влияние 17 -эстрадиола на содержание циклических нуклеотидов и активность протеинкиназ а

експериментальні роботи
УДК 612.453-092.9:612.015.1:612.621.31
влияние 17b-эстрадиола на содержание
циклических нуклеотидов и активность протеинкиназ а
и с в коре надпочечных желез человека
Е. Н. ГРИНЧЕНКО, Е. И. КОВЗУН, А. С. МИКОША
Институт эндокринологии и обмена веществ им. В. П. Комиссаренко АМН Украины, Киев
e-mail: endo@i.kiev.ua
Исследовано влияние 17b-эстрадиола на уровень сАМР и сGMP, активность протеинкиназ А и
С, а также секрецию кортикостероидных гормонов в послеоперационной адренокортикальной ткани
человека. В условиях действия 17b-эстрадиола наблюдается накопление сАМР в адренокортикоцитах.
Под влиянием эстрадиола в опытах in vitro в микросомальных фракциях адренокортикальной ткани
обнаруживается повышение уровня активности протеинкиназ, а также значительное усиление стероидогенеза. Очевидно, что активация стероидогенеза 17b-эстрадиолом обусловлена сАМР-зависимой
сигнальной системой.
К л ю ч е в ы е с л о в а: эстрадиол, сАМР, сGMP, протеинкиназа А, протеинкиназа С, кора надпочечных желез.
В
последние годы внимание многих исследователей привлекают биологические
эффекты эстрогенов, не связанные непосредственно с размножением. Некоторые заболевания сердечно-сосудистой системы, костей, развитие опухолей связаны с эстрогенной
обеспеченностью организма и имеют четкую
зависимость от половой принадлежности.
До недавнего времени кору надпочечных
желез не относили к органам-мишеням эстрогенов, однако у приматов найдены рецепторы
эстрогенов в ткани коры надпочечников [1, 2].
Исследовалась роль эстрогенов и рецепторов
эстрогенов в регуляции роста клеток линии
H295R (адренокортикальная опухоль человека) [3]. Имеются данные о непосредственном
влиянии эстрогенов in vitro и in vivo на образование кортикостероидов [4–7]. Известно, что
под влиянием кортикотропина в ткани железы происходит накопление сАМР и активация
протеинкиназы А (ПКА) [8, 9], что обусловливает увеличение скорости лимитирующей
реакции стероидогенеза – отщепления боковой цепи холестерола. В последние годы при
анализе механизма воздействия 17b-эстрадиола на различные ткани (но не надпочечных
желез) изучаются геномные эффекты, а также
возможность использования данным эстрогеном сАМР-зависимой сигнальной системы
переноса сигналов [10, 11]. Большое внимание
исследователей привлекает протеинкиназа С
(ПКС), как один из важнейших ферментов,
участвующих в регуляции пролиферации и
88
онкогенеза, а также являющейся интегральной частью механизма передачи клеточного
сигнала, опо­средующего действие агонистов,
каждый из которых оказывает на ткань специфическое влияние. Изменения ее активности
лежат в основе патогенеза опухолей коры надпочечных желез [12–14]. Однако какого-нибудь
четкого предположения о механизмах переноса
сигнала и реализации эффектов эстрогенов в
адренокортикоцитах сделано не было.
В настоящей работе представлены результаты изучения влияния 17b-эстрадиола на
уровень циклических AMP и GMP, а также на
активность протеинкиназы А и протеинкиназы С в субклеточных фракциях коры надпочечных желез человека.
