011616 - 1 - Изобретение относится к фармацевтической

011616
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к технологии получения
лечебных средств из репродуктивных тканей морских гидробионтов, и может быть использовано в профилактических и лечебных целях для восстановления функции репродуктивной системы человека при
его расстройствах.
Анализ современной информации указывает, что экстракты липидов и комплексов веществ липидбелковой природы из разных тканей животных организмов имеют целый ряд биологических свойств,
которые свидетельствуют о возможности создания новых естественных лечебных средств специфического действия. Раскрытие механизма действия и особенностей биотрансформации многих естественных
соединений из морских гидробионтов, а также новые разработки технологий получения их эффективных
форм стали предпосылкой для создания новых биологически активных препаратов.
Известен новый класс пептидных регуляторов - цитомединов, которые имеют возможность восстанавливать функции тех органов, из которых извлечены эти вещества и которые при этом не имеют антигенных свойств (Хавенсон В.Х., Морозов В.Г. Биологические регуляторы цитомедины. Рос. Нац. Конгресс «Человек и лекарство», Москва, 1982г., с. 518), а также известен ряд способов получения лечебнопрофилактических препаратов из морских гидробионтов (Лебская Т.А. Состояние и перспективы разработки лечебно-профилактических продуктов питания из морских гидробионтов. Научно-практическая
конф. «Техника и технология производства на рубеже 21 века»).
Одним из приоритетных направлений в этой области является использование естественных соединений из морских гидробионтов, которые содержат уникальный набор биологически активных веществ.
Известен терапевтический эффект фосфолипидов с ω-3 полиненасыщенными жирными кислотами
(ПНЖК) для лечения ревматоидного артрита и сепсиса, а также известно влияние фосфолипидов на развитие тканей мозга и глаз (пат. № 5434183, США, МПК3 А61К 31/66, опубл. 1995). Известны извлечение
прогестерона, тестостерона и эстрогена из тканей морских моллюсков (Никитина С.М., Савченко О.Н.,
Коган М.Е.//Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 1977. - том 8, № 4- с. 443-447), а также
"Способ лечения задержки внутриутробного развития плода" с помощью препаратов метаболичного действия, а именно аминокислоты аргинина, биологически активных веществ и витаминов (пат. № 62817А,
Украина, МПК7 А61К 31/24, опубл. 2003.; Савельева Г.М., Федорова М.Ц., Клименко П.А. Плацентарная
недостаточность. М.: Медицина, 1991, 271 с.). Как известно, аргинин является субстратом для синтеза
оксида азота, чем достигается его влияние на систему плацентарной микроцеркуляции и способность
влиять на процессы роста плода путем регуляции секреции гормона роста гипофизом (Марков К.М. О биорегуляторной системе L-аргинин - окись азота//Пат. физиология и эксперим. терапия. 1996, 1. - с. 34-39).
Известно, что основным компонентом комплексного лечения патологических пролиферативных
процессов репродуктивных органов (ПППРО) является гормонотерапия. Принципы гормональной терапии разных форм ПППРО и локализация заболеваний базируются на угнетении активной системы гипоталамус-гипофиз яичников с развитием секреторных, гипотрофических или атрофических изменений.
Возникновение диспластической болезни эндометрия обусловлено совместным влиянием разлада гормональных, иммунологических равновесий органов и биохимическими нарушениями. В связи с этим полезным является способ получения терапевтического препарата, в котором в качестве активного компонента представлен "компонент RM", рыбного белка, который удаляет опухолевые клетки из организма
человека и животного (экон. пат. № 275810, ГДР, МПК4 А61К 35/60, 37/00, опубл. 1990). Препарат активен против нейробластомных клеток, а также может быть использован в терапии.
Известно об иммуногенных пептидах и синтетических имуностимуляторах для обработки гиперплазии простаты, а также эндометриоза и тестикулярной карциномы у мужчин (пат. № 60222467, Япония, МПК4 A23J 1/04 A23L 1/305, опубл. 1996). Эти пептиды используются для лечения гиперплазии андрогензависимой карциномы, а у женщин - для лечения эндометриоза.
