Фотофизические свойства молекул красителя для STED
реклама
МОСКОВСКИЙ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ (ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ) ФАКУЛЬТЕТ ОБЩЕЙ И ПРИКЛАДНОЙ ФИЗИКИ КАФЕДРА «ПРОБЛЕМЫ КВАНТОВОЙ ФИЗИКИ», ФИАН Выпускная квалификационная работа на степень бакалавра Фотофизические свойства молекул красителя для STED-фотолитографии с разрешением, превосходящим дифракционный предел Аббе Студентка 123группы Маслобоева Е.С. Научный руководитель: к. ф.-м. н. Чубич Д.А. МОСКВА 2015 Содержание Введение ........................................................................................................... 3 Преодоление дифракционного барьера Аббе ................................................ 3 STED-микроскопия .......................................................................................... 8 STED-литография........................................................................................... 12 Влияние металлических наночастиц на излучательные свойства красителя ......................................................................................................................... 20 Экспериментальная часть .............................................................................. 26 Заключение ..................................................................................................... 34 Список литературы ........................................................................................ 35 2 Введение Долгое время дифракция ограничивала разрешающую способность оптических инструментов и создание пространственных структур с размерами много меньшими длины волны. С появлением техники STED (stimulated emission depletion) был преодален предел Аббе в микроскопии, и это послужило толчком к развитию STED фотолитографии. Главное преимущество данной техники заключается в том, что мы можем создавать низкоразмерные структуры с размерами существенно меньше длины волны с помощью видимого света, а не с помощью коротковолнового рентгеновского излучения. Ключевую роль в литографии играет фотоинициатор – краситель, способный запускать реакцию фотополимеризации и/или фотовосстановление металла. Но для техники STED подходит не каждый краситель. Подходящий инициатор должен обладать некоторым набором оптических свойств. Данная работа посвящена исследованию фотофизических свойств наиболее подходящего для STED красителя, а именно DETC(7-диэтиламино-3-тиенокумарин), а также выявлению влияния на его свойства образовавшихся металлических наночастиц. Преодоление дифракционного предела Аббе Известно, что дифракция пространственных мешает изображению и распознаванию структур много (дифракционный предел Аббе: ∆𝑥𝐴𝐴𝐴𝐴 = меньших 𝜆 2𝑛 𝑠𝑠𝑠𝑠 = 𝜆 2𝑁𝑁 длины волны ). Для преодоления дифракционного барьера используются метаматериалы и ближнеполевую оптическую микроскопию[29]. Тем не менее в последние годы появились концепции, которые позволяют преодолеть дифракционный барьер в дальнопольной флуоресцентной микроскопии[1,2]. Обеспечивая лучшее разрешение, эти идеи продвигают нас дальше, чем уже существующие 3 техники[3]. STED (stimulated emission depletion) –микроскопия имеет пространственное разрешение ~ 30 нм, что порядка λ/25 для длины волны 750 нм[4]. Вторая идея данного типа ground state depletion – микроскопия имеет близкий потенциал разрешения[2]. Их общий принцип заключается в том, что дифракционный барьер преодолевается насыщением обратимых молекулярных переходов освещением с сильным пространственным градиентом распределения интенсивности. Считается, что чтобы преодолеть дифракционный барьер нужны оптические нелинейности. Так как большие нелинейности часто связаны с сильными полями, наномасштабов господствовало будет препятствовать мнение, что разрешению необходимость чрезвычайно больших интенсивностей. Основная идея метода. Предположим, что светопоглощающее вещество может переходить между двумя состояниями А и В(рис.1)[5]. В простейшем случае А – основное и В – возбужденное состояние. Так как мы собираемся распознавать и писать светом, то переход А→В должен быть разрешен в соответствии с правилами отбора. Обозначая коэффициенты переходов 𝑘𝐴𝐴 и 𝑘𝐵𝐵 , населенность уровней 𝑁𝐴 и 𝑁𝐵 описывается следующим образом: 𝑑𝑁𝐴 𝑑𝑑 = −𝑘𝐴𝐴 𝑁𝐴 + 𝑘𝐵𝐵 𝑁𝐵 = − 𝑑𝑁𝐵 𝑑𝑑 4 (1) Рис. 1 Цикл состояний вещества. 