ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ГЕПАРИНА А.Е. Хомутов

УДК 612.812
ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ГЕПАРИНА
А.Е. Хомутов, М.Б. Звонкова, М.Е. Пахомова
Нижегородский госуниверситет
Гепарин, применяемый в физиологии и медицине в основном как антикоагулянт, обладает широким спектром физиологической активности. Взаимодействуя со многими химическими соединениями, гепарин может модифицировать их влияние на организм и даже придавать им новые свойства.
Показан модулирующий эффект гепарина на фермент-субстратные взаимодействия, активность факторов роста, действие гормонов и отравляющих
веществ. Химическая гетерогенность молекул гепарина, выделенных из разных источников, является предпосылкой для регуляции его функциональной
активности в организме.
Эндогенный сульфатированный гликозаминогликан гепарин уже давно привлекает внимание исследователей во всем мире. Несмотря на то, что гепарин считают наиболее изученной молекулой в организме, его роль все еще до конца не
определена (Hamphries et al., 1999). Это связано отчасти с вариабельностью
строения гепарина в различных тканях и у разных видов, которая обусловливает
различия в его свойствах (Ляпина, 1987). Так, например, молекулярная масса
(длина полисахаридного остова) и степень сульфатирования гепарина могут влиять на его способность связывать красители, ферменты, факторы роста сосудистого эпителия (Jiao et а1., 1999; O’Farrell et а1., 1999; Soker et а1., 1994). Но главная
загадка гепарина — его необычайная полифункциональность, не свойственная
более ни одной другой биологической молекуле. Гепарин является биорегулятором необычайно широкого спектра действия и играет особую роль в поддержании
гомеостаза (Орлов, 2000). В зависимости от специфики исследований разные ученые концентрировали свое внимание на антикоагулянтных, липолитических, гипогликемических, антигипоксических, противовоспалительных свойствах гепарина (Кудряшов, 1975; Лукашин, 1982; Ляпина, 1987; Ульянов и др., 1989; Кондашевская, Ляпина, 1998а). В рамках одной статьи невозможно рассмотреть все проблемы, связанные с этим интересным веществом. Поэтому мы попытались представить преимущественно работы, посвященные механизмам действия гепарина.
Одно из центральных свойств гепарина, обеспечивших его широкое применение в клинике и эксперименте, — его антикоагулянтная активность. Гепарин ингибирует все фазы свертывания крови, вступая во взаимодействие с форменными
элементами, белками плазмы, тромбоцитарными факторами, а также выполняя
роль регулятора ферментативной активности. Полученные in vitro и образующиеся в кровотоке комплексы гепарина с тромбином, фибриногеном, антиплазмином,
фактором XIII, а также тироксином, некоторыми биогенными аминами (серотонином, адреналином) обладают литическим действием на нестабилизированный
фибрин и антикоагулянтной активностью (Кудряшов, 1975).
Интереснейшей особенностью гепарина является его способность регулировать активность многих ферментов, причем механизмы действия могут быть раз128
личны. Свойство гепарина блокировать активность сериновых протеиназ системы
свертывания крови обусловило его применение в клинике для лечения тромбозов.
Гепарин способен взаимодействовать со всеми сериновыми протеиназами системы свертывания крови с образованием комплексов, в которых активность протеиназ блокируется либо непосредственно, либо на такие протеиназы более эффективно действует их ингибитор — антитромбин (Ляпина, 1980).
Другие сериновые протеиназы, в частности, трипсин, также взаимодействуют
с гепарином. Было показано, что гепарин оказывает дестабилизирующее действие
на трипсин (Миргородская и др., 1978). При изучении механизмов, посредством
которых гепарин может модулировать активность сериновых протеиназ, выяснили, что гепарин вызывает быстрые конформационные изменения трипсина, сопровождающиеся необратимой денатурацией и деградацией протеиназы (Finotti,
Manente, 1994). Исследователи предположили, что гепарин катализирует окислительную деградацию трипсина, обусловленную высвобождением кислородных
радикалов, которые отвечают за временное увеличение каталитических функций
трипсина, наблюдаемую в начальный период. В дальнейшем теми же авторами
было показано, что окислительное действие гепарина на трипсин может модифицироваться в присутствии других восстанавливающих агентов. Например, низкие
концентрации гепарина повышали окислительный потенциал глюкозы по отношению к трипсину, а высокие концентрации, напротив, понижали его (Finotti,
1997).
