1 004881 2 Данная заявка на изобретение утверждает

1
Данная заявка на изобретение утверждает
преимущества предварительной заявки США №
60/045255, зарегистрированной 28 апреля 1997 г.
Область изобретения
Данное изобретение относится к области
медицины, в частности касается лечения сосудистых патологий с помощью активированного
протеина С. Более точно, настоящее изобретение относится к композициям активированного
протеина С человека.
Обоснование изобретения
Протеин С является сериновой протеазой и
естественным антикоагулянтом, который принимает участие в регуляции гомеостаза, инактивируя факторы Va и VIIIa системы свертывания
крови. In vivo человеческий протеин С синтезируется преимущественно клетками печени в
виде одиночного полипептида, состоящего из
461 аминокислотного остатка. Эта одноцепочечная молекула-предшественник подвергается
многочисленным посттрансляционным модификациям, включая 1) отщепление сигнальной
последовательности из 42 аминокислот, 2) протеолитическое удаление остатка лизина в положении 156 и остатка аргинина в положении 157
одноцепочечного зимогена с формированием
двухцепочечной молекулярной формы зимогена
(т.е. легкой цепи из 155 аминокислотных остатков, связанную дисульфидным мостиком с тяжелой цепью, которая включает в себя 262 аминокислотных остатка и содержит сериновую
протеазу), 3) витамин К-зависимое карбоксилирование девяти остатков глутаминовой кислоты,
кластеризованных в пределах первых аминокислот легкой цепи, в результате чего образуются девять остатков гамма-карбоксиглутаминовой кислоты, и 4) прикрепление углеводных
цепей по четырем сайтам (один сайт на легкой и
четыре сайта на тяжелой цепи). Тяжелая цепь
имеет в своем составе хорошо охарактеризованную триаду сериновых протеиназ Асп 257, Гис
211 и Сер 360. В конечном итоге циркулирующий двухцепочечный зимоген активируется in
vivo тромбином на фосфолипидной поверхности
в присутствии ионов кальция. В результате активации с N-конца тяжелой цепи удаляется додекапептид с формированием активированного
протеина С (аПС), который обладает ферментативной активностью.
Помимо ферментативной активности аПС
в пределах системы свертывания крови, этот
белок может самопроизвольно деградировать с
уменьшением функциональной активности в
качестве антикоагулянта. Заявители обнаружили очень важный метаболический путь деградации аПС. Аутодеградация N-конца легкой цепи
может привести к разрыву цепи по обе стороны
от гистидина в положении 10. Таким образом, в
результате такой деградации образуются два
неактивных продукта: дис-(1-9)-инактивированный протеин, у которого девять N-концевых
остатков легкой цепи были удалены, дис-(1-10)-
004881
2
инактивированный протеин С, у которого были
удалены первые десять N-концевых остатков
легкой цепи. Данный, ранее неизвестный метаболический путь деградации протеина С ведет к
утрате антикоагулянтной активности в результате потери критически важных остатков глутаминовой кислоты в положениях 6 и 7. Таким
образом, минимальный уровень продуктов аутодеградации активированного протеина С, дис(1-9)- и дис-(1-10)-инактивированного протеина
С, очень важен для получения высокоэффективной композиции протеина С высокой степени
чистоты. Указанные продукты деградации протеина С ранее были неизвестны, их очень трудно, если вообще возможно, удалить при помощи
обычных методов очистки. Далее, заявители
обнаружили, что растворимость аПС в твердом
состоянии значительно увеличивается в присутствии наполнителя определенной группы.
Очевидно, что сведение к минимуму деградации активированного протеина С как в
растворе, так и в лиофилизированном (твердом)
состоянии крайне желательно. Соответственно,
наше открытие позволяет приготовить высокоэффективные композиции активированного
протеина С высокой степени чистоты, которые
были бы презентабельны на рынке фармакологических препаратов.