В качестве прототипа заявленного изобретения выбран "Способ получения лечебного средства, которое восстанавливает патологическое состояние мембран клеток" (пат. № 55562, Украина, МПК7 А61К
31/00, опубл. 15.04.2003), который включает измельчение в замороженном состоянии сырья из репродуктивных органов морских организмов, его экстракцию этанолом, отделение от экстракта остатков сырья и
очистку экстракта от примесей с помощью добавления смеси 50% этанола и гексана при их объемном
соотношении (1-5):(20-40), при этом витамин Е добавляют к концентрату, полученному после обособления гексановой фракции от водно-спиртовой.
Этот способ включает измельчение сырья репродуктивных тканей морских организмов в замороженном состоянии, его экстракцию этанолом, отделение экстракта от остатков сырья, очищение экстракта от примесей - нейтральных липидов и белковых компонентов - смесью 50% этанола и гексана, а гексановую фракцию после отделения выпаривают и получают субстанцию морских форфолипидов, которая содержит ω-3 ПНЖК, которую стабилизируют витамином Е.
Полученный таким способом препарат содержит, большей частью, липидные компоненты, фосфолипиды с ω-3 ПНЖК, остаток холестерола и триглицеридов и не содержит пептидов или полипептидов.
Стало известно, что значительное количество пептидных биорегуляторов способны восстанавливать функции таких органов, из которых были выделены эти вещества. Такие данные обусловили разви-1-
011616
тие нового направления экспериментальной и клинической медицины - это биорегулирующая терапия,
которая основывается на использовании полученных из органов животных или морских организмов пептидных биорегуляторов при разных заболеваниях, патологических состояниях и старении.
Задача изобретения - разработка способа получения средства для восстановления репродуктивной
функции человека при его расстройствах применением нового способа обработки репродуктивных органов из морских гидробионтов для получения естественного лекарственного препарата на основе комплекса фосфолипидов с ω-3 ПНЖК, регуляторных короткоцепочечных пептидов, нуклеотидных компонентов и аминокислот, которому присущ целый ряд адаптогенных и гормоноподобных свойств и который, таким образом, проявляет положительное влияние при половых расстройствах.
Поставленная задача решается тем, что способ получения лечебного средства (торговая марка
ФIЛОМЕК®) для использования с целью профилактики и лечения нарушений репродуктивной функции
человека и гормональных отклонений в системе гипофиз-гонады включает измельчение сырья репродуктивных органов морских гидробионтов (молочко, икра морских рыб и головоногих моллюсков, в частности кальмаров) в замороженном состоянии, экстракцию сырья этанолом, отделение экстракта от остатков
сырья, фильтрацию, упаривание отделенного этанольного экстракта до окончательного удаления этанола, очищение полученной фракции от триглицеридов, холестерола, эфиров холестерола, и жирных кислот, и углеводородов путем двойного растворения липид-белковой фракции в этаноле при температуре
не более 30°С и фильтрацию раствора от осадка с помощью капроновой микропористой мембраны с размером пор 0,2 мкм, добавление витамина Е не менее 0,05%, упаривание очищенного этанольного раствора и получение субстанции конечного продукта, которая содержит фосфолипиды с ω-3 ПНЖК, регуляторные пептиды, нуклеотидные компоненты и незаменимые аминокислоты (аргинин, глицин), и в комплексе проявляет целый ряд адаптогенных и гормоноподобных свойств, оказывая положительное влияние при половых расстройствах.
Очистку липид-белковой фракции проводят путем перерастворения упаренной фракции в этаноле
при соотношении 100 г сухого остатка/(0,5-1,0) л этилового спирта.
Кроме этого, фильтрацию раствора после перерастворения в этаноле осуществляют с помощью капроновой микропористой мембраны с размером пор 0,2 мкм, одновременно добавляют витамин Е не менее 0,05% и субстанцию выпаривают в вакууме, получая конечный продукт.
Совокупность разработанных авторами схемы, операций и режимов обработки репродуктивных
тканей морских организмов обеспечивает получение средства с новым спектром свойств, что решает
поставленную задачу.
