експериментальні роботи УДК 612.453-092.9:612.015.1:612.621.31 влияние 17b-эстрадиола на содержание циклических нуклеотидов и активность протеинкиназ а и с в коре надпочечных желез человека Е. Н. ГРИНЧЕНКО, Е. И. КОВЗУН, А. С. МИКОША Институт эндокринологии и обмена веществ им. В. П. Комиссаренко АМН Украины, Киев e-mail: [email protected] Исследовано влияние 17b-эстрадиола на уровень сАМР и сGMP, активность протеинкиназ А и С, а также секрецию кортикостероидных гормонов в послеоперационной адренокортикальной ткани человека. В условиях действия 17b-эстрадиола наблюдается накопление сАМР в адренокортикоцитах. Под влиянием эстрадиола в опытах in vitro в микросомальных фракциях адренокортикальной ткани обнаруживается повышение уровня активности протеинкиназ, а также значительное усиление стероидогенеза. Очевидно, что активация стероидогенеза 17b-эстрадиолом обусловлена сАМР-зависимой сигнальной системой. К л ю ч е в ы е с л о в а: эстрадиол, сАМР, сGMP, протеинкиназа А, протеинкиназа С, кора надпочечных желез. В последние годы внимание многих исследователей привлекают биологические эффекты эстрогенов, не связанные непосредственно с размножением. Некоторые заболевания сердечно-сосудистой системы, костей, развитие опухолей связаны с эстрогенной обеспеченностью организма и имеют четкую зависимость от половой принадлежности. До недавнего времени кору надпочечных желез не относили к органам-мишеням эстрогенов, однако у приматов найдены рецепторы эстрогенов в ткани коры надпочечников [1, 2]. Исследовалась роль эстрогенов и рецепторов эстрогенов в регуляции роста клеток линии H295R (адренокортикальная опухоль человека) [3]. Имеются данные о непосредственном влиянии эстрогенов in vitro и in vivo на образование кортикостероидов [4–7]. Известно, что под влиянием кортикотропина в ткани железы происходит накопление сАМР и активация протеинкиназы А (ПКА) [8, 9], что обусловливает увеличение скорости лимитирующей реакции стероидогенеза – отщепления боковой цепи холестерола. В последние годы при анализе механизма воздействия 17b-эстрадиола на различные ткани (но не надпочечных желез) изучаются геномные эффекты, а также возможность использования данным эстрогеном сАМР-зависимой сигнальной системы переноса сигналов [10, 11]. Большое внимание исследователей привлекает протеинкиназа С (ПКС), как один из важнейших ферментов, участвующих в регуляции пролиферации и 88 онкогенеза, а также являющейся интегральной частью механизма передачи клеточного сигнала, опо­средующего действие агонистов, каждый из которых оказывает на ткань специфическое влияние. Изменения ее активности лежат в основе патогенеза опухолей коры надпочечных желез [12–14]. Однако какого-нибудь четкого предположения о механизмах переноса сигнала и реализации эффектов эстрогенов в адренокортикоцитах сделано не было. В настоящей работе представлены результаты изучения влияния 17b-эстрадиола на уровень циклических AMP и GMP, а также на активность протеинкиназы А и протеинкиназы С в субклеточных фракциях коры надпочечных желез человека. Материалы и методы В исследованиях использовали постоперационные ткани надпочечных желез 16 больных, прооперированных в клинике Института эндокринологии. Работа была одобрена комитетом по биоэтике института. Из очищенных участков визуально неизмененной ткани коры надпочечных желез (условно нормальная ткань, УНТ), прилежащей к опухолям, готовили срезы. Помещали 200–250 мг срезов в 1 мл питательной среды 199 («Государственный завод медицинских препаратов», Украина), содержащей дополнительно 10 мМ HEPES, рН 7,4 («Calbiochem», США) и бычий сывороточный альбумин («Serva», Германия) в концентрации 2 мг/мл среды. В опытные про- ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 5 Е. Н. ГРИНЧЕНКО, Е. И. КОВЗУН, А. С. МИКОША ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 5 3-х мин для коагуляции белков, после