𝒌𝑨𝑨 – коэффициент перехода А→В, 𝑰𝑨𝑨 - интенсивность падающего излучения, 𝝈АВ - эффективное сечение перехода; 𝒌𝑩𝑩 – коэффициент перехода B→A, состоящий из спонтанной составляющей 𝒌𝒔𝑨𝑨 и части, индуцированной падающим излучением 𝑰𝑨𝑨 , 𝝈𝒂𝒂 𝑩𝑩 - эффективное сечение перехода ; Если вещество в начальный момент времени находилось в состоянии А, то вероятность все еще обнаружить его в А через время t: 𝑘𝐴𝐴 𝑁𝐴 (𝑡) = 𝑁𝐴∞ = 𝑘𝐴𝐴 +𝑘𝐵𝐵 𝑘 �𝑘𝐵𝐵 + exp[−(𝑘𝐴𝐴 + 𝑘𝐵𝐵 )𝑡]� 𝐴𝐴 (2) Для 𝑡 > 5(𝑘𝐴𝐴 + 𝑘𝐵𝐵 )−1 , пренебрежем экспонентой и положим 𝑘𝐵𝐵 𝑘𝐴𝐴 +𝑘𝐵𝐵 . Рассмотрим переход в состояние В. Переход А→В происходит под действием света с длиной волны 𝜆𝐴𝐴 , с коэффициентом 𝜎АВ 𝐼𝐴𝐵 , где 𝜎АВ эффективное сечение перехода, а 𝐼𝐴𝐴 – локальное число фотонов через площадку. В самом общем случае предположим, что 𝐼𝐴𝐴 индуцирует 𝑎𝑎 < 𝜎𝐴𝐴 . Поэтому переход В→А состоит из переход В→А с сечением 𝜎ВА 𝑠 спонтанной компоненты 𝑘𝐵𝐵 и индуцированной, таким образом 𝑘𝐵𝐵 = 𝑠 𝑎𝑎 + 𝜎𝐵𝐵 𝐼𝐴𝐴 . Из этого следует 𝑘𝐵𝐵 𝑁𝐴∞ = 𝑎𝑎 𝑠 𝜎𝐵𝐵 𝐼𝐴𝐴 +𝑘𝐵𝐵 (3) 𝑎𝑎 �𝐼 𝑠 �𝜎𝐴𝐴 +𝜎𝐵𝐵 𝐴𝐴 +𝑘𝐵𝐵 5 Для интенсивностей: 𝐼𝐴𝐴 ≫ 𝑎𝑎 𝑎𝑎 𝜎𝐵𝐵 /(𝜎𝐴𝐴 + 𝜎𝐵𝐵 ). 𝑠 𝑘𝐵𝐵 𝑎𝑎 𝜎𝐴𝐴 −𝜎𝐵𝐵 𝑠𝑠𝑠 ≡ 𝐼𝐴𝐴 , получаем ∞ ����� 𝑁 𝐴 = Пусть переход A→B запускается светом с пространственным распределением интенсивности, имеющим локальный ноль: 𝐼𝐴𝐴 (𝑟⃗) = 𝑚𝑚𝑚 𝐼𝐴𝐴 ⃗ = 𝑥, 𝑦, 𝑧) нормированная функция, описывающая 𝑓(𝑟⃗), 𝑓(𝑟���⃗) 0 = 0. 𝑓(𝑟 дифракционно-ограниченное распределение интенсивности. Если выбрать 𝑚𝑚𝑚 𝑠𝑠𝑠 ∞ ����� ≫ 𝐼𝐴𝐴 , то получим 𝑁𝐴∞ = 𝑁 𝐼𝐴𝐴 𝐴 в каждой точке пространства, исключая ближайшую окрестность точки ���⃗, 𝑟0 где 𝑁𝐴∞ = 1. Таким образом мы можем создать произвольно узкую область, находящуюся в состоянии А, встроенную внутрь области с заметным содержанием В. Важно, что произвольно узкая область состояния А не зависит ни от 𝜆АВ , ни от особенностей 𝑓(𝑟⃗). Не важно описывает ли 𝑓(𝑟⃗) моду Лагер-Гаусса или стоячую волну или любую другую функцию, если они имеют хотя бы один локальный ноль. 𝑚𝑚𝑚 𝑠𝑠𝑠 В обычных случаях 𝐼𝐴𝐴 и 𝐼𝐴𝐴 конечны, а 𝑓(𝑟⃗) оперделенная функция. В самом простом случае стоячей волны 𝑓(𝑥) = 𝑠𝑠𝑠2 ( 2𝜋𝜋 𝜆𝐴𝐴 ) ширина на половине высоты узкой области А может быть посчитана следующим образом: ∆𝑥 ≥ 𝜆𝐵𝐵 𝜋 arcsin �� 𝑚𝑚𝑚 𝑠𝑠𝑠 𝑓(𝑥) = 𝐼𝐴𝐴 𝐼𝐴𝐴 𝑠 𝑘𝐴𝐴 𝑏𝑏 �𝐼 𝑚𝑚𝑚 �𝜎𝐵𝐵 −𝜎𝐴𝐴 𝐴𝐴 �= 𝜆𝐵𝐵 𝜋 1� 2) arcsin(𝜍 − ≈ Возможные значения фактора насыщения 𝜍 = 𝜆𝐴𝐴 𝜋 �𝜍 𝑚𝑚𝑚 𝐼𝐴𝐴 𝑠𝑠𝑠 𝐼𝐴𝐴 (4) ≫ 1. Если ς=10000, то получаем ∆𝑥 ≈ 𝜆𝐴𝐴 /100, но теоретически можно уменьшить пятно и до молекулярного масштаба. Данный метод применим и к литографии. Если используемый материал может быть переведен из состояния А в устойчивое состояние С, 6 то можно определить новую концепцию для лазерного письма без дифракционного предела. Сначала, материал, находящийся в А, переводят в состояние В, не инициирующее полимеризацию, профилем 𝐼𝐴𝐴 (𝑟⃗) = 𝑚𝑚𝑚 𝐼𝐴𝐴 𝑓(𝑥). В состоянии А остается область ∆𝑥̅ ≪ 𝜆𝐴𝐴 . Затем, переводим молекулы, оставшиеся в А, в устойчивое состояние С. В то время как роль насыщаемого перехода А→В заключается в определении расположения и ширины структуры, роль самого состояния В – в том, чтобы защитить материал от полимеризации. Таким образом, основной особенностью для письма является наличие переходного защитного состояния В, не подверженного полимеризации. Если B→A инициируется светом, термически, химически или иначе, то можно полностью контролировать время процесса. Важно, что и ширину ∆𝑥̅ и расстояние между элементами 𝛿𝑥 можно произвольно масштабировать. В результате, этот концепт позволяет прописывать структуры любого размера и плотности сфокусированным светом независимо от длины волны. С новой концепцией дифракция не представляет фундаментального ограничения на достижимое разрешение, в действительности же его ограничивает уровень насыщения материала. Поэтому задача состоит в том, чтобы найти насыщаемый переход с низкой интенсивностью 𝑠𝑠𝑠 насыщения 𝐼𝐴𝐴 . Насыщаемые обратимые оптические переходы позволяют создать массу дифракционно-неограниченных режимов получения изображения. С соответствующими материалами эта идея может быть расширена на дифракционно-неограниченную литографию. Разрешение в таком случае зависит от уровня насыщения и выражается простой формулой. В то время как действенность этого метода была продемонстрирована в микроскопии с помощью насыщаемого вынужденного 7 гашения, обобщение прокладывает путь для ряда новых техник получения изображения и письма. Необходимость высоких интенсивностей, которая является запретной для достижения разрешения молекулярных масштабов, может быть преодолена использованием состояний со временами жизни >1µs. При существующем разнообразии доступных материалов синтез новых молекул с обратимыми насыщаемыми переходами дает шанс открыть наномасштабы с видимым стратегия должна фокусированным светом. Представленная подтолкнуть исследовательскую активность использовать эту возможность. STED-микроскопия Почти 20 лет назад Хелль и Вичман[1] предложили метод преодоления ограничения разрешения из-за дифракции в оптической микроскопии. В своем предложении они заявили, что разрешение в флюоресцентной микроскопии не ограничивается дифракцией, если