Этот способ характеризуется рядом преимуществ:
использование сырья репродуктивных органов морских организмов позволяет получить значительный процент фосфолипидов с ω-3 ПНЖК и ценных аминокислот, включая аргинин, глицин, которые
входят в состав короткоцепочечных пептидов и пептидных биорегуляторов, обеспечивая восстановление
функции репродуктивных органов;
использование только этилового спирта для очистки экстракта от примесей нейтральных липидов и
некоторых белковых компонентов;
перерастворение экстракта в этаноле при их объемном соотношении (1-10):(1-5) при температуре не
более 30°С обеспечивает извлечение значительного количества нейтральных липидов (холестерола,
триглицеридов, эфиров холестерола и жирных кислот) и сохранность аминокислот, среди которых аргинин и глицин имеют особое значение для лечения расстройств репродуктивной системы;
очистка экстракта от примесей нейтральных липидов позволяет сохранить в субстанции короткоцепочечные регуляторные пептиды и нуклеотиды (уридин, урацил, гипоксантин), которые обладают активными биологическими свойствами в комплексе с ω-3 фосфолипидами (свойства гонадотропина и тестостерона);
благодаря использованию этанола определенной температуры и фильтрации раствора через капроновую микропористую мембрану с размером пор 0,2 мкм удаляются нейтральные липиды и белковые
компоненты, но при этом сохраняются пептиды, аминокислоты и фосфолипиды, которые являются основными действующими компонентами нового препарата;
преимущество нового способа состоит в сокращении количества технологических операций и технологического времени за счет использования одного растворителя - этанола;
полученная субстанция содержит комплекс фосфолипидов с ω-3 ПНЖК, регуляторные пептиды и
нуклеотиды и имеет высокое содержание аргинина, что обеспечивает лечебное действие при расстройствах функции половых органов человека. Полученные пептиды как биологические регуляторы обладают высокой эффективностью и отсутствием побочного действия. Одновременно ω-3 фосфолипиды восстанавливают дефицит жирных кислот в больном организме, который является сопутствующим отрицательным фактором заболеваний репродуктивной системы организма;
подобранное соотношение, температура этанола и время перерастворения остатка с последующей
фильтрацией на капроновой микропористой мембране обеспечивают эффективность полученного лечебного средства.
-2-
011616
Заявленный способ за счет новой схемы обработки репродуктивных тканей морских организмов позволяет выделить высокоактивную субстанцию, которая включает фосфолипиды с ω-3 ПНЖК, короткоцепочечные регуляторные пептиды, ценные аминокислоты - аргинин, глицин и нуклеотидные компоненты (уридин, урацил, гипоксантин), витамин Е. Полученный комплекс биологически активных веществ
отличается рядом гормоноподобных, адаптогенных и антиоксидантных свойств.
Полученная субстанция за счет фосфолипидов с ω-3 ПНЖК имеет мембранопротекторное и иммуномодулирующее свойства, восстанавливает недостаточность ПНЖК в организме - докозагексаеновой и
эйкозапентаеновой - и регулирует содержание арахидоновой кислоты, которая имеет отношение к синтезу простагландинов в организме человека. За счет регуляторных пептидов, которые вмещают аргинин,
полученная субстанция повышает концентрацию тестостерона в плазме крови, стимулирует клетки Лейдига при старении человека. Новый препарат содержит также короткоцепочечные пептиды и нуклеотидные компоненты, которые имеют в своем составе азотистые основания, производные пурина и пиримидина (уридин, урацил, гуанин, гипоксантин). Идентифицированные нуклеотидные компоненты находятся в определенном количественном соотношении и были определены как компоненты-индикаторы при
стандартизации нового препарата.
Основой созданного биологически активного комплекса являются фосфолипиды с ω-3 ПНЖК, нуклеотидные компоненты, связанные с ди- и олигопептидами и свободными аминокислотами, у которых
выявлено высокое содержание аргинина, дефицит которого у крыс приводит к атрофии семенников, а у
мужчин - к снижению количества сперматозоидов. Новый способ устраняет одновременно наибольшее
количество нежелательных липидов (триглицеридов, холестерола, эфиров жирных кислот, холестерола и
углеводородов) в их комплексе с белком, что позволяет выделить субстанцию, которая по составу биологически активных веществ влияет на восстановление нарушений функций репродуктивной системы организма и способствует лечению гиперплазии и бесплодия человека.