Еще один фермент в организме человека и животных также непосредственно
связан с гепарином — протеаза 1 тучных клеток (химаза). Химаза представляет
собой сериновую протеазу, близкую по ряду свойств к химотрипсину и секретируемую исключительно тучными клетками соединительных тканей. Химаза хранится в секреторных гранулах клеток в виде комплекса с гепарин-протеогликаном
и при активации тучных клеток выходит в таком виде из клетки. Найдено, что эндогенный гепарин-протеогликан защищает химазу от действия протеазных ингибиторов (Pejler, Berg, 1995). Кроме того, гепарин может изменять скорость деградации химазой субстрата (например, анафилатоксина С3а), который в обычных
условиях устойчив к действию фермента (Gervasoni et а1., 1986). Инактивирующее действие химазы на тромбин также значительно усиливается при оптимальной концентрации гепарина (Pejler, Karlström, 1993). В случае нарушения гепарин-связывающего сайта тромбина (при исследовании мутантной молекулы
тромбина или после инкубации тромбина с олигонуклеотидами) стимулирующий
эффект гепарин-протеогликана на инактивацию тромбина химазой был менее выражен (Pejler, Sadler, 1999). Авторы предполагают, что механизм, посредством которого гепарин может стимулировать активность химазы, заключается в одновременном связывании химазы и субстрата, поскольку гепарин блокирует положительно заряженные участки на химазе и таким образом снижает уровень электростатического отталкивания между химазой и положительно заряженными субстратами.
D.Е. Humphries et а1. (1999) изучали трансгенных мышей с поврежденным геном N-деацетилазы/N-сульфотрансферазы, которые не могли синтезировать полностью сульфатированный гепарин, и выяснили, что гепарин контролирует через
пост-трансляционные механизмы уровень положительно заряженных протеаз в
гранулах тучных клеток (протеаз 4 и 5 тучных клеток мыши и карбоксипептидазы
А).
129
Гепарин оказывает просветляющее действие на липемическую плазму крови,
являясь активатором липопротеидной липазы крови (Кудряшов, 1975). Было показано, что гепарин может стабилизировать липазу печени in vitro, не влияя на активность фермента (Schoonderwoerd et а1., 1981), а также обладает способностью
высвобождать капиллярную липопротеидлипазу и печеночную триглицеридлипазу в кровоток (Williams, Johnson, 1989). По современным представлениям, гепарин путем конкурентного взаимодействия вытесняет липопротеидлипазу из ее соединения с гепарансульфатом, являющимся одним из компонентов внешней поверхности мембраны эндотелиальной клетки. В результате этого процесса осуществляется поступление фермента в циркулирующую кровь (Алекперов, Алиев,
1987).
Гепарин специфически ингибирует казеинкиназу 2, не зависимую от циклических нуклеотидов протеинкиназу, но в то же время не оказывает влияния на другие протеинкиназы, включая казеинкиназу 1, ц-АМФ-зависимые протеинкиназы
типа I и II, протеаза-активируемую киназу 1 (Hathaway et а1., 1980). Более подробные исследования позволили выяснить, что гепарин действует как конкурентный ингибитор по отношению к субстрату — казеину. F. O’Farrell et а1. (1999)
показали, что сила ингибирования казеинкиназы 2 зависит от длины молекулы
гепарина. Так, фрагмент гепарина из 24 моносахаридных остатков был наиболее
активным (константа ингибирования была как у коммерческого нефракционированного гепарина). Сокращение молекулы гепарина до 8–12 моносахаридных остатков значительно ослабляло ингибирующий эффект.
Регуляторные свойства гепарина не исчерпываются взаимодействием с ферментами. Очень перспективны работы, посвященные влиянию гепарина на ростовые факторы. Например, факторы роста фибробластов (ФРФ), специфические
белки с широким спектром биологической активности взаимодействуют с двумя
рецепторами: ФРФ-рецептором трансмембранной тирозинкиназы и гепарансульфат-родственным протеогликаном внеклеточного матрикса. Эти компоненты
формируют комплекс ФРФ-рецептор ФРФ-протеогликан, который запускает процесс трансдукции сигнала посредством димеризации рецептора ФРФ (Faham et
а1., 1998). Гепарин может стимулировать аутофосфорилирование рецепторов 4
(но не рецепторов 1) ФРФ и таким образом запускает фосфорилирование по тирозину ряда сигнальных систем и стимулирует пролиферацию клеток (Gao,
Goldfarb, 1995). Гепарин и гепарансульфат влияют на связывание фактора роста
сосудистого эпителия VEGF165 соответствующими рецепторами эндотелиальных
клеток, причем фрагменты гепарина из 16–18 моносахаридных остатков ингибируют связывание, а фрагменты большего размера, напротив, способствуют связыванию. Образцы гепарина с большим содержанием сульфата были более активны,
чем нативный или О/N-десульфатированный гепарин (Soker et а1., 1994).
Множество работ посвящено модулирующему действию гепарина на самые
различные биологически активные вещества эндогенной и экзогенной природы.
