генетический контроль гомеостаза ионов кальция у дрожжей
реклама
На правах рукописи Фокина Анастасия Владимировна ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ГОМЕОСТАЗА ИОНОВ КАЛЬЦИЯ У ДРОЖЖЕЙ РОДА OGATAEA 03.01.03 – молекулярная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2012 2 Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук и в лаборатории молекулярной генетики Института экспериментальной кардиологии Федерального государственного учреждения «Российский кардиологический научнопроизводственный комплекс» Министерства здравоохранения и социального развития Российской федерации. Научный руководитель: кандидат биологических наук Агафонов Михаил Олегович Официальные оппоненты: Северин Федор Федорович, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования “Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова”, Научноисследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, заведующий лабораторией молекулярной биологии дрожжей. Эльдаров Михаил Анатольевич, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр "Биоинженерия" Российской академии наук, ведущий научный сотрудник, руководитель группы гетерологичной экспрессии. Ведущая организация: Кафедра генетики и биотехнологии Биолого-почвенного факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет». Защита состоится «15» ноября 2012 в 11.00 часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119234 Россия, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, ауд 389. С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций). Автореферат разослан «___» октября 2012. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Крашенинников И.А. 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Кальций принимает участие и в координации работы клеточных систем, являясь вторичным мессенджером при прохождении сигнала, и в функционировании секреторных органелл. При этом нарушение функционирования секреторного пути может приводить как к нарушению гомеостаза ионов кальция, так и вызывать определенные клеточные ответы, зависящие от кальция-мессенджера Дрожжи являются традиционным модельным объектом для изучения процессов, протекающих в эукариотической клетке. Однако поддержание гомеостаза кальция в клетках дрожжей имеет свои особенности. В частности, в отличие от животной клетки, в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) дрожжей нет помпы, осуществляющей транспорт Са2+ в этот компартмент. Основным депо Ca2+ в дрожжевой клетке является вакуоль, куда кальций откачивается из цитоплазмы за счет функционирования АТФ-азы Pmc1p (рис. 1). Мембраны аппарата Гольджи содержат другую АТФ-азу, Pmr1p, переносящую в люмен органеллы Рис. 1. Схема взаимодействия внутриклеточных компартментов, участвующих в поддержании баланса Ca2+ у дрожжей. Черными стрелками показано направление прямого транспорта, осуществляемого с помощью везикул, розовыми стрелками — направление обратного транспорта. Белок αCOP участвует в транспорте из аппарата Гольджи в ЭР, и в транспорте из эндосом (направление транспорта не известно), Ypt6p участвует в транспорте из эндосом в аппарат Гольджи и из аппарата Гольджи в ЭР. Синие стрелки отражают транспорт Ca2+через мембраны: канал Cch1p/Mid1p переносит Ca2+ через плазматическую мембрану в цитоплазму, АТФ-аза Pmc1p — из цитоплазмы в вакуоль, а АТФ-аза Pmr1p — из цитоплазмы в полость аппарата Гольджи. 4 кальций и марганец — два иона, необходимые для процессов гликозилирования и сортинга белков, протекающих в этой органелле. Считается, что аппарат Гольджи является основным источником ионов кальция для ЭР дрожжей, однако при нарушении гена PMR1 полностью блокируются Са2+-зависимые процессы в аппарате Гольджи, но концентрация Са2+ в ЭР поддерживается на достаточном для жизни уровне. Это указывает на существование дополнительного источника Са2+ для ЭР. Однако ни этот источник, ни путь, по которому кальций попадает в ЭР, до сих пор не известны. Настоящая работа направлена на изучение механизма доставки и определение источников ионов кальция для эндоплазматического ретикулума дрожжей. Некоторые функции ионов кальция являются тесно связанными с гомеостазом ионов марганца. В этой связи часть работы посвящена изучению пересечений функций этих ионов в клетках дрожжей. Среди дрожжей наиболее традиционным объектом для изучения гомеостаза ионов кальция являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae, однако для решения поставленных задач в качестве модели были выбраны дрожжи Ogataea polymorpha и O. parapolymorpha, что было связано с наличием выраженных проявлений мутаций, нарушающих гомеостаз ионов кальция у этих видов. В частности, мутация ret1-27, которая нарушает С-концевой домен белка α-COP (компонента окаймляющего комплекса COPI, участвующего в ретроградном везикулярном транспорте) приводит к нарушению гомеостаза Са2+, а инактивация гена PMR1 в штамме с делецией С-концевого домена α-СОР приводит к тому, что клетки способны расти только при увеличенной концентрации Са2+ в среде. Это указывает на участие, по крайней мере, некоторых компонентов комплекса COPI в транспорте Са2+ в ЭР из независимого от Pmr1p источника. И дрожжи рода Ogataea, и S. cerevisiae при нарушении гена вакуолярной кальциевой АТФ-азы PMC1 не способны расти на среде с высокой концентрации Ca2+, однако, в отличие от S. cerevisiae, мутанты pmc1∆ дрожжей рода Ogataea чувствительны к присутствию в среде додецилсульфата натрия (SDS). О механизме действия SDS ничего не известно. Изученные в работе мутанты проявляли чувствительность к SDS в концентрации 0,001-0,008%, что намного ниже критической концентрации мицеллообразования (ККМ = 8,2 мМ = 0,24%), а значит причина чувствительности дрожжей к SDS не должна быть связана со свойствами этого вещества как детергента. Поэтому возникал вопрос, связана ли чувствительность мутанта pmc1∆ к SDS с повышением концентрации Ca2+ в цитозоле, или у Pmc1p дрожжей рода Ogataea существует еще какая-то неизвестная функция? Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение механизма доставки ионов кальция в эндоплазматический ретикулум, а также роли кальция и марганца в жизненно важных процессах у дрожжей рода Ogataea. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 5 1). Провести поиск генов, мутации которых супрессируют чувствительность штамма pmc1∆ к SDS. 2). Изучить влияние мутаций, нарушающих гомеостаз кальция (pmr1∆, ret1-27 и pmc1∆), на жизнеспособность дрожжей рода Ogataea в разных условиях. 3). Исследовать взаимодействие мутаций, нарушающих гомеостаз Ca2+ у дрожжей рода Ogataea. 4). Изучить влияние мутаций, вызывающих нарушения гомеостаза Ca2+, на чувствительность дрожжей рода Ogataea к высокой и низкой концентрации Mn2+. Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые были исследованы проявления нарушений генов PMC1 и PMR1 у дрожжей рода Ogataea. В частности, впервые было показано влияние нарушения гена PMR1 на жизнеспособность дрожжей в различных условиях, а также различие механизмов гибели клеток с нарушением генов PMR1, RET1 и PMC1. Были идентифицированы гены, нарушение которых приводит к супрессии чувствительности к SDS у мутанта pmc1∆ O. polymorpha. Впервые было показано, что у O. polymorpha нарушение гена PMC1 приводит к нарушению регуляции клеточного цикла при переходе от фазы G2 к M. В работе изучены совместные проявления различных мутаций, нарушающих гомеостаз Ca2+. При этом впервые было показано, что влияние мутации ypt6∆ на проявления pmr1∆ сходно с влиянием мутации ret1-27, и выражается в усилении зависимости мутанта от содержания ионов Ca2+ в среде. Также впервые показано, что нарушение гена CCH1 усиливает проявления мутаций pmr1∆ и ret1-27, а мутации pmc1∆ и ret1-27 проявляются независимо как в условиях нехватки, так и избытка Ca2+. При этом нарушение гена PMC1 усиливает влияние мутации ret1-27 на процессирование гетерологичного белка uPA-Q302, продуцируемого дрожжами O. polymorpha. Вместе эти результаты позволяют выдвинуть гипотезу, согласно которой везикулярный транспорт осуществляет доставку ионов кальция в эндоплазматический ретикулум дрожжей, а в качестве источника ионов кальция для ЭР, помимо аппарата Гольджи помимо аппарата Гольджи, могут выступать эндосомы. В работе также изучено влияние содержания в среде ионов марганца на рост дрожжей с мутациями pmr1∆, pmc1∆, ret1-27, ypt6∆ и cch1∆, и впервые показано, что продукты генов RET1, YPT6, CCH1 и PMC1 вовлечены в гомеостаз Mn2+ в клетке. Дрожжи рода Ogataea используются в биотехнологии для получения штаммовпродуцентов рекомбинантных белков. Одним из ограничений такого применения часто оказывается неспособность дрожжей эффективно секретировать некоторые чужеродные белки. Поскольку Са2+ и Mn2+ необходимы для нормального функционирования секреторного пути, 6 полученные в работе результаты могут быть использованы при разработке подходов для оптимизации процесса секреции рекомбинантных белков. Апробация работы. Результаты работы были доложены на межлабораторных семинарах Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН (21.06.2012) и Института экспериментальной кардиологии ФГУ «РКНПК» (27.09.2012), а также были представлены на 4-ой международной конференции “Hansenula polymorpha worldwide network conference” (2006, Харен, Голландия), 12-ом международном конгрессе “International Congress on Yeasts” (2008, Киев, Украина) и V Съезде ВОГиС (2009, Москва). Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 3 тезисных сообщений. Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: «Ведение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 139 страницах и включает в себя 39 рисунков, 7 таблиц и список литературы, содержащий 296 ссылки. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Штаммы O. polymorpha, O. parapolymorpha и E. coli. Исследования проводили с использованием метилотрофных дрожжей, происходящих от двух независимых природных изолятов: АТСС 26012 (DL-1) и АТСС 34438 (CBS 4732), которые ранее на основе сходства физиологических и биохимических характеристик были отнесены к одному виду — Hansenula polymorpha или Pichia angusta. Недавно изоляты были ре-классифицированы и отнесены к разным видам рода Ogataea: АТСС 34438 назван O. polymorpha, а АТСС 26012 считается агамным мутантом O. parapolymorpha. Дрожжам O. parapolymorpha характерна высокая частота гомологичной рекомбинации, поэтому этот вид чаще использовали для направленного нарушения генов, а вид O. polymorpha использовали в различных экспериментах, особенно тех, где требовалось скрещивание и получение мейотического потомства. Для молекулярного клонирования использовали штамм E. coli: DH5α F’ (FT/endA1 hsdR17 (rK-mK+) supE44 thi-1 recA1 gyrA (Nalr) relA1 Δ(lacZYA-argF)U169 deoR (φ80dlacΔ(lacZ)M15)) Методы. В работе использовали различные методы генетики дрожжей (скрещивание и анализ мейотического потомства, трансформация плазмидами, инактивация хромосомных генов и др.), микробиологические и биохимические методы (выделение ДНК из клеток E. coli и дрожжей, электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле и выделение ДНК из геля, полимеразная 7 цепная реакция, молекулярное клонирование, приготовление дрожжевых лизатов, измерение тотального клеточного белка, переосаждение белков из культуральной среды, тестирование ферментативной активности белка uPA и β-галактозидазы, электрофорез денатурированных белков в полиакриламидном геле и иммуноблоттинг). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Мутации в генах CCH1, HOG1 и WEE1 супрессируют проявления мутации pmc1∆. У O. polymorpha и O. parapolymorpha нарушение гена PMC1 приводит к повышению концентрации кальция в цитозоле и чувствительности дрожжей к SDS. Мы провели поиск мутаций, спрессирующих чувствительность мутанта pmc1∆ к SDS. Мутации получали методом случайной интеграции трансформирующей ДНК, основанном на том, что при трансформации дрожжей O. polymorpha линейные фрагменты ДНК с высокой частотой интегрируют в геном по механизму негомологичной рекомбинации, в результате чего нарушаются различные локусы. Наличие известной последовательности в мутантном локусе позволяет быстро его идентифицировать. Таким образом, на основе штамма с делецией гена PMC1 была получена коллекция мутантов, менее чувствительных к SDS, и у трех из них определены нарушенные гены. Эти гены были обозначены CCH1, HOG1 и WEE1, поскольку их последующий анализ показал, что они являются ортологами генов CCH1, HOG1 и SWE1/WEE1 S. cerevisiae. Нарушение WEE1 произошло в результате хромосомной перестройки, затронувшей не только этот ген, но и локус, находящийся на расстоянии около 45 т.п.н. от него. Продукт гена CCH1 — субъединица канала для ионов кальция в цитоплазматической мембране. Продукт гена HOG1 — протеинкиназа, ответственная за реакцию клетки на гиперосмотический шок, а ген WEE1/SWE1 кодирует киназу, участвующую в регуляции клеточного цикла. Участие генов CCH1 и HOG1 в контроле чувствительности дрожжей рода Ogataea к SDS, было подтверждено путем направленного нарушения этих генов в штамме с мутацией pmc1∆. Штаммы O. polymorpha, в которых были совмещены мутации pmc1∆ cch1∆ и pmc1∆ hog1∆, росли на среде, содержащей 0,008% SDS. в то время как штамм с мутацией pmc1∆ был к такой концентрации SDS чувствителен (рис. 2). То, что нарушение гена CCH1 супрессирует чувствительность pmc1∆ к SDS, доказывает связь этой чувствительности с нарушением гомеостаза ионов кальция. В отличие от генов CCH1 и HOG1, направленное нарушение гена WEE1 в штамме с мутацией pmc1∆ O. polymorpha не приводило к снижению чувствительности дрожжей к SDS. Однако, при введении плазмиды с геном WEE1 в штамм pmc1∆ wee1∆, полученный путем интеграции в геном штамма pmc1∆ плазмидной ДНК по механизму негомологичной 8 рекомбинации, наблюдалась комплементация чувствительности к SDS: штамм pmc1∆ wee1∆, содержащий плазмиду с геном WEE1, обладал большей чувствительностью к SDS, чем штамм pmc1∆ wee1∆ без плазмиды (рис. 3). Мы провели ряд экспериментов по изучению наследования супрессорного проявления мутации wee1∆. Полученные нами данные указывали на то, что мутация wee1∆ супрессирует проявления pmc1∆ только на фоне хромосомной перестройки. Такая перестройка могла привести к нарушению гена или генов, которые были задействованы в механизме, обуславливающем чувствительность к SDS самого мутанта wee1∆. Мы предполагаем, что чувствительность к SDS, наблюдаемая при повышении концентрации ионов кальция в цитозоле в результате нарушения гена PMC1, опосредована одновременно и Wee1p и другим неизвестным компонентом (X), который негативно регулируется Wee1p. При этом по отдельности ни инактивация Wee1p, ни инактивация гипотетического компонента Х не снижают чувствительность к SDS. Рис. 2. Рост штаммов с мутациями pmc1∆, pmc1∆ cch1∆ и pmc1∆ hog1∆ на среде, содержащей SDS. Суспензии клеток штаммов с двойной мутацией S67/p61H (pmc1∆ cch1∆) и S67/p63B (pmc1∆ hog1∆), а также исходного штамма S67 (pmc1∆) наносили на твердую среду YPD (-) и YPD, содержащую 0,008% SDS (SDS), и инкубировали 2 суток при 370С. Рис. 3. Рост штаммов с мутациями pmc1∆ и pmc1∆ wee1∆ на среде, содержащей SDS. Суспензии клеток штаммов 1B (PMC1 WEE1), SDS116 (pmc1∆ wee1∆) и SDS116/pKAF48 (pmc1∆ wee1∆ [WEE1]) наносили на твердую среду YPD (-) и YPD, содержащую 0,006% SDS (SDS), и инкубировали 2 суток при 370С. Нарушение гена PMC1 приводит к паузе клеточного цикла в фазе G2. У S. cerevisiae нарушение гена PMC1 приводит к повышению концентрации Ca2+ в цитозоле, и активации Ca2+/кальмодулин-зависимой протеинфосфатазы кальциневрина. Кальциневрин негативно регулирует активность киназы Wee1p и на уровне транскрипции гена WEE1, и на уровне 9 деградации белка Wee1p. Для того, чтобы изучить влияние нарушения гена PMC1 на экспрессию гена WEE1, мы получили штамм, содержащий химерный ген WEE1:lacZ, кодирующий N-концевой фрагмент Wee1p и β-галактозидазу, под промотором WEE1. Нарушение гена PMC1 в таком штамме не оказывало существенного влияния на активность βгалактозидазы, однако сильно снижало скорость роста дрожжей и приводило к существенным морфологическим изменениям делящихся клеток (рис. 4). Подобные морфологические изменения ранее были обнаружены у S. cerevisiae при нарушении перехода G2-M в клеточном цикле, например, вызванным сверхэкспрессией гена SWE1/WEE1. Киназа Wee1p негативно регулирует активность циклин-зависимой киназы Cdc28p. Негативно регулируемый кальциневрином комплекс Hsl1p/Hsl7p взаимодействует с Wee1p, усиливая его деградацию, что приводит к активации комплекса Cdc28p/Clb и переходу клеточного