В данном изобретении описано приготовление композиций активированного протеина С
с улучшенными свойствами и значительно
уменьшенным содержанием продуктов аутодеградации, таких как дис-(1-9)- и дис-(1-10)инактивированные формы легкой цепи активированного протеина С. Поэтому предлагаемые
лекарственные формы пригодны для назначения
больным в случае необходимости.
Настоящее изобретение обеспечивает стабильную лиофилизированную форму, в состав
которой входят активированный протеин С и
наполнитель из следующей группы веществ:
маннит, трегалоза, рафиноза, сахароза или их
сочетания.
Настоящее изобретение обеспечивает стабильную лекарственную форму, в состав которой входят приблизительно 2,5 мг/мл активированного протеина С, приблизительно 15 мг/мл
сахарозы и приблизительно 20 мг/мл NaCl. Далее настоящее изобретение обеспечивает лекарственную форму следующего состава: приблизительно 5 мг/мл активированного протеина С,
приблизительно 30 мл/мг сахарозы и приблизительно 38 мг/мл NaCl.
Настоящее изобретение обеспечивает процесс приготовления лекарственной формы, в
состав которой входят активированный протеин
С и наполнитель из следующей группы веществ:
маннит, трегалоза, рафиноза, сахароза и их сочетания.
Настоящее изобретение обеспечивает лекарственную форму разовой дозы, которая
представляет собой упаковку с разовой дозой
3
препарата, содержащей компоненты в следующем весовом соотношении: приблизительно 1
часть активированного протеина С, приблизительно 7,6 частей соли и приблизительно 6 частей наполнителя.
Далее, настоящее изобретение обеспечивает лечение заболеваний, связанных с внутрисосудистым свертыванием крови, при которых
назначается лекарственная форма активированного протеина С, описанная в данном изобретении.
Подробное описание изобретения
В целях настоящего изобретения, согласно
данной формуле изобретения, вводят следующие термины.
АПС, или активированный протеин С, означает
рекомбинантный или выделенный из плазмы крови активированный протеин С. Термин
аПС включает в себя и подразумевает предпочтительно активированный протеин С человека,
хотя может обозначать и другие формы и производные, обладающие протеолитической, амидолитической и эстеролитической, а также биологической (антикоагулянтной и профибринолитической) активностью протеина С. Примеры
производных протеина С были описаны Gelitz et
al. Патент США № 5453373 и Foster et al., патент США № 5516650; полная концепция этих
авторов включена в данное изобретение путем
цитирования.
АРТТ обозначает активированное парциальное тромбопластиновое время.
Р-чПС означает зимоген рекомбинантного
протеина С человека.
Р-аПС означает рекомбинантный активированный протеин С, полученный путем активации зимогена протеина С in vitro или in vivo
или в результате прямой секреции активированной формы протеина С прокариотическими или
эукариотическими клетками, а также трансгенными животными, включая, например,
секретированный клетками почки человека
(линия 293) зимоген с последующей очисткой и
активацией способами, известными специалистам и описанными Yan, патент США №
4981952 и Cottingham, WO № 97/20043; полная
концепция этих авторов включена в данное изобретение путем цитирования.
Непрерывная инфузия означает постоянное, в значительной степени непрерывное, введение раствора в кровеносный сосуд в течение
обозначенного периода времени.
Болюсная инъекция означает однократную
инъекцию определенного количества лекарственного препарата (которое называется болюсом).
"Пригоден для назначения" означает лиофилизированную лекарственную форму или
раствор, который может назначаться больному
при лечении.
004881
4
"Зимоген" означает зимоген протеина С, в
данной заявке представляет собой секретированные одно- или двухцепочечные реактивные
формы протеина С.
"Фармацевтически приемлемый буфер"это понятие, известное в фармацевтике. Фармацевтически приемлемые буферы включают в
себя фосфат натрия, цитрат натрия, ацетат натрия или трис.