можно снять свечение во внешнем кольце дифракционно-ограниченной PSF (функция рассеяния точки) пучка возбуждения достаточно быстро, до того как флюорофор испустит фотон. Гашение после возбуждения, но до эмиссии возможно, потому что среднее время жизни флюоресцирующего состояния порядка 1нс, и остается время, чтобы за счёт вынужденного излучения первести молекулу из возбужденного в основное состояние. Обычно используют фемто- и пикосекундные импульсы, чтобы возбудить весь флюорофор внутри PSF возбуждения, а затем оптически и обратимо снимают возбуждение во внешнем кольце вторым импульсом. Используется несколько техник реализации оптического переключения, но STED первым продемонстрировал сверхдифракционное разрешение[6]. 8 Идея STEDа. Рис. 2 Схема уровней энергии фотоинициатора и переходов молекулы фотоинициатора для STEDа На рис.2 показаны возможные состояния и переходы молекулы фотоинициатора. Лазер возбуждения возбуждает молекулы состояния 𝑆0 в возбужденное фотоинициатора из их основного 𝑆1∗ двухфотонным поглощением. Некоторые молекулы могут безызлучательно возвращаться в основное состояние. Тем не менее большинство молекул будут релаксировать в промежуточное состояние 𝑆1 , из которого они могут либо высвечиваться, либо подвергаться интеркомбинационной конверсии в триплетное состояние 𝑇1 , из которого может быть запущена химическая реакция в фоторезисте. Идея STEDа состоит в том, чтобы снять молекулы с промежуточного состояния 𝑆1 назад в основное 𝑆0 через вынужденное испускание, вызванное излучением второго лазера (лазер гашения) другой длины волны[7]. 9 Рис. 3 Конфигурация лазерных лучей для STEDa Конфигурация лучей для выполнения STEDа представлена на рис.3. Вынужденное излучение переводит возбужденные молекулы в основное состояние, таким образом спонтанное излучение оказывается погашенным. Если все молекулы во внешнем кольце PSF возбуждения были погашены импульсом STEDa, то только молекулы в самом центре все еще будут активны. Следовательно, когда фотон детектируется, то наблюдатель заранее знает, что он исходит из того объема, где молекулы еще в возбужденном состоянии. Этот объем называется эффективная PSF STEDмикроскопа. В идеале, doughnut STED-PSF скорее должна быть полой сферой, чтобы достичь трехмерного улучшения эффективной PSF. Правильную полую сферическую PSF нельзя создать, используя традиционные линзы микроскопов, но одновременное распределение интенсивности в поперечном направлении вокруг пятна и две дополнительные части впереди и позади фокальной плоскости создать можно. Тем временем, эффективная PSF с поперечной шириной 8нм уже реализована в дальнопольной флюоресцентной STED микроскопии[8]. Множество приложений данного метода было предложено за последнее десятилетие, большинство из них в области биологии, возможно использование в науке о материалах. 10 Рис. 4 Альтернативные техники оптического переключения флюорофоров. STED один из способов снять возбуждение, но не единственный (см. рис. 4)[9]. Например, молекулы красителя во внешнем кольце (внутри doughnut) могут быть перекачаны на полустабильный триплетный уровень (b). Это не позволяет молекулам внешнего кольца из основного состояния возбудиться последующим импульсом. При последующем измерении детектируются только фотоны из центральной части. Другая возможность – перевести фотохромные молекулы внешнего кольца в непоглощающее состояние (с). Теперь только оставшиеся молекулы в центре PSF можно возбудить, и таким образом эффективная PSF сжимается. Вместо собственно флюорофора можно использовать гаситель энергии (d). В этом случае, акцептор энергии располагается близко (в идеале химически связан) с флюорофором, который выступает в роли донора. Если акцептор в не поглощающем состоянии, флюорофор светит. Если же акцептор оптически переведен в поглощающее состояние, то донор-флюорофор светить не будет, т.к. энергия возбуждения донора будет резонансно 11 передаваться акцептору за счет Фёрстеровского механизма с последующей нерадиционной релаксацией. В этом случае, PSF обычной формы будет соответствовать длине волны, которой возбуждается донор, а doughnut PSF – той, которая делает акцептор активным. STED-литография В 1990, Дэнк, Стриклер и Вебб представили двухфотонную флюоресцентную микроскопию, которая давала хорошее аксиальное разрешение без необходимости конфокализации [10]. Годом позже они показали, что двухфотонное возбуждение фотополимера позволяет хранить данные с высокой плотностью [11]. В 1997, Кавата и его коллеги применили метод для трехмерной двухфотонной полимеризационной литографии (2PPL two-photon-polymerization lithography) в негативном фоторезисте. Сейчас 2PPL обеспечивает изготовление структур с