цикла от фазы G2 к фазе M. Мы предполагаем, что продукт химерного гена WEE1:lacZ, спасал от деградации Wee1p дикого типа, эффективно конкурируя с ним за взаимодействие с комплексом Hsl1p/Hsl7p, таким образом, приводил к накоплению Wee1p, и в результате происходила остановка клеточного цикла в фазе G2. Протеинкиназа Hog1p также участвует в регуляции клеточного цикла. При определенных условиях, например, в условиях гиперосмотического шока, Hsl1p подвергается фосфорилированию киназой Hog1p, что нарушает его взаимодействие комплекса Hsl1p/Hsl7p с Wee1p, вызывает накопление Wee1p и остановку клеточного цикла в фазе G2. Поскольку нарушение генов HOG1 и WEE1 приводит к снижению чувствительности к SDS у мутанта pmc1∆, можно заключить, что у дрожжей рода Ogataea чувствительность мутанта pmc1∆ к SDS связана с паузой в фазе G2, происходящей по причине накопления Wee1p. Рис. 4. Делящиеся клетки из ночных культур штаммов DL1-L/pCHLX (WT), DL1-∆wee (wee1), DLW/L (WEE1:lacZ PMC1) и DLW-∆pmc (WEE1:lacZ pmc1). Влияние мутации ret1-27 на процессирование белка uPA-Q302 сходно с проявлениями мутаций, нарушающих вакуолярную сортировку. Мутация ret1-27 влияет на функционирование секреторного аппарата клетки. В частности, штаммы с этой мутацией, более эффективно секретируют гетерологичный белок uPA, что связано с улучшением его укладки и 10 секрецией аберрантных форм. Мы сравнили влияние мутации ret1-27 на секрецию дрожжами O. polymorpha белка uPA и его мутантного варианта с нарушенным участком N-гликозилирования uPA-Q302. Для оценки эффективности секреции мы анализировали содержание белков uPA и uPA-Q302 в культуральной среде и клеточных лизатах методом иммуноблоттинга. Оказалось, что количество белка uPA-Q302 в культуральной среде у штамма с мутацией ret1-27 не увеличено по сравнению со штаммом дикого типа, но при этом большая часть uPA-Q302, секретированного мутантным штаммом, мигрирует при электрофорезе на уровне ~30 кДа (рис. 5А). Количество внутриклеточного uPA-Q302 также заметно не отличалось у мутантного штамма и штамма дикого типа (рис. 5Б). В то же время, мутация ret1-27 существенно увеличивала секрецию немутантного варианта uPA без существенного перераспределения продуктов его протеолиза, а также уменьшала внутриклеточное накопление этого белка, что совпадало с полученными ранее результатами. Известно, что увеличение протеолитической активации uPA и uPA-Q302 характерно для мутантов с нарушением компонентов, участвующих в транспортировке белков из аппарата Гольджи в вакуоль. Эффект мутации ret1-27 был специфичен для мутантного белка uPA-Q302. На данный момент мы затрудняемся предположить механизм этого явления, поскольку для мутации ret1-27 не было обнаружено влияния на сортировку белков в вакуоль, а у мутантов с дефектом вакуолярной сортировки в существенной степени не нарушен гомеостаз кальция. Интересно, что увеличение протеолитической активации uPA-Q302 у штамма с мутацией ret1-27 (общее свойство с мутациями, нарушающими вакуолярный сортинг) усиливалось при инактивации гена вакуолярной кальциевой АТФазы PMC1 (данные не приведены). Это наблюдение также свидетельствует о связи COPI-зависимого транспорта с функционированием вакуоли. Известно, что комплекс COPI-B, в состав которого входит белок α-COP (Ret1p), Рис. 5. Иммуноблоттинг с антителами против uPA культуральных сред (А), клеточных лизатов (Б) штаммов 64MA70UAL (ret1-27, uPA), 64MA70UA-RET (RET1, uPA), 64MA70QAL (ret1-27, uPA-Q302) и 64MA70QA-RET (RET1, uPA-Q302). А — Индукцию проводили в течение 70 часов. Б — Индукцию проводили в течение 30 часов. 11 участвует в транспорте из эндосом — промежуточных компартментов, через которые происходит транспорт в вакуоль эндоцитируемых белков и белков из аппарата Гольджи. Мы предполагаем, что влияние мутации ret1-27 на процессирование uPA-Q302, опосредовано ее влиянием на функционировние эндосом. Нарушение гена PMR1 приводит к снижению жизнеспособности у O. polymorpha. У O. polymorpha, как и у S. cerevisiae, нарушение гена PMR1, кодирующего Ca2+/Mn2+ АТФ-азу аппарата Гольджи, приводит к чувствительности к нехватке в среде Ca2+, к нарушению гликозилирования секретируемых белков в аппарате Гольджи и к увеличению эффективности секреции чужеродных белков. Кроме того, эта мутация приводила к снижению как скорости роста, так и плотности стационарной культуры. Это могло указывать на повышенную частоту гибели клеток. Изучение ночных культур штаммов O. polymorpha методом окрашивания метиленовым синим, показало, что в культуре штамма с мутацией pmr1∆ доля окрашенных, а значит мертвых, клеток составляла около 30%, тогда как в культуре штамма, содержащего плазмиду, несущую аллель гена PMR1 дикого типа, доля мёртвых клеток составляла всего 67%. Для того чтобы изучить влияние нарушения гена PMR1 на жизнеспособность клеток при пониженной температуре, аликвоты ночной культуры штамма с мутацией pmr1∆ и штамма, содержащего плазмиду, несущую аллель гена PMR1 дикого типа, инкубировали 0-6 дней при температуре +40C, высевали в разведениях на чашки с YPD и выращивали при оптимальной для роста температуре (+370C) до появления колоний. Через 6 суток хранения при +40С в культуре штамма с мутантной аллелью pmr1∆, доля клеток, способных дать колонии, составляла менее 1% относительно исходной культуры, тогда как в культуре штамма с копией гена PMR1 дикого типа, доля жизнеспособных клеток за то же время фактически не изменилась. В норме, выделенная из клеток геномная ДНК дрожжей мигрирует при электорфорезе в