Активированный протеин С является антитромботическим препаратом с более широким
терапевтическим индексом, чем применяемые в
настоящее время антикоагулянты, например,
гепарин или пероральные антикоагулянты гидрокумаринового ряда. В качестве антитромботического препарата аПС оказывает глубокий
эффект при лечении широкого спектра приобретенных заболеваний, связанных с внутрисосудистым свертыванием крови, включая тромботический инсульт, тромбоз глубоких вен, легочную эмболию, тромбоз периферических артерий, сердечную эмболию или эмболию периферических артерий, острый инфаркт миокарда,
диссеминированное внутрисосудистое свертывание, острые пре- и посткапиллярные окклюзии, возникающие в том числе и при трансплантациях или тромбозе сосудов сетчатки.
Настоящее изобретение связано с композициями активированного протеина С. Желательна такая композиция, которая представляла
бы собой стабильный лиофилизированный продукт высокой степени чистоты, который содержит активированный протеин С и наполнитель
из следующей группы веществ: маннит, трегалоза, рафиноза и сахароза.
Лиофилизированный продукт восстанавливается растворением с помощью соответствующего разбавителя, такого как стерильная
вода или стерильный изотонический раствор.
Предпочтительно, чтобы рН полученного раствора варьировал в пределах (~5,5)-(~6,5).
В данной композиции протекают сложные
молекулярные взаимодействия между активированным протеином С, буфером, концентрацией
соли, рН, температурой и наполнителями, причем вклад каждого фактора в стабильность композиции непредсказуем. После ресуспендирования, в результате снижения степени аутодеградации, лиофилизированные композиции данного изобретения позволяют получить стабильный
активированный протеин С с ферментативной
активностью. Заявителям удалось значительно
снизить уровни дис-(1-9)- и дис-(1-10)инактивированного аПС. Как правило, уровень
дис-(1-9)- и дис-(1-10)-инактивированных аПС
составляет менее 10% продуктов аутодеградации. Предпочтительно, чтобы уровни дис-(1-9)и дис-(1-10)-инактивированных аПС составляли
менее 8% продуктов аутодеградации. Более
предпочтительно, чтобы уровни дис-(1-9)- и
дис-(1-10)-инактивированных аПС составляли
менее 5% и еще более предпочтительно, чтобы
5
они составляли менее 3% продуктов деградации. Такая стабильность достигается в результате тщательного контроля за условиями процесса
приготовления композиции, а также путем добавления сахарозы, трегалозы, рафинозы или
маннита. Интересен тот факт, что другие наполнители, такие как гидроксиэтилкрахмал и глицерин, не позволяют добиться необходимой
стабильности и фармацевтической качественности препарата.
Наполнители, которые применяются в
рамках данного изобретения, позволяют получить фармацевтически качественную композицию со стабильными внешними характеристиками, которая легко растворяется в соответствующем растворителе. После ресуспендирования предлагаемая композиция остается стабильной в течение 24-48 ч при комнатной температуре. Такая высокая степень стабильности ранее
была недостижима.
В предлагаемой композиции активированного протеина С предпочтительными наполнителями являются сахароза, трегалоза и рафиноза. Более предпочтительными являются сахароза и рафиноза, а наиболее предпочтительным
наполнителем является сахароза. Количество
наполнителя в композиции составляет 1-10 частей на 1 часть аПС по весу. Более того, концентрация наполнителя в композиции является
важным параметром для лиофилизации. Оптимальная концентрация наполнителя зависит от
количества аПС и природы наполнителя. Предпочтительная концентрация сахарозы в растворе
для лиофилизации составляет 10-40 мг/мл. Более предпочтительна концентрация сахарозы 1530 мг/мл. Наиболее предпочтительная концентрация сахарозы в растворе для лиофилизации 15 мг/мл при приготовлении лекарственной
формы с содержанием аПС 2,5 мг/мл. Наиболее
предпочтительная концентрация сахарозы в
растворе для лиофилизации - 30 мг/мл при приготовлении композиции с содержанием аПС 5,0
мг/мл. При добавлении заявляемого наполнителя повышается химическая и физическая стабильность композиции активированного протеина С.