поперечными размерами 90[12], 80[13,14] и 65[15] нм, когда для двухфотонного возбуждения используется лазер в импульсном режиме с длинной волны 1030, 800 и 520 нм соответственно . Размеры структур уже ниже дифракционного предела в 2PPL из-за внутренней химической нелинейности. В литографии разрешение определяется минимальным расстоянием между двумя соседними, но еще различимыми структурами, и в настоящее время оно порядка 200 нм с использованием света в видимом диапазоне. Аналогично дальнейшему переходу двухфотонной микроскопии в двухфотонную литографию, утверждалось, что ограниченный возбуждаемый объем может быть применен к пространственному контролю фотохимических реакций в нанометровом масштабе. Как и в STED-микроскопии один лазерный импульс возбуждает фотоинициатор для полимеризации радикалов, а STED-лазер локально подавляет возможность фотоинициатора начать полимеризацию во внешнем кольце 12 PSF. Таким образом, полимеризация ограничивается внутренней частью PSF и получаем сжатие эффективной PSF. Основанные на STEDe подходы обеспечивают получение структур с размерами ниже границ 2PPL. Теоретически, это позволяет даже с помощью видимого света создавать неограниченно маленькие наноструктуры. Недавно группа Клара сообщила, что STED-2PPL позволяет создавать структуры с шириной 55 нм и поперечным разрешением 120нм [16]. Рис. 5. Установки для STED микроскопии и STED литографии Типичные установки для STED микроскопии и STED литографии представлены на рис.5. Так как в том и другом случае возбуждение происходит на одной длине волны, а гашение на другой, то необходимы два лазера. В традиционной STED конфигурации необходимо, чтобы лазер возбуждения в УФ – видимом диапазоне согласовался со спектром поглощения флюорофора. Лазеры возбуждения и гашения проходят через апертуру (для очистки пространственного 13 спектра излучения) и расширитель пучка (для полного заполнения объектива микроскопа). Фазовая маска формирует нужный профиль лазера гашения. Излучение флуоресценции проходит сквозь два дихроичных зеркала, отсеивающих излучение возбуждения и гашения, и детектируется лавинным фотодиодом. Рис. 6 Компоненты фоторезиста: PETTA (мономер) и фотоинициатор DETC. Найти подходящий фотоинициатор для STEDа очень сложно. Чтобы эффективно гасить возбужденные молекулы вынужденным излучением необходима большая сила осциллятора 𝑆1 − 𝑆0 перехода. Более того, для взаимодействия требуется довольно большое время жизни возбужденного состояния. Нужна высокая флуоресцентная квантовая эффективность. К сожалению, обычные фотоинициаторы разработаны для быстрого и эффективного внутрисистемного кроссинга и таким образом дают совсем маленькую квантовую эффективность[7]. Известны два фотоинициатора, полимеризации-деактивации: поддерживающих изопропил-тиоксантон диэтиламино-3-тиенокумарин(DETC). Квантовая (ITX), механизм 7- эффективность флюоресценции в растворе этанола для DETCa 2,5%, a для ITX 15%[17]. Время жизни S1 уровня у ITX больше, чем у DETC. Но DETC оказывается лучшим на данный момент фотоинициатором для 3D-STEDлазерного 14 письма. Причиной этому служит соотношение между вероятностью поглощения на верхние уровни 𝑆1∗ и гашения в основное состояние. Было показано, что гашение на 532 нм индуцирует преимущественно быстрое снятие возбуждения с первого синглетного состояния DETCa и следовательно эффективно предотвращает интеркомбинационный переход (ISC) в триплетное состояние, с которого начинается полимеризация радикала. Попытки дальнейшего улучшения литографии направлены на дизайн новых фотоинициаторов на основе DETCa. На рис. 6 изображены мономер Petta и фотоинициатор DETC. Рис. 7 Поглощение(черный) и флюоресцеция(зеленый) DETCа. Дополнительно представлены энергии возбуждения 15 Рис. 8 Рис.7 и 8 отражают оптические свойства красителя DETC. Рис. 9 Диаграмма Яблонского для STED наноскопии и STED литографии. На рис.9 представлены диаграммы Яблонского для STED наноскопии и STED литографии. Аналогично STED-микроскопии, где были найдены альтернативы вынужденной эмиссии, чтобы воздействовать на флюорофор, альтернативы существуют и для STED-литографии[9]. 16 Рис. 10 Альтернативы STEDу для преодоления предела Аббе. Рис.10 Показывает следующую альтернативу: ITX можно перевести в триплетное состояние и только потом запретить с помощью upконверсионного тушения инициацию полимеризации радикалов. Например, инициатор полимеризации после ISC возбуждается до верхнего триплетного состояния 𝑇𝑚 , которое распадается к основному состоянию без полимеризации. Точный механизм все же еще не понят до конца. Так же можно использовать абсорбцию на верхние синглетные уровни, т.