Лекция 13. (Трансляция. Особенности процесса у про

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА
1. Инициация – рекогниция, образование
инициаторного комплекса, старт трансляции
2. Элонгация – продолжение трансляции
3. Терминация – завершение трансляции
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. ТРАНСЛЯЦИЯ.
Последовательность молекулярных
событий, происходящих с рибосомой,
которая приводит к взаимодействию
рибосомы с началом кодирующей
нуклеотидной последовательности
mРНК и последующему считыванию
этой последовательности
подготовительный этап трансляции
суть : образовании ковалентной связи между
Контролируется ферментом аминоацил-tРНКсинтетазой (APC-азой, кодазой)
и
Существует 20 вариантов аминоацил-tРНК-синтетаз (по числу
аминокислот).
Аминоацил-tРНКсинтетаза несет 3
центра
связывания:
с АТФ
с аминокислотой
с tРНК
Синтетаза соединяет АК и АТФ,
отщепляется пиро-фосфат,
высвобождается энергия, для
следующих действий. АМФ
присоеди-няется к АК,
обеспечивая ее связь с
акцептором
Аминоацилирование
заключается в замене
присоединенной к
аминокислоте
молекулы АМФ на
молекулу тРНК
Аминоацилированная tРНК
(аа-tRNA)
высвобождается
Суммарное уравнение двух реакций:
1. Активирование аминокислоты – карбоксильная
группа аминокислоты присоединяется к α-фосфату
АТФ. Полученный нестабильный аминоациладенилат стабилизируется связываясь с ферментом
аминоацил-tРНК-синтетазой
аминокислота+ АТР→аминоацил-AMP +РР (пирофосфат)
2. Аминоацилирование – перенос аминоацильной
группы аминоацил-аденилата на 2’ или 3’-OH-группу
концевой рибозы tРНК
аминоацил-AMP + tРНК→аминоацил-tРНК + АМР
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. ТРАНСЛЯЦИЯ у про- и эукариот
Стадии
Характеристика
Рекогниция
образовании ковалентной связи между tРНК
и аминокислотой
Образование
инициаторного
комплекса
Met-tРНКMet объединяется с малой
субъединицей рибосомы в форме
комплекса: Met-tРНКMet, lF и ГТФ
Инициация
Узнавание инициаторного кодона,
присоединение большой субчастицы,
связывание аминоацил-tРНК в А-центре
рибосомы
Элонгация
Рост пептидной цепи, транспептидация,
образование дипептида, транслокация
Терминация
В А-центр рибосомы попадает один из стопкодонов: UAG, UAA или UGA,
трансляционный комплекс диссоциирует
: свободная рибосомная частица ассоциирует с
mРНК у начала ее кодирующей последовательности нуклеотидов и начинает
трансляцию на специальном иниициирующем кодоне, с участием
специальной иниицаторной tРНК
dnaN
ACATTATCCGTTAGGAGGATAAAA
(ДНК-зажим ДНК-полимеразы III)
gyrA
GTGATACTTCAGGGAGGTTTTTTA
(гираза А)
bofA
CAAGCGAAGGAGATGAGAAGATTC
(металлопротеиназа)
metS
ACATTCTGATTAGGAGGTTTCAAG
(метилтрансфераза)
В бактериях бывают
(Met) и
В эукариотах только
(Met)
У прокариот всегда начинается с
O
NH
C
H
CH
CH2
S
CH3
(Val)
:
O
R
C
CH
NH
У прокариот есть особая tРНК –
.
Она узнается метиониновой кодазой, соединяется с метионином.
После реакции аминоацилирования метионин формилируется специальными
ферментами, которые узнают эту особую форму tРНК.
У прокариот синтез N-формилметионил-tРНК протекает в две
стадии:
I cтадию
катализирует
метионил-tРНКсинтетаза.
Реакция нуждается в
доставке энергии
гидролиза АТФ.
1.блокирует участие NН2 -группы метионина в образовании
пептидной связи
2. обеспечивает синтез белка в направлении NH2 –> СООН
II стадию
катализирует
трансформилаза
ТДФК тетрагидрофолат,
донор
одноуглеродной
группы.
ДГФК -дигидрофолат
Рибосомы транслируют
mРНК со скоростью
приблизительно 12
аминокислот в секунду
В ходе синтеза белка прочтение информации mРНК идёт в направлении от
5'- к З'-концу, обеспечивая синтез пептида от N- к С-концу.
.
30S и 50S рибосомные субъединицы
показаны светлым и темным серым цветом
присоединяется к
рибосомной субъединице и
обеспечивает распад
рибосомы на субъединицы
связывается с A-сайтом 30S
рибосомной субъединицы и
служит инициатором
присоединения tRNA к
рибосомному P-сайту
блокируя A-сайт.