В табл. 1, 2 и 3 представлены результаты исследования химического состава разных видов сырья, а
именно определение общих липидов (табл. 1), количественное содержимое фосфолипидов (табл. 2) и
основных жирных кислот в составе фосфолипидов из разных источников морского происхождения (табл. 3),
которые свидетельствуют, что состав сырья может влиять на выход конечного продукта и на показатели
содержания фосфолипидов и жирных кислот, имеющих важное значение для репродуктивной системы
организма.
Таблица 1
Содержание общих липидов, неорганического фосфора и фосфолипидов
в сырье из морских организмов (моллюсков и рыбы)
-3-
011616
Таблица 2
Количественное содержание фосфолипидов, выделенных из сырья рыб и кальмаров
Таблица 3
Содержание основных жирных кислот в составе фосфолипидов
из разных источников морского происхождения
-4-
011616
Главными фосфолипидами лечебного средства являются фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин
(табл. 4), которые содержат наибольшее количество эсенциальных биологически активных жирных кислот - эйкозапентаеновой и докозагексаеновой (табл. 3).
Таблица 4
Химический состав лечебного средства из гонад морских организмов
Анализ субстанции лечебного средства (табл. 5) свидетельствует о значительном содержании неорганического фосфора и азота, что указывает на присутствие фосфолипидов, аминокислот и пептидов.
Достоверность субстанции определяется качественным анализом нуклеотидных составляющих и
фосфолипидов, аминокислот и неорганического фосфора в субстанции. В результате исследования аминокислотного состава субстанции лечебного средства (табл. 6) было установлено процентное соотношение аминокислот в лечебном средстве, которое показало, что в состав субстанции входят свободные
аминокислоты в определенном количестве, а при гидролизе субстанции обнаружено содержание аминокислот, которые входят в состав ди-, трипептидов (свободные аминокислоты - 67,7%, связанные - 32,3%).
Таблица 5
Анализ субстанции лечебного средства «ФIЛОМЕК»
-5-
011616
Таблица 6
Содержание аминокислот в 1 мг лечебного средства «ФIЛОМЕК»
Сущность изобретения иллюстрируется конкретными примерами его осуществления и результатами исследования полученного конечного продукта - субстанции препарата, которую после анализа капсулируют (примеры 1-6).
Пример 1.
100 г гонад (молочко кальмара, селедки, скумбрии) измельчают в замороженном состоянии на мясорубке, заливают 10 объемами этилового спирта, перемешивают 3 ч в реакторе с мешалкой, дальше экстракт фильтруют, выпаривают в вакууме до полного удаления спирта. Полученную фракцию перерастворяют в этаноле при температуре 25-30°С при соотношении 100 г сухого остатка/0,5 л этилового спирта,
этанольный раствор фильтруют через капроновую микропористую мембрану с размером пор 0,2 мкм для
удаления нерастворимого осадка и добавляют витамин Е в количестве не менее 0,05%, этанольный раствор с витамином Е упаривают в вакууме и получают субстанцию, которую капсулируют. Выход: 8,5 г
(8,5%).
Пример 2.
100 г икры кальмара (скумбрии, сельди) измельчают в замороженном состоянии на мясорубке, заливают 10 объемами этилового спирта, перемешивают 3 ч в реакторе с мешалкой, далее экстракт фильтруют, упаривают в вакууме до полного удаления спирта. Полученную фракцию дважды перерастворяют
в этаноле при температуре 30-35°С при соотношении 100 г сухого остатка/1,0л этилового спирта, далее
этанольный раствор фильтруют через капроновую микропористую мембрану с размером пор 0,2 мкм для
удаления нерастворимого осадка, добавляют витамин Е в количестве не менее 0,05%, этанольный раствор с витамином Е выпаривают в вакууме и получают субстанцию, которую капсулируют. Выход: 8,8 г
(8,8%).
Пример 3.