к. они не эффективны для полимеризации. (b) демонстрирует еще одну возможность улучшения размеров структур и разрешения в одно- и двухфотонной литографии. В этой технике фотостартер не подвергается второму лучу вообще. Вместо этого добавляется второй тип фотоактивируемых молекул, которые из возбужденного состояния могут либо снять возбуждение с молекулы 17 стартера, либо остановить рост цепи полимера во внешнем круге PSF стартера. Эта идея аналогична технике фотовоздействуемых акцепторов флюоресцентной энергии в микроскопии. Обзор размеров и разрешений различных техник литографии дан в таблице 1. Из него следует, что старт-стоп техника с двухфотонным поглощением для возбуждения стартера и однофотонным – для стоппера является наилучшей. Таблица 1 Обзор экспериментов, основанных на STEDе. Достигнутые продольные и поперечные размеры и разрешение. Техника Группа Размер структуры Разрешение STED Wegener[7] 170 нм осевой 175 нм латеральное 375 нм аксиальное Klar[16] 55 нм латеральный 120 нм латеральное 53 нм аксиальный Поглощение с переходом на вышележащие состояния Fourkas[18] 40 нм аксиальный - Wegener[19] 65 нм латеральный - Стартерстоппер Scott[20] 110 нм латеральный - Gu[21] 10 нм лат. (2х фот. возб. стартера) 52 нм латеральное 40 нм (1 фот. возб. стартера) 80 нм аксиальное (2х фот.возб. стартера) Действительно, старт-стоп техника имеет один большой плюс в сравнении с другими методами, STEDом и поглощением на верхние уровни. В этих двух техниках стартер полимеризации оптически гасится во внешнем кольце PSF возбуждения, и разумно предположить, что размер эффективной PSF (область, где стартеры все еще в активном состоянии после гашения) того же порядка, что и в современной STED-микроскопии, 18 а именно всего лишь несколько десятков нанометров. Тем не менее, достигнутые размеры структур и разрешение в STED-литографии уступают разрешению в STED-микроскопии. Это может быть объяснено предположениями, что либо молекулы-стартеры диффундируют во вне эффективной PSF и размывают размер единичной объемной точки, либо цепная реакция полимеризации не достаточно бысто самопрекращается и полимеры выходят за рамки эффективной PSF. В принципе, оба эффекта могут быть подавлены, если PSF гашения будет возбуждать стопперы полимеризации, которые будут подавлять радикалы, диффундирующие стартеры и рост полимерных цепей; тем не менее в этой технике остается еще много вопросов и необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить существующие идеи. STED-наноскопия с момента своего зарождения 20 лет назад стала распространенной техникой в биологии. Дифракционный предел Аббе потерял свою значимость, и разрешение ниже 10 нм было получено с помощью видимого света. Фундаментально новые понятия были открыты в клеточной биологии и физиологии, заметно продвинулись нейрология и изучение протеинов. Аналогично STED-микроскопии, STED не единственный способ гасить фотостартеры полимеризации в литографии. В группе техник STED-микроскопии: вынужденная эмиссия, гашение основного состояния, фотохромное включение и оптическая активация деактиваторов флюоресценции. Все они уместны для гашения флюорофоров. В STED-литографии могут использоваться: вынужденная эмиссия, up-конверсия с возбужденных состояний или, возможно, оптически активируемые стопперы полимеризации. В то время как STEDмикроскопия достигла 10 нм разрешения, разрешение в STED и смежных с ним техник литографии на порядок хуже (хотя и ниже дифракционного предела). 19 Для дальнейшего развития необходимо решить следующие задачи. Чтобы еще увеличить разрешение в литографии, нужно исследовать материалы, которые подходят для построения наномасштабных структур, не дают усадки, и в то же время достаточно твердые, чтобы выдержать процессы смывки. Необходимо предотвратить диффузию возбужденных фотостартеров из объема эффективной PSF. В STED и родственных ему техниках литографии используются только негативные резисты, использование позитивных резистов может открыть новые области приложений. Несмотря на сложности, будущее STED-литографии представляется светлым и безоблачным. Влияние металлических наночастиц на излучательные свойства красителя Когда свет взаимодействует с металлической наночастицей (NP nanoparticle), ее электроны проводимости под действием электрического поля падающей волны совершают колебания, образуются коллективные осцилляции – поверхностные плазмонные резонансы (LSPRs – localized surface Plasmon resonances). Это дает радикальное изменение падающего излучения и такие удивительные эффекты как локализация электромагнитной энергии в субволновых масштабах, образование на поверхности наночастицы областей высокой интенсивности или направленного отражения света структурой. LSPRs могут соединяться с электромагнитным