постоянном поле в агарозном геле как полоса выше уровня 10 т. п. н. с незначительным количеством более низкомолекулярных форм, дающих некоторую "смазанность" основной полосы (рис. 6А, левая дорожка). Однако в препарате геномной ДНК мутанта pmr1∆ мы обнаружили большое количество ДНК, мигрирующей при электрофорезе существенно быстрее основной полосы (рис. 6А, средняя дорожка) и количество таких форм ДНК сильно возрастало, если среда содержала аммоний-фосфатный буфер (рис. 6А, правая дорожка). В этих условиях большая часть клеток погибала, поэтому логично предполагать, что фрагментации ДНК связана с процессом гибели клеток, что характерно для апоптоза. Нарушение роста клеток штамма с мутацией pmr1∆ происходит по причине нехватки Ca2+ в секреторном пути, гибель клеток штамма с мутацией pmc1∆ — из-за повышения концентрации Ca2+ в цитозоле. При 12 электрофоретическом анализе ДНК клеток штамма с мутацией pmc1∆ существенного усиления фрагментации выявлено не было ни в случае гибели клеток в присутствии 200 мМ CaCl2, ни в присутствии 0,006% SDS (рис. 6В). Это наблюдение указывает на то, что механизмы нарушения роста клеток штамма с мутацией pmr1∆ и штамма с мутацией pmc1∆ отличаются. Мутации ret1-27 и ypt6∆ нарушают доставку Ca2+ в компартменты секреторного пути. Ген RET1 кодирует белок α-COP, являющийся компонентом окаймляющего комплекса COPI. Мутация ret1-27, нарушающая ретроградный везикулярный транспорт, также приводит к чувствительности дрожжей рода Ogataea к нехватке в среде Ca2+, а совмещение этой мутации с нарушением гена PMR1 летально. Рост дрожжей, у которых совмещены эти мутации, возможен только при повышенной концентрации Ca2+ в среде. При переносе клеток с такой среды на стандартную клетки начинали гибнуть, что сопровождалось сильной фрагментацией ДНК (рис. 6Б). Ген YPT6 кодирует ГТФ-азу, участвующую в слиянии с мембранами органелл везикул, осуществляющих транспорт между цистернами аппарата Гольджи, от эндосом к аппарату Гольджи и от аппарата Гольджи к ЭР. Взаимодействие мутации pmr1∆ с ypt6∆ было похоже на взаимодействие с ret1-27: совмещение мутаций pmr1∆ и ypt6∆ хотя и не было летальным, штамм pmr1∆ ypt6∆ был почти неспособен расти на стандартной среде, а добавление в среду CaCl2 в существенной степени восстанавливало рост (рис. 7). В отсутствие АТФ-азы Pmr1p концентрация Ca2+ в ЭР поддерживается на достаточном для жизни уровне, что говорит о том, что помимо аппарата Гольджи в качестве источников Ca2+ для ЭР могут выступать другие органеллы, или внешняя среда. Поскольку нарушение везикулярного транспорта усугубляет кальций-зависимый фенотип pmr1∆, можно заключить, что в отсутствие Pmr1p везикулярный транспорт осуществляет доставку ионов кальция из дополнительного источника в ЭР. Мы предполагаем, что таким источником могут быть эндосомы. Эти органеллы не имеют собственной кальциевой АТФ-азы, однако они связаны везикулярным транспортом с плазматической мембраной (а значит и с внешней средой), а также с вакуолью, которая является основным депо Ca2+ в дрожжевой клетке. Нарушение гена CCH1 усиливает проявления мутаций pmr1∆ и ret1-27. Нарушение гена CCH1, кодирующего субъединицу канала для Ca2+ в цитоплазматической мембране, приводило к чувствительности клеток к недостатку кальция в среде. Аналогичные проявления были у мутаций pmr1∆ и ret1-27. Поэтому можно было предполагать, что совмещение этих мутаций с нарушением ССН1 должно увеличивать зависимость клеток от содержания ионов кальция в среде. Действительно, при совмещении мутаций pmr1∆ и cch1∆ мы наблюдали комбинативный эффект: рост штамма с делецией pmr1∆ существенно замедлялся, а рост 13 Рис. 6. Фракции ДНК, выделенные из штаммов 1MA77/12-PMR (PMR1), и 1MA77/12-A (pmr1∆) (А); MC39 (pmr1 ret1-27) (Б), или DLU-∆pmc (pmc1∆) и DLU (PMC1) (В). А — Трансформантов выращивали в индукционной среде в присутствии фосфата аммония ((NH4)3PO4), или без него (-) при 370С в течение 24 часов. Из клеток выделяли ДНК и разделяли электрофоретически в 2% агарозе. Б — Клетки штамма MC39, потерявшего плазмиду pCAT1 с геном PMR1 (pmr1∆ ret1-27) выращивали в среде YPD, содержащей 10 мМ CaCl2, а затем пересевали в среду YPD и инкубировали 0-6 часов. В — Штаммы выращивали в среде YPD в присутствии 100 мМ CaCl2 (CaCl2), 0,006% SDS (SDS), или без добавок (-) при 370С в течение 24 часов. Из клеток выделяли ДНК и разделяли электрофоретически в 1,8% агарозе. Рис. 7. Рост штаммов с мутациями pmr1∆ и ypt6∆. Суспензии клеток штаммов 1MA77/12G (pmr1∆ YPT6), 1MA77/12G-∆ypt<pCAT1 (PMR1 ypt6∆), 1MA77/12G-∆ypt (pmr1∆ ypt6∆) с шагом разведения 10 раз наносили на среду YPD (-) и YPD, содержащую 10 мМ CaCl2 (CaCl2), и инкубировали 2 суток при 370С. 14 «двойного мутанта» pmr1∆ cch1∆ полностью прекращался (рис. 8). Этот фенотип зависел от Ca2+, поскольку при добавлении в среду 10 мМ CaCl2 рост pmr1∆ cch1∆ восстанавливался. Нарушение гена CCH1 должно снижать концентрацию кальция в цитоплазме, а значит и эффективность его транспорта оттуда в компартменты секреторного пути АТФ-азами Pmr1p и Pmc1p. В том случае, если дополнительным Рис. 8. Рост штаммов с мутациями pmr1∆, cch1∆ и pmr1∆ cch1∆. Штаммы 1MA77/12GA-L (pmr1∆ CCH1), 1MA77/12GA-∆cch (pmr1∆ cch1∆), 1MA77/12GA∆cch<pAF18 (PMR1 cch1∆) и 1MA77/12GA-L<pAF18 (PMR1 CCH1) штрихом высевали на среду SC (SC) и SC с 10 мМ CaCl2 (SC + CaCl2), и инкубировали 2 суток при 370С. источником кальция для ЭР была бы только внешняя среда, и в отсутствие Pmr1p в секреторный путь кальций попадал бы исключительно благодаря