Перед лиофилизацией и растворением
лиофилизированной формы, для максимального
подавления аутодеградации в растворенном состоянии предпочтительно поддерживать рН раствора в пределах (~5,5)-(~6,5). Предпочтительное значение композиции (~5,6)-(~6,4). Более
предпочтительное значение композиции (~5,7)(~6,3). Еще более предпочтительное значение
композиции (~5,8)-(~6,2). Наиболее предпочтительное значение композиции (~5,9)-(~6,1). Самое предпочтительное значение композиции
~6,0.
Для обеспечения эффективного контроля
рН раствор аПС должен содержать фармацевтически приемлемый буфер.
004881
6
Соответственно, при лиофилизации наличие такого буфера в композиции оптимально и
предпочтительно. Буфером может быть трисацетат, цитрат натрия и фосфат натрия. Более
предпочтительны буферные системы, включающие в себя цитрат натрия и фосфат натрия.
Наиболее предпочтительной буферной системой
является цитрат натрия. Предпочтительная молярность буферной системы составляет 10-50
мМ. Более предпочтительная молярность буферной системы составляет 10-20 мМ. Наиболее
предпочтительная молярность буферной системы - 40 мМ. Специалист согласится с тем, что
существует большое количество доступных буферных систем, которые могут быть использованы в композициях согласно изобретению.
Аналогично, при лиофилизации и восстановлении ионная сила является критическим
параметром, обеспечивающим стабильность
раствора. Как правило, ионная сила определяется концентрацией соли в растворе. В фармацевтике для приготовления растворов с определенной ионной силой обычно используется хлорид
калия (КСl) или хлорид натрия (NaCl), но выбор
не ограничивается этими веществами. В данном
изобретении предпочтительной солью является
хлорид натрия. В процессе лиофилизации концентрация соли должна быть достаточно высокой для того, чтобы обеспечить кристаллизацию
соли на этапе замораживания в цикле лиофилизации. Предпочтительно, чтобы концентрация
хлорида натрия была выше 150 мМ. Более предпочтительно, чтобы концентрация хлорида натрия в растворе для замораживания была в пределах 150-1000 мМ. Для композиции с содержанием аПС 2,5 мг/мл предпочтительной концентрацией хлорида натрия в растворе для замораживания является 150-650 мМ. Еще более предпочтительна концентрация хлорида натрия в
растворе для замораживания 250-450 мМ. Наиболее предпочтительная концентрация хлорида
натрия в растворе для замораживания составляет 300-400 мМ. Для композиции с содержанием
аПС 2,5 мг/мл самая предпочтительная концентрация хлорида натрия в растворе для замораживания составляет 325 мМ.
Аналогично, для композиции с содержанием аПС 5,0 мг/мл предпочтительная концентрация хлорида натрия в растворе для замораживания составляет 150-1000 мМ. Более предпочтительна концентрация хлорида натрия в растворе
для замораживания 250-750 мМ. Еще более
предпочтительная концентрация хлорида натрия
в растворе для замораживания составляет 400700 мМ. Для композиции с содержанием аПС
5,0 мг/мл самая предпочтительная концентрация
хлорида натрия в растворе для замораживания
составляет 650 мМ.
Весовое соотношение компонентов в композиции,
пригодной
для
лиофилизации
(аПС:соль:наполнитель), является важным фактором процесса лиофилизации. Данное соотно-
7
шение варьирует в зависимости от концентрации аПС, концентрации и природы соли, а также концентрации и природы наполнителя. Специалист может легко определить предпочтительное соотношение компонентов при помощи
существующих методов и методов, описанных в
примере № 1. В частности, предпочтительно
следующее соотношение компонентов: одна
часть активированного протеина С приблизительно к 7-8 частям соли и приблизительно к 5-7
частям наполнителя. Соотношение одна часть
активированного протеина С: приблизительно
7,5-8 частей соли: приблизительно 5,5-6,5 частей наполнителя более предпочтительно. Наиболее предпочтительно такое соотношение: одна часть активированного протеина С: приблизительно 7,6 частей соли: приблизительно 6 частей наполнителя.