Материалы и методы
В исследованиях использовали постоперационные ткани надпочечных желез 16
больных, прооперированных в клинике Института эндокринологии. Работа была одобрена комитетом по биоэтике института. Из
очищенных участков визуально неизмененной
ткани коры надпочечных желез (условно нормальная ткань, УНТ), прилежащей к опухолям, готовили срезы. Помещали 200–250 мг
срезов в 1 мл питательной среды 199 («Государственный завод медицинских препаратов»,
Украина), содержащей дополнительно 10 мМ
HEPES, рН 7,4 («Calbiochem», США) и бычий
сывороточный альбумин («Serva», Германия) в
концентрации 2 мг/мл среды. В опытные про-
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 5
Е. Н. ГРИНЧЕНКО, Е. И. КОВЗУН, А. С. МИКОША
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 5
3-х мин для коагуляции белков, после чего
центрифугировали при 7000 g 5 мин и определяли уровень cAMP и cGMP в супернатанте,
используя для cAMP радиоиммунологический
набор TRK‑432 («Amersham», Великая Британия) и TRK-500 для cGMP. При статистической обработке данных применяли однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с
использованием F-критерия Фишера и t-критерий Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Показано, что инкубация срезов коры
надпочечных желез человека с 17b-эстрадиолом в концентрации 3,7×10-5–3,7×10-4 М вызывает достоверное повышение уровня 11-ОКС в
инкубационной среде (рис. 1). Данный эффект
17b-эстрадиола на ткани надпочечников человека подтверждает более ранние наблюдения
активации стероидогенеза in vivo и in vitro
эстрогенами в адренокортикальных клетках
крыс, новорожденных поросят и морских свинок [4, 7, 18].
Исходя из механизма активации стероидогенеза, мы изучили влияние 17b-эстрадиола
на содержание в ткани циклических нуклеотидов и активность протеинкиназ.
Исследования показали, что инкубация
срезов УНТ на протяжении 4-х часов в среде,
содержащей *3,7×10-5 М и 3,7×10-4 М эстрадиола,
8000
Ʉɨɧɰɟɧɬɪɚɰɢɹ 11-ɈɄɋ, ɧɦɨɥɶ/ɥ
Ʉɨɧɰɟɧɬɪɚɰɢɹ 11-ɈɄɋ, ɧɦɨɥɶ/ɥ
бы вносили спиртовый раствор 17b-эстрадиола
(«Koch-Light», Великая Британия) в конечной
концентрации 3,7×10-5–3,7×10-4 М, в контрольные пробы – соответствующий объем этанола.
Срезы инкубировали при 37 °С при непрерывном встряхивании. Время инкубации составляло 4 часа. Инкубацию останавливали, помещая пробы в лед. Среду инкубации сливали и
проводили количественное определение 11-оксикортикостероидов (11-ОКС) [15], используя
в качестве стандарта гидрокортизон. Срезы гомогенизировали в 2–3 объемах охлажденного
буфера, содержащего (мМ): сахарозы – 320,
трис-HCl – 25 (рН 7,4), MgCl2 – 3, ЭГТА – 2,
спермидина – 0,1, фенилметилсульфонил­
фторида – 0,1, тритона Х-100 – 0,1%. Центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин
осаждали дебрис, ядерную и митохондриальную фракции. Полученный супернатант снова
центрифугировали при 100 000 g 1 ч, получая
цитозольную (супернатант) и микросомную
фракции. Микросомы суспендировали в стеклянном гомогенизаторе в небольшом объеме
среды (100 мМ трис-HCl и 0,25 М сахарозы с
рН 7,4). Фракции хранили при – 60 °С. Концентрацию белка в пробах определяли по методу Bradford [16].
Для электрофореза в агарозном геле использовали агарозу марки Type-IV: Special High
8000раствор
EEO («Sigma», США). Готовили 1,6%-й
агарозы в 50 мМ трис-HCl-буфере (рН 8,0), на7000
гревая на водяной бане при 95 °С до полного
растворения агарозы. После охлаждения
6000 раст­
вор заливали в аппарат для горизонтального
5000
электрофореза. Заполимеризовавшийся
гель
заливали 50 мМ трис-HCl-буфером (рН 8,0),
4000
затем пробы с 80%-м глицеролом вносили
в
лунки. Электрофорез проводили при
100
V
в
3000
течение 20–30 минут.