эндоцитозу, нарушение гена CCH1 не должно было бы оказывать влияние на проявления мутации pmr1∆. Но поскольку при совмещении мутаций мы наблюдали комбинативный эффект, можно предположить, что вакуоль, в которую Ca2+ попадает из цитоплазмы, является одним из источников этого иона для ЭР. Аналогичным образом делеция cch1∆ влияла на проявления мутации ret1-27 в условиях дефицита ионов кальция в среде. Штаммы с мутациями в одном из генов RET1, или ССH1 проявляли чувствительность при концентрации ЭГТА равной 15 мМ, а штамм, Рис. 9. Рост штаммов с мутациями cch1∆, ret1-27 и cch1∆ ret1-27 в условиях дефицита Ca2+. Суспензии клеток штаммов 64MA70-cch∆<p2CHA627OPU (RET1 cch1∆), 64MA70-cch∆ (ret1-27 cch1∆), 64MA70 (ret1-27 CCH1) и 64MA70∆<p2CHA6-27OPU (RET1 CCH1) наносили на твердую SC* (-) и эту эту же среду, содержащую ЭГТА в концентрации 10 (10 мМ ЭГТА) и 15 мМ (15 мМ ЭГТА), и инкубировали 2 суток при 370С. совмещающий мутацию ret1-27 с нарушением гена CCH1, рос заметно хуже остальных штаммов уже при 10 мМ ЭГТА (рис. 9). Мы полагаем, что это также связано с тем, что кальций, попадающий внутрь клетки благодаря Cch1p переносится в люмен аппарата Гольджи и вакуоли, а оттуда транспортируется в ЭР в везикулах COPI. 15 Мутации ret1-27 и pmc1∆ влияют на гомеостаз Ca2+ независимо друг от друга. Для того, чтобы определить роль вакуоли в снабжении ЭР ионами кальция, мы изучили взаимное влияние мутаций ret1-27 и pmc1∆. При концентрации CaCl2 равной 80 мМ штамм O. polymorpha с мутацией pmc1Δ и двойной мутант pmc1Δ ret1-27 демонстрировали меньшую скорость роста по сравнению со штаммом, несущим аллели этих генов дикого типа, а при концентрации 160 мМ рост штаммов pmc1Δ и pmc1Δ ret1-27 прекращался. При этом способность штамма с мутацией ret1-27 и аллелью гена PMC1 дикого типа расти на среде, содержащей ионы кальция, существенно не отличалась от способности штамма, несущего аллели дикого типа обоих генов (рис. 10А). Таким образом, мутация ret1-27 не оказала существенного влияния на чувствительность к высокому содержанию кальция в среде, обусловленную мутацией pmc1Δ. При выращивании на среде, содержащей 15 мМ ЭГТА, скорость роста всех штаммов была одинаково снижена. Концентрация ЭГТА в среде 20 мМ оказалась непермиссивной и для штамма с мутацией ret1-27 и аллелью PMC1 дикого типа, и для двойного мутанта pmc1Δ ret1-27 (рис. 10Б). Таким образом, мутация pmc1Δ не оказала заметного влияния на чувствительность к ЭГТА в штамме O. polymorpha с мутацией ret1-27. Нарушение везикулярного транспорта в штамме с мутацией ret1-27 должно ухудшать доставку ионов кальция в ЭР как из аппарата Гольджи, так и из дополнительного источника этих ионов. В том случае, если бы вакуоль Рис. 10. Рост штаммов с мутациями pmc1∆, ret1-27 и pmc1∆ ret1-27 в условиях избытка (А) и дефицита (Б) в среде ионов кальция. А — Суспензии клеток штаммов 64MA70Q-RET-∆pmc (pmc1∆ RET1), 64MA70QA-pmc (pmc1∆ ret1-27), 64MA70QAL (PMC1 ret1-27) и 64MA70QL-RET (PMC1 RET1) наносили на твердую среду YPD (-) и YPD, содержащую CaCl2 в концентрации 80 (80 мМ CaCl2) и 160 мМ (160 мМ CaCl2), и инкубировали 2 суток при 370С. Б — Суспензии клеток штаммов 64MA70Q-RET-∆pmc (pmc1∆ RET1), 64MA70QA-∆pmc (pmc1∆ ret127), 64MA70QAL (PMC1 ret1-27) и 64MA70QL-RET (PMC1 RET1) наносили на твердую среду SC* (-) и эту же среду, содержащую ЭГТА в концентрации 15 (15 мМ ЭГТА) и 20 мМ (20 мМ ЭГТА), и инкубировали 2 суток при 370С. 16 играла существенную роль в качестве дополнительного источника ионов кальция для ЭР, можно было бы ожидать, что совмещение нарушения везикулярного транспорта, вызванное мутаций ret1-27, и снижение концентрации Ca2+ в вакуоли, вызванное мутацией pmc1∆, будет иметь физиологические последствия. Однако оказалось, что мутации влияют на гомеостаз Ca2+ независимо. Это указывает на то, что роль вакуоли как источника Ca2+ для ЭР не столь существенна. Mn2+ восстанавливает рост штамма с нарушенным геном PMR1 при низкой концентрации Ca2+в среде. Если среда не содержит достаточного количества Ca2+ жизднедеятельность клеток дрожжей нарушается. Известно, что при нехватке Ca2+ в среде добавление низких концентраций Mn2+ восстанавливает рост дрожжей S. cerevisiae. Это означает, что ионы марганца могут заменять ионы кальция в каком-то жизненно важном процессе. АТФ-аза аппарата Гольджи Pmr1p участвует в транспорте Ca2+ и Mn2+ в люмен органеллы, где эти ионы необходимы для процессов гликозилирования, укладки и сортировки белков. Поэтому клетки, лишенные Pmr1p, обладают повышенной чувствительностью к нехватке в среде Ca2+. Для того, чтобы проверить, 2+ положительный эффект Mn не связан ли на рост дрожжей с процессами, протекающими в секреторном пути, мы изучили влияние разных концентраций MnCl2 на рост pmr1∆ в условиях дефицита кальция. Мутант pmr1∆ был чувствителен к нехватке в среде ионов кальция и избытку ионов марганца, а при добавлении в среду 0,5-1 мМ MnCl2 его рост значительно улучшался (рис. 11). Это означает, что процесс, в котором ионы кальция и марганца взаимозаменяемы, локализован в секреторном Рис. 11. Рост штамма с мутацией pmr1∆ на среде SC* с низким содержанием Ca2+ при различных концентрациях Mn2+. Суспензии штаммов 1MA77/12GA-L (pmr1∆) и 1MA77/12GA<pAF18 (wt) (~200 кл/мкл) по 3 мкл наносили на твердую среду SC* (-), и на эту же среду с добавкой MnCl2 в концентрации 0,5-3 мМ, и инкубировали при 370С 2 суток. пути. Увеличение концентрации Mn2+ в среде не спасает от гибели клетки O. polymorpha при одновременном нарушении генов PMC1 и PMR1. У дрожжей