полем, испускаемым молекулами, атомами, квантовыми точками, расположенными в окрестности NP, это ведет к сильному изменению излучательных и неизлучательных свойств эмиттера. Можно считать плазмонные наноструктуры наноантеннами, потому что они действуют по схожему с радиоантеннами принципу, но на более высоких частотах. Обычно плазмоннные наноантенны оптических частот делают из золота и серебра из-за их хороших металлических качеств и низкой абсорбции, также из-за низкой химической активности и самое 20 главное, из-за того, что положение поверхностного плазмонного резонанса для этих металлов лежит в видимой области. Плазмонный резонанс в наноантеннах помогает преодолеть дифракционное ограничение разрешения и позволяет контролировать взаимодействие света и вещества в субволновых объемах (например, в наномасштабе в видимых частотах)[22]. Маленький модовый объем LSPR также увеличивает локальную плазмонную плотность состояний (LDOS – local density of states) вблизи NP, что позволяет изменять оптические свойства (скорость распада и квантовую эффективность) эмиттеров, расположенных в ее окрестности. Эмиттеры вблизи металлических наночастиц: взаимодействие с поверхностными плазмонами. Эффект Пёрселла. В 1946 Перселл открыл, что спонтанная эмиссия связана не только с эмиттером, но также зависит и от окружающей среды [23]. В этом случае убедителен пример атома в полости с идеально отражающими стенками. Если размер полости меньше половины длины волны атомного излучения, т.е. никакая мода не поддерживается системой на частоте испускания 𝜔, то атом не будет высвечиваться. Это значит, что мы не можем считать эмиттер и его окружение двумя различными вещами, так как они взаимодействуют и модифицируют друг друга. Спонтанная эмиссия отдельного атома происходит из-за внешнего возмущения и запрещена в картине первого квантования. Ситуация полностью меняется, если электромагнитное поле тоже квантуется (вторичное квантование). В этом случае нижнее состояние, например 1 отсутствие фотонов в системе, имеет энергию 𝐸𝑣𝑣𝑣 = ћ𝜔, что отлично от 2 нуля. Это состояние известно как состояние с нулевой энергией и происходит из-за случайных флуктуаций электрического поля – вакуума. Они могут воздействовать на отдельный эмиттер и заставить его 21 опуститься на уровень с меньшей энергией. Можно вычислить соответствующую излучательную скорость излучательных переходов, используя «золотое» правило Ферми: 𝛾= 2 � ∙ 𝐸 𝜌(𝜔), ��𝑓�𝜇̂ �𝑖�� 𝑣𝑣𝑣 ћ2 2𝜋 (5) где 𝛾 - скорость распада из начального(возбужденного) состояния |𝑖⟩ в конечное |𝑓⟩, 𝜇̂ и 𝐸�𝑣𝑣𝑣 операторы дипольного момента и вакуумного поля, вычисленные в точке расположения эмиттера, а 𝜌(𝜔) - конечная плотность состояний. Уравнение позволяет нам считать спонтанную эмиссию возбужденного состояния как вынужденную нулевыми флуктуациями вакуума. Конечная плотность фотонных состояний 𝜌(𝜔) определена так что 𝜌(𝐸)𝑑𝑑 дает число конечных состояний (мод) попадающих в интервал от 𝐸 до 𝐸 + 𝑑𝑑, где 𝐸 = ћ𝜔. Можно вычислить 𝜌(𝜔) в вакууме, считая, что электромагнитные волны заключены в кубическом объеме V: 𝜌(𝜔) = 𝑉𝜌0 = 𝑉 𝜔2 (6) 𝜋2 𝑐 3 Величина 𝜌0 локальная плотность состояний (LDOS – local density of states) для вакуума, т.е. число конечных состояний (мод) в единице объема с частотой 𝜔. С другой стороны матричный элемент перехода, усредненный по всем возможным направлениям: 2 1 ��𝑓�𝜇̂ ∙ 𝐸�𝑣𝑣𝑣 �𝑖�� = 3 𝜇𝑖𝑖 2 𝐸𝑣𝑣𝑣 2 , (7) где 𝜇𝑖𝑖 2 квадрат модуля электрического дипольного момента перехода 𝜇𝑖𝑖 = −𝑒⟨𝑖|𝒓|𝑓⟩ (8) где 𝑒 - заряд электрона, 𝒓 – оператор координаты. Электрическое поле вакуума можно получить, приравнивая электромагнитную энергию в объеме V к нулевой энергии 22 2 ∫ 𝜀0 𝐸𝑣𝑣𝑣 𝑑𝑑 = откуда ћ𝜔 2 , (9) ћ𝜔 𝐸𝑣𝑣𝑣 = � 2𝜀 Используя (10) 0𝑉 уравнения, мы получаем скорость распада отдельного эмиттера: 𝛾𝑓𝑓𝑓𝑓 = 1 𝜏𝑓𝑓𝑓𝑓 = 𝜇𝑖𝑖 2 𝜔3 (11) 3𝜋𝜀0 ћ𝑐 3 где 𝜏𝑓𝑓𝑓𝑓 – излучательное время жизни в свободном состоянии , т.е. без влияния окружающей среды. Вклад эмиттера и окружающей среды на скорость распада 𝛾 делится на две части, с точки зрения уравнения 𝛾 = 2𝜋 ћ2 2 ��𝑓�𝜇̂ ∙ 𝐸�𝑣𝑣𝑣 �𝑖�� 𝜌(𝜔). Матричный элемент учитывает квантово-механические свойства эмиттера, а плотность состояний 𝜌(𝜔) отражает влияние окружающей среды. Подобная ситуация случается, когда эмиттер помещен в полость. В зависимости от размеров, формы и состава оболочки, могут поддерживаться только определенные моды излучения. Это значит, что полость ограничивает число состояний, в которые может распасться фотон. Если, например, эмиттер расположен близко к NP, то конечная плотность состояний будет иметь пик на резонансной длине волны плазмона, что дает новый и сильный канал распада для эмиттера. 