионизованной воде. BioRad Protein Assay Solution (Sigma) разбавляли в 4 раза в бидистиллированной деионизованной воде. Остальные реактивы, используемые в данной работе, были получены от Sigma и были как минимум ч.д.а. 3.2. Культуры клеток и используемый биологический материал Модели инициации апоптоза в клеточных культурах Все эксперименты по культивированию и работе с клетками были проведены сотрудниками лаборатории В.Е. Кагана в университете Питтсбурга (Пенсильвания, США). Подробную информацию об этих экспериментах можно найти в статьях [183-186]. Ниже приведено сокращенное описание использованных в работе клеточных линий, а также протоколов проводимых с ними экспериментов. Клеточные линии человеческих нейтрофилов (HL60), макрофагов (RAW264.5 и ТНР-1) и человеческих Т-лимфоцитов (Jurkat), полученные от American Type Culture Collection, а также мышиные эмбриональные клетки Цит c +/+ и Цит c -/- , полученные от факультета Биохимии университета Техаса (Даллас), культивировались в среде DMEM (RAW264.5) или RPMI1640 (HL60, ТНР-1, Jurkat) с добавлением FBS. ТНР-1 клетки дифференцировались в макрофаги путем культивирования в присутствии ФМА (40 пмоль/106 клеток) в течение 72 часов до эксперимента. Обогащение клеток HL60 и Jurkat линолевой кислотой 60 HL60 или Jurkat клетки (1·106 клеток/мл) культивировали в течение 16 ч в среде, содержащей линолевую кислоту в конечной концентрации 100 нмоль/мл среды. Затем клетки осаждали и промывали в среде RPMI1640 без фенолового красного и использовали для экспериментов. Инициация апоптоза в клетках Апоптоз инициировали тремя различными методами. В каждом случае степень протекания апоптоза оценивалась по связыванию с аннексином V/пропидий иодидом с использованием проточного цитометра. Н2О2-индуцированный апоптоз: HL60 клетки, культивированные в отсутствие (обычные HL60) или в присутствие линолевой кислоты (ЛК-HL60) плотностью 1·106 клеток/мл, инкубировали с 100 мкМ H2O2 при 37°C в CO2-инкубаторе (5% СО2) в течение ~ 5 часов. Поскольку оказалось невозможным получить аннексин V-положительные/пропидий иодид-отрицательные Jurkat клетки в аналогичных условиях, для них такой способ инициации апоптоза (H2O2) не применялся. tBuOOH-индуцированный апоптоз: клетки Цит c +/+ и Цит c -/- плотностью 1·106 клеток/мл инкубировали с 200 мкМ tBuOOH при 37°C в течение ~ 16 часов. Актиномицин Д-индуцированный апоптоз: клетки Цит c +/+ и Цит c -/- плотностью 1·106 клеток/мл инкубировали с актиномицином Д с концентрацией 100 нг/мл при 37°C в течение ~ 16 часов. Стауроспорин (СТС)-индуцированный апоптоз: HL60, ЛК-HL60, Jurkat или ЛКJurkat клетки (плотностью 1·106 клеток/мл) инкубировали с 4 мкМ (HL60) или 300 нМ (Jurkat) СТС в течение 4 или 2 часов соответственно. Апоптоз, индуцированный FAS антителами: Jurkat и ЛК-Jurkat клетки (плотностью 1·106 клеток/мл) инкубировали в течение 90 минут с 250 нг/мл FAS антителом (клон CH-11). Этот способ индуцирования апоптоза не применялся для HL60 клеток, поскольку известна их низкая чувствительность к такому апоптотическому пути. Оценка степени апоптоза Степень апоптоза мышиных эмбриональных клеток Цит c оценивали по связыванию с аннексином V-ФИТЦ. 61 +/+ и Цит c -/- Оценка степени фагоцитоза Степень фагоцитоза клеток HL60 и обогащенных линолевой кислотой ЛКHL60 оценивали по степени их захвата макрофагами в соотношении 10:1. Фагоцитарный индекс рассчитывался путем умножения процента макрофагов, фагоцитировавших клетки, на среднее число клеток, захваченных одним макрофагом. Пероксидация кардиолипина смесью цитохрома c с Н2О2 Кардиолипин был выделен из мозга крысы и отделен от других липидов методов ВЭЖХ. 250 мкМ кардиолипин в 20 мМ буферном растворе HEPES рН 7,4, содержащем 100 мкМ ДТПА, был обработан смесью Цит c и Н2О2 в течение 3 часов при 37ºС. Цитохром c и Н2О2 добавляли небольшими порциями каждые 10 минут до конечных концентраций 10 мкМ и 100 мкМ, соответственно. Обработанный таким образом кардиолипин затем экстрагировали и анализировали методом ВЭЖХ-МС. Пероксидацию тетралинолеоилкардиолипина проводили аналогично. Ротенон-индуцированная модель болезни Паркинсона Данная работа была проведена в Питтсбургском университете (США). В качестве модельных животных использовали самцов крыс Lewis (возрастом 7-9 месяцев, Charles River), у которых иниициировали болезнь Паркинсона введением 3,0 мг/(кг·день) ротенона. Ротенон вводили 1 день, в течение 5 дней или до начала развития признаков паркинсонизма (10-14 дней). Контрольной группе животных вводили ДМСО, используемый в качестве растворителя для ротенона. Выделяли участки substantia nigra и cortex (в качестве контроля), экстрагировали липиды и проводили хромато-масс-спектрометрический анализ, как это описано в работе [186] и в соответствующих методиках этого раздела. Схема эксперимента приведена на рис. 21 ниже. Красным цветом отмечена часть исследования, проделанная непосредственно автором данной диссертационной работы. 62 Рис. 21. Схема исследования окисления липидов при болезни Паркинсона. Модель церебральной ишемии после остановки сердца и сердечно-легочной реанимации Данная работа была проведена в Питтсбургском университете (США). В качестве модельных животных использовали самцов крыс PND 17. Крыс под наркозом вводили в состояние асфиксии на 9 минут, отключая их от дыхательного аппарата, после чего возобновляли поток кислорода и проводили сердечно-легочную реанимацию. Физиологические показатели регистрировали во время операции, подробное описание можно найти в статье [185]. Крысы выживали после операций и подвергались дальнейшему наблюдению. У выживших после асфиксии и реанимации крыс были обнаружены двигательные и когнитивные нарушения. Для оценки двигательных нарушений применяли два теста. Тест на гимнастическом бревне состоял из трех испытаний, в которых животные были помещены на подвесной деревянной узкой балке (шириной 1,5 см). Время, в течение которого крыса оставалась на балке, измеряли (в течение максимум 60 секунд). До остановки сердца, животных предварительно тренировали для теста на бревне. Для теста на наклонной плоскости крыс помещали на плоскую доску с увеличением угла 63 (45°- 80°). Максимальный угол, при котором животное могло сохранять свое положение в течение 10 секунд, было записано. Когнитивные нарушения оценивали по тесту Морриса, проведенному на 7-13 день после асфиксии-реперфузии. Водный лабиринт состоял из пластикового бассейна (диаметром 180 см, высотой 60 см), заполненного водой (26±1°C), в юго-западном секторе которого на расстоянии 26 см от стены лабиринта находилась платформа (диаметр 10 см). На 7-9 день после асфиксииреперфузии, платформу была помещена на 2 см над поверхностью воды (то есть, была видимой для крыс), животных помещали в воду. На 10-13 день платформа была помещена на 2 см ниже поверхности воды (была скрытой для крыс). На каждом из четырех ежедневных испытаний, крысу помещали в бассейн лицом к стене, начиная с четырех возможных случайным образом выбранных местах запуска. Крысам давали до 120 секунд, чтобы найти скрытые платформы. Если крысам не удалось найти платформу после 120 секунду, ее помещали на платформу и оставляли на платформе в течение 30 секунд, прежде чем поместить в инкубатор между испытаниями (испытания проводили с интервалом 4 минуты). Система видеонаблюдения AnyMaze, Stoelting, штат Иллинойс была использована для записи плавательного движения крыс. Для тестирования эффективности вещества XJB-5-131, крысам делали инъекцию XJB через сутки после восстановления спонтанного кровообращения. Для определения уровня апоптоза, в выделенных участках мозга крыс определяли активность каспаз 3/7 [185]. Сыворотка крови для определения содержания гидропероксидов липидов В опытах по определению содержания гидропероксидов липидов методом активированной ХЛ была использована сыворотка крови 10 пациентов с доклиническим атеросклерозом (ЦКБ гражданской авиации). Сыворотку хранили при температуре -20°С. 3.3. Аппаратура Хемилюминесценцию измеряли на хемилюминометрах SmartLum-5773 и Lum-100 (ИнтерОптика-С, Россия). 64 Для сопряжения компьютера и хемилюминометра использовали оригинальный программный продукт PowerGraph (версия 3.3, разработчик Измайлов Д.Ю.). Спектры поглощения регистрировали с использованием двухлучевого спектрофотометра Analytic Jena SPECORD 200 (Германия). Флуоресценцию измеряли на спектрофлуориметре RF-5301 (Shimadzu Corporation, Япония). Полимерные пленки получали методом послойной адсобрции с использованием автоматизированной системы погружения (Riegler and Kirstein GmbH, Германия). Липосомы получали с использованием экструдера Avanti Mini (США). Растворители упаривали на ротационном испарителе ИР-1ЛТ (Россия). Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп Zeiss LSM 510 Meta (Zeiss, Германия) с 63× масляным объективом (Plan-Apochromat, NA 1,4, Zeiss, Германия) использовали для получения изображений. Высокоэффективную жидкостную хроматографию липидов с последующим детектированием методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ВЭЖХ/ИЭР-МС) проводили с использованием хроматографической системы Dionex HPLC, состоящей из насоса для мобильной фазы Dionex UltiMate, дегазирующего элемента UltiMate 3000 и автосемплера UltiMate 3000 (Thermo Fisher Inc., США). Для сопряжения системы с компьютером использовали программу Chromeleon. Система Dionex HPLC была сопряжена с масс-спектрометром LXQ с ионной ловушкой или с гибридным квадруполь-орбитральным масс-спектрометром Q-Exactive (Thermo Fisher Inc., США), управляемыми программой Xcalibur. Колонки Luna 3 µm Silica2 100Å размером 150×1 мм (Phenomenex, США) использовали для нормально-фазовой ВЭЖХ; Luna 3 µm C182 100Å размером 150×1 мм (Phenomenex, США) и 3 µm C8 100Å размером 150×2 мм (Phenomenex, США) – для обращенно-фазовой ВЭЖХ. Для нормально-фазовой 2D тонкослойной хроматографии использовали силикагельные пластины размером 5×5 см фирмы Whatman (США). Обращеннофазовую твердофазную экстракцию проводили с использованием 96-луночных картриджей DSC-18 фирмы Supelco. 65 Монослои ТОКЛ формировались на ленгмюровской ванне Nima 601A (Nima Technology, Финляндия) в ИК РАН им. А.В. Шубникова. Для измерения рН использовали рН-метр HANNA 201 (США). Отбор аликвот проводили при помощи набора микропипеток серии Eppendorf (объемы 2,0–20,0; 10,0–100,0; 20–200 и 100–1000 мкл). Для приготовления водных растворов использовали бидистиллированную деионизованную воду (установка очистки воды MilliporeMilli-Q, Франция). В работе использовали весы A&DH t100 (Япония) и Kern ABS 80-4 (Германия). Пробирки с растворами при необходимости перемешивали на встряхивателе типа Vortex с частотой 1000 об/мин. При необходимости, растворы фильтровали с помощью фильтров фирмы Whatman (США). Данные, полученные хемилюминесцентными и спектроскопическими методами, обрабатывали в Excel, для работы с изображениями, полученными методами микроскопии, использовали программы LSM Browser и ImageJ. Анализ полученных хроматограмм и масс-спектров проводили с использованием программы Xcalibur. 3.4. Изучение взаимодействия цитохрома c и его комплекса с кардиолипином с липидными гидропероксидами 3.4.1. Реакции разложения гидропероксидов липидов под действием цитохрома c и его комплекса с анионными липидами Метод активированной хемилюминесценции В данной работе рассматриваются результаты, полученные при применении двух различных способов добавления реактивов в кювету для регистрации ХЛ. В обоих случаях реакционная смесь добавлялась в кювету в два этапа. Важно отметить, что по ходу каждого этапа в кювету добавлялись разные реагенты, а ХЛ могла развиваться только при одновременном присутствии этих компонентов смеси. Тот или иной способ введения добавки использовался нами в зависимости от поставленной задачи. 66 Первый способ (рис. 22, А) подразумевал добавление относительно большого объема реактивов, затем непродолжительную регистрацию фоновой ХЛ, а затем уже введение относительно малого объема растворов остальных компонентов реакционной смеси. При этом в процессе второй добавки необходимо было приостанавливать регистрацию ХЛ на несколько секунд, что приводило к потере части данных о так называемой быстрой вспышке ХЛ. Такой способ введения позволял вводить несколько последовательных добавок по ходу регистрации одной хемилюминесцентной кривой. В случае использования второго способа добавки компонентов смеси в реакционную кювету (рис. 22, Б), когда к малому объему реактивов через шприц вводится большой объем, потери данных о быстрой вспышке не наблюдалось, однако в ряде случаев при использовании второго способа введения наблюдалась артефактная вспышка ХЛ – она появлялась даже при отсутствии в реакционной смеси цитохрома с и вероятно была обусловлена так называемым bulb-эффектом (перемешивание). Эта вспышка совпадала во времени с быстрой вспышкой (они развивалась сразу после ввода добавки), что приводило к усложнению интерпретации данных. Быстрые вспышки ХЛ реакций регистрировали как минимум для двух параллельных измерений. Рис. 22. Сравнение двух способов регистрации ХЛ кривых. А. Добавление меньшего объема к большему с открытием прибора и остановкой регистрации данных на время ввода. Б. Введение большего объема к меньшему через шприц без остановки регистрации ХЛ. 67 ХЛ в реакции взаимодействия цитохрома с и его комплекса с ТОКЛ с органическим гидропероксидом А. ХЛ система цитохром c – С-525 – tBuOOH Концентрация цитохрома c В кювете для ХЛ смешивали (в указанном порядке) ФБ (20 мМ, рН 7,4), цитохром c (скон. 0; 1; 2,5; 5; 7,5; 10 или 15 мкМ) и 40 мкл 0,5 мМ С-525 (скон. 20 мкМ) и регистрировали фоновый сигнал ХЛ в течение ~ 60 сек, после чего добавляли tBuOOH (скон. 10 мМ) и продолжали регистрацию сигнала в течение еще 8 минут с перемешиванием. Конечный объем смеси 1000 мкл. Частота регистрации составляла 1 Гц. Концентрация tBuOOH В кювете для ХЛ смешивали (в указанном порядке) ФБ (20 мМ, рН 7,4), 50 мкл 100 мкМ цитохрома c (скон. 5 мкМ) и 40 мкл 0,5 мМ С-525 (скон. 20 мкМ) и регистрировали фоновый сигнал ХЛ в течение ~ 60 сек, после чего добавляли tBuOOH (скон. 0; 0,5; 1; 2,5; 5; 7,5; 10; 17; 25; 40 или 50 мМ) и продолжали регистрацию сигнала в течение еще 8 минут с перемешиванием. Конечный объем смеси 1000 мкл. Частота регистрации составляла 1 Гц. Б. ХЛ система цитохром c-ТОКЛ – С-525 – tBuOOH В кювете для ХЛ смешивали (в указанном порядке) ФБ (20 мМ, рН 7,4), 50 мкл 100 мкМ цитохрома c (скон. 5 мкМ), 50 мкл 3 мМ ТОКЛ, растворенного в метаноле (скон. 150 мкМ, соотношение ТОКЛ:Цит c 30:1), и 40 мкл 0,5 мМ С-525 (скон. 20 мкМ) и регистрировали фоновый сигнал ХЛ в течение ~ 60 сек, после чего добавляли tBuOOH (скон. 10 мМ) и продолжали регистрацию сигнала в течение еще 8 минут с перемешиванием. Конечный объем смеси 1000 мкл. Частота регистрации - 1 Гц. ХЛ в реакции взаимодействия цитохрома с и его комплекса с ТОКЛ с окисленной линолевой кислотой А. ХЛ система цитохром c – С-525 – линолевая кислота В кювету для хемилюминесценции добавляли 50 мкл 20 мМ линолевой кислоты (скон. 1 мМ) в разной степени окисленной пропусканием через нее 68 воздуха (степень окисленности линолевой кислоты оценивали по ХЛ в системе FeSO4 – С-525 – линолевая кислота) и регистрировали кривые ХЛ без перемешивания с частотой регистрации 10 Гц. В эппендорфе смешивали (в указанном порядке) 20 мМ ФБ рН 7,4 (общий объем V = 1000 мкл), 40 мкл 0,5 мМ С-525 (скон. 20 мкМ) и 50 мкл 100 мкМ цитохрома c (скон. 5 мкМ) и вводили в кювету через шприц, не прерывая регистрацию ХЛ спектров. Б. ХЛ система цитохром c-ТОКЛ – С-525 – линолевая кислота Эксперименты проводили согласно той же методике, что и для системы, описанной в предыдущем пункте и не содержащей ТОКЛ, дополнительно добавив в эппендорф с цитохромом c и кумарином С-525 50 мкл 3 мМ ТОКЛ, растворенного в метаноле (скон. 150 мкМ, соотношение ТОКЛ:Цит c 30:1). В. Влияние различных параметров на кумарин-активированную ХЛ в реакции взаимодействия цитохрома с с окисленной линолевой кислотой Для нижеперечисленных методик частично окисленную при длительном хранении линолевую кислоту во время эксперимента держали на льду, чтобы предотвратить ее окисление в ходе эксперимента. рН буферного раствора В кювету для хемилюминесценции добавляли 50 мкл 20 мМ линолевой кислоты (скон. 1 мМ) и регистрировали спектры ХЛ без перемешивания с частотой регистрации 10 Гц. В эппендорфе смешивали (в указанном порядке) 20 мМ ФБ рН 4,1; 6,5; 7,4; 8,4 или 9,4 (общий объем V = 1000 мкл), 40 мкл 0,5 мМ С-525 (скон. 20 мкМ) и 50 мкл 100 мкМ цитохрома c (скон. 5 мкМ) и вводили в кювету через шприц, не прерывая регистрацию ХЛ спектров. Концентрация линолевой кислоты Концентрацию линолевой кислоты варьировали при двух различных фиксированных концентрациях цитохрома c: 2,5 или 5 мкМ. В кювету для хемилюминесценции добавляли 50 мкл метанола или 25, 50, 75 или 100 мкл 20 мМ линолевой кислоты (скон. 0; 0,5; 1; 1,5 и 2 мМ) и регистрировали спектры ХЛ без перемешивания с частотой регистрации 10 Гц. В эппендорфе смешивали (в указанном порядке) 20 мМ ФБ рН 7,4 (общий объем V 69 = 1000 мкл), 40 мкл 0,5 мМ С-525 (скон. 20 мкМ) и 25 или 50 мкл 100 мкМ цитохрома c (скон. 2,5 или 5 мкМ, соответственно) и вводили в кювету через шприц, не прерывая регистрацию ХЛ спектров. Концентрация С-525 В кювету для хемилюминесценции добавляли 50 мкл 20 мМ линолевой кислоты (скон. 1 мМ) и регистрировали спектры ХЛ без перемешивания с частотой регистрации 10 Гц. В эппендорфе смешивали (в указанном порядке) 20 мМ ФБ рН 7,4 (общий объем V = 1000 мкл), 0, 50 или 100 мкл 0,05 мМ С-525 или 20, 30, 40, 60, или 80 мкл 0,5 мМ С-525 (скон. 0; 2,5; 5; 10; 15; 20; 30 или 40 мкМ) и 50 мкл 100 мкМ цитохрома c (скон. 5 мкМ) и вводили в кювету через шприц, не прерывая регистрацию ХЛ спектров. Концентрация цитохрома c В кювету для хемилюминесценции добавляли 50 мкл 20 мМ линолевой кислоты (скон. 1 мМ) и регистрировали спектры ХЛ без перемешивания с частотой регистрации 10 Гц. В эппендорфе смешивали (в указанном порядке) 20 мМ ФБ рН 7,4 (общий объем V = 1000 мкл), 40 мкл 0,5 мМ С-525 (скон. 20 мкМ) и 0, 50 или 100 мкл 10 мкМ или 25, 50, 75, 100 или 150 мкл 100 мкМ цитохрома c (скон. 0; 0,5; 1; 2,5; 5; 7,5; 10 или 15 мкМ) и вводили в кювету через шприц, не прерывая регистрацию ХЛ спектров. Кумарин-активированная ХЛ в реакции взаимодействия цитохрома с с окисленным БКЛ Как и в случае с окисленной линолевой кислотой, частично окисленный при длительном хранении БКЛ во время эксперимента держали на льду, чтобы предотвратить окисление в ходе эксперимента. Концентрация БКЛ В кювету для хемилюминесценции добавляли 0, 20, 50 или 100 мкл 1 мМ БКЛ (скон. 0; 20; 50 и 100 мкМ) и регистрировали спектры ХЛ без перемешивания с частотой регистрации 10 Гц. В эппендорфе смешивали (в указанном порядке) 20 мМ ФБ рН 7,4 (общий объем V = 1000 мкл), 40 мкл 0,5 мМ С-525 (скон. 20 70 мкМ) и 50 мкл 100 мкМ цитохрома c (скон. 5 мкМ) и вводили в кювету через шприц, не прерывая регистрацию ХЛ спектров. Концентрация цитохрома c В кювету для хемилюминесценции добавляли 50 мкл 1 мМ БКЛ (с кон. 50 мкМ) и регистрировали спектры ХЛ без перемешивания с частотой регистрации 10 Гц. В эппендорфе смешивали (в указанном порядке) 20 мМ ФБ рН 7,4 (общий объем V = 1000 мкл), 40 мкл 0,5 мМ С-525 (скон. 20 мкМ) и 0, 20 или 50 мкл 100 мкМ цитохрома c (скон. 0, 2 или 5 мкМ) и вводили в кювету через шприц, не прерывая регистрацию ХЛ спектров. Кумарин-активированная ХЛ в реакции взаимодействия цитохрома с с гидропероксидом линолевой кислоты Для изучения ХЛ быстрых реакций методом добавок была разработана схема эксперимента, представленная на рис. 23. Сначала больший объем ХЛ смеси добавляли к меньшему объему в кювете с регистрацией ХЛ без потери данных. После окончания реакции (угасания ХЛ до фонового значения) кювета отставлялась на баню со льдом. В новую кювету помещали необходимую добавку, после чего начинали регистрацию ХЛ сигнала и вводили содержимое кюветы 1 через шприц, также без потери данных. Рис. 23. Схема регистрации нескольких быстрых ХЛ вспышек методом введения большего объема к меньшему через шприц. Описание в тексте. 71 В кювету для хемилюминесценции помещали 31 мкл 160 мкМ гидропероксида линолевой кислоты (скон. 5 мкМ) (рис. 23, 1) и регистрировали спектры ХЛ без перемешивания с частотой регистрации 10 Гц. В эппендорфе смешивали (в указанном порядке) 20 мМ ФБ рН 7,4 (конечный объем в ХЛ кювете V = 1000 мкл), 50 мкл 100 мкМ цитохрома c (скон. 5 мкМ) и 50 мкл метанола или 50 мкл 3 мМ ТОКЛ (скон. 150 мкМ) и 40 мкл 0,5 мМ С-525 (скон. 20 мкМ) и вводили в кювету через шприц, не прерывая регистрацию ХЛ спектров (рис. 23, 2). После окончания реакции регистрацию ХЛ останавливали, кювету с содержащейся в ней ХЛ смесью отставляли на ледяную баню (рис. 23, 3). В новую ХЛ кювету помещали либо 31 мкл 160 мкМ гидропероксида линолевой кислоты (скон. 5 мкМ), либо 50 мкл 100 мкМ цитохрома c (скон. 5 мкМ) и 50 мкл 3 мМ ТОКЛ (скон. 150 мкМ) - рис. 23, 4 - и начинали регистрировать ХЛ. Через шприц вводили содержимое предыдущей кюветы и регистрировали новую вспышку ХЛ, как показано на рис. 23, 5. Пероксидазная активность комплекса цитохрома с с ТОКЛ в ХЛ реакции окисления люминола пероксидом водорода до и после его взаимодействия с гидропероксидом линолевой кислоты В кювету для хемилюминесценции помещали 100 мкл 100 мкМ Н 2О2 (скон. 10 мкМ) и 50 мкл 1 мМ люминола (скон. 50 мкМ) и регистрировали спектры ХЛ без перемешивания с частотой регистрации 10 Гц. В эппендорфе смешивали (в указанном порядке) 20 мМ ФБ рН 7,4 (конечный объем в ХЛ кювете V = 1000 мкл), 50 мкл 100 мкМ цитохрома c (скон. 5 мкМ) и 50 мкл 3 мМ ТОКЛ (скон. 150 мкМ) и вводили в кювету через шприц, не прерывая регистрацию ХЛ спектров. Во втором случае, в эппендорфе смешивали (в указанном порядке) 20 мМ ФБ рН 7,4 (конечный объем в ХЛ кювете V = 1000 мкл), 50 мкл 100 мкМ цитохрома c (скон. 5 мкМ), 50 мкл 3 мМ ТОКЛ (скон. 150 мкМ) и 31 мкл 160 мкМ гидропероксида линолевой кислоты (скон. 5 мкМ), перемешивали и выдерживали 6 минут. Вводили в кювету с Н2О2 (скон. 10 мкМ) и люминолом (скон. 50 мкМ) через шприц, не прерывая регистрацию ХЛ спектров, как и для предыдущего эксперимента. 