чего центрифугировали при 7000 g 5 мин и определяли уровень cAMP и cGMP в супернатанте, используя для cAMP радиоиммунологический набор TRK‑432 («Amersham», Великая Британия) и TRK-500 для cGMP. При статистической обработке данных применяли однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с использованием F-критерия Фишера и t-критерий Стьюдента. Результаты и обсуждение Показано, что инкубация срезов коры надпочечных желез человека с 17b-эстрадиолом в концентрации 3,7×10-5–3,7×10-4 М вызывает достоверное повышение уровня 11-ОКС в инкубационной среде (рис. 1). Данный эффект 17b-эстрадиола на ткани надпочечников человека подтверждает более ранние наблюдения активации стероидогенеза in vivo и in vitro эстрогенами в адренокортикальных клетках крыс, новорожденных поросят и морских свинок [4, 7, 18]. Исходя из механизма активации стероидогенеза, мы изучили влияние 17b-эстрадиола на содержание в ткани циклических нуклеотидов и активность протеинкиназ. Исследования показали, что инкубация срезов УНТ на протяжении 4-х часов в среде, содержащей *3,7×10-5 М и 3,7×10-4 М эстрадиола, 8000 Ʉɨɧɰɟɧɬɪɚɰɢɹ 11-ɈɄɋ, ɧɦɨɥɶ/ɥ Ʉɨɧɰɟɧɬɪɚɰɢɹ 11-ɈɄɋ, ɧɦɨɥɶ/ɥ бы вносили спиртовый раствор 17b-эстрадиола («Koch-Light», Великая Британия) в конечной концентрации 3,7×10-5–3,7×10-4 М, в контрольные пробы – соответствующий объем этанола. Срезы инкубировали при 37 °С при непрерывном встряхивании. Время инкубации составляло 4 часа. Инкубацию останавливали, помещая пробы в лед. Среду инкубации сливали и проводили количественное определение 11-оксикортикостероидов (11-ОКС) [15], используя в качестве стандарта гидрокортизон. Срезы гомогенизировали в 2–3 объемах охлажденного буфера, содержащего (мМ): сахарозы – 320, трис-HCl – 25 (рН 7,4), MgCl2 – 3, ЭГТА – 2, спермидина – 0,1, фенилметилсульфонил­ фторида – 0,1, тритона Х-100 – 0,1%. Центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин осаждали дебрис, ядерную и митохондриальную фракции. Полученный супернатант снова центрифугировали при 100 000 g 1 ч, получая цитозольную (супернатант) и микросомную фракции. Микросомы суспендировали в стеклянном гомогенизаторе в небольшом объеме среды (100 мМ трис-HCl и 0,25 М сахарозы с рН 7,4). Фракции хранили при – 60 °С. Концентрацию белка в пробах определяли по методу Bradford [16]. Для электрофореза в агарозном геле использовали агарозу марки Type-IV: Special High 8000раствор EEO («Sigma», США). Готовили 1,6%-й агарозы в 50 мМ трис-HCl-буфере (рН 8,0), на7000 гревая на водяной бане при 95 °С до полного растворения агарозы. После охлаждения 6000 раст­ вор заливали в аппарат для горизонтального 5000 электрофореза. Заполимеризовавшийся гель заливали 50 мМ трис-HCl-буфером (рН 8,0), 4000 затем пробы с 80%-м глицеролом вносили в лунки. Электрофорез проводили при 100 V в 3000 течение 20–30 минут. Определяли активность ПКС в 2000 цитозольной и микросомной фракциях с использова1000 нием нейрогранина, а ПКА – с субстратом кемптид (оба субстрата фирмы «Sigma»), как 0 описано ранее [17]. Активность ПКС и ПКА выражали в нмоль фосфорилированного субстрата×мин‑1×мг-1 белка. Для определения уровня cAMP и cGMP брали 100 мг срезов, проинкубированных как описано выше. Инкубация продолжалась от 30 мин до 4 ч. После окончания инкубации срезы гомогенизировали в буфере, содержащем 250 мМ сахарозы, 25 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 4 мМ ЭДТА для торможения ферментативной деградации cAMP и cGMP фосфодиэстеразами. Гомогенат кипятили на протяжении 7000 * 6000 * 1 2 3 5000 4000 1 2 3 * 3000 2000 1000 0 Рис. 1. Концентрация 11-ОКС в среде инкубации срезов коры надпочечных желез человека в присутствии 17b-эстрадиола. * Влия­ние 17 b‑эстрадиола достоверно, р < 0,01 (n = 10): 1 – контроль, 2 – 3,7×10 -5 М 17 b-эстрадиола, 3 – 3,7×10 -4 М 17 b-эстрадиола. 