100 г икры и молочка кальмара (сельди, скумбрии) измельчают в замороженном состоянии на мясорубке, заливают 10 объемами этилового спирта, перемешивают 3 ч в реакторе с мешалкой, далее экстракт фильтруют, выпаривают в вакууме до полного удаления спирта. Полученную фракцию перерастворяют в этаноле при температуре 25-30°С при соотношении 100 г сухого остатка/0,75 л этилового
спирта, далее этанольный раствор фильтруют через капроновую микропористую мембрану с размером
-6-
011616
пор 0,2 мкм для удаления нерастворимого осадка, добавляют витамин Е в количестве не менее 0,05%,
этанольный раствор с витамином Е упаривают в вакууме и получают субстанцию, которую капсулируют.
Выход: 9,2 г (9,2%).
Пример 4. Исследование биологических свойств и специфической биологической активности полученного лечебного средства.
Полученное лечебное средство содержит фосфолипиды с ω-3 ПНЖК в структуре, свободные аминокислоты аргинин, глицин и в составе ди- и трипептидов, нуклеотидные компоненты (уридин, урацил,
гипоксантин), витамин Е, которые в комплексе имеют адаптогенные и гормоноподобные свойства, подобно препаратам "Пантокрин" и "Женьшень".
Так как средство получено из репродуктивных органов морских моллюсков и рыб в период полового созревания, вещества, которые образуются в половых железах, тесно связаны с гипофизарно-гонадной
системой. Таким образом, репродуктивные органы морских организмов содержат, кроме важных компонентов, фосфолипидов с эссенциальными ПНЖК в структуре, также аминокислоты, короткоцепочечные
пептиды, нуклеотиды, гормоны и гормоноподобные соединения, которые в комплексе проявляют положительное действие при расстройствах функций репродуктивных органов.
Эксперименты проводили на взрослых и старых крысах-самцах. Подопытные животные получали в
эксперименте субстанцию лечебного средства в количестве 5 мг на 100 г веса, контрольная группа получала физиологический раствор. Установлено, что у старых крыс (контрольная группа) концентрация тестостерона в плазме крови значительно ниже, чем у взрослых. Лечебное средство незначительно повышает концентрацию тестостерона в плазме крови взрослых крыс. В то же время наблюдается достоверное
повышение концентрации тестостерона у старых крыс. Таким образом, у старых животных, которые получали лечебное средство, отмечается значительная активация синтеза тестостерона и заметно возрастает количество клеток Лейдига, которые содержат в цитоплазме большое количество крупных четко определенных структур кристаллоидов. Заметное увеличение количества интенсивно производящих гормон
клеток Лейдига убедительно доказывает, что препарат стимулирует синтез тестостерона в клетках Лейдига старых самцов (табл. 7).
Таблица 7
Влияние лечебного средства «ФIЛОМЕК» на концентрацию тестостерона
в крови взрослых и старых крыс (26-27 месяцев) (радиоиммунологический метод)
*р<0,001
Пример 5. Определение влияния лечебного средства «ФIЛОМЕК» на репродуктивную способность
стареющих самцов крыс.
Исследование проводили на модели ускоренного старения под влиянием рентгеновского облучения. Раствор субстанции полученного средства в масле вводили per os облученным взрослым животным
на протяжении 30 суток, старым крысам без облучения на протяжении 60 суток в количестве 5 мг на 1 кг
веса тела. Контрольные группы - взрослые самцы без облучения и старые - получали раствор масла. Исследовали следующие показатели: содержимое тестостерона в плазме крови, вес тестикул и их морфологические показатели, а также фертильную способность самцов после спаривания с интактными самками.
В результате исследований было найдено, что концентрация тестостерона снижалась при облучении у
старых животных. Кроме этого, при введении облученным самцам исследуемого средства было обнаружено повышение деления сперматогонов и увеличение популяции сперматопитов. В семьях облученных
самцов процент оплодотворения был в 2 раза меньшим по сравнению с группой, которая получала лечебное средство. Таким образом, введение лечебного средства улучшало репродуктивную способность
самцов. При исследовании группы старых самцов, которым на протяжении 2 месяцев вводили получен-7-
011616
ное средство, было отмечено увеличение в 2 раза относительного веса тестикул и снижение уровня тестостерона. Таким образом, исследуемое лечебное средство «ФIЛОМЕК» влияет на репродуктивную систему, является эффективным при устранении нарушений половой функции и способствует оплодотворению. Кроме этого, средство предотвращает развитие гиперплазии клеток (табл. 7, 8).