После распада
субъединиц, IF2, mRNA и
fMet-tRNAfMet
соединяются с 30S
рибосомной
субъединицей
У прокариот перед каждым геном и соответственно в mРНК
перед копией каждого гена имеется
SD
лидер
Она разного размера (до 160
нукл.), разной первичной
структуры и содержит
полипуриновую
последовательность
,
комплементарную 3'концевому участку
16S rРНК.
Комплементарными могут
быть 3-9 нуклеотидов.
dnaN
gyrA
serS
bofA
csfB
xpaC
metS
ACATTATCCGTTAGGAGGATAAAA
GTGATACTTCAGGGAGGTTTTTTA
TCAATAAAAAAAGGAGTGTTTCGC
CAAGCGAAGGAGATGAGAAGATTC
GCTAACTGTACGGAGGTGGAGAAG
ATAGACACAGGAGTCGATTATCTC
ACATTCTGATTAGGAGGTTTCAAG
Назначение комплементарного взаимодействия 3'-концевого
участка 16S rРНК и последовательности Шайна-Дальгарно .
Инициирующий кодон находится на растоянии 3-10 нукл. от
последовательности Шайна-Дальгарно.
Последовательность
Шайно-Дальгарно (ShineDalgamo -SD) mRNA
взаимодействует с anti-SD
последовательностью 16S
rRNA и инициирующий
кодон присоединяется в
Р-сайте рибосомы.
Инициирующие факторы,
особенно IF3,
способствуют этому
присоединению
К малой субъединице, на которой уже находится mРНК, подходит
формилметиониновая tРНК, соединенная с формилметионином.
В результате образуется
:
состояций из 30S рибосомной субъединицы, трех инициаторных
факторов, mRNA в стартовой позиции, где fMet-tRNAfMet связана
кодон независимо
Затем происходит ассоциация рибосомы. При этом изменяется
конформация 16S rРНК и нарушается связь между ней и
последовательностью Шайна-Дальгарно.
Аминоацильный конец формилметиониновой tРНК оказывается в
Р-центре. Второй кодон гена оказывается в Асп-центре.
Соответствующая ему аминоацил-tРНК устанавливается таким
образом, что ее аминоацильный конец попадает в А-центр
Пептидилтрансфераза отрывает формилметионин в Р-центре и
переносит его в А-центр (транспептидация).
Образуется пептидная связь между формилметионином и
аминоацил-tРНК.
Вслед за связыванием аа-тРНК с Аучастком рибосомы происходит
реакция транспептидации между этой
аа-тРНК (акцепторный субстрат) и
сидящей в Р-участке молекулой
пептидил-тРНК (донорный субстрат).
Реакция приводит к замещению
остатка тРНК в молекуле пептидил-тРНК
на остаток аминоацил-тРНК, так что
аминогруппа аминоацил-тРНК образует
пептидную связь с карбо-ксильной
группой пептидильного остатка
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Образование формил-метионил-tРНК (fmet-tРНК).
30 S + IF3 → диссоциация рибосомы
+ mРНК
Доставка fmet-tРНК к старт-кодону AUG (IF2/GTP → IF2/GDP)
Образование водородных связей между кодоном AUG и
антикодоном UAC (fmet-tРНК)
+IF1 (способствует реассоциации рибосомы)
+ 50 S → 70 S
Отсоединение факторов инициации (IF1,2,3)
fmet-tРНК находится в Р-участке рибосомы, А-участок свободен.
Рамка
считывания
устанавливается
благодаря
последовательности
(богатая пуринами 5-8нуклеотидная
последовательность,
комплементарная
полипиримидиновому участку 16S rРНК)
: затем рибосома считывает кодирующую
последовательность нуклеотидов по триплетам (кодонам) и соответственно
наращивает полипептидную цепь по одной аминокислоте, последовательно
удлиняя ее С-конец
EF-Tu и EF-Ts - белки связываются с рибосомой. Рибосома претерпевает
конформационные изменения и сдвигается на один кодон.
Формилметиониновая tРНК покидает рибосому. Второй кодон оказывается
напротив Р-центра. Сюда же переходит tРНК, несущая на хвосте дипептид. В
Асп-центр попадает третий кодон, а в А-центр очередная аминоацил-tРНК.
В Р-центре отрывается дипептид, переносится в А-центр и
соединяется с третьей аминоацил-tРНК
1. Образование следующего комплекса аминоацил-tРНК
2. Доставка аминоацил-tРНК в А-участок рибосомы
(Tu/GTP → Tu/GDP)
3. Образование пептидной связи между аминокислотами в
Р- и А-участках
4. Транслокация рибосомы на 1 кодон
(G/GTP → G/GDP)
5. Восстановление комплекса Tu/GTP:
Tu/GDP + Ts → Tu/Ts + GDP
Tu/Ts + GTP → Tu/GTP + Ts
: дойдя до терминирующего кодона, рибосома
прекращает трансляцию и освобождает законченную полипептидную цепь
белка. Рибосомные частицы диссоциируют от mРНК, снова готовы инициировать
трансляцию и войти в эпицикл.