72 Фотометрический и флуоресцентный анализ Изменения, происходящие с цитохромом c при его взаимодействии с гидропероксидом линолевой кислоты или в присутствие и отсутствие ТОКЛ наблюдали по поглощению в полосе Соре и по флуоресценции белка. Для этого регистрировали спектр поглощения 5 мкМ цитохрома c или 5 мкМ комплекса цитохрома c с ТОКЛ (1:32) в 20 мМ ФБ рН 7,4 в стеклянной кювете (l 1,00 см), относительно 20 мМ ФБ рН 7,4, от 300 до 650 нм с шагом 1,0 нм в объеме 1 мл, после чего добавляли 5 мкМ (конечная концентрация) гидропероксид линолевой кислоты и регистрировали спектры поглощения с 1 по 5 минуту каждую 1 мин. Через 5 минут добавляли свежую порцию гидропероксида линолевой кислоты (5 мкМ) и снова регистрировали спектры поглощения. Спектры флуоресценции регистрировали аналогично, в стеклянных кюветах (l 1,00 см) в объеме 2 мл, используя длину волны возбуждения 265 нм и измеряя флуоресценцию от 290 до 400 нм с Δλex/em 3 нм. 3.4.2. Реакции пероксидации БКЛ пероксидом водорода в присутствие цитохрома c Влияние момента добавления пероксида водорода к смеси цитохром c – БКЛ Серию экспериментов проводили для двух концентраций Н2О2 (30 или 120 мкМ). В кювету для хемилюминесценции помещали (в указанном порядке) 20 мМ ФБ рН 7,4 (общий объем реакционном смеси 1000 мкл), 60 мкл 0,5 мМ С-525 (скон. 30 мкМ) и 40 мкл 3 мМ БКЛ (скон. 120 мкМ) и регистрировали спектры ХЛ без перемешивания с частотой регистрации 1 Гц. Через 5 минут добавляли 28 мкл 133 мкМ цитохрома c (скон. 3,75 мкМ, соотношение липид:белок 32:1) и продолжали регистрацию ХЛ. Затем в разные моменты времени: через 0,5; 1; 2; 3 или 5 минут после добавления цитохрома c добавляли 30 мкл 1 мМ или 4 мМ Н2О2 (скон. 30 или 120 мкМ, соответственно) и продолжали регистрировать ХЛ. 73 Фотометрический и флуоресцентный анализ реакции взаимодействия цитохрома c и его комплексов с ТОКЛ или БКЛ с пероксидом водорода Спектры поглощения регистрировали в пластиковых кюветах (l 1,00 см) в объеме 1 мл относительно соответствующих растворителей (20 мМ ФБ рН 7,4 с добавлением количества метанола, эквивалентного добавленному в эксперименте). Регистрировали спектры поглощения 3,75 мкМ цитохрома c в 20 мМ ФБ рН 7,4 в пределах от 300 до 650 нм с шагом 1,0 нм, после чего в систему добавляли 120 мкМ ТОКЛ, БКЛ или эквивалентный объем метанола, после чего регистрировали спектры на 0,5; 1; 2; 3; 4 и 5 минуте после добавления кардиолипина/метанола. Добавляли 30 или 120 мкМ Н2О2 и регистрировали спектры поглощения на 0,5 мин. и с 1 по 15 минуту после добавления Н 2О2 каждую минуту. Спектры флуоресценции регистрировали аналогичным образом, в стеклянных кюветах (l 1,00 см) в объеме 2 мл, используя длину волны возбуждения 265 нм и измеряя флуоресценцию от 290 до 400 нм с Δλex/em 3 нм. 3.5. Определение гидропероксидов липидов методом активированной хемилюминесценции 3.4.1. Родамин-активированная хемилюминесценция при окислении Fe2+ гидропероксидами липидов Используемые в текущем разделе ХЛ системы ранее были описаны в литературе [187, 188]. В данной работе условия регистрации ХЛ были адаптированы для новых хемилюминометром и использовались для сравнения ХЛ сигналов, полученных в различных ХЛ системах. Кроме того, родаминактивированная ХЛ в присутствие линолевой кислоты вместо сыворотки крови была изучена. ХЛ система FeSO4 – родамин 6ж – линолевая кислота Выбор частоты регистрации спектров ХЛ В кювету для хемилюминесценции добавляли линолевую кислоту (с кон. 1 мМ), частично окисленную при хранении и содержащую продукты окисления, и 74 регистрировали кривые хемилюминесценции без перемешивания с частотой регистрации 1, 10 или 50 Гц. В эппендорфе в указанном порядке смешивали 20 мМ ФБ рН 7,4 (общий объем V = 1000 мкл), родамин 6ж (скон. 20 мкМ) и водный раствор FeSO4 (скон. 1 мМ) и вводили в кювету через шприц, не прерывая регистрацию ХЛ спектров. Концентрация сульфата железа (II) В кювету для хемилюминесценции добавляли линолевую кислоту (скон. 1 мМ), частично окисленную при хранении, и регистрировали кривые хемилюминесценции без перемешивания с частотой регистрации 10 Гц. В эппендорфе в указанном порядке смешивали 20 мМ ФБ рН 7,4 (общий объем V = 1000 мкл), родамин 6ж (скон. 20 мкМ) и водный раствор FeSO4 с конечной концентрацией 0; 0,5; 1; 2,5; 5; 10 или 15 мМ и вводили в кювету через шприц, не прерывая регистрацию хемилюминесцентных спектров. Концентрация родамина 6ж В кювету для хемилюминесценции добавляли линолевую кислоту (скон. 1 мМ), частично окисленную при хранении, и регистрировали кривые хемилюминесценции без перемешивания с частотой регистрации 10 Гц. В эппендорфе в указанном порядке смешивали 20 мМ ФБ рН 7,4 (общий объем V = 1000 мкл), родамин 6ж с конечной концентрацией 0; 10, 20, 40 или 80 мкМ и водный раствор FeSO4 (скон. 1 мМ) и вводили в кювету через шприц, не прерывая регистрацию ХЛ спектров. Концентрация линолевой кислоты В кювету для хемилюминесценции добавляли 50 мкл метанола или 10, 20, 30, 40 или 50 мкл 100 мМ линолевой кислоты (скон. 0; 1, 2, 3, 4 или 5 мМ), частично окисленной при хранении, и регистрировали кривые ХЛ без перемешивания с частотой регистрации 10 Гц. В эппендорфе в указанном порядке смешивали 20 мМ ФБ рН 7,4 (общий объем V = 1000 мкл), родамин 6ж (скон. 20 мкМ) и водный раствор FeSO4 (скон. 1 мМ) и вводили в кювету через шприц, не прерывая регистрацию ХЛ спектров. 75 Родамин-активированная ХЛ при окислении Fe2+ гидропероксидами сыворотки крови В кювету для хемилюминесценции добавляли 50 мкл сыворотки крови и регистрировали кривые хемилюминесценции (без перемешивания) с частотой регистрации 10 Гц. В эппендорфе в указанном порядке смешивали 20 мМ ФБ рН 7,4 (общий объем V = 1000 мкл), родамин 6ж (скон. 20 мкМ) и водный раствор FeSO4 с конечной концентрацией 0; 0,5; 1; 2,5; 5; 10 или 15 мМ и вводили в кювету через шприц, не прерывая регистрацию хемилюминесцентных спектров. 3.4.2. Люминол-активированная хемилюминесценция в реакции восстановления органических и липидных гидропероксидов под действием микропероксидазы Регистрация хемилюминесценции Хемилюминесцентный реагент (ХЛ-реагент) готовили смешением 100 мкМ микропероксидазы-11 и 5 мМ изолюминола в 20 мМ боратном буферном растворе pH 10, при этом МР-11 и изолюминол добавляли к ББ; получаемые концентрации в реагенте: 0,2 мкМ микропероксидазы-11 и 2 мкМ изолюминола. После смешения реагент отстаивали 20 мин до угасания собственной хемилюминесценции, затем использовали для анализа в день приготовления. Помещали 50 мкл раствора изучаемого гидропероксида в фосфатном буферном растворе 50 мМ pH 7,4 (для каждого из гидропероксидов концентрации указаны в соответствующих пунктах) в кювету хемилюминометра и начинали регистрацию кинетики ХЛ. Затем 950 мкл ХЛ-реагента вводили в кювету с помощью шприца через капилляр, не прерывая регистрацию и продолжали измерение ХЛ в течение 5 минут без перемешивания. Частота регистрации – 10 Гц. В качестве аналитического сигнала использовали площадь под кривой хемилюминесценции. Строили градуировочные зависимости площади под кривой хемилюминесценции от концентрации исследуемого гидропероксида. Для получения фоновых значений вместо раствора гидропероксида в кювету вносили 50 мкл фосфатного буферного раствора 50 мМ pH 7,4. В случае 76 исследования окисленной линолевой кислоты, в фоновый образец буферного раствора добавляли хлороформ в количестве, эквивалентном содержанию в объектах, т.к. хлороформ проявляет собственную хемилюминесценцию при реакции с ХЛ-реагентом. В случае ЛНП фоновый раствор не содержал дополнительных компонентов, так как гепарин и CaCl2 не проявили хемилюминесцентной активности. ХЛ система MP-11 – изолюминол – трет-бутилгидропероксид рН буферного раствора Подготавливали ряд ХЛ-реагентов, содержащих 20 мкл 5 мМ изолюминола (скон. 2 мкМ) и 100 мкл 0,1 мМ MP-11 (скон. 0,2 мкМ) в различных буферных растворах (общий объём 50 мл): ФБ 20 мМ (pH 7,4; 8,4; 8,9), ББ 20 мМ (pH 10). В кювету для хемилюминесценции помещали 50 мкл 4 мкМ tBuOOH (скон. 200 нМ), затем вводили 950 мкл соответствующего ХЛ-реагента, и регистрировали кривые ХЛ. Концентрация изолюминола Подготавливали ХЛ-реагент, содержавший 100 мкл 0,1 мМ MP-11 (скон. 200 нМ) и различные концентрации изолюминола (скон. 0; 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 10 мкМ) в боратном буферном растворе 20 мМ pH 10 (общий объём 50 мл). В кювету для хемилюминесценции помещали 50 мкл 4 мкМ tBuOOH (с кон. 200 нМ), затем вводили 950 мкл соответствующего ХЛ-реагента, и регистрировали кривые ХЛ. Концентрация микропероксидазы-11 Подготавливали ХЛ-реагент, содержавший 20 мкл 5 мМ изолюминола(скон. 2 мкМ) и различные концентрации MP-11 (скон. 0; 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 нМ) в боратном буферном растворе 20 мМ pH 10 (общий объём 50 мл). В кювету для хемилюминесценции помещали 50 мкл 4 мкМ tBuOOH (скон. 200 нМ), затем вводили 950 мкл соответствующего ХЛ-реагента, и регистрировали кривые ХЛ. Концентрация трет-бутилгидропероксида 77 Подготавливали ХЛ-реагент, содержавший 100 мкл 0,1 мМ MP-11 (скон. 200 нМ) и 20 мкл 5 мМ изолюминола (скон. 2 мкМ) в боратном буферном растворе 20 мМ pH 10 (общий объём 50 мл). В кювету для хемилюминесценции помещали 50 мкл раствора tBuOOH различных концентраций (скон. 0; 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750, 1000, 1250 нМ), затем вводили 950 мкл соответствующего ХЛ-реагента, и регистрировали кривые хемилюминесценции. ХЛ система MP-11 – изолюминол – гидропероксид линолевой кислоты Подготавливали ХЛ-реагент, содержавший 100 мкл 0,1 мМ MP-11 (скон. 200 нМ) и 20 мкл 5 мМ изолюминола (скон. 2 мкМ) в боратном буферном растворе 20 мМ pH 10 (общий объём 50 мл). В кювету для хемилюминесценции помещали 50 мкл раствора 13-HpODE различных концентраций (скон. 0; 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 225, 250, 275, 300 нМ), затем вводили 950 мкл соответствующего ХЛ-реагента, и регистрировали кривые ХЛ. Методика определения суммарного содержания гидропероксидов липидов в липопротеинах низкой плотности (ЛНП) Выделение липопротеинов низкой плотности (ЛНП) из сыворотки крови осуществляли по методике, описанной в работе [189]: 150 мкл сыворотки помещали в пробирку, содержащую 1,5 мл 0,28% CaCl2 и 30 мкл 1% раствора кристаллического гепарина. Пробирку аккуратно встряхивали, выстаивали при 4°С в течение 10 мин, затем центрифугировали при 3000 g 15 мин; супернатант отделяли и 2 мл буферного раствора (50 мМ KH2PO4; pH 7,4) добавляли к полученному осадку. Полученный раствор анализировали хемилюминесцентным методом без дальнейшего разбавления. До регистрации спектров образцы хранили на льду. Схематично процедура выделения ЛНП представлена на рис. 24. 78 Рис. 24. Схема выделения липопротеинов низкой плотности из сыворотки крови. Описание в тексте. Подготавливали ХЛ-реагент, содержавший 100 мкл 0,1 мМ MP-11 (скон. 200 нМ) и 20 мкл 5 мМ изолюминола (скон. 2 мкМ) в боратном буферном растворе 20 мМ pH 10 (общий объём 50 мл). В кювету для хемилюминесценции помещали 50 мкл раствора ЛНП, выделенных из сыворотки крови различных пациентов (10 шт.), затем вводили 950 мкл соответствующего ХЛ-реагента, и регистрировали кривые хемилюминесценции. Концентрация гидропероксидов липидов в образцах ЛНП рассчитана с помощью метода внешних стандартов (градуировочной зависимости) для трет-бутилгидропероксида. 3.6. Получение комплекса цитохрома c с кардиолипином в гидрофобном растворителе Последовательность операций при приготовлении растворов комплекса Цит-ТОКЛ в гидрофобном растворителе показана на рис. 25. Рис. 25. Схема получения раствора комплекса цитохрома с с кардиолипином в гидрофобном растворителе. Описание в тексте. 79 Вначале готовили 20 или 50 мкМ раствор цитохрома c в ФБ (20 мМ, рН 7,4), к которому затем добавляли раствор ТОКЛ в метаноле до суммарного объема 1000 мкл; мольные соотношения липид:белок 10:1, 15:1, 20:1, 30:1 и 40:1), смесь перемешивали (рис. 25, 1). В разных опытах добавляли разное процентное содержание метанола в пробу до конечного объемного соотношения ФБ:метанол 9:1 или 9:11. На втором этапе к раствору добавляли либо чистый хлороформ (1000 мкл), либо смесь хлороформа с метанолом в соотношении 2:1, эту смесь хорошо встряхивали и центрифугировали для расслоения растворов (рис. 25, 2). С помощью шприца с длинной иглой осторожно отсасывали хлороформ-метанольный раствор (80% объема нижней фазы - рис. 25, 3) и переносили его либо в кювету для измерения спектров поглощения и определения количества цитохрома с, перешедшего в хлороформ, либо в пробирку роторного испарителя. После удаления всего растворителя с помощью роторного испарителя на дне пробирки оставалась темно-красная пленка, содержащая комплекс Цит-ТОКЛ (рис. 25, 4). Пленку растворяли в 1000 мкл нгексана (рис. 25, 5). Измерение концентрации цитохрома с проводили спектрофотометрически, используя калибровочные графики для стандартных растворов белка в водных и водно-метанольных смесях при длине волны 407 нм. Максимум поглощения цитохрома с в водно-метанольных смесях с содержанием метанола 0, 10, 20, 30, 40 и 50% в длинноволновой области спектра 695-700 нм использовали для оценки конформационного состояния белка. 3.7. Получение малых однослойных липосом методом экструзии Однослойные липосомы получали методом экструзии, описанным в работе [190]. Получали липосомы двух типов: (1) ФХ-ФГ-холестерол-ФЭфлуо 7/2/1/0,5 (по массе) и (2) ФХ-холестерол-ФЭфлуо 9/1/0,5 (по массе). 10,5 мг липидов растворяли в 1 мл смеси хлороформ:этанол (1:1 по объему) в круглодонной колбе на 50 мл и досуха упаривали растворитель на роторном испарителе при 40ºС и давлении 75 мбар в течение 2 часов. Полученную тонкую липидную пленку оставляли под вакуумом на ночь при комнатной температуре и не следующий день растворяли в 2 мл буферного раствора трис-HCl при 5280 57ºС, поддерживая температуру выше температуры плавления используемых липидов. Полученную суспензию подвергали 11 циклам заморозки в жидком азоте (8 мин.) и нагреву до 52-57 ºС (15 мин.), после чего липосомы экструдировали 11 раз через 400 нм поликарбонатные мембраны и 11 раз через 100 нм поликарбонатные мембраны с использованием экструдера Avanti Mini при 52-57˚С. Готовые суспензии липосом хранили при 4˚С. Гидродинамические радиусы липосом определяли методом динамического светорассеяния из 10 параллельных измерений. 3.8. Получение полиэлектролитных пленок методом послойной адсорбции Полимерные пленки, состоящие из гиалуроновой кислоты (HA) и поли-Lлизина (PLL) получали методом послойной адсорбции последовательным погружением стеклянной подложки в растворы полианиона и поликатиона с использованием автоматического робота, как было описано ранее [190]. Предварительно, микроскопические стекла (d 12 мм) очищали в 2% растворе Hellmanex, 1 M HCl (2 раза) и Milli Q H2O (2 раза) в течение 15 минут для каждого из реагентов при 60ºС. Очищенные стекла погружали в раствор полиэтиленимина (PEI) с концентрацией 1 мг/мл, а затем поочередно в растворы поли-L-лизина и гиалуроновой кислоты (концентрации 0,5 мг/мл, по 10 минут на каждый полимер) с тремя промывками между каждым нанесением полимера в буферном растворе трис-HCl (по 3 минуты) – всего 24 цикла нанесения поликатиона/полианиона с использованием автоматического робота. Поли-Lлизин наносили в качестве последнего слоя. Таким образом, была получена следующая последовательность слоев: PEI-(PLL-HA)24-PLL. К готовым пленкам добавляли 0,1% азида натрия и хранили их в буферном растворе трис-HCl при 4ºС не более, чем две недели. Для анализа z-распределения липидов на полимерных пленках, использовали стеклянные подложки с цилиндрической геометрией: пленки наносили на узкие (диаметр 100 мкм при длине около 1,5 см) стеклянные трубочки согласно протоколу, описанному выше, но при 37 ºС. 81 3.9. Адсорбция липидов на поверхности полиэлектролитных пленок 3.9.1. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия (ЛСКМ) Полиэлектролитные мультислойные пленки погружали в суспензию флуоресцентно меченных липосом и наблюдали процесс адсорбции и структурирования липидов на поверхности пленок с помощью лазерного конфокального микроскопа с использованием масляного объектива 63×/1,4 и аргонового лазера при длине волны возбуждения 458 нм и интеграции сигнала при длинах волн 515 нм и выше в режиме z-сканирования с шагом 1,0 мкм. Настройки мощности лазера не меняли в течение эксперимента с целью дальнейшего количественного анализа полученных изображений. Транспорт флуоресцентно меченного белка из водного раствора через липидный бислой в полимерные мультислои также наблюдали с помощью конфокальной микроскопии. Использовали масляный объектив 63×/1,4 и аргоновый лазер при длине волны возбуждения 488 нм и интеграции сигнала при длинах волн 515 нм и выше в режиме z-сканирования с шагом 1,0 мкм. Сигнал от флуоресцентно-меченных липидов в этих условиях либо был сопоставим с фоновым значением и вычитался при анализе данных, либо был искусственно уменьшен до фонового значения за счет предварительного фотовыжигания образца (при 100% интенсивности лазера при 458 нм) и также вычитался впоследствии. 3.9.2. Выбор условий формирования липидного бислоя на поверхности полиэлектролитных пленок Условия адсорбции липидов на поверхность пленки представлены в таблице 2. В данном исследовании влияние на формирование липидного бислоя на поверхности полимерных мультислоев трех основных параметров: строения самой полимерной пленки, концентрации и липидного состава липосом. Адсорбцию проводили из объема 300 мкл (суспензия липосом в буферном растворе трис-HCl) при комнатной 82 температуре и при интенсивном перемешивании микропипеткой в момент добавления липосом, но без перемешивания в дальнейшем. Процесс адсорбции наблюдали в течении 2 часов. Полимерные 24-бислойные пленки Полианион Поликатион Адсорбируемые липосомы (диаметр ~ 100 нм) Концентрация (суммарное Тип липосом содержание липидов) 20 мкМ Поли-L-лизин 15-30 кДа ФХ-ФГ-холестеролфлуо ФЭ 50 мкМ 7/2/1/0,5 (по 100 мкМ массе) Гиалуроновая 200 мкМ кислота 360 кДа ФХ-ФГ-холестеролПоли-L-лизин ФЭфлуо 7/2/1/0,5 150-300 кДа ФХ-холестерол- 50 мкМ 50 мкМ ФЭфлуо 9/1/0,5 Таблица 2. Варьируемые параметры адсорбции липидов на поверхность полиэлектролитных пленок. 3.9.3. Транспорт белков через липидный бислой из раствора состоящим из 24 в полиэлектролитные пленки К планарным полимерным пленкам, бислоев гиалуроновой кислоты и поли-L-лизина (150-300 кДа), покрытым липидным бислоем из ФХ-ФГ-холестерол-ФЭфлуо липосом, а также к непокрытым липидами пленкам (в качестве контрольного эксперимента) добавляли 300 мкл лизоцима или α-лактальбумина, меченных флуоресцеином, в конечной концентрации 0,5 мг/мл в буферном растворе трис-HCl и хорошо перемешивали микропипеткой. Транспорт белка наблюдали без перемешивания при комнатной температуре в течении 30 минут. За это время флуоресцентный сигнал выходил на плато и не менялся. 83 3.10. Определение пероксидазной активности комплекса цитохрома c с ТОКЛ липидного монослоя хемилюминесцентным методом Данные по изучению монослоев кардиолипина, представленные в данной работе, были получены при сотрудничестве с институтом кристаллографии РАН. Монослои ТОКЛ были сформированы на границе раздела вода – воздух согласно методике, разработанной в ИК РАН. В качестве субфазы использовалась MilliQ вода (Millipore, США) с 20 мМ ФБ рН 7,4. Для формирования монослоев поверхность водной субфазы наносился на раствор ТОКЛ в хлороформе. Монослой формировался при перемещении барьера ванны вплоть до достижения заданного поверхностного давления в слое. После формирования монослоя кардиолипина, в раствор добавляли цитохром с в конечной концентрации 50 или 200 нМ. Определяли пероксидазную активность (1) цитохрома c, не встроенного в липидный монослой, (2) цитохрома c, встроенного в монослой ТОКЛ при его эквивалентной площади и (3) цитохрома c, встроенного в монослой ТОКЛ при его максимальном сжатии. Для определения пероксидазной активности образца в кювете для ХЛ смешивали 715 мкл ФБ (20 мМ, рН 7,4), 245 мкл пробы (12,3 нМ или 50 нМ конечная концентрация Цит c) и 20 мкл 1 мМ люминола (20 мкМ) и регитрировали фоновый сигнал ХЛ в течение ~ 30 сек, после чего добавляли 20 мкл 1 мМ Н2О2 (20 мкМ) и продолжали регистрирацию сигнала в течение еще 5 минут. Для определения максимальной пероксидазной активности каждого из образцов в систему добавляли избыток ТОКЛ (дополнительно, не из монослоя). Для этого в ХЛ кювете смешивали 675 мкл ФБ, 245 мкл пробы (12,3 нМ или 50 нМ конечная концентрация Цит c), 40 мкл 10 мкМ ТОКЛ (в метаноле; Цит-КЛ ~ 1:32) и 20 мкл 1 мМ люминол (20 мкМ), регитрировали фоновый сигнал ХЛ в течение ~ 30 сек, после чего добавляли 20 мкл 1 мМ Н2О2 (20 мкМ) и продолжали регистрирацию сигнала в течение еще 5 минут. Частота регистрации – 1 Гц. Пероксидазную активность комплекса цитохрома c с ТОКЛ липидного монослоя выражали в % от максимальной активности, используя площадь под 84 кривыми ХЛ со 2 по 5 минуту в качестве аналитического сигнала. Эксперименты проводились для n=2. 3.11. Методы выделения, разделения и определения липидов клеточных культур и тканей животных Данные по изучению изменения липидного состава клеточных культур и тканей животных при различных моделях апоптоза, представленные в данной работе, были получены в Питтсбургском университете (США, Пенсильвания). В данном разделе будут описаны только методики, использованные непосредственно автором. Подробную информацию о прочих методах и экспериментах, результаты которых были использованы в данной работе, можно найти в соответствующих статьях. 3.11.1. Экстракция липидов и определение содержания фосфолипидов в образце Липиды экстрагировали из клеток линий HL60 и Jurkat (~ 106 клеток/мл) или гомогенизированных на льду в стеклянном гомогенизаторе тканей мозга крыс (кусочки ~ 0,3 г: участки Cortex и Substantia Nigra) согласно методу, предложенному Фолчем [191]. Для этого к образцу на льду добавляли 1 мл 0,785% KCl и интенсивно перемешивали пробирку, после чего добавляли 5 мл смеси хлороформ:метанол 2:1 по объему. Пробирку интенсивно встряхивали каждые 2-3 минуты в течении часа, после чего оставляли смесь на ночь в холодильнике до полного расслоения фаз. Нижнюю фазу, содержащую экстрагированные липиды, переносили в отдельную пробирку и упаривали досуха в инертной атмосфере, продуванием азота. Вторичную экстракцию проводили в тот же день, для этого к оставшемуся образцу добавляли 5 мл хлороформа, интенсивно перемешивали содержимое пробирки 4-5 раз в течение нескольких минут и центрифугировали в течении 5 минут при скорости 1000 g. Нижнюю фазу объединяли с первичным экстрактом и упаривали досуха. Полученную таким образом тонкую липидную пленку растворяли в 200 мкл смеси хлороформ:метанол 2:1, определяли содержание фосфолипидов в образце 85 (методика описана ниже) и хранили при -20ºС. Отдельные классы фосфолипидов после разделения методом 2D тонкослойной хроматографии экстрагировали аналогичным образом. Суммарное количество фосфолипидов оценивали по содержанию фосфора. Для этого из липидного образца упаривали растворитель (в потоке азота) и добавляли 125 мкл 70% перхлорной кислоты, тщательно перемешивали до полного растворения липидной пленки, после чего грели при 170ºС в течение 20-40 минут до полного окисления и исчезновения мутности раствора. После охлаждения образцов, добавляли 825 мкл MilliQ H2O, 125 мкл 2.5% Na2MoO4*2H2O, 125 мкл 10% свежеприготовленной аскорбиновой кислоты и интенсивно перемешивали, после чего образцы помещали в кипящую водяную баню на 10 минут. Для построения калибровочной зависимости использовали 0, 5, 15. 25, 35 и 45 мкл 1 мМ NaH2PO4 с добавлением различных объемов воды (825, 820, 810, 800, 790 и 780 мкл соответственно). Стандартные растворы готовили аналогичным образом, согласно процедуре, описанной выше. Приготовленные таким образом образцы, окрашенные в зелено-синий цвет, помещали в фотометрические кюветы (l=1,00 см) и измеряли поглощение при 797 нм, используя MilliQ H2O в кювете сравнения. Содержание фосфора определяли как минимум для двух параллельных проб. 3.11.2. Определение суммарного содержания белка (для тканей животных) Для определения содержания белка в образцах тканей животных, гомогенат ткани разбавляли водой и озвучивали, после чего центрифугировали при 10000 g в течение 10 минут и использовали супернатант для определения белка с помощью кита BioRad Protein Assay с использованием 96-луночном планшетного фотометра. Для построения калибровочной зависимости использовали растворы 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 и 35 мкл 0,1 мг/мл БСА. Необходимый для измерений объем образца подбирали визуально таким образом, чтобы после добавления к образцу BioRad появлялась ярко-голубая окраска, сопоставимая с 15-20 мкл БСА (в пределах калибровочной зависимости). К стандартным растворам и образцу добавляли 290 мкл BioRad, 86 разбавленного бидистиллированной водой в соотношении 1:4, инкубировали в течение 5 минут и измеряли поглощение при 595 нм. Содержание белка определяли как минимум как минимум для трех параллельных проб. 3.11.3. Разделение липидов методом тонкослойной 2D хроматографии Липидные экстракты, выделенные из клеток и тканей, разделяли по классам липидов методом нормально-фазовой тонкослойной 2D хроматографии [192] на силикагельных пластинах (5×5 см), предварительно очищенных смесью хлороформ:метанол 2:1 и прокаленных при 120ºС в течение 10 минут. Для предотвращения окисления липидов в процессе их выделения, вся процедура проводилась в токе инертного газа (азота). Готовые системы должны быть прозрачными. Наносили ~ 2 мкг (по фосфору) липидов в объеме около 5 мкл на каждую пластину, досуха выпаривали растворитель в токе азота и погружали подготовленную таким образом пластину в систему 1: смесь 65 мл хлороформа, 25 мл метанола и 5 мл NH4OH на примерно 5 минут, до полного элюирования. Высушивали пластину в токе азоте и погружали ее в систему 2 (в направлении, перпендикулярном системе 1), состоящую из 50 мл хлороформа, 20 мл ацетона, 10 мл метанола, 10 мл ледяной уксусной кислоты и 5 мл бидистиллированной воды. После элюирования, высушенную пластину смачивали водой для проявления пятен разделенных липидов и соскребали их в 1 мл воды, после чего немедленно добавляли 5 мл хлороформ-метанольной смеси 2:1 для дальнейшей экстракции. Вид типичной хроматограммы, полученной вышеописанным способом для клеток типа 32D, представлен на рис. 26. 87 Рис. 26. Типичный вид 2D ТС хроматограммы липидного экстракта [193]. 3.11.4. Обработка липидного экстракта тканей смесью фосфолипаз А1 и А2 с последующим отделением жирных кислот методом твердофазной экстракции Липидные экстракты, выделенные из мозга крысы, обрабатывали смесью фосфолипаз А1 и А2, гидролизующих фосфолипиды с высвобождением жирных кислот для из дальнейшего анализа [194]. Реакцию проводили в среде 50 мМ боратного буферного раствора рН 9,0 с добавлением 20 мМ холата натрия, 2 мМ CaCl2 и 0,1 мМ диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ДТПА). 