89 експериментальні роботи протеинкиназы А в микросомной фракции, приводит к повышению содержания сАМР в 2,7 раза (от 7 пмоль на 100 мг ткани в контпричем при обеих концентрациях эстрогена роле до 19 пмоль/100 мг, р < 0,05, в присутст­ (таблица). Сходное повышение активности * 1000 вии большей концентрации эстрадиола). При протеинкиназы С в микросомной фракции 900гормона уровень добавлении 3,7×10-5 М сАМР наблюдается после инкубации срезов в присут­ ɰȺɆ Ɏ 800 мг ткани и не отлисоставляет 10 пмоль/100 ствии 3,7×10-4 М 17b-эстрадиола. В цитозольɰȽɆɎ 700величины. Содержание чается от контрольной ной фракции существенных изменений актив600 инкубации (рис. 2). сАМР зависит от времени ности протеинкиназ мы не отмечали. Ранее % 500 отмечено после трех Выраженное повышение нами установлена активация протеинкиназ в * часов инкубации и 400 достигает максимальной ткани коры надпочечников крыс in vivo при 300 степени в заключительный момент, через чевведении эстрадиола [19]. Принимая во вни200 тыре часа. Дисперсионный анализ данных мание наличие эстрогенсвязывающих белков показал достоверное 100 увеличение содержания и рецепторов в коре надпочечных желез челосАМР в зависимости от 0 времени инкубации. века [3, 20] и обобщая полученные нами данСодержание сGMP в срезах под влиянием ные, можно сделать вывод о прямом влиянии 0 30 60 180 240 17b‑эстрадиола не изменяется (рис. 2). 17b‑эстрадиола на адренокортикоциты in vitro ȼɪɟɦɹ, ɦɢɧ Инкубация срезов УНТ надпочечников и об участии сАМР-зависимой сигнальной человека с эстрадиолом приводит к активации системы в активации стероидогенеза эстрадиолом. Сведения об определении ПКС в опухолевых новообразованиях надпочечных желез 1000 900 человека крайне немногочисленны. Особое cAMP ɰȺɆɎ 800 внимание исследователей привлекает участие cGMP ɰȽɆɎ 700 ПКС в переносе сигналов ряда агонистов, ре600 гулирующих процессы митоза и апоптоза [21]. % 500 Среди гормонов, определяющих скорость этих 400 процессов, важное место занимают эстрогены 300 [6, 22, 23]. Учитывая полученные нами дан200 ные можно допустить, что ПКС опосредует 100 0 плейотропный эффект 17b-эстрадиола в коре надпочечников. 0 30 60 180 240 Обобщая представленные результаты и Время, мин ȼɪɟɦɹ, ɦɢɧ данные других исследований можно сделать вывод, что активация стероидогенеза в коре Рис. 2. Относительное содержание сАМР и надпочечных желез эстрогенами in vitro, высGMP (%) в срезах коры надпочечных желез -4 ражающаяся в значительном повышении секчеловека при инкубации с 3,7×10 М 17b-эстреции 11-ОКС, обусловлена cAMP-зависимой радиола после 30, 60, 180 и 240 мин инкубации сигнальной системой. (p < 0,05; F-критерий Фишера, n = 5). Влияние 17b-эстрадиола на активность протеинкиназы А и протеинкиназы С в субклеточных фракциях коры надпочечников человека (M ± m, n = 5) Концентрация 17b-эстрадиола, М 0 3,7×10 -5 3,7×10-4 ПКА, нмоль×мг-1×мин-1 Цитозольная фракция ПКС, нмоль×мг-1×мин-1 Микросомная фракция Цитозольная фракция Микросомная фракция 6,81 ± 1,24 11,78 ± 1,55 8,64 ± 1,77 9,90 ± 0,68 7,62 ± 0,87 14,80 ± 1,53* 8,04 ± 0,18 11,68 ± 1,07 9,11 ± 2,1 17,87 ± 1,31* 11,18 ± 0,73 15,10 ± 1,31* * Влияние 17b-эстрадиола достоверно, р < 0,05. 90 ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 5 Е. Н. ГРИНЧЕНКО, Е. И. КОВЗУН, А. С. МИКОША вплив 17b-естрадіолу на вміст циклічних нуклеотидів та активність протеїнкіназ а і с у корі надниркових залоз людини Є. М. Грінченко, О. І. Ковзун, О. С. Микоша Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В. П. Комісаренка АМН України, Київ; e-mail: [email protected] На післяопераційній адренокортикальній тканині людини досліджено вплив 17b‑естрадіолу на рівень сАМР та сGMP, активність протеїнкіназ А та С, а також на секрецію кортикостероїдних гормонів. За дії 17b‑естрадіолу спостерігається накопичення сАМР в адренокортикоцитах. Виявлено підвищення рівня активності протеїнкіназ під впливом естрадіолу in vitro в мікросомальних