Водорастворимые препараты амфифильных
Реклама
Российский химико-технологический университет имени Д.И.Менделеева На правах рукописи Шаймурзин Али Хафизович Водорастворимые препараты амфифильных полимеров 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель доктор химических наук, профессор Штильман М.И. Москва – 2015 СОДЕРЖАНИЕ 1. ВВЕДЕНИЕ 5 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10 2.1. Полимерные носители 10 2.1.1. Ультрадисперсные частицы 11 2.1.1.1. Строение и форма ультрадисперсных частиц 11 2.1.1.2. Образование мицеллярных систем 13 2.1.1.3. Образование микроэмульсий 15 2.1.1.4. Наноэмульсии 15 2.1.1.5. Виды нанодисперсных систем 16 2.1.2. Наноносители 18 2.1.2.1. Полимеры с иммобилизованными БАВ 21 2.1.2.2. Системы с контролируемым выделением БАВ 22 2.1.2.3. Полимеры с химически связанным БАВ 23 2.1.2.4. Формы с нехимически введенным БАВ 24 2.1.3. Амфифильные полимеры 26 2.1.3.1. Строение амфифильных полимеров 26 2.1.3.2. Структура амфифильных полимерных материалов 27 2.1.4. Фитоактивные полимеры 28 2.1.5. Водорастворимые полиэлектролиты 29 2.2. Поливинилпирролидон и его свойства 30 2.3. Полиакриламид и его свойства 31 2.4. Биологически активные вещества 32 2.4.1. Биологическая активность 32 2 2.4.2. Цитокинины. 6-бензиламинопурин 33 2.4.3. Физиологическая роль 6-бензиламинопурина 35 2.4.4. Нуклеиновые основания 36 2.4.5. Пуриновые и пиримидиновые основания 41 2.4.6. БАВ на примере 5-фторурацила 42 2.5. Биологически активные системы с использованием полимеров 43 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. 45 3.1. Выбор метода получения препаратов 45 3.2. Влияние концентрации условий синтеза на выход полимеров 47 3.3. Определение молекулярной массы и растворимости исследуемых амфифильных полимеров и сополимеров 48 3.4. Влияние температуры реакции на процесс сополимеризации 51 3.5. Влияние суммарной концентрации мономеров на процесс полимеризации 52 3.6. Исследования кинетики выделения аденина в препаратах с обычным и амфифильным поливинилпирролидоном 54 3.7. Исследования кинетики выделения 6- бензиладенина и урацила в препаратах с различными носителями. 55 3.8. Исследование зависимости размеров частиц препарата от молекулярной массы амфифильного полимера. 58 3.9. Исследование природы связи в препарате и его устойчивости 60 3.10. Сравнительная характеристика выхода 5-фторурацила из растворов с и без амфифильного полимера. 61 3.11. Определение устойчивости препарата 64 3.12. Определение состава образующихся комплексов с ДНК 64 3.13. Оценка устойчивости комплексов с ДНК в водно-солевых средах 67 3 3.14. Исследование взаимодействия полимерных мицелл, в том числе их комплексов с доксорубицином и ДНК, с клетками 75 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 89 4.1. Выбор метода синтеза амфифильных полимеров 92 4.2. Получение амфифильного полимера N-винилпирролидона 93 4.3. Полимеризация N-винилпирролидона в присутствии меркаптосоединений 95 4.5. Получение амфифильного полимера в две стадии 95 4.5.1. Полимеризация N-винилпирролидона в присутствии меркаптосоединений 96 4.5.2.Модификация полимеров, содержащих концевую карбоксильную группу 96 4.5.3.Модификация полимеров, содержащих концевую аминогруппу 4.6. Получение амфифильных сополимеров 97 97 4.7. Определение максимального значения показателя светопоглощения для биологически активных веществ 98 4.8. Процесс иммобилизации на примере аденина 99 4.9. Получение полимерных наночастиц с 6-бензиладенином 99 4.10. Получение препарата амфиильного поли-N-винилпирролидона с 5-фторурацилом 102 4.11. Получение полимерных наночастиц с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями 4.12.Получение препаратов, 105 сформированных из функциональных амфифильных полимеров с ДНК 111 5. ВЫВОДЫ 119 6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 121 4 1. ВВЕДЕНИЕ Актуальность работы. В современной химии биологически активные полимеры (далее БАП) различного назначения выделились в отдельную область химии технологии высокомолекулярных соединений, тесно связанную с другими областями. Среди таких полимеров в первую очередь следует отметить иммобилизованные биокатализаторы, полимерные биоциды, лекарственные полимеры, аффинные и иммуносорбенты, и т. п. В частности, большой интерес представляют высокомолекулярные соединения, способные доставлять биологически активные вещества (далее БАВ) к пораженному органу и влиять на рост и развитие растений (так называемые фитоактивные полимеры) и обладающее существенным преимуществом перед известными низкомолекулярными регуляторами. Ценность данных полимеров в их биологической активности и в выполнении роли носителя, то есть в доставке и выделении из них при гидролизе низкомолекулярного БАВ. Данные препараты с фитоактивным полимером относятся к типичным системам с контролируемым выделением активного вещества (controlled release). Такие системы широко исследуют и применяют в различных областях. Фитоактивные полимеры, по сути, являются аналогами содержащихся в организме живых существ и растений депонированных форм фитогормонов, которые представляют собой конъюгаты жизненноважных биологически активных веществ с природными высокомолекулярными соединениями. Благодаря использованию данных препаратов можно устранить следующие, типичные для низкомолекулярных веществ, недостатки: плохая растворимость в воде, узкие диапазоны стимулирующих доз концентраций и проявление фототоксичности при превышении этих диапазонов. Таким образом, применение БАВ в системе с данным полимером обеспечивает его поступление в течение необходимого и заданного времени, что существенно повышает эффективность препарата. Одним из оптимальных способов 5 получения данных препаратов является иммобилизация, так называемый процесс связывания наноразмерных БАВ с полимером в водном растворе. Метод иммобилизация БАВ, клеток и ферментов увеличивает их активность и повышает продуктивность синтеза запасных и физиологически активных веществ, в связи с чем иммобилизациязанимает важное место в биохимической технологии. Более того, эффективность процессов, котрые происходят в самых разных областях человеческой деятельности: медицина, энергетика, пищевая промышленность, микроэлектроника и другие, увеличилась благодаря использованию иммобилизованных препаратов. В результате исследований и синтеза амфифильных полимеров установлено, что их препараты с БАВ обладают целым рядом существенных преимуществ перед низкомолекулярными аналогами: пролонгированным действием, заданным уровнем растворимости в воде, пониженной токсичностью и фитотоксичностью, активностью при невысоких дозах и концентрациях. Сам синтез фитоактивных полимеров представляет из себя достаточно сложный процесс, что затрудняет их производство и применение, но в данной работе она решена за счёт применения так называемых полимеров с дифильным строением-амфифильных полимеров. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы – получить и исследовать препараты с различными БАВ с амфифильным полимером в виде товарной таблеточной формы, подобрать оптимальный состав полимерноситель – активное вещество, провести с некоторыми препаратами испытание и дать представления о его промышленном использовании. Диссертация посвящена созданию и исследованию препаратов новых наноразмерных форм БАВ и регуляторов роста и развития растений (РРРР). Для выполнения данной цели были поставлены следующие задачи: – синтез амфифильных полимеров и сополимеров на основе поливинилпирролидона и полиакриламида, содержащих в боковой цепи группы с кратными связи, в количестве достаточном для образования трехмерной пространственной структуры в результате сшивки по свободно-радикальному механизму в присутствии 6 инициаторов радикальной полимеризации, при незначительном изменении физико-химических свойств модифицированного полимера, по сравнению с исходным, исследование процесса модификации поливинилпирролидона; – исследование свойств полимеров – их растворимость в различных растворителях, молекулярная масса (по концевой группе методом оксимирования), снятие спектров ИК и УФ для полимеров с различной молекулярной массой (ММ); – исследование способности полимеров различного строения к образованию агрегатов (определены значения критической концентрации мицелообразования (ККМ), их устойчивость при разбавлении, размер агрегатов при различных способах формирования, распределение частиц по размерам). Обоснование выбора объектов исследования. Конкретным объектом исследования стали широко применяемые в медицине 5-фторурацил и ДНК, нуклеиновые основания и препараты регуляторов роста растений (РРР) с 6бензиламинопурином на полимерных носителях - амфифильных полимерах: поливинилпирролидон и полиакриламид, полученные в результате радикальной полимеризации с хлорангидридом стеариновой кислоты и сополимеры поливинилпирролидона и полиакриламида с полиакриловой кислотой. Использование указанных полимеров позволило получить стабильные амфифильные высокомолекулярные соединения, что в свою очередь позволило получить препараты в водных растворах и в пригодной товарной форме. Использование вышеуказанных БАВ и РРР цитокининовой группы – аденин и его 6-N-замещенные обосновано востребованносью данных БАВ в различных ораслях, простотой метода получения и дешевизной, а также их способностью принимать различные таутомерные формы. 7 Научная новизна. В настоящей работе разработаны методы получения наноагрегатов на основе водорастворимых амфифильных полимеров, включающих 5-фторурацил, используемый при лечении онкологии, ДНК и РРРР цитокининовой группы – аденин и его 6-N-замещенные; исследованы условия получения таких наноагрегатов, их свойства, в частности устойчивость в водных средах, кинетика выделения из них активного вещества, а также активность регуляторов, включенных в наноформы, с активностью не включенных БАВ и предложены основы технологии их получения и технологии их применения. Практическая значимость работы. В работе получены новые препараты БАВ и регуляторов роста растений, обладающие высокой стабильностью, значительным водопоглощением, незначительно изменяющимся при изменении внешних условий - ионной силы, а также, как уже было отмечено выше, существенными преимуществами перед низкомолекулярными аналогами – пролонгированным действием, заданным уровнем растворимости в воде, пониженной токсичностью и фитотоксичностью, активностью при невысоких дозах и концентрациях. Предложено использовать разработанные по методу, указанному в данной работе водные растворы амфифильных полимеров в качестве препаратов для применения в медицине при лечении тяжелых болезней (с 5фторурацилом, ДНК) и в сельском хозяйстве (с 6-бензиламинопурином) на различных культурах с целью повышения урожайности, его сохранения при неблагоприятных климатических условиях, для повышения устойчивости растений к засухе, заморозкам в районах рискованного земледелия и регулирования роста растений. Препараты используют главным образом в виде водных растворов и дисперсий для внутреннего применения в лечебных целях и опрыскивания растений в стадии вегетации, обработки семян, клубней, черенков и т.п. и лишь изредка-путем внесения в почву. 8 Публикации. Основные положения и результаты работы изложены в 7 печатных работах, в том числе, в 2 статьях в журналах и сборниках, 5 тезисах докладов, получен один патент - «Фармацевтическая композиция для применения в онкологии» (RU 2560702). Объем и структура работы. Диссертация изложена на 129 страницах, состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы; содержит 20 таблиц, 67 рисунков, 106 библиографических ссылок. 9 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Сегодня в любой отрасли, в том числе и в биохимии большое внимание привлекают инновационные препараты и материалы на стыке наук, каковыми являются назначения (materials предназначенные для полимерные for материалы medico-biological создания изделий, медико-биологического use) – продуктов т.е. материалы, и препаратов, применяемых в медицине, биотехнологии, сельском хозяйстве и т.п. и используемых для обеспечения и оптимизации жизнедеятельности человека, животных, растений, микроорганизмов. Во многих случаях материалы медико-биологического назначения (биоматериалы, biomaterials) функционируют в непосредственном взаимодействии с живыми тканями и клеточными объектами [1]. Работы в области полимерных биоматериалов являются частью чрезвычайно широкой и важной области – химии и технологии полимеров медико-биологического назначения. 2.1. Полимерные носители Полимерные носители – это новый вид водорастворимых синтетических полимеров, способных химически связывать биологически активные и лекарственные вещества, биорегуляторы другого назначения и биоциды, предназначенные для применения в медицине, биотехнологии, растениеводстве, ветеринарии, пищевой и косметической промышленности, биоанализе. Как ясно из названия, полимерные носители служат, как соединения для доставки необходимых веществ до требуемого органа и ткани. В зависимости от назначения предлагаемые полимеры могут быть синтезированы как: - линейными: водорастворимые биологически безвредные высокомолекулярные соединения с оптимальным молекулярно-массовым 10 распределением, могут содержать при необходимости в основной цепи гидролизуемые группы (определяет возможность их биодеградации, а значит обеспечивает полное выведение полимеров и продуктов их распада из организма при инъекционном реакционноспособные группы, введении), способные а также связывать боковые иммобилизуемые лиганды различными типами химической связи; - амфифильные водорастворимые полимеры, которые содержат наряду с основной гидрофильной цепью одну концевую алифатическую гидрофобную группу и способны ориентироваться на границе разно полярных жидкостей и на границе жидкость-воздух, могут использоваться, например, при получении липосом, обладающих повышенной устойчивостью в кровеносном русле; - функциональные суперпористые гидрогели: содержат сквозные поры с размером до десятков микрон с высокой объемной устойчивостью в различных средах и высокой доступностью функциональных групп. 2.1.1. Ультрадисперсные частицы 2.1.1.1. Строение и форма ультрадисперсных частиц Ультрадисперсные частицы по своему строению являются так называемыми «элементарными частицами» коллоидной химии. В зависимости от условий кристаллизации, а именно таких параметров, как величины пересыщения или переохлаждения, наличия примесей и т.д., из растворов могут образовываться два вида ультрадисперсных частиц аморфные и кристаллические. По причине того, что процессы образования новой фазы (процессы самоорганизации) протекают в неравновесных условиях возможно разнообразие форм, при этом степень совершенства структуры будет зависить от того, насколько условия проведения процесса кристаллизации отклонятся от равновесных. 11 Сильное влияние на процесс кристаллизации также могут оказывать поверхностно-активные вещества (ПАВ), присутствющие в растворе. Важной особенностью процессов кристаллизации, приводящих к образованию наночастиц, является то, что их форма не может быть описана методами обычной геометрии. Для описания таких систем привлекается фрактальная геометрия [2]. Водные растворы ПАВ относятся к самоорганизованным наносистемам, у которых размер частиц дисперсной фазы лишь ненамного превосходит молекулярный раствор. Возможные случаи самоорганизации молекул ПАВ показаны на рисунке 1: к ним относятся адсорбционные слои ПАВ на различных поверхностях раздела, а также прямые и обратные мицеллы. Рисунок 1.- Схема образования организованных структур в растворах ПАВ. 1 – Раствор ПАВ; 2 – прямая мицелла в водном растворе;3 – солюбилизация неполярной жидкости прямой мицеллой; 4 – обратная мицелла в неполярной жидкости; 5 – солюбилизация полярной фазы обратной мицеллой; 6 – адсорбционный слой ПАВ на поверхности раздела водный раствор – воздух. Важно отметить, что образование таких биологически активных структур на поверхности воды играет исключительно важную роль в биохимии. От природы жидкой фазы или же, при рассмотрении процессов адсорбции ПАВ из растворов на твёрдой поверхности, природы твёрдой подложки 12 зависят причины, вызывающие образование самоорганизованных структур ПАВ. В водных растворах ПАВ процессы самоорганизации определены общим возрастанием энтропии системы dS > 0, которое суммируется из значений изменения энтропии дисперсной фазы dSd и изменения энтропии дисперсионной среды dSm. В данном случае локальное уменьшение энтропии молекул ПАВ в процессах адсорбции на поверхности раздела водный раствор – воздух и мицеллобразования перекрывается возрастанием значения энтропии молекул воды, что даёт общее изменение энтропии системы dS > 0[3]. 2.1.1.2. Образование мицеллярных систем Уникальным объектом коллоидной химии являются поверхностноактивные вещества (ПАВ) – органические вещества (синтетические или природные), которые обладают ажной научной особенностью - способностью адсорбироваться на поверхности раздела фаз, таким образом снижая межфазное натяжение при ограниченной растворимостью в воде. Уникальность состоит в том, что ПАВ имеют дифильное строение: молекула или ион ПАВ содержит как гидрофобную часть, так и полярную группу. Гидрофобная часть представляет собой углеводородный радикал, содержащий от 8 до 18 углеродных атомов. Общеизвестно, что вода является структурированной жидкостью при комнатной температуре, при этом структура воды подобна структуре льда, но в отличие ото льда имеет только ближний порядок (r 0,8 нм) [4]. Засчет растворения ПАВ происходит дальнейшее структурирование молекул воды вокруг его неполярных углеводородных раликалов. Это в свою очередь приводит к общему уменьшению энтропии системы, а поскольку система стремится к максимуму энтропии, то при достижении определённой концентрации, называемой критической концентрацией мицеллообразования (ККМ), молекулы или ионы ПАВ самопроизвольно начинают образовывать ассоциаты, которые называются мицеллами (по предложению открывшего их 13 учёного Мак-Бэна, 1913 г.). Таким образом, процесс образования мицелл сопровождается высвобождением части структурированной воды, а это является термодинамически выгодным процессом, потому что приводит к увеличению энтропии системы. В зависимости от концентрации ПАВ процесс образования мицелл обычно фиксируется по изменению значений какого-либо из физических свойств раствора ПАВ (например, вязкости, поверхностного натяжения, светорассеяния, плотности, электропроводности и т. д.). Несмотря на то, что величина ККМ зависит от множества факторов: природы ПАВ, рН раствора, присутствия в растворе других органических соединений и электролитов, от степени разветвления и длины углеводородного радикала, определяющим является соотношение между гидрофильными и гидрофобными свойствами ПАВ: чем слабее полярная группа и длиннее углеводородный радикал, тем меньше значение представления о величины ККМ термодинамике (наиболее растворов полно ПАВ современные и процессах мицеллообразования освещены в монографии Русанова [3]). При достижении концентраций, близких к ККМ, мицеллы начинают представлять собой похожие на сферические образования, при этом полярные группы контактируют с водой, а гидрофобные радикалы ориентируются во внутрь, образуя таким образом неполярное ядро. В таком состоянии молекулы или ионы, которые входят в сотсав мицеллы, находятся в динамическом равновесии с объёмом раствора, что по сути и является основной причиной «шероховатости» внешней поверхности мицелл [3]. При этом от природы ПАВ будет зависить степень гидратации полярных групп, структура гидратного слоя и внутреннего ядра[5]. При концентрациях нескольких типов ПАВ, мицелл больших (рисунок ККМ, 1), возможно различающихся образование по форме: сферические, цилиндрические, гексагонально упакованные, ламеллярные. Таким образом, мицеллы можно рассматривать как одномерные, двумерные и объёмные нанообъекты. В зависимости от природы ПАВ числа агрегации 14 (n) могут изменяться от десятков до нескольких сотен, при этом будут меняться и размеры мицелл. 2.1.1.3. Образование микроэмульсий Микроэмульсии – это термодинамически стабильные изотропные дисперсии двух несмешивающихся жидкостей и относятся к лиофильным дисперсным системам. Микроэмульсии могут быть получены двумя путями: диспергированием двух несмешивающихся жидкостей, которое происходит самопроизвольно и в результате сильного снижения межфазного натяжения, либо, как было отмечено выше, в процессе солюбилизации. При этом термодинамическая стабильность микроэмульсионных систем достигается засчет низкого межфазного натяжения, которое может составлять 10 – 5 мДж . м – 2 для ионных ПАВ и 10 – 4 мДж . м – 2 для неионогенных ПАВ [6].