500 нмоль фосфолипидов (по фосфору) высушивали в потоке азота до образования тонкой липидной пленки и инкубировали со смесью фосфолипазы А1, выделенной из thermomyces lanuginosus, и porcine pancreatic фосфолипазы А2 в 1 мл буферного раствора при 37ºС в течение 45 минут, добавляя смесь фосфолипаз три раза каждые 15 минут (0, 15 и 30 минут, соответственно) и интенсивно встряхиваяя полученный раствор. Для каждого добавления использовали фосфолипазу А 1 из расчета 10 мкл/мкмоль ФЛ и фосфолипазу А2 10 ед/мкмоль ФЛ. Полученные таким образом свободные жирные кислоты отделяли методом твердофазной экстракции. К 400 мкл фосфолипидов после обработки фосфолипазами (в инкубационном подкисленного буферном 0,1% растворе) муравьиной добавляли кислоты, и 100 мкл интенсивно метанола, встряхивали. Картриджи для твердофазной экстракции промывали 1 мл метанола и 88 уравновешивали 1 мл 20% метанола в воде с добавлением 0,02% муравьиной кислоты под вакуумом, после чего пропускали 500 мкл образца через промытый картридж. Экстрагированные таким образом липиды упаривали досуха в токе азота и перерастворяли в смеси хлороформ:метанол 2:1 для дальнейших хромато-масс-спектрометрических исследований. 3.11.5. Разделение липидов методом ВЭЖХ Разделение липидов по классам проводили методом нормально-фазовой хроматографии с использованием градиентного элюирования на силикагельной колонке. Растворитель А (гексан:пропанол:вода 47:57:1 по объему) и растворитель Б (гексан:пропанол:вода 47:57:10 по объему) содержали 5 мМ ацетат аммония и 0,01% муравьиной кислоты. Скорость элюирования составляла 0,05 мл/мин []. Используемый градиент растворителя представлен на рис. 27, А. Разделение окисленных и неокисленных жирных кислот по индивидуальным видам проводили методом обращенно-фазовой хроматографии с использованием градиентного элюирования на колонке С18. Растворитель А представлял собой смесь тетрагидрофуран:метанол:вода:уксуснавя кислота в объемном соотношении 25:30:44,9:0,1. В качестве растворителя Б использовали смесь метанол:вода 9:1 по объему, оба растворителя содержали 5 мМ ацетат аммония. Скорость элюирования составляла 0,05 мл/мин. Используемый градиент растворителя представлен на рис. 27, Б. Рис. 27. Градиенты растворителей, используемые для ВЭЖХ разделения (А) липидов по классам на нормально-фазовой колонке; (Б) свободных жирных кислот по молекулярным видам на обращенно-фазовой колонке. 89 Разделение кардиолипина окисленных проводили и неокисленных молекулярных методом обращенно-фазовой видов хроматографии с использованием изократического элюирования на колонке С8 или С18. Мобильная фаза представляла пропанол:вода:триэтиламин:уксусная кислота собой в объемном смесь 2- соотношении 45:5:0,25:0,25. Скорость элюирования составляла 0,15 мл/мин. Разделение липидов проводили из расчета 100 нмоль фосфолипидов (по фосфору), растворенных в 20 мкл смеси хлороформ:метанол 2:1, из 5 мкл образца (25 нмоль фосфолипидов). Во всех случаях хроматографические колонки были соединены с масс-спектрометрами, где проходило последующее определение липидов. 3.11.6. Масс-спектрометрическое определение липидов Использовали масс-спектрометры (LXQ с ионной ловушкой или с гибридный квадруполь-орбитральный Q-Exactive) со способом ионизации методом электрораспыления в режиме регистрации отрицательно заряженных ионов, при напряжении от 3,5 до 5,0 кВ и температуре источника ионизации 150ºС. В случае определения фосфолипидов, ионы детектировали в диапазоне m/z 370-1600; при определении кардиолипинов использовали m/z 1000-1600, а при определении свободных жирных кислот был выбран диапазон m/z 200–400. Тандемную масс-спектрометрию (МС2 спектры) индивидуальных фосфолипидов и кардиолипинов использовали для определения их жирнокислотного состава, с энергией соударения на уровне 20-40% и параметром активации q = 0,25 для диссоциации при соударении и 0,70 для Q-имульсной диссоциации. Для получения МС2 спектров регистрировали интегральный сигнал из 5 микросканов с максимальным временем ввода 1000 мс, для пиков с разницей 1 m/z. В образцы липидов добавляли внутренние стандарты с концентрацией 5 мкМ для каждого индивидуального липида, описанные в таблице 3. Количественное определение проводили с использованием калибровочных зависимостей с использованием внутренних (5 мкМ) и внешних стандартов в концентрационном диапазоне 1-15 мкМ основных классов фосфолипидов (таблица 3) и индивидуальных видов 90 свободных жирных кислот (таблица 4). Важно отметить, что молекулярные виды липидов, выбранных в качестве внутренних стандартов, не входили в состав анализируемых липидных экстрактов и, таким образом, их добавление не искажало полученных результатов. Калибровочные зависимости получали в тот же день, что и хромато-массспектры липидных экстрактов. Стоит отметить, что приведенные в таблицах 3 и 4 значения коэффициентов линейной регрессии и времена удерживания липидов незначительно варьировались от одного эксперимента к другому, в зависимости от условий хроматографического разделения и ионизации образцов, а также условий калибровки масс-спектрометра. Все хромато-масс-спектрометрические эксперименты проводили как минимум для двух параллельных проб. 91 Класс липидов Внутренний стандарт m/z [M]- Время Внешний удерживавния, стандарт мин. m/z [M]- Время удерживавния, мин. Калибровочный коэффициент, относит. R2 площадь пика/мкМ 0,136 0,991 Фосфатидилхолин (ФХ) 11:0/11:0 638,3 33,3 18:1/18:1 830,5 29,5 Фосффатидилсерин 17:0/17:0 762,5 24,5 18:1/18:1 786,5 24,4 1,478 0,994 (ФС) Фосфатидилэтаноламин 17:0/17:0 718,5 13,3 18:1/18:1 742,6 13,0 0,622 0,998 (ФЭ) Фосфатидилинозитол 17:0/17:0 809,5 11,6 18:1/18:1 833,5 11,4 0,622 0,995 (ФИ) Кардиолипин (КЛ) (14:0)4 1239,8 14,1 (18:2)4 1447,9 12,8 6,746 0,896 Сфингомиелин (СМ) 15:0 691,4 33,8 18:1 773,5 31,8 0,116 0,999 Лизо-фосфатидилхолин 17:0 554,2 50,9 18:0 568,2 50 0,548 0,993 (ЛФХ) Лизо-фосффатидилсерин 17:0 762,5 15,4 18:0 786,5 15,4 0,460 0,937 (ЛФС) Лизофосфатидилэтаноламин 13:0 410,3 18 18:0 480,3 16,9 0,254 0,989 (ЛФЭ) Лизофосфатидилинозитол 13:0 529,2 17,1 18:1 597,2 17,2 0,269 0,952 (ЛФИ) Лизо-кардиолипин (14:0)3 1029,6 16,1 (18:2)2 1185,7 15,1 0,164 0,989 (ЛКЛ) Таблица 3. Внутренние и внешние стандарты, используемые для определения основных классов фосфолипидов методом массспектрометрии, и коэффициенты линейной регрессии, полученные для концентрационного диапазона 1-15 мкМ и соответствующие им коэффициенты корреляции, используемые для количественного анализа. Калибровочный m/z коэффициент, Жирная кислота R2 [M] относит. площадь пика/мкМ Миристиновая кислота C14:0 227,2 21,2 0,083 0,968 Пальмитиновая кислота C16:0 255,2 27,0 1,633 0,944 Стеариновая кислота C18:0 283,2 32,0 0,133 0,952 Олеиновая кислота C18:1 281,2 28,3 0,910 0,992 Линолевая кислота C18:2 279,2 25,1 0,309 0,989 Линоленовая кислота C18:3 277,2 22,2 0,404 0,991 Арахидоновая кислота C20:4 303,2 24,9 0,523 0,976 Эйкозапентаеновая кислота C20:5 301,2 21,9 0,074 0,961 Докозапентаеновая кислота C22:5 329,2 26,5 0,430 0,968 Докозагексаеновая кислота C22:6 327,2 24,5 0,433 0,998 9-оксо-октадекаеновая кислота 293,2 10,4 0,399 0,996 13-оксо-октадекаеновая кислота 293,2 9,9 0,586 0,970 9-гидрокси-октадекаеновая кислота 295,2 11,5 0,352 0,974 13-гидрокси-октадекаеновая кислота 295,2 10,8 0,398 0,993 9,10-эпокси-октадекаеновая кислота 295,2 14,0 0,406 0,982 12,13-эпокси-октадекаеновая кислота 295,2 13,6 0,431 0,981 9-гидроперокси-октадекаеновая кислота 311,2 11,7 0,074 0,956 13-гидроперокси-октадекаеновая кислота 311,2 11,5 0,044 0,986 Табица 4. Cтандарты, используемые для определения свободных жирных кислот методом масс-спектрометрии, и коэффициенты линейной регрессии, полученные для концентрационного диапазона 1-15 мкМ и соответствующие им коэффициенты корреляции, используемые для количественного анализа. В качестве внутреннего стандарта использовали жирную кислоту С17:0 (m/z 269,2) с концентрацией 5 мкМ. Время удерживавния, мин. 93 4. Результаты и обсуждение В этой главе будут рассмотрены результаты изучения молекулярных механизмов реакций пероксидации липидов под действием комплекса цитохрома c с анионными липидами и предложенные методики определения гидропероксидов липидов (раздел 4.1), модели для изучения цитохрома c с анионными липидами в гидрофобном окружении (раздел 4.2), а также результаты исследования роли процесса пероксидации липидов под действием комплекса цитохрома c с анионными липидами в апоптозе (раздел 4.3). 4.1. Молекулярные механизмы реакций пероксидации, катализируемых цитохромом c и его комплексом с анионными липидами В данном разделе будут вначале рассмотрены результаты изучения реакций взаимодействия цитохрома c и его комплекса с кардиолипином с органическими гидропероксидами (на примере трет-бутилгидропероксида) и две реакции с анионными липидами: разрушение гидропероксидов липидов и реакция липопероксидации. Будут также приведены разработанные методики определения гидропероксидов липидов. 4.1.1. Взаимодействие цитохрома c и его комплекса с кардиолипином с органическими гидропероксидами Органические гидропероксиды различной природы представляют собой интересный с химико-биологической точки зрения объект в силу ряда особенностей своего строения. С одной стороны, органические гидропероксиды, такие как трет-бутилгидропероксид или гидропероксид кумола, как и пероксид водорода, практически неограниченно растворимы в воде. В то же время, они содержат в своем составе органическую часть и, тем самым, по ряду свойств напоминают гидропероксиды липидов и могут рассматриваться в качестве модельного объекта или же стандарта для определения липидных гидроперекисей. 94 Взаимодействию цитохрома c с органическими гидропероксидами различной природы посвящено много работ, однако точный молекулярный механизм протекаемых при этом реакций не был изучен. В работе [150] было показано, что молекула цитохрома c содержит несколько активных центров, отвечающих за разложение пероксида водорода, органических гидропероксидов или гидропероксидов липидов, при этом, по-видимому, отличаются и молекулярные механизмы реакций разложения различных пероксидов цитохромом c. В данной работе эти предположения были подтверждены методом активированной хемилюминесценции. Ниже рассмотрены данные, полученные при изучении ХЛ системы, состоящей из цитохрома c или его комплекса с ТОКЛ, tBuOOH и активатора ХЛ кумарина С-525 в фосфатном буферном растворе рН 7,4. Рис. 28. А. Кривые ХЛ, полученные при добавлении tBuOOH (1 – 0 мкМ, 2 – 2,5 мМ, 3 – 5 мМ, 4 – 10 мМ, 5 – 50 мМ; момент добавления показан стрелкой) к смеси 5 мкМ цитохрома c и 20 мкМ С-525 в 20 мМ ФБ рН 7,4. Объем ХЛ смеси 1000 мкл. Частота регистрации – 1 Гц. Б. Зависимости максимальной интенсивности (слева) и площади под кривой ХЛ (справа) от концентрации tBuOOH. Стандартные отклонения даны для 2 параллельных измерений. 95 ХЛ кривые, полученные для изучаемой системы при различных концентрациях tBuOOH, представлены на рис. 28, А. Наблюдаемые при добавлении tBuOOH вспышки ХЛ достигают своего максимального значения за ~ 0,5 минут (чем больше tBuOOH было добавлено, тем быстрее достигается максимум), после чего ХЛ медленно затухает до фонового значения за время порядка 10 минут. При этом, как видно из полученных зависимостей максимальной интенсивности и площади под кривой ХЛ от концентрации tBuOOH (рис. 28, Б), введение tBuOOH в количестве больше 10 мМ не приводит к увеличению суммарного количества образованных в реакции радикалов (плато на концентрационной зависимости площади), но ускоряет реакцию (интенсивность максимума ХЛ продолжает увеличиваться). Рис. 29. А. Кривые ХЛ, полученные при добавлении 10 мМ tBuOOH (момент добавления показан стрелкой) к смеси различных количеств цитохрома c (1 – 0 мкМ, 2 – 1 мкМ, 3 – 2,5 мкМ, 4 – 5 мкМ, 5 – 7,5 мкМ, 6 – 15 мкМ) и 20 мкМ С-525 в 20 мМ ФБ рН 7,4. Объем ХЛ смеси 1000 мкл. Частота регистрации – 1 Гц. Б. Зависимости максимальной интенсивности (слева) и площади под кривой ХЛ (справа) от концентрации цитохрома c. Стандартные отклонения даны для 2 параллельных измерений. 96 Влияние концентрации цитохрома c на вид ХЛ кривых и их основные характеристики показано на рис. 29. Видно, что увеличение концентрации цитохрома c приводит к увеличению ХЛ сигнала. Согласно данным, полученным ранее [195], соотношение липид:белок в наносферах комплекса Цит-ТОКЛ в изучаемых условиях (20 мМ ФБ рН 7,4) составляет примерно 30:1. Это соотношение было выбрано для дальнейших экспериментов. Сравнение спектров ХЛ реакции разложения tBuOOH цитохромом c и его комплекса с ТОКЛ (1:30) показало, что кинетика двух этих реакций совершенно различна (рис. 30, А). В отличие от цитохрома c, комплекс с ТОКЛ разрушает гораздо меньшее количество трет-бутилгидропероксида, при этом реакция заканчивается за почти на порядок меньшее время. Возможное объяснение наблюдаемого явления схематично представлено на рис. 30, Б. Поскольку tBuOOH хорошо растворим в воде, при его добавлении к чистому цитохрому взаимодействие может происходить без стерических препятствий. Доступ к активному центру цитохрома c, окруженного «шубой» из гидрофобных молекул кардиолипина, затруднен, во-первых, самим наличием кардиолипина и, во-вторых, тем фактом, что поверхность молекулы цитохрома c в прото-липидном комплексе значительно изменяется и становится более гидрофобной. Рис. 30. А. Кривые ХЛ, полученные при добавлении 10 мМ tBuOOH к смеси 5 мкМ цитохрома c (черным цветом) или 5 мкМ комплекса цитохрома c с ТОКЛ (1:30) (серым) и 20 мкМ С-525 в 20 мМ ФБ рН 7,4. Объем ХЛ смеси 1000 мкл. Частота регистрации – 1 Гц. Б. Схематичное объяснение наблюдаемой формы ХЛ кривых. Пояснения в тексте. 97 Дальнейшее изучение реакции разложения липидных гидропероксидов различной природы цитохромом c будет подробно рассмотрено в следующих нескольких разделах. 4.1.2. Реакции взаимодействия цитохрома c и его комплекса с кардиолипином с анионными липидами и их гидропероксидами Описано два типа реакций между цитохромом с с анионными липидами: реакции разложения предсуществующих гидропероксидов липидов и реакции образования новых гидропероксидов липидов под действием АФК. В данной работе были последовательно изучены оба типа реакций. Первая часть была посвящена разложению гидропероксидов, вторая – пероксидазной реакции. Реакция 1. Разложение гидропероксидов липидов А. Образование липидных радикалов в реакции 1 Взаимодействие комплекса цитохрома c с ТОКЛ с гидропероксидом линолевой кислоты изучали методом ХЛ с использованием активатора кумарина С525, селективного перехватчика энергии радикалов липидов (рис. 31). При добавлении смеси комплекса цитохрома c с ТОКЛ и С-525 к раствору гидропероксида линолевой кислоты (ЛК-ООН) наблюдается короткая вспышка хемилюминесценции, свидетельствующая об образовании радикалов в системе: LOОН LO• LOH + L• LOO• При повторной добавке того же количества Цит-ТОКЛ новой вспышки не наблюдается, а при повторной добавке ЛК-OOH наблюдается новая впышка по форме и светосумме мало отличающаяся от первой: площади под кривыми, рассчитанные за 5 минут ХЛ, составили 6±1 В·с (n=2) и для первого, и для второго добавления ЛК-ООН. Это говорит о том, что в данной реакции ЛК-OOH полностью расходуется за 5 минут, а количество цитохрома остается прежним или меняется незначительно. 98 Аналогичные результаты были получены в отсутствие ТОКЛ. Рис. 31. Вид ХЛ кривых в системе 5 мкМ Цит-ТОКЛ 1:30, 5 мкМ ЛК-ООН и 20 мкМ C-525 в среде 20 мМ калий-фосфатного буферного раствора pH 7,4 (черная кривая). Момент введения смеси Цит-ТОКЛ и C-525 в ФБ через шприц к ЛК-ООН (в кювете) отмечен стрелкой. Частота регистрации 10 Гц. Добавка 5 мкМ ЦитТОКЛ 1:30 не приводила к повторной вспышке ХЛ (зеленая кривая). Добавка 5 мкМ ЛК-ООН приводила к аналогичной ХЛ вспышке (красная кривая). Б. Разрушение цитохрома c в реакции 1 Цитохром c и его комплекс с ТОКЛ характеризуются поглощением в видимой части спектра. К тому же, комплекс цитохрома c с ТОКЛ обладает флуоресценцией в УФ области, обусловленной белковой частью молекулы цитохрома. Для оценки этих спектральных характеристик цитохрома c и его комплекса с ТОКЛ реакцию стехиометрического разложения ЛК-ООН проводили в тех же условиях, но в отсутствие активатора ХЛ кумарина, поскольку он оказывает мешающее влияние: спектры поглощения компонентов исследуемых систем приведены на рис. 32. Концентрации всех компонентов, за исключением С-525 такие же, как и для ХЛ системы. Концентрция С-525 в ХЛ реакции составляла 20 мкМ (и 25 или 30 мкМ для последующих экспериментов), для приведенного на рис. 32 спектра – 6 мкМ. 99 Рис. 32. Спектры поглощения компонентов исследуемых систем относительно 20 мМ ФБ рН 7,4 с добавлением 4% метанола (состав растворителя в конечной смеси) в 1000 мкл. l=1,00 см. Цит c – 3,75 мкМ; Цит-ТОКЛ и Цит-БКЛ - 1:32, 3,75 мкМ; ТОКЛ и БКЛ - 120 мкМ; кумарин С525 – 6 мкМ. В реакции взаимодействия с ЛК-ООН гем цитохрома c, свободного (рис. 33, кривые 3 и 4) или в комплексе с ТОКЛ (рис. Р40, кривые 1 и 2) не подвергается значительным изменениям – как было оценено по поглощению в полосе Соре (рис. 33, А) после взаимодействия с 5 мкМ ЛК-ООН разрушению гема подверглось 0,2 мкМ цитохрома c (~ 4% от исходного количества) и 0,1 мкМ Цит c в комплексе с ТОКЛ (~ 2%). В то же время, флуоресценция комплекса цитохрома c с ТОКЛ в УФ области уменьшилось более, чем в два раза (рис. 33, Б), что свидетельствует о драматических изменениях, происходящих с белковой частью Цит c в реакции разложения гидропероксидов липидов. Аналогичные данные для свободного Цит c также приведены на рис. 33, Б, однако, флуоресценции цитохрома, не связанного в комплекс, не отличается от фонового значения как до, так и после добавления ЛКООН. 100 Рис. 33. (А) Спектры поглощения, (Б) спектры флуоресценции (λex 265 нм, Δλex/em 3 нм) и (В) кривые люминол-активированной ХЛ (50 мкМ люминол) в присутствие 10 мкМ Н2О2 (момент введения Цит-ТОКЛ в ФБ через шприц к смеси люминола и Н2О2 (в кювете) принят за 0 минут, частота регистрации 10 Гц): 1 – 5 мкМ ЦитТОКЛ 1:30; 2 - 5 мкМ -ТОКЛ 1:30 + 5 мкМ ЛК-ООН (спектры и ХЛ кривые регистрировали через 6 минут после смешивания); 3 – 5 мкМ Цит c; 4 - 5 мкМ Цит c + 5 мкМ ЛК-ООН (спектры и ХЛ кривые регистрировали через 6 минут после смешивания). Другой важной характеристикой комплекса Цит-ТОКЛ является его пероксидазная активность. Она была оценена по ХЛ реакции окисления люминола пероксидом водорода (рис. 33, В). Активность комплекса, вступившего в стехиометрическую реакцию с ЛК-ООН, была найдена на ~ 20% меньшей, по сравнению с исходным Цит-ТОКЛ. Таким образом, было показано, что Цит c и его комплекс с ТОКЛ разлагает гидропероксиды липидов с образованием радикалов липидов. Гем цитохрома c при этом не подвергается значительному разрушению, и Цит c способен разложить нестехиометрическое и заведомо большее количество гидропероксидов, что указывает на его каталитические свойства в данной реакции. В то время как 101 белковая часть молекулы и микроокружение гема, по-видимому, подвергаются в ходе реакции окислительным модификациям. В. Разложение других липогидропероксидов в реакции с цитохромом c Важным аспектом в изучении реакций разложения гидропероксидов липидов является установление роли природы самих липидов. Вопрос о том, описываются ли реакции разложения различных липидных гидропероксидов одими и теми же механизмами, или же они как-то отличаются друг от друга, до сих пор остается открытым. Метод ХЛ позволяет изучать кинетику и механизмы радикальных реакций. Ниже приведены ХЛ кривые для различных липидов: 5 мкМ ЛК-ООН, 1,5 мМ линолевой кислоты, частично окисленной при хранении, смеси 1,5 мМ линолевой кислоты и 150 мкМ ТОКЛ или 100 мкМ БКЛ, также частично окисленного при хранении (рис. 34). Рис. 34. Кумарин-активированная ХЛ в системах, состоящих из 5 мкМ Цит c, 25 мкМ С525 и различных липидов (указаны на рис.): 5 мкМ ЛК-ООН, 1,5 мМ линолевая кислота (частично окисленная при хранении), 1,5 мМ линолевая кислота и 150 мкМ ТОКЛ или 100 мкМ БКЛ. Реакции проводили в среде 20 мМ ФБ раствора pH 7,4. Смесь Цит c и С-525 в ФБ была введена через шприц к липидам (в случае смеси ЛК/ТОКЛ ТОКЛ был добавлен к Цит c и С-525) – момент смешения реагентов соответствует началу ХЛ вспышки. Частота регистрации - 50 Гц. В отсутствие референтного метода, интенсивность хемилюминесценции не может быть сопоставлена между экспериментами напрямую по ряду причин. Во102 первых, количество добавленных в систему гидропероксидов известно только для чистого ЛК-ООН и различно для приведенных экспериментов: возможно провести сравнение только для ЛК и ЛК/ТОКЛ, поскольку в обоих случаях источником гидропероксидов служит ЛКокисл. Во-вторых, неизвестно влияние стерических затруднений для различных липидов: доступ гидропероксидов к активному центру цитохрома может оказаться различным. Наконец, выход ХЛ определяется выходом реакции перехвата энергии активатором кумарином, который также, вероятно, зависит от природы анионного липида. Дальнейшее изучение кинетических данным методом математического моделирования могло бы выявить полную схему протекаемых в системе реакций. Тем не менее, для качественной оценки может быть использована сама форма кинетических кривых, схожая для всех приведенных АЛ. Очевидно, такие ХЛ кривые могут быть описаны набором одних и тех же элементарных реакций, отличающихся константами скоростей и их соотношением. Полученные данных свидетельствуют о схожих механизмах реакций разложения гидропероксидов липидов различной природы. Аналогично, была изучена реакция разложения ЛК-ООН, БКЛ или их смеси (рис. 35, первая вспышка ХЛ). Для всех трех случаев форма ХЛ кривой, а также площади под кривой, посчитанные за первые 2,5 минуты (4,4±1,4 В·с для ЛК-ООН, 2,7±0,3 В·с для БКЛ и 3,3±1,6 В·с для их смеси, n = 2) статистически не отличались друг от друга. Дальнейшее добавление Н2О2 приводило к новой вспышке ХЛ, возникающей в результате пероксидазной реакции, которая будет подробно описана в следующем разделе. 103 Рис. 35. Кумарин-активированная ХЛ в системе 5 мкМ Цит c, 25 мкМ С525 и 150 мкМ БКЛ (первая вспышка, черная кривая), 5 мкМ ЛК-ООН (первая вспышка, красная кривая) или смеси 5 мкМ ЛК-ООН и 150 мкМ БКЛ (первая вспышка, синяя кривая). Смесь Цит c и С-525 в ФБ была введена через шприц к липидам (БКЛ/ЛКООН/их смесь в кювете) через 0,5 мин. после начала регистрации. Через ~ 10 минут реакционная смесь была введена через шприц к 100 мкМ Н2О2 (в кювете) – вторая вспышка ХЛ. Через ~ 5 минут к реакционной смеси было добавлено еще 100 мкМ Н2О2 (с открытием прибора и частичной остановкой регистрации ХЛ) – третья вспышка ХЛ. Реакции проводили в среде 20 мМ ФБ раствора pH 7,4. Частота регистрации - 10 Гц. Объем ХЛ смеси после первой ХЛ вспышки составил 1000 мкл. Н2О2 вводили порциями по 100 мкл (объем после двух добавок – 1200 мкл). Реакция 2. Пероксидация липидов Цитохром c способен разлагать гидропероксиды липидов как в свободном, так и в связанном в комплекс с АЛ виде. Однако только комплекс цитохрома c с АЛ может продуцировать новые гидропероксиды, окисляя липиды АФК: 104 H2O2 + LH LHox, Эта реакция, классически названная пероксидазной, также была изучена в данной работе. После разложения гиропероксидов липидов: ЛК-ООН, БКЛ или их смеси (рис. 35, первая вспышка ХЛ) под действием цитохрома c, в систему вводили достаточно большое количество Н2О2 (20-кратный избыток по отношению к Цит c), что приводило к пероксидазной реакции, сопровождающейся новой вспышкой ХЛ (рис. 35). Для системы с БКЛ было показано, что в отсутствие любого из компонентов системы, а также при замене БКЛ на неокисляемый ТОКЛ, хемилюминесценция не наблюдается (рис. 36). Рис. 36. Кумарин-активированная ХЛ в системе, состоящей из цитохрома c, кардиолипина (БКЛ или ТОКЛ) и Н2О2. За 0 минут принят момент добавления цитохрома c (3,75 мкМ) к смеси 30 мкМ кумарина С-525 и 120 мкМ кардиолипина (комплекс 1:32). Момент добавления 120 мкМ Н2О2 указан стрелкой. Реакции проводили в среде 20 мМ ФБ раствора pH 7,4. Частота регистрации – 1 Гц. На врезке представлены начальные участки ХЛ кривых. Очевидно, что хемилюминесценция была вызвана образованием новых радикалов липидов в результате добавления пероксида водорода. Эта реакция 105 может происходить как по гомо-, так и по гетеролитическому механизму, с образованием промежуточных соединений 1 и 2 согласно реакциям [150]: HOOH + Tir-◊-Fe3+ (Цит c) → HO• + ОН- + Tir•-◊-Fe3+ (compound 2), HO• + ОН- + Tir•-◊-Fe3+ → Н2O + Tir•-◊-Fe4+=O (compound 1), Tir•-◊-Fe4+=O + LH → L• + H+ + Tir•-◊-Fe3+, Tir•-◊-Fe3+ + LH → L• + H+ + Tir-◊-Fe3+. В присутствие кислорода, радикалы липидов L • переходят в радикалы LOO•, которые инициируют реакции цепного окисления по схеме [161]: L• + O2 → LOO• → … Согласно приведенным выше реакциям, молекула цитохрома c участвует в пероксидазном цикле как катализатор, что позволяет одному эквиваленту цитохрома продуцировать большое количество липидных радикалов. Тем не менее, сравнение перовой и второй ХЛ вспышек на рис. 35 – реакций разложения гидропероксида и липо-пероксидации под действием Н2О2 – показывает, что даже в присутствие большого избытка пероксида водорода, количество образованных радикалов мало по сравнению с количеством радикалов, образованных в реакции разложения гидропероксида липида. Повторное добавление 100 мкМ Н2О2 также приводит к появлению сравнительно небольшой вспышке ХЛ (третья вспышка на рис. 35), отличающейся от предыдущей затухающей формой, что свидетельствует о том, что какой-то из компонентов системы был израсходован. Фотометрический и флуоресцентный анализ показали, что цитохром c в комплексе как с ТОКЛ, так и с БКЛ, практически полностью разрушается под действием избытка Н2О2 (рис. 37 и 38). В отсутствие кардиолипина, Цит c не подвергается разрушению под действием того же количества Н2О2, что и в экспериментах с кардиолипином (согласно спектрам поглощения; спектры испускания свободного цитохрома c не измеряли, поскольку он не обладает собственной флуоресценцией). Важно также отметить, что в случае с БКЛ, частично окисленным и содержащим гидропероксиды липида, за пять минут 106 взаимодействия с цитохромом c не наблюдалось изменений ни спектров поглощения, ни флуоресценции, в отличие от случая с чистым гидропероксидом ЛК (рис. 33). Рис. 37. Спектры поглощения и зависимость поглощения в полосе Соре от времени после добавления 120 мкМ пероксида водорода к 5 мкМ цитохрому c (1) и его комплексам с ТОКЛ (2) или БКЛ (3) в соотношении 1:32. Спектры, показанные красной пунктирной линией, соответствуют исходному спектру Цит c. К этому раствору добавляли ТОКЛ, БКЛ или эквивалентный объем метанола и регистрировали спектры поглощения в течение 5 минут, после чего добавляли Н2О2. К раствору цитохрома с в ФБ добавляли метанол, ТОКЛ или БКЛ и регистрировали спектры поглощения. Реакции проводили в среде 20 мМ ФБ раствора pH 7,4. 