Таблица 8
Влияние лечебного средства «ФIЛОМЕК» на репродуктивную способность стареющих крыс
х
р<0,050
p<0,001 по отношению к норме
xx
Пример 6. Исследование влияния лечебного средства при развитии нарушений репродуктивной
системы организма, вызванных недостаточностью плазмалогенов и полиненасыщенных ω-3 и ω-6 жирных кислот.
Известно, что продуцирование простагландинов зависит от арахидоновой кислоты как предшественника биосинтеза простагландинов. Дефицит ненасыщенных жирных кислот ведет к нарушению фертильности в организме. Следует отметить, что введение простагландинов не ликвидирует проявления
дефицита ненасыщенных жирных кислот. Нами показано, что снижение уровня эссенциальных жирных
кислот, таких как арахидоновая и докозагексаеновая, связано с развитием гиперплазии. При этом выявлено специфическое снижение уровней жирных кислот плазмалогенных фосфолипидов репродуктивных
органов (фигура, табл. 9).
-8-
011616
Таблица 9
Содержание жирных кислот плазмалогенных фосфолипидов микросом маток крыс
при условии недостаточности ПНЖК и при введении лечебного средства «ФIЛОМЕК»
При исследовании влияния лечебного средства «ФIЛОМЕК» на содержание плазмалогенных фосфолипидов и жирных кислот микросом матки крыс было показано, что недостаточность ПНЖК в организме крыс приводит к значительному снижению плазмалогенных фосфолипидов в микросомах матки.
Использование заявляемого лечебного средства нормализует количество плазмалогенных фосфолипидов,
а также количество арахидоновой (АК), линоленовой кислот в 2 раза и докозагексаеновой (ДГК) более
чем в 10 раз.
Найденные изменения АК и ДГК связаны с синтезом простагландинов, а также биосинтезом плазмалогенов, а их недостаток может быть восстановлен с помощью разработанного лечебного средства.
Таким образом, можно допустить, что лечебное средство может быть использовано для лечения гиперплазии эндометрия и при развитии других пролиферативных процессов в организме человека.
Таким образом, предложенное изобретение решает задачу получения из гонад морских организмов
средства, в состав которого входят фосфолипиды с ω-3 ПНЖК (табл. 3), короткоцепочечные регуляторные пептиды, незаменимые аминокислоты - аргинин, глицин и нуклеотидные компоненты (уридин, урацил, гипоксантин), витамин Е. Полученный препарат из биологически активных веществ имеет целый
ряд гормоноподобных, адаптогенных и антиоксидантных свойств и может быть применен для восстановления функции репродуктивной системы человека при половых расстройствах и при лечении бесплодия.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения средства для профилактики и лечения расстройств репродуктивной системы
человека или животных, отличающийся тем, что сырье репродуктивных органов морских организмов в
-9-
011616
период их полового созревания в замороженном состоянии измельчают, после чего измельченное сырье
экстрагируют этиловым спиртом, полученный экстракт упаривают до полного удаления спирта, а сухой
остаток дважды перерастворяют в этиловом спирте при соотношении 100 г сухого остатка/(0,5-1,0) л
этилового спирта, после чего полученный экстракт фильтруют и добавляют витамин Е в количестве не
менее 0,05 мас.% от массы сухого остатка, взятого для перерастворения, и полученный фильтрат упаривают до полного удаления спирта.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что перерастворение сухого остатка в этиловом спирте осуществляют в течение 30 мин при температуре этилового спирта не более 30°С.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что фильтрацию экстракта после растворения остатка осуществляют с помощью капроновой микропористой мембраны с размером пор 0,2 мкм.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что конечный продукт капсулируют в количестве 0,5-1,0 г.
5. Средство для профилактики и лечения расстройств репродуктивной системы человека или животных, отличающееся тем, что оно получено способом по пп.1-4.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 10 -