В зависимости от взаимодействия фаз существует два вида микроэмульсий: прямые – масло в воде (м/в) – и обратные – вода в масле (в/м), то есть определяется тем,, какая фаза является дисперсной, а какая непрерывной. В обоих случаях дисперсная фаза состоит из капель, размер которых не превышает 100 нм., при этомазмер и форма частиц дисперсной фазы определяют свойства микроэмульсий и реологические свойства межфазных адсорбционных слоёв, образованных поверхностно-активными веществами. Засчёт того, что микроэмульсии обладают большой подвижностью и большой поверхностью раздела между фазами, они служат универсальной средой для проведения многих химических синтезов и получения твёрдых наночастиц [7]. 2.1.1.4. Наноэмульсии Наноэмульсия может быть определена «как масло в воде» со средним диаметром капель от 50 до 1000 нм., но обычно средний размер капель находится в интервале между 100 и 500 нм. Термины субмикронных эмульсии (МСП) и мини- эмульсии используются как синонимы. Эмульсии, 15 которые соответствуют этому определению были использованы в парентеральном питании в течение длительного времени [8]. Подготовка наноэмульсий требует гомогенизации под высоким давлением. Частицы, образуются так, что липофильное ядро отделено от окружающей водной фазы с помощью монослоя фосфолипидов. Наноэмульсии поэтому четко и отличаются от липосом, где двухслойный фосфолипид отделяет водное ядро от гидрофильной внешней фазы (рис. 1). Из-за их липофильного барьера, наноэмульсии больше подходят для переноски липофильных соединений, чем липосомы. Как и липосомы, они поддерживают процеесс проникновения в кожу необходимых активных ингредиентов и, следовательно, увеличивают их концентрацию в коже. Кроме того, наноэмульсии получют всё больший интерес из-за их собственных биологически активных эффектов. Наноэмульсии могут способствовать транспортировке подходящих липидов в коже. Это может уменьшить трансэпидермальную потерю воды (TEWL), что указывает на усиление барьерной функции кожи[9]. 2.1.1.5. Виды нанодисперсных систем Нанодисперсные системы (рис. 2), такие как липосомы, наноэмульсий и липидные наночастицы становятся все более важными в качестве средств для регулируемой доставки и оптимизированного расположения активных ингредиентов, в частности применяемых в косметике. Все упомянутые нанодисперсные системы объединяет то, что для их синтеза требуются сложные технологии производства, такие как гомогенизации высокого давления для подготовки дисперсных систем, что требует, как правило, высокого расхода энергии[10]. - Липосомы Липосомы представляют собой небольшие сферические пузырьки, которые состоят из амфифильных липидов, вмещающих водное ядро. 16 Липиды (выделяют преимущественно фосфолипиды), которые образуют двойные слои, подобные найденным в биомембранах (рис. 3). В большинстве случаев основным компонентом является фосфатидилхолин. В зависимости от условий обработки и химического состава липосомы образуются с одного или нескольких концентрических бислоев. Липосомы часто отличаются в зависимости от их количества и размера. Небольшие однослойные пузырики (SUV), большие однослойные (LUV) и большие многослойные (MLV) или мультивезикулярные (MVV) (рис. 4). Маленькие диаметром от 20 до примерно 100 нм., остальные варьируются в размерах от нескольких сотен нанометров до нескольких микрон. Толщина мембраны (фосфолипидный бислой) имеет размеры приблизительно от 5 до 6 нм.[11]. Большие диспергируют липосомы в воде образуют выше их спонтанно, температуры когда фосфолипиды фазового перехода. Амфифильные и липофильные вещества, например, растворимые в масле UV-фильтры, могут быть включены в липидный бислой. Липосомы используются в косметике. Главный эффект пустых липосом - увеличение влажности кожи (2). Рисунок 2.-Нанодисперсные системы: 1а, липосомы: липидный бислой, ограждающий водное ядро; 1б, наноэмульсии: липидный монослой, ограждающий жидкое ядро липидов; 1в, липидные наночастицы: липидный монослой, ограждающий твердое ядро липидов 17 Рисунок 3.- Химический состав и схематическое представление фосфолипида (лецитин) Рисунок 4.-Схематическое изображение липосом разного размера и числа слоев: SUV: маленькие однослойные, LUV: большие однослойные, MLV: большие многослойные, MVV: мультисферические. 2.1.2. Наноносители Наноносители предназначены как внутривенного, так и внутримышечного для инъекционного введения. Наноносители делятся на два вида: - монолитные сферические образования, которые содержат активные вещества (АВ) по всей массе или только на поверхности наночастицы. В данном случае происходит постепенное выделение АВ из наночастицы при контролируемой и постоянной скоростью: 1) с поверхности; 2) со всей массы наночастицы в процессе ее распада или набухания. Также к данному виду 18 относятся нанокристаллы, которые состоят только из АВ, подвергнутый измельчению до требуемых соответствующих размеров, что позволяет нанокристаллам растворяться быстрее, чем частицы с более крупными размерами[12]. Нанокристаллы имеют ряд преимуществ перед другими наносисемами: - высокая степень содержания активного вещества (~100%); - простая и по сути контролируемая подача АВ (при этом от скорости растворения нанокристаллов зависит и скорость высвобождения в организме лекарственного вещества; - обычное распределение в организме лекарственного вещества; - довольно простой и очень эффективный способ получения[13]. - полые сферические контейнеры (при толщине стенки ~10–30 нм), которые содержат жидкую среду, где растворено активное вещество АВ. За счет диффузии активного вещества через стенку или разрыва капсулы происходит высвобождение АВ из нанокапсулы, при этом скорость высвобождения регулируется строением и способом получения нанокапсулы. За счет большой удельной поверхности нанокапсулы особенно необходимы для АВ, которые труднорастворимы в воде[12]. Основным направлением разработки наноносителей с контролируемым выделением активного вещества является создание системы, которая функционировала бы по принципу обратной связи и в соответствии с требованиями внутренней среды организма была способна обеспечить длительную равномерную подачу АВ в активной форме в орган-мишень. Такие системы относят к универсальным и физиологически оптимальным и моделируют основные функции организма. 19 Выделяют следующие основные типы транспортных систем: - полимеры с химически связанным БАВ; - полимеры с нехимически введенным БАВ; - системы с контролируемым выделением БАВ - трансдермальные системы; - капсулированные формы лекарственных веществ и полимерные гидрогели[14]. Полимеры – носители БАВ должны соответствовать нескольким требованиям: отличаться высокой чистотой и гомогенностью, не оказывать раздражающего, токсического или иного побочного действия, они должны достаточно быстро претерпевать биодеградацию или выводиться из организма и не образовывать при биодеградации токсичных веществ. В качестве носителей ЛВ используют как природные (полисахариды и их производные, белки (поливиниловый и спирт, другие), гомо- так и и синтетические сополимеры полимеры акриламида, N- винилпирролидона и другие) [15]. В последнее десятилетие разрабатывается новый подход, основанный на использовании полимерных систем, изменяющих свои свойства при изменении температуры окружающей среды, т.е. водорастворимых полимеров с нижней критической температурой смешения (НКТС) [15]. В растворах таких полимеров при повышении температуры выше критической наблюдается фазовое расслоение, обусловленное переходом макромолекул из конформации набухшей глобулы в конформацию компактного клубка. Применительно к лекарствам этот подход представляется достаточно универсальным, поскольку в зонах воспаления или новообразований обычно 20 наблюдается местное повышение температуры, что должно обеспечивать самопроизвольное концентрирование лекарства в этих зонах. 2.1.2.1. Полимеры с иммобилизованными БАВ Высокомолекулярные соединения, в которых БАВ связаны с полимерным носителем химической связью - одни из самых распространённых и применяемых наноносителей биологически активных веществ, в которых данная связь не разрушается в процессе и в среде функционирования системы. Примером таких иммобилизованные соединений ферменты, являются которые так применяются называемые в составе лекарственных препаратов, раствворяющихся в воде. Благодаря вязыванию фермента с полимерным носителем повышается устойчивость фермента к денатурации, которая приводит к потере активности.Ещё одним из важных свойств модифицированного полимером белка является его длительная циркуляции в кровеносном русле, что способствует значительному повышению эффективности препарата. Метод получения водорастворимых иммобилизованных ферментов состоит в том, что часть функциональных групп не участвует в формировании самого активного центра белка, при этом могут образовывать химические связи с функциональными группами полимерного модификатора. Метод актуален, поскольку решение вопроса получения иммобилизованных биокатализаторов имеет большое значение для биохимических процессов, где широко применяются их нерастворимые формы. Препараты иммуноактивных полимеров тоже относятся к полимерам с иммобилизованным БАВ, представляя собой конъюгат полимерного носителя и активной, в основном низкомолекулярной, группировки (гаптена), 21 вызывающий Гаптеновой раздражение активностью рецепторов могут иммунокомпетентных обладать различные клеток. вещества, как аналогичные, так и отличные детерминантной группе антингенов, например, это: витамины, пептиды, коферменты, ароматические нитросоединения и др. Большую роль при создании искусственных вакцин играют полиэлектролитные модификаторы антигенов, которые усиливают действие последних[16]. 2.1.2.2. Системы с контролируемым выделением БАВ Данные системы отличаются пролонгированным действием препарата, то есть с постепенным и контролируемым выделением БАВ. Эти системы представляют собою важную группу биологически активных систем в науке и в медицине. Благодаря такому действию, БАВ попадают в живой организм в не больших дозах, скорость поступления которого можно регулировать, при этом изменяя строение всей системы, можно устранить многие недостатки свободных БАВ. Например, применение данных систем снижает роль побочных действий, в том числе побочной токсичности, и способствует вводу в организм повышенной дозы препарата, а это важно для лекарственных систем. Таким образом, из-за его быстрого расходования препарата невозможно обеспечить его длительное действие при однократном введении [16]. Достигнуть постепенного дозирования лекарственного вещества из системы можно за счет следующих факторов: 1) распад химической связи между полимерным носителем и лекарственным веществом (биологически активные полимеры); 2) выход активного вещества за счет деградации (эрозии) полимерной системы (наночастицы, покрытия таблеток); 22 3) диффузионное проникновение через слой полимера (трансдермальные средства); 4) выход активного вещества при набухании системы (гидрогелевые системы). Осмотические устройства представляют отдельную группу систем с контролируемым выделением БАВ. 2.1.2.3. Полимеры с химически связанным БАВ Полимеры с химически связанным БАВ - это препараты, в которых БАВ связан с полимером гидролитически, то есть связью, которая постепенно разрушается в условиях функционирования. Примеры применения и виды данных препаратов: - в растениеводстве и других областях сельского хозяйстваполимерные: полимерные формы регуляторов роста и развития растений (фитоактивные полимеры) и различных пестицидов, которые дозируют активные вещества с оптимальной скоростью; - в медицине: такие полимеры используют для создания водорастворимых форм, которые транспортируют в пораженный орган, что в свою очередь способствует уменьшению вводимой дозы препарата, а также снижению возможности проявления им общего побочного действия. В полимеры вводятся лиофилизующие группы для придания всей системе водорастворимости, а также так называемые группы - "векторы», способствующие доставке полимера в пораженный орган. В основную цепь полимера могут быть введены гидролизуемые группы для того, чтобы полимер-носитель распался и не накапливался в организме после выполнения лекарственным препаратом своей функции [17]. 23 2.1.2.4. Формы с нехимически введенным БАВ Сюда относятся препараты, содержащие БАВ, который постепенно выделяется в результате распада полимерной матрицы или же благодаря диффузии через слой полимера. Наиболее широко данные препараты применяются в медицине. Использование препаратов с нехимически введенным активным веществом позволяет улучшает свойства БАВ и значительно повышает их эффективность. За счет своей макромолекулярной природы высокомолекулярные соединения также обладают биологической активностью. Сегодня по всему миру разработка и исследование новых биологически активных веществ и систем, которые получают на основе полимеров. Такие системы применяются во многих отралях: растениеводстве и животноводстве, медицине и биотехнологии, пищевой и косметической промышленности. Очень необходимым в применении является еще один вид полимерных систем – полимер-полимерные комплексы (ППК). Данные системы представляют особый класс полимерных веществ, которые образуются в результате соединения макромолекул с различными по природе функциональными группами за счет солевых (ионных) или водородных связей. Полимер-полимерные комплексы, которые образовались посредством водородных связей называются интерполимерными комплексами (ИПК), а посредством солевых связей – интерполиэлектролитные комплексы (ИПЭК). На основе ИПЭК могут быть созданы эффективные системы с иммобилизованным ферментом, обладающим свойством саморегулирования [17]. При изменении рН или ионной силы окружающей среды происходит компактизация и переход частиц фермент-ИПЭК в нерастворимое состояние, в результате которого резко падает каталитическая активность системы. Трансдермальные терапевтические системы (ТТС) – многослойные наклеивающиеся системы, которые предназначены для непрерывной подачи 24 содержащихся в них ЛВ через неповрежденную кожу в системное кровообращение. Важной особенностью данных систем является поддержание концентрации ЛВ на постоянном уровне, который близок к минимальному терапевтическому уровню, в течение длительного (определенного только медицинскими показаниями) времени за счет высвобождения определенных доз, которые зависят от консистенции и фармокинетики ЛВ [18]. В результате, все ТТС функционируют по принципу пассивной диффузии: БАВ проникает через кожу или слизистую оболочку за счет градиента концентраций по обе стороны полупроницаемой мембраны, в качестве которой в данном случае выступает кожа (или слизистая). Микрокапсулами являются заключенные в инертную полимерную оболочку мельчайшие сферической формы частицы вещества, которое находится в твердом или жидком состоянии. Диаметр частиц микрокапсул может составлять от нескольких десятков нанометров до нескольких миллиметров. При этом частицы с размером меньше 800 нм относятся к нанокапсулам, а с размерами более 1 мкм – микрокапсулам [19]. Сейчас широко стали применяться и полимерные гидрогели. Полимерные гидрогели – это пористые, хорошо набухающие, но при этом не растворяющиеся в воде материалы. Полимерные гидрогели получают в присутствии бифункционального сшивающего агента полимеризацией водорастворимых ненасыщенных соединений[20]. Содержание воды в равновесно набухших гидрогелях составляет от 10 до 95 %. В таких системах БАВ не связано с гидрогелем химическими связями, а скорость его выделения определяется природой и строением гидрогеля. При синтезе гидрогеля путем варьирования природы водорастворимого мономера или соотношения между мономером и сшивающим агентом можно достичь регулирования скорости выделения БАВ. Помимо этого, существуют полимеры, которые при изменении параметров окружающей среды способны изменять степень набухания, что даёт большие возможности для регулирования скорости выделения БАВ, а 25 также создания на их основе систем с контролируемым выделением ЛВ по механизму обратной связи [4]. 2.1.3. Амфифильные полимеры 2.1.3.1. Строение амфифильных полимеров Уникальное и столь необходимое в современной химии строение имеет олекула амфифильного полимера: в своем составе она содержит как достаточно длинную гидрофильную, так и гидрофобную части. Амфифильный происхлодит от греч. амфи, что означает «с двух сторон», и фило – «любящий». (рис.5). Как видно данные полимеры можно использовать в различных растворах, и особенно важно в водном, что минимизирует затраты, уменьшает отрицательное влияние на среду и позволяет доставить при определенном соотношении и строении полимера практически любые БАВ. Амфифильные полимеры получают полимеризацией мономеров различных типов или последующей модификацией водорастворимого полимера по функциональным группам[21]. Рисунок 5. - Строение простейшего амфифильного полимера. Амфифильные полимеры могут быть ионными (полиэлектролиты) и неионными. В качестве неионного гидрофильного фрагмента в основном используются блоки полиэтиленоксида (ПЭО) . При получении положительно заряженных амфифильных макромолекул носителями заряда 26 обычно выступают протонированные третичные амины, у которых степень ионизации зависит полиэлектролитных от рН блоков среды. могут Примерами служить таких катионных поли(2-винилпиридин), поли[2(диметиламино)этилметакрилат], полиимины различного строения. Почти во всех случаях у амфифильных полимеров в качестве гидрофобных фрагментов выступают длинноцепные группы с алифатическим рядом или же ароматическими углеводородными радикалами [7, 22]. Часто используемыми и наиболее распространёнными из амфифильных полимеров являются поливинилпирролидон и полиакриламид, таким образом относящихся к важной группе данных видов полимеров засчёт следующего строения: гидрофильный фрагмент имеет полимерную цепь из гидрофильных мономерных звеньев, а гидрофобным выступает длинноцепной алифатический радикал. [23,24]. 2.1.3.2. Структура амфифильных полимерных материалов Химическое строение и гидрофильно-гидрофобный баланс макромолекул полимеров влияют на их свойства. В зависимости от этого полимеры могут быть как масло- , так и водорастворимыми, поэтому выделяют два вида полимеров: иономеры и гидрофобно-модифицированные полимеры [25]. Амфифильные полимеры, состоящие из лиофильных мономерных звеньев и длинноцепного углеводородного радикала, прекрасно растворяются в воде, но при наличии слабой полярной группы растворяются в неполярных жидких фазах и практически не растворяться в воде. В данном случае при определённой концентрации полимера возможно образование обратных мицелл, которое обусловлено специфическими взаимодействиями между полярными группами и форма которых может быть различной, и зависит от концентрации полимера (рис. 6). 27 В водном растворе гидрофобная часть макромолекулы образует ядро частицы, а оболочка состоит из гидрофильной части молекулы, которая оказывает стабилизирующее влияние на систему[26]. Рисунок 6.- Структуры, возникающие в водных растворах. 1 мономеры, 2 – мицелла, 3 – цилиндрический агрегат мицелл, 4 гексагонально упакованные цилиндрические агрегаты мицелл, 5 ламинарный агрегат мицелл, 6 – гексагонально упакованные капли воды обратной мицеллярной системе. – – – в 2.1.4. Фитоактивные полимеры Лекарства и регуляторы роста растений могут быть использованы в разных формах: постепенный выход БАВ из системы может реализоваться как за счет разрушения химической связи между полимерным носителем и остатком регулятора (собственно фитоактивные полимеры), так и за счет других факторов - диффузии (монолитные полимерные формы, мембранные системы), осмотических явлений (осмотические насосы) [27]. При этом только системы первого из представленных вариантов с химически иммобилизаованным на полимере БАВ позволяют получить водорастворимые препараты, которые будут пригодны для применения всеми известными методами, в том числе, когда требуется равномерное распределение разбавленного раствора регулятора по растительным объектам. Типичная макромолекула фитоактивного полимера состоит из цепи полимерного носителя и боковых остатков регулятора, связанных с основной цепью гидролитически лабильными группами. Полимер может содержать также группы, придающие всей системе растворимость в воде (лиофилизующие группы). В принципе регулятор может быть присоединен и 28 с участием концевой группы полимерного носителя. Но в этом случае с полимером можно связать меньшее количество БАВ. Фитоактивные полимеры могут являться основой новых препаратов для растениеводства, обладающих уникальным комплексом свойств:растворимость в воде, широкая область стимулирующих доз и концентраций, снизжение возможного риска при передозировке ингибирования или даже гербицидного действия, хорошая степень адсорбциии при нанесении на биологический объект [27]. 