Определяли активность ПКС в 2000
цитозольной и микросомной фракциях с использова1000
нием нейрогранина, а ПКА – с субстратом
кемптид (оба субстрата фирмы «Sigma»), как
0
описано ранее [17].
Активность ПКС и ПКА выражали в нмоль
фосфорилированного
субстрата×мин‑1×мг-1
белка.
Для определения уровня cAMP и cGMP
брали 100 мг срезов, проинкубированных как
описано выше. Инкубация продолжалась от
30 мин до 4 ч. После окончания инкубации
срезы гомогенизировали в буфере, содержащем
250 мМ сахарозы, 25 мМ трис-HCl (рН 7,4) и
4 мМ ЭДТА для торможения ферментативной деградации cAMP и cGMP фосфодиэстеразами. Гомогенат кипятили на протяжении
7000
*
6000
*
1
2
3
5000
4000
1
2
3
*
3000
2000
1000
0
Рис. 1. Концентрация 11-ОКС в среде инкубации срезов коры надпочечных желез человека в присутствии 17b-эстрадиола. * Влия­ние
17 b‑эстрадиола достоверно, р < 0,01 (n = 10):
1 – контроль, 2 – 3,7×10 -5 М 17 b-эстрадиола,
3 – 3,7×10 -4 М 17 b-эстрадиола.
89
експериментальні роботи
протеинкиназы А в микросомной фракции,
приводит к повышению содержания сАМР в
2,7 раза (от 7 пмоль на 100 мг ткани в контпричем при обеих концентрациях эстрогена
роле до 19 пмоль/100 мг, р < 0,05, в присутст­
(таблица). Сходное повышение активности
*
1000
вии большей концентрации
эстрадиола). При
протеинкиназы С в микросомной фракции
900гормона уровень
добавлении 3,7×10-5 М
сАМР
наблюдается после инкубации срезов в присут­
ɰȺɆ
Ɏ
800 мг ткани и не отлисоставляет 10 пмоль/100
ствии 3,7×10-4 М 17b-эстрадиола. В цитозольɰȽɆɎ
700величины. Содержание
чается от контрольной
ной фракции существенных изменений актив600 инкубации (рис. 2).
сАМР зависит от времени
ности протеинкиназ мы не отмечали. Ранее
% 500 отмечено после трех
Выраженное повышение
нами установлена активация протеинкиназ в
*
часов инкубации и 400
достигает максимальной
ткани коры надпочечников крыс in vivo при
300
степени в заключительный
момент, через чевведении эстрадиола [19]. Принимая во вни200
тыре часа. Дисперсионный
анализ данных
мание наличие эстрогенсвязывающих белков
показал достоверное 100
увеличение содержания
и рецепторов в коре надпочечных желез челосАМР в зависимости от
0 времени инкубации.
века [3, 20] и обобщая полученные нами данСодержание сGMP в срезах под влиянием
ные, можно сделать вывод о прямом влиянии
0
30
60 180 240
17b‑эстрадиола не изменяется (рис. 2).
17b‑эстрадиола на адренокортикоциты in vitro
ȼɪɟɦɹ, ɦɢɧ
Инкубация срезов УНТ надпочечников
и об участии сАМР-зависимой сигнальной
человека с эстрадиолом приводит к активации
системы в активации стероидогенеза эстрадиолом.
Сведения об определении ПКС в опухолевых новообразованиях надпочечных желез
1000
900
человека крайне немногочисленны. Особое
cAMP
ɰȺɆɎ
800
внимание исследователей привлекает участие
cGMP
ɰȽɆɎ
700
ПКС в переносе сигналов ряда агонистов, ре600
гулирующих процессы митоза и апоптоза [21].
% 500
Среди гормонов, определяющих скорость этих
400
процессов, важное место занимают эстрогены
300
[6, 22, 23]. Учитывая полученные нами дан200
ные можно допустить, что ПКС опосредует
100
0
плейотропный эффект 17b-эстрадиола в коре
надпочечников.