Связываясь с гепарином, эти вещества могут изменять свою активность (усиливая
или ослабляя типичные эффекты) или приобретать не свойственные им ранее
функции. Так, например, в лаборатории Б.А. Кудряшова были исследованы комплексы гепарина с различными веществами по отношению к гемостазу: с адреналином и серотонином, тироксином, мочевиной (Кудряшов, 1975), с аспирином
(Кудряшов, Ляпина, 1977), с гистамином (Кудряшов и др., 1990), с пирацетамом
(Кондашевская, Ляпина, 1998б), с метионином (Ляпина и др., 1999). Многие из
этих веществ в отсутствии гепарина не оказывали действия на систему крови, а в
130
комплексе с гепарином приобретали антикоагулянтные свойства. Адреналин и
гистамин, связанные с гепарином, не проявляли своего типичного действия на
сердечно-сосудистую систему. А.М. Ульянов и др. (1989) выяснили, что комплекс
гепарина с инсулином оказывал значительно более выраженное гипогликемическое действие, чем инсулин в эквивалентной дозе.
В работе на изолированном сердце было выяснено, что гепарин оказывает модифицирующее действие на кардиостимулирующие свойства некоторых регуляторных пептидов (инсулина, тиролиберина, АКТГ4-10 фрагмента семакса) и снижает токсические эффекты мелиттина (основного компонента пчелиного яда) (Орлов, 2000).
В ряде работ отражена способность гепарина снижать токсичность некоторых
ядовитых веществ. В экспериментах на животных было доказано защитное действие гепарина при отравлении змеиными ядами, пчелиным ядом (Хомутов, Орлов,
1987). Предварительное введение крысам гепарина снижало токсические эффекты, вызванные внутрибрюшинным введением этанола и ацетальдегида (Бакаринов, 2000).
В основе многих биологических свойств гепарина в организме лежит его комплексообразующая способность, реализующаяся путем электровалентного взаимодействия анионных группировок полисахарида с катионными группами белков
и других соединений (Алекперов, Алиев, 1987). Участки полипептидной цепи
ферментов, взаимодействующих с гепарином, содержат, как правило, аминокислотные остатки аргинина и лизина. Например, печеночная липаза и эндотелиальная липопротеидлипаза имеют по три таких участка, один из которых полностью,
а остальные частично консервативны (Sendak et а1., 2000). Белок антитромбин III
содержит последовательность из основных аминокислот (LYRKANKS), с которой
связывается гепарин посредством пентасахаридного антитромбин III-связывающего сайта. Пептиды с нарушенной последовательностью аминокислот способны лишь к неспецифическому связыванию с гепарином (Bae et а1., 1994). При
изучении положительно заряженных олигопептидов LWL и RWR было показано
взаимодействие остатков триптофана с сульфатными группами гепарина
(Mascotti, Lohman, 1995). Примечательно, что некоторые зоотоксины, для которых
показана способность взаимодействовать с гепарином (мелиттин пчелиного яда,
нейротоксины яда кобры), также имеют в своем составе такие аминокислотные
остатки, как аргинин, лизин и триптофан (Орлов, Гелашвили, 1985).
Таким образом, полифункциональные свойства гепарина во многом связаны со
способностью его молекулы вступать во взаимодействие с молекулами химических веществ, относящихся к различным классам соединений.
ЛИТЕРАТУРА
Алекперов А.Ф., Алиев А.М. Комплексообразование гепарина с органическими катионами // Фармация. 1987. Т. 36, № 1. С. 80–85.
Бакаринов П.В. Физиологическая характеристика защитных свойств гепарина при действии экзогенного этанола на организм: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. Н. Новгород,
2000.
Кондашевская М.В., Ляпина Л.А. Новое свойство комплекса гепарин-серотонин //
Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1998а. № 10. С. 425–427.
131
Кондашевская М.В., Ляпина Л.А. Комплекс гепарин-пирацетам, его действие на кровь
и кровоток // Изв. АН, сер. биол. М., 1998б. № 6. С. 758–761.
Кудряшов Б.А. Биологические проблемы регуляции жидкого состояния крови и ее
свертывания. М., 1975.
Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А. Комплекс гепарин-аспирин, его физико-химические и физиологические свойства // Вопр. мед. хим. 1977. Т. 23, вып. 1. С. 44–51.
Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А., Азаева Л.Д. Комплексное соединение гепарина с гистамином, его физико-химические и биологические свойства // Вопр. мед. хим. 1990. № 4.
С. 55–57.
Лукашин Б.П. Роль гепарина в повышении неспецифической резистентности организма // Патофизиология и эксперим. терапия. 1982. № 5. С. 81–87.
Ляпина Л.А. О взаимодействии гепарина с сериновыми протеиназами системы свертывания крови // Физиология человека. 1980. Т. 6, № 2. С. 265–273.
Ляпина Л.А. Физиологические функции гепарина // Успехи современной биологии.
