Доклиническое исследование влияния препарата Панкреол на

Доклиническое исследование влияния препарата Панкреол на течение
острого экспериментального панкреатита.
Работа выполнена на базе ВЭК НИИ Митоинженерии МГУ в период февраль-март 2012 года.
При проведении доклинических исследований выбрана модель острого панкреатита,
индуцируемого введением L-аргинина, характеризующая избирательным повреждением
(некрозом) ацинарных клеток поджелудочной железы в течение первых 48 часов.
Экспериментальное исследование проведено в соответствии со следующими нормативными
документами:
• Приказом МЗ РФ N 708 от 23 августа 2010 г. Об утверждении правил лабораторной
практики (GLP);
• «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых
фармакологических веществ», Москва, 2005 г.,
• СОП № 11И, 15И, 17И, 18И, 6Ж.
Материалы и методы.
Экспериментальная модель: острый панкреатит, вызванный введением L-аргинина.
Для изучения эффективности лечения панкреатита с помощью введения различных
лекарственных средств используют дозу L-Аргинина 100-200 мг/100 гр. внутрибрюшинно
(Hegyi et al., 1997; Takacs et al., 2001).
Приборы и материалы:
Весы лабораторные электронные AJ-CE/AJH-CE, Vibra, Japan
Пробирки полипропиленовые 1,5 мл., Scientific Specialtios Inc, USA
Пробирки полипропиленовые 50 мл., SPL, China
Автоматические дозаторы 10 – 100 мкл и 10-100 мкл Eppendorf ,Germany
Шприцы одноразовые 5,6,10 мл производство Becton Dickinson (Испания)
Вода (CAS 7732-18-5, Millipore Milli-Q PLUS (R≥18,2 MОм·cм)
Фосфатный буфер (Helicon, Am-E404-100,LOT 3600C172)
L-аргинин (Merck, K40829187)
Лабораторные животные.
В работе использованы половозрелые самцы крыс, сток Wistar, количество – 40 особей. Вес
300-400 гр., возраст при поставке: 12-14 недель. Животные содержались группами по 5-6
животных в клетке, в условиях свободного доступа к воде и корму при световом режиме
12/12, в хорошо вентилируемых помещениях (кратность 10-12 об/ч стерильным ламинарным
потоком) с температурой воздуха 20-24С, влажностью 30-70%. В первые сутки эксперимента
был ограничен доступ крыс к корму. Для исключения появления патогенной флоры в
помещениях ежедневно проводились мероприятия по дезинфекции с помощью
профессиональных дезинфицирующих средств (Лайна-Мед, Россия).
Дизайн исследования:
Для получения адекватных результатов проводили ранжирование животных на 5 групп,
гомогенных по весу и уровню биохимических показателей плазмы крови. Взвешивание
животных проводили на технических весах с точностью ±0.1 г. согласно СОП «Процедура
взвешивания животных» (СОП № 11И).
За сутки до моделирования острого панкреатита проводили биохимический анализ крови,
взятой из хвоста согласно СОП № 15И «Процедура взятия проб крови путем ампутации
кончика хвоста у мышей и крыс» и ранжирование крыс по уровню ферментов в крови.
Острый панкреатит моделировали внутрибрюшинным введением L-Аргинина в дозе 100
мг/100 грамм веса крысы. Аргинин вводили в виде 20% раствора, приготовленного на
фосфатном буфере рН 6.8 (объеме примерно 2,5 мл).
Экспериментальные группы:
1. «Интактная группа» (n=5) – животным проведена инъекция физ. раствора,
внутрибрюшинно. Объем вводимого раствора аналогичен объему, вводимому
животным экспериментальных групп.
2. «Негативный контроль» (n=9) – животным вводится физ. р-р подкожно в дозе 1
мл/100 грамм веса; первый раз через 12 часов после введения Аргинина, затем два
раза в день, ежедневно, в течение 6 суток.
3. «Экспериментальная группа 0,035» (n=8) – животным вводится препарат Панкреол
подкожно в дозе 0,035 мл/100 гр. (0,12 мл на крысу), первый раз через 12 часов после
введения Аргинина, затем два раза в день, ежедневно, в течение 6 суток.
4. «Экспериментальная группа 0,1» (n=9) – животным вводится препарат Панкреол
подкожно в дозе 0,1 мл/100 гр. (0,3 мл на крысу), первый раз через 12 часов после
введения Аргинина, затем два раза в день, ежедневно, в течение 6 суток.
5. «Экспериментальная группа 0,35» (n=9) – животным вводится препарат Панкреол
подкожно в дозе 0,35 мл/100 гр. (1,2 мл на крысу), первый раз через 12 часов после
введения Аргинина, затем два раза в день, ежедневно, в течение 6 суток.
На второй и четвертый день после введения аргинина проводилось взятие крови из хвоста на
биохимический анализ согласно СОП № 15И «Процедура взятия проб крови путем ампутации
кончика хвоста у мышей и крыс».
На 6-е сутки после введения аргинина животных эвтаназировали согласно СОП № 6Ж
«Процедура эвтаназии грызунов углекислым газом». Кровь отбиралась из сердца животных
согласно СОП № 17И «Процедура взятия проб крови из камер сердца у мышей и крыс». У 3-5
крыс из каждой группы отбирали поджелудочную железу, печень и тонкий кишечник для
гистологического исследования, определяли соотношение массы поджелудочной железы к
массе тела.
Методы исследования:
Биохимический анализ
Собранная в пробирку кровь отстраивается при комнатной температуре в течение 30 минут.
После этого центрифугируется при 5000 об. в течение 5 минут. После этого отбирается
супернатант и, при необходимости, хранится при -80 °С. Анализ проводится при помощи
Биохимического автоматического анализатора A-25 (Biosystems). Определяемые
биохимические параметры: амилаза (ед/л), глюкоза (ммоль/л), триглицериды (ммоль/л),
аланинаминотрансфераза (ед/л), аспартатаминотрансфераза (ед/л), липаза (ед/л).
Гистологический анализ
Для гистологического исследования брались образцы и фиксировались в 10% растворе
формалина. Образцы обрабатывали с помощью общепринятых методов: после стандартной
проводки по спиртам образцы заливают парафином и готовят срезы толщиной 5-6 мкм,
которые окрашивают гематоксилин-эозином. Анализ гистологических препаратов проводили
под световым микроскопом.
Критерии оценки: общее состояние, биохимические показатели, морфология поджелудочной
железы (результаты патологоанатомического и гистологического исследований).
Статистический анализ.
Статистическая обработка данных проводилась с помощью непараметрических (критерии
Манна-Уитни, Вилкоксона, Фишера).
Результаты.
Отработка модели экспериментального острого панкреатита. Используемые дозы: 200
мг/100 гр однократно, 100 мг/100 гр двукратно с интервалом 1 час, 100мг/100гр однократно.
При отработке модели было установлено, что однократное внутрибрюшинное введение LАргинина в дозе 100 мг/100 гр приводит к развитию острого панкреатита (подтверждено
патологоанатомическим исследованием).
Общее состояние:
После внутрибрюшинного введения аргинина у животных экспериментальных групп
наблюдались заторможенность, оглушение, нарушение дыхания, судороги. На первые сутки
после введения аргинина погибло трое животных, по одному из групп негативного контроля,
Панкреола в дозах 0,035, 0,35 мл/100 гр.
У экспериментальных животных, в отличие от группы интактного контроля, отмечались
заторможенность, вялость, диарея, взъерошенность шерсти, кифоз, бледность кожных
покровов, общее состояние слабости. У большинства животных наблюдался болевой синдром
(вокализация при прикосновении и манипуляциях). В последующие дни признаки
сохранялись, но были меньше выражены.
Результаты биохимического исследования крови:
Введение L-Аргинина сопровождалось изменением ряда биохимических показателей (см. таб.
1, 2, 3). Наиболее заметными были изменения уровня глюкозы, липазы и триглицеридов.
Именно эти биохимические показатели расцениваются как маркеры функциональной
активности поджелудочной железы. Выявлены достоверные отличия в активности липазы в
группе животных, получавших лечение препаратом Панкреол, по сравнению с группой
негативного контроля (введение физ. р-ра).
Изменения других исследуемых биохимических показателей было несущественным, значения
во все периоды находились в пределах физиологических норм.
Таблица 1. Уровень биохимических параметров в крови животных на 2-е сутки (через 36
часов) после моделирования острого панкреатита (u/L+станд.ошибка среднего).
ALT
AMYLASE
DIRECT
Интактный 70,40+8,06
608,2 +23,62
контроль
Негативный 59,60+7,44
562,80+46,72
контроль
Группа 0,035 68,75+11,94 544,20+22,85
Группа 0,1
GLUCOSE
TRIGLYC
ERIDES
210,80+32,96
7,04+0,25
1,07+0,07
28,66+9,39
299,40+24,18
5,34+0,46
1,83+0,40
21,96 +6,11
2,03+0,53
24,80+1,44
1,31+0,26
26,31+5,64
1,81+0,64
27,92+9,55
AST
283,80+45,44
72,72+11,77 648,86+71,45
275,86+35,32
Группа 0,35 90,83+17,16 559,67+62,27
210,50+55,47
5,20+0,41
*
5,11+0,69
**
6,07+0,42
Lypase
*- p<0,01 по сравнению с интактным контролем
**- p<0,005 по сравнению с интактным контролем
Таблица 2. Уровень биохимических параметров в крови животных на 4 сутки (через 84 часа)
после моделирования острого панкреатита (u/L+станд.ошибка среднего).
Группы
Интактный
контроль
Негативный
контроль
Группа
0,035
Группа 0,1
Группа 0,35
ALT
AMYLASE
DIRECT
AST
GLUCOSE
TRIGLYCE Lypase
RIDES
61,4+6,38 577,6+44,99 217,6+16,95
6,72+0,27
0,59+0,23 25,15+7,61
54,0+5,67 529,5+48,73 207,8+8,34
6,65+0,50
1,23+0,82 15,15+1,76
61,2+9,60 545,2+28,95 213,8+29,85
6,66+0,13
1,3+0, 94 19,64+1,21
56,0+8,61 611,8+83,95 201,0+33,05
6,73+0,35
2,14+1,02 20,30+2,90
51,0+5,59 515,6+25,46 214,7+18,53
5,89+0,37
0,6+0,28 17,14+4,23
Таблица 3. Уровень биохимических параметров в крови животных на 6 сутки (через 132 часа)
после моделирования острого панкреатита (u/L+станд.ошибка среднего).
Группы
Интактный
контроль
Негативный
контроль
Группа
0,035
Группа 0,1
Группа 0,35
ALT
AMYLASE
DIRECT
AST
69,4+4,32
630,3+110,93 301,8+10,27
GLUCOSE
5,46+0,22
TRIGLYCE Lypase,
RIDES
22,05+2,53
0,64+0,06
63,0+5,29
555,5+43,5
263,7+17,95
6,23+0,23
69,3+8,09
559,5+52,5
271,0+38,00
6,56+0,70
67,0+5,03
615,7+10,90
258,5+69,50
7,83+0,43
*#
1,05+0,04
6,18+0,20
0,48+0,01
209,0+13,68
*
*- p<0,05 по сравнению с интактным контролем
# - p<0,05 по сравнению с негативным контролем
55,5+10,09
450,8+52,72
0,7+0,02
10,60+2,35*
0,85+0,01
13,55+0,05
14,40+1,22*
23,98+5,69
#
В течение всего периода наблюдения во всех группах уровень глюкозы находился в пределах
физиологической нормы, однако было отмечено снижение содержания глюкозы в крови через
36 часов после введения L-Аргинина. В группе крыс, получавших Панкреол в дозе 0,35 мл/100
грамм, в эти сроки уровень глюкозы приближен к уровню интактного контроля. В
последующие дни уровень глюкозы в группах «негативный контроль», «Панкреол 0,035»,
«Панкреол 0,1», «Панкреол 0,35» был сопоставим с показателями интактного контроля.
Следует учесть, что на 6-е сутки у интактных животных уровень глюкозы был ниже по
сравнению с предыдущими значениями. С этим фактом могут быть связаны выявленные
отличия с группой «Панкреол 0,1» (уровень глюкозы в группе «Панкреол 0,1 находится в
пределах физилогически нормальных значений).
Анализ динамики изменений уровня липазы в группах животных после моделирования
острого панкреатита выявил следующую закономерность: в группе негативного контроля
уровень липазы постепенно снижался в течение всего периода наблюдений и на 6 сутки после
введения аргинина был значимо ниже, чем в контроле (10,60±2,34 u/L против 22,05±2,53 u/L,
р<0,05). Снижение уровня липазы сопровождалось изменением уровня триглицеридов. Это
может свидетельствовать о повреждении ацинарных клеток поджелудочной железы и
развитии внешнесекреторной недостаточности. У животных, получавших лечение
Панкреолом в дозе 0,35 мл/100 гр., на 6 сутки после моделирования острого панкреатита
уровень липазы в крови был значимо выше, чем в группе негативного контроля (23,98+5,69
u/L против 10,60±2,34 u/L соответственно, р<0,05) и соответствовал значению в контрольной
группе (22,05±2,53 u/L).
Необходимо отметить, что на основании только биохимических показателей сложно
оценивать степень повреждения поджелудочной железы при введении L-Аргинина. Поэтому
окончательное заключение о характере повреждений поджелудочной железы,
спровоцированных введением L-Аргинина, и протекторном действии Панкреола необходимо
делать с учётом данных патологоанатомического и гистологического исследований.
Результаты патологоанатомического исследования:
Таблица 4. Вес крыс и поджелудочной железы на 6 сутки после моделирования острого
панкреатита.
Группы
Интактный
контроль
Негативный
контроль
Группа 0,035
Группа 0,1
Группа 0,35
вес крыс, гр.
поджелудочная
железа, гр.
% к массе
поджелудочной железы
372,80+12,8623
1,53+0,089588
0,411481
349,60+16,58192
1,05+0,124130 *
0,298913
350,67+23,28185
320,29+21,98020 *
344,80+14,38888
1,56+0,200734
1,62+0,319891
1,84+0,144305 #
0,443441
0,506839 @
0,532918
*- p<0,05 по сравнению с интактным контролем
# - p<0,05 по сравнению с негативным контролем
@ - p=0,05 по сравнению с негативным контролем
Масса поджелудочной железы в группе негативного контроля была достоверно ниже на
6-е сутки после введения аргинина (p<0,05). Поскольку использовался зафиксированный в
формалине материал, снижение массы поджелудочной железы косвенно отражает
некротические процессы, прошедшие в ней. В то же время, во всех трех группах животных,
получавших Панкреол, снижение веса данного органа не наблюдалось. Более того, в группе
крыс, получавших максимальную дозу Панкреола 0,35 мл/100 гр, наблюдалось достоверное
(p<0,05) увеличение массы поджелудочной железы относительно негативного контроля. Это
может косвенно свидетельствовать о протекторном действии препарата Панкреол в дозе 0,35
мл/100 гр.
Соотношение массы поджелудочной железы к общей массе тела в группе контроля также
снижается по сравнению с интактными животными. У крыс, получавших Панкреол во всех
трех дозах, не наблюдалось снижения соотношения массы поджелудочной железы к общей
массе тела, и данное соотношение было на уровне интактного контроля. В группе животных,
получавших Панкреол в дозе 0,1 мл/100 гр. это изменение было близко к достоверному (@p=0,05).
Приложение к эксперименту.
«Исследование влияния введения препарата под рабочим названием
«Панкреол» на течение острого панкреатита у крыс Wistar».
Результаты гистологического исследования.
В приложении представлены микрофотографии гистологических срезов поджелудочной
железы крыс Wistar
интактной группы (интактный контроль) и крыс Wistar после
моделирования острого панкреатита путем введения аргинина (негативный контроль,
аргинин) и последующего применения Панкреола (Панкреол 0,035, Панкреол 0,1; Панкреол
0,35). Препараты окрашены гематоксилин-эозином, увеличение ×100, ×200.
Поджелудочная железа (интактный контроль). Рис.1.
Общая структура железы не нарушена. Ацинусы в основном состоят из типичных,
морфологически интактных экзокриноцитов с эозинофильными секреторными гранулами в
апикальной части, базофильной цитоплазмой и круглым ядром в базальной. Единичные очаги
изменения паренхиматозных клеток поджелудочной железы в виде фокальной вакуолярной
дистрофии экзокриноцитов.
Протоки поджелудочной железы выстланы кубическим эпителием без морфологических
изменений, наличие оксифильных масс в просвете выводных протоков. Интима, медия и
адвентиция стенок внутриорганных артерий и вен без патологических изменений.
Островки Лангерганса нормального размера и формы, состоят из полигональных клеток с
широкой мелкозернистой цитоплазмой, расположенных в центре (В-клетки) и относительно
небольших клеток по периферии островка (А-клетки), между которыми видны выстланные
эндотелием синусоиды.
Поджелудочная железа (негативный контроль, аргинин). Рис.2, 3.
Архитектоника железы нарушена, основная масса железистой ткани с явлениями
дистрофического и некробиотического поражения панкреоцитов. В дольках железы,
сохранивших ацинарное строение, панкреоциты с явлениями дистрофии и некробиоза:
уменьшены в размерах, повышена базофилия цитоплазмы, уменьшена в размерах зимогенная
зона, часты очаги ацинусов с вакуолизированной цитоплазмой с пикнотичными ядрами.
Единичные вакуоли наблюдаются в отдельных панкреатических островках (островках
Лангерганса).
Кровеносные сосуды и капилляры как внутри дольки, так и междольковые расширены и
полнокровны. Стенки сосудов утолщены, отечны. Наблюдался отек между ацинусами внутри
дольки и междольковой соединительной ткани.
Поджелудочная железа (Панкреол). Рис.4-6.
Структура железы сохранена. Среди общей массы сохранившихся ацинусов единичные
островки дистрофических изменений (очаговая вакуолизация). Ацинусы в основном состоят
из типичных, морфологически интактных экзокриноцитов с эозинофильными секреторными
гранулами в апикальной части, базофильной цитоплазмой и круглым ядром в базальной.
Островки Лангерганса нормального размера и формы, без признаков дистрофии.
Протоки поджелудочной железы выстланы кубическим эпителием без морфологических
изменений. Просветы отдельных выводных протоков содержат оксифильно окрашенные
гомогенные массы.
Рисунок 1. Гистоструктура поджелудочной железы. Интактный контроль.
Рисунок 2. Гистоструктура поджелудочной железы. Негативный контроль.
Некробиотические изменения ацинарных клеток, вакуолизация цитоплазмы.
Рисунок 3. Гистоструктура поджелудочной железы. Негативный контроль.
Некробиотические изменения ацинарных клеток, вакуолизация циттоплазмы. Разрежение
островка Лангерганса.
Рисунок 4. Гистоструктура поджелудочной железы. Группа Панкреол 0,035.
Сохранение структуры поджелудочной железы. Очаговые дистрофические изменения
ацинарных клеток. Островки Лангерганса не затронуты. Лейкоцитарная реакция не
обнаружена.
Рисунок 5. Гистоструктура поджелудочной железы. Группа Панкреол 0,1.
Сохранение структуры поджелудочной железы. Среди общей массы сохранившихся ацинусов
локальные очаги с признаками вакуольной дистрофии панкреацитов. Островки Лангерганса не
затронуты. Лейкоцитарная реакция не обнаружена.
Рисунок 6. Гистоструктура поджелудочной железы. Группа Панкреол 0,35.
Сохранение структуры поджелудочной железы. Среди общей массы сохранившихся ацинусов
единичные островки дистрофических изменений. Островки Лангерганса сохранены.
Лейкоцитарная реакция не обнаружена.
Заключение:
Результаты гистологического исследования демонстрируют, что введение аргинина вызывает
обширное повреждение ацинарной зоны поджелудочной железы. В группах с применением
препарата Панкреол тяжесть и объем дистрофических изменений экзокриноцитов были
существенно меньше, основная масса ацинусов была сохранена.
Выводы:
По результатам проведенного исследования препарат под рабочим названием «Панкреол»
нормализует состояние животных после моделирования состояния острого панкреатита,
оказывает протекторное действие на клетки поджелудочной железы. Введение препарата в
дозе 0,35 мл/100 гр. кроме того способствует восстановлению уровню липазы до контрольных
значений, что косвенно может свидетельствовать о нормализации экзокринной функции
поджелудочной железы.