0
30
60
180
240
Обобщая представленные результаты и
Время,
мин
ȼɪɟɦɹ, ɦɢɧ
данные других исследований можно сделать
вывод, что активация стероидогенеза в коре
Рис. 2. Относительное содержание сАМР и
надпочечных желез эстрогенами in vitro, высGMP (%) в срезах коры надпочечных желез
-4
ражающаяся в значительном повышении секчеловека при инкубации с 3,7×10 М 17b-эстреции 11-ОКС, обусловлена cAMP-зависимой
радиола после 30, 60, 180 и 240 мин инкубации
сигнальной системой.
(p < 0,05; F-критерий Фишера, n = 5).
Влияние 17b-эстрадиола на активность протеинкиназы А и протеинкиназы С в субклеточных фракциях коры надпочечников человека (M ± m, n = 5)
Концентрация
17b-эстрадиола, М
0
3,7×10
-5
3,7×10-4
ПКА, нмоль×мг-1×мин-1
Цитозольная
фракция
ПКС, нмоль×мг-1×мин-1
Микросомная
фракция
Цитозольная
фракция
Микросомная
фракция
6,81 ± 1,24
11,78 ± 1,55
8,64 ± 1,77
9,90 ± 0,68
7,62 ± 0,87
14,80 ± 1,53*
8,04 ± 0,18
11,68 ± 1,07
9,11 ± 2,1
17,87 ± 1,31*
11,18 ± 0,73
15,10 ± 1,31*
* Влияние 17b-эстрадиола достоверно, р < 0,05.
90
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 5
Е. Н. ГРИНЧЕНКО, Е. И. КОВЗУН, А. С. МИКОША
вплив 17b-естрадіолу на вміст
циклічних нуклеотидів та
активність протеїнкіназ а
і с у корі надниркових залоз
людини
Є. М. Грінченко, О. І. Ковзун,
О. С. Микоша
Інститут ендокринології та обміну речовин
ім. В. П. Комісаренка АМН України, Київ;
e-mail: endo@i.kiev.ua
На
післяопераційній
адренокортикальній тканині людини досліджено вплив
17b‑естрадіолу на рівень сАМР та сGMP, активність протеїнкіназ А та С, а також на секрецію кортикостероїдних гормонів. За дії
17b‑естрадіолу спостерігається накопичення сАМР в адренокортикоцитах. Виявлено
підвищення рівня активності протеїнкіназ під
впливом естрадіолу in vitro в мікросомальних
фракціях адренокортикальної тканини. Спостерігається значне посилення стероїдогенезу.
Дійшли висновку, що активація стероїдогенезу
17b-естрадіолом обумовлена сАМР-залежною
сигнальною системою.
К л ю ч о в і с л о в а: естрадіол, сАМР,
сGMP, протеїнкіназа А, протеїнкіназа С, кора
надниркових залоз.
EFFECT OF 17b-ESTRADIOL
ON CONTENT OF CYCLIC
NUCLEOTIDES AND
PROTEIN KINASES A AND C ACTIVITY
IN HUMAN ADRENAL CORTEX
E. M. Grinchenko, O. I. Kovzun,
O. S. Mikosha
Komissarenko Institute of Endocrinology
& Metabolism, Academy of Medical
Sciences of Ukraine, Kyiv;
e-mail: endo@i.kiev.ua
Summary
The influence of 17b-estradiol on cAMP and
cGMP levels, protein kinases A and C activity and
corticosteroids secretion was investigated in postoperative human adrenal cortex tissue. cAMP accumulation in adrenocorticocytes increased under
the influence of 17b-estradiol. In vitro estradiol
raised the activities of protein kinases A and C in
membrane fraction of adrenal cortex tissue. Significant increasing of steroidogenesis was observed.
These data support our conclusion that cAMP de-
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 5
pendent signaling system is involved in activation
of steroidogenesis by 17b-estradiol.