2.1.5. Водорастворимые полиэлектролиты Наиболее известная область использования неионогенных водорастворимых полимеров - применение их для восполнения дефицита компонентов крови, возникающего при шоковой кровопотере. Эти полимеры являются основой одного из важнейших типов лекарственных препаратов кровезаменителей. Водорастворимые полимеры составляют основу двух групп кровезаменителей: гемодинамического и дезинтоксикационного действия. Кровезаменители гемодинамического действия восполняют функцию белков плазмы, в первую очередь сывороточного альбумина, обеспечивающую осмотическое давление крови. Поскольку для выполнения этой функции полимер должен иметь достаточно высокий молекулярный вес (не менее 5060 кДа), в качестве основы препаратов этого типа используют полимеры природного происхождения (после определенной химической модификации), способные к последующей биодеструкции в организме и выведению из него [28]. Полианионы и поликатионы обладают биологической активностью и могут влиять на деятельность поглощающих клеток организма, с чем связана их антивирусная активность. Эта способность позволяет рассматривать их как перспективные компоненты противовирусных вакцин.Повышенная концентрация интерферонов способствует устойчивости организма, в 29 частности к онкологическим заболеваниям, что вводит полианионы в число препаратов, обладающих противоопухолевой активностью [29]. 2.2. Поливинилпирролидон и его свойства Поливинилпирролидон (ПВП) – полимер, синтезированный из мономера N-винилпирролидона в 1939 году Уолтэрем Рэппе, является одним из немногих водорастворимых полимеров, которые широко используются в разных областях, особенно медицине. Такая востребованность объясняется тем, что данный полимер обладает уникальными химическими и биологическими свойствами, ценными для практического использования в медицине. ПВП - желто-белый порошок с t° размягчения ~ 140 — 160°С, d420 = l,19; nD20 =1,58 (для пленки) [30]. За счёт наличия в макромолекуле лактамного цикла обеспечивается растворимость полимера в воде. При применении для растворения ПВП смесей воды с растворителями, смешивающимися с ней, например, ацетона, наблюдаются области несмешиваемости, и это свойство используется для фракционирования полимеров методом дробного осаждения. ПВП обладает высокой химической стойкостью, которая при увеличении молекулярного веса полимера возрастает. При температуре 230 — 270°С происходит деполимеризация сухого ПВП, при этом при добавлении воды и повышении температуры увеличивается скорость процесса деполимеризации. Касаемо боковых групп цепи: амидные группы устойчивы к тепловой обработке в водном растворе до 110-130°С [31]. Отсутствие склонности к гидрофобной агрегации подтверждено исследованиями коллоидных свойств N-ПВП, а также тем, что полимер не ПВП в водном растворе представляют собой статистические клубки, что связывают со специфической структурой звеньев ПВП [30]. 30 Одним из важных свойств N-ПВП является то, что за счёт нейтральности и неспецифической активности данного полимера, происходит незначительное взаимодействие со структурными элементами организма и, прежде всего, с клеточными мембранами. ПВП также широко применяется в промышленности: как и в медицине, здесь важна его легкая растворимость в воде и во многих растворителях, а также способность к комплексообразованию с различными соединениями [31]. 2.3. Полиакриламид и его свойства На ряду с водорастворимые поли-N-винилпирролидоном полимеры на основе широко применяются акриламида (АА) – «полиакриламиды». В данную группу входят: полиакриламид (ПАА) неионогенный полимер, его анионные производные - частично гидролизованный ПАА и катионные производные - поливиниламин, а также сополимеры АА с различными ионогенными и неионогенными мономерами [32]. Отличительным свойством акриламида является то, что он в присутствии радикальных и ионных инициаторов легко полимеризуется с образованием линейного высокомолекулярного полимера, а также под действием ультрафиолетового и радиационного излучения, ультразвука и электрического тока. Наибольший практический интерес представляют полимеры с высокой молекулярной массой (ММ = 106-107), для получения которых требуются высокая чистота мономеров, малые концентрации инициатора, отсутствие кислорода и примесей ионов металлов, которые являются сокатализаторами, а также на полимеризацию акриламида существенно влияет pH реакционной среды: при низких рН и высоких температурах возможно образование нерастворимых в воде сшитых полимеров вследствие создания между макромолекулами имидных мостиков (-CO-NH-CO-), а при высоких рН протекает гидролиз амидных групп. В 31 зависимости от способа полимеризации (полимеризацию проводят в водных растворах, в водно-органических растворителях и дисперсиях) полимеры получают в виде растворов, гранул, порошка и дисперсий полимеров в органических жидкостях [33,34]. Для получения потребительскими сополимеров, свойствами по обладающие сравнению с улучшенными ПАА используется радикальная сополимеризация АА с виниловыми мономерами при этом неионогенные сополимеры получают сополимеризацией АА с акрилонитрилом, акрилатами, винилиденхлоридом [35,36]. 2.4. Биологически активные вещества 2.4.1. Биологическая активность Возможность влиять на важные процессы в организме живых существ называется «биологической активностью» препарата. При химическом воздействии биологически активными веществами (БАВ) на биологические системы (в том числе на организм человека), регулируется их жизнедеятельность. При этом в зависимости от вещества, его содержания могут проявляться различные процессы: стимулирование, усугубление или развитии тех или иных признаков и т.п. Худшим проявлением биологической активности является биоцидное действие, когда в результате воздействия вещества организм погибает [37]. Биологическая активность фитоактивных полимеров зависит от скорости гидролиза функциональной группы, связывающей регулятор и полимерный делившегося носитель. количества Если эта связь регулятора распадается недостаточно медленно, для вы- реализации стимулирующего действия. В этом случае полимер не обладает активностью даже при значительном увеличении дозы. В настоящее время известно большое число таких веществ. Их широкое использование могло бы привести к созданию высокоэффективных лекарств, биоцидов, стимуляторов роста и развития ценных признаков у растений и полезных микроорганизмов, 32 но в большинстве случаев возможности применения БАВ используют недостаточно, и часто с не максимальной эффективностью [38,39]. Для некоторых лекарственных веществ и биорегуляторов характерны узкие области положительно действующих доз и концентраций, превышая которые проявляются побочные эффекты. Кроме того, такое побочное действие не позволяет ввести в организм количества БАВ, обеспечивающие необходимое во многих случаях длительное действие препарата [40,41]. 2.4.2. Цитокинины. 6-бензиламинопурин Фитогормоны - это эндогенные регуляторы роста растений, вещества, которые синтезируются в растениях, транспортируются по ним в малых концентрациях и способны вызывать ростовые эффекты [42]. Все фитогормоны обладают тремя основными особенностями: 1. Эндогенное происхождение. Изменения в интенсивности синтеза того или иного фитогормона, вызванное внутренними или внешними причинами, вызывает ответную реакцию растения — переход к другому характеру ростовых или формативных процессов. 2. Возможность транспортировки по растению. Физиологический смысл этой особенности состоите том, что фитогормон, образовавшийся в одном органе (например, в апикальной меристеме стебля), должен обладать свойством регуляции ростовых процессов в других органах (например, в корне). Именно таким образом достигается взаимодействие органов и целостность растения 3. Способность в малых концентрациях (10-12 - 10-7М) вызывать заметные ростовые или формативные эффекты. Примером ростового эффекта может служить ускорение или замедление роста стебля, формативного — дефолиация. Работы многих ученых [43, 44,45, 46] показали, что фитогормоны участвуют в регуляции обмена веществ на всех этапах жизни растений — от развития зародыша до полного завершения жизненного цикла и отмирания. Они определяют характер роста и развития растений, формирования новых 33 органов, габитуса, цветения, старения вегетативных частей, перехода к покою и выхода из него и т.п. Известно 8 групп фитогормонов, пять из которых относятся к классическим группам - ауксины, гиббереллины, цитокинины, абсцизовая кислота, этилен, а три открытые недавно - брассиностероиды, жасминовая и салициловая кислоты. Все из них могут, как активизировать, так и тормозить функциональную активность клеток и вызывают у компетентных клеток сравнительно быстрые физиологические реакции, связанные, очевидно, с мембранами и более медленные изменения, зависящие от синтеза белков и нуклеиновых кислот. Общее условие для действия любого фитогормона — это наличие в клетках специфичных рецепторов [47]. Также получено много синтетических аналогов природных соединений, обладающих высокой физиологической активностью и эти вещества не могут быть отнесены к фитогормонам, так как не образуются в растениях, но многие по активности не уступают и даже превосходят фитогормоны[48]. Рисунок 7.- 6-аминопурина (аденина) В химическом отношении природные цитокинины и их синтетические заменители представляют собой производные 6-аминопурина (аденина, рисунок 7) с заместителем в аминогруппе при шестом атоме углерода пуринового кольца. 34 Основными представителями цитокининового ряда являются: кинетин, 6-бензиламинопурин (6-БАП, формула 2), 8-азакинетин, бензимидазол, которые принадлежат к синтетическим цитокининам, а представителем природных цитокининов является зеатин, который был выделен из растения кукурузы [49]. 2.4.3. Физиологическая роль 6-бензиламинопурина. Группа цитокининовых оказывают влияние как на рост клеток, так и на рост всего растения в целом. Этому утверждению имеются данные, что при опрыскивании синтетическим аналогом цитокинина - кинетином сухой вес проростков ячменя и пшеницы возрастает на 8-12% [48], а вопытах с проростками кукурузы опрыскивание кинетином увеличивает объем корневой системы, а также сырой и сухой вес надземных органов [49]. Были проведены и испытания в условиях полевого опыта, которые дали следующие результаты: на растениях озимой пшеницы синтетического опрыскивание аналога цитокинина 6-БАП увеличило темпы роста и продуктивность, повышало число зерен в колосе [50]. 6-бензиламинопурин – основной регулятор цитокиниового ряда. Рисунок 8.- 6-аминопурина (аденина) 6-бензиламинопурин (6-бензиладенин, 6-БАП, 225,2 г/моль) – аминопроизводное пурина, не растворим в воде. 6-БАП - пестицид, относится к цитокининам, регулятор роста растений, используется в сельском хозяйстве (аграрном) для увеличения урожая, для защиты растений и быстрого роста любых аграрных культур. 35 Эффекты от бензиламинопурина: * Стимулирует деление клеток и развитие боковых побегов, бутонов, соцветий. * Активирует формирование хлоропластов и усиливают газообмен растенийза счет открывания устьиц * Увеличивает размеры клеток листа и тем самым усиливают рост молодых листьев * Обладает и определенным защитным действием на растения против неблагоприятных внешних условий 6-БАП используется как продукт, который в маленьких концентрациях добавляют в готовые удобрения или в готовые пестициды, а также как непосредственный самодостаточный продукт [51]. 2.4.4. Нуклеиновые основания. Полимеры и олигомеры, полученные полимеризацией, поликонденсацией или замещением боковых групп полимерных носителей производных нуклеиновых оснований пиримидинового ряда (тимин, урацил, цитозин) и пуринового ряда (аденин и гуанин), а также их производных, часто используются и привлекают внимание как потенциальные фармакологические средства, аффинные сорбенты, модели нуклеиновых кислот и т. п.Некоторые аспекты, связанные с синтезом полимерных соединений нуклеиновых оснований, рассмотрены в некоторых обзорах [51,52]. Винильные производные данных соединений можно получить дегидрохлорированием 1 - (Р-хлорэтильных) или 9 - (3хлорэтильных) производных или же возможным разложением 1 - (рацетоксиэтильных) или Э-ф-ацетоксиэтильных) производных соответственно, для соединений пиримидинового типа и пуринового типа, а также при взаимодействии с винилацетатом и рядом других методов представлены на рисунке 9: 36 СНг—СНа R-H R—СН2СН2ОН -* R—CH2CH2C1 -^ R—СН=СН2 --- > I—CH2CH2O—COCH3->R—СН=СН2 СНаС(О)-ОСН=СН2 R -H ------------------* R—СН=СН2. Hg(CH3COO)2; H2SO4 (метод 1) (метод 2) (метод 3) Рисунок 9.- Методы получения винильных производных полимерных соединений нуклеиновых оснований. Эти пути синтеза винильных производных нуклеиновых оснований и некоторых их производных[53], условия получения которых приведены в таблице 1. Таблица 1. Винильные производные нуклеиновых оснований. Соединение 1-Винилурацил Метод синтеза 1 Выход, Т. пл., С % 40-50 181—182 1-Винилтимин 1 47 205-207 9-Виниладепин 1 60 196—197 1-Винил-З-метилурадил 3 — 95—97 1-Винил-З-бензоилурацил 3 олигомерпый продукт 1-Винил-43 55 77—78 6-Хлор-9-винилпурин 3 70 166-167 этоксипиримидиион 2,6-Дихлор-9-пурин 3 80 126—127 Продукты вннилирования 3 олигомерпый продукт урацила, цитидина, N1-Винил-2-этокси-43 10 97—99 ацетилцитидина пиримидинон (А)(Б) 5-Винилурацил 18 230—270 1 7-Винилпурин * 3 — 137—138 9-Винилпурин 3 75 ИЗ 9-Винилтеофиллин (В) 177—178 2 5-Винил-2-тиоурацил (Г) см. * — 170 (с разл.) 1 2 Получена смесь изомерных продуктов. * Получен взаимодействием метил-2-диметоксиметил-5-метоксибутирата с тиомочевиной. * 37 Таблица 2 . Замещенные 9-винилпурины. Заместитель в положении -6 Т. пл., °С Выход, % N(CH8)S N(C2H5)2 NHNHa SH 146 80,5-81,5 165—167 86 58 85 N (С3Н7)2 N 59—61 75 (С4Н9)2 N 69,5—70,5 67 (СН3)Н 178—179 - Результаты полимеризации 9-виниладенина, 1-винилтимина и 1винилурацила с различными инициаторами в среде ряда растворителей приведены в таблице 3[54]. Как следует из таблиц (табл. 3,4), присутствие в качестве заместителя в положении 6 винилпуринов гидразиннои и тиольнои групп препятствует полимеризации. Плохо полимеризуются также диаминозамещенные аденины, которые имеют в качестве заместителей этильную, пропильную или бутильную группы[55]. Данные полимеры были трудно растворимы в обычных органических алкильными растворителях. заместителями вступают Виниладенины в с низшими сополи-меризацию с акрилонитрилом (табл.4). Ряд работ посвящен синтезу полимеров, содержащих в качестве боковых за¬местителей остатки нуклеиновых оснований, полимеризацией метакриловых эфиров их N-оксиэтильных производных. Эти эфиры синтезированы этерификацией метакрилоилхлоридом. N-оксиэтильных Метакрилоиль-ный эфир производных N-оксиэтиладенина получали в присутствии гидрида натрия [56]. 38 Таблица 3. Результаты оснований. Мономер 9-Виниладенин полимеризации Инициатор Раство- T, °с Время, Выход ритель часы полимер, % нуклеиновых [Т], ДЛ/Л АИБН ДМСО 95 8 33 0,095 (30°С,НСООН) То же ДМФА 95 24 33 — АЦГК Fe2+ + Н2О2 1-Винилтимин АИБН АЦГК Fe + Н2О2 ДМСО Н2О 30 35 6 5 — 1 — 2 ДМСО 95 8 30 0,057 10 (30° С, ДМСО) — ДМСО АИБН АЦГК 30 8 35 12 95 6 Н2О 2+ 1-Винилурацил винилзамещенных ДМСО ДМСО — 100 0,21 30 6 100 (30° С, ДМСО) — 35 12 следы — н2о Fe*+ + Н2О2 Примечание: АИБН —АИБН- азодиизобутиронитрил, АЦГК — азо-бисциклогексилкарбонитрил. 39 Таблица 4. Результаты сополимеризации 1-винилцитозина винилгипоксантина с акрилатом натрия. Заместительв Время, часы Количество Выход, % положении 6 инициатора, моль/л и 9- Содержание пуринового соединения в сополимере, мол. % С1 10 1• 10-3 49 N(CH3)2 8 10 1• 10-2 l• 10 -3 73 36 ______ 55 N(C2H5)2 NHCH3 8 8 1 • 10-2 1-10-2 64 73 38 39 Полимеры с молекулярной массой 20 000—26 000 были получены полимеризацией производных аминостирола, содержащего в заместителе остатки урацила (рис. 10,а), тимина (рис. 10,б), аденина. сн=сн н=сн а б Рисунок 10. - Полимеры, содержащие в заместителе остатки урацила (а), тимина (б), аденина. 40 При исследовании радикальной гомополимеризации соединений были определены скорости полимеризации, энтальпия и энтропия активации процесса полимеризации, стереорегулярность полимеров, зависящие от типа растворителя. Было установлено, что при радикальной полимеризации «индиотактичность полимеров уменьшается с уменьшением стерического фактора боковых групп. Полимерные соединения, содержащие остатки нуклеиновых оснований, предложено получать путем аминоэтилирования оснований нуклеиновых кислот при действии этиленимина с последующей реакцией полученных производных с акриловым ангидридом. 2.4.5. Пуриновые и пиримидиновые основания. Важную роль в организме человека выполняют пуриновые и пиримидиновые основания, участвуя в процессах жизнедеятельности, нарушение протекания которых приводит к развитию множества серьёзных заболеваний. Так как пуриновые основания поступают в человеческий организм с пищей, синтезируются в клетках и являются частью важнейших соединений организма, нормальное протекание пуринового обмена лежит в основе оптимального уровня обновления нуклеиновых кислот и белков, стабильности энергетического метаболизма, поскольку при нарушении распада пуриновых нуклеотидов накапливаются мочевая кислота - продукт метаболизма. Синтез пуриновых нуклеотидов — осуществляется главным образом в печени и является сложным многостадийным процессом. Распад пуриновых нуклеотидов может происходить различными путями: свободный аденин и аденин в составе нуклеотидов дезаминируются, превращаясь в гипоксантин и далее в ксантин (2,6-диоксипурин), который в свою очередь под действием фермента ксантиноксидазы переводиться в мочевую кислоту. Особый интерес представляют нуклеиновые основания в виде препаратов с амфифильными полимерными носителями. За основу 41 получения таких препаратов в работе предложены методы иммобилизации, что позволяет решить главную задачу – доставку активных веществ малых концетрации при пролонгированном действии. Одно из важных мест в современной биоехнологии занимает иммобилизация биологически активных веществ, клеток и ферментов, как метод повышения их активности и продуктивности синтеза запасных и физиологически активных веществ. Эффективность процессов, происходящих в самых разных областях человеческой деятельности: медицина, микроэлектроника, энергетика, пищевая промышленность и т.д., удалось достичь за счет использования иммобилизованных препаратов. В связи с этим также большой интерес представляют нуклеиновые основания. Наряду с этим, стоит отметить, что пуриновые и пиримидиновые основания при разных значениях рН принимают разные таутомерные формы[52], которые показаны на рис. 11 на примере аденина: Рисунок 11.- Схема таутомерности аденина. 2.4.6. БАВ на примере 5-фторурацила. 5-фторурацил (рисунок 12) является важнейшим для медицины биологически активным веществом и применяется как противораковый препарат и относится к группе антиметаболитов. 42 Рисунок 12.- Строение молекулы 5-фторурацила. 5-фторурацил ингибирует процесс деления пораженных клеток за счёт угнетения активности фермента. На настоящее время синтезировано и разработано большое число препаратов и технологий по созданию лекарств и лечебных текстильных аппликаций для их местной доставки при лучевой терапии онкологических заболеваний. При всём при этом существует проблема применении БАВ, подвергающихся изменению структуры, а для достижения положительного эффекта требуется его многократное введение или же использование завышенных доз препарата, что существенно удорожает применение. Несомненно, стоит отметить, что применение препаратов с высоким содержанием 5-фторурацила приводит к очень нежелательным повреждениям близлежащих органов и тканей и ограничивает область их применения, а также не способствует важной роли даных препаратов в организме - пролонгированному действию лекарства [57,58]. 2.5. Биологически активные системы с использованием полимеров На основании анализа проведенных исследований, основные недостатки препаратов могут быть устранены или же их влияние на эффективность может быть значительно снижена при использовании БАВ в виде химических соединений с некими носителями или модификаторами, в роли которых чаще всего используют различные амфифильные полимеры. 43 По своим функциям данное химическое соединение является новым биологически активным полимером, которое отличается от от исходного полимера-носителя химическим строением [59]. Следует также отметить, что химическая связь БАВ с полимерным носителем, вне зависимости от вида, может быть, как устойчивой во время функционирования биологически активного полимера (такие полимеры часто называют системами с иммобилизованным, то есть "обездвиженным" БАВ), так и разрушаться с определенной скоростью. В последнем случае происходит контролируемое выделение БАВ (controlled release) при определлной скорости, которая может регулироваться строением полимера или конструкцией биологически активной системы, что решает вопрос эффективного действия препарата. Такие биологически активные объекты называются полимерами или системами с контролируемым выделением БАВ[59]. Помимо биологически активных полимеров часто используются полимерные формы с нехимически введенным БАВ, при создании которых используются полимеры, сформированные в виде различных форм (таблетки, микрокапсулы, пленки). В данных системах также происходит постепенное выделение БАВ, химически не связанный с полимерным носителем[60]. Способность неионогенные водорастворимых или полимеров ионогенные различного водорастворимые строения - полимеры (полиэлектролиты), которые при этом не содержат специально связанного БАВ влиять на жизнедеятельность организма и органов человека, показана во многих работах. На основе таких полимеров получены эфективные лекарственные препараты и системы. 44 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. 3.1. Выбор метода получения препаратов В данной работе используется два метода получения препаратов: для +3: аденин, тимин, урацил, цитозин и переведенный в солевую форму гуанин, а также для нерастворимых в воде 6-бензиламинопурин. При этом надо заметить, вещества растворяются только в горячей воде. Для не растворимых в воде веществ использовался эмульсионный метод получения, то есть производился процесс иммобилизации [61,62]. В связи с оптимизацией получения препарата в работе в основном использованы полимеры, полученные в одну стадию по методу радикальной полимеризации в растворе (рисунок 13). Однако, в некоторых случаях, полимеры, полученные в две стадии, наиболее удовлетворяют предъявляемым требованиям, а именно там, где требуется невысокое значение молекулярной массы и меньшая доля лиофобной части носителя. Рисунок 13.- Получение амфифильного полимера в одну стадию. Существует несколько основных способов иммобилизации: 1) путем образования ковалентных связей между биологически активным веществом и носителем; 2) полимеризацией мономера, образующего матрицу, в присутствии фермента, который при этом оказывается включенным в сетку полимера - обычно геля; 3) благодаря электростатическому взаимодействию 45 противоположно заряженных групп фермента и матрицы; 4) сополимеризацией фермента и мономера, образующего матрицу; 5) связыванием фермента и матрицы в результате невалентных взаимод. гидрофобных, с образованием водородных связей и др.; 6) инкапсулированием - созданием около молекул фермента полупроницаемой капсулы, напр., включением фермента в липосомы; 7) сшиванием молекул фермента между собой, напр., глутаровым альдегидом, диметиловым эфиром диимида адипиновой кислоты. Особый случай иммобилизации проведение ферментативных реакций в двухфазной системе, когда фермент находится в водной фазе, а субстраты и продукты реакции распределяются между орг. и водной фазами, что позволяет в зависимости от коэф. распределения в-в между фазами сдвигать равновесие реакции в нужную сторону; диспергирование фаз увеличивает поверхность их раздела и тем самым улучшает доступ иммобилизации субстрата наибольшее к ферменту[63,64]. распространение Среди получили способов ковалентное связывание фермента с матрицей и включение фермента в гель (рис. 14). Рисунок 14.- Способы иммобилизации ферментов: а - адсорбция на нерастворимых носителях, б – включение в поры геля, в – отделение фермента с помощью полупроницаемой мембраны, г – использование двухфазной реакционной среды. 46 3.2. Влияние концентрации инициатора и температуры синтеза на выход полимеров. С целью определения условий синтеза полимеров с необходимым содержанием реакционноспособных звеньев и определенными химическими физико- характеристиками, было исследовано влияние концентрации инициатора на выход полученных гелей. На рис. показана 15 зависимость выхода амфифильного поливинилпирролидона от количества инициатора. 100 Выход, % 80 60 40 20 0 0 0,5 1 1,5 Концентрация инициатора, мг/мл 2 Рисунок 15.-Зависимость выхода амфифильного поливинилпирролидона от количества инициатора. Температура синтеза 78 °С. Во всех случаях процесс, фактически, завершался с высоким выходом за 3-4 часа, а при увеличении количества инициатора до 2 мг/мл реакция завершалась уже за 1 час. 47 100 90 80 Выход, % 70 60 50 40 30 20 10 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Концентрация инициатора, мас. % Рисунок 16.- Зависимость выхода амфифильного полиакриламида. Температура синтеза 72 °С. Проведение процесса при относительно невысоких концентрациях инициатора ведет к образованию продукта с низким выходом. Это обусловлено незначительным содержанием свободных радикалов в системе. При увеличении концентрации инициатора в системе возникает значительное количество свободных радикалов, инициирующих зарождение кинетической цепи сразу во многих активных центрах, что приводит к существенному увеличению выхода продукта[65,66]. При исследовании влияния температуры синтеза на выход амфифильных полимеров N-ПВП и ПАА выявлено, что оптимальной температурой для проведения синтеза является t=78 оС для N-поливинилпирролидона и t=72 оС для полиакриламида (рис. 15,16) 3.3. Определение молекулярной массы и растворимости исследуемых амфифильных полимеров и сополимеров Синтезированы и приготовлены разными методами по три образца амфифильных и обычных полимеров с разной молекулярной массой: 48 поливинилпирролидон (ПВП), полиакриламид (ПАА) и один образец полиакрилата К, полученный омылением полиакриламида. Среднечисловую молекулярную массу полимеров Mn вычисляли по формуле: Mn = mп/ cHCl*(V-Vt ), где mп – масса навески полимера, г; cHCl – концентрация раствора кислоты, моль/л; (V-Vt )– разность объемов холостой и определяемой пробы, л. Таблица 5. Молекулярные массы и растворимость полимеров. Полимер ПВП амф. ПВП ПАА ПАА ПАК ПА К Сопо- Сополим.амф.- амф. м.амф.- амф. м.амф.- лимер мер ОД ОД ОД АК+ АК+АА ВП Молекуляр ная масса 1 2 3 11 900 7 500 6 800 5 200 4 500 3 500 7 300 3 600 3 600 7300 3 500 10500 8300 6500 7300 Таблица 6. Растворимость амфифильных поливинилпирролидон (ПВПамф), полиакриламид (ПААамф) и полиакрилата (ПАКамф). Растворитель Вода Хлороформ Спирт ДМСО ДМФА Полимер ПВП амф. ПАА амф. ПА К амф. + частично + + + частично - + + + + 49 По идентичному методу в одну стадию были синтезированы и приготовлены три образца амфифильных сополимеров винилпирролидона с акриловой кислотой с разной молекулярной массой. В результате получены сополимеры винилпирролидона и акриловой кислоты со следующими значениями молекулярной массы: 10500, 8300 и 6500, а также один образец сополимера акриламида с акриловой кислотой. Таблица 7. Растворимость амфифильных сополимеров винилпирролидона и акриламида с акриловой кислотой. Растворитель Вода Хлороформ Спирт ДМСО Полимер СВП-АК амф. + + САА-АК амф. ДМФА + частично - + + частично Кривая титрования сополимера 2.1. 7 6 рН 5 4 3 2 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 V нсl, мл а Кривая титрования 2.2. 7 6 рН 5 4 3 2 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 V нсl, мл. б 50 Кривая титрования 3.1. 7 6 рН 5 4 3 2 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 V нсl, мл. в Кривая титрования 3.2. 7 6 рН 5 4 3 2 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 V нсl, мл. г Рисунок 17.- Кривые титрования (а,б,в,г) для определения среднечисловой молекулярной массы сополимеров. 3.4. Влияние температуры реакции на процесс сополимеризации Установлено, что выход полимеризации наиболее высоких значений достигает при температуре 75оС, после чего начинают преобладать реакции обрыва цепи (табл. 8). При более низких и высоких температурах выход получается меньше за счет низкой эффективности инициирования. Оптимальной температурой для ведения реакции следует считать 75 оС, поскольку в этих условиях получается продукт с наилучшим выходом. 51 Таблица 8. Влияние температуры на процесс сополимеризации T, °C Выход, % ω, % 70 72,70 29,90 75 78,50 25,10 80 74,75 24,50 90 64,20 20,90 3.5. Влияние суммарной концентрации мономеров на процесс полимеризации Из полученных данных зависимости выхода от суммарной концентрации мономеров (табл. 9) можно сделать вывод, что наиболее полно реакция проходит в диапазоне концентраций 1,5-2 моль/л. В пределах рассмотренного интервала концентраций выход изменяется в пределах не более чем пяти процентов.Также с увеличением концентрации несколько увеличивается содержание биологически активного компонента в полимере, что свидетельствует о более полном протекании полимеризации. В рассмотренном диапазоне концентраций влияние этого параметра на процесс полимеризации не так значительно, как для температуры. Оптимальными условиями для ведения реакции можно считать концентрацию мономеров 2-3 моль/л. 52 Таблица 9 Влияние концентрации мономеров на процесс сополимеризации N-поливинилпирролидона с акриловой кислотой. [CΣ], моль/л Выход, % ω, % 1,5 78,68 21,42 2 71,34 19,55 2,5 67,81 20,85 3 60,63 20,48 3,5 55,47 20,59 Таблица 10. Свойства полимеров и препаратов на их основе. С6Строение полимера Cl Cl CH CH2 N O CH CH2 O C NH2 O C C17H35 n Mn С6-БАП, мг/л, %, БАП, мг/л, после связывания нач. отгонки %, связывания, после 4-х суток 11900 4,74 6,90 68,7 42,5 7300 11,40 57 17,5 O C C17H35 n 4,44 53 3.6. Исследования кинетики выделения аденина в препаратах с обычным и амфифильным поливинилпирролидоном При массовом соотношении полимер: аденин- 5:1 осталось в препарате 7,6 мг/л аденина, что соответствует 27 % от общего веса аденина в смеси. В некоторых препаратах с меньшей молекулярной массой полимера или же с обычными неамфифильными полимерными носителями лишь около 5% (рис. 18,19). Сам же препарат оказался не устойчивым при лиофилизации и последующем растворении. 1,00 светопоглощение 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 концентрация аденина, мг./л 100 90 80 %, масс. 70 60 50 40 30 20 10 0 0 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75 сутки Рисунок 18.- Калибровочная кривая и кинетика выделения аденина из препарата с обычным ПВП. 54 100 90 80 %, масс. 70 60 50 40 30 20 10 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 сутки Рисунок 19. -Кинетика выделения аденина из препарата с амфифильным ПВП. 3.7. Исследования кинетики выделения 6- бензиладенина и урацила в препаратах с различными носителями. 6-бензиламинопурин не обладает зарядом, но регулируя рН можно усиливать заряд в ту или иную сторону за счет того, что вещество принимает различные таутомерные формы; присущи ярко выраженные лиофобные свойства и при эмульсионном методе получения иммобилизованных наноразмерных БАВ до 70% от введенного активного вещества, в зависимости от молекулярной массы и типа носителя, включается в комплекс, препарат при растворении после лиофильной сушки остается устойчивым. Исследования кинетики выделения свободного 6-бензиладенина показали, что регулятор включается в комплекс с образованием водорастворимого препарата. Также стоит отметить, что 6-бензиладенин по-разному вёл себя с полимерными носителями. В то же время свободный аденин выделился достаточно быстро (рис. 18) и практически не связывался со стандартным ПВП (с молекулярной массой 8000) и хорошо вступал в комплекс с ПВП 360 000, что говорит о вступлении в связь аденина с амфифильным полимером (рис. 19), но все же остается 55 фактор влияния молекулярной массы-ведь быстрее выделился из препарата с амфифильным ПВП. Данные получены на основании построенной калибровочной кривой (рис. 21-23). 6-БАП не обладает зарядом, но регулируя рН можно усиливать заряд в ту или иную сторону; также это биологически активное вещество (БАВ) обладает ярко выраженными лиофобными свойствами и при эмульсионном методе получения иммобилизованных наноразмерных БАВ до 75% в зависимости от молекулярной массы и типа носителя включается в комплекс (рис. 20), при этом остается устойчивым препарат при растворении после лиофильной сушки. ПВПамф. 11900 ПАКамф.-ОД ПВПамф.- аденин ПАКамф. 100 90 ПВПамф.6800 ПААамф. 7300 80 %, масс. 70 60 50 40 30 20 10 0 0 0,5 1 1,5 сутки 2 2,5 3 3,5 4 Рисунок 20.- Кинтетика выделения 6-БАП и аденина из различных препаратов полимеров Так, например, наилучшие показатели по образованию комплекса и пролонгированному действию регулятора являются амфифильные поливинилпирролидон с высокой молекулярной массой и полиакрилат, полученный в две стадии. 56 1,00 светопоглощение 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 концентрация бензиладенина, мг./л светопоглощение Рисунок 21.- Калибровочная кривая 6-бензиламинопурина. 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 концентрация урацила, мг./л Рисунок 22.- Калибровочная кривая светопоглощения урацила. 100 90 80 %, масс. 70 60 50 40 30 20 10 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 сутки Рисунок 23.- Кинетика выделение урацила из препарата с сополимером 57 Все препараты, кроме препарата с аденином и урацилом (кроме амфифильного поли-N-пирролидона) оказались устойчивыми при растворении в холодной воде после лиофильной сушки, что указывает на их включение в комплекс, о чем свидетельствуют данные по спектрам УФ, а также заряды частиц. Протонирование и депротонирование пуриновых оснований сопровождается изменениями УФ спектров поглощения и реакционной способности[67]. 3.8. Исследование зависимости размеров частиц препарата от молекулярной массы амфифильного полимера. Показателем эффективного действия препарата является размер его частиц. Целью исследования было получение наноразмерных частиц препарата регулятора роста растений с пролонгированным действием. На гистограммах (рис. 24-26) представлены зависимости радиуса частиц от молекулярной массы для ПВП, ПАА, ПАК-ОД с разными носителями и pH. 450 400 350 радиус, нм 300 250 200 150 100 50 0 1 2 3 4 5 Препарат с амф. поли-N-пирролидоном Рисунок 24.- Зависимость радиуса частиц препарата от молекулярной массы амфифильного N- поливинилпирролидона, где 1 – ПВП амф. – Аденин (Mn=4500), 2 – ПВПамф. – 6-БАП (Mn=4500), 3 ПВПамф. – 6-БАП (Mn=6800), 4 - ПВПамф. – 6-БАП (Mn=11900), 5 ПВПамф. – 6-БАП (Mn=11900, pH = 3-4) 58 600 500 Радиус, нм 400 300 200 100 0 1 2 3 4 Молекулярная масса Рисунок 25.- Зависимость радиуса частиц препарата от молекулярной массы амфифильного полиакриламида, где 1 – ПАА-ОД амф. – 6-БАП (Mn=3600), 2 - ПАА амф. – 6-БАП (Mn=3600) 3 - ПАА амф. – 6-БАП (Mn=7300), 4 - ПАА амф. – 6-БАП (Mn=7300, рН=8-9) 200 180 160 Радиус, нм 140 120 100 80 60 40 20 0 1 2 3 Молекулярная масса Рисунок 26.- Зависимость радиуса частиц препарата от молекулярной массы амфифильного полиакрилата, где 1 – ПАК-ОД амф. – 6-БАП (Mn=3500), 2 ПАК-ОД амф. – 6-БАП (Mn=3500, рН=4-5), 3 - ПАК амф. – 6-БАП (Mn=7300) 59 На основании полученных данных можно сделать вывод, что размер частиц растет пропорционально молекулярной массе, а также при изменении значения рН, то есть изменении татомерной формы БАВ. 3.9. Исследование природы связи в препарате и его устойчивости Для водорастворимых веществ сила ковалентной связи незначительна, поэтому при их получении, с учетом того, что данные соединения принимают разные таутомерные формы (таблицы 11,12), регулировался рН растворов. Данный факт является основным критерием при получении препаратов. Первые же исследования кинетики выделения нуклеиновых оснований [68] показали, что они практически не включаются в комплекс с образованием водорастворимого препарата, за исключением полимераносителя – амфифильного поливинилпирролидона молекулярной массой из образцов. При с наибольшей этом свободные вещества выделились достаточно быстро. В то же время (на примере аденина) практически не связывался со стандартным ПВП. На примере 6бензиламинопурина, который не обладает зарядом, но регулируя рН можно усиливать заряд в ту или иную сторону за счет того, что вещество принимает различные таутомерные формы. Препарат при растворении после лиофильной сушки остается устойчивым. 60 Таблица 11. Некоторые физические свойства пуриновых оснований. УФ спектры Основание Мол. масса Аденин 135,1 Гуанин 151,1 рКа форма молекулы дикатион катион нейтр. анион катион нейтр. анион дианион λмакс, нм 265 265 260 270 250 245 275 273 0,1; 4,1; 9,1 3,2; 12,5 9,3; Таблица 12. Некоторые физические свойства пуриновых оснований. УФ спектры Основание Мол. масса Цитозин 111,1 Урацил 112,1 Тимин 126,1 рКа форма молекулы катион нейтр. анион нейтр. анион дианион нейтр. анион дианион λмакс, нм 275 268 283 258 282 273 265 293 280 4,5-4,7 12,1-12,3 9,35-9,50 13,9 9,9; 13,9 3.10. Сравнительная характеристика выхода 5-фторурацила из растворов с и без амфифильном полимером. Исследование препаратов амфифильного поли-N-винилпирролидона с 5- фторурацилом - фармацевтическая композиция для применения в онкологии. 61 Таблица 13. Результаты исследования образцов с полимером и без него. Образец№ 1.1 Образец № 1.2. m ал.Na,г 1,64 m ПВП,г 0,31 m 5-ФУ,г 0,034 m ал.Na,г 1,95 m 5-ФУ,г 0,034 Таблица 14. Результаты исследования образцов с полимером и без него с большой концентрацией 5 -фторурацила. Образец №1.2. m ал.Na,г 1,31 m ПВП,г m 5-ФУ,г 0,64 0,64 Образец № 2.2. m ал.Na,г 1,95 m 5-ФУ,г 0,64 Таблица 15. Значения концентраций способом 5-ФУ, измеренные спектофотометрическим Концентрация 5-ФУ, измеренная спектофотометрическим способом: Образец№1.1 С = 0,77мг/см2 Образец№1.2 С = 0,21мг/см2 Образец № 2.1 С = 1,46мг/см2 Образец№2.2 С = 0,62мг/см2 Рисунок 27.- Сравнительный анализ выхода 5-фторурацила из препаратов. Образцы 1.1. и 1.2. с амфифильным полимером, образцы 2.1 и 2.2 –без препарата с амфифильным полимером. 62 Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине и может быть использовано при лечении злокачественных новообразований[69]. Известна композиция, обладающая противоопухолевым действием [70], содержащая трийодид винилпирролидон, замещенного также известны бензимидазолия противоопухолевые и поли-N- средства с поливинилпирролидоном и нитрозоаминомочевиной [71,72], которые могут быть использованы в химиотерапевтической практике для лечения злокачественных новообразований. Недостатком этих фармацевтических композиций является то, что они используются для лечения определенных нозологий, а также не обладают пролонгированным действием.Наиболее близкой по действию является фармацевтическая композиция, содержащая альгинат натрия, 5-фторурацил. Недостатком этой композиции является необходимость использования высоких доз 5-фторурацила для достижения в очаге поражения требуемой концентрации, что может приводить к нежелательным повреждениям близлежащих тканей, а также снижение вязкости композиции при гаммастерилизации, что ограничивает область применения и отрицательно влияет на пролонгацию действия лекарства. Применение данного изобретения обеспечивает снижение токсичности лечения, увеличение ударной дозы лекарственного препарата и достижение пролонгации его действия, а также сохранение вязкости композиции после стерилизации. Предлагаемая фармацевтическая композиция не теряет реологических свойств при стерилизации и может быть шире использована при лечении различных онкологических заболеваний, при которых требуется повышенная вязкость вводимой композиции. 63 3.11. Определение устойчивости препарата Далее, для определения устойчивости препарата, полученные комплексы были лиофильно высушены и подвергнуты диализу. Устойчивым считается препарат в товарной форме, если не распадается и растворяется после лиофильной сушки. Данная композиция позволяет сохранить реологические свойства при стерилизации и увеличить сроки хранения, позволяет увеличить ударную дозу 5-фторурацила, при использовании текстильного материала на 20% пролонгировать действие препарата 3.12. Определение состава образующихся комплексов с ДНК. За возможным связыванием полимерных мицелл, сформированных амфифильными полимерами, с ДНК следили по изменению размера частиц в системе при смешении компонентов[73]. Перед измерением 3 мл 0,7 %-ного мицеллярного раствора обеспыливали пропусканием его через фильтры с диаметром пор 0,45 мкм непосредственно в измерительную кювету. 20 мM раствор ДНК добавляли в кювету с мицеллярным раствором последовательно аликвотами по 75, 75 и 150 мкл. Размер частиц определяли методом динамического светорассеяния. Результаты для пяти систем, полученных смешением амфифильных полимеров с ДНК, представлены в таблице 16. Таблица 16. Размеры частиц в системе полимерные мицеллы + ДНК Гидродинамический радиус (нм) Полимер П10 Исходные +75 мкл полимерные ДНК мицеллы 43 43 +150 мкл ДНК 43 +300 мкл ДНК 43 П20 65 64 63 62 П40 16 16 18 19 Пкат 10 10 22 60 Пцв 72 72 84 104 64 Как следует из данных таблицы, добавление ДНК к мицеллярным растворам неионных полимеров не сопровождалось изменением размера частиц, что указывало на отсутствие взаимодействия таких полимеров с отрицательно заряженными молекулами ДНК. Напротив, добавление ДНК к мицеллярным растворам ионных полимеров, Пкат и Пцв, приводило к резкому (6-кратному) укрупнению частиц в суспензии в случае Пкат и не столь заметному (1,5-кратному) увеличению размера в случае Пцв. Увеличение размера ионных полимерных частиц в присутствии ДНК было веским доводом в пользу связывания молекул ДНК с полимерными мицеллами. Для количественной оценки комплексообразования в системе полимер+ДНК был использован следующий подход. К суспензии ионных полимеров в буфере, дополнительно содержавшем 0,15 M NaCl, добавляли возрастающие количества ДНК[74]. Смеси инкубировали в течение 0,5 часа при 25 ºС, затем центрифугировали в течение 10 минут при 12 тыс. об/мин. Не связавшуюся с полимерными частицами ДНК определяли, измеряя оптическую плотность соответствовавшей супернатанта максимуму при поглощения длине водного волны 260 раствора нм, ДНК. Полученные результаты сравнивали с калибровочной кривой зависимости оптической плотности раствора ДНК в том же буферном растворе. Оказалось, что ДНК связывается с частицами (микроагрегатами), сформированными из Пкат2. На кривой, представленной на рисунке 28, есть область концентраций полимера, в пределах которой практически вся добавленная ДНК связывается с полимерными частицами. Связывание ДНК продолжается вплоть до концентрации равной 5×10-5 М; при больших концентрациях ДНК она начинает появляться в растворе. 65 Оптическая плотность 2 2 1 1 2 4 [ДНК]×104 (М) Рисунок 28.- Зависимость оптической плотности супернатанта после осаждения комплекса ДНК-Пкат2 от концентрации ДНК (1). Концентрация Пкат2 5,5 мг/мл. Контроль: оптическая плотность раствора ДНК (2). Напротив, ДНК практически не связывалась с частицами (микроагрегатами), сформированными из Пкат3. В этом случае зависимость оптической плотности супернатанта от концентрации ДНК совпадала с калибровочной кривой (рисунок 29). По-видимому, отсутствие взаимодействия Пкат3 с ДНК было связано с низким положительным зарядом полимерных частиц. Таким образом, эффективность связывания ионных полимеров с ДНК определялась, среди прочего, суммарным положительным зарядом полимерной мицеллы[75]. Оптическая плотность 2 1 2 1 4 2 [ДНК]×10 (М) 4 Рисунок 29.- Зависимость оптической плотности супернатанта после осаждения комплекса ДНК-Пкат3 от концентрации ДНК (1). Концентрация Пкат2 6,1 мг/мл. Контроль: зависимость оптической плотности раствора ДНК (2). 66 3.13. Оценка устойчивости комплексов с ДНК в водно-солевых средах. Таким образом, ДНК образует комплекс с частицами, сформированными из катионного Пкат2, в водно-солевом буферном растворе с концентрацией NaCl равной 0,15 М. Оказалось, что комплекс сохраняется и в растворах с более высокой концентрацией NaCl. Для демонстрации этого к образцам суспензии комплекса ДНК-Пкат2 были добавлены возрастающие количества (объемы) раствора NaCl. После выдерживания смесей в течение 20 минут и последующего центрифугирования в течение 10 минут при 12 тыс. об/мин были измерены оптические плотности суспернатантов. Это позволило оценить концентрации ДНК, несвязанной с частицами полимера, и, следовательно, доли ДНК, сохранившей контакт с полимерными частицами (γ). Результаты представлены на рисунке 30. γ 1,0 0,75 0,5 0,25 0,2 0,4 0,6 [NaCl] (М) Рисунок 30. - Зависимость доли молекул ДНК, связанных в комплекс с частицами Пкат2, от концентрации NaCl. Видно, что при всех исследованных концентрациях NaCl (вплоть до [NaCl]=0,65 М) ДНК присутствовала в растворе в виде комплекса с Пкат2. Аналогичный результат был получен для комплекса, образованного ДНК с другим катионным полимером, Пкат4. И в этом случае комплекс ДНКполикатион сохранял устойчивость растворах с повышенной концентрацией NaCl (вплоть до [NaCl] = 0,6 М). 67 Связывание ДНК с катионным амфифильным полимером, Пкат4, было исследовано следующим образом. К раствору Пкат4 в 0,01М фосфатном буфере с рН 7, добавляли возрастающие количества ДНК. После инкубирования смеси в течение 0,5 часа и последующего центрифугирования определяли не связавшуюся с полимерными частицами ДНК, измеряя оптическую плотность супернатанта при длине волны 260 нм. Полученные результаты были пересчитаны на концентрацию ДНК, связанной в комплекс с поликатионом, и представлены на рисунке 31 (кривая 1). [ДНК]связ×103 (М) 4,0 3,0 2,0 1 2 3 1,0 1 2 3 4 [ДНК]×10 (М) 3 Рисунок 31. - Изотерма связывания ДНК на катионном полимере, Пкат4.[NaCl]: 0 (1), 0,15 (2) и 0,3 M (3). Затем процедуру повторили с той разницей, что связывание ДНК с Пкат4 проводили в буфере, дополнительно содержавшем NaCl в концентрации 0,15 и 0,3 М (кривые 2 и 3, соответственно). Как следует из приведенных данных, почти вся добавленная ДНК связывалась с катионным полимером; эффективность взаимодействия оставалась неизменной вплоть до [NaCl] = 0,3 M. Таким образом, мы показали, что комплекс ДНК-Пкат4 стабилен при физиологических условиях: рН 7 и [NaCl] = 0,15 M. Аналогичный подход был использован для анализа комплексообразования в системе ДНК + катионный Пкат5. Было показано, что 68 ДНК количественно связывается с поликатионом в водно-солевых растворах с [NaCl] ≤ 0,15 M. Наконец, мы добавили ДНК к растворам функциональных полимеров, Пф1 и Пф2, в 0,15 М фосфатном буфере. После центрифугирования образцов были измерены оптические плотности супернатантов при длине волны 260 нм (D), и результаты представлены в виде зависимости «D – [ДНК]» (кривые 1 и 2 на рисунке 32). Для сравнения на том же рисунке изображена калибровочная кривая зависимости оптической плотности раствора ДНК в том же буферном растворе. Оптическая плотность 2.0 1.5 1 2 3 1.0 0.5 0 0 1.0 2.0 3.0 4.0 [ДНК]×104 (М) Рисунок 32. - Зависимость оптической плотности суперната нта после осаждения комплексов ДНК-Пф1 (1) и ДНК-Пф2 (2) от концентрации ДНК. Концентрация полимеров 6,1 мг/мл. Контроль: оптическая плотность раствора ДНК (3). Оказалось, что ДНК практически не связывалась с частицами, сформированными из неионных функциональных полимеров. В обоих случаях зависимости оптической плотности супернатантов от концентрации ДНК совпадали с калибровочной кривой. По-видимому, отсутствие взаимодействия Пф1 и Пф2 с ДНК было связано с незначительным (близким нулевому) зарядом полимерных частиц. Концентрация полимеров 6,1 мг/мл. Контроль: оптическая плотность раствора ДНК (3). 69 С целью выяснения характера взаимодействия амфифильных полимеров с липидной мембраной анализировались изотермы сжатия ленгмюровских пленок, полученных при нанесении на поверхность водной фазы спиртовых растворов полимер-липидных смесей[76]. Типичный набор изотерм, полученных для смесей фосфатидилхолина (ФХ) и амфифильного полимера, приведен на рисунке 33. Поверхностное давление (мН/м) 60 50 40 2 3 30 1 20 4 10 0 0 20 40 60 80 100 Площадь монослоя (%) Рисунок 33. - Изотермы сжатия смесей фосфатидилхолин-П40. Содержание полимера в смеси: 0 (1), 10 (2), 20 (3) и 30 (4) вес.%. Как следует из представленных данных, неионный амфифильный полимер встраивается в липидный монослой, при этом максимальный сдвиг изотермы вправо (в сторону меньших степеней сжатия слоя) наблюдается для смеси с 10%-ным содержанием полимера. По-видимому, увеличение его доли в смеси сопровождается переходом части молекул полимера в водную фазу, что, в свою очередь, приводит к уменьшению влияния полимера на изотерму сжатия монослоя. Этот же метод был использован для анализа поведения смешанных монослоев липид-катионный полимер [77]. Было показано, что катионные полимеры, Пкат2 и Пкат3, встраивались в фосфатидилхолиновый монослой. Параллельно было исследовано взаимодействие полимерных мицелл со сферическими бислойными липидными везикулами (липосомами). Cуспензия смешанных липосом, состоящих из нейтрального ФХ и анионного 70 КЛ2-, была добавлена к суспензиям катионных полимерных частиц. Естественно было ожидать, что взаимодействие анионных липосом с частицами катионных полимеров будет приводить к изменению ЭФП частиц. Результаты измерения ЭФП частиц в присутствии липосом приведены на рисунке 34. ЭФП (мкм/с)/(В/см) 1,0 0,8 1 0,6 0,4 2 0,2 0,0 -0,2 0 2 4 6 Концентрация липосом (мг/мл) Рисунок 34. - ЭФП частиц катионных полимеров в присутствии липосом. Пкат2 (1) и Пкат3 (2). Видно, что добавление суспензии липосом к суспензиям обоих полимеров действительно сопровождается уменьшению абсолютной величины ЭФП (поверхностного заряда) полимерных частиц, что отражает образование комплекса липосома-поликатион. Поскольку катионные полимеры являются эффективными тушителями флуоресценции, за связыванием таких полимеров на липосомальной мембране можно следить, используя липосомы со встроенной в бислой флуоресцентной меткой [78]. Для этого в ходе получения липосом в их мембрану был включен флуоресцентно меченый липид (ФИТЦ-ФЭ). Добавление раствора катионного Пкат4 к суспензии меченых липосом сопровождалось понижением интенсивности флуоресценции метки (рисунок 35), что указывало на связывание катионных мицелл с отрицательно заряженными липосомами. 71 Флуоресценция (%) 100 90 80 70 60 0 0,5 1 1,5 2 [Пкат4]×104 (M) Рисунок 35. - Влияние Пкат4 на флуоресценцию меченых ФХ/КЛ2- (8/2) липосом. Общая концентрация липидов. 1 мг/мл, 0.01M Na2HPO4 + 0.15М NaCl, рН 7. Последующее добавление раствора NaCl к суспензии комплекса приводило к увеличению интенсивности флуоресценции метки (рисунок 36). Флуоресценция (%) 100 75 50 0 0,2 0,4 0,6 [NaCl] (M) Рисунок 36. - Влияние NaCl на флуоресценцию меченых ФХ/КЛ2- (8/2) липосом в комплексе с Пкат4. Общая концентрация липидов 1 мг/мл, [Пкат4]=5×10-4 M, 0.01M Na2HPO4 + 0.15М NaCl, рН 7. Полное восстановление флуоресценции (до исходного уровня) наблюдалось при [NaCl]=0,3 М и отражало диссоциацию комплекса на исходные компоненты - Пкат4 и липосомы. Изменения, происходящие в системе при добавлении раствора NaCl, свидетельствовали об электростатической природе связывания катионного полимера с ФХ/КЛ2липосомами. 72 В то же время, добавление раствора ДНК к суспензии комплекса Пкат4липосома приводило к укрупнению частиц в системе и выпадению осадка, при этом наблюдалась дополнительное уменьшение интенсивности метки, встроенной в мембрану липосом. Эти изменения указывали на связывание молекул ДНК с частицами комплекса Пкат4-липосома и образование тройного комплекса липосома-сополимер-ДНК. Однако флуоресценция метки полностью восстанавливалась в 0,1 М растворе NaCl. Эта концентрация соли была заметно ниже той, которая требовалась для полной диссоциации комплекса Пкат4-липосома (0,3 М NaCl). Это позволяло заключить, что в 0,1 М растворе NaCl тройной комплекс ДНК-Пкат4-липосома диссоциировал на липосомы и частицы комплекса ДНК-Пкат4. Из литературы известно, что взаимодействие амфифильных полимерных соединений с биологической мембраной может приводить к увеличению ее проницаемости по отношению к низкомолекулярным веществам[79]. В работах нашей лаборатории было показано, что блоксополимеры этиленоксида и пропиленоксида (плюроники) вызывают ускорение pH-индуцированного транспорта противоопухолевого антибиотика доксорубицина в бислойные липидные везикулы (липосомы). Влияние полимеров на транспорт доксорубицина мы исследовали, используя pH-градиентные липосомы, заполненные кислым буферным раствором с рН 4,0. Проникновение Докс через мембрану рН-градиентных липосом сопровождается тушением его флуоресценции. Таким образом, кинетика тушения флуоресценции доксорубицина отражает кинетику его накопления в липосомах. 73 Флуоресценция (о.е.) 60 1 2 3 50 40 30 20 0 2 4 6 мин Рисунок 37. -Кинетика мембранного транспорта Докс в отсутствии (1) и в присутствии Пкат2 (2) и Пкат3 (3). Внутренний буфер: 20 мМ HEPES/5 мМ Трис, pH 7,0 + 0,3 M раствор сахарозы; внешний буфер: 0,3 M цитрат-Трис, pH 4,0. На рис. 37 представлена кинетика уменьшения интенсивности флуоресценции Докс при добавлении его раствора к суспензиям электронейтральных ФХ липосом (кривая 1). Кривые 2 и 3 отражают кинетику того же процесса, но в присутствии катионных полимеров – Пкат2 и Пкат3, соответственно. Как видно из рисунка, катионные полимеры не оказывают заметного влияния на скорость мембранного транспорта Докс. Кинетика мембранного транспорта Докс была исследована в присутствии двух функциональных неионных полимеров, Пф1 и Пф2. При этом влияние транспортировки полимеров, которые доксорубицина была они оказывают исследована при на процесс применении суспензии pH-градиентных липосом, буферным раствором (со значение рН 4) внутри частиц и нейтральным внешним буферным раствором. Накопление Докс в таких липосомах сопровождалось понижением его интенсивности флуоресценции. Таким образом, кинетика погашения флуоресценции доксорубицина отражала общую кинетику его накопления в липосомах. На рисунке 38, а, слева представлена кинетика уменьшения интенсивности флуоресценции препарата Докс при добавлении его раствора к применяемым в данном методе суспензиям электронейтральных ФХ липосом (показано на первой кривой 1). Кривая 2 также отражает кинетику данного процесса, но 74 уже в присутствии Пф2. Из этого можно сделать вывод, что скорость мембранного транспорта Докс функционального полимера. заметно уменьшается в присутствии Влияние полимеров на константу скорости мембранного транспорта Докс отражено на рис. 38,б. Флуоресценция K, мин-1 20 3 15 2 1 1 10 2 1 2 5 1 2 1 3 мин 2 3 [Полимер]×103 (M) Рисунок 38. – Кинетика мембранного транспорта Докс в отсутствии (1) и в присутствии Пф1 (а). Влияние полимеров Пф1 и Пф2 на постоянной скорости Dox мембранного транспорта (б). Внутренний буфер: 20 мМ HEPES/5 мМ Трис, pH 7,0 + 0,3 M раствор сахарозы; внешний буфер: 0,3 M цитрат-Трис, pH 4,0; [Dox]=5×10-5 M. Для константы обоих полимеров с ростом наблюдалось концентрации закономерное полимеров, уменьшение очевидно, благодаря связыванию Докс функциональными полимерами. Этот факт может быть использован для контроля скорости проникновения Докс в клетки. 3.14. Исследование взаимодействия полимерных мицелл, в том числе их комплексов с доксорубицином и ДНК, с клетками. В ходе поставленной задачи решались подзадачи: - Исследование цитотоксичности полимеров. - Анализ влияния полимеров на цитотоксичность доксорубицина по отношению к опухолевым и нормальным клеткам. -Исследование внутриклеточной локализации ДНК и доксорубицина. 75 В связи с этим для определения цитотоксичности полимеров использовали исходные (чувствительные) и устойчивые (резистентные) клетки карциномы молочной железы (MSF7 и MCF7/R, соответственно). Для определения процента выживших после эксперимента клеток использовали метод прижизненного окрашивания МТС. Для всех трех неионных полимеров (П10, П20 и П40) и клеток линии mCF7/R были получены результаты, представленые на рисунке 39 в соответствующих координатах «процент выживших клеток – концентрация полимера».Доля выживших клеток (%). 140 120 1 100 2 3 80 60 40 20 0 0,01 0,1 1 10 Концентрация полимера (%) Рисунок 39.- Выживаемость клеток MCF7/R в присутствии полимеров. П10 (1), П20 (2) и П40 (3). Представленные данные свидетельствуют о том, что все исследованные неионные полимеры не проявляют заметной цитотоксичности вплоть до концентрации 2%. Аналогичный результат – отсутствие заметной токсичности неионных полимеров – был получен для чувствительных клеток MSF7. Похожая картина наблюдалась при добавлении к тем же клеткам, чувствительным MCF7 и резистентным MCF7/R, катионного (Пкат) и цвиттерионного (Пцв) амфифильных полимеров. Оба полимера проявляли токсичность при концентрациях выше 0,5 вес.%. Следующим этапом работы была оценка влияния амфифильных полимеров на цитотоксичность противоопухолевого антибиотика Докс[80]. 76 Доля выживших клеток (о.е.) 1,4 1,2 2 1,0 0,8 0,6 1 0,4 0,2 0,0 1E-5 1E-4 1E-3 0,01 0,1 1 Конц. Докс (мкг/мл) Рисунок 40. -Выживаемость клеток MCF7 (1) и MCF7/R (2) в присутствии Докс. Эксперименты проводили на клетках карциномы молочной железы человека MCF7/R, которые проявляют устойчивость к действию лекарства. Как видно из данных на рисунке 40, устойчивые клетки MCF7/R гибнут при концентрации Докс на два порядка более высокой, чем клетки MCF7, не проявляющие лекарственной устойчивости. Устойчивость (резистентность) клеток к действию лекарства объясняется экспрессией на их мембранах специфического белка Р-гликопротеина, который выбрасывает лекарство из клеток, используя для этого энергию гидролиза АТФ. Доля выживших клеток (%) 140 120 100 80 60 без полимера П10 40 П20 20 П40 0 1 10 100 Конц. Докс (мкг/мл) Рисунок 41. - Выживаемость MCF7/R клеток в зависимости от концентрации Докс в присутствии полимеров. Концентрация полимеров: 0,83 wt% П10, 1,25 wt% П20 и 0,5 wt% П40 77 На рисунке 41 показана зависимость доли выживших клеток в отсутствие полимера (1) и в присутствии 0.83% П10 (2), 1.25% П20 (3) и 0.5% П40 (4). Во всех случаях концентрация антибиотика, вызывающая гибель 50% клеток, составляет около 300 мкг/мл. Иными словами, неионные амфифильные полимеры не влияют на накопление Докс в резистентных клетках. Напротив, ионные амфифильные полимеры (катионные и цвитерионные) оказывают заметное влияние на цитотоксичность Докс. Введение в клеточную антибиотика среду почти таких полимеров на порядка: 2 увеличивало гибель клеток цитотоксичность начиналась при концентрации доксорубицина равной 0,003 мг/мл. Наконец, была исследована локализация Докс и флуоресцентно меченой ДНК в трех типах клеток: (1) человеческой карциномы молочной железы MCF7, (2) устойчивой к действию лекарств сублинии MCF7/R и (3) нормальных мышиных фибробластах 3Т3. За локализацией Докс следили с помощью флуоресцентной микроскопии. Инкубация клеток MCF7 с Докс приводила к его быстрому накоплению в клеточном ядре, при этом цитоплазма клеток оставалась практически свободной от лекарства (рисунок 42, А). В то же время, инкубация резистентных клеток MCF7/DOX с лекарством сопровождалась проникновением в клетки лишь незначительного количества лекарства. В этом случае клеточное ядро оставалось свободным от Докс (рисунок 42, Б). 78 Рисунок 42. - Изображения клеток MCF7 (A) и MCF7/DOX (B) после инкубации их с Докс в течение 1 часа при 37ºC и 5% CO2 (λex=840 нм, λem=520-620 нм). Интенсивность сигнала в MCF7/DOX клетках была увеличена в 20 раз для визуализации изображения. Таким образом, методом флуоресцентной микроскопии позволяет зарегистрировать внутриклеточную локализацию Докс в клетках. В дальнейшем этот метод будет использован для исследования влияния полимеров на внутриклеточную локализацию лекарства. Для изучения локализации ДНК в клетках мы использовали флуоресцентно меченый олигонуклеотид, содержащий ковалентно связанный на 5’-конце. Как показано на рисунке 43 (А,Б), инкубация меченого олигонуклеотида с клетками практически не влияла на их флуоресценцию. Это означает малую эффективность спонтанного проникновения ДНК в клетки млекопитающих. Включение ДНК в комплекс с катионным гомополимером, ПДМАЭМА, способствовало проникновению ДНК в клетки (рисунок 43, В). Этот результат позволяет надеяться на то, что и амфифильные катионные полимеры на основе поливинилпирролидона также будут ускорять мембранный транспорт ДНК. 79 В Б A Рисунок 43. - Микрофотографии образцов клеток, инкубированных с олигонуклеотидом и его комплексом с катионным полимером. Собственная флуоресценция клеток (А), клетки, инкубированные с раствором олигонуклеотида (Б), клетки, инкубированные с раствором комплекса олигонуклеотид-катионный гомополимер (В). Объектив 100х, ex=450-500 нм, em=520-550 нм. Исследование цитотоксичности неионных функциональных полимеров, Пф1 и Пф2, проводили на устойчивых клетках карциномы молочной железы человека MCF7/R. Долю выживших клеток с помощью описанного ранее метода прижизненного окрашивания метилтетразолиевым синим. Как видно из данных, представленных на рисунке 44 и рисунке 45, оба полимера проявляли примерно одинаковую токсичность по отношению к обоим типам клеток (примерно 0,1 %). Доля выживших клеток (%) 100 1 80 2 60 40 20 10-2 10-1 1 10 Конц. полимера (вес.%) Рисунок 44. - Выживаемость чувствительных клеток MCF7 от концентрации Пф1 (1) и Пф2 (2). 80 Доля выживших клеток (%) 100 80 2 60 1 40 20 1E-3 0.01 0.1 1 10 Конц. полимера (вес.%) Рисунок 45. - Выживаемость устойчивых MCF7/R клеток в присутствии Пф1 (1) и Пф2 (2). Продолжительность инкубации 1 час. В дополнение к этому мы исследовали влияние продолжительности инкубации клеток в присутствии полимеров на цитотоксичность последних. Эксперимент был проведен по описанной выше стандартной процедуре, но клетки выдерживали в содержащей полимеры среде в течение 48 часов. Результаты представлены на рис. 46. Доля выживших клеток (%) (%) Доля выживших клеток 100 100 80 80 60 60 40 40 2 1 2 1 20 20 0 1E-5 1E-4 1E-3 0,01 0,1 Конц. полимера (вес.%) (вес.%) 1 0 1E-5 1E-4 1E-3 0,01 0,1 1 Конц. полимера Рисунок 46. - Выживаемость устойчивых MCF7/R клеток в присутствии Пф1 (1) и Пф2 (2). Продолжительность инкубации 48 часов. 81 В табл. 17 эти результаты сопоставлены с контрольными (инкубацией клеток в полимерсодержащей среде в течение 1 часа). Видно, что 48-часовая инкубация более, чес на порядок увеличивает цитотоксичность полимеров. Таблица 17. Значение LD50 для неионных амфифильных полимеров. LD50, % Полимер MCF7 MCF7/R Продолжительность инкубации Продолжительность инкубации 1час 48 часов 1 час 48 часов П15 0.0360.010 0.0050.002 0.0410.015 0.0070.002 П45 0.0770.010 0.0080.002 0.0640.011 0.0190.003 Помимо этого было исследовано влияние функциональных полимеров на токсичность Докс по отношению чувствительным клеткам MCF7. Клетки инкубировали в присутствии полимеров (Пф1 или Пф2, 0,01 вес.%) и возрастающих количеств Докс в течение 1 суток. Для определения доли выживших после эксперимента клеток использовали метод прижизненного окрашивания метилтетразолиевым синим (МТС). Как видно из данных рис. 47, оба полимера в максимально нетоксичной концентрации (0,01 вес.%) практически не влияют на токсичность Докс по отношению к чувствительным клеткам. Иными словами, функциональные (альдегидные) группы не влияют на способность полимеров и их конъюгатов с Докс проникать через клеточную мембрану. 82 Доля выживших клеток (%) 2 100 3 80 1 60 40 20 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 Конц. Докс (мг/мл) Рисунок 47. - Выживаемость чувствительных клеток MCF7 в отсутствии полимеров (1) и в присутствии Пф1 (2) и Пф2 (3) от концентрации Докс. Затем эксперименты были повторены, но вместо чувствительных клеток были использованы клетки MCF7/R, которые проявляют устойчивость к действию лекарства. Как видно из данных рис. 48, оба полимера практически не влияют на токсичность Докс по отношению к клеткам, проявляющим множественную лекарственную устойчивость. Доля выживших клеток (%) 100 80 60 40 1 2 3 20 1E-4 1E-3 0.01 0.1 1 Конц. Докс (мг/мл) Рисунок 48. - Выживаемость устойчивых клеток MCF7R в отсутствии (1) и в присутствии Пф1 (2) и Пф2 (3) от концентрации Докс. 83 Для исследования влияния незаряженных амфифильных сополимеров на внутриклеточное накопление доксорубицина были использованы устойчивые клетки MCF7/R и неионные сополимеры двух видов: с гидрофильным поливинилпирролидоновым фрагментом (П15 и П45) и функциональными альдегидными группами (Пф1 и Пф2). Оказалось, что в отсутствии сополимеров Докс не проникает внутрь клеток (рис. 49, а-б). Однако, добавление сополимеров сопровождается появлением яркой флуоресценции на ядрах клеток (рис. 49, в-е). а б в г д е 150 100 50 Докс Докс/Пф2 Докс/Пф1 Докс/П45 0 Докс/П15 Интенсивность флуоресценции (%) Рисунок 49. - Флуоресцентные микрофотографии клеток MCF7/DOX после инкубации их с Докс в отсутствии полимеров (а, фазовый контраст; б, флуоресценция) и в присутствии П15 (в), П45 (г), Пф1 (д) и Пф2 (е). Микроскоп Opton с объективом 60х, ex=510-520 нм, em=550-580 нм, время экспозиции 0,47с. Рисунок 50. - Общая флуоресценция клеток MCF7/DOX, обработанных Докс и смесями Докс/неионный полимер. 84 Результаты количественной обработки изображений, представленных на рис. 49, отражены на рис. 50. Видно, что максимальное накопление Докс в клеточных ядрах наблюдалось при использовании сополимера П15 с 15членным поливинилпирролидоновым блоком. Увеличение длины поливинилпирролидонового блока (при переходе от П15 к П45) понижало общую гидрофобность амфифильной макромолекулы и эффективность ее связывания с клеточной мембраной. Как следствие, уменьшалось количество Докс в ядрах клеток. Этим же можно объяснить слабое влияние функциональных полимеров, Пф1 и Пф2, на мембранный транспорт Докс. В состав обоих полимеров входили достаточно длинные гидрофильные фрагменты со степенью полимеризации 30 (для Пф1) и 40 (дляПф2), понижавшие способность этих полимеров активировать проникновение Докс через клеточную мембрану. Для визуализации эффекта катионного полимера, Пкат5, на накопление ДНК в клетках диинтеркалирующим MCF7/R использовали красителем YOYO. На поликислоту, рис. 51 меченую представлены микрофотографии клеток, обработанных флуоресцентно меченой ДНК (а) и ДНК, связанной в комплекс с Пкат5 (б). а б Рисунок 51. - Флуоресцентные микрофотографии клеток MCF7/DOX после инкубации их с YOYO-меченой ДНК (а) и ее комплексом с Пкат5 (б). Микроскоп Opton с объективом 60х, ex=450-500 нм, em=520-550 нм, время экспозиции 1,27с. Видно, что связывание ДНК с катионным полимером существенно усиливало ее захват клетками. Вместе с тем на фотографии клеток, 85 обработанных комплексом полимера с ДНК, были хорошо видны ярко светящиеся точки, расположенные как вне, так и внутри клеток (рисунок 51, б). По всей видимости, появление этих точек было связано с образованием достаточно крупных (с размером порядка микрона) агрегатов комплекса а б 100 80 Флуоресце нция (%) 120 40 60 30 40 20 ат 5 К/ П к ДН 20 К ДН а ан ДНК о 0 ДНК/Пкат5 Ц ит оп бр др Я ем М Интенсивность флуоресценции (%) ДНК/полимер. ла зм а Рисунок 52. - Общая флуоресценция клеток MCF7/DOX, обработанных комплексом YOYO-меченой ДНК с Пкат5, (а) и внутриклеточное распределение меченой ДНК (б) в сравнении с данными для свободной ДНК (контроль). Результаты количественной обработки изображений отражены на рис. 52. Сравнение интенсивностей флуоресценции клеток, обработанных меченой ДНК и ее комплексом с Пкат5. (рис. 52,а) показывает, что связывание ДНК в комплекс приводило почти к 5-кратному увеличению захвата ДНК в клетку. Помимо сравнительной определена оценки интенсивность плазматической мембраны, общей флуоресценции флуоресценции что позволило ядер, клеток была цитоплазмы нарисовать и картину внутриклеточного распределения ДНК. Как следует из данных рис. 52 б, 35% свободной ДНК фиксировалось на клеточной мембране, 40% проникало в цитоплазму и 25% достигало клеточного ядра. 86 Включение в комплекс с Пкат5 не влияло на долю ДНК в цитоплазме, но изменяло распределение ДНК между мембраной и ядром. Доля мембраносвязанной ДНК понижалась до 25%, а доля проникшей в ядро повышалась до 35%. Таким образом, комплексование ДНК с катионным сополимером приводило не только к увеличению общего количества проникшей в клетки ДНК, но и способствовало проникновению части, захваченной ДНК из цитозоля в ядро. Таким образом, количественно описано влияние четырех неионных амфифильных сополимеров на эффективность проникновения Докс в клеточные ядра. Максимальный эффект наблюдался при использовании сополимера П15 с 15-членным поливинилпирролидоновым блоком. Показано, что связывание ДНК в комплекс с катионным полимером, Пкат5, приводило к увеличению общего количества проникшей в клетки ДНК и способствовало проникновению части, захваченной ДНК из цитозоля в ядро. Проведенные в течение выполнения работы исследования позволили разработать серию новых амфифильных полимеров винилпирролидона, содержащих одну дополнительные концевую боковые длинноцепную функциональные н-алкильную группы группу и (эпоксидную, альдегидную, аминную, карбоксильную) в полимерном фрагменте [81]. Такое строение полимеров определило их способность к самоорганизации в водных системах с образованием наноразмерных функциональных структур, во-первых, способных к включению различных лекарственных веществ (что было продемонстрировано на примере антибиотика доксорубицина и ионов биогенных металлов) и связывать различные биолиганды (что было показано на примере ряда аминокислот и ДНК) [82,83]. Было установлено, что связывание способствует доксорубицина их и ДНК проникновению с амфифильными через липидные полимерами мембраны и проникновению в живые клетки, а также способствовало проникновению части, захваченной ДНК из цитозоля в ядро. 87 Проведенные исследования могут быть использованы как теоретическая основа создания лекарственных препаратов нового поколения на основе наноразмерных систем, получаемых на основе функциональных амфифильных полимеров. 88 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. ОШИБКА! ЗАКЛАДКА НЕ ОПРЕДЕЛЕНА. 1. Поли-N-винилпирролидон (ПВП) CH N CH 2 желто-белый порошок; n O C Молекулярная масса 8000; t размягч. =140-160 °С; d420=1,19 г/см3; nd20=1,52 (для пленки); Растворяется в воде и большинстве органических растворителях (низшие спирты, ацетон, циклогексан, триэтаноламин, диметилформамид, диоксан, толуол); не растворяется в эфире, алифатических и циклических углеводородах. В работе был использован готовый продукт отечественного производства без предварительной очистки. 2. N-винилпирролидон (N-ВП) Молекулярная бесцветная масса жидкость со 111,4; слабым характерным запахом; CH N CH 2 tкип. = 72 °С (2,5 мм рт.ст.); d420 = 1,046 г/см3; C O nd20 = 1,5124; Растворяется в воде и большинстве органических растворителях [84-86]. В работе был использован препарат фирмы «Aldrich», очищенный перегонкой под вакуумом при Р=10мм.рт.ст., t =90 °C. 89 3.Акриламид Молекулярная масса 71,08; бесцветные кристаллы; tпл.= 84,5°С; O CH2 CH C tкип. = 215°С; NH2 d430 = 1,122 г/см3; Растворимость (г на 100 г р-рителя): в воде - 211,5, метаноле -155,0, этаноле-86,2, ацетоне-63,1, этилацетате -12,6, хлороформе - 2,66, бензоле0,346, гептане-0,0068. В работе был использован мономер фирмы «Fluka», очищенный перекристаллизацией из этилового спирта. 4. Динитрилазоизомасляной Молекулярная масса 164; бесцветный кристаллический порошок; нерастворим в воде; растворим в этаноле, ацетоне, диоксане. кислоты (ДАК) CH3 H3C CH3 N C работе C CH3 CN CN В N был использован отечественный препарат, очищенный перекристаллизацией из этанола. 5. Xлорацетамид (ХАА) Молекулярная масса 94,15; бесцветные кристаллы; tпл.=119-120 °С; Cl-CH2-CONH2 tразл. =225 °С; d420=1,53 г/см3; nd20=1,23; Растворяется в воде, спирте, эфире [87,88]. В работе был использован продукт фирмы «Sigma» без дополнительной очистки. 90 Молекулярная масса 284,47; 6. Стеариновая кислота полупрозрачная, бесцветная или желтоватая масса, c характерным запахом; tпл.=53-65 °С; tкип=376,1 °С при 2,5 мм.рт.ст.; C17H35COOH d404 = 0,849 г/см3; Растворимость (г в 100 г р-рителя): в бензоле -2,4; хлороформе -6,0; этаноле-2,25; СН3СООН-0,12; воде-0,03. В работе был использован продукт фирмы «Sigma» без дополнительной очистки. Молекулярная масса 83,5; 7. Тионилхлорид прозрачная, бесцветная жидкость с резким запахом (дымит на воздухе); tпл.= -99,5°С; tкип = 75,6°С; SOCl2 d420 = 1,638 г/см3; Разлагается при температуре выше 140°C. Растворим в бензоле, хлороформе; водой гидролизуется до H2SO3 и HCl. В работе был использован реактив отечественного производства, очищенный перегонкой при атмосферном давлении. 8. Триэтаноламин Молекулярная масса 101; бесцветная маслянистая жидкость; N(С2H4OH)3 tкип=121°С; d417 = 1,51 г/см3; Хорошо смешивается с водой, не имеет запаха. В работе был использован препарат фирмы «Aldrich», очищенный вакуумной перегонкой. 91 9. Органические растворители (диоксан, этиловый спирт, изопропиловый спирт, диэтиловый эфир, диметилсульфоксид, ацетон) очищали и абсолютировали по известным методикам. 4.1. Выбор метода синтеза амфифильных полимеров. В данной работе используется два метода синтеза амфифильных полимеров. Для получения препаратов регуляторов роста растений были подобраны и использованы полимеры (табл. 18) таким образом, что иммобилизация проходила наиболее эффективно. В данной работе будут показаны зависимости числа включения БАВ от метода синтеза, строения (соотношения лиофильной к лиофобным частям полимера) и молекулярной массы полимера. Достаточно большое количество регулятора при сохранении растворимости в воде удалось ввести в полимер при сополимеризации Nвинилпирролидона с акриловой кислотой [89,90]. Недостатками же этого варианта являются: с технологической точки зрения, так как сополимеры образовывались с невысоким выходом и БАВ выделялся со слишком высокой скоростью и в ряде случаев, что приведет к ингибированию роста растений при передозировке препарата. Для сополимеризации применялся метод полимеризации в растворе, в качестве растворителя использовался диоксан, имеющий достаточно высокую температуру кипения и хорошо растворяющий оба компонента. В настоящей работе также исследовано влияние различных факторов (температура реакции, концентрация мономеров) на процесс сополимеризации. 92 Таблица №18. Строение и параметры используемых амфифильных полимеров. С6Строение полимера Cl Cl CH CH2 N O CH CH2 O C NH2 O C C17H35 n Mn С6-БАП, мг/л, %, БАП, мг/л, после связывания нач. отгонки %, связывания, после 4-х суток 11900 4,74 6,90 68,7 42,5 7300 11,40 57 17,5 O C C17H35 n 4,44 4.2. Получение амфифильного полимера N-винилпирролидона. Для реакционной смеси получаем хлорангидрида стеариновой кислоты: 16 мл. 1,2 моль тионилхлорида прибавляют по каплям при перемешивании к 1,0 моль стеариновой кислоты; реакционную смесь нагревают в водяной бане (50-80°C) до прекращения выделения хлороводорода и отгоняют остаток тионилхлорида. Далее осуществляется вакуум-перегонка хлорангидрида кислоты в трехгорлой колбе, снабженной капилляром и термометром. Используется прямой холодильник и водоструйный насос, а также приперегонке используется жидкий и газообразный азот. Смесь нагревается над газовой горелкой до 205-215°C. К 2 г. хлорангидрида стеариновой кислоты, предварительно взвешенной в пробирке с притертой пробкой, добавили 10 мл N-винилпирролидона и 0,01 г инициатора – динитрила азодиизомасляной кислоты, далее 40мл. диоксана (предварительно высушенного от воды). Синтез вели в течение 2,5 ч. в термостате при t = 75°C. Полученную реакционную смесь отогнали на роторе 93 от диоксана при t = 80°C и пониженном давлении с количеством оборотов 90об./мин., не высушивая. Далее растворили в воде и довели рН до нейтрального 0,05 н раствором щелочи, после чего высушили лиофильно до постоянной массы [91,92]. Меняя мольное соотношение компонентов, а именно уменьшая долю мономера в смеси, получили следующие результаты синтезов: - mпвп(1) = 8,5 г. ω = 79 %; - mпвп(2) = 4,5 г. ω = 83 %; - mпвп(3) = 3,2 г. ω = 74 %. Молекулярные массы были определены потенциометрическим титрованием. Среднечисловую молекулярную массу полимеров Mn вычисляли по формуле: Mn = mп/ cHCl*(V-Vt ), где mп – масса навески полимера, г; cHCl – концентрация раствора кислоты, моль/л; (V-Vt )– разность объемов холостой и определяемой пробы, л. Молекулярные массы и растворимость полимеров сведены в табл. 19: Таблица №19. Молекулярные массы и растворимость полимеров. Полимер ПВП ПВП амф. м.амф.- ОД ПАА амф. ПАА ПАК ПА К м.амф амф. м.амф.ОД .-ОД Сополимер АК+ВП Сополимер АК+АА 10500 8300 6500 7300 Молекулярная масса 1 2 3 11 900 7 500 6 800 5 200 4 500 3 500 7 300 3 600 3 600 7300 3 500 94 4.3. Полимеризация N-винилпирролидона в присутствии меркаптосоединений Навески N-винилпирролидона и инициатора (динитрила азоизомасляной кислоты) (0.1 ÷ 3.0 вес. %) растворяли в диоксане (30 %-ный раствор по мономеру) и добавляли различные количества меркаптоуксусной кислоты, меркаптопропионовой полученными кислоты растворами или продували меркаптоэтиламина. инертным газом, Ампулы с запаивали и выдерживали при Т = 343 К в течение 1 часа. Образовавшиеся полимеры выделяли осаждением в серный эфир, очищали экстракцией этим осадителем, и сушили до постоянного веса в вакууме. Выход полученных полимеров составлял 70 ÷ 95 %[93]. 4.4. Определение молекулярной массы амфифильного полимера. Методом потенциометрического титрования определена молекулярная масса полимера по содержанию в нем концевых кетонных групп. Для этого навеску полимера (0,2 г) растворяли в 20мл предварительно приготовленного оксимирующего раствора. Титровали 0,02н раствором HCl. За ходом реакции нейтрализации следили по изменению значения pH раствора при помощи pHметра. Среднечисловую молекулярную массу полимеров Mn вычисляли по формуле: Mn = mп/ cHCl*(V-Vt ), где mп – масса навески полимера, г; cHCl – концентрация раствора кислоты, моль/л; (V-Vt )– разность объемов холостой и определяемой пробы, л. Среднечисловая молекулярная масса полученного полимера равна 11900. Таким же образом, меняя соотношение реагирующих веществ, а точнее мономера получили образцы с молекулярной массой 6800 и 4500. 95 4.5. Получение амфифильного полимера в две стадии. 4.5.1. Полимеризация N-винилпирролидона в присутствии меркаптосоединений Навески N-винилпирролидона и инициатора (динитрила азоизомасляной кислоты) (0.1 ÷ 3.0 вес. %) растворяли в диоксане (30 %-ный раствор по мономеру) и добавляли различные количества меркаптоуксусной кислоты, меркаптопропионовой полученными кислоты растворами или продували меркаптоэтиламина. инертным газом, Ампулы с запаивали и выдерживали при Т = 343 К в течение 1 часа. Образовавшиеся полимеры выделяли осаждением в серный эфир, очищали экстракцией этим осадителем, и сушили до постоянного веса в вакууме. Выход полученных полимеров составлял 70 ÷ 95 % [94]. 4.5.2. Модификация полимеров, содержащих концевую карбоксильную группу. Расчетное количество ПВП, содержащего концевую карбоксильную группу, растворяли в сухом изопропаноле. добавляли при перемешивании К полученному раствору раствор избытка N,N’ дициклогексилкарбодиимида (2,0 моля на 1 моль карбоксильных групп) в этом же растворителе. Смесь перемешивали при Т = 273 К в течение 1 часа, затем добавляли раствор соответствующего количества алифатического амина (н-гексиламина, н-октиламина, н-додециламина, н гексадециламина, н октадециламина, ди(н-гексил)амина, ди(н-октил)амина, ди(н- октадецил)амина) (1,5 моля на 1 моль карбоксильных групп) в сухом изопропаноле и выдерживали 2 часа при Т = 333 К. Выпавший после охлаждения реакционной смеси осадок отфильтровывали, а фильтрат упаривали до объёма около 10 мл. Полученный полимер осаждали в серный эфир, экстрагировали осадителем и сушили в вакууме до постоянного веса. Выход полимеров во всех случаях близок к теоретическому (75÷80%) [95]. 96 4.5.3. Модификация полимеров, содержащих концевую аминогруппу Навеску ПВП, содержащего концевую аминогруппу, растворяли в сухом диоксане. В полученный раствор при Т = 273 К при перемешивании вводили расчетное количество триэтиламина в диоксане, а затем хлорангидрид лауриновой, пальмитиновой, стеариновой, арахиновой или бегеновой кислоты в этом же растворителе и смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 2 часов. Выпавший осадок солянокислого триэтиламина отфильтровывали, а полученный полимер осаждали в серный эфир, экстрагировали осадителем и сушили в вакууме до постоянного веса. Выход полимеров во всех случаях близок к теоретическому (70÷75%)[96,97]. 4.6. Получение амфифильных сополимеров. По идентичному методу в одну стадию были синтезированы и приготовлены три образца амфифильных сополимеров винилпирролидона с акриловой кислотой с разной молекулярной массой. К 2 г. хлорангидрида стеариновой кислоты, предварительно взвешенной в пробирке с притертой пробкой, добавили 10 мл N-винилпирролидона, акриловой кислоты и 0,01 г инициатора – динитрила азодиизомасляной кислоты, далее 40 мл. диоксана (предварительно высушенного от воды). Синтез вели в течение 2,5 ч. в термостате при t = 75°C. Полученную реакционную смесь отогнали на роторе от диоксана при прониженном давлении, не высушивая. Далее растворили в воде и довели рН до нейтрального 0,05 н раствором щелочи, после чего высушили лиофильно до постоянной массы. Меняя мольное соотношение компонентов, а именно уменьшая долю мономера в смеси, получили следующие результаты синтезов: - mпвп(1= 4,5 г. ω = 68 %, 10500; - mпвп(2) = 3,5 г. ω = 72 %, 8300; - mпвп(3) = 2,2 г. ω = 67 %, 6 500. 97 4.7. Определение максимального значения показателя светопоглощения для биологически активных веществ. При измерении растворов с различными концентрациями выявлено, что максимальное значение светопоглощения наблюдается: - для гуанина при длине волны λмакс= 274 нм.; - для урацила при длине волны λмакс= 258 нм.; - для цитозина при длине волны λмакс= 267 нм.; - для тимина при длине волны λмакс= 264 нм. Таким образом, все калибровочные кривые (рис. 53-55) построены при светопоглощение данных фиксированных длинах волн. 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 концентрация аденина, мг./л светопоглощение Рисунок 53-. Калибровочная кривая для аденина. 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 концентрация бензиладенина, мг./л Рисунок 54. -Калибровочная кривая для бензиладенина. 98 светопоглощение 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 концентрация урацила, мг./л Рисунок 55. - Калибровочная кривая для урацила. 4.8. Процесс иммобилизации на примере аденина. Отдельно растворили аденин в горячей воде (t = 70°C), после охлаждения раствора аденина, его тщательно смешивали с водным раствором полимера и дали комплексу отстояться. Проводили исследование диализным методом относительно 1л дистиллированной воды – снимались показания в емкости и в диализном мешке каждые 12 часов в течение 4-х суток для определения кинетики выделения свободного аденина и его включение в амфифильный полимер при различных концентрациях компонентов комплекса, а также определения места иммобилизации в объеме агрегата. При массовом соотношении полимер: аденин- 5:1 осталось в препарате 7,6 мг/л аденина, что соответствует 27 % от общего веса аденина в смеси. Комплекс же оказался не устойчивым при лиофилизации и последующем растворении. 4.9.Получение полимерных наночастиц с 6-бензиладенином эмульсионным методом. Аналогичные исследования были проведены с производным аденина, с одним из известных регуляторов роста растений цитокининового ряда – 6бензиламинопурином (6-бензиладенин, 6-БАП). 6-бензиламинопурин (6-бензиладенин, 6-БАП) – 6-N замещенный аденина, Mn=225,26; t° 230-233 , белый порошок, без запаха, нерастворим в воде. 99 Относиться к цитокининам – регуляторам роста корней и плода. Растворы для исследования - полимерные наночастицы были приготовлены эмульсионным методом: 20мг амфифильного поли-N-винилпирролидона с различными молекулярными массами (ПВП 4500 - ПВП 11900, ПВП-ОД 3500 – ПВП-ОД 7500 и ПАА 3600 – ПАА 7300) и 5,00мг 6-БАП растворяли в 10 мл хлороформа (Спвп-од=0,5мг/мл, Сimc=25%масс.), после чего полученный раствор вливали в 30 мл дистиллированной воды. Далее эмульсию интенсивно перемешивали и обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут при мощности 100Вт на ультразвуковом диспергаторе «Sonopuls HD2200» («Bandelin electronic», Германия). После этого, органический растворитель при пониженном давлении (вакуум 140 мм рт. ст.) отгоняли на роторном испарителе «Rotadest» («MTA Kutesz», Венгрия). Затем полученный раствор центрифугировали в течение 8 минут при скорости вращения 6500об./мин на центрифуге «HERAEUS» («Christ GMBH», Германия) и надосадочную жидкость фильтровали через мембраны «Durapore» c диаметром пор 0,45мкм («Millipore Corp.», Ирландия) [98]. 6-БАП не обладает зарядом, но регулируя рН можно усиливать заряд в ту или иную сторону; также это биологически активное вещество (БАВ) обладает ярко выраженными лиофобными свойствами и при эмульсионном методе получения иммобилизованных наноразмерных БАВ до 75% в зависимости от молекулярной массы и типа носителя включается в комплекс, при этом остается устойчивым препарат при растворении после лиофильной сушки. Одним из показателей эффективного действия препарата с БАВ является размер его частиц [99]. Были сняты размеры комплексов (диаметр частиц) светорассеянием и заряд на оборудование Zeta Plus Brookhaven Instruments, предварительно центрифугировав растворы на центрифуге MiniSpin eppendorf в течение 12 минут при скорости вращения 12000 об./мин. 100 На гистограмме (рис. 56) и рисунке 57 представлены зависимости радиуса частиц от молекулярной массы для N-ПВПамф. с различными значениями pH и ЯМР-спектр полимера. 450 400 350 радиус, нм 300 250 200 150 100 50 0 1 2 3 4 5 Препарат с амф. поли-N-пирролидоном Рисунок 56.- Зависимость радиуса частиц от молекулярной массы для NПВПамф., где: 1 – ПВП амф. – Аденин (Mn=4500) 2 – ПВПамф. – 6-БАП (Mn=4500) 3 - ПВПамф. – 6-БАП (Mn=6800) 4 - ПВПамф. – 6-БАП (Mn=11900) 5 - ПВПамф. – 6-БАП (Mn=11900, pH = 3-4) 101 Рисунок 57.- С-ЯМР спектр амифифильного N- поливинилпирролидона (12000). 4.10. Получение препарата амфиильного поли-N-винилпирролидона с 5фторурацилом Задачей предлагаемого изобретения является устранение указанных недостатков, обеспечение возможности использования композиции для других нозологий, снижение токсичности лечения, достижение пролонгации действия препарата. Для решения поставленной задачи в фармацевтическую композицию, содержащую альгинат натрия, 5-фторурацил, предложено дополнительно ввести наноэмульсию амфифильного поли-N-винилпирролидона при его 102 соотношении с альгинатом натрия 1:2 весовых частей, при этом композиция содержит 5-фторурацила 0,5 – 5,0 масс. %, остальное вода. То, что в качестве полимерного носителя предложено использовать амфифильный поли-N-винилпирролидона, определено его способностью к самоорганизации в водных системах с образованием наноразмерных функциональных структур. Амфифильные полимеры образуют в водных системах сферические агрегаты с размерами от десятков до сотен нанометров в зависимости от строения полимера и способа получения наночастиц. Уникальность используемого поли-N-винилпирролидона заключается в его амфифильности, то есть в неограниченной возможности получения водных растворов препаратов с различными биологически активными веществами, а также в доступности и простоте синтеза, пролонгированном действии препаратов, что является преимущественным фактором в его использовании по сравнению с ранее применяемыми полимерами. Фармацевтическую композицию получают следующим образом: для получения препарата используют 20 мг амфифильного поли-Nвинилпирролидона, который растворяют в 10 мл хлороформа, после чего полученный раствор вливают в 30 мл. дистиллированной воды. Далее эмульсию интенсивно перемешивают и обрабатывают ультразвуком в течение 5 минут при мощности 100Вт на ультразвуковом диспергаторе «SonopulsHD2200» («Bandelinelectronic», Германия). После этого, органический растворитель при пониженном давлении (вакуум 140 мм рт. ст.) отгоняют на роторном испарителе «Rotadest» («MTAKutesz», Венгрия). Затем полученный раствор центрифугируют в течение 8 минут при скорости вращения 6500 об./мин на центрифуге «HERAEUS» («ChristGMBH», Германия) и надосадочную жидкость фильтруют через мембраны «Durapore» c диаметром пор 0,45мкм («MilliporeCorp.», Ирландия). Получение наночастиц амфифильного полимера достигается эмульсионным методом, который используется для полимеров с сильно выраженными гидрофобными свойствами. Для этого амфифильный полимер 103 растворяют в органическом растворителе, добавляют водную фазу для получения эмульсии, стабилизированной амфифильным полимером. Затем получают наноэмульсию, уменьшая размер капель эмульсии при помощи ультразвука, и удаляют органический растворитель. Для получения амфифильного полимера N-винилпирролидона к 2 г. хлорангидрида стеариновой кислоты, предварительно взвешенной в пробирке с притертой пробкой, добавляют 10 мл N-винилпирролидона и 0,01 г инициатора – динитрила азодиизомасляной кислоты, далее 40мл диоксана (предварительно высушенного от воды). Синтез ведут в течение 2,5 ч. в термостате при t = 75°C. Полученную реакционную смесь освобождают от диоксана при t = 80°C и пониженном давлении с количеством оборотов 90об./мин., не высушивая. Далее растворяют в воде и доводят рН до нейтрального 0,05 н раствором щелочи, после чего высушивают лиофильно до постоянной массы. Далее амфифильный полимер N-винилпирролидона в виде наноэмульсии при постоянном перемешивании вводится в предварительно набухший в дистиллированной воде полимер альгинат натрия, а затем в композицию добавляется лекарственный препарат 5-фторурацил. Композиция тщательно перемешивается в месильной машине до образования однородной массы. Вариант 1. Наноэмульсия амфифильного полимера N-винилпирролидона, остальное вода. Вариант 2. Фармацевтическая композиция для лечения рака прямой кишки содержит альгинат натрия 2 масс%, 5-фторурацил 0,5 масс% и 1 масс% наноэмульсии амфифильного полимера N-винилпирролидона, остальное вода. Вариант 3. Фармацевтическая композиция, используемая для лечения рака кожи, которую наносят потом на текстильный материал, содержит альгинат натрия 104 3 масс% , 5-фторурацил 5 масс% и 1,5 масс% наноэмульсии амфифильного полимера N-винилпирролидона, остальное вода. Формула изобретения Фармацевтическая композиция, содержащая альгинат натрия, 5- фторурацил, отличающаяся тем, что композиция дополнительно содержит амфифильный поли-N-винилпирролидона при его соотношении с альгинатом натрия 1:2 весовых частей, 5-фторурацила содержит в количестве 0,5 – 5,0 масс. %, остальное вода. 4.11. Получение полимерных наночастиц с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями. Все нуклеиновые основания, за исключением гуанина хорошо растворяются в горячей воде [100], поэтому все препараты были получены простым смешениеми дальнейшим обработкой ультразвуком в течение 5 минут при мощности 100Вт на ультразвуковом диспергаторе «Sonopuls HD2200» («Bandelin electronic», Германия). Препарат же с гуанином был получен из его солевой формы. Все препараты, кроме препарата с аденином оказались устойчивыми при растворении в холодной воде после лиофильной сушки, что указывает на их включение в комплекс, что показывают и спектры УФ, а также заряды частиц. Протонирование и депротонирование пуриновых оснований сопровождается изменениями УФ спектров поглощения (рис. 58) и реакционной способности. 105 Зависимость длины волны от формы молекулы 300 250 h, нм. 200 дикатион катион 150 нейтральная анион 100 дианион 50 0 Рисунок 58. - Зависимость длины волны от формы молекулы нуклеиновых оснований. Из этого можно сделать вывод, что пуриновые основания более склонны к образованию препаратов, так как имеют высокое значение молекулярной массы, что важно для образования связи с лиофобной частью и могут существовать в таутомерной форме с положительным зарядом, например, препарат с полиакрилатами. Важно отметить, необходимым условие образования ионной связи с носителем является то, что молекулы пуриновых и пиримидиновых оснований при разных значениях рН, принимают различные таутомерные формы (и изменение УФ спектров поглощения λмакс, нм), которые показаны на рис. 59 - 61: АДЕНИН Рисунок 59. - Формула аденина и его таутомерные формы. 106 Препараты с аденином: - получен препарат с ПВПамф. (1); ПААамф. (1,2); ПАК-ОД и с сополимером винилпирролидона с акриловой кислотой; - исследована кинетика выделения аденина из препарата; - при массовом соотношении полимер (ПВПамф. (1)): аденин- 5:1 осталось в препарате 7,6 мг/л аденина, что соответствует 27 % от общего веса аденина в смеси. Комплекс же оказался не устойчивым при лиофилизации и последующем растворении, что показывает слабое лиофильно-лиофобное взаимодействие в препарате; -выявлено, что препарат более устойчив с обычным полимером ПВП, молекулярная масса которого выше в 30 раз; - при уменьшении значения рН среды (при приготовлении препарата (добавление HCl; 0,2 н)) по истечении 4-х суток в препарате осталось 76,47 % аденина, что показывает ионное взаимодействие; - в препарате с сополимером акриловой кислоты и винилпирролидона (10500) в течение 4-х суток выделилось 58 % активного вещества; - активное вещество хорошо взаимодействует и с полимером ПАКамф-ОД: в данном случае лишь до 29% выделения аденина за такой же период времени, при этом урацил практически полностью выделяется из данного препарата; - с ПААамф. (3600) выделяется лишь 10% аденина, при этом изменение рН (увеличение или же уменьшение значения) отрицательно сказывается на устойчивости препарата. 107 ГУАНИН Рисунок 60. - Формула гуанина и его таутомерные формы. Гуанин переводим в водорастворимую форму через его солевой раствор. Остальные вещества хорошо растворяются в горячей воде, поэтому с ними стоит вопрос лишь подбора параметров раствора и компонентов для образования препаратов. ЦИТОЗИН, ТИМИН, УРАЦИЛ Рисунок 61. - Формула цитозина, тимина и урацила и их таутомерные формы. В данной работе используется два метода получения препаратов: для водорастворимых: аденин, тимин, урацил, цитозин и переведенный в солевую форму гуанин, а также для нерастворимых в воде 6108 бензиламинопурин[101]. При этом надо заметить, вещества растворяются только в горячей воде. Для не растворимых в воде веществ использовался эмульсионный метод получения, то есть производился процесс иммобилизации. В связи с оптимизацией получения препарата в работе в основном использованы полимеры, полученные в одну стадию [102,103]. Однако, в некоторых случаях, полимеры, полученные в две стадии, наиболее удовлетворяют предъявляемым требованиям, а именно там, где требуется невысокое значение молекулярной массы и меньшая доля лиофобной части носителя. Бензиладенин (6 – бензиламинопурин). Относится к классу цитокининов-регуляторов роста растений, производное аденина. tкип.=230-233°С, молекулярный вес 225,26 г/моль[102]. Рисунок 62.- Формула 6-бензиламинопурина. С данным биологически активным соединением проведены следующие исследования: - получен препарат с ПВПамф.(1); ПААамф.(1); ПАК-ОД и с сополимером винилпирролидона с акриловой кислотой; - исследована кинетика выделения бензиладенина из препарата; - препарат с ПАК-ОД был получен эмульсионным методом и был подвержен ультразвуку: начальная Сбап=4,44 мг/л, 109 после отгонки Сбап=11,40 мг/л (по калибровочной кривой), процент связывания в комплекс,%: 57; после диализа по истечении 4-х суток осталось 17,5 %. Вывод: изначально идет слабое связывание в препарате. - препарат с ПВПамф.(1): начальная Сбап=4,74 мг/л, после отгонки Сбап=6,90 мг/л (по калибровочной кривой), процент связывания в комплекс,%: 68,7; после диализа по истечении 4-х суток осталось 42,5 % Вывод: препарат получился устойчивым. Отсюда следует, что наиболее стабильные препараты получаются с носителями полиакрилатом К-ОД при рН=4-5, что уже свидетельствует об образовании ионной связи, а также с амф. ПВП с большей молекулярной массой, который действует как неионогенный ПАВ с большим радиусом частиц. Также эти препараты устойчивы в товарной форме, что было показано при повторном растворении после лиофильной сушки. Урацил - при исследовании выявлено, что активное вещество плохо взаимодействует и с полимером ПАКамф-ОД, полученным по методике, использованной Кусковым А.Н.: урацил практически полностью выделяется из данного препарата, а с большей концентрацией урацила в препарате осталось до 15%; Рибофлавин - данное БАВ обладает высокой молекулярной массой, в ионном виде не существует, так как быстро разрушается, при этом не устойчиво в свободном виде на свету и хорошо растворяется лишь в горячей воде; но все же представляет собой интерес, являясь витамином В2; - в виду всех этих недостатков по данным исследования методом иммобилизации ковалентными связями в препарате всего 12,52 % от общего количества активного вещества; 110 Тимин - результаты с данным веществом схожи с результатами по урацилу в виду того, что оба представляют ряд пиримидиновых оснований и близки в гомологической цепочке; при этом товарная форма препарата не растворилась ни в горячей, ни в холодной воде, таким образом, он оказался не устойчивым, что значит, для иммобилизации тимина необходимы другие методы. 4.12. Анализ поведения смешанных монослоев, сформированных из функциональных амфифильных полимеров с ДНК. Типичный набор изотерм, полученных для смесей фосфатидилхолина (ФХ) и амфифильного полимера, приведен на рис. 63. Как следует из представленных данных, катионный амфифильный полимер, Пкат4, встраивается в липидный монослой, при этом максимальный сдвиг изотермы вправо (в сторону меньших степеней сжатия слоя) наблюдается для смеси с наибольшим содержанием полимера. Поверхностное давление (мН/м) 50 40 1 2 34 30 20 10 20 40 60 80 100 Площадь монослоя (%) Рисунок 63.- Изотермы сжатия монослоев, сформированных из ФХ (1), а также смесей ФХ-Пкат4 (9/1) (2), ФХ-Пкат4 (8/2) (2) и ФХ-Пкат4 (7/3). Монослойная техника [104] была использована для анализа поведения смешанных монослоев, сформированных из ФХ и функциональных амфифильных полимеров, Пф1 и Пф2. Было показано встраивание обоих 111 полимеров в ФХ монослой. В дополнение к этому было исследовано взаимодействие полимерных мицелл со сферическими бислойными липидными везикулами (липосомами). Возрастающие количества Пф1 и Пф2 были добавлены к 1 мг/мл суспензии ФИТЦ-меченых ФХ липосом. В обоих случаях наблюдалось некоторое уменьшение интенсивности флуоресценции, встроенной в бислой метки и заметное (почти в два раза) увеличение размера частиц в суспензии (рис. 64). Флуоресценция (о.е.) Гидродинамический диаметр (мкм) 250 100 200 90 1 2 150 80 1 2 100 50 70 10 20 30 40 50 10 20 30 40 50 [Полимер]×105 (M) [Полимер]×10 (M) 5 Рисунок 64.- Зависимость интенсивности флуоресценции (слева) и размера (справа) меченых ФХ липосом от концентрации полимеров. Пф1 (1) и Пф2 (2). Полученные результаты свидетельствовали о связывании функциональных полимеров с нейтральными липосомами. В другой серии экспериментов, при которых увеличиали количество катионного полимер, Пкат5, были добавлены к 1,5 мг/мл суспензии ФХ/КЛ2липосом. В этом случае происходило уменьшение интенсивности флуоресценции, встроенной в бислой метки и агрегацией липосом (рис. 65, слева, кривая 1 и рис. 65, справа, кривая 1), что указывало на связывание катионного полимера с анионными липосомами. Затем эксперимент был повторен в фосфатном буфере, дополнительно содержавшем 0,1 М NaCl. В этом случае интенсивность флуоресценции метки и размер частиц в системе практически не изменялись (рис. 63, слева, кривая 2 и рис. 63, справа, кривая 112 2), то есть связывания полимера с липосомами не наблюдалось. Таким образом, связывание Пкат5 с анионными липосомами было чувствительно к концентрации NaCl концентрации в соли окружающем подавляло водном растворе: увеличение комплексообразование вследствие экранирования зарядов обоих макроионов (полимера и липосом) зарядами малых противооионов: Na+ и Cl-. Ранее аналогичное поведение было отмечно у другой системы: катионный Пкат4 – анионные липосомы, в которой взаимодействие компонентов тоже имеет электростатическую природу. Флуоресценция (о.е.) Гидродинамический диаметр (нм) 800 100 2 600 90 1 1 400 80 200 2 70 2 4 6 8 10 2 [Полимер]×10 (M) 4 6 8 10 [Полимер]×105 (M) 5 Рисунок 65.- Зависимость интенсивности флуоресценции (слева) и размера (справа) меченых ФХ/КЛ2- липосом от концентрации Пкат5. [NaCl]: 0 (1) и 0,15 M (2). Следующим шагом был ответ на вопрос: способен ли катионный П кат4 связываться с анионными липосомами, мембрана которых ковелентно модифицирована молекулами полиоксиэтилена (ПОЭ). Экспонированная во внешний раствор ПОЭ корона могла рассматриваться в качестве грубой модели клеточного гликокалликса. Для приготовления ПОЭ-содержащих липосом использовали описанную выше стандартную процедуру с добавлением цетилового эфира ПОЭ на стадии получения смешанной липидной пленки[104,105]. 113 Методом динамического светорассеяния было установлено, что размеры трехкомпонентных ФХ/КЛ2-\Бридж липосом и контрольных ФХ липосом лежали в пределах 70-90 нм. Добавление раствора Пкат5 к суспензиям липосом вызывало увеличение размера частиц в суспензиях на 10-20 нм (рис. 66). Гидродинамический диаметр (нм) 120 1 2 100 80 0 1,0 2,0 3,0 7 [Пкат4]×10 (M) Рисунок 66.-Зависимость размера ФХ(1) и трехкомпонентных ФХ/КЛ2\Бридж (2) липосом от концентрации Пкат4. 4 Небольшое увеличение размера свидетельствовало о связывании поликатиона на поверхности обоих типов липосом. Примечательно, что адсорбция поликатиона не вызывала агрегации частиц в системе. Выше упоминалось о том, что анионные молекулы ДНК связываются с катионным Пкат5 в 102-М фосфатном буфере, а также в буфере, содержавшем 0,15М NaCl. В то же время, анионные ФХ/КЛ2- липосомы с мольной долей отрицательно зараженных КЛ2- групп равной 0,2 связываются с Пкат5 только в 102-М фосфатном буфере. Взаимодействие липосома-Пкат5 практически полностью подавляется при добавлении к буферному раствору 0,15М NaCl. Причина этого может заключаться в различном устройстве двух анионных матриц – ДНК и липосомы. Линейная плотность отрицательно заряженных групп вдоль линейной цепи ДНК существенно выше плотности таких групп на поверхности липосомы. Следствием этого является более высокая устойчивость комплексов ДНК-Пкат5 в водно-солевых растворах. 114 Мы исследовали поведение тройной системы ДНК-Пкат5-липосома в 102-М фосфатном буфере с рН 7. Для приготовления ФХ/КЛ2- (8/2) липосом была использована описанная выше стандартная процедура, предполагающая ультразвуковую обработку водно-липидной суспензии. Для получения флуоресцентно меченых липосом в липидный бислой включали флуоресцентно меченый липид, N-[(7-нитробенз-2-окси-1,3- диазол-4-yl)-дипальмитоил]-фосфатидилэтаноламин (НБД-ФЭ). 0,1 мг/мл суспензия меченых липосом была добавлена к 0,025 вес.% раствору Пкат5. Это сопровождалось появлением слабой опалесценции и понижением интенсивности флуоресценции метки до 62 % (за 100% принимали интенсивность флуоресценции исходной суспензии липосом). Наблюдаемые изменения отражали связывание липосом с Пкат5. Последующее добавление возрастающих количеств ДНК в систему сопровождалось дополнительным понижением интенсивности флуоресценции и фазовым разделением (образованием осадка). После центрифугирования образцов в течение 10 минут при скорости 12000 об/мин была измерена интенсивность флуоресценции в супернатантах. Результаты представлены в таблице 20. Интенсивность флуоресценции супернатантов после центрифугирования трехкомпонентной суспензии ДНК-Пкат5-меченые липосомы* Таблица 20. Интенсивность флуоресценции в супернатантах. [ДНК]×104, M Флуоресценция, % 0 62 1 55 2 50 3 37 4 10 -2 * Измерено в 10 M фосфатном буфере, рН 7. 115 Низкий остаточный уровень флуоресценции (10 % для [ДНК]=4×10-4 М) указывал на то, что большая часть ДНК включалась в седиментировавшие частицы комплекса. Затем эксперимент был повторен с немечеными липосомами, после чего была измерена оптическая плотность супернатантов при длине волны 260 нм, соответствовавшей максимуму поглощения в УФспектре ДНК. Измерения показали, что ДНК практически количественно включалась в состав осадка. Наконец, раствор ДНК был добавлен к суспензии ФХ/КЛ2- липосом. Как и ожидалось, это не привело к формированию осадка, то есть не сопровождалось взаимодействием линейного полианиона и анионных липосом. Полученные результаты указывали на формирование тройного комплекса ДНК-Пкат4-липосома. После этого мы иследовали поведение тройной системы, состоявшей из ДНК, анионных липосом и катионного Пкат5 в физиологическим растворе с рН 7 и концентрацией соли (NaCl) равной 0,15М. Добавление 0,025 вес.% раствора Пкат5 к 0,1 мг/мл суспензии НБД-меченых липосом сопровождалось незначительным понижением интенсивности флуоресценции метки (по сравнению с почти 40 %-ным уменьшением в отсутствии NaCl), что свидетельствовало о слабом связывании ДНК с катионным полимером. Однако последующее добавление возрастающих количеств ДНК в систему приводило к резкому уменьшению интенсивности флуоресценции и фазовым разделением (образованием рыхлого осадка). Состав осадка был определен так же, как это было сделано для системы в отсутствии соли. Во-первых, после центрифугирования трехкомпонентных образцов была измерена интенсивность флуоресценции в супернатантах (Рис. 67), и установлено, что большая часть ДНК включалась в седиментировавшие частицы. Во-вторых, эксперимент с немечеными ФХ/КЛ2- липосомами показал практически количественное включение ДНК в состав осадка. И, в-третьих, мы добавили раствор ДНК к суспензии ФХ/КЛ2липосом и не увидели формирования осадка, то есть не зарегистрировали 116 образования комплекса между линейным полианионом и анионными липосомами. Доля выживших клеток (%) 100 80 60 1 2 3 40 20 1E-4 1E-3 0.01 0.1 1 Конц. Докс (мг/мл) Рисунок 67.- Выживаемость устойчивых клеток MCF7R в отсутствии (1) и в присутствии Пф1 (2) и Пф2 (3) от концентрации Докс. В дополнение к этому раствор ДНК был добавлен к суспензии флуоресцентно меченых ФХ/КЛ2-\Бридж липосом с иммобилизованным на их поверхности Пкат4. Заряд-зарядовое соотношение ДНК/Пкат4 поддерживалось равным 1. Это сопровождалось фазовым разделением и образованием осадка. После центрифугировнаия образца была измерена интенсивность флуоресценции супернатанта, которая оказалась примерно вдвое меньше интенсивности флуоресценции исходных липосом. Таким образом, почти половина ФХ/КЛ2-\Бридж липосом участвовала в образовании тройного комплекса ДНК-Пкат4-липосома. Последний из них сохранил стабильность (не диссоциировал на исходные компоненты) до концентрации соли равной 0,65 М. Эти результаты вместе с описанными ранее экспериментальными доказательствами [106] прочного связывания ДНК с Пкат5 позволяют предложить следующую схему формирования комплекса в тройной системе ДНК-Пкат5-анионная липосома. На первой стадии ДНК образует электростатический комплекс с мицеллами Пкат5, стабилизированный 117 множественными солевыми связями между противоположно заряженными группами обоих компонентов. формируются достаточно В результате в составе комплекса протяженные гидрофобные участки, представленные последовательностями взаимно нейтрализованных звеньев ДНК и Пкат5. На второй стадии образовавшийся комплекс взаимодействует с ФХ/КЛ2- (8/2) липосомами, по-видимому, благодаря встраиванию гидрофобных фрагментов ДНК-Пкат5 комплекса в липосомальную мембрану. По этой причине образовавшийся тройной комплекс ДНК-Пкат5-анионная липосома нечувствителен к концентрации соли в окружающем растворе. 118 5. ВЫВОДЫ. Подводя итог данной диссертационной работы, можно сделать следующие выводы: - получены амфифильные производные поли-N-винилпирролидона, полиакриламида и полиакрилата К, которые содержат одну концевую гидрофобную группу, а также были синтезированы сополимеры акриловой кислоты с акриламидом и винилпирролидоном; - использованы амфифильные полимеры, полученные в две стадии, которые также оказались эффективными носителями БАВ; - исследованы свойства полимеров – их растворимость в различных растворителях, молекулярная масса (методом потенциометрического титрования), сняты спектры УФ для полимеров с различной ММ; - исследована способность полимеров различного строения к образованию агрегатов (их устойчивость при разбавлении, размер агрегатов при различных способах формирования, распределение частиц по размерам); - отработан метод выделения частиц в сухом виде (модель товарной формы); - определены условия хранения препарата и получена оптимальная концентрация для каждого из них; - исследован процесс включения БАВ и получения препаратов (на примере нуклеиновых оснований - аденина, бензиладенина, урацила, тимина, цитозина и гуанина) с использованием различных носителей методом иммобилизации; 119 - исследована устойчивость наноагрегатов с включенным БАВ при разбавлении и изменении свойств водной фазы – рН, ионная сила; - определены места включения БАВ в объеме агрегата для различных носителей (гидрофобная часть, полимерная часть); - разработано изобретение - фармацевтическая композиция для применения в онкологии – препарат амфифильного поли-N-винилпирролидона с 5форурацилом, применение которого обеспечивает снижение токсичности лечения, увеличение ударной дозы лекарственного препарата и достижение пролонгации его действия, а также сохранение вязкости композиции после стерилизации; - исследована кинетика выделения БАВ (пролонгированное действие препарата) из агрегата диализным методом для различных носителей; - получены и исследованы препараты с ДНК, а также предложено их практическое применение. В данной научной работе цель - получение наноразмерных частиц препарата с различными БАВ с пролонгированным действием достигнута. 120 6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 1. Shtilman, M.I. Polymeric biomaterials. Part I.VSP: Utresht-Tokyo, 2000. 247 p. 2. А. Л. Фотиев, Б. В. Слободин, М. Я. Ходос. Ванадаты. Состав, синтез, структура, свойства. М.: Наука, 1988. 272 с. 3. Русанов, А.И. Мицеллообразование в водных растворах поверхностноактивных веществ. СПб.: Химия, 1992. 358 с. 4. О. Я. Самойлов. Структура водных растворов электролитов и гидратация ионов. Изд-во АН СССР, Москва, 1957. 254 c. 5. Алексеев К. В., Аляутдин Р. Н., Блынская Е. В., Квинх Б. Т. Основные направления в технологии получения наноносителей лекарственных средств// Вестник новых медицинских технологий. 2009. № 2. С. 143. 6. R. Aveyard, T. Lawless. Interfacial Tension Minima in Oil-Water-Surfactant Systems // J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1986. 82 c. 7. А.Н. Кусков, М.И. Ямсков. Синтез пирролидона и Штильман, А.М. Тсатсакис, В.П. Торчилин, И.А амфифильных акриламида полимеров различного поли-N-винил- строения // Журнал прикладной химии. 2005. Т. 78, № 5. C.822-826. 8. Русанов, А.И. Мицеллообразование в водных растворах поверхностноактивных веществ. СПб.: Химия, 1992. 358 с. 9. P. Alexandridis, B Lindman. Amphiphilic Block Copolymers: Self-Assembly and Applications. Amsterdam: Elsevier, 2000. 448p. 10. Ed. by M.P. Pileni. Structure and Reactiviity in Reversed Micelles. Amsterdam: Elsevier, 1989. Ред. 2. XVIII. 379 с. 11. H.F. Eick, H. Christen. Stability of micelles in apolar media // J. Colloid Interface Sci. 1974. V.46, № 3, P.417. 12. В.В. Коршак, М.И. Штильман. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений. М.: Наука, 1984. 261 с. 13. Торчилин, В.П. Иммобилизованные ферменты в медицине. М.: Знание, 1986. 31 с. 121 14. I. Hasegawa, N. Hirashima. Styrene maleic acid neocarzinostatin-transcatheter embolization for hepatocellular carcinoma // Gan To Kagaku Ryoho. 2002. V.29, № 2, P. 253-259. 15. Y. Takakura, Т. Fujita, M. Hashida, H. Sezaki. Disposition characteristics of macromolecules in tumor-bearing mice // Pharm. Res. 1990. V. 7, № 4. P. 339346. 16. H.S. Mayerson, C.G. Wolfram. Capillary permeability to macromolecules: stretched pore phenomenon // Am. J. Phisiol. 1999. V. 198, № 2, P. 155-160. 17. В.В. Коршак, М.И. Штильман. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений. М.: Наука, 1998. 281 с. 18. G.E. Ghanem, C. Jourban, R. Arnould, F. Lejeune, J. Fruhling. Labelled polycyanoacrylate nanoparticles for human in vivo application // Appl. Radiat. Isot. 1993. V. 44, № 9. P. 1219-1224. 19. Torchilin, V.P. Polymeric contrast agents for medical imaging // Current Pharmaceutical Biotechnology. 2000. V. 1, № 52. P. 183-215. 20. A.L. Klibanov, K. Maruyama, V.P. Torchilin, L. Huang. Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes // FEBS Lett. 1990. V.268, № 1. P.235-238. 21. L. Brigger, C. Dubernet, P. Couvreur. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis // Adv. Drug Deliv. Rev. 2002. V. 54, № 5. P. 631-651. 22. M.C. Jones, J.C. Leroux. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers // Eur. J. of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 1999. V.48, № 2. P.101-111. 23. Torchilin, V.P. Polymeric contrast agents for medical imaging // Current Pharmaceutical Biotechnology. 2000. V. 1, № 52. P. 183-215. 24. A.L. Villemson, A.N. Kuskov, M.I. Shtilman, L.V. Galebskaya, E.V. Ryumina, N.I Larionova. Interaction of polymers aggregates based on steariylpoly-N-vinylpyrrolidone with blood components // Biochemistry. 2004. V.69, № 8. Р. 765-775. 122 25. М.И. Штильман, И.И. Твердохлебова, М.Ю. Ярмыш, Е.В. Михайлова, А.М. Тсатсакис, В.П. Торчилин, А. Ризос. Амфифильные полимеры Nвинилпирролидона // Высокомолек. соед. 1999. Т.41, № 5. С.906-909. 26. Халатур, П.Г. Самоорганизация полимеров. // Соросовский образовательный журнал. 2001. Т.7, № 41. С.36-43. 27. Платэ Н.А., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры. М.: Химия, 1986. 296 с. 28. K.N. Prasad, T.T. Luong, A.T. Florence, J. Paris, C. Vaution, M. Seiller, F. Puisieux. Surface activity and association of ABA polyoxyethylene- polyoxypropylene block copolymers in aqueous solution // J. Colloid Interface Sci. 1979. V.69, № 2. P.225-232. 29. J.S. Tan, D.E. Butterfield, C.L. Voycheck, K.D. Caldwell, J.T. Li. Surface modification of nanoparticles by PEO/PPO block copolymers to minimize interactions with blood components and prolong blood circulation in rats // Biomaterials. 1993. V.14, № 1. P.823-833. 30. Сидельковская Ф. П. Химия N-винилпирролидона и его полимеров. М: Химия, 1973. 448 с. 31. Куренков В.Ф. Полиакриламид. М.: Химия, 1992. 192 с. 32. Куренков В.Ф. Водорастворимые полимеры акриламида // Соросовский образовательный журнал. 1997. № 5. С.48-53. 33. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology / Halverson F. 3rd ed. N.Y.: Wiley, 1980. Vol. 10. P. 489. 34. Kurenkov V.F. Handbook of Engineering Polymeric Materials. Ch. 3. Morganville, N.J.: Marcel Dekker, 1997. P. 61-72. 35. А. Н. Кусков, М. И. Штильман, А.М. Тсатсакис, В.П. Торчилин, И.А. Ямсков. Синтез амфифильных полимеров N-винилпирролидона и акриламида различного строения // Журнал прикладной химии. 2005. Т. 78, вып. 5. С. 822-826. 123 36. V.P. Torchilin, T.S. Levchenko, K.R. Whiteman, A.A. Yaroslavov, A.M. Tsatsakis, A.K. Rizos, E.V. Michailova, M.I. Shtilman. Amphiphilic poly-Nvinylpyrrolidones: Synthesis, properties and liposome surface modification // Biomaterials. 2001. V.22, № 22. P.3035-3044. 37. Головкин Б. Н. и др. Биологически активные вещества растительного происхождения. М.: Наука, 2001. Т. I. 350 с. 38. Смирнова З.И. Интродукция и приёмы культуры цветочно-декоративных растений. М.: Наука, 1997. 168 с. 39. М. Ю. Королёва. Наноэмульсии – перспективные дисперсные системы для косметики и фармацевтики// Сырье & Упаковка. 2012. №5. С. 21-25. 40. Поликсенова В. Д. Биологически активные вещества биогенной и абиогенной природы как индукторы неспецифической устойчивости томатов к стрессам // Вестник БГУ. Сер. 2 : журнал. 2007. № 3. С. 83—86. 41. Кулаева О. Н. Белки теплового шока и устойчивость растений к стрессу // Соровский образовательный журнал. Биология, 1997. 42. Ахиярова, Г.Р., Веселов, Д.С. Гормональная регуляция роста и водного обмена при засолении /Тезисы участников 6-ой Пущинской школыконференции молодых ученых «Биология –наука XXI века», 2002. 43. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функции. М.: Наука, 1973. 44. Полевой В.В. Физиология растений: учеб. для биол. спец. вузов. М.: Высш. шк., 1989. С. 428-430. 45. Atanassova L., Pissarska M., Stoyanov I. Cytokinins and growth responses of maize and pea plants to salt stress. // Bulg. J. Plant Physiol. Sofia, 1996, Vol. 22 №1/2, р. 22-31. 46. Лебедев С.И. Физиология растений. – 3-е изд. перераб. и доп. М.: Агропромиздат, 1988. С. 519. 47. Георгиевский В. П., Комиссаренко П. Ф., Дмитрук С. Е. Биологически активные вещества лекарственных растений. Новосибирск: Наука, Сиб. отдние, 1990. 333 с. 124 48. Кудоярова Г. Р., Теплова И. Р., Докичева Р. А., Усманова И. Ю., Веселов С. Ю. Влияние 6-БАП на рост и содержание ауксинов в проростках пшеницы и кукурузы / Иммуноанализ регуляторов роста в решении проблем физиологии растений, растеневодства и биотехнологии. Материалы III конференции. Уфа, 2000. 49. Войников В. К., Рудиковский А. В., Побежимова Т. П., Варакина Н. Н. Физиологический стресс и стрессовые белки растений / Второй съезд Всесоюзного общества физиологов растений: Тезисы докладов II ч. М., 1992. 316 с. 50. Калинина Н. А., Драговоз И. В., Яворская В. К. Фитогормональный баланс корней кукурузы на фоне действия хлоридного засоления и 6-БАП / Ученые записки ТНУ, 2002. Том 14. 51. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В 2-х томах. Т. 2. М.: Мир, 1993. 415 с. 52. Химическая энциклопедия / И. Л. Кнунянц. М.: Советская энциклопедия, 1988. 623 с. 53. Морган П. Поликонденсационные процессы синтеза полимеров. Л.: Химия, 1970. 448 с. 54. A.N. Kuskov, A.L. Villemson, M.I. Shtilman, N.I. Larionova, A.M. Tsatsakis, I. Tsikalas, A.K. Rizos. Amphiphilic poly-N-vinylpyrrolidone nanocarriers with incorporated model proteins // J.of Physics: Condens. Mater. 2007. V.19, №.20. P. 484 - 495. 55. М.И. Штильман, И.И. Твердохлебова, М.Ю. Ярмыш, Е.В. Михайлова, А.М. Тсатсакис, В.П. Торчилин, А. Ризос. Амфифильные полимеры Nвинилпирролидона // Высокомолек. соединения. 1999. Т.41, № 5. С.906-909. 56. Shtilman, M.I. Amphiphilic polymers of N-vinylpyrrolidone as potential modificator for liposome membranes / Boston, 199926th (Intern.Symp.on Contr.Release of Bioact. Materials), CRS, 1999. P.534-535. 57. КнореД.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия: учебник для хим., биол. и мед. спец. вузов. — 3-е изд. испр. М.: Вища школа, Киев, 2000. 479 с. 58. Ленинджер А. Основы биохимии: в 3-х т. Т.2. М., Мир, 1985. 368 с. 125 59. Петров Р.В., Хаитов Р.М. Искусственные антигены и вакцины. М.: Медицина, 1988. 288 с. 60. Торчилин В.П. Иммобилизованные ферменты в медицине. М.: ВНТИЦ, 1998. 198 с. 61. Волков В.А. Коллоидная химия для химико-технологических специальностей текстильных вузов и вузов легкой промышленности. М.,2001. 640 с. 62. L. Brigger, C. Dubernet, P. Couvreur. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis / // Adv. Drug Deliv. Rev. 2002. V. 54, № 5. P. 631-651. 63. И. В. Березин, К. Мартинек. Введение в прикладную этимологию. Иммобилизованные ферменты. М., 1982. 383 с. 64. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. Вводный курс и применение в биотехнологии. М., 1983. 213 с. 65. М.И. Штильман, И.И. Твердохлебова, М.Ю. Ярмыш, Е.В. Михайлова, А.М. Тсатсакис, В.П. Торчилин, А. Ризос. Амфифильные полимеры Nвинилпирролидона // Высокомолек. соед. 1999. Т.41, № 5. С.906-909. 66. Кабакова М. М. Тетразолилакрилатные сшитые сополимеры в качестве термостойких сорбентов водных растворов поливалентных металлов : дис. ... канд. хим. наук : 02.00.06. СПб., 2006. 160 с. 67. Умаров, М.Ф. В.С. Горелик. Оптическая спектроскопия биоактивных препаратов. Вологда: ВоГУ, 2014. 147 с. 68. A.L. Villemson, E.V. Malykh, M.I. Shtilman, N.I. Larionova. Self-assembling systems based on amphiphilic poly-N-vinylpyrrolidone and their interaction with model proteins // Biochemistry. 2004. № 2. С.23-27. 69. Коровина М.А. Разработка методологии и технологии создания лечебных текстильных и гидрогелевых аппликаций для направленной местной доставки лекарств при лучевой терапии онкологических заболеваний (теория и практика): дис. ... д-ра техн. наук. М, 2011. 93с. 70. Композиция, обладающая противоопухолевым действием: пат. 2094047 Рос. Федерация. № 95121870/14; заявл. 25.12.1995; опубл. 27.10.1997, A61K31/415, A61K31/415, A61K31:79. 126 71. Противоопухолевое средство с поливинилпирролидоном: пат. 1683190 Рос. Федерация. опубл. 23.06.1995, МПК А61К 9/08, А61К 31/70. 72. Противоопухолевое средство с нитрозоаминомочевиной: пат. 2066181 Рос. Федерация, опубл. 1996, МПК А61К 9/08, А61К 31/17, А61Р 35/00, Официальный бюллетень «Изобретения. Полезные модели», 1996. № 25. 73. Wu H.L., Ramachandran C., Weiner N.D., Roessler B.J. Topical transport of hydrophilic compounds using water-in-oil nanoemulsions // Int. J. Pharm., 2001. Vol. 220, p. 63 74. Anton N., Vandamme T.F. Nano-Emulsions. // Int. J. Pharm., 2009. Vol. 377, p. 142 75. A. San Juan, D. Letourneur, V.A. Izumrudov. Quaternized poly(4vinylpyridine)s as model gene delivery polycations: structure-function study by modification of side chain hydrophobicity and degree of alkylation // Bioconjug. Chem. 2007. V.18. № 3. 922-928 p. 76. J.S. Hrkach, M.T. Peracchia, A. Bomb, N. Lotan, R. Langer. Nanotechnology for biomaterials engineering: structural characterization of amphiphilic polymeric nanoparticles by H-NMR spectroscopy // Biomaterials. 1997. V.18, № 1. P.27-30. 77. Ito, K. Effect of Radical Scavenger on Initiation Efficiency. // Journal of polymer science, part A-1. 1972. V.10. P.57-62. 78. A.M. Tsatsakis, M.I. Shtilman. Phytoactive polymers. New synthetic plant growth regulators / Eds.K.Angelakis and Tran Thah Van. Plenum.Publ Co.: NewYork – London, 1993. P.255-272. 79. Devarajan R., Arunachalam V., Kumaraswamy M., Tajuddin I., Joghee T. J. Darsen’s glycidic ester condensation reaction on poly(N-vinylpyrrolidone) // Of appl. Polym. Sci. 1992. V. 44. Р. 1473-1475. 80. N.A. Sheikh, M. Shamisi, W.J. Morrow. Delivery systems for molecular vaccination // Curr. Opin. Mol. Ther. 2000. V.2, № 1. P.37-54. 81. Справочник по физической химии полимеров / Ю.С. Липатов. Киев: Наукова Думка, 1984. 374 c. 82. Химическая энциклопедия / Зефиров Н. С. М.: Большая Российская энциклопедия, 1995. 639 с. 127 83. Справочник химика. М.: Химия, 1984. Т. 4. 448 с. 84. Ю.В. Карякин, И.И. Ангелов. Чистые химические реактивы. М.: Химия, 1974. 408 с. 85. Райхардт, Х. Растворители в органической химии. Л.: Химия, 1973. 416 с. 86. М.И. Штильман, В.Ю. Хвостова, Р.И.Ташмухамедов, Т.А. Головкова, А.М.Tsatsakis. Эпоксидсодержащий поли-N-винилпирролидон // Пластмассы. 2001. № 7. С.5-9. 87. D.J. Bharali, S.K. Sahoo, S. Mozumdar, A. Maitra. Cross-linked polyvinylpyrrolidone nanoparticles: a potential carrier for hydrophilic drugs // J. Coll Interface Sci. 2003. V. 258, № 2. P. 415-423. 88. G.E. Ghanem, C. Jourban, R. Arnould, F. Lejeune, J. Fruhling. Labelled polycyanoacrylate nanoparticles for human in vivo application // Appl. Radiat. Isot. 1993. V. 44, № 9. P. 1219-1224. 89. Torchilin, V.P. Polymeric contrast agents for medical imaging // Current Pharmaceutical Biotechnology. 2000. V. 1, № 52. P. 183-215. 90. Штильман, М. И. Полимеры медико-биологического назначения. М.: ИКЦ «Академкнига», 2006. 400 с. 91. L. Brigger, C. Dubernet, P. Couvreur. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis // Adv. Drug Deliv. Rev. 2002. V. 54, № 5. P. 631-651. 92. A.N. Kuskov, A.L. Villemson, M.I. Shtilman, N.I. Larionova, A.M. Tsatsakis, I. Tsikalas, A.K. Rizos. Amphiphilic poly-N-vinylpyrrolidone nanocarriers with incorporated model proteins // J.of Physics: Condens. Mater. 2007. V.19, №.20. P.484-495. 93. G.S. Kwon, M. Naito, M. Yokoyama, Т. Okano, Y. Sakurai, K. Kataoka. Physical entrapment of Adriamycin in AB block copolymer micelles // J. Controll. Rel. 1995. V.12, № 2. P.192-195. 94. V.P. Torchilin, M.I. Shtilman, V.S. Trubetskoy, K. Whiteman, A.M. Milshtein. Amphyphylic vinyl polymers effectively prolong liposome circulation time in vivo // Biochimica et Biophysica Acta. 1994. V.1195, № 1. Р. 181-184. 95. Кусков А.Н. Амфифильные полимеры N-винилпирролндона: дис. ... канд. хим. наук : 02.00.06. М., 2006. 36 с. 128 96. Л.И Валуев, Т.А. Валуев, И.Л. Валуев и др. Полимерные системы для контролируемого выделения биологически активных соединений // Успехи биохимии. 2003. Т. 43. С. 307-328. 97. V.S. Trubetskoy, M.D Frank-Kamentsky, K.R. Whiteman, V.P. Torchilin. Stable polymeric micelles: lymphangiographic contrast media for gamma scintigraphy and magnetic resonance imaging // Acad. Radiol. 1996. V.3, № 3. P.232-238. 98. Большая медицинская энциклопедия / Б. В. Петровский. М.: Советская энциклопедия, 1985. 6000 с. 99. Виллемсон А.Л., Малых Е.В., Штильман М.И., Ларионова Н.И. Самоорганизующиеся сиситемы на основе амфифильного поливинилпирролидона и их взаимодействие с модельными белками. // Биохимия, 2003, Т.68, С. 1063-1069. 100. Биологический энциклопедический словарь. / М. С. Гиляров, Г. Г. Винберг, Г. А. Заварзин и др. М.: Сов. Энциклопедия, 1986. 864 с. 101. E.W. Van Etten, W. Van Vianen, P. Roovers, P. Frederik. Mild heating of amphotericin B-desoxycholate: effects on ultrastructure, in vitro activity and toxicity, and therapeutic efficacy in severe candidiasis in leukopenic mice // Antimicrob Agents Chemother. 2000. V. 44, № 6. Р. 1598-1603. 102. Г. С. Муромцев, Д. И. Чкаников, О. Н. Кулаева. Основы химической регуляции роста и продуктивности растений. М.: Агропромиздат, 1987. 383с. 103. Speiser, P.P. Nanoparticles and liposomes: a state of the art. Methods Find // Exp. Clin. Pharmacol. 1991. V. 13, № 5. P. 337-342. 104. A.A. Gabizon. Pegylated liposomal doxorubicin: metamorphosis of an old drug into a new form of chemotherapy // Cancer Invest. V. 19, № 4. P. 424-436. 105. Горячая А.В. Водорастворимые функциональные амфифильные полимеры: дис. ... канд. хим. наук : 02.00.06. М., 2009. 95 с. 106. Тихонов А.И., Ярных Т.Г., 3упанец И.А. Биофармация. Х.: НФаУ, 2003. 240 с. 129