1987. Т. 103. Вып. 1. С. 66–80.
Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Заадетданова Г.А. Комплекс гепарина с метионином и
его противосвертывающий эффект // Вестник Московск. ун-та, сер. биол. М., 1999. № 2.
С. 3–6.
Миргородская О.А., Тенникова Т.Б., Москвичев Б.В. Некоторые особенности взаимодействия трипсина с гепарином // Биохимия. 1978. Т. 43, вып. 10. С. 1924–1928.
Орлов А.В. Модифицирующее влияние гепарина на проявление кардиотропных эффектов физиологически активных веществ пептидной природы: Автореф. дисс. ... канд. биол.
наук. Н. Новгород, 2000.
Орлов Б.Н., Гелашвили Д.Б. Зоотоксинология. М., 1985.
Ульянов А.М., Шапиро Ф.Б., Ляпина Л.А. Гипогликемическая активность комплекса
инсулин-гепарин и условия ее проявления // Патофизиология и эксперим. терапия. 1989.
№ 1. С. 54–57.
Хомутов А.Е., Орлов Б.Н. Физиологическая роль гепарина. Горький,1987.
Bae J., Desai U.R., Pervin A. et al. Interaction ofheparin with synthetic antithrombine III
peptide analogues // Biochem. J. 1994. V. 301, № 1. P. 121–129.
Faham S., Linhardt R.J., Rees D.C. Diversity does make a difference: fibroblast growth factor-heparin interactions // Curr. Opin. Struct. Biol. 1998. № 8. P. 578–576.
Finotti P. Biphasic pattern ofheparm-induced oxidative degradation oftrypsin in the presence
of glucose // Biochimie. 1997. V. 79, № 6. P. 356–358.
Finotti P., Manente S. Heparin-induced structural and functional alterations of bovine trypsin
// Biochim. Biophys. Acta. 1994. V. 1207, № 1. P. 80–87.
Gao G., Goldfarb M. Heparin can activate a receptor tyrosine kinase // EMBO J. 1995. V. 14,
№ 10. P. 2183–2190.
Gervasoni J.Е., Conrad D.H., Hugli T.E. et al. Degradation of human anaphylatoxin C3a by
rat peritoneal mast cells: a role for the secretory granule enzyme chymase and heparin proteoglycan // J. Immunol. 1986. V. 136, № 1. P. 285–92.
Hathaway G.M., Lubben T.H., Trough J.A. Inhibition of casein kinase II by heparin // J.
Biol. Chem. 1980. V. 255, № 17. P. 8038–8041.
Humphries D.Е., Wong G.W., Friend D.S. et al. Heparin is essential for the storage of specific granule proteases in mast cells // Nature. 1999. V. 400, № 6746. P. 769–772.
Jiao Q.S., Liu Q., Sun C., He H. Investigation of the binding site in heparin by spectrophotometry // Talanta. 1999. V. 48, № 5. P. 1095–1101.
132
Mascotti D.P., Lohman T.M. Thermodynamics of charged oligopeptide-heparin interactions
// Biochemistry. 1995. V. 34, № 9. P. 2908–2915.
О’Farrell F., Loog M., Janson I.M., Ek P. Kinetic study of the ingibition of CK2 by heparin
fragments of different length // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1433, № 1–2. P. 68–75.
Pejler G., Berg L. Regulation of rat mast cell protease I activity. Protease inhibition is prevented by heparin proteoglican // Eur. J. Biochem. 1995. V. 233, № 1. P. 192–199.
Pejler G., Karlström A. Thrombin is inactivated by mast cell secretory granule chymase //
J. Biol. Chem. 1993. V. 268, № 16. P. 11817–11822.
Pejler G., Sadler J.E. Mechanism by which heparin proteoglycan modulates mast cell chymase activity // Biochemistry. 1999. V. 38, № 37. P. 12187–12195.
Schoonderwoerd K., Hülsmann W.C., Jansen H. Stabilization of liver lipase in vitro by
heparin or by binding to non-parenchymal liver cells // Biochim. Biophys. Acta. 1981. V. 665,
№ 2. P. 317–321.
Sendak R.A., Berryman D.E., Gellman G. et al. Binding of of hepatic lipase to heparin. Identification of specific heparin-binding residues in two distinct positive charge clusters // J. Lipid
Res. 2000. V. 41, № 2. P. 260–268.
Soker S., Goldstaub D., Svahn C.M. et al. Variations in the size and sulfation of heparin
modulate the effect of heparin on the binding of VEGF165 to its receptors // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1994. V. 203, № 2. P. 1339–1347.
Williams S.P., Johnson E.A. Release of lipoprotein lipase and hepatic triglyceride lipase in
rats by heparin and other sulphated polysaccharides // Thromb. Res. 1989. V. 55, № 3. P. 361–
368.
133