23 Рис. 11 Схематическое сравнение между плотностью фотонных состояний в полости (красный) и в свободном пространстве (синий пунктир). Если считать, что полость поддерживает только одну моду на частоте 𝜔с , то плотность состояний может быть представлена функцией Лоренца: 𝜌(𝜔) = 2 ∆𝜔 𝜋 4(𝜔−𝜔с )2 +∆𝜔2 , (12) с добротностью полости 𝑄 = 𝜔𝑐 /∆𝜔, где ∆𝜔 – ширина максимума LDOS на частоте 𝜔 = 𝜔с . Если эмиттер, помещенный в оболочку имеет электронный переход на 𝜔0 = 𝜔с , говорят что полость настроена на частоту эмиссии, а плотность состояний на 𝜔 = 𝜔0 : 𝜌(𝜔0 ) = 2𝑄 𝜋𝜔0 . (13) Используя уравнения (7), (13), (5), можно вычислить скорость распада эмиттера внутри полости : 𝛾𝑐𝑐𝑐 = 𝛽 2 2𝜇𝑖𝑖 2 𝑄 𝜀0 ћ 𝑉 , (14) |𝜇∙𝐸| где 𝛽 = |𝜇||𝐸| - фактор, учитывающий ориентацию дипольного момента. Интересно сравнить скорость распада эмиттера в оболочке и в свободном пространстве. Если 𝛽 2 = 1, 24 𝐹𝑝 = 𝛾𝑐𝑐𝑐 𝛾𝑓𝑓𝑓𝑓 = 𝜏𝑓𝑓𝑓𝑓 𝜏𝑐𝑐𝑐 = 3 4𝜋 𝑄� 2 𝜆3 𝑛3 𝑉 � (15) где 𝐹𝑝 - коэффициент Перселла, n – коэффициент отражения оболочки. 𝐹𝑝 показывает, как скорость распада эмиттера меняется в присутствии оболочки. Если 𝐹𝑝 >1, спонтанное излучение повышено; в противном случае – полость тормозит испускание. Пример этого эффекта показан на рис.12, где измеряется скорость излучательного распада молекулы красителя, расположенного вблизи пары золотых наноантенн[24]. В этом эксперименте пара наноантенн размерами 90-60-20 нм расположены на расстоянии 20 нм друг от друга. Краситель (Atto680 с квантовой эффективностью 40%) имеет время жизни 3,3 нс. Красные окружности флюоресценции (в показывают логарифмическом зависимость масштабе) интенсивности от времени резонансной частоте антенн вдали от них. Черные квадраты на – флюоресценцию красителя чуть выше наноантенн. Рис. 12 Нормированное измерение скорости флюоресценции красителя вблизи антенны (черный) и на удалении от нее (красный), с экспоненциальным приближением (синяя и черная линии). Вставка: изображение золотой нано антенны. 25 Видно, что для измерений без наноантенн (красные окружности) спад интенсивности подчиняется скорость распада наноантенн одноэкспоненциальному закону, откуда 𝛾0 ≈ 0,3нс−1 . С другой стороны, присутствие изменяет кинетику красителя, приводя к многоэкспоненциальному спаду. В этом случае можно различить два канала с разными скоростями распада. Медленный спад относится к молекулам, которые не связаны с плазмонами (LSPR) наноантенн, и дает скорость распада очень близкую к скорости в отсутствии металлической структуры (𝛾1 ≈ 0,3нс−1 ). Быстрый спад относится к расположенным в окрестности наноантенн Заметим, что молекулам, которые связаны с плазмонами. молекулы, на которые воздействуют наноантенны, высвечиваются в ~5 раз быстрее невозмущенных (𝛾2 ≈ 1,7нс−1 ). Известна интересная техника NP-STED (nanoparticle assisted) использующая специальную конфигурацию частиц: ядро легированное красителем и покрытое тонким слоем металла – золота или серебра[27,28]. В работе [28] приведено экспериментальное подтверждение того, что NPSTED позволяет достичь субдифракционного разрешения в STED с интенсивностью гашения в 4 раза меньше, чем потребовалось бы для гашения такого же флюорофора без помощи плазмонного резонатора. В работе исследовались сферические ядра диаметром 120 нм из кремнезема легированные красителем ATTO 647N, покрытые 20 нм слоем золота. 26 Рис. 13. (a) Изображение наночастиц, состоящих из легированного красителем кремнеземного ядра, покрытого слоем золота. (b) Улучшение разрешения при использовании core-shell NP от плотности мощности гашения. Синие диски – непокрытые ядра, диски с точкой – покрытые. Красный (зеленый) пунктир получен МНК. На рис.13(а) изображена структура NP, на рис.13(b) улучшение мощности в зависимости от мощности гашения. Данные результаты подтверждают действенность концепции NPSTED и открывают новые перспективы для сверхразрешения, поэтому исследования кинетики люминесценции красителя без наночастиц и в присутствии наночастиц серебра 27 является актуальной задачей. Экспериментальная часть Рис. 14 Установка MicroTime200, состоящая из конфокального и оптического блоков. Предметом нашего исследования стало изучение фотофизических свойств красителя DETC и различных структур с ним. Исследования проводились с помощью установки MicroTime200, изображенной на рис.14, состоящей из конфокального и оптического блоков. Рис. 15 Конфокальный блок (рис.15): получение изображений с разрешением близким к дифракционному пределу требует специальных способов возбуждения и детектирования. В MicroTime200 это реализованно 28 добавлением апертуры, расположенной в плоскости изображения и ограничивающей поток фонового рассеянного света. Таким образом, освещаемая область и область, с которой детектируют излучение, совпадают. Такая конфигурация позволяет только точечные измерения, и чтобы получить изображение образец перемещается относительно стационарного лазерного луча. Рис. 16 Оптический блок (рис.16): в оптическом блоке распространяется лазерный луч (диодный лазер, импульсный режим, 𝜆𝑒𝑒𝑒 = 375нм), возбуждает молекулу красителя, флюоресцентоное излучение, проходя через апертуру (pinhole), детектируется SPADом (Single Photon Avalanche Diode). Излучение лазера отражается зеркалами и не детектируется. Встроенная CCD камера служит для диагностики точности фокусировки. 