107 Рис. 38. Спектры флуоресценции (λex 265 нм, Δλex/em 3 нм) 5 мкМ комплекса цитохрома c с ТОКЛ или БКЛ в соотношении 1:32 при добавлении 120 мкМ Н 2О2. Спектры испускания регистрировали каждую минуту. Реакции проводили в среде 20 мМ ФБ раствора pH 7,4. Сравнение данных хемилюминесцентного, фотометрического и флуоресцентного анализа позволяет предположить протекание побочной реакции разрушения самого цитохрома c, вероятно, под действием образующихся радикалов: R• + Tir-◊-Fe3+ → (разрушение цитохрома c) Эта реакция, по-видимому, протекает наравне или с большим выходом, чем пероксидация липидов, в результате чего цитохром c эффективно разрушается в ходе пероксидазной реакции и, таким образом, наврядли может быть назван истинным катализатором, в отличие от реакции разложения гидропероксидов липидов. Общая схема обеих реакций цитохрома с с анионными липидами, изученных и описанных в данной работе, представлена на рис. 39. Реакции 1 и 2 – каталитическое восстановление гидропероксидов липидов с образованием радикалов LO•. Реакции 3-4-5-6 описывают двухэлектронный пероксидазный цикл, а реакции 3 и 6 – одноэлектронный цикл пероксидации липидов, в результате 108 протекания обоих циклов образуются радикалы липидов, приводящие к формированию новых гидропероксидов липидов, разрушающихся согласно реакциям 1 и 2. Все описанные реакции, рассматриваемые как взаимосвязанные в одном цикле, приводят в конечном счете к цепной реакции пероксидации липидов биологических мембран под действием цитохрома с и его комплекса с анионными липидами. Роль этого процесса в апоптозе будет рассмотрена в последней главе данной диссертационной работы. Рис. 39. Схема химических реакций взаимодействия цитохрома с с анионными липидами. LH – липид, LOOH – гидропероксид липида, HOOH – пероксид водорода, Tir – тирозин, ◊ - порфириновая часть цитохрома c, ferro-/ferricyt C – окисленная и восстановленная формы цитохрома c, соответственно, comp 1 и 2 – промежуточные продукты окисления ферро-цитохрома (соединение 2 – одноэлектронного, 1 – двухэлектронного). Пояснения к схеме в тексте. 109 4.1.3. Хемилюминесцентные методики определения гидропероксидов липидов Родамин-активированная хемилюминесценция в реакции восстановления гидропероксидов липидов FeSO4 В работе [188] была проведено сравнение хемилюминесценции липопротеинов крови в присутсвие ионов двухвалентного железа Fe2+ и активированной эозином, люминолом или родамином 6ж, а также показана прямая зависимость хемилюминесцентного сигнала от концентрации липопротеинов. В данной работе была изучена родамин-активированная хемилюминесцентная реакция окисления Fe2+ гидропероксидами линолевой кислоты в качестве модельного вещества. Важно отметить, что подобный подход с использованием более простого объекта позволяет лучше понять физико-химические основы протекающих в системе реакций. В то же время, как и в предыдущих разделах данной работы, в качестве объекта исследования была взята линолевая кислота, частично окисленная кислородом воздуха и содержащая гидропероксиды. В силу быстрой кинетики изучаемой реакции, компоненты ХЛ системы смешивали с использованием способа введения пробы через шприц с непрерывной регистрацией спектров ХЛ и без потери ХЛ данных. На основании данных, полученных при разных частотах регистрации хемилюминесценции, для дальнейших экспериментов была выбрана частота 10 Гц. ХЛ кривые, полученные с частотой 1 Гц, содержат недостаточное, а с частотой 50 Гц – избыточное число точек (рис. 40). 110 Рис. 40. Кривые ХЛ, полученные при различных частотах регистрации (1, 10 и 50 Гц) введением через шприц 1 мМ FeSO4 и 20 мкМ родамина 6ж в 20 мМ ФБ рН 7,4 к 1 мМ линолевой кислоте в конечном объеме 1000 мкл. Момент смешения компонентов ХЛ смеси соответствует началу ХЛ вспышки. Далее было изучено влияние концентрации каждого из компонентов ХЛ смеси на кинетику и вид хемилюминесцентных кривых. Увеличение концентрации линолевой кислоты (рис. 41) и родамина 6ж (рис. 42) приводило к увеличению максимума интенсивности наблюдаемой быстрой вспышки ХЛ, при этом сама форма ХЛ кривых не менялась. Полученные данные подтверждают природу свечения, связанную с количественным разложением гидропероксидов линолевой кислоты, а также механизм физической активации хемилюминесценции родамином 6ж. Рис. 41. Кривые ХЛ, полученные введением через шприц 1 мМ FeSO4 и 20 мкМ родамина 6ж в 20 мМ ФБ рН 7,4 к различным количествам линолевой кислоты (1 – 0 мМ (50 мкл метанола); 2 – 1 мМ; 3 – 2 мМ; 4 – 3 мМ; 5 – 4 мМ; 6 – 5 мМ) в конечном объеме 1000 мкл. Частота регистрации – 10 Гц. Момент смешения компонентов ХЛ смеси соответствует началу ХЛ вспышки. 111 Рис. 42. Кривые хемилюминесценции, полученные введением через шприц различных количеств родамина 6ж (1 – 10 мкМ, 2 – 20 мкМ, 3 – 40 мкМ, 4 – 80 мкМ) и 1 мМ FeSO4 в 20 мМ ФБ рН 7,4 к 1 мМ линолевой кислоте в конечном объеме 1000 мкл. Частота регистрации – 10 Гц. Момент смешения компонентов ХЛ смеси соответствует началу ХЛ вспышки. Ширина пика (в сек.) на половине высоты показана для каждного пика. Увеличение концентрации железа в пределах одного порядка величины (0,5 – 5 мМ), напротив, приводило к уменьшению хемилюминесцентной вспышки, при этом ширина пика, посчитанная на половине высоты, также уменьшилась почти в 4 раза (рис. 43). Рис. 43. Кривые хемилюминесценции, полученные введением через шприц 20 мкМ родамина 6ж и различных количеств FeSO4 (1 – 0,5 мМ, 2 – 1 мМ, 3 – 2,5 мМ, 4 – 5 мМ) в 20 мМ ФБ рН 7,4 к 1 мМ линолевой кислоте в конечном объеме 1000 мкл. Частота регистрации – 10 Гц. Момент смешения компонентов ХЛ смеси соответствует началу ХЛ вспышки. Ширина пика (в сек.) на половине высоты показана для каждого пика. 112 Полученные данные согласуются с кинетическими данными, полученными для кумарин-активированной хемилюминесценции реакции восстановления гидропероксидов липидов Fe2+, для которой наблюдали двухфазную кинетику – быструю и медленную вспышку [196]. В данном случае, по-видимому, две вспышки не удалось разрешить. Рис. 44. Кривые хемилюминесценции, полученные введением через шприц 20 мкМ родамина 6ж и различных количеств FeSO4 (1 – 1 мМ, 2 – 2,5 мМ, 3 –5 мМ, 4 – 10 мМ, 5 – 15 мМ) в 20 мМ ФБ рН 7,4 к 50 мкл сыворотки крови в конечном объеме 1000 мкл. Частота регистрации – 10 Гц. Момент смешения компонентов ХЛ смеси соответствует началу ХЛ вспышки. Наконец, аналогичная форма ХЛ кривых и влияние концентрации Fe2+ были получены и для сыворотки крови человека. В отличие от работы [188], липопротеины не выделяли и использовали сыворотку крови без предварительной пробоподготовки. Эти данные представлены на рис. 44. Увеличение концентрации ионов Fe2+ приводило к уширению кинетических ХЛ кривых и исчезновению быстрой вспышки. Поскольку форма ХЛ кривых совпала с полученной в работе [188] для липопротеинов, оценить, необходимо ли выделять ЛНП из образца для ХЛ анализа или сыворотку можно анализировать напрямую, представляло практический интерес. Возможной причиной ошибок, вносимых при использовании сыворотки крови может стать сложность и многокомпонентность сыворотки как объекта, и, как следствие, присутствие мешающих компонентов. 113 Рис. 45. Влияние прединкубации сыворотки/плазмы крови с родамином 6ж на хемилюминесценцию в системе: 1 – сыворотка и родамин 6ж были смешаны непосредственно в ХЛ эксперименте; 2 - сыворотка и родамин 6ж были смешаны за 5 минут до ХЛ эксперимента; 3 – плазма и родамин 6ж были смешаны непосредственно в ХЛ эксперименте; 4 - плазма и родамин 6ж были смешаны за 3 минуты до ХЛ эксперимента. Рабочие концентрации: 80 мкМ родамин 6ж, 1 мМ FeSO4 и 50 мкл сыворотка или плазма крови в 20 мМ ФБ рН 7,4 в конечном объеме 1000 мкл. Частота регистрации – 10 Гц. Момент смешения компонентов ХЛ смеси соответствует 0 минутам. Действительно, сравнение ХЛ кривых, полученных с предварительной инкубацией сыворотки или плазмы крови с родамином 6ж и без инкубации (смешение в момент эксперимента), показало, что при предварительном взаимодействии сыворотки с родамином 6ж форма ХЛ кривых меняется и интенсивность ХЛ в каждый момент времени падает (рис. 45, кривые 1 и 2 и 3 и 4, соответственно). Вероятно, наблюдаемое явление связано со связыванием родамина с компонентами (белками) объекта. Таким образом, использование описанной методики определения гидропероксидов липидов без предварительного выделения фракции липопротеинов не представляется возможным. Разработка методики определения гидропероксидов липидов на основе ХЛ реакции их восстановления микропероксидазой в присутствие изолюминола Добавление смеси изолюминола с микропероксидазой к раствору, содержащему небольшие количества гидропероксидов липидов, приводит к 114 возникновению вспышки ХЛ, интенсивность которой зависит от концентрации гидропероксидов, согласно схеме реакций, прведенной в работе [197] и описанной выше в обзоре литературы. Данная реакция была положена в основу некоторых хемилюминесцентных методик определения гидропероксидов липидов [165, 198], однако ранее применялась для проточных методов в хроматографической детекции и не была адаптирована для стационарных условий. К тому же, в различных вариантах методики использовали различные стандарты - трет- бутилгидропероксид или гидропероксиды различных липидов, что затрудняет сравнение полученных данных. Оптимизация условий хемилюминесцентных реакций Значение рН буферного раствора и концентрации реагентов (микропероксидазы-11 и изолюминола) подбирали с использованием ХЛ системы на основе трет-бутилгидропероксида с концентрацией 200 нМ таким образом, чтобы сигнал был максимальным, расход реагентов как можно меньшим, при этом микропероксидаза и изолюминол оставались в необходимом избытке по отношению к предполагаемому содержанию гидропероксидов. Исследуемая ХЛ система крайне чувствительна к pH реакционной среды. Данные, полученные при проведении реакции с использованием 2 мкМ изолюминола и 200 нМ микропероксидазы, представлены на рис. 46, А. Наблюдаемый эффект усиления хемилюминесцентоного сигнала с ростом pH, повидимому, связан с увеличением квантового выхода изолюминола, переходящего в щелочной среде в более активную депротонированную форму. Для дальнейших исследований использовали боратный буферный раствор с pH 10.0. При увеличении концентрации изолюминола до 2 мкМ происходит рост площади под кривой ХЛ, в то время как при концентрациях более 2 мкМ происходит уменьшение хемилюминесцентного сигнала при увеличении концентрации изолюминола (рис. 46, Б). Данный эффект, вероятно, связан с концентрационным тушением. Концентрация 115 микропероксидазы влияет на хемилюминесценцию в системе аналогичным образом. Максимум аналитического сигнала достигается при 200 нМ, дальнейшее увеличение концентрации микропероксидазы не приводит к росту ХЛ сигнала (рис. 46, Б). Рис. 46. Зависимости площади под кривой ХЛ от (А) pH буферного раствора (фосфатный для pH<9 или боратный буферный раствор pH 10.0; ХЛ-реагент содержал 200 нМ 1 MP-11 и 2 мкМ изолюминол) и (Б) концентраций изолюминола (черные треугольники) или микропероксидазы (белые ромбы). Концентрация трет-бутилгидропероксида 200 нМ. Общий объем ХЛ смеси 1000 мкл. Стандартные отклонения даны для 2 параллельных измерений. Два стандарта для определения гидропероксидов липидов Для определения суммарного содержания гидропероксидов липидов в биологических объектах было предложено использовать два различных стандарта: трет-бутилгидропероксид и гидропероксид линолевой кислоты. ХЛ кривые, полученные для различных концентраций двух этих стандартов, а также для выделенных из крови пациента, больного липопротеинов низкой плотности, представлены на рис. 47. 116 атеросклерозом, Рис. 47. Типичный вид ХЛ кривых в системе, состоящей из 200 нМ MP-11, 2 мкМ изолюминола и различных количеств гидропероксидов: (А) третбутилгидропероксида (1 – 25 нМ, 2 – 50 нМ и 3 – 100 нМ) и (Б) гидропероксида линолевой кислоты (1 – 75 нМ, 2 – 100 нМ и 3 – 200 нМ) в среде боратного буферного раствора pH 10.0. (В) Типичный вид кривых хемилюминесценции ЛНП, выделенных из сыворотки крови в присутствие 200 нМ MP-11 и 2 мкМ изолюминола в среде боратного буферного раствора pH 10.0. Общий объем ХЛ смеси 1000 мкл. Видно, что реакция с гидропероксидом линолевой кислоты протекает почти на порядок быстрее. Важно отметить тот факт, что за исследуемый период времени (5 минут) реакция восстановления ЛК-ООН полностью заканчивается, что следует из уменьшения ХЛ сигнала до фонового значения. В случае с tBuOOH, ХЛ реакция продолжается значительно дольше (рис. 47, А и Б). Стоит также отметить, что форма ХЛ кривых в случае с ЛК-ООН совпадает с формой кривых, полученных для биологических объектов (рис. 47, В). Вышесказанное позволяет заключить, что гидропероксид линолевой кислоты представляет собой лучший стандарт для определения гидропероксидов липидов по сравнению с трет-бутилгидропероксидом, в то же время, последний значительно выигрывает по химической устойчивости, доступности, а также по своей стоимости. 117 Калибровочные зависимости для обоих стандартов линейны в исследуемом концентрационном диапазоне и представлены на рис. 48. Рис. 48. Градуировчные зависимости площади под кривой ХЛ от концентрации (А) трет-бутилгидропероксида и (Б) гидропероксида линолевой кислоты. Стандартные отклонения даны для 3 параллельных измерений. Метрологические характеристики, рассчитанные для обоих стандартов: tBuOOH: y = (0,68±0,07)·c(нМ) (P=0,99; n=10), r=0,99. Предел обнаружения 13 нМ. ЛК-ООН: y = (0,45±0,05)·c(нМ) (P=0,99; n=12), r =0,99. Предел обнаружения 16 нМ. Определение гидропероксидов липидов в липопротеинах низкой плотности крови Были исследованы образцы сыворотки крови 10 пациентов с ранней стадией атеросклероза. Фракцию липопротеинов низкой плотности выделяли согласно методике, описанной в работе [189]. Процедура выделения схематично показана на рис. 4, А. Определяли количество гидропероксидных групп методом градуировочного графика по tBuOOH или ЛК-ООН. Результаты исследования приведены в таблице 5. 118 В единицах tBuOOH, В единицах ЛК-OOH, мкмоль/мл сыворотки крови мкмоль/мл сыворотки крови № 1 0,9±0,1 0,6±0,1 2 0,5±0,1 0,3±0,1 3 1,7±0,1 1,1±0,1 4 1,2±0,1 0,8±0,1 5 1,4±0,1 0,9±0,1 6 2,6±0,2 1,7±0,1 7 1,7±0,5 1,1±0,3 8 2,4±0,3 1,6±0,2 9 2,8±0,5 1,9±0,3 10 1,5±0,1 1,0±0,1 Среднее значение: 1,7±0,8 1,1±0,5 Таблица 5. Определение гидропероксидов липидов в липопротеинах низкой плотности крови пациентов, больных атеросклерозом, с использованием двух стандартных соединений: трет-бутилгидропероксида и гидропероксида линолевой кислоты. Стандартные отклонения приведены для 3 измерений. Рассчитанные значения хорошо коррелируют с содержанием гидропероксидов ЛНП пациентов, больных атеросклерозом, представленным в работе [167]. 4.2. Комплекс цитохрома c с кардиолипином в гидрофобном окружении Подходы, примененные в первом разделе диссертации, позволили изучить основы молекулярных механизмов реакций, однако используемая модель наносфер комплекса в принципиально водной среде отличное от имеет ряд недостатков, в первую клеточного конформационное очередь, состояние как цитохрома c, так и липидов. Поэтому на следующем этапе работы были предприняты попытки разработать новую модель, позволяющую глубже понять механизмы реакций в среде, близкой к биологической. 119 4.2.1. Получение комплекса цитохрома c с кардиолипином в среде гидрофобного растворителя Ранее наши многократные попытки перевести комплекс цитохрома с с кардиолипином, выпавший в осадок из водного раствора, в малополярные органические растворители, такие как н-гептан или хлороформ, не увенчались успехом. По-видимому, гидрофобные взаимодействия между сложившимися в кристаллоподобную структуру наносферами (или нанотрубками), имеющими гидрофобную поверхность, настолько велики, а удалить полностью остатки воды из осадка настолько трудно, что растворитель не в состоянии оторвать друг от друга наносферы в составе твердой фазы. Чтобы это произошло, к растворителю надо добавить более полярный растворитель, такой как метанол. Это хорошо видно на рис. 49, где приведены спектры поглощения растворов комплекса цитохрома с с ТОКЛ в гексане, полученные, как описано выше, при разном содержании метанола в смеси перед добавлением хлороформа. Рис. 49. Спектры поглощения комплекса цитохрома c с ТОКЛ в гексане: 1 – при экстракции хлороформом из раствора цитохрома с в смеси вода-метанол 10:11, 2 – из раствора в смеси вода-метанол 10:1. Видно, что при более высоком содержании метанола в водно-метанольной смеси комплекс цитохрома с с кардиолипином переходит в хлороформ, а затем – в 120 гексан значительно активнее (рис. 49, 1), чем при низком содержании метанола (рис. 49, 2). Если смесь цитохрома с с кардиолипином была растворена в растворителе с отношением вода/метанол 9:1, количество комплекса, переведенного в гексан, составляло 0,6 нм, а если отношение было 9:11, оно составляло уже 3,2 нмоль (из 20 нмоль цитохрома с в исходной смеси). Переход комплекса цитохрома с с кардиолипином из водно-метанольной фазы в хлороформ, как показали наши опыты, не зависит от того, добавляли ли мы основное количество метанола перед добавлением хлороформа или же в смеси с хлороформом. В последнем случае процедура перевода комплекса цитохрома с с кардиолипином из водно-буферного раствора в хлороформ весьма напоминает метод выделения липидов по Фолчу, по которому к ткани добавляют 20-кратный избыток смеси хлороформа с метанолом 2:1 [191]. В наших опытах соотношение хлороформ/метанол/вода составляло 100:54:50. Согласно Фолчу, при соотношении 100:50:37 (что близко к нашему) верхняя фаза состояла в основном из смеси воды и метанола (8:48:47), а нижняя – из хлороформа с небольшим количеством метанола и воды (86:14:1). Большинство липидов в такой системе переходят в хлороформ, а в системе, содержащей комплекс цитохрома с с кардиолипином в хлороформ переходят покрытые углеводородной оболочкой шарики, спрятавшие внутри себя цитохром с. Как уже говорилось, в отсутствие кардиолипина цитохром с в хлороформ не переходит ни в отсутствии метанола, ни при его 50% содержании в водном растворе. Как видно на рис. 50, при отношении кардиолипина к цитохрому в исходной смеси 10:1 и даже 15:1 цитохром c переходит в хлороформ в незначительном количестве (всего 1 и 4% от всего цитохрома в системе), тогда как при соотношении липид/белок 20:1 и 30:1 доля гемопротеина, перешедшего в хлороформ, существенно возрастает (по данным спектрофотометрии, до 24 и 37%, соответственно). 121 Рис. 50. Спектры поглощения комплекса цитохрома c с ТОКЛ, экстрагированного в хлороформ, при различных молярных отношениях кардиолипин/цитохром c: 1 – 30:1, 2 – 20:1, 3 – 15:1, 4 – 10:1 и 5 – 0:1. Экстракция производилась путем добавления равного количества хлороформа к водно-метанольной смеси (10:11 по объему) 20 мкМ цитохрома c и кардиолипина в соответствующей концентрации. То обстоятельство, что в хлороформ во всех приведенных случаях переходила лишь меньшая часть цитохрома, растворенного в водно-метанольной фазе, связано с тем, что он находился в избытке по сравнению с кардиолипином (то есть в соотношении белок:липид большем, чем конечное соотношение Цит:ТОКЛ в хлороформе). В стехиометрический таких условиях комплекс в Цит-КЛ, водном состав растворе которого при формируется постепенном добавлении кардиолипина остается постоянным [176]. С учетом того, что при добавлении реактива Фолча в фазу хлороформметанол переходят все фосфолипиды из исходного водного раствора, очевидно, что разделив количество добавленного кардиолипина на количество цитохрома, перешедшего в хлороформ, мы получим молярное отношение липид:белок в комплекса цитохрома с с кардиолипином, который перешел в гидрофобную фазу. При добавлении достаточного количества кардиолипина (соотношение ТОКЛ:Цит в водно-метанольной среде 20:1 и более) это отношение было найдено равным 77±11, что равно или незначительно превышает значения, которые были получены 122 нами для комплексов в осадке из водно-буферных растворов [195]. Таким образом, комплексы Цит-КЛ могут быть экстрагированы раствором Фолча и переведены в хлороформ, а затем – и в гексан. Эффект добавления метанола на конформационное состояние цитохрома с оценивали по его поглощению в концентрированном растворе в длинноволновой области спектра (695-700 нм) в водно-метанольных смесях с различным содержанием метанола. Полученные спектры представлены на рис. 51. Видно, что изменение конформации полипептидной цепи происходит при введении 40% метанола и более (спектры не показаны), что согласуется с эмпирически найденными условиями получения комплекса в хлороформ-метанольной смеси, описанными в данном разделе. Рис. 51. Спектры поглощения 50 мкМ цитохрома c в водно-метанольной смеси с содержанием метанола (по объему): 1 – 0%, 2 – 10%, 3 – 20%, 4 – 30% и 5 – 40%. Экстракция производилась путем добавления равного количества хлороформа к водно-метанольной смеси (10:11 по объему) 20 мкМ цитохрома c и кардиолипина в соответствующей концентрации. Получение комплекса Цит-КЛ в виде раствора в неполярной среде дает новые возможности в исследованиях строения этого комплекса и механизма его участия в липидной пероксидации в мембранах митохондрий. 123 4.2.2. Активность комплекса цитохрома c с кардиолипином в липидном монослое Известно, что цитохром c меняет свою конформацию в завистмости от микроокружения. Предыдущая часть данной работы была посвящена изучению его функций в водных или гидрофобных органических растровах. В данном разделе приведены результаты исследования его пероксидазной активности в монослое ТОКЛ на границе раздела вода-воздух. Липидный монослой представляет собой модель митохондриальной мембраны, точнее, ее половины. Мембрана митохондрии содержит около 30% кардиолипина и 65% фосфатидилхолина (проценты даны относительно общего содержания липидов). ФХ таким образом представляет собой основной компонент мембраны, однако не играет роли в активации пероксидазной функции цитохрома c, в отличие от кардиолипина. Поэтому образование монослоя из чистого кардиолипина на первом этапе исследования можно считать адекватной моделью. Монослои формировали в ванных Ленгмюра, на базе института кристаллографии РАН. Липиды на поверхности фосфатного буферного раствора сжимали до максимального давления, контролируя образование монослоя премещением барьера до достижения максимального поверхностного давления. После формирования монослоя кардиолипина, в среду под монослоем вводили раствор цитохрома c. Далее, после встраивания белка в монослой кардиолипина, отбирали пробу для ХЛ анализа пероксидазной активности встроенного в монослой цитохрома c (рис. 52, кривая 2). В контрольном эксперименте отбирали раствор цитохрома c без монослоя (рис. 52, кривая 1). Для определения максимальной пероксидазной активности для цитохрома c, до ХЛ анализа к пробе добавляли избыток ТОКЛ, что приводило к формированию наносфер с цитохромом c в максимально активной конформации – рис. 52, кривые 3 и 4. 