Предпочтительной солью является хлорид
натрия в концентрации 325 мМ (для композиции, содержащей аПС 2,5 мг/мл аПС) и 650 мМ
(для композиции с содержанием аПС 5,0 мг/мл)
и весовом соотношении с сахарозой 1,3:1. Эта
концентрация достаточно высока, чтобы обеспечить кристаллизацию соли при замораживании и с наибольшей степенью вероятности
обеспечивает аморфность смеси аПС с сахарозой и цитратом, которая затем может быть лиофилизована. Таким образом, ионная сила NaCl
при предпочтительных концентрациях 325 и 650
мМ обеспечивает стабильность лекарственной
формы в процессе лиофилизации.
В данном изобретении также описан процесс для приготовления стабильной лиофилизированной лекарственной формы, который представляет собой лиофилизацию раствора, включающего в себя активированный протеин С и
наполнитель из следующей группы веществ:
маннит, трегалоза, рафиноза или их сочетание.
Настоящее изобретение также обеспечивает
способ приготовления стабильной лиофилизированной композиции, который представляет
собой лиофилизацию раствора, содержащего 2,5
мг/мл активированного протеина, приблизительно 15 мг/мл сахарозы, приблизительно 19
мг/мл NaCl и натрий-цитратный буфер с рН более 5,5, но менее 6,5. Далее, настоящее изобретение обеспечивает способ получения стабильной лиофилизированной композиции, который
представляет собой лиофилизацию раствора,
содержащего 5,0 мг/мл активированного протеина, приблизительно 30 мг/мл сахарозы, приблизительно 38 мг/мл NaCl и натрий-цитратный
буфер с рН более 5,5, но менее 6,5.
Настоящее изобретение обеспечивает лекарственную форму разовой дозы, которая
представляет собой упаковку, содержащую стабильную лиофилизированную композицию, в
состав которой входят активированный протеин
С и наполнитель, выбираемый из группы, состоящей из маннита, трегалозы, рафинозы или
их сочетаний. Далее, настоящее изобретение
004881
8
обеспечивает способ лечения заболеваний, связанных с внутрисосудистым свертыванием крови, с назначением описанной композиции.
Данный препарат аПС назначается предпочтительно парентерально для того, чтобы
обеспечить поступление эффективной формы
аПС в кровоток, что достигается введением соответствующей дозы в виде непрерывной инфузии в течение приблизительно от 1 до 48 ч. При
этом количество введенного аПС составляет
приблизительно от 0,01 до 0,05 мг/кг/ч. Альтернативно данная форма аПС может быть назначена путем введения части соответствующей
часовой дозы в виде болюсной инъекции в течение приблизительно 5-30 мин, затем следует
непрерывная инфузия соответствующей дозы в
течение приблизительно 23-47 ч, в результате
чего вводится соответствующая доза в течение
24-48 ч.
Примеры, которые приводятся ниже, иллюстрируют данное изобретение и показывают
его в практическом аспекте. Сфера изобретения
не должна толковаться в рамках данных примеров.
Приготовление № 1. Получение протеина
С человека.
Рекомбинантный протеин С человека (раПС) был синтезирован клетками почки человека линии 293 с использованием методов, хорошо известных специалистам; такие методы были описаны Yan, патент США № 4981952, полная концепция этих авторов включена в данное
изобретение путем цитирования. Ген, кодирующий протеин С человека, был обнаружен и
запатентован Bang et al., патент США №
4775624; полная концепция этих авторов включена в данное изобретение путем цитирования.
Плазмида, которая используется для экспрессии
гена протеина С человека в клетках 293, представляет собой плазмиду hLPC, которая была
запатентована Bang et al., патент США №
4992373; ссылка на данное изобретение приводится. Конструирование плазмиды pLPC также
описано в Европейской патентной публикации
№ 0445939 и в статье Grinner et al., Biotechnology 5:1189-1192, Bang et al., патент США №
4775624; полная концепция этих авторов включена в данное изобретение путем цитирования.