Так продолжается до тех пор, пока в Асп-центр не приходит
терминирующий кодон. Полипептид отрывается в Р-центре,
переносится в А-центр и, т.к. присоединиться ему не к чему, он
отваливается от рибосомы. Рибосома диссоциирует и малая
субъединица сканирует mРНК.
Стоп-кодоны: UAA, UAG, UGA
Факторы терминации: RF1, RF2, RF3
RF1 распознает кодоны UAG и UAA
RF2 распознает кодоны UGA и UAA
RF3 облегчает работу других факторов, обладает GTP-азной
активностью.
Все синтезируемые
полипептиды прокариот на
N-конце несут
формилметионин.
• в 20% случаев он
отщепляется
• в 80% отщепляется только
формильная группа и на N
конце остается метионин
– это несколько рибосом,
одновременно транслирующих одну молекулу mРНК.
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. ТРАНСЛЯЦИЯ У ПРО- И ЭУКАРИОТ.
- кодирует строение только одной
полипептидной цепи
эукариотические mРНК узнаются эукариотическими
рибосомами по
точки
инициации трансляции - рибосомная частица сначала
присоединяется к 5'-концу mРНК, а затем движется вдоль
цепи mРНК и сканирует ее, пока не встретит инициирующий
кодон
40S субъединица рибосомы соединяется с eIF3, который препятствует ее
связыванию с 60S субъединицей, но стимулирует объединение с тройным
комплексом, включающим Мет-tРНКiМет, eIF-2 и ГТФ
фактор eIF2 обеспечивает взаимодействие рибосом с инициаторной Met-tРНК и
mРНК
Образуется прединициационный комплекс, содержащий mРНК, 40S субчастицу,
тройной комплексом Met-tРНК–eIF2–GTP и через фактор eIF3 взаимодействующую с
фактором eIF4G, который является частью многокомпонентного фактора eIF4F через
eIF4E, взаимодействующий с кэп-группой mРНК.
Кроме того, в состав этого комплекса входит фактор eIF1A. В таком виде
прединициационный комплекс способен перемещаться вдоль 5'UTR mРНК и
осуществлять поиск инициирующего AUG-кодона
В выборе AUG-кодона у эукариот участвует факторы eIF2 и eIF5. После локализации
инициирующего кодона 40S субъедниицей она объединяется с большой 60S
субъединицей рибосом при участии фактора eIF5, что приводит к образованию
полноценного инициационного комплекса
от комплекса ряда отделяются факторы инициации трансляции:
освобождается комплекс eIF2–GDP, eIF1A и eIF3.
В таком виде комплекс способен образовывать первую пептидную связь в
строящейся полипептидной цепи, т.е. инициировать синтез белка.
По завершении инициации рибосома располагается на mРНК таким образом, что в
Р-центре находится инициирующий кодон AUG с присоединённой к нему МетtРНКМет, а в А-центре - триплет, кодирующий включение первой аминокислоты
синтезируемого белка. Далее начинается самый продолжительный этап белкового
синтеза - элонгация
К рибосоме присоединяется фактор элонгации EF-2, за счёт энергии ГТФ продвигает
рибосому по mРНК на один кодон к 3'-концу. Пептидил-tРНК, не меняя своего
положения относительно mРНК, из А-центра перемещается в Р-центр. Свободная от
метионина tРНКiМет покидает рибосому, а в область А-центра попадает следующий
кодон
Пи терминации
трансляции в А-центр
попадает один из стопкодонов: UAG, UAA или
UGA.
К рибосоме
присоединяются 2 RF (от
англ, releasing factor)
или фактора
терминации.
Один из них с помощью
пептидилтрансферазного центра
катализирует
гидролитическое
отщепление
синтезированного
пептида от tРНК.
Другой за счёт энергии
гидролиза ГТФ вызывает
диссоциацию рибосомы
на субъединицы
 Рибосомы
70S (30S, 50S)
 Стартовая аминокислота fmet
 Факторы инициации
IF1, 2, 3
 Выбор
Последовательность
старт-кодона
Шайна-Дальгарно
 Факторы элонгации
EF1 (Tu), EF2 (Ts),
EF3 (G)
 Факторы терминации
RF1, RF2, RF3
 Локализация
Цитозоль
процесса в клетке
 Сопряженность
Идут одновременно
с транскрипцией
80S (40S, 60S)
met
eIF 1, 2, 3, 4A, 4B, 4C, 4Е, 5
КЭП (гипотеза
сканирования)
eEF1, eEF2
eRF1 (возможно, eRF2)
Цитозоль, мембраны
ЭПР, митохондрии
После транскрипции и
процессинга РНК