Структурно-функциональные исследования бета2

УДК 577.22
Половинкин В.А.1 , Чупин В.В.1,2, Арсеньев А.С.1,2
1
2
Московский физико-технический институт (государственный университет)
Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А.
Овчинникова
Структурно-функциональные исследования бета2-адренергического рецептора
человека
Мембранные белки составляют более четверти всех белков, кодируемых
геномом человека [1]. Несмотря на то, что обычно мембранные белки экспрессируются
на низком уровне, они выполняют ключевую роль в регулировании физиологического
статусаклетки.
G-белок сопряженные рецепторы (GPCRs) представляют собой крупнейшее
семейство мембранных белков у эукариот. К настоящему времени идентифицировано
более 1000 белков данного класса. Необходимо отметить, что лекарства, действующие
посредством связывания с G-белковыми рецепторами, составляют более чем 50%
современного фармацевтического рынка, а доход с продаж этих лекарств превышает 40
миллиардов долларов США в год. Одним из подклассов семейства GPCR, к которому
приковано пристальное внимание многих фармацевтических компаний, является
группа адренергических рецепторов. Мутации в аминокислотных последовательностях
адренорецепторов приводят к таким заболеваниям как астма, гипертония, сердечная
недостаточность [2]. Адренергические рецепторы являются белками-мишенями для
большинства современных лекарств против данных заболеваний. Но очень часто эти
лекарства обладают побочными действиями, что, например, создает ряд проблем в
развивающихся странах, где уровень заболевания астмой растет одновременно с
ростом численности населения. Знание структур адренорецепторов и механизмов
связывания с лигандами позволило бы использовать современные вычислительные
технологии для создания новых лекарственных средств, тем самым на порядки
ускорить процесс разработки лекарственных средств и сделать этот процесс более
дешевым.
Основная проблема, возникающая при изучении структуры и функций
мембранных белков (в особенности семейства GPCRs), заключается в невозможности
выделения мембранных белков в достаточных количествах из их нативного окружения,
так как мембранные белки обычно присутствуют в биологических мембранах в низкой
концентрации. Возможный путь решения этой проблемы состоит в экспрессии
мембранных белков в бактериальных клетках и последующей экстракции белков из
мембран. Однако этот подход зачастую не приносит желаемых результатов из-за
токсичности экспрессируемых мембранных белков. Экспрессия мембранных белков в
тельца включения позволяет решить эту проблему. При этом требуется ренатурация
(рефолдинг) мембранных белков в нативную структуру in vitro путем солюбилизации
мембранных белков в мицеллах, бицеллах или липидных бислоях. К настоящему
времени не существует универсальных приемов рефолдинга мембранных белков, и
правильное
применение
того
или
иного
подхода,
к
сожалению,
остаётсявнекоторомсмысле «искусством».
Данная работа посвящена изучению рефолдинга представителя семейства Gбелок сопряженных рецепторов -β2-адренергического рецептора человека, а также
разработке функциональных тестов, позволяющих определять нативность структуры
данного рецептора.
В качестве объекта исследования была выбрана мутантная форма β2адренергического рецептора (ADRB2-DC). В молекуле белка ADRB2 остатки цистеина
C77, C116 и C125 были заменены на остатки валина V77, V116 и V125, а остатки
цистеина C265, C285, C327 - на остатки серина S265, S285 и S327 соответственно. Из
литературы известно, что данные аминокислотные остатки цистеина функционально не
значимы для молекулы рецептора. В связи с этим, была проведена замена
«функционально-незначимых» и труднодоступных для восстановителей остатков
цистеина из мембранных доменов белка на другие структурно аналогичные остатки,
которые не вступают в образование внутри-и межмолекулярных ковалентных связей.
Исследуемый белок имеет 4 цистеина, находящиеся во внемембранной части
белка. Правильное формирование дисульфидных связей обуславливает формирование
нативной (или близкой к нативной) конформации белковой молекулы и, как следствие,
появление определенной специфичности к лигандам рецептора. С этой целью
отработана методика спектрофотометрического определения концентрации свободных
сульфгидрильных групп с использованием реактива Эллмана, и было показано, что
рефолдирование белка-рецептора ADRB2-DC по методу, разработанному в нашей
лаборатории, происходит c замыканием внутримолекулярных дисульфидных связей.
Для проверки функциональной активности белка после проведения ренатурации
(рефолдинга)
и
окисления
была
разработана
методика
для
количественного
детектирования лиганда, связываемого рецептором, с помощью тонкослойной
хроматографии. В качестве лиганда использовался алпренолол, который можно
специфически детектироватьв сложных смесях на пластинках ТСХ.
Связывание рецептора с лигандом проводили, используя равновесный диализ.
Функциональное
тестирование
подтвердило,
что
структуры
рефолдированного
рецептора ADRB2-DC является нативной (или близкой к нативной). Однако
разработанная методика детектирования алпренолола (относительно дешевая в
сравнении с другими существующими методиками) позволяет охарактеризовать
взаимодействие лиганда с рецептором лишь качественно, не определив константу
связывания.
Литература
1. Wallin E., Heijne G. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from
eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms // Protein Science. – 1998. – N. 7. – P.
1029-1038.
2. Taylor
M.R.
Pharmacogenetics
of
the
human
Pharmacogenomics J. – 2007. - V. 7, N. 1. – P. 29-37.
beta-adrenergic
receptors
//