Кратко: данную плазмиду вводили в клетки 293
методом трансфекции, затем идентифицировали
стабильные трансформанты, переводили их в
субкультуру и растили в среде без сыворотки.
После ферментативной обработки среду, не содержащую клеток, получали методом микрофильтрации.
Протеин С человека выделяли из культуральной жидкости модифицированным Yan,
патент США № 4981952. Культуральную среду
просветляли с помощью 4 мМ ЭДТА и пропускали через анионообменную смолу (Fast-Flow Q,
Pharmacia). После промывания колонки 20 мМ
трис и 200 мМ NaCl, pH 7,4 (4 объема колонки)
9
и 20 мМ трис и 150 мМ NaCl pH 7,4 (2 объема
колонки), связанный зимоген рекомбинантного
протеина С элюировали 20 мМ трис и 150 мМ
NaCl и 10 мМ СаСl2, рН 7,4. Степень очистки
элюированного протеина С составляла более
95% по данным электрофореза в геле с ДСН.
В ходе дальнейшей очистки протеин переводили в 3 М NaCl и пропускали через колонку
с гидрофобной смолой (Toyopearl phenyl 650 М,
TosoHaas), уравновешенную буфером следующего состава: 20 мМ трис, 3 М NaCl, 10 мМ
СаСl2, рН 7,4. Колонку промывали 2 объемами
уравновешивающего буфера без СаС2, и рекомбинантный протеин С человека элюировали 20
мМ трис, рН 7,4.
Элюированный протеин готовили к активации путем удаления остаточного кальция.
Рекомбинантный протеин С человека пропускали через металлоаффинную колонку (Chelex100, Bio-Rad) и адсорбировали на ионообменнике (Fast Flow, Pharmacia). Обе колонки соединяли последовательно и уравновешивали 20 мМ
трис, 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, рН 7,4. После
загрузки белка, колонку с Chelex-100 промывали одним объемом этого буфера и отсоединяли
от колонки с ионообменником. Ионообменную
колонку промывали 3 объемами уравновешивающего буфера, после чего белок элюировали
0,4 М NaCl, 20 мМ трис ацетат, рН 6,5.
Концентрацию рекомбинантного протеина
С человека и рекомбинантного активированного
протеина С в растворе измеряли в УФ-свете при
длине волны 280 нм, коэффициент экстинкции
Е0,18=1,81 или 1,83 соответственно.
Приготовление № 2. Активация рекомбинантного протеина С человека.
Бычий тромбин иммобилизировали на активированной СН-сефарозе 4В (Pharmacia) в
присутствии 50 мМ HEPES, рН 7,5 при 4°С. Реакцию проводили на колонке с сефарозой; концентрация тромбина составляла приблизительно
5000 единиц/мл сефарозы. Циркуляция раствора
тромбина через колонку длилась около 3 ч, затем добавляли 2-аминоэтанол (АМЭ) до концентрации 0,6 мл/л циркулирующего раствора.
Раствор с АМЭ циркулировал в течение дополнительных 10-12 ч для обеспечения полного
блокирования непрореагировавших аминов на
сефарозе. После блокирования сефарозу с иммобилизированным тромбином промывали 10
объемами 1 М NaCl, 20 мМ трис, рН 6,5 для того, чтобы удалить неспецифически связанный
протеин, уравновешивали буфером для активации и использовали в реакции активации.
Очищенный р-чПС переводили в 5 мМ
ЭДТА (для хелатирования остаточного кальция)
и разбавляли до концентрации 2 мг/мл при помощи 20 мМ трис, рН 7,4 или 20 мМ трис ацетат, рН 6,5. Скорость пропускания через колонку подбирали так, чтобы обеспечить контакт
между р-чПС и иммобилизованным тромбином
в течение 20 мин. Фильтрат собирали и немед-
004881
10
ленно определяли его амидолитическую активность. Если фильтрат обладал специфической
(амидолитической) активностью, сравнимой с
установленным стандартом для аПС, его вновь
пропускали через колонку с тромбином для
полной активации р-чПС. Затем следует разбавление в соотношении 1:1 20 мМ буфером при
рН 7,4 или 6,5 для того, чтобы сохранить аПС в
более низких концентрациях аПС до следующего этапа обработки.