124 Рис. 52. ХЛ кривые, полученные в реакции окисления люминола пероксидом водорода в присутствие комплекса цитохрома c с ТОКЛ: 1 - Цит c без монослоя ТОКЛ (контроль), 2 – Цит c в монослое ТОКЛ, 3 - контроль после добавления к нему избытка ТОКЛ (максимальная активность), 4 - Цит c в монослое ТОКЛ после добавления к нему избытка ТОКЛ (максимальная активность). За 0 минут принят момент добавления Н2О2 к смеси люминола и анализируемого образца цитохрома c. Для получения кривых 3 и 4 ТОКЛ добавляли непосредственно перед добавлением Н2О2. Приведенные выше кривых ХЛ были получены в реакции окисления люминола пероксидом водорода в присутствие пробы – цитохрома c и его комплекса с ТОКЛ. Данная методика была разработана в лаборатории медицинской биофизики МГУ ранее и применялась для водных растворов. В качестве аналитического сигнала для оценки пероксидазной активности рассчитывали площадь под ХЛ кривой за 5 минут ХЛ реакции. Для сравнения данных, пероксидазная активность цитохрома c, встроенного в монослой, после добавления к нему избытка ТОКЛ, была принята за 100%. Данные приведены в таблице 6. 125 № 1 2 3 4 Образец Цит c без монослоя ТОКЛ (контроль) Цит c в монослое ТОКЛ Цит c без монослоя ТОКЛ: максимальная активность Цит c в монослое: максимальная активность Площадь под ХЛ Пероксидазная кривой, В активность, % 1,9±0,3 10±2 5,1±0,6 27±3 14,7±3,8 79±21 18,6±0,2 100 Таблица 6. Данные ХЛ анализа пероксидазной активности цитохрома c в монослое ТОКЛ на основе реакции окисления люминола пероксидом водорода в присутствие комплекса. Нумерация образцов соответствует рис. 52. Стандартные отклонения приведены для 2 измерений. Полученные данные показали принципиальную возможность определения пероксидазной активности цитохрома c в монослое липидов. Тем не менее, значения полученных сиглалов ХЛ незначительно превосходят фоновые значения, и необходимо проводить оптимизацию методики в дальнейшем. Согласно полученным данным, пероксидазная активность цитохрома c, встроенного в монослой кардиолипина, составляет 27% от максимального значения. 4.2.3. Разработка модели клетки на основе липидного бислоя для изучения мембранно-ассоциированных процессов Наиболее адекватной моделью липидной мембраны принято считать липидный бислой. Недавние исследования взаимодействия цитохрома c с кардиолипином гигантских однослойных липосом [181, 182] показали высокий потенциал перспективность и этого направления. Тем не менее, использование липосом в качестве модельной мембраны имеет ряд ограничений, связанных, в 126 первую очередь, с динамикой их поведения в растворе, а также с невысокими концентрационными пределами. В данной работе была предложена альтернативная модель липидного бислоя, нанесенного на подложку из биополиэлектролитных мультислоев, состоящих из гиалуроновой кислоты (HA, -) и поли-L-лизина (PLL, +). Оба полимера представляют собой компоненты внеклеточного матрикса, что позволяет рассматривать разработанную систему как модель клетки. HA/PLL полимерная пленка была получена методом послойной адсорбции. Пленка, нанесенная на плоскую поверхность покровного стекла и состоящая из 24 бислоев (пар HA/PLL) имеет толщину порядка 1-2 мкм и характеризуется высоким содержанием воды (порядка 80% от объема) [199]. Внутренняя структура мультислоев была изучена ранее в работах [200, 201]. Известно, что гиалуроновая кислота образует жесткий каркас, в то время как полилизин Важно также отметить, что такие полимерные пленки аккумулируют биомолекулы различной природы (АТФ, ДНК, белки и пр.), что позволяет достигнуть высоких концентраций. Предложенная модель клетки схематично представлена на рис. 53. Липидный бислой образован из липосом, двумя основными компонентами которых были цвиттерионный фосфатидилхолин (ФХ) и анионный липид фосфатидилглицерол (ФГ). Структурно молекула ФГ представляет собой половину молекулы кардиолипина. Липосомы диаметром около 100 нм (как было показано методом динамического светорассеяния) липидом NBD-фосфатидилэтаноламином. были Их помечены адсорбцию флуоресцентным на поверхность планарных HA/PLL мультислоев наблюдали методом конфокальной микроскопии. 127 Рис. 53. Модель клеточной мембраны (липидный бислой), на границе раздела между водным раствором (цитозоль, голубым цветом) и биополимерными мультислоями (внеклеточный матрикс, HA/PLL). Масштаб не соблюден. Пояснения в тексте. На первом этапе исследования необходимо было подобрать условия формирования гомогенной бислойной липидной структуры на поверхности полимеров. Было показано, что характер взаимодействия анионных липосом с мультислоями определяется допированием поверхности полимерной пленки полиL-лизином (рис. 54, А и Б). Для создания пленки использовали два вида поли-Lлизина, отличающихся по молекулярной массе: порядка 28 или 280 кДа. PLL 28 отличается от PLL280 на несколько порядков большим коэффициентом диффузии (в силу меньшей длины цепи) и, следовательно, быстрее диффундирует к поверхности мультислоев или даже выходит за пределы пленки. Избыточное количество PLL28 приводит к его агрегации с анионными липосомами на поверхности пленки (рис. 54, А). Замена поли-L-лизина на PLL280 приводит к формированию гомогенной структуры мультислоев (рис. 54, Б). 128 липидного слоя на поверхности Рис. 53. Изучение морфологии липидного слоя на полимерных мультислоях методом сканирующей конфокальной лазерной микроскопии. А. Образование агрегатов липидов с PLL на поверхности HA/PLL28 пленки. Б. Образование липидного бислоя на поверхности HA/PLL280 пленки. С. Распределение липидов (слева) и белка лизоцима (справа) на HA/PLL280 пленке, нанескенной на стеклянное волокно. Шкала – 20 мкм. Флуоресцентные изображения (посередине) соответствуют локализации липидов (флуоресцентно меченных). Приведенные профили флуоресценции (снизу) были взяты вдоль желтых стрелок, указанных на флуоресцентных изображениях. Изображения, полученные при пропускании света (633 нм) приведены сверху. Перед тем началом эксперимента полимерные пленки «царапали» тонкой металлической иглой, полученные царапины (в виде креста для рис. 53, А) и вертикальной линии (рис. 53, Б) использовали для (1) фокусирования на поверхности пленки и (2) в качестве контроля для адсорбции липосом на стекло. Попытка уменьшить силу взаимодействия липосом и полилизина за счет исключения из состава липосом ФГ не привела к улучшению качества липидного бислоя (данные не показаны). 129 Распределение липосом на поверхности пленок, а не внутри мультислоев, было показано с использованием HA/PLL280 пленки, нанесенной на длинное и узкое стеклянное волокно цилиндрической формы (рис. 53, В). В качестве контрольного эксперимента, в пленку загрузили белок лизоцим, для которого известно гомогенное распределение по всей глубине пленки (рис. 53, В, справа). В отличие от лизоцима, липосомы (рис. 53, В, слева) локализуются только на поверхности мультислоев и не проникают внутрь. Чтобы подтвердить формирование бислойной структуры, а не мультислойное строение липидного покрытия, количество адсобрированных липидов определяли по уменьшению флуоресценции супернатанта (суспензии липосом, содавленной к пленке полимеров). Найденное значение составило 0,4±0,1 нмоль, в то время как количество липидов, необходимое для образования липидного бислоя (оцененное теоретически) равно 0,6 нмоль. Очевидно, что адсорбированное количество недостаточно для образования нескольких бислоев и, учитывая гомогенное распределение липидов по поверхности (рис 53, Б), можно предположить, что липосомы разворачиваются и образуют липидный бислой на поверхности мультислоев. Наконец, транспорт модельного белка, лизоцима, по свойствам и размерам аналогичного цитохрому c, через полученную мембрану и в ее отсутствие был изучен методом конфокальной микроскопии (рис. 54). 130 Рис 54. Транспорт лизоцима через липидный бислой (А - черные ромбы, Б – изображения снизу) и в отсутствие липидного бислоя (А – красные круги, Б – изобрадения сверху). А. Кинетика транспорта лизоцима. Стандартные отклонения приведены для 2 измерений. Б. Изображения, полученные для 30 мин. Шкала – 20 мкм. В присутствие мембраны было показано уменьшение количества белка, прошедшего в пленку по сравнению с непокрытыми липидами мультислоями, примерно в 2-3 раза. Были найдены условия получения гомогенной и непрерывной структуры бислоя липидов, его структура была подтверждена методами флуоресцентного анализа и лазерной конфокальной микроскопии, барьерные свойства против транспорта белков были изучены. Разработанная система может быть использована в дальнейшем для изучения процессов, происходящих на мембране или в околомембранном пространстве клетки. 4.3. Роль реакций пероксидации липидов под действием комплекса цитохрома c с анионными липидами в развитии апотоза Завершающий этап работы был посвящен изучению роли процесса липидной пероксидации в апоптозе непосредственно в культурах клеткок при внутреннем пути инициации апоптоза и тканях животных при различных патологиях. Данное исследование стало возможным благодаря использованию мощного инструмента 131 для тотального скрининга липидного состава клеток и тканей – хромато-массспектрометрического анализа. 4.3.1. Механизм биосинтеза липидных медиаторов из кардиолипина митохондрий под действием цитохрома c в процессе апоптоза Последняя часть данной диссертационной работы была посвящена изучению роли реакций пероксидации анионных липидов в процессе апоптоза. Известно, что катализируемая цитохромом c пероксидация мембраны митохондрий приводит к образованию в ней пор и дальнейшему выходу апоптогенных белков в цитозоль. В этом разделе будет показана еще одно важное значение реакций пероксидации кардиолипина под действием цитохрома c – биосинтез липидных медиаторов. Было также показано, что этот механизм реализуется при церебральной ишемииреперфузии и болезни Паркинсона (следующие два раздела). Известно, что стадия инициации апоптоза происходит в митохондриях, после чего каскад каспаз развивается в цитозоле и на финальной стадии достигает клеточной мембраны. Очевидно, что в клетке должна существовать система сигнальных молекул для реализации программы апоптоза: в роли таких молекул выступают липидные медиаторы, продукты окисления полиненасыщенных жирных кислот. В ранних работах был изучен путь биосинтеза липидных медиаторов из фосфатидилсерина, находящегося на клеточной мембране (подробно результаты этих работ были описаны в обзоре [202]). Известно, что этот механизм осуществляется ферментными системами, находящимися в цитозоле. Тем не менее, в ряде исследований было показано, что фосфатидилсерин является не единственным липидом, подвергающимся окислению в процессе апоптоза. Так, кардиолипин, содержащийся в митохондриях, источниках апоптоза, также может подвергаться окислению. Данная работа была проведена в Питтсбургском университете (США) с использованием ряда химических, клеточных и животных моделей [184]. Вклад 132 автора заключался в интерпретации данных хромато-масс-спектрометрического анализа. Основные результаты будут рассмотрены ниже. Результаты хромато-масс-спектрометрического анализа липидов мутантных клеток, не содержащих цитохром (Цит c (Цит c +/+ -/- ) и контрольных клеток той же линии ), подвергнутых апоптозу, инициированному актиномицином Д (не являющимся окислителем) или окислителем tBuOOH приведены на рис. 55. Рис. 55. А. Уровень апоптоза, оцененный по связыванию клеток с аннексином V. Б. ВЭЖХ-МС свободных окисленных жирных кислот и В. ВЭЖХ-МС лизокардиолипинов в Цит c +/+ и Цит c -/- клетках без обработки и после обработки актиномицином Д или tBuOOH. ФЛ – фосфолипиды, КЛ – кардиолипин. Стандартные отклонения даны для n=3. (*) – значения, статистически (p≥0,99) отличающиеся от соответствующих контрольных. Для Цит c -/- клеток уровень апоптоза (согласно флуоресценции аннексина V) после обработки актиномицином или tBuOOH не отличался от контрольного значения, в то время как для Цит c +/+ количество клеток, вступивших в апоптоз, возросло в несколько раз после обработки актиномицином или tBuOOH (рис. 55, А). Согласно данным ВЭЖХ-МС анализа, этот процесс сопровождался накоплением продуктов окисления (рис. 55, Б) и гидролиза (рис. 55, В). 133 Использование ингибиторов различных фосфолипаз в сочетаниии с последующим ВЭЖХ-МС анализом фосфолипидов позволило установить, что гидролиз окисленного кардиолипина происходит под действием кальций-независимой фосфолипазы А2 (данные не показаны). Окисленные и затем гидролизованные из кардиолипина митохондриальной мембраны жирные кислоты могут затем быть экстернализованы во внеклеточный матрикс и выполнять сигнальные функции. Далее было проведено ВЭЖХ-МС исследование продуктов окисления кардиолипина митохондрий, выделенных из тканей мозга. Кардиолипин мозга крысы и других млекопитающих отличается большим разнообразием молекулярных видов (рис. 56, А). Основные полиненасыщенные компоненты кардиолипина мозга – линолевая, арахидоновая и докозагексаеновая жирные кислоты, легко подвергающиеся окислению. Рис. 56. Масс-спектры (А) кардиолипина, выделенного из митохондрий мозга крысы и (Б) тетралинолеоилкардиолипина, выделенного из сердца. Каждая линия в спектре соответствует молекулярному виду с определенным m/z. Над спектрами приведены молекулярные формулы и соответствующие им m/z для максимальных пиков в каждом из кластеров кардиолипина. 134 Выделенный из митохондрий природный кардиолипин окисляли смесью цитохрома c с пероксидом водорода. Полученные продукты окисления анализировали методом ВЭЖХ-МС. Найденные в липидном экстракте окисленные жирные кислоты (и ЖК, из которых они были образованы) приведены в таблице 7 ниже. В таблице также приведены литературные данные, указывающие на функции липидных медиаторов найденных окисленных ЖК при различных патологиях. 135 Количество m/z [M-H]- Окисленная ЖК присоединенных Образована атомов из ЖК Функции липидного медиатора кислорода 293 9-оксо-октадекадиеновая кислота + 1 [O] - 2 [H] Воспалительная гиперлагезия; ЛК 18:2 лиганд для ванилоидных рецепторов [203] Воспалительная гиперлагезия; лиганд для ванилоидных 293 13-оксо-октадекадиеновая кислота + 1 [O] - 2 [H] ЛК 18:2 рецепторов, блокирует интерлейкиновые рецепторы и активирует PPARγ-рецепторы [203, 204] Лиганд для ванилоидных и G2A 295 9-гидрокси-октадекадиеновая кислота рецепторов, блокирует + 1 [O] ЛК 18:2 интерлейкиновые рецепторы и активирует PPARγ-рецепторы [205-207] 136 Лиганд для ванилоидных и G2A 295 13-гидрокси-октадекадиеновая кислота рецепторов, блокирует + 1 [O] ЛК 18:2 интерлейкиновые рецепторы и активирует PPARγ-рецепторы [205, 206] 295 295 309 309 309 309 309 9,10-эпокси-октадекамоноеновая кислота 12,13-эпокси-октадекамоноеновая кислота + 1 [O] ЛК 18:2 Не установлено + 1 [O] ЛК 18:2 Не установлено 9-гидрокси-14-оксо- + 2 [O] октадекадиеновая кислота - 2 [H] 13-гидрокси-8-оксо- + 2 [O] октадекадиеновая кислота - 2 [H] 9,10-эпокси-13-оксо- + 2 [O] октадекамоноеновая кислота - 2 [H] 12,13-эпокси-9-оксо- + 2 [O] октадекамоноеновая кислота - 2 [H] 9,10-эпокси-13-гидрокси- + 2 [O] откадекадиеновая кислота - 2 [H] 137 ЛК 18:2 Не установлено ЛК 18:2 ЛК 18:2 Стимулируют выработку альдостерона ЛК 18:2 (минералокортикостероидный гормон коры надпочечников) ЛК 18:2 [208] 309 311 311 325 325 325 325 319 319 319 12,13-эпокси-9-гидрокси- + 2 [O] откадекадиеновая кислота - 2 [H] 8,13-дигидрокси-октадекадиеновая кислота 9,14-дигидрокси-октадекадиеновая кислота + 2 [O] + 2 [O] + 3 [O] октадекадиеновая кислота - 2 [H] 13-оксо-8-гидроперокси- + 3 [O] октадекадиеновая кислота - 2 [H] 9-оксо-14-гидроперокси- + 3 [O] октадекадиеновая кислота - 2 [H] 14-оксо-9-гидроперокси- + 3 [O] октадекадиеновая кислота - 2 [H] кислота 12-гидрокси-эйкозатетраеновая кислота 14,15-эпоксиэйкозатетраеновая ЛК 18:2 Не установлено 8-оксо-13-гидроперокси- 15-гидрокси-эйкозатетраеновая ЛК 18:2 ЛК 18:2 ЛК 18:2 ЛК 18:2 Не установлено ЛК 18:2 ЛК 18:2 + 1 [O] АК 20:4 + 1 [O] АК 20:4 + 1 [O] АК 20:4 138 Блокирует интерлейкиновые рецепторы и активирует PPARγрецепторы, стимулирует экспрессию белка CD36 [209212] кислота 319 319 337 337 337 337 265 11,12-эпоксиэйкозатетраеновая + 1 [O] АК 20:4 8,9-эпоксиэйкозатетраеновая кислота + 1 [O] АК 20:4 8,9-дигидрокси-эйкозатриеновая + 2 [O] кислота + 2 [H] 5,6-дигидрокси-эйкозатриеновая + 2 [O] кислота + 2 [H] 11,12-дигидрокси-эйкозатриеновая + 2 [O] кислота + 2 [H] 14,15-дигидрокси-эйкозатриеновая + 2 [O] кислота + 2 [H] Транкированная 14,15-дигидрокси- + 2 [O] эйкозатетраеновая кислота транкированная кислота Транкированная 4,10,16293 тригидрокси-докозагексаеновая кислота + 3 [O] транкированная АК 20:4 АК 20:4 АК 20:4 Не установлено АК 20:4 АК 20:4 ДГК 22:6 Не установлено Таблица 7. Найденные в составе кардиолипина мозга крысы после его обработки смесью цитохрома c и H 2O2 окисленные жирные кислоты и их биологические функции липидных медиаторов. ЛК- линолевая кислота, АК – арахидоновая кислота, ДГК – докозагексаеновая кислота. 139 Важно отметить тот факт, что для цитохрома c основным субстратом окисления в кардиолипине служит линолевая кислота, в результате окисления которой образуется огромное число различных молекулярных видов окисленной ЛК. Арахидоновая кислота окисляется только в определенных положениях: продуктов ее окисления в конце углеводородной цепи (в положениях 17-, 18-, 19- и 20-) не обнаружили, в то время как основные компоненты – арахидоновая и докозагексаеновая кислота – практически не подвергаются окислению, при том, что обе указанные кислоты – арахидоновая и докозагексаеновая – содержат большие, чем линолевая кислота, системы двойных связей и должны легче подвергаться окислению. Аналогичные закономерности будут показаны для двух частных случаев реализции механизма биосинтеза липидных медиаторов из кардиолипина под действием цитохрома c и далее кальций-независимого гидролиза фосфолипазами, рассмотренных в двух следующих главах. Рис. 57. МС спектры исходного кардиолипина (m/z 1448) и продуктов его окисления смесью цитохрома c и H2O2 (количество присоединенных атомов кислорода указано стрелками). Поскольку основным субстратом окисления была найдена линолевая кислота, с целью количественной оценки каждого из молекулярных видов продуктов ее окисления, аналогичный эксперимент был проведен для окисления тетралинолеоилкардиолипина вместо кардиолипина мозга крысы (МС спектр приведен на рис. 56, Б) под действием цитохрома c в присутствие пероксида водорода. МС спектры исходного кардиолипина (m/z 1448) и продуктов его окисления приведены на рис. 57. Количественная оценка полученных продуктов окисления была также проведена масс-спектрометрически, с использованием соответствующих стандартов для каждого из индивидуальных молекулярных видов. Эти данные приведены в таблице 8. Количество % от суммарного присоединенных атомов количества продуктов кислорода окисления 1448 0 0,9±0,1 1462 1 2,2±0,1 1464 1 5,7±0,1 1478 2 4,8±0,2 1480 2 13,9±0,1 1494 3 6,2±0,2 1496 3 10,3±0,4 1510 4 7,2±0,3 1512 4 11,2±0,4 1523 5 5,5±0,1 1528 5 7,7±0,1 1542 6 5,8±0,7 1544 6 6,5±0,9 1558 7 3,1±0,6 1560 7 3,4±0,1 1574 8 2,1±0,5 1576 8 2,4±0,1 1590 9 0,6±0,1 1592 9 0,5±0,1 Таблица 8. Количественная оценка тетралинолеоилкардиолипина и продуктов его окисления после обработки смесью цитохрома c и H2O2. Стандартные отклонения приведены для 3 измерений. m/z [M-H]- Полученные данные свидетельствуют о роли реакций пероксидации кардиолипина в биосинтезе липидные медиаторов апоптоза. Основным субстратом окисления в этих реакциях является линолевая кислота. 4.3.2. Пероксидация кардиолипина и других липидов в процессе апоптоза клеток мозга при церебральной ишемии-реперфузии после остановки сердца Считается, что патогенез церебральной ишемии связан со снижением энергопродукции и нарушением активного транспорта различных ионов через 141 мембраны с раскрытием Са2+-каналов. Избыточное внутриклеточное накопление ионов кальция и их переход в активную форму вызывает активацию внутриклеточных ферментов, фосфолипаз, что приводит к образованию липидных медиаторов из жирных кислот фосфолипидов, окисленных циклооксигеназой и липоксигеназой, и, в конечном счете, реализации механизмов смерти нейрона. В недавних исследованиях было выявлено, что липидные медиаторы могут быть также синтезированы кальций-независимой фосфолипазой из окисленного под действием цитохрома c кардиолипина. Вклад каждого из этих механизмов в гибель нейронов при церебральной ишемииреперфузии не был оценен до сих пор. В данной работе использовали следующую модель церебральной ишемииреперфузии у крыс: после 9 минут асфиксии и исчезновения биоэлектрической активности сердца проводили сердечно-легочную реанимацию. Анализы участка мозга cortex у крыс после восстановления спонтанного кровообрапщения показали 10-кратную активацию каспаз 3/7. У выживших крыс наблюдались двигательные и когнитивные нарушения. В исследовании крыс разделили на 3 группы: (1) контрольная группа, (2) крысы, подвергнутые остановке сердца и реанимированные и (3) крысы, реанимированных после остановки сердца и получившие через сутки после восстановления спонтанного кровообращения селективный ингибитор окисления в митохондриях, искусственно синтезированный антиоксидант вещество XJB-5-131 [213]. При этом для крыс, получивших через сутки после восстановления спонтанного кровообращения XJB наблюдалось снижение активности каспаз 3/7 и ускоренное восстановление двигательных функций. Полный анализ липидного состава cortex у крыс был проведен методом хромато-масс-спектрометрии непосредственно автором данной диссертационной работы, поэтому далее эти результаты будут рассмотрены более детально. На первом этапе был определен кортикальный липидный состав для всех трех исследуемых групп животных. Для этого липидный экстракт разделяли по классам фосфолипидов на нормально-фазовой силикагельной колонке и 142 определяли их суммарное содержание с использованием стандартных веществ для каждого фосфолипидного класса (таблица 3). Полученные данные выражали в единицах нмоль фосфолипидов/мг белка, результаты представлены в таблице 9. Контроль Церебральная Фосфолипиды (здоровые ишемия- Cortex крысы) реперфузия Церебральная ишемияреперфузия // XJB5-131 нмоль/мг белка ± станд.откл (n=4) Фосфатидилхолин 229±12 237±36 236±33 Фосфатидилэтаноламин 73±8 78±7 74±10 Фосфатидилсерин 31±5 32±5 31±7 Фосфатидилинозитол 8±2 10±2 8±2 Фосфатидилглицерол 14±2 15±2 13±1 Кардиолипин 9±1 9±1 8±1 Таблица 9. Кортикальный фосфолипидный состав. Статичтически значимых различий для исследуемых групп не обнаружено. Статистически значимых различий в фосфолипидном составе для исследуемых групп не было обнаружено. Было выдвинуто предположение, что изменения в липидном составе, связанные с окислением липидов во время церебральной ишемии-реперфузии, к моменту выделения липидного экстракта могли быть уже нивелированы внутренними системами клеток. Один из основных механизмов удаления окисленных фосфолипидов связан с действием фосфолипаз, ферментов, гидролизующих фосфолипиды с образованием лизофосфолипида и свободной ЖК. С целью проверить это предположение, был проведен ВЭЖХ-МС-анализ лизо-фосфолипидов по отдельным фосфолипидным классам. В контрольных образцах были обнаружены лизофосфатидилхолин, лизо-фосфатидилэтпноламин, лизо-фосфатидилинозитол и 143 монолизо-кардиолипин. Лизо-фосфатидилсерин и лизо-фосфатидилглицерол не были найдены (рис. 58). Рис. 58. Лизо-фосфолипиды и их молекулярные виды, обнаруженные в участке cortex крыс контрольной группы: ЛФИ – лизофосфатидилинозитол, ЛФЭ – лизофосфатидилэтаноламин, ЛФХ - лизофосфатидилхолин, монолизо-КЛ – монолизокардиолипин. Погрешности представляют собой стандартные отклонения для n=4. В образцах кортекса крыс, подвергнутых остановке сердца, уровень всех обнаруженных продуктов гидролиза повысился, однако только для монолизокардиолипина эти изменения были статистически достоверными. Для крыс, получивших XJB, уровни лизо-фосфолипидов упали вновь до контрольного значения или ниже, причем эти изменения были найдены статистически достоверными для всех лизо-фосфолипидов, кроме фосфатидилэтаноламина. Полученные данные для каждого из обнаруженных лизо-фосфолипидов приведены на рис. 59. 144 Рис. 59. ВЭЖХ-МС анализ кортикальных лизо-фосфолипидов по классам. ЛФИ – лизофосфатидилинозитол, ЛФЭ – лизофосфатидилэтаноламин, ЛФХ лизофосфатидилхолин, монолизо-КЛ – монолизокардиолипин. Стандартные отклонения даны для n=4. (*) – значения для лизо-фосфолипидов, статистически (p≥0,99) отличающихся от найденных для контрольных крыс, (#) - значения для лизо-фосфолипидов, статистически (p≥0,99) отличающихся от найденных для ишемия-реперфузионных крыс. При гидролизе фосфолипидов в клетке окисленные ЖК высвобождаются из всех фосфолипидных классов, так что, в конечном счете, определить, из каких фосфолипидов были гидролизованы те или иные ЖК, невозможно. Тем не менее, можно оценить суммарное содержание свободных ЖК в образце. Для этого фракция ЖК была выделена методом 2D-тонкослойной хроматографии (прочие фракции фосфолипидов также были сохранены для дальнейших анализов) и разделена по индивидуальным окисленным и неокисленным видам на обращенно-фазовой хроматографической колонке с последующим МС определением. Для неокисленных ЖК не было найдено статистически значимых различий для трех исследуемых групп, однако содержание окисленных жирных кислот оказалось различным (рис. 60, А). Были обнаружены продукты окисления линолевой кислоты: гидрокси-, эпокси- и гидроперокси-производные. Более того, найденные изменения суммарного содержания окисленных ЖК и лизофосфолипидов, практически совпадают (Δ на рис. 60, Б). 145 Рис. 60. А. ВЭЖХ-МС анализ свободных окисленных ЖК: гидрокси-, эпокси- и гидроперокси-производных ЛК. Б. Сопоставление уровня суммарных свободных продуктов окисления линолевой кислоты (ЛКокисл.) и суммарного содержания лизо-фосфолипидов (лизо-ФЛ). Стандартные отклонения даны для n=4. (*) – значения, статистически (p≥0,99) отличающихся от найденных для контрольных крыс, (#) – значения, статистически (p≥0,99) отличающиеся от найденных для ишемия-реперфузионных крыс. При проведении МС анализа липидов, важно иметь в виду, что для биологических тканей во время апоптоза характерно окисление липидов на уровне всего 0.1 % и менее – даже такой уровень окисления приводит к драматическим изменениям в метаболизме клетки. К тому же, что эта незначительная доля продуктов окисления липидов рассредоточена между различными классами фосфолипидов, таким образом, что определяемые содержания лежат в диапазоне 0.01 % от общего числа липидов и менее, что приводит к необходимости обнаружения следовых количеств окисленных липидов на фоне спектра неокисленных липидов и представляет собой сложную задачу. Молекулярные виды неокисленных липидов насчитывают более 1000 соединений. При этом в их состав входят одни и те же жирнокислотные остатки, насчитывающие не более 30 неокисленных молекулярных видов, и, разумеется, определение их и продуктов их окисления представляет собой более простую задачу. В данной работе был предложен подход к выделению жирнокислотных остатков из фосфолипидов путем их количественной обработки фосфолипазами 146 с последующей твердофазной экстракцией гидролизованных жирных кислот. Принцип этого подхода схематично показан на рис. 61. Рис. 61. Схема выделения жирнокислотных остатков из фосфолипидов путем (I) их обработки фосфолипазами с (II) последующей твердофазной экстракцией гидролизованных жирных кислот для (III) ВЭЖХ-МС анализа. ФЛ – фосфолипид, лизо-ФЛ – лизо-фосфолипид, ЖК – жирная кислота, PLA – фосфолипаза. Пояснения в тексте. Экстракт липидов переводится в водную среду, где фосфолипиды самоорганизуются с образованием липосом, после чего их обрабатывают либо смесью фосфолипаз А1 и А2, гидролизующих жирные кислоты из sn1 и sn2положения, соответственно. Полученные таким образом жирные кислоты отделяют от оставшихся в результате гидролиза полярных головок фосфолипидов, негидролизованных или частично гидролизованных липидов, а также фосфолипаз методом обращенно-фазовой твердофазной экстракции. Спектр свободных жирных кислот (тех, которые не входили в состав фосфолипидов в образце) вычитается впоследствии из соответствующего спектра гидролизованных ЖК. В результате обработки липидного экстракта смесью фосфолипаз А 1 и А2 и ВЭЖХ-МС анализа окисленных ЖК, были обнаружены моноокси-продукты окисления линолевой кислоты (кето-, гидрокси- и эпокси-производные) и диокси-соединения (кето-гидрокси или эпокси-гидрокси-производные – точная химическая структура не была установлена, а также дигидрокси-производные ЛК). Продукты окисления других полиненасыщенных ЖК не были найдены. 147 Повышение уровня окисления фосфолипидов для каждого из молекулярных видов окисленных ЖК (рис. 62, А) и для их суммарного содержания (рис. 62, Б) за вычетом свободных окисленных ЖК (представленных на рис. 60) свидетельствует о роли пероксидации липидов в патогенезе церебральной ишемии-реперфузии после остановки сердца. Митохондриальный антиоксидант XJB-5-131 показал эффективность ингибирования окисления липидов. Рис. 62. ВЭЖХ-МС анализ негидролизованных окисленных ЖК (в составе фосфолипидов): (А) кето-, гидрокси-, эпокси-, кето-гидрокси (или эпоксигидрокси)-и дигидрокси-производных ЛК и (Б) суммарное содержание вышеперечисленных продуктов окисления линолевой кислоты (ЛКокисл.). Стандартные отклонения даны для n=4. (*) – значения, статистически (p≥0,99) отличающихся от найденных для контрольных крыс, (#) – значения, статистически (p≥0,99) отличающиеся от найденных для ишемияреперфузионных крыс. Наконец, более детальный анализ выделенной ранее фракции кардиолипина позволил обнаружить его окисленные молекулярные виды, они были найдены только в образцах мозга крыс после остановки сердца (рис. 63). 148 Рис. 63. ВЭЖХ-МС анализ окисленного кортикального кардиолипина. А. Хроматографический пик окисленного кардиолипина был обнаружен только в образцах мозга крыс после ишемии-реперфузии. Б. МС2 спектры окисленного кардиолипина с [M-H]- 1464 и 1480, полученные для хроматографического пика слева. Пики с m/z 293, 295, 309 и 311 (отмеченные красным) соответствуют окисленной линолевой кислоте в составе кардиолипина, m/z 255, 279 и 303 (синим) – неокисленные ЖК. m/z 153 характерен для фосфолипидов (фосфатноглицериновый остаток). Пероксидация всех основных классов фосфолипидов в патогенезе церебральной ишемии-реперфузии после остановки сердца была обнаружена. Тем не менее, наиболее значимые изменения произошли с кардиолипином, подвергнутому окислению и последующему гидролизу в большей степени по сравнению с остальными фосфолипидами. К тому же, лечение селективного митохондриального ингибитора окисления, XJB, оказалось эффективным. Полученные данные служат индикатором того, что при реперфузионном окислении фосфолипидов митохондриальный путь окисления кардиолипина под действием цитохрома c, по-видимому, преобладает над путем окисления фосфолипидов клеточной мембраны под действием цитозольных ферментов – циклооксигеназы, липоксигеназы, цитохрома P450 и других пероксидаз [214]. Была показана роль кальций-независимого пути биосинтеза липидных медиаторов из кардиолипина, окисленного под действием цитохрома c, и эффективность применения селективного 149 ингибитора пероксидации кардиолипина, вещества XJB, для лечения церебральной ишемии-реперфузии после остановки сердца. 4.3.3. Пероксидация липидов в процессе апоптоза клеток мозга substantia nigra при болезни Паркинсона Болезнь Паркинсона – медленно прогрессирующее хроническое нейродегенеративное заболевание, вызванное разрушением и гибелью нейронов, вырабатывающих нейромедиатор дофамин в черной субстанции мозга substantia nigra [215]. Одной из основных причин, приводящих к развитию паркинсонизма, считают нарушение работы митохондрий, митохондриальный стресс, тесно связанный с усилением процесса апоптоза, а основными поражающими факторами – снижение активности комплекса I [216], понижение уровня глутатиона [217], модификации белка [218], повреждения ДНК [219] и, наконец, окисление липидов [220]. Основным продуктом окисления липидов при болезни Паркинсона был найден 4-гидрокси-2-ноненаль, транкированная жирная кислота, однако ее источники, липиды, продуктом окисления которых является ноненаль [221] [222], до сих пор не были установлены. Между тем, определение мишеней окисления представляет собой важный шаг как для понимания механизмов апоптоза и пероксидации липидов, так и для возможной защиты липидов от окисления в медицинских целях для лечения паркинсонизма. Современные методы исследования, в первую очередь, масс-спектрометрия липидов, позволили идентифицировать эти липиды-мишени. Данная работа была проведена индуцированной в Питтсбургском модели болезни университете Паркинсона, (США) модель и на ротенон- общая схема эксперимента описаны в разделе атериалы и методы (рис. 21). Вклад автора данной диссертационной работы заключался в получении и интерпретации данных хромато-масс-спектрометрического анализа. Основные результаты будут рассмотрены ниже. С целью оценить общий жирнокислотный состав фосфолипидов и определить, какие из них потенциально могут быть мишенями для окисления, был применен подход, аналогичный описанному в предыдущем разделе (рис. 61) 150 и заключающийся в обработке липидного экстракта фосфолипазами с последующей твердофазной экстракцией гидролизованных ЖК. В отличие от предыдущего исследования, липидный экстакт обрабатывали отдельно фосфолипазами А1 и А2. Найденный жирнокислотный состав фосфолипидов отдельно для sn1 и sn2-положений представлен на диаграммах ниже (рис. 64). Содержание свободных жирных кислот, найденное в образцах (те же молекулярные виды, что и для sn1 и sn2-положений были обнаружены), вычиталось. Из трех представленных групп ЖК, только полиненасыщенные ЖК могут служить субстратом окисления. Доминирующими видами ПНЖК в обоих положениях были найдены докозагексаеновая кислота, содержащая систему 6 двойных связей (22:6) и арахидоновая кислота (20:4), содержащая систему 4 двойных связей. Рис. 64. Жирнокислотный состав фосфолипидов в (А) sn1 и (Б) sn2-положениях для substantia nigra крыс. ЖК разделены на три группы: насыщенные (14:0, 16:0, 18:0, 20:0 и 22:0), мононенасыщенные (16:1, 18:1 и 20:1) и полиненасыщенные жирные кислоты (молекулярные виды указаны на рис.). Ввиду большей доли докозагексаеновой и арахидоновой кислот среди обнаруженных ПНЖК, а также наличию в них длинной системы двойных связей, предполагалось обнаружить большее количество продуктов их окисления по сравнению с прочими жирными кислотами. Анализ окисленных ЖК, напротив, не выявил ни одного продукта их окисления, и единственным субстратом, подвергнутым окислению была линолевая кислота. Были обнаружены моноокси(гидрокси- и эпокси-) производные ЛК. Их содержание статистически достоверно увеличилось на 5 и на последний день (10-14, в зависимости от индивидуальной 151 реакции крысы) введения ротенона (рис. 65). Участок мозга cortex использовали в качестве контроля, там повышения уровня окисления не было обнаружено. Рис. 65. Количество эпокси- и гидрокси-соединений, найденных в substantia nigra здоровых крыс (белые столбики) и ротенон-обработанных крыс (черным) на 1, 5 или последний (10-14) день введения ротенона (ротенон вводили до начала развития у крыс физиологических признаков паркинсонизма). Звездочками отмечены статистически отличные от соответствующего контрольного значения (p≥0.99, n=5). Погрешности – стандартные отклонения. Дальнейший анализ липидов был проведен другими авторами опубликованной по теме этого исследования статьи [183] и выявил, что основной мишенью окисления и источником окисленной линолевой кислоты служил кардиолипин. 4.3.4. Деградационная стадия апоптоза. Роль пероксидации липидов в формировании фагоцитарных сигналов «съешь меня» Для изучения роли пероксидации и окисления фосфатидилсерина при внутреннем и внешнем путях развития апоптотоза проводили хромато-массспектрометрический анализ липидных экстрактов из контрольных и апоптотических клеток линий HL60 и Jurkat. Следует подчеркнуть, что все эксперименты по работе с клетками были проведены сотрудниками лаборатории В.Е. Кагана. Сам автор данной работы проводил экстракцию и последующий хромато-масс-спектрометрический анализ липидов, поэтому в данном разделе будут, в основном, приведены результаты масс-спектрометрического исследования, в то время как данные, полученные в клеточных экспериментах 152 будут описаны только в случаях, когда их обсуждение необходимо для понимания картины в целом. Клетки линии HL60 подобны нейтрофилам [223] и отличаются низким содержанием окисляемых видов фосфатидилсерина (тех видов, которые содержат линолевую кислоту). Это затрудняет их прямое использование для изучения роли окисления ФС для фагоцитоза. С целью повышения содержания таких окисляемых молекулярных видов, в культивационную среду клеток была добавлена линолевая кислота. Результаты интегрирования линолевой кислоты в фосфолипиды клеток были оценены методом ВЭЖХ-МС с разделением фосфолипидов по классам на нормально-фазовой колонке (рис. 66, А, Б). Рис. 66. ВЭЖХ-МС анализ липидного состава клеток HL60, контрольных и обогащенных линолевой кислотой. A. Нормально-фазовая хроматограмма разделения фосфолипидов по классам. Б. Распределение фосфатидилсерина в контрольных и обогащенных ЛК HL60 клетках по молекулярным видам и перераспределение одного из основных молекулярных видов с m/z 786,5 (пояснение в тексте). В. МС1 и МС2 спектры для m/z 786,5 в НL60 клетках. Г. МС1 и МС2 спектры для m/z 786,5 в НL60 клетках, обогащенных ЛК. Стандартные отклонения даны для n=3. (*) – значения для LA-HL60, статистически (p≥0,99) отличающиеся от найденных для контрольных HL60 клеток. 153 В обычных HL60 клетках, без добавления линолевой кислоты, основным молекулярным видом фосфатидилсерина является вид С18:0/C18:1 (sn1/sn2), соответствующий на масс-спектре пику с m/z 788,5. Второй по интенсивности пик с m/z 786,5, согласно данным MS2-спектра соответствует молекулярным видам С18:1/С18:1 и С18:0/C18:2, причем обнаружено лишь следовое количество линолеат-содержащего вида С18:0/C18:2 по сравнению с доминирующим С18:1/C18:1 (рис. 67). После обогащения клеток линолевой кислотой общее содержание фосфатидилсерина (как и других фосфолипидов) не изменилось, однако произошло перераспределение молекулярных видов в сторону линолеатсодержащих молекул. С18:0/C18:2-ФС стал основным молекулярным видом фосфатидилсерина (рис. 66, Б и 67), при этом количество неокисляемых С16:0/C18:1 и С18:0/C18:1-ФС уменьшилось. Рис. 67. А. МС1 и МС2 спектры для m/z 786,5 в НL60 клетках. Б. МС1 и МС2 спектры для m/z 786,5 в НL60 клетках, обогащенных ЛК. ЛК-обогащенные клетки использовали далее для изучения влияния окисленного ФС на фагоцитарный ответ макрофагов при апоптозе. Обычные HL60 клетки при этом выступали в качестве контроля. Важно отметить, что для клеток HL60 характерно наличие окисляемых ЖК в sn2-положении. Эта особенность строения использовалась нами в дальнейших экспериментах с обработкой клеток различными фосфолипазами. Н2О2 представляет собой классический инструмент для инициации апоптоза в HL60 клетках [224] [225]. На рис. 68, А показано увеличение уровня фагоцарного захвата апоптических HL60 клеток RAW264.7 макрофагами после обработки их пероксидом водорода. При этом для LA-HL60 клеток наблюдалось 154 значительно большее (в 7.2 раз по фагоцитарному индексу) увеличение уровня фагоцитоза (рис 68, А). О том, что более эффективный фагоцитоз апоптотических LA-HL60 по сравнению с обычными HL60 клетками достигается не за счет увеличения экстернализации ФС, свидетельствуют аналогичные уровни ФИТС-аннексин-связывания в обоих типах клеток (данные не показаны). Рис. 68. Н2О2-индуцированный апоптоз в HL60 клетках. А. Фагоцитарные индексы, посчитанные для контрольных (naïve) и обогащенных ЛК (LA-HL60) клеток без и после обработки Н2О2. Соответствующие изображения макрофагов (красным) и захвачекнных ими клеток (зеленым) представлены на врезке. Б. Количество основных окисляемых молекулярных видов ФС в LA-HL60 и в LA-HL60, обработанных Н2О2. Стандартные отклонения даны для n=3. МС анализ фосфолипидов клеток, разделенных по классам на нормальнофазоговой ВЭЖХ колонке, показал существенное уменьшение содержания окисляемого ФС (рис 68, Б) и примерно четырехкратное увеличение количества окисленного ФС (суммарное количество ФСокисл. В Н2О2-обработанных LA-HL60 клетках составило 130 ± 9 пмоль/106 клеток). Доминирующими продуктами окисления при этом были молекулярные виды, содержащие два атома кислорода (гидроперокси-, дигидрокси- и гидокси-эпокси) в линолеате ацильной цепи C18:0/C18:2-ФС (рис 69). Чтобы убедиться, что наблюдаемый эффект усиления фагоцитоза окисленным фосфатидилсерином не является специфическим для конкретной линии макрофагов, использовали макрофаги ТНР-1, стимулированные ФМА. В этом случае также обнаружили, что апоптотические 155 LA-HL60 клетки являются гораздо более привлекательными мишенями для фагоцитоза THP-1 макрофагами по сравнению с обычными HL60 клетками (данные не показаны). Рис. 69. МС2 спектры для m/z 786,5 802, 5 и 818, 5, соответствующих молекулярному виду ФС С18:0/18:2, С18:0/18:2+[O] и С18:0/18:2+[2O]. С целью оценить распределение образованного под действием Н2О2 окисленный фосфатидилсерина между внутренней и внешней поверхностями плазматической мембраны, был проведен дополнительный ВЭЖХ-ИЭР-МС анализ апоптотических LA-HL60 клеток с использованием двух независимых подходов: (1) обработка клеток фосфолипазой А1 в присутствии БСА, очищенного от жирных кислот, и анализ образованных при этом окисленных sn2-ацил-лизо-фосфатидилсеринов и (2) обработка липопротеиновой Lp-PLA2, фосфолипазой, обладающей высокой селективностью по отношению к окисленным липидам (по отношению к неокисленным) [226] с последующим анализом накопленных sn1-ацил-лизофосфолипидов. Оба подхода схематично представлены на рис. 70. Идеологически, эксперимент напоминает представленный ранее на рис. 61, однако, если в предыдущих случаях фосфолипазами обрабатывали липидные экстракты, в настоящем исследовании обработке фосфолипазами подвергали сами клетки. 156 Рис. 70. Схема определения фосфатидилсеринов, экстернализованных на поверхность клетки в процессе апоптоза. А. Экстернализация ФС и ФСокисл на внешнюю сторону клеточной мембраны в результате апоптоза. Б. Обработка клетки фосфолипазой А1 приводит к гидролизу ФС с образованием лизо-ФС и окисленного лизо-ФС. Количество окисленного лизо-ФС эквивалентно количеству окисленного по sn2-положению ФС. В. Обработка клетки липопротеиновой фосфолипазой А2 приводит к гидролизу окисленного ФС с образованием лизо-ФС и окисленных свободных жирных кислот. Количество лизо-ФС эквивалентно количеству окисленного по sn2-положению ФС. Количество окисленных ЖК заведомо больше количества окисленного ФС, поскольку под действием Lp-PLA2 происходит гидролиз не только ФСокисл, но и других окисленных фосфолипидов. Количество экстернализованных на поверхность молекул окисленных ФС (эквивалентное количеству окисленных sn2-ацил-лизо-ФС производных) было таким образом оценено с использованием первого подхода и составило 24±8 пмоль/106 клеток. Общее количество sn2-ацил-лизо-ФС производных (окисленных и неокисленных), гидролизованных PLA1, а значит, и суммарное количество экстернализованного фосфатидилсерина, составило 173 пмоль/106 клеток. Исходя из этих данных, было подсчитано, что доля окисленного фосфатидилсерина составляет ~ 14±4 мольных % от общего количества экстернализованного на клеточную поверхность фосфатидилсерина, или ~ 19 мольных % от общего окисленного ФС клеток. ВЭЖХ-МС анализ фосфолипидов клеток, обработанных Lp-PLA2, показал накопление sn1-ацил-лизо-ФС. Обнаруженное количество sn1-ацил-лизо-ФС 157 после обработки Lp-PLA2 составило 13±2 пмоль/106 клеток, или 8 мольных % от общего количества клеточного ФС. В силу специфичности окисленному ФС, это эквивалентно количеству Lp-PLA2 к окисленного ФС, экстернализованного на поверхность. Полученные данные хорошо согласуются с результатами экспериментов с PLA1-обработанными клетками, описанными выше. Одновременно с лизофосфолипидами были также обнаружены различные виды гидролизованной окисленной линолевой кислоты: с одним атомом кислорода (оксо- и гидрокси-), двумя (гидроперокси-, дигидрокси- и гидроксиэпокси-) или тремя (оксо- гидроперокси-) - виды с m/z 293, 295, 311 и 325, соответственно. Полученные хроматографические пики и соответствующие им МС2 спектры для этих окисленных жирных кислот представлены на рис. 71. Обработка клеток Lp-PLA2 привела к существенному увеличению содержания этих окисленных кислот, в то время как изменений в содержании неокисленные свободных жирных кислот при этом не наблюдалось. Рис. 71. ВЭЖХ-МС анализ окисленных свободных жирных кислот. Хроматографические пики,соответствующие им МС2 спектры и предполагаемые на основании этих данных структурные формулы для m/z 295, 311 и 325. 158 Для получения более полного представления о взаимосвязи между обогащением фосфатидилсерина окисляемой линолевой кислотой, апоптозом и фагоцитарным ответом, использовали два индуктора гибели клеток, не являющихся окислителями - стауроспорин (СТС) и FAS антитела – для запуска апоптоза по внутреннему и внешнему механизму воздействия соответственно. С помощью одного из этих индукторов в Jurkat клетках был вызван апоптоз, после чего проведен ВЭЖХ-МС анализ и оценка фагоцитоза. Результаты, полученные для СТС-индуцированного пути, согласуются с данными для Н 2 О2 - индуцированного пути апоптоза в HL60 клетках. Напротив, активация FAS-пути апоптоза в Jurkat клетках не привела к значительному увеличению содержания окисленных ФС, несмотря на обогащение этих клеток линолевой кислотой (данные не показаны, [183]). Полученные данные говорят о том, что накопление окисленного фосфатидилсерина в апоптотических клетках приводит к усилению фагоцитоза. Липиды клеток, обогащенных линолевой кислотой, способны подвергаться окислению в процессе апотоза, в результате чего на их поверхности накапливается ФСокисл. Было показано, что фагоцитарный индекс для таких клеток на порядок больше по сравнению с контрольными (необогащенными ЛК) клетками. При этом, согласно результатам проведенного ВЭЖХ-МС анализа липидов, среди экстернализованного на поверхность клеток в процессе апоптоза фосфатидилсерина, окисленный ФСокисл представляет лишь незначительную долю от общего количества экстернализованного ФС. Таким образом, профагоцитарная активность окисленного фосфатидилсерина примерно на два порядка величины выше, чем для неокисленного ФС. 159 5. Заключение На сегодняшний день исследования в области апоптоза представляют собой актуальное направление развития науки. Несмотря на большой объем знаний, накопленных за последние 40 лет, в этой области до сих пор многие вопросы остаются открытыми. В данной работе была предпринята попытка глубже понять механизмы и биологичесое значение важного звена в развитии апоптоза – пероксидации липидов мембран под действием цитохрома c и его комплекса с анионными липидами. Несмотря на то, что в литературе предложено и описано большое число реакций, приводящих к пероксидации липидов мембран, единой концепции на настоящий момент не существут. Литературные данные зачастую разнятся или противоречат друг другу. Особенностью данной диссертационной работы является то, что для изучения реакций пероксидации был применен метод активированной хемилюминесценции, позволяющий регистрировать кинетику образования липидных радикалов. В результате проведенного исследования было установлено, что в основе процесса пероксидации липидов лежат две химических реакции: разложение гидропероксидов липидов и липопероксидация под действием пероксида водорода. Важным аспектом исследования представляется то, что реакции пероксидации липидов были изучены в различных средах. Отдельно стоит отметить, что комплекс цитохрома c с кардиолипином удалось получить в виде раствора в неполярном органическом растворителе. Это может дать начало новому подходу в исследовании структуры и функций комплекса цитохрома c с анионными липидами. Изучение роли процесса пероксидации в апоптозе также позволило сделать ряд важных наблюдений и выводов. Основным из них стоит считать участие реакций пероксидации кардиолипина митохондриальных мембран под действием цитохрома c в биосинтезе окисленных жирных кислот, способных 160 исполнять роль липидных медиаторов воспаления. Удалось также показать, что такой путь биосинтеза реализуется при развитии церебральной ишемии, вызванной остановкой сердца с последующей реанимацией, и при паркинсонизме. Другим важным результатом исследования стоит назвать установление роли пероксидации фосфатидилсерина цитоплазматических мембран: было показано, что окисленный фосфатидилсерин представляет собой гораздо более эффективный сигнал «съешь меня» для фагоцитов по сравнению с неокисленным. Таким образом, данная диссертационная работа раскрывает механизм пероксидации липидов мембран под действием цитохрома c и его комплекса с анионными липидами и уточняет роль этого процесса в апоптозе. 161 6. Выводы 1. Методом активированной хемилюминесценции было показано, что пероксидация липидов под действием цитохрома c и его комплекса с анионными липидами реализуется в результате протекания двух реакций: реакции разложения гидропероксидов липидов и липопероксидации под действием пероксида водорода. Предложены воможные схемы этих двух реакций. 2. Впервые был получен комплекс цитохрома c с кардиолипином в виде раствора в неполярном растворителе. Соотношение липид:белок в комплексе было найдено равным 77±11. 3. Методом хроматографического спектрометрического разделения определения было липидов показано, и их что массреакции пероксидации кардиолипина под действием цитохрома c не только приводят к инициации апоптоза, нарушая целостность митохондриальной мембраны, но и могут сопровождаться последующими реакциями гидролиза окисленных жирных кислот Ca2+-независимыми фосфолипазами, что приводит к образованию окисленных жирных кислот, исполняющих роль липидных медиаторов воспаления. 4. Методом ВЭЖХ-МС было показано, что реакции пероксидации кардиолипина, катализируемые комплексом Цит-КЛ, приводят к биосинтезу окисленных жирных кислот, исполняющих роль липидных медиаторов воспаления, при церебральной ишемии, вызванной остановкой сердца с последующей реанимацией; показана эффективность применения селективного ингибитора пероксидации кардиолипина, вещества XJB. 5. Методом ВЭЖХ-МС было показано, что реакции пероксидации кардиолипина, катализируемые комплексом Цит-КЛ, приводят к биосинтезу окисленных жирных кислот, исполняющих роль липидных медиаторов воспаления, при болезни Паркинсона. 6. Установлено, что про-фагоцитарная активность окисленного фосфатидилсерина примерно в 50 раз выше, чем для неокисленного ФС. 162 7. Список цитируемой литературы 1. Kerr R. O., Cardamone J., Dalmasso A. P., Kaplan M. E. Two mechanisms of erythrocyte destruction in penicillin-induced hemolytic anemia // N Engl J Med. ‒ 1972. ‒ T. 287, № 26. ‒ C. 1322-5. 2. Kerr J. F., Winterford C. M., Harmon B. V. Apoptosis - its significance in cancer and cancer-therapy // Cancer. ‒ 1994. ‒ T. 73, № 8. ‒ C. 2013-2026. 3. Ameisen J. C., Capron A. Cell dysfunction and depletion in AIDS - the programmed cell-death hypothesis // Immunology Today. ‒ 1991. ‒ T. 12, № 4. ‒ C. 102-105. 4. Kerr J. F., Wyllie A. H., Currie A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics // Br J Cancer. ‒ 1972. ‒ T. 26, № 4. ‒ C. 239-57. 5. Debatin K. M., Fahrigfaissner A., Enenkelstoodt S., Kreuz W., Benner A., Krammer P. High expression of APO-1 (CD95) on T lymphocytes from human immunodeficiency virus-1-infected children // Blood. ‒ 1994. ‒ T. 83, № 10. ‒ C. 3101-3103. 6. Landfield P. W., Thibault O., Mazzanti M. L., Porter N. M., Kerr D. S. Mechanisms of neuronal death in brain aging and Alzheimer's disease - role of endocrine-mediated calcium dyshomeostasis // Journal of Neurobiology. ‒ 1992. ‒ T. 23, № 9. ‒ C. 12471260. 7. Walkinshaw G., Waters C. M. Induction of apoptosis in catecholaminergic PC12 cells by L-DOPA. Implications for the treatment of Parkinson's disease // Journal of Clinical Investigation. ‒ 1995. ‒ T. 95, № 6. ‒ C. 2458-2464. 8. Han F., Da T., Riobo N. A., Becker L. B. Early mitochondrial dysfunction in electron transfer activity and reactive oxygen species generation after cardiac arrest // Critical care medicine. ‒ 2008. ‒ T. 36, № 11 Suppl. ‒ C. S447-53. 9. Santos M. S., Moreno A. J., Carvalho A. P. Relationships between ATP depletion, membrane potential, and the release of neurotransmitters in rat nerve terminals. An in vitro study under conditions that mimic anoxia, hypoglycemia, and ischemia // Stroke; a journal of cerebral circulation. ‒ 1996. ‒ T. 27, № 5. ‒ C. 941-50. 10. Apoptosis and Autoimmune Disorders, Autoimmune Diseases - Contributing Factors, Specific Cases of Autoimmune Diseases, and Stem Cell and Other Therapies. / Halaby R., 2012. 11. Zhivotovsky B., Orrenius S., Brustugun O. T., Døskeland S. O. Injected cytochrome c induces apoptosis // Nature. ‒ 1998. ‒ T. 391, № 6666. ‒ C. 449-50. 163 12. Skulachev V. P. Cytochrome c in the apoptotic and antioxidant cascades // FEBS Lett. ‒ 1998. ‒ T. 423, № 3. ‒ C. 275-80. 13. Владимиров Ю. А., Проскурнина Е. В., Измайлов Д. Ю., Новиков А. А., Брусничкин А. В., Осипов А. Н., Каган В. Е. Механизм активации пероксидазной активности цитохрома с кардиолипином // Биохимия. ‒ 2006. ‒ T. 91, № 9. ‒ C. 1215-1224. 14. Belikova N. A., Vladimirov Y. A., Osipov A. N., Kapralov A. A., Tyurin V. A., Potapovich M. V., Basova L. V., Peterson J., Kurnikov I. V., Kagan V. E. Peroxidase activity and structural transitions of cytochrome c bound to cardiolipin-containing membranes // Biochemistry. ‒ 2006. ‒ T. 45, № 15. ‒ C. 4998-5009. 15. Skulachev V. P. Why are mitochondria involved in apoptosis? Permeability transition pores and apoptosis as selective mechanisms to eliminate superoxideproducing mitochondria and cell // FEBS Lett. ‒ 1996. ‒ T. 397, № 1. ‒ C. 7-10. 16. Skulachev V. P. How proapoptotic proteins can escape from mitochondria? // Free Radic Biol Med. ‒ 2000. ‒ T. 29, № 10. ‒ C. 1056-9. 17. Владимиров Ю.А. Нарушение барьерных свойств внутренней и наружной мембран митохондрий, некроз и апоптоз // Биологические мембраны, 2002. ‒ C. 355-377. 18. Bröker L. E., Kruyt F. A., Giaccone G. Cell death independent of caspases: a review // Clin Cancer Res. ‒ 2005. ‒ T. 11, № 9. ‒ C. 3155-62. 19. Yuan J., Kroemer G. Alternative cell death mechanisms in development and beyond // Genes Dev. ‒ 2010. ‒ T. 24, № 23. ‒ C. 2592-602. 20. Манских В. Н. Пути гибели клетки и их биологическое значение // Цитология. ‒ 2007. ‒ T. 49, № 11. ‒ C. 909-915. 21. Онищенко Г. Е. Варианты программированной гибели клеток // Book Варианты программированной гибели клеток / Editor. ‒ МГУ им. М.В.Ломоносова, Москва 2005. 22. Фосфоглив: механизм действия и применение в клинике. / Ипатова О. М. ‒ Москва, 2005. ‒ 318 с. 23. Krysko D. V., Vanden Berghe T., D'Herde K., Vandenabeele P. Apoptosis and necrosis: detection, discrimination and phagocytosis // Methods. ‒ 2008. ‒ T. 44, № 3. ‒ C. 205-21. 24. Abud H. E. Shaping developing tissues by apoptosis // Cell Death Differ. ‒ 2004. ‒ T. 11, № 8. ‒ C. 797-9. 164 25. Helewski K. J., Kowalczyk-Ziomek G. I., Konecki J. Apoptosis and necrosis--two different ways leading to the same target // Wiad Lek. ‒ 2006. ‒ T. 59, № 9-10. ‒ C. 679-684. 26. Criddle D. N., Gerasimenko J. V., Baumgartner H. K., Jaffar M., Voronina S., Sutton R., Petersen O. H., Gerasimenko O. V. Calcium signalling and pancreatic cell death: apoptosis or necrosis? // Cell Death Differ. ‒ 2007. ‒ T. 14, № 7. ‒ C. 1285-94. 27. Saraste A., Pulkki K. Morphologic and biochemical hallmarks of apoptosis // Cardiovasc Res. ‒ 2000. ‒ T. 45, № 3. ‒ C. 528-37. 28. Ueda N., Shah S. V. Tubular cell damage in acute renal failure-apoptosis, necrosis, or both // Nephrol Dial Transplant. ‒ 2000. ‒ T. 15, № 3. ‒ C. 318-23. 29. Ziegler U., Groscurth P. Morphological features of cell death // News Physiol Sci. ‒ 2004. ‒ T. 19. ‒ C. 124-8. 30. Методы исследования программируемой клеточной гибели. Учебнометодическое пособие по курсу «Теория апоптоза». / Скибо Ю. В., Абрамова З. И. ‒ Казань, 2011. Учебно-методическое пособие по курсу «Теория апоптоза». ‒ 61 с. 31. Alam M. N., Bristi N. J., Rafiquzzaman M. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity // Saudi Pharm J. ‒ 2013. ‒ T. 21, № 2. ‒ C. 143-52. 32. Putcha G. V., Harris C. A., Moulder K. L., Easton R. M., Thompson C. B., Johnson E. M. Intrinsic and extrinsic pathway signaling during neuronal apoptosis: lessons from the analysis of mutant mice // J Cell Biol. ‒ 2002. ‒ T. 157, № 3. ‒ C. 441-53. 33. Dabbagh A., Rajaei S. The role of anesthetic drugs in liver apoptosis // Hepat Mon. ‒ 2013. ‒ T. 13, № 8. ‒ C. e13162. 34. Иммунологические проблемы апоптоза. / Барышников А. Ю., Шишкин Ю. В. ‒ Москва: Эдиториал УРСС, 2002. ‒ 320 с. 35. Mahmood Z., Shukla Y. Death receptors: targets for cancer therapy // Exp Cell Res. ‒ 2010. ‒ T. 316, № 6. ‒ C. 887-99. 36. Zou H., Henzel W. J., Liu X., Lutschg A., Wang X. Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3 // Cell. ‒ 1997. ‒ T. 90, № 3. ‒ C. 405-13. 37. Schulze-Osthoff K., Ferrari D., Los M., Wesselborg S., Peter M. E. Apoptosis signaling by death receptors // Eur J Biochem. ‒ 1998. ‒ T. 254, № 3. ‒ C. 439-59. 38. Клетки. / Льюин Б.: Бином. Лаборатория знаний, 2011. ‒ 952 с. 165 39. Коркина Л. Г., Брагин Е. О., Сороковой В. И., Владимиров Ю. А. Изучение динамики транспорта ионов Ca(2+) в митохондриях и срезах печени крыс при аноксии с помощью флуоресцентного зонда // Биофизика мембран. ‒ 1973. ‒ T. 18. ‒ C. 258-263. 40. Ott M., Robertson J. D., Gogvadze V., Zhivotovsky B., Orrenius S. Cytochrome c release from mitochondria proceeds by a two-step process // Proc Natl Acad Sci U S A. ‒ 2002. ‒ T. 99, № 3. ‒ C. 1259-63. 41. Брагин Е. О., Сороковой В. И., Коган Э. М., Владимиров Ю. А. Роль ионов кальция в аноксическом повреждении окислительного фосфорилирования в митохондриях // Вопросы мед. химии. ‒ 1975. ‒ T. 2. ‒ C. 150-154. 42. Брагин Е. О., Дергунов A. B., Неугодова Г. Л., Сороковой В. И., Владимиров Ю. А. Роль фосфолипазы А2 в аноксическом повреждении энергозависимых функций митохондрий // Вопр. мед. химии. ‒ 1977. ‒ T. 5. ‒ C. 673 - 677. 43. Korkina L. G., Sorokovoy V. I., Vladimirov Y. A. Accumulation of Ca2+ in mitochondrial membranes and Ca2+-induced membrane damage studied with chlorotetracycline as a fluorescent probe // Studia Biophysica. ‒ 1973. ‒ T. 3. ‒ C. 177-192. 44. Hunter D. R., Haworth R. A. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms // Arch Biochem Biophys. ‒ 1979. ‒ T. 195, № 2. ‒ C. 453-9. 45. Hunter D. R., Haworth R. A. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. III. Transitional Ca2+ release // Arch Biochem Biophys. ‒ 1979. ‒ T. 195, № 2. ‒ C. 468-77. 46. Hunter D. R., Haworth R. A., Southard J. H. Relationship between configuration, function, and permeability in calcium-treated mitochondria // J Biol Chem. ‒ 1976. ‒ T. 251, № 16. ‒ C. 5069-77. 47. Hunter F. E., Weinstein J., Scott A. A., Schneider A. K. The effect of phosphate on glutathione induced lipid peroxidation and swelling in rat liver mitochondria // Biochem Biophys Res Commun. ‒ 1963. ‒ T. 11. ‒ C. 456-60. 48. Rytomaa M., Mustonen P., Kinnunen P. K. Reversible, nonionic, and pHdependent association of cytochrome c with cardiolipin-phosphatidylcholine liposomes // J Biol Chem. ‒ 1992. ‒ T. 267, № 31. ‒ C. 22243-8. 49. Scott A. A., Hunter F. E., Jr. Role of cytochrome C in glutathione induced swelling and lipid peroxidation in liver mitochondria // Biochem Biophys Res Commun. ‒ 1963. ‒ T. 11. ‒ C. 461-5. 166 50. Vladimirov Y. A., Olenev V. I., Suslova T. B., Cheremisina Z. P. Lipid peroxidation in mitochondrial membrane // Adv Lipid Res. ‒ 1980. ‒ T. 17. ‒ C. 173249. 51. Ostrander D. B., Sparagna G. C., Amoscato A. A., McMillin J. B., Dowhan W. Decreased cardiolipin synthesis corresponds with cytochrome c release in palmitateinduced cardiomyocyte apoptosis // J Biol Chem. ‒ 2001. ‒ T. 276, № 41. ‒ C. 380617. 52. Petrosillo G., Ruggiero F. M., Pistolese M., Paradies G. Reactive oxygen species generated from the mitochondrial electron transport chain induce cytochrome c dissociation from beef-heart submitochondrial particles via cardiolipin peroxidation. Possible role in the apoptosis // FEBS Lett. ‒ 2001. ‒ T. 509, № 3. ‒ C. 435-8. 53. Petrosillo G., Ruggiero F. M., Paradies G. Role of reactive oxygen species and cardiolipin in the release of cytochrome c from mitochondria // FASEB J. ‒ 2003. ‒ T. 17, № 15. ‒ C. 2202-8. 54. Kagan V. E., Borisenko G. G., Tyurina Y. Y., Tyurin V. A., Jiang J., Potapovich A. I., Kini V., Amoscato A. A., Fujii Y. Oxidative lipidomics of apoptosis: redox catalytic interactions of cytochrome c with cardiolipin and phosphatidylserine // Free Radic Biol Med. ‒ 2004. ‒ T. 37, № 12. ‒ C. 1963-85. 55. Belikova N. A., Jiang J., Tyurina Y. Y., Zhao Q., Epperly M. W., Greenberger J., Kagan V. E. Cardiolipin-specific peroxidase reactions of cytochrome C in mitochondria during irradiation-induced apoptosis // Int J Radiat Oncol Biol Phys. ‒ 2007. ‒ T. 69, № 1. ‒ C. 176-86. 56. Kagan V. E., Tyurin V. A., Jiang J., Tyurina Y. Y., Ritov V. B., Amoscato A. A., Osipov A. N., Belikova N. A., Kapralov A. A., Kini V., Vlasova, II, Zhao Q., Zou M., Di P., Svistunenko D. A., Kurnikov I. V., Borisenko G. G. Cytochrome c acts as a cardiolipin oxygenase required for release of proapoptotic factors // Nat Chem Biol. ‒ 2005. ‒ T. 1, № 4. ‒ C. 223-32. 57. Strasser A., O'Connor L., Dixit V. M. Apoptosis signaling // Annu Rev Biochem. ‒ 2000. ‒ T. 69. ‒ C. 217-45. 58. Desagher S., Martinou J. C. Mitochondria as the central control point of apoptosis // Trends Cell Biol. ‒ 2000. ‒ T. 10. ‒ C. 369-377. 59. Antonsson B., Conti F., Ciavatta A., Montessuit S., Lewis S., Martinou I., Bernasconi L., Bernard A., Mermod J. J., Mazzei G., Maundrell K., Gambale F., Sadoul R., Martinou J. C. Inhibition of Bax channel-forming activity by Bcl-2 // Science. ‒ 1997. ‒ T. 277, № 5324. ‒ C. 370-2. 167 60. Shimizu S., Narita M., Tsujimoto Y. Bcl-2 family proteins regulate the release of apoptogenic cytochrome c by the mitochondrial channel VDAC // Nature. ‒ 1999. ‒ T. 399, № 6735. ‒ C. 483-7. 61. Salvioli S., Bonafe M., Capri M., Monti D., Franceschi C. Mitochondria, aging and longevity--a new perspective // FEBS Lett. ‒ 2001. ‒ T. 492, № 1-2. ‒ C. 9-13. 62. Alberts B. The promise of cancer research // Science. ‒ 2008. ‒ T. 320, № 5872. ‒ C. 19. 63. Самуилов В. Д., Олескин А. В., Лагунова Е. М. Программируемая клеточная смерть // Биохимия. ‒ 2000. ‒ T. 65, № 8. ‒ C. 1029-1046. 64. Гордеева А. В., Звягильская Р. А., Лабас Ю. А. Апоптоз одноклеточных организмов: механизмы и эволюция // Биохимия. ‒ 2004. ‒ T. 69. ‒ C. 1301-1313. 65. Апоптоз и его молекулярные эффекторы. / Сербин М. Е., Щербак Е. В. ‒ Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии: Сборник: Томск: Сибирский государственный медицинский университет, 2004. 66. Williamson P., Schlegel R. A. Transbilayer phospholipid movement and the clearance of apoptotic cells // Biochim Biophys Acta. ‒ 2002. ‒ T. 1585, № 2-3. ‒ C. 53-63. 67. Fadok V. A., Voelker D. R., Campbell P. A., Cohen J. J., Bratton D. L., Henson P. M. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages // J Immunol. ‒ 1992. ‒ T. 148, № 7. ‒ C. 2207-16. 68. Fadok V. A., Bratton D. L., Rose D. M., Pearson A., Ezekewitz R. A., Henson P. M. A receptor for phosphatidylserine-specific clearance of apoptotic cells // Nature. ‒ 2000. ‒ T. 405, № 6782. ‒ C. 85-90. 69. Arur S., Uche U. E., Rezaul K., Fong M., Scranton V., Cowan A. E., Mohler W., Han D. K. Annexin I is an endogenous ligand that mediates apoptotic cell engulfment // Dev Cell. ‒ 2003. ‒ T. 4, № 4. ‒ C. 587-98. 70. Shimaoka T., Kume N., Minami M., Hayashida K., Kataoka H., Kita T., Yonehara S. Molecular cloning of a novel scavenger receptor for oxidized low density lipoprotein, SR-PSOX, on macrophages // J Biol Chem. ‒ 2000. ‒ T. 275, № 52. ‒ C. 40663-6. 71. Greenberg M. E., Sun M., Zhang R., Febbraio M., Silverstein R., Hazen S. L. Oxidized phosphatidylserine-CD36 interactions play an essential role in macrophagedependent phagocytosis of apoptotic cells // J Exp Med. ‒ 2006. ‒ T. 203, № 12. ‒ C. 2613-25. 168 72. Frasch S. C., Fernandez-Boyanapalli R. F., Berry K. Z., Leslie C. C., Bonventre J. V., Murphy R. C., Henson P. M., Bratton D. L. Signaling via macrophage G2A enhances efferocytosis of dying neutrophils by augmentation of Rac activity // J Biol Chem. ‒ 2011. ‒ T. 286, № 14. ‒ C. 12108-22. 73. Frasch S. C., Bratton D. L. Emerging roles for lysophosphatidylserine in resolution of inflammation // Prog Lipid Res. ‒ 2012. ‒ T. 51, № 3. ‒ C. 199-207. 74. Dillon S. R., Mancini M., Rosen A., Schlissel M. S. Annexin V binds to viable B cells and colocalizes with a marker of lipid rafts upon B cell receptor activation // J Immunol. ‒ 2000. ‒ T. 164, № 3. ‒ C. 1322-32. 75. Borisenko G. G., Matsura T., Liu S. X., Tyurin V. A., Jianfei J., Serinkan F. B., Kagan V. E. Macrophage recognition of externalized phosphatidylserine and phagocytosis of apoptotic Jurkat cells--existence of a threshold // Arch Biochem Biophys. ‒ 2003. ‒ T. 413, № 1. ‒ C. 41-52. 76. Elliott M. R., Ravichandran K. S. Clearance of apoptotic cells: implications in health and disease // J Cell Biol. ‒ 2010. ‒ T. 189, № 7. ‒ C. 1059-70. 77. Liu J., Chakraborty S., Hosseinzadeh P., Yu Y., Tian S., Petrik I., Bhagi A., Lu Y. Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers // Chem Rev. ‒ 2014. ‒ T. 114, № 8. ‒ C. 4366-469. 78. The Biochemistry of Bacterial Cytochromes. / Yamanaka T.: Springer, 1992. ‒ 251 с. 79. Cusanovich M. A., Hazzard J. T., Meyer T. E., Tollin G. Intramolecular and intracomplex electron transfer in redox proteins // Prog Clin Biol Res. ‒ 1988. ‒ T. 274. ‒ C. 401-18. 80. Winkler J. R., Robertson P. B. Periodontal disease associated with HIV infection // Oral Surg Oral Med Oral Pathol. ‒ 1992. ‒ T. 73, № 2. ‒ C. 145-50. 81. Structural studies of eukaryotic cytochromes c. / Brayer G. D., Murphy M. P.: A multidisciplinary approach. Sausalito, California: University Science Books, 1996. 82. Cytochrome c: A Multidisciplinary Approach. / Meyer T. E.: Univ. Sci. Books, Mill Valley, CA, 1996. 83. Cytochromes c: Evolutionary, Structural, and Physicochemical Aspects. / Moore G. R., Pettigrew G. W.: Springer-Verlag: New York, 1990. 84. Kleingardner J. G., Bren K. L. Comparing substrate specificity between cytochrome c maturation and cytochrome c heme lyase systems for cytochrome c biogenesis // Metallomics. ‒ 2011. ‒ T. 3, № 4. ‒ C. 396-403. 169 85. Tuominen E. K. Phospholipid-Cytochrome c Interactions; University of Helsinki, 2011. ‒ 49 c. 86. Caffrey M. S., Cusanovich M. A. Site-specific mutagenesis studies of cytochromes c // Biochim Biophys Acta. ‒ 1994. ‒ T. 1187, № 3. ‒ C. 277-88. 87. Vladimirov Y. A., Proskurnina E. V., Izmailov D. Y., Novikov A. A., Brusnichkin A. V., Osipov A. N., Kagan V. E. Cardiolipin activates cytochrome c peroxidase activity since it facilitates H(2)O(2) access to heme // Biochemistry (Mosc). ‒ 2006. ‒ T. 71, № 9. ‒ C. 998-1005. 88. Биологическая химия. Биологическая химия. / Николаев А. Я.; Под ред. Николаев А. Я. ‒ 3 изд.: Медицинское Информационное Агентство, 2004. Биологическая химия. ‒ 566 с. 89. Brunori M. Control of electron transfer in metalloproteins // Biosensors & Bioelectronics. ‒ 1994. ‒ T. 9, № 9-10. ‒ C. 633-636. 90. McCord J. M., Fridovic I. The reduction of cytochrome c by milk xantine oxidase // Journal of Biological Chemistry. ‒ 1968. ‒ T. 243, № 21. ‒ C. 5753-5760. 91. Azzi A., Montecucco C., Richter C. Use of acetilated ferricytochrome C for detection of superoxide radicals produced in biological membraned // Biochemical and Biophysical Research Communications. ‒ 1975. ‒ T. 65, № 2. ‒ C. 597-603. 92. Pereverzev M. O., Vygodina T. V., Konstantinov A. A., Skulachev V. P. Cytochrome c, an ideal antioxidant // Biochemical Society Transactions. ‒ 2003. ‒ T. 31. ‒ C. 1312-1315. 93. Kozlov A. V., Yegorov D. Y., Vladimirov Y. A., Azizova O. A. Intracellular free iron in liver-tissue and liver homogenate - studies with electron-paramagnetic resonance on the formation of paramagnetic-complexes with desferal and nitric-oxide // Free Radical Biology and Medicine. ‒ 1992. ‒ T. 13, № 1. ‒ C. 9-16. 94. Barr D. P., Gunther M. R., Deterding L. J., Tomer K. B., Mason R. P. ESR spintrapping of a protein-derived tyrosyl radical from the reaction of cytochrome c with hydrogen peroxide // Journal of Biological Chemistry. ‒ 1996. ‒ T. 271, № 26. ‒ C. 15498-15503. 95. Deterding L. J., Barr D. P., Mason R. P., Tomer K. B. Characterization of cytochrome c free radical reactions with peptides by mass spectrometry // Journal of Biological Chemistry. ‒ 1998. ‒ T. 273, № 21. ‒ C. 12863-12869. 96. Qian S. Y., Chen Y. R., Deterding L. J., Fann Y. C., Chignell C. F., Tomer K. B., Mason R. P. Identification of protein-derived tyrosyl radical in the reaction of 170 cytochrome c and hydrogen peroxide: characterization by ESR spin-trapping, HPLC and MS // Biochemical Journal. ‒ 2002. ‒ T. 363. ‒ C. 281-288. 97. Chen Y. R., Chen C. L., Chen W. G., Zweier J. L., Augusto O., Radi R., Mason R. P. Formation of protein tyrosine ortho-semiquinone radical and nitrotyrosine from cytochrome c-derived tyrosyl radical // Journal of Biological Chemistry. ‒ 2004. ‒ T. 279, № 17. ‒ C. 18054-18062. 98. McMillin J. B., Dowhan W. Cardiolipin and apoptosis // Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology of Lipids. ‒ 2002. ‒ T. 1585, № 2-3. ‒ C. 97-107. 99. Simopoulos A. P. The importance of the ratio of omega-6/omega-3 essential fatty acids // Biomedicine & Pharmacotherapy. ‒ 2002. ‒ T. 56, № 8. ‒ C. 365-379. 100. Gonzalvez F., Gottlie E. Cardiolipin: setting the beat of apoptosis // Apoptosis. ‒ 2007. ‒ T. 12. ‒ C. 877-885. 101. Iverson S. L., Orrenius S. The cardiolipin-cytochrome c interaction and the mitochondrial regulation of apoptosis // Arch Biochem Biophys. ‒ 2004. ‒ T. 423, № 1. ‒ C. 37-46. 102. Zhang M., Mileykovskaya E., Dowhan W. Gluing the respiratory chain together Cardiolipin is required for supercomplex formation in the inner mitochondrial membrane // Journal of Biological Chemistry. ‒ 2002. ‒ T. 277, № 46. ‒ C. 4355343556. 103. Schagger H. Respiratory chain supercomplexes of mitochondria and bacteria // Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. ‒ 2002. ‒ T. 1555, № 1-3. ‒ C. 154159. 104. Gomez B., Robinson N. C. Phospholipase digestion of bound cardiolipin reversibly inactivates bovine cytochrome bc(1) // Biochemistry. ‒ 1999. ‒ T. 38, № 28. ‒ C. 9031-9038. 105. Brown L. R., Wüthrich K. A spin label study of lipid oxidation catalyzed by heme proteins // Biochim Biophys Acta. ‒ 1977. ‒ T. 464, № 2. ‒ C. 356-69. 106. Brown L. R., Wüthrich K. NMR and ESR studies of the interactions of cytochrome c with mixed cardiolipin-phosphatidylcholine vesicles // Biochim Biophys Acta. ‒ 1977. ‒ T. 468, № 3. ‒ C. 389-410. 107. Rytomaa M., Kinnunen P. K. Dissociation of cytochrome c from liposomes by histone H1. Comparison with basic peptides // Biochemistry. ‒ 1996. ‒ T. 35, № 14. ‒ C. 4529-39. 171 108. Rytomaa M., Kinnunen P. K. Reversibility of the binding of cytochrome c to liposomes. Implications for lipid-protein interactions // J Biol Chem. ‒ 1995. ‒ T. 270, № 7. ‒ C. 3197-202. 109. Rytomaa M., Kinnunen P. K. Evidence for two distinct acidic phospholipidbinding sites in cytochrome c // J Biol Chem. ‒ 1994. ‒ T. 269, № 3. ‒ C. 1770-4. 110. Jutila A., Rytomaa M., Kinnunen P. K. Detachment of cytochrome c by cationic drugs from membranes containing acidic phospholipids: comparison of lidocaine, propranolol, and gentamycin // Mol Pharmacol. ‒ 1998. ‒ T. 54, № 4. ‒ C. 722-32. 111. Cortese J. D., Voglino A. L., Hackenbrock C. R. Multiple conformations of physiological membrane-bound cytochrome c // Biochemistry. ‒ 1998. ‒ T. 37, № 18. ‒ C. 6402-9. 112. Pinheiro T. J., Elove G. A., Watts A., Roder H. Structural and kinetic description of cytochrome c unfolding induced by the interaction with lipid vesicles // Biochemistry. ‒ 1997. ‒ T. 36, № 42. ‒ C. 13122-32. 113. Choi S., Swanson J. M. Interaction of cytochrome c with cardiolipin: an infrared spectroscopic study // Biophys Chem. ‒ 1995. ‒ T. 54, № 3. ‒ C. 271-8. 114. Vladimirov Y. A., Proskurnina E. V., Izmailov D. Y., Novikov A. A., Brusnichkin A. V., Osipov A. N., Kagan V. E. Mechanism of activation of cytochrome C peroxidase activity by cardiolipin // Biochemistry (Mosc). ‒ 2006. ‒ T. 71, № 9. ‒ C. 989-97. 115. Tuominen E. K., Wallace C. J., Kinnunen P. K. Phospholipid-cytochrome c interaction: evidence for the extended lipid anchorage // The Journal of biological chemistry. ‒ 2002. ‒ T. 277, № 11. ‒ C. 8822-6. 116. Sinibaldi F., Fiorucci L., Patriarca A., Lauceri R., Ferri T., Coletta M., Santucci R. Insights into cytochrome c-cardiolipin interaction. Role played by ionic strength // Biochemistry. ‒ 2008. ‒ T. 47, № 26. ‒ C. 6928-35. 117. Kostrzewa A., Pali T., Froncisz W., Marsh D. Membrane location of spin-labeled cytochrome c determined by paramagnetic relaxation agents // Biochemistry. ‒ 2000. ‒ T. 39, № 20. ‒ C. 6066-74. 118. Kawai C., Prado F. M., Nunes G. L., Di Mascio P., Carmona-Ribeiro A. M., Nantes I. L. pH-Dependent interaction of cytochrome c with mitochondrial mimetic membranes: the role of an array of positively charged amino acids // The Journal of biological chemistry. ‒ 2005. ‒ T. 280, № 41. ‒ C. 34709-17. 119. Sinibaldi F., Howes B. D., Piro M. C., Polticelli F., Bombelli C., Ferri T., Coletta M., Smulevich G., Santucci R. Extended cardiolipin anchorage to cytochrome c: a 172 model for protein-mitochondrial membrane binding // Journal of biological inorganic chemistry : JBIC : a publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. ‒ 2010. ‒ T. 15, № 5. ‒ C. 689-700. 120. Stepanov G., Gnedenko O., Mol'nar A., Ivanov A., Vladimirov Y., Osipov A. Evaluation of cytochrome c affinity to anionic phospholipids by means of surface plasmon resonance // FEBS Lett. ‒ 2009. ‒ T. 583, № 1. ‒ C. 97-100. 121. Nantes I. L., Zucchi M. R., Nascimento O. R., Faljoni-Alario A. Effect of heme iron valence state on the conformation of cytochrome c and its association with membrane interfaces. A CD and EPR investigation // J Biol Chem. ‒ 2001. ‒ T. 276, № 1. ‒ C. 153-8. 122. Heimburg T., Marsh D. Investigation of secondary and tertiary structural changes of cytochrome c in complexes with anionic lipids using amide hydrogen exchange measurements: an FTIR study // Biophys J. ‒ 1993. ‒ T. 65, № 6. ‒ C. 2408-17. 123. Bernad S., Oellerich S., Soulimane T., Noinville S., Baron M. H., Paternostre M., Lecomte S. Interaction of horse heart and thermus thermophilus type c cytochromes with phospholipid vesicles and hydrophobic surfaces // Biophys J. ‒ 2004. ‒ T. 86, № 6. ‒ C. 3863-72. 124. Газарян И. Г., Хушпульян Д. М., Тишков В. И. Особенности структуры и механизма действия пероксидаз растений // Успехи биологической химии. ‒ 2006. ‒ T. 46. ‒ C. 303-322. 125. Фермент пероксидаза. / Андреева В. А.: Наука, 1988. ‒ 128 с. 126. Furtmuller P. G., Jantschko W., Zederbauer M., Jakopitsch C., Arnhold J., Obinger C. Kinetics of interconversion of redox intermediates of lactoperoxidase, eosinophil peroxidase and myeloperoxidase // Jpn J Infect Dis. ‒ 2004. ‒ T. 57, № 5. ‒ C. S30-1. 127. Chance B. The kinetics of the enzyme-substrate compound of peroxidase // Journal of Biological Chemistry. ‒ 1943. ‒ T. 151, № 2. ‒ C. 553-577. 128. Siegel B. Z., Galston A. W. The isoperoxidases of Pisum sativum // Plant Physiol. ‒ 1967. ‒ T. 42, № 2. ‒ C. 221-6. 129. Shannon L. M., Kay E., Lew J. Y. Peroxidase isozymes from horseradish roots. I. Isolation and physical properties // J Biol Chem. ‒ 1966. ‒ T. 241, № 9. ‒ C. 2166-72. 130. Иванова Т. М., Рубин Б. А. О природе фенолксидазного действия пероксидазы // Биохимия. ‒ 1962. ‒ T. 27, № 4. ‒ C. 622-630. 173 131. Пейве Я. В., Иванова Н. Н., Овчаренко Г. А., Ширинская М. Г. О возможном участии пероксидазы в восстановлении нитратов в растениях // Физиология растений. ‒ 1975. ‒ T. 22, № 3. ‒ C. 527-536. 132. Klapper M. H., Hackett D. P. The oxidatic activity of horseradish peroxidase. I. Oxidation of hydro- and naphthohydroquinones // J Biol Chem. ‒ 1963. ‒ T. 238. ‒ C. 3736-42. 133. Klapper M. H., Hackett D. P. The oxidatic activity of horseradish peroxidase. II. Participation of ferroperoxidase // J Biol Chem. ‒ 1963. ‒ T. 238. ‒ C. 3743-9. 134. Paul K. G., Stigbrand T. Four isoperoxidases from horseradish root // Acta chem. scand. ‒ 1970. ‒ T. 24, № 10. ‒ C. 3607-3617. 135. Титов А. Ф. Изопероксидазы растений // Успехи современной биологии. ‒ 1975. ‒ T. 80, № 1. ‒ C. 102-115. 136. Passardi F., Theiler G., Zamocky M., Cosio C., Rouhier N., Teixera F., MargisPinheiro M., Ioannidis V., Penel C., Falquet L., Dunand C. PeroxiBase: the peroxidase database // Phytochemistry. ‒ 2007. ‒ T. 68, № 12. ‒ C. 1605-11. 137. Арнхольд Ю. Свойства, функции и секреция миелопероксидазы человека // Биохимия. ‒ 2004. ‒ T. 69, № 1. ‒ C. 8-15. 138. Klebanoff S. J. Myeloperoxidase: friend and foe // J Leukoc Biol. ‒ 2005. ‒ T. 77, № 5. ‒ C. 598-625. 139. Andrews P. C., Parens C., Krinsky N. I. Comparison of myeloperoxidase an hemi-myeloperoxidase with respect to catalysis, regulation, and bactericidal activity // Arch. Biochem. Biophys. ‒ 1984. ‒ T. 228, № 2. ‒ C. 439-442. 140. Абатуров А. Е. Антимикробные энзимы системы неспецифической защиты респираторного тракта // Здоровье ребенка. ‒ 2009. ‒ T. 3, № 18. ‒ C. 122-125. 141. Taurog A., Tong W., Chaikoff I. L. Iodine metabolism of rat thyroids after hypophysectomy // Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. ‒ 1956. ‒ T. 16, № 7. ‒ C. 982-982. 142. Helliwell R. J. A., Adams L. F., Mitchell M. D. Prostaglandin synthases: recent developments and a novel hypothesis // Prostaglandins Leukotrienes and Essential Fatty Acids. ‒ 2004. ‒ T. 70, № 2. ‒ C. 101-113. 143. Muller F. L., Lustgarten M. S., Jang Y., Richardson A., Van Remmen H. Trends in oxidative aging theories // Free Radical Biology and Medicine. ‒ 2007. ‒ T. 43, № 4. ‒ C. 477-503. 144. Iwase H., Sakurada K., Ikegaya H., Hatanaka K., Takeichi H., Kobayashi M., Yoshida K. Thiol-oxidizing agent diamide and acidic pH enhance lipid peroxidation of 174 rat heart mitochondria and cardiolipin-cytochrome c complex // Iubmb Life. ‒ 2001. ‒ T. 51, № 1. ‒ C. 39-43. 145. Letellier L., Shechter E. Correlations between structure and spectroscopic properties in membrane model system. Fluorescence and circular dichroism of the cytochrome c-cardiolipin system // Eur J Biochem. ‒ 1973. ‒ T. 40, № 2. ‒ C. 507-12. 146. Taler G., Schejter A., Navon G., Vig I., Margoliash E. The nature of the thermal equilibrium affecting the iron coordination of ferric cytochrome c // Biochemistry. ‒ 1995. ‒ T. 34, № 43. ‒ C. 14209-12. 147. Aviram I., Myer Y. P., Schejter A. Stepwise modification of the electrostatic charge of cytochrome c. Effects on protein conformation and oxidation-reduction properties // J Biol Chem. ‒ 1981. ‒ T. 256, № 11. ‒ C. 5540-4. 148. Kagan V. E., Bayir H. A., Belikova N. A., Kapralov O., Tyurina Y. Y., Tyurin V. A., Jiang J., Stoyanovsky D. A., Wipf P., Kochanek P. M., Greenberger J. S., Pitt B., Shvedova A. A., Borisenko G. Cytochrome c/cardiolipin relations in mitochondria: a kiss of death // Free Radic Biol Med. ‒ 2009. ‒ T. 46, № 11. ‒ C. 1439-53. 149. Kapralov A. A., Kurnikov I. V., Vlasova I. I., Belikova N. A., Tyurin V. A., Basova L. V., Zhao Q., Tyurina Y. Y., Jiang J., Bayir H., Vladimirov Y. A., Kagan V. E. The hierarchy of structural transitions induced in cytochrome c by anionic phospholipids determines its peroxidase activation and selective peroxidation during apoptosis in cells // Biochemistry. ‒ 2007. ‒ T. 46, № 49. ‒ C. 14232-44. 150. Belikova N. A., Tyurina Y. Y., Borisenko G., Tyurin V., Samhan Arias A. K., Yanamala N., Furtmuller P. G., Klein-Seetharaman J., Obinger C., Kagan V. E. Heterolytic reduction of fatty acid hydroperoxides by cytochrome c/cardiolipin complexes: antioxidant function in mitochondria // J Am Chem Soc. ‒ 2009. ‒ T. 131, № 32. ‒ C. 11288-9. 151. Владимиров Ю. А., Проскурнина Е. В., Измайлов Д. Ю., Новиков А. А., Брусничкин А. В., Осипов А. Н., Каган В. Е. Кардиолипин активирует пероксидазную активность цитохрома с, потому что увеличивает доступность железа гема для H2O2 // Биохимия. ‒ 2006. ‒ T. 71, № 9. ‒ C. 1225-1233. 152. Barr D. P., Mason R. P. Mechanism of radical production from the reaction of cytochrome c with organic hydroperoxides. An ESR spin trapping investigation // The Journal of biological chemistry. ‒ 1995. ‒ T. 270, № 21. ‒ C. 12709-16. 153. Prasad S., Maiti N. C., Mazumdar S., Mitra S. Reaction of hydrogen peroxide and peroxidase activity in carboxymethylated cytochrome c: spectroscopic and kinetic studies // Biochim Biophys Acta. ‒ 2002. ‒ T. 1596, № 1. ‒ C. 63-75. 175 154. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. / Владимиров Ю. А., Арчаков А. И.; Под ред. Франк Г. М. ‒ Москва: Наука, 1972. ‒ 252 с. 155. Halliwell B., Gutteridge J. M. Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: an overview // Methods Enzymol. ‒ 1990. ‒ T. 186. ‒ C. 1-85. 156. Porter N. A. Chemistry of lipid peroxidation // Methods Enzymol. ‒ 1984. ‒ T. 105. ‒ C. 273-82. 157. Niki E. Lipid peroxidation: Physiological levels and dual biological effects // Free Radical Biology and Medicine. ‒ 2009. ‒ T. 47, № 5. ‒ C. 469-484. 158. Lee R., Margaritis M., Channon K. M., Antoniades C. Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations // Curr. Med. Chem. ‒ 2012. ‒ T. V.19, № №16. ‒ C. P.2504-20. 159. Осипов А. Н., Савов В. М., Яхъяев А. В., Зубарев В. Е., Азизова О. А., Каган В. Е., Владимиров Ю. А. Исследование радикалов, образующихся при взаимодействии органических гидроперекисей с ионами железа, методом спиновых ловушек // Биофизика. ‒ 1984. ‒ T. 29, № 4. ‒ C. 533-536. 160. Азизова O. A., Осипов А. Н., Савов В. М., Яхъяев A. B., Зубарев В. Е., Каган В. Е., Владимиров Ю. А. Инициирование неферментативного перекисного окисления липидов в системе Fe- аскорбат-линолеат // Биофизика. ‒ 1985. ‒ T. 30, № 1. ‒ C. 36-39. 161. Владимиров Ю. А., Проскурнина Е. В. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция // Успехи биологической химии. ‒ 2009. ‒ T. 49. ‒ C. 341388. 162. Основы аналитической химии в 2 кн. Кн. 2. Методы химического анализа: Учеб. для ВУЗов. / Золотов Ю. А. ‒ 3 изд. ‒ Москва: Высшая школа, 2004. ‒ 503 с. 163. Химический люминесцентный анализ неорганических веществ. / Головина А. П., Левшин Л. В. ‒ Москва: Химия, 1978. ‒ 248 с. 164. Козлов А. В., Осипов А. Н., Владимиров Ю. А. Механизм люминолзависимой хемилюминесценции сыворотки крови человека в присутствии пероксида водорода // Биофизика. ‒ 1990. ‒ T. 35, № 2. ‒ C. 347-349. 165. Lundqvist H., Dahlgren C. Isoluminol-enhanced chemiluminescence: a sensitive method to study the release of superoxide anion from human neutrophils // Free Radic. Biol. Med. ‒ 1996. ‒ T. V.20, № №6. ‒ C. P.785-92. 176 166. Vladimirov Y. A., Sharov V. S., Driomina E. S., Reznitchenko A. V., Gashev S. B. Coumarin derivatives enhance the chemiluminescence accompanying lipid peroxidation // Free radical biology & medicine. ‒ 1995. ‒ T. 18, № 4. ‒ C. 739-45. 167. Yamaguchi Y., Kagota S., Kunitomo M., Haginaka J. High-performance liquid chromatographic assay of hydroperoxide levels in oxidatively modified lipoproteins // J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. ‒ 1999. ‒ T. V.731, № №2. ‒ C. P.223-9. 168. Fuchs B., Bresler K., Schiller J. Oxidative changes of lipids monitored by MALDI MS // Chemistry and Physics of Lipids. ‒ 2011. ‒ T. 164, № 8. ‒ C. 782-795. 169. Milne S., Ivanova P., Forrester J., Brown H. A. Lipidomics: An analysis of cellular lipids by ESI-MS // Methods. ‒ 2006. ‒ T. 39, № 2. ‒ C. 92-103. 170. Hankin J. A., Farias S. E., Barkley R. M., Heidenreich K., Frey L. C., Hamazaki K., Kim H.-Y., Murphy R. C. MALDI Mass Spectrometric Imaging of Lipids in Rat Brain Injury Models // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. ‒ 2011. ‒ T. 22, № 6. ‒ C. 1014-1021. 171. Murphy R. C., Axelsen P. H. Mass spectrometric analysis of long-chain lipids // Mass Spectrometry Reviews. ‒ 2011. ‒ T. 30, № 4. ‒ C. 579-599. 172. Ji J., Kline A. E., Amoscato A., Samhan-Arias A. K., Sparvero L. J., Tyurin V. A., Tyurina Y. Y., Fink B., Manole M. D., Puccio A. M., Okonkwo D. O., Cheng J. P., Alexander H., Clark R. S., Kochanek P. M., Wipf P., Kagan V. E., Bayir H. Lipidomics identifies cardiolipin oxidation as a mitochondrial target for redox therapy of brain injury // Nature neuroscience. ‒ 2012. ‒ T. 15, № 10. ‒ C. 1407-13. 173. Amoscato A. A., Sparvero L. J., He R. R., Watkins S., Bayir H., Kagan V. E. Imaging Mass Spectrometry of Diversified Cardiolipin Molecular Species in the Brain // Analytical Chemistry. ‒ 2014. ‒ T. 86, № 13. ‒ C. 6587-6595. 174. Sparagna G. C., Johnson C. A., McCune S. A., Moore R. L., Murphy R. C. Quantitation of cardiolipin molecular species in spontaneously hypertensive heart failure rats using electrospray ionization mass spectrometry // Journal of Lipid Research. ‒ 2005. ‒ T. 46, № 6. ‒ C. 1196-1204. 175. Tyurina Y. Y., Domingues R. M., Tyurin V. A., Maciel E., Domingues P., Amoscato A. A., Bayir H., Kagan V. E. Characterization of cardiolipins and their oxidation products by LC-MS analysis // Chemistry and Physics of Lipids. ‒ 2014. ‒ T. 179. ‒ C. 3-10. 176. Vladimirov Y. A., Proskurnina E. V., Alekseev A. V. Molecular mechanisms of apoptosis. structure of cytochrome c-cardiolipin complex // Biochemistry (Mosc). ‒ 2013. ‒ T. 78, № 10. ‒ C. 1086-97. 177 177. Владимиров Ю. А., Ноль Ю. Ц., Волков В. В. Белково-липидные наночастицы, от которых зависит “быть или не быть” живой клетке // Кристаллография. ‒ 2011. ‒ T. 56, № 4. ‒ C. 712-719. 178. Демин Е. М., Проскурнина Е. В., Владимиров Ю. А. Антиоксидантное действие дигидрокверцетина и рутина в пероксидазных реакциях, катализируемых цитохромом с // Вестник Московского университета. ‒ 2008. ‒ T. 49, № 5. ‒ C. 354-360. 179. Quinn P. J., Dawson R. M. Interactions of cytochrome c and [14C] // Biochem J. ‒ 1969. ‒ T. 115, № 1. ‒ C. 65-75. 180. Quinn P. J., Dawson R. M. The interaction of cytochrome c with monolayers of phosphatidylethanolamine // Biochem J. ‒ 1969. ‒ T. 113, № 5. ‒ C. 791-803. 181. Beales P. A., Bergstrom C. L., Geerts N., Groves J. T., Vanderlick T. K. Single vesicle observations of the cardiolipin-cytochrome C interaction: induction of membrane morphology changes // Langmuir. ‒ 2011. ‒ T. 27, № 10. ‒ C. 6107-15. 182. Bergstrom C. L., Beales P. A., Lv Y., Vanderlick T. K., Groves J. T. Cytochrome c causes pore formation in cardiolipin-containing membranes // Proc Natl Acad Sci USA. ‒ 2013. ‒ T. 110, № 16. ‒ C. 6269-74. 183. Tyurin V. A., Balasubramanian K., Winnica D., Tyurina Y. Y., Vikulina A. S., He R. R., Kapralov A. A., Macphee C. H., Kagan V. E. Oxidatively modified phosphatidylserines on the surface of apoptotic cells are essential phagocytic 'eat-me' signals: cleavage and inhibition of phagocytosis by Lp-PLA2 // Cell Death Differ. ‒ 2014. ‒ T. 21, № 5. ‒ C. 825-35. 184. Tyurina YY P. S., Tyurin VA, Kapralov AA, Jiang J, Anthonymuthu TS, Kapralova VI, Vikulina AS, Jung M, Epperly M, Mohammadyani D, KleinSeetharaman J, Jackson TC,, Kochanek PM P. B., Greenberger JS, Vladimirov YA, Bayır H, Kagan VE. A mitochondrial pathway for biosynthesis of lipid mediators. // Nature Chemistry. ‒ 2014. ‒ T. In Press. 185. Ji J., Baart S., Vikulina A. S., Clark R. S., Anthonymuthu T. S., Tyurin V. A., Du L., St Croix C. M., Tyurina Y. Y., Lewis J., Skoda E. M., Kline A. E., Kochanek P. M., Wipf P., Kagan V. E., Bayır H. Deciphering of mitochondrial cardiolipin oxidative signaling in cerebral ischemia-reperfusion // J Cereb Blood Flow Metab. ‒ 2015. ‒ T. 35, № 2. ‒ C. 319-28. 186. Tyurina Y. Y., Polimova A. M., Maciel E., Tyurin V. A., Kapralova V. I., Winnica D. E., Vikulina A. S., Domingues M. R., McCoy J., Sanders L. H., Bayır H., Greenamyre J. T., Kagan V. E. LC/MS analysis of cardiolipins in substantia nigra and 178 plasma of rotenone-treated rats: Implication for mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease // Free Radic Res. ‒ 2015. ‒ T. 49, № 5. ‒ C. 681-91. 187. Hui S. P., Murai T., Yoshimura T., Chiba H., Nagasaka H., Kurosawa T. Improved HPLC assay for lipid peroxides in human plasma using the internal standard of hydroperoxide // Lipids. ‒ 2005. ‒ T. 40, № 5. ‒ C. 515-522. 188. Шерстнев М. П., Атанаев Т. Б., Владимиров Ю. А. Активированная родамином ж хемилюминесценция плазмы крови в присутствии ионов двухвалентного железа // Биофизика. ‒ 1989. ‒ T. 34, № 4. ‒ C. 684-687. 189. Vladimirov Y. A., Sherstnev M. P. Biophysical chemiluminescent analysis // Soviet Medical Reviws/Section B. Physicochemical Aspects of Medicine. ‒ London: Harwood Academic Pubishers GmbH, 1991. ‒ C. 1-43. 190. Volodkin D. V., Michel M., Schaaf P., Voegel J.-C., Moehwald H., Ball V. Liposome Embedding into Polyelectrolyte Multilayers: A New Way to Create Drug Reservoirs at Solid-Liquid Interfaces // Advances in Planar Lipid Bilayers and Liposomes, Vol. 8. - 2008. - C. 1-25. 191. Folch J., Lees M., Sloane Stanley G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues // J Biol Chem. ‒ 1957. ‒ T. 226, № 1. ‒ C. 497-509. 192. Rouser G. Quantitative liquid column and thin layer chromatography of lipids and other water insoluble substances, elution selectivity principles, and a graphic method for pattern analysis of chromatographic data // Journal of Chromatographic Science. ‒ 1973. ‒ T. 11, № 2. ‒ C. 60-76. 193. Shvedova A. A., Tyurina J. Y., Kawai K., Tyurin V. A., Kommineni C., Castranova V., Fabisiak J. P., Kagan V. E. Selective peroxidation and externalization of phosphatidylserine in normal human epidermal keratinocytes during oxidative stress induced by cumene hydroperoxide // Journal of Investigative Dermatology. ‒ 2002. ‒ T. 118, № 6. ‒ C. 1008-1018. 194. Tyurina Y. Y., Poloyac S. M., Tyurin V. A., Kapralov A. A., Jiang J., Anthonymuthu T. S., Kapralova V. I., Vikulina A. S., Jung M. Y., Epperly M. W., Mohammadyani D., Klein-Seetharaman J., Jackson T. C., Kochanek P. M., Pitt B. R., Greenberger J. S., Vladimirov Y. A., Bayır H., Kagan V. E. A mitochondrial pathway for biosynthesis of lipid mediators // Nat Chem. ‒ 2014. ‒ T. 6, № 6. ‒ C. 542-52. 195. Vladimirov Y. A., Nol' Y. T., Volkov V. V. Protein–lipid nanoparticles that determine whether cells will live or die // Crystallography Reports. ‒ 2011. ‒ T. 56, № 4. ‒ C. 553-559. 179 196. Измайлов Д. Ю., Владимиров Ю. А. Математическое моделирование кинетики цепного окисления липидов и хемилюминесценции в присутствии Fe2+. I. Основная модель // Биологические мембраны. ‒ 2002. ‒ T. 19, № 6. ‒ C. 507-515. 197. Spector A., Zhou W., Ma W., Chignell C. F., Reszka K. J. Investigation of the mechanism of action of microperoxidase-11, (MP11), a potential anti-cataract agent, with hydrogen peroxide and ascorbate // Exp. Eye Res. ‒ 2000. ‒ T. V.71, № №2. ‒ C. P.183-94. 198. Ogura Y., Koyama J., Fukuhara T. Highly sensitive and rapid flow-injection fluorometric determination of lipid hydroperoxide in human sebum // Bunseki Kagaku. ‒ 2012. ‒ T. 61, № 5. ‒ C. 397-401. 199. Prokopovic V. Z., Duschl C., Volodkin D. V. Hyaluronic acid/poly-L-lysine multilayers coated with gold nanoparticles: cellular response and permeability study // Polymers for Advanced Technologies. ‒ 2014. ‒ T. 25, № 11. ‒ C. 1342-1348. 200. Madaboosi N., Uhlig K., Jaeger M. S., Moehwald H., Duschl C., Volodkin D. V. Microfluidics as A Tool to Understand the Build-Up Mechanism of Exponential-Like Growing Films // Macromolecular Rapid Communications. ‒ 2012. ‒ T. 33, № 20. ‒ C. 1775-1779. 201. Uhlig K., Madaboosi N., Schmidt S., Jaeger M. S., Rose J., Duschl C., Volodkin D. V. 3d localization and diffusion of proteins in polyelectrolyte multilayers // Soft Matter. ‒ 2012. ‒ T. 8, № 47. ‒ C. 11786-11789. 202. Serhan C. N., Chiang N., Van Dyke T. E. Resolving inflammation: dual antiinflammatory and pro-resolution lipid mediators // Nature Reviews Immunology. ‒ 2008. ‒ T. 8, № 5. ‒ C. 349-361. 203. Patwardhan A. M., Scotland P. E., Akopian A. N., Hargreaves K. M. Activation of TRPV1 in the spinal cord by oxidized linoleic acid metabolites contributes to inflammatory hyperalgesia // Proc Natl Acad Sci U S A. ‒ 2009. ‒ T. 106, № 44. ‒ C. 18820-4. 204. Altmann R., Hausmann M., Spöttl T., Gruber M., Bull A. W., Menzel K., Vogl D., Herfarth H., Schölmerich J., Falk W., Rogler G. 13-Oxo-ODE is an endogenous ligand for PPARgamma in human colonic epithelial cells // Biochem Pharmacol. ‒ 2007. ‒ T. 74, № 4. ‒ C. 612-22. 205. Vangaveti V., Baune B. T., Kennedy R. L. Hydroxyoctadecadienoic acids: novel regulators of macrophage differentiation and atherogenesis // Therapeutic advances in endocrinology and metabolism. ‒ 2010. ‒ T. 1, № 2. ‒ C. 51-60. 180 206. Alsalem M., Wong A., Millns P., Arya P. H., Chan M. S., Bennett A., Barrett D. A., Chapman V., Kendall D. A. The contribution of the endogenous TRPV1 ligands 9HODE and 13-HODE to nociceptive processing and their role in peripheral inflammatory pain mechanisms // Br J Pharmacol. ‒ 2013. ‒ T. 168, № 8. ‒ C. 196174. 207. Obinata H., Hattori T., Nakane S., Tatei K., Izumi T. Identification of 9hydroxyoctadecadienoic acid and other oxidized free fatty acids as ligands of the G protein-coupled receptor G2A // J Biol Chem. ‒ 2005. ‒ T. 280, № 49. ‒ C. 40676-83. 208. Goodfriend T. L., Ball D. L., Egan B. M., Campbell W. B., Nithipatikom K. Epoxy-keto derivative of linoleic acid stimulates aldosterone secretion // Hypertension. ‒ 2004. ‒ T. 43, № 2. ‒ C. 358-63. 209. Huang J. T., Welch J. S., Ricote M., Binder C. J., Willson T. M., Kelly C., Witztum J. L., Funk C. D., Conrad D., Glass C. K. Interleukin-4-dependent production of PPAR-gamma ligands in macrophages by 12/15-lipoxygenase // Nature. ‒ 1999. ‒ T. 400, № 6742. ‒ C. 378-82. 210. Delerive P., Furman C., Teissier E., Fruchart J., Duriez P., Staels B. Oxidized phospholipids activate PPARalpha in a phospholipase A2-dependent manner // FEBS Lett. ‒ 2000. ‒ T. 471, № 1. ‒ C. 34-8. 211. Morgantini C., Imaizumi S., Grijalva V., Navab M., Fogelman A. M., Reddy S. T. Apolipoprotein A-I mimetic peptides prevent atherosclerosis development and reduce plaque inflammation in a murine model of diabetes // Diabetes. ‒ 2010. ‒ T. 59, № 12. ‒ C. 3223-8. 212. Pidgeon G. P., Lysaght J., Krishnamoorthy S., Reynolds J. V., O'Byrne K., Nie D., Honn K. V. Lipoxygenase metabolism: roles in tumor progression and survival // Cancer Metastasis Rev. ‒ 2007. ‒ T. 26, № 3-4. ‒ C. 503-24. 213. Wipf P., Xiao J., Jiang J., Belikova N. A., Tyurin V. A., Fink M. P., Kagan V. E. Mitochondrial targeting of selective electron scavengers: synthesis and biological analysis of hemigramicidin-TEMPO conjugates // Journal of the American Chemical Society. ‒ 2005. ‒ T. 127, № 36. ‒ C. 12460-1. 214. Farooqui A. A., Yang H. C., Rosenberger T. A., Horrocks L. A. Phospholipase A2 and its role in brain tissue // Journal of neurochemistry. ‒ 1997. ‒ T. 69, № 3. ‒ C. 889-901. 215. Sanders L. H., Greenamyre J. T. Oxidative damage to macromolecules in human Parkinson disease and the rotenone model // Free Radic Biol Med. ‒ 2013. ‒ T. 62. ‒ C. 111-20. 181 216. Schapira A. H., Cooper J. M., Dexter D., Clark J. B., Jenner P., Marsden C. D. Mitochondrial complex I deficiency in Parkinson's disease // J Neurochem. ‒ 1990. ‒ T. 54, № 3. ‒ C. 823-7. 217. Sofic E., Lange K. W., Jellinger K., Riederer P. Reduced and oxidized glutathione in the substantia nigra of patients with Parkinson's disease // Neurosci Lett. ‒ 1992. ‒ T. 142, № 2. ‒ C. 128-30. 218. Good P. F., Hsu A., Werner P., Perl D. P., Olanow C. W. Protein nitration in Parkinson's disease // J Neuropathol Exp Neurol. ‒ 1998. ‒ T. 57, № 4. ‒ C. 338-42. 219. Alam Z. I., Jenner A., Daniel S. E., Lees A. J., Cairns N., Marsden C. D., Jenner P., Halliwell B. Oxidative DNA damage in the parkinsonian brain: an apparent selective increase in 8-hydroxyguanine levels in substantia nigra // J Neurochem. ‒ 1997. ‒ T. 69, № 3. ‒ C. 1196-203. 220. Dexter D. T., Carter C. J., Wells F. R., Javoy-Agid F., Agid Y., Lees A., Jenner P., Marsden C. D. Basal lipid peroxidation in substantia nigra is increased in Parkinson's disease // J Neurochem. ‒ 1989. ‒ T. 52, № 2. ‒ C. 381-9. 221. Yoritaka A., Hattori N., Uchida K., Tanaka M., Stadtman E. R., Mizuno Y. Immunohistochemical detection of 4-hydroxynonenal protein adducts in Parkinson disease // Proc Natl Acad Sci U S A. ‒ 1996. ‒ T. 93, № 7. ‒ C. 2696-701. 222. Jomova K., Vondrakova D., Lawson M., Valko M. Metals, oxidative stress and neurodegenerative disorders // Mol Cell Biochem. ‒ 2010. ‒ T. 345, № 1-2. ‒ C. 91104. 223. Millius A., Weiner O. D. Chemotaxis in neutrophil-like HL-60 cells // Methods Mol Biol. ‒ 2009. ‒ T. 571. ‒ C. 167-77. 224. Sun L., Yau H. Y., Wong W. Y., Li R. A., Huang Y., Yao X. Role of TRPM2 in H(2)O(2)-induced cell apoptosis in endothelial cells // PLoS One. ‒ 2012. ‒ T. 7, № 8. ‒ C. e43186. 225. Fox S., Leitch A. E., Duffin R., Haslett C., Rossi A. G. Neutrophil apoptosis: relevance to the innate immune response and inflammatory disease // J Innate Immun. ‒ 2010. ‒ T. 2, № 3. ‒ C. 216-27. 226. Tyurin V. A., Yanamala N., Tyurina Y. Y., Klein-Seetharaman J., Macphee C. H., Kagan V. E. Specificity of lipoprotein-associated phospholipase A(2) toward oxidized phosphatidylserines: liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry characterization of products and computer modeling of interactions // Biochemistry. ‒ 2012. ‒ T. 51, № 48. ‒ C. 9736-50. 182