фракціях адренокортикальної тканини. Спостерігається значне посилення стероїдогенезу. Дійшли висновку, що активація стероїдогенезу 17b-естрадіолом обумовлена сАМР-залежною сигнальною системою. К л ю ч о в і с л о в а: естрадіол, сАМР, сGMP, протеїнкіназа А, протеїнкіназа С, кора надниркових залоз. EFFECT OF 17b-ESTRADIOL ON CONTENT OF CYCLIC NUCLEOTIDES AND PROTEIN KINASES A AND C ACTIVITY IN HUMAN ADRENAL CORTEX E. M. Grinchenko, O. I. Kovzun, O. S. Mikosha Komissarenko Institute of Endocrinology & Metabolism, Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv; e-mail: [email protected] Summary The influence of 17b-estradiol on cAMP and cGMP levels, protein kinases A and C activity and corticosteroids secretion was investigated in postoperative human adrenal cortex tissue. cAMP accumulation in adrenocorticocytes increased under the influence of 17b-estradiol. In vitro estradiol raised the activities of protein kinases A and C in membrane fraction of adrenal cortex tissue. Significant increasing of steroidogenesis was observed. These data support our conclusion that cAMP de- ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 5 pendent signaling system is involved in activation of steroidogenesis by 17b-estradiol. K e y w o r d s: estradiol, сАМР, сGMP, protein kinase А, protein kinase С, adrenal cortex. 1. Hirst J. J., West N. B., Brenner R. M., Novy M. J. // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 1992. – 75. – P. 308–314. 2. Albrecht E. D., Babischkin J. S., Davies W. A. et al. // Endocrinology. – 1999. – 140, N 12 – P. 5953–5961. 3. Montanaro D., Maggiolini M., Recchia A. G. et al. // J. Mol. Endocrinol. – 2005. – 35. – P. 245–256. 4. Юдаев Н. А., Микоша А. С. // Биохимия. – 1963. – 28, N 3. – С. 462–466. 5. Nowak K. W., Neri G., Nussdorfer G. G., Malendowicz L. K. // Life Sci. – 1995. – 57, N 9. – P. 833–837. 6. Ковзун О. І., Челнакова І. С., Микоша О. С. / VII Український біохім. з’їзд. Вересень 1997. Київ. Тези доповідей. К., 1997. – Ч. II. – С. 176. 7. Микоша А. С., Ковзун Е. И., Гринченко Е. Н. // Укр. біохім. журн. – 2003. – 75, № 1. – С. 29–32. 8. Vinson G., Whitehouse B., Hinson J. The adrenal cortex. Englewood Cliff: Prentice Hall. 1992. – 316 p. 9. Микоша А. С., Тронько Н. Д. // Успехи современной биологии. – 2004. – 124, № 4. – С. 362–370. 10. Aronica S. M., Kraus W. L., Katzenellenbogen B. S. // Proc. Natl. Acad. Sci. – 1994. – 91. – P. 8517–8521. 11. Rosner W., Hryb D. J., Khan M. S. et al. // Steroids. – 1999. – 64. – P. 100–106. 12. Cozza E. N., del Carmen Vila M., AcevedoDuncan M. et. al. // J. Steroid Biochem. – 1990. – 35, N 2. – P. 343 – 351. 13. Lehoux J. G., Grondin F., Pacuraru J. P., Yachaoui Y. // Mol. Cell. Endocrinol. – 1991. – 78, N 1–2. – P. 97–106. 14. Arola J., Hiekkila P., Voutilainen R., Kahri A. I. // J. Endocrinol. – 1994. – 141. – P. 285 – 293. 15. Балашов Ю. Г. // Физиол. журн. СССР. – 1990. – 76, N 2. – С. 280–283. 16. Bradford M. M. // Anal. Biochem. – 1976. – 72, N 1–2. – P. 248–254. 17. Пушкарьов В. М., Ковзун О. І., Тронько М. Д. та ін. // Укр. біохім. журн. – 2005. – 77, № 1. – С. 65–71. 91 експериментальні роботи 18. Ковзун О. І., Грінченко Є. М., Микоша О. С. // Клін. та експерим. патол. – 2004. – 3, №2. Ч. 1. – С. 137–139. 19. Гринченко Е. Н. // Матеріали ІХ Українського біохімічного з’їзду. 24–27 жовтня 2006 р. Харків. – 2. – C. 44. 20. Nakao M., Sato B., Koga M. et al. // J. Steroid. Biochem. – 1986. – 25, N 1. – P. 1–9. 21. Mazzocchi G., Rossi G. P., Rebuffat P. et al. // Endocrinology. – 1997. – 138, N 6. – P. 2333– 2337. 22. Морозова Т. М., Митина Р. Л., Ожогина З. Б., Сидоркина О. М. // Биохимия. – 1986. – 51, N 10. – С. 1624–1629. 23. Keshamouni V. G., Mattingly R. R., Reddy K. B. // J. Biol. Chem. – 2002. – 277. – P. 22558– 22565. Получено 11.04.2006 92 ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 5