29 Основным параметром исследования являлось время жизни уровня, обеспечивающего флюоресценцию. Самым чувствительным методом для измерения времени жизни является TCSPC (Time-Correlated Single Photon Counting). Метод основан на точном измерении времени между моментом возбуждения и моментом прибытия в детектор фотона флюоресценции. Измерение задержки проводится большое число раз для учета статистической природы флюоресцентного испускания, по полученным данным строится гистограмма. Анализируя эту гистограмму, можно получить время жизни и амплитуду сигнала. Исследование красителя DETC Был снят спектр люминесценции образца DETCа в растворе с мономером PETTA. Полученные данные находятся в соответствии с полученными известными результатами. Рис. 17 Получены гистограммы для определения времени жизни. 30 Рис. 18 TCSPC гистограмма для DETC. Рис. 19 Гистограмма времен жизни для DETC На основании полученных данных имеем, что время жизни фотоинициатора DETC 2,48 нс. Для изучения влияний металлических наночастиц на излучательные свойства красителя был исследован образец, состоящий из нанокомпозитных объектов, в составе которых имеется DETC, полимер и наночастицы серебра. 31 Рис. 20 Рис. 21 Гистограмма времен жизни для нанокомпозита 32 Рис. 22 TCSPC гистограмма для нанокомпозита На основании полученных данных имеем среднее время жизни возбужденного уровня красителя DETC составе нанокомпозита 1,87нс; Долгоживущие уровни 2,92 нс; короткоживущие 1,03 нс. Короткоживущий уровень соответсвует молекулам расположенным вблизи металлических наночастиц, а долгоживущий – не взаимодействующим с плазмонами молекулами. 33 Заключение В рамках данной работы были рассмотрены следующий вопросы: Рассмотрен STED метод преодоления дифракционного предела Аббе в микроскопии и литографии; Сформулированы требования к молекуле фотоинициатора для STED фотолитографии и представлены оптические свойства красителя DETC в органической матрице; Экспериментально показано влияние наночастиц металла на оптические свойства молекулы красителя DETC, что может способствовать более эффективному гашению. 34 Список литературы 1. S.W.Hell, J.Wichmann, Opt. Lett. 19 (1994) 780. 2. S.W.Hell, M.Kroug, Appl. Phys. B 60 (1995) 495. 3. J.Boechhoefer, arXiv:1405.1118v1 [physics.optics]. 4. M.Dyba, S.W.Hell, Phys. Rev. Lett. 88 (2002) 163901. 5. S.W.Hell, Physics Letters A 326, (2004) 140 -145. 6. T.A.Klar, S.W.Hell, Opt. Lett. 24 (1999) 954-6. 7. J.Fischer, M.Vegener, arXiv:1105.5703 [physics.optics]. 8. E.Rittweger, K.Y.Han, S.E.Irvine, S.Eggeling, S.W.Hell, Nat. Photonics 3 (2009) 144-7. 9. T.A.Klar, R.Wollhofen, J.Jacak, Phys. Scr. T162 (2014) 014049 (10pp). 10. W.Denk, J.H.Strickler, W.W.Webb, Science 248 (1990) 73-6. 11.J.H.Strickler, W.W.Webb, Opt. Lett. 16 (1991) 1780-2. 12.F.Burmeister, Laser Appl. 24 (2012) 042014. 13.J.F.Xing, Appl. Phys. Lett. 90 (2007) 131106. 14.P.V.Ferreras, Laser Appl. 24 (2012) 042004. 15.W.Haske, Opt. Exp. 15 (2007) 3426-36. 16.R.Wollhofen, J.Katzmann, C.Hrelescu, J.Jacak, T.A.Klar, Opt. Exp. 21 (2013) 10831-40. 17.Thomas J.A.Wolf, Ultrafast photophysics and photochemistry of radical precursors in solution, KIT Scientific Publishing 2013. 18.L.Li, R.Gattass, E.Gershgoren, H.Hwang, J.T.Fourkas, Science 324, 910-3 (2009). 19.J.Fischer, J.Freymann, M.Vegener, Adv. Mater. 22 3578-82 (2010). 20.T.F. Scott, B.A.Kowalski, A.C.Sillivan, C.N.Bowman, R.R. McLeod, Science 324, 913-7 (2009). 21.Y.Y.Cao, Z.Gan, B.Jia, R.A.Evans, M.Gu, Opt. Exp. 19 19486-94 (2011). 22.V.Giannini, A.I.Fernandez-Dominguez, S.C.Heck, S.A.Maier, Chem.Rev.2011, 111, 3888-3912. 35 23.E.M.Purcell, Phys. Rev. 1946, 69, 681. 24.O.L.Muskens, V.Giannini, J.A.Sanchez-Gil, J.Gomes Rivas, Nano Lett. 2007, 7, 2871. 25.J.Fischer, M.Vegener, Laser Photonics Rev.7, No.1, 22-44, 2013. 26.Y.Sivan, Y.Sonnefraud, S.Kena-Cohen, J.B.Pendry, S.A. Maier, ACSNano, vol.6, no.6, 5291-5296, 2012. 27.Y.Sivan, Appl. Phys. Lett. 101, 021111 (2012). 28.Y.Sonnefraud, H.G.Sinclair, Y.Sivan, M.R.Foreman, C.W.Dunsby, M.A.A.Neil, P.M. French, S.A.Maier, Nano Lett. 2014, 4449-4453. 29. B.Huang, M.Bates, X.Zhuang, Annu. Rev. Biochem. 2009. 78:993–1016 36