K e y w o r d s: estradiol, сАМР, сGMP, protein kinase А, protein kinase С, adrenal cortex.
1. Hirst J. J., West N. B., Brenner R. M., Novy M. J.
// J. Clin. Endocrinol. Metab. – 1992. – 75. –
P. 308–314.
2. Albrecht E. D., Babischkin J. S., Davies W. A.
et al. // Endocrinology. – 1999. – 140, N 12 –
P. 5953–5961.
3. Montanaro D., Maggiolini M., Recchia A. G.
et al. // J. Mol. Endocrinol. – 2005. – 35. –
P. 245–256.
4. Юдаев Н. А., Микоша А. С. // Биохимия. –
1963. – 28, N 3. – С. 462–466.
5. Nowak K. W., Neri G., Nussdorfer G. G.,
Malendowicz L. K. // Life Sci. – 1995. – 57,
N 9. – P. 833–837.
6. Ковзун О. І., Челнакова І. С., Микоша О. С.
/ VII Український біохім. з’їзд. Вересень
1997. Київ. Тези доповідей. К., 1997. –
Ч. II. – С. 176.
7. Микоша А. С., Ковзун Е. И., Гринченко Е. Н.
// Укр. біохім. журн. – 2003. – 75, № 1. –
С. 29–32.
8. Vinson G., Whitehouse B., Hinson J. The
adrenal cortex. Englewood Cliff: Prentice Hall.
1992. – 316 p.
9. Микоша А. С., Тронько Н. Д. // Успехи
современной биологии. – 2004. – 124,
№ 4. – С. 362–370.
10. Aronica S. M., Kraus W. L., Katzenellenbogen B. S.
// Proc. Natl. Acad. Sci. – 1994. – 91. –
P. 8517–8521.
11. Rosner W., Hryb D. J., Khan M. S. et al. //
Steroids. – 1999. – 64. – P. 100–106.
12. Cozza E. N., del Carmen Vila M., AcevedoDuncan M. et. al. // J. Steroid Biochem. –
1990. – 35, N 2. – P. 343 – 351.
13. Lehoux J. G., Grondin F., Pacuraru J. P.,
Yachaoui Y. // Mol. Cell. Endocrinol. – 1991. –
78, N 1–2. – P. 97–106.
14. Arola J., Hiekkila P., Voutilainen R., Kahri A. I.
// J. Endocrinol. – 1994. – 141. – P. 285 –
293.
15. Балашов Ю. Г. // Физиол. журн. СССР. –
1990. – 76, N 2. – С. 280–283.
16. Bradford M. M. // Anal. Biochem. – 1976. –
72, N 1–2. – P. 248–254.
17. Пушкарьов В. М., Ковзун О. І., Тронько М. Д.
та ін. // Укр. біохім. журн. – 2005. – 77,
№ 1. – С. 65–71.
91
експериментальні роботи
18. Ковзун О. І., Грінченко Є. М., Микоша О. С.
// Клін. та експерим. патол. – 2004. – 3,
№2. Ч. 1. – С. 137–139.
19. Гринченко Е. Н. // Матеріали ІХ Українського
біохімічного з’їзду. 24–27 жовтня 2006 р.
Харків. – 2. – C. 44.
20. Nakao M., Sato B., Koga M. et al. // J. Steroid.
Biochem. – 1986. – 25, N 1. – P. 1–9.
21. Mazzocchi G., Rossi G. P., Rebuffat P. et al. //
Endocrinology. – 1997. – 138, N 6. – P. 2333–
2337.
22. Морозова Т. М., Митина Р. Л., Ожогина З. Б.,
Сидоркина О. М. // Биохимия. – 1986. – 51,
N 10. – С. 1624–1629.
23. Keshamouni V. G., Mattingly R. R., Reddy K. B.
// J. Biol. Chem. – 2002. – 277. – P. 22558–
22565.
Получено 11.04.2006
92
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 5