S. cerevisiae гибель двойного мутанта pmr1∆ pmc1∆ связана с повышением концентрации кальция в цитозоле. Мы показали, что совмещение этих мутаций у O. polymorpha также летально (данные не приведены). Нарушение гена PMR1 приводит к нехватке ионов кальция в люмене аппарата Гольджи и нарушению протекающих там процессов. У O. polymorpha совмещение нарушения гена PMR1 с мутациями, нарушающими везикулярный транспорт, было летально (pmr1∆ ret1-27), или 17 приводило к синтетическому ингибированию роста (pmr1∆ ypt6∆), связанному со снижением концентрации кальция в секреторном пути. В связи с тем, что вакуоль может играть роль дополнительного источника ионов кальция для ЭР, можно было предположить, что двойной мутант pmr1∆ pmc1∆ O. polymorpha гибнет не по причине высокой концентрации Ca2+ в цитозоле, а по причине низкой концентрации Ca2+ в секреторном пути. Mn2+ способен улучшать рост pmr1∆ при низкой концентрации ионов кальция, заменяя Ca2+ в процессах, которые, как мы полагаем, локализованы в секреторном пути. Мы изучили влияние Mn2+ на рост клеток pmr1∆ pmc1∆. Добавление в среду 1 мМ MnCl2 не позволяло выживать клеткам pmr1∆ pmc1∆. Это указывало на то, что у O. polymorpha совмещение мутаций pmr1∆ и pmc1∆ летально не изза нехватки кальция в секреторном пути, а по причине высокой его концентрации в цитозоле, так же как и у S. cerevisiae. Ca2+ снижает токсический эффект ионов марганца на клетки O. polymorpha. Несмотря на то, что низкие концентрации Mn2+ могут оказывать положительный эффект на рост некоторых мутантов, высокая концентрация этого иона в среде токсична для клеток. Причины токсичности Mn2+ не известны, а ее проявление в существенной степени зависит используемой среды. Для определения токсичных концентраций этого иона для O. polymorpha мы использовали специальную синтетическую среду с низким содержанием Са2+. На такой среде при концентрации MnCl2 выше 3 мМ рост всех проверенных штаммов либо был сильно подавлен, либо совсем отсутствовал. Однако, при добавлении 5 мМ CaCl2 ингибирование роста O. polymorpha, вызванное 3 мМ MnCl2, ослаблялось (данные не приведены). Положительное влияние Ca2+ на рост O. polymorpha в условиях токсической концентрации Mn2+ может происходить по двум причинам: (1) механизм токсичности Mn2+ связан непосредственно с конкурентным вытеснением Ca2+, и/или (2) Ca2+ конкурирует с Mn2+ при проникновении в клетку. Мутации ret1-27 и ypt6∆ повышают чувствительность O. polymorpha к Mn2+. У S. cerevisiae известно два переносчика марганца, Smf1p и Smf2p. В связи с тем, что потребность клетки в ионах марганца очень низкая, основная доля молекул переносчиков локализуется во внутриклеточных везикулах и эндосомах, а не на поверхности клетки, при этом большая часть молекул сразу направляется на деградацию после синтеза. При повышении концентрации марганца в среде реакция клетки включает в себя две стадии, на первой происходит быстрый эндоцитоз переносчиков с поверхности клетки и перенос их в вакуоль на деградацию, а во второй — направление на деградацию молекул, находящихся во внутриклеточных депо. Мутации ret1-27 и ypt6∆ нарушают везикулярный транспорт, и как следствие — гомеостаз Ca2+ в секреторном пути. Мы изучили, как влияет нарушение генов RET1 и YPT6 на зависимость 18 роста O. polymorpha от концентрации Mn2+ при условии нехватки Ca2+. Оказалось, что даже при концентрации 1 мМ MnCl2 был токсичным для мутанта ret1-27: штамм с мутацией ret1-27 рос при этой концентрации MnCl2 хуже, чем штамм дикого типа при концентрации 3 мМ (рис. 12). Известно, что белок α-COP, кодируемый геном RET1, в составе субкомплекса COPI-B участвует в транспорте из эндосом, а нами было обнаружено, что мутация ret1-27 и мутации, нарушающие вакуолярную сортировку, сходным образом влияют на процессирование гетерологичного белка uPA-Q302. Поэтому можно предполагать, что мутация ret1-27 вызывает нарушения функций эндосом и влияет на локализацию белков плазмалеммы, включая специфические транспортеры Mn2+. В случае мутанта ypt6∆ эффект MnCl2 был токсическим даже при концентрации 0,5 мМ (рис. 13). ГТФ-аза Ypt6p участвует в слиянии везикул с мембранами органелл секреторного пути при транспорте из эндосом в аппарат Гольджи, поэтому механизм чувствительности этого мутанта также может быть связан с функционированием эндосом и локализацией транспортеров Mn2+. Другими словами, мутации ret1-27 и ypt6∆ за счет нарушения везикулярного транспорта могут приводить к изменению распределения транспортеров марганца в клетке и/или снижать эффективность их деградации в вакуоли. Это должно увеличивать их количество на плазмолемме, и ухудшать способность клетки реагировать на повышение концентрации Mn2+ в среде. Рис. 12. Рост штамма с мутацией ret1-27 на среде SC* при различных концентрациях Mn2+. Суспензии штаммов 64MA70QAL (ret1-27) и 64MA70QL-RET (RET1) в концентрации ~200 и ~20 клеток/мкл по 3 мкл наносили на твердую среду SC* (-), и SC*, содержащую 1 мМ MnCl2, 3 мМ MnCl2, и инкубировали 2 суток при 370С. Рис. 13. Рост штамма с мутацией ypt6∆ на среде SC* при разных концентрациях Mn2+. Суспензии штаммов 1MA77/12G-∆ypt6<pCAT1 (ypt6∆) и 1MA77/12<pCAT1 (YPT6) в концентрации ~200 клеток/мкл по 3 мкл наносили на твердую среду SC* (-), и на такую же среду, содержащую 0,5-5 мМ MnCl2, и инкубировали 2 суток при 370С. Нарушение генов CCH1 и PMC1 приводит к снижению чувствительности к Mn2+ у O. polymorpha. Добавление в среду ионов кальция частично защищало штамм дикого типа от токсического действия высокой концентрации марганца. Можно было предположить, что это связано с конкуренцией ионов кальция и марганца в каком-то жизненно важном процессе 19 протекающем в цитоплазме. Мы решили проверить, как повлияет снижение и повышение концентрации Ca2+ в цитозоле при различных концентрациях Mn2+ в среде. Cch1p является субъединицей канала для ионов кальция в плазматической мембране, нарушение гена CCH1 приводит к снижению концентрации Ca2+ в цитозоле и чувствительности клеток к нехватке Ca2+ в среде. Нарушение гена PMC1, кодирующего вакуолярную кальциевую АТФ-азу, наоборот, приводит к повышению концентрации Ca2+ в цитозоле. Мы изучили, как повлияет добавление MnCl2 на рост штаммов O. polymorpha, у которых нарушены гены CCH1 и PMC1. Оказалось, что мутация cch1∆ повышает устойчивость O. polymorpha к токсическому действию MnCl2 (рис. 14). Поскольку нарушение гена CCH1 нарушает транспорт Ca2+ через цитоплазматическую мембрану, и в то же время приводит к устойчивости дрожжей к Mn2+, можно сделать вывод о том, что описанное выше защитное действие Ca2+ при токсической концентрации Mn2+ связано не с конкуренцией ионов в каком-то жизненно важном процессе в цитоплазме, а скорее с конкуренцией при проникновении в клетку. Мы предполагаем, что кальциевый канал Cch1p/Mid1p может пропускать ионы марганца, и, когда клетка отвечает на повышение концентрации этого иона эдоцитозом молекул специфических транспортеров Mn2+ с поверхности, Cch1p/Mid1p становится основным транспортером марганца внутрь клетки. Поэтому, при делеции гена CCH1 клетки приобретают устойчивость к высокой концентрации марганца. Штамм pmc1∆ также оказался устойчивым к негативному воздействию MnCl2 (рис. 15). Повышение концентрации кальция в цитозоле, происходящее вследствие нарушения гена PMC1, активирует кальциневрин-зависимый Рис. 14. Рост штамма с мутацией cch1∆ на среде SC* при разных концентрациях Mn2+. Суспензии штаммов 1MA77/12GA-cch∆<pAF18 (cch1∆) и 1MA77/12U/pCHLXdHS<pAF18 (CCH1) в концентрации ~200 клеток/мкл по 3 мкл наносили на твердую среду SC* (-), и на такую же среду, но содержащую еще 0,1-3 мМ MnCl2, и инкубировали 2 суток при 370С. сигнальный каскад, который регулирует Рис. 15. Рост штамма с мутацией pmc1∆ на среде SC* при различных концентрациях Mn2+. Суспензии штаммов 1MA77/12GApmc∆<pAF18 (pmc1∆) и 1MA77/12GA<pAF18 (wt) (~200 кл/мкл) по 3 мкл наносили на твердую среду SC* (-), и на эту же среду с добавкой MnCl2 в концентрации 0,5-3 мМ, и инкубировали при 370С 2 суток. 20 активность множества генов, в том числе снижает экспрессию ССH1. Поскольку полученные нами результаты указывают на то, что Cch1p/Mid1p при высокой концентрации марганца является основным каналом, переносящим ионы марганца через мембрану, делеция PMC1 может вызывать устойчивость клеток к высокой концентрации марганца за счет снижения экспрессии гена CCH1. 21 ВЫВОДЫ 1. Идентифицированы мутации, супрессирующие у дрожжей O. polymorpha и O. parapolymorpha чувствительность к SDS, обусловленную нарушением вакуолярной кальциевой АТФазы Pmc1p. Анализ этих мутаций показал, что гиперчувствительность к SDS мутанта pmc1∆ обусловлена увеличением концентрации Ca2+ в цитозоле и связана с ингибированием перехода клеточного цикла от фазы G2 к M. 2. Снижение жизнеспособности у O. polymorpha при инактивации гена PMR1 связано с уменьшением концентрации Ca2+ и Mn2+ в секреторных органеллах. Этот эффект усиливается на фоне нарушений везикулярного транспорта, вызванных инактивацией Ypt6p и делецией Сконцевого домена α-COP. 3. Делеция С-концевого домена α-COP приводит к усилению протеолитического процессинга модельного белка uPA-Q302, что указывает на участие α-COP в формировании везикул, осуществляющих транспорт между аппаратом Гольджи и вакуолью. 4. Ионный канал Cch1p/Mid1p участвует в транспорте Mn2+ в клетку, а белки Ypt6p и α-СOP участвуют в контроле транспорта Mn2+ у O. polymorpha. 5. На основе полученных данных выдвинута гипотеза, предполагающая, что в клетках дрожжей Ca2+ в ЭР может доставляться из эндосом при участии везикулярного транспорта. 22 Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Fokina A., Sokolov S., Ah Kang H., Kalebina T., Ter-Avanesyan M. D., Agaphonov M. Inactivation of Pmc1 vacuolar Ca(2+) ATPase causes G 2 cell cycle delay in Hansenula polymorpha. // Cell Cycle. 2012. V. 11. №4. P. 778-784. 2. Agaphonov M.O., Plotnikova T.A., Fokina A.V., Romanova N.V., Packeizer A.N., Kang H.A. and Ter-Avanesyan M.D. Inactivation of the Hansenula polymorpha PMR1 gene affects cell viability and functioning of the secretory pathway. // FEMS Yeast Research. 2007. V. 7. №7. P. 1145-1152. 3. Агафонов М.О., Ильина А.В., Фокина А.В. Контроль укладки белков в секреторном пути Hansenula polymorpha. // Тезисы Съезда генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина и V Съезда ВОГиС. 21-28 июня 2009. Часть II. С. 59. 4. Agaphonov M.O., Fokina A., Chechenova M., Ter-Avanesyan M. Interrelationship between functioning of secretory organelles and Ca2+ homeostasis in Hansenula polymorpha. // Abstract Book of 12th International Congress on Yeasts. August 11-15 2008. 5. Agaphonov M.O., Chechenova M.B., Plotnikova T.A., Fokina A.V. Ter-Avanesyan M.D. Genetic analysis of Ca2+ trafficking in the secretory pathway of Hansenula polymorpha. // 4th Hansenula polymorpha worldwide network conference. Abstract Book. 3-5 September 2006. 23 Список сокращений ЭГТА — этиленгликольтетраацетат ЭР — эндоплазматический ретикулум COP — окаймляющий комплекс SDS — додецилсульфат натрия