Для того чтобы удалить примеси тромбина
из материала, содержащего аПС, его пропускали
через ионообменную колонку (Fast Flow Q,
Pharmacia), уравновешенную буфером для активации либо 20 мМ трис, рН 7,4 либо 20 мМ
трис-ацетат, рН 6,5 со 150 мл NaCl. В данных
условиях тромбин не взаимодействует с анионообменной смолой и проходит через колонку в
фильтрате, используемом для нанесения образца. После загрузки аПС на колонку, ее промывали 2-6 объемами 20 мМ уравновешивающего
буфера, после чего проводили поэтапную элюцию связанного аПС с использованием 0,4 М
NaCl либо в 20 мМ трис-ацетате, рН 6,5 мМ
трис, рН 7,4. Увеличение объема элюирующего
буфера обеспечивает более полное удаление
додекапептида с колонки. Элюированный материал хранили в виде замороженного раствора
(-20°С) или лиофилизированого порошка.
Антикоагулянтную активность активированного протеина С определяли по увеличению
времени свертывания крови в тесте активированного парциального тромбопластинового
времени АРТТ. Для построения стандартной
кривой готовят образцы аПС в буфере для разведения (1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина [БСА] со степенью чистоты "для радиоиммунологического анализа", 20 мМ трис, рН
7,4, 150 мМ NaCl, 0,02% NaN3); концентрацию
аПС варьировали от 125 до 1000 мг/мл и готовили несколько разведений в этих пределах
концентрации. В каждую кювету с образцом
добавляли по 50 мкл холодной лошадиной
плазмы и 50 мкл восстановленного реагента для
определения активированного парциального
тромбопластинового времени (АРТТ Reagent,
Sigma) и инкубировали 5 мин при 37°С. После
инкубации в каждую кювету добавляли по 50
мкл соответствующего образца. При определении базального времени свертывания, вместо
образца или стандарта добавляли буфер для разведения. Таймер фиброметра (СоА Screener Hemostatis Analyzer, American Labor) запускали
одновременно с добавлением CaCl (50 мкл) при
37°С к каждому образцу или стандарту. Концентрацию активированного протеина С в образцах рассчитывали при помощи уравнения
линейной регрессии стандартной кривой. Результаты измерения времени свертывания, приведенные в данной заявке, являются средним
значением, как минимум для трех повторов,
11
включая образцы для построения стандартной
кривой.
Пример 1. Композиция активированного
протеина С.
Активированный протеин С человека был
получен, как описано в разделах "приготовление
№ 1" и "приготовление № 2". Композиции активированного протеина С были проанализированы в плане обработки в стандартном лиофилизаторе. Для измерения двух параметров, которые определяют возможность обработки композиции в стандартном лиофилизаторе, применяли
методы лиофилизационной микроскопии и
дифференциальной сканирующей калориметрии
(ДСК). Метод лиофилизационной микроскопии
используется для определения температуры
коллапса замороженных растворов, подвергаемых лиофилизации. Метод ДСК используется
для определения температуры стеклования (Тс)
замороженного раствора. Показатели температуры коллапса и стеклования являются важными параметрами расчета безопасных верхних
температурных пределов, которые могут быть
использованы для лиофилизации. Результаты
лиофилизационной микроскопии дополняют
данные о температуре стеклования, полученные
методом ДСК. Температура коллапса выше
-40°С является оптимальной для образцов, которые будут лиофилизированы в стандартной
установке.
Соотношение между аПС, сахарозой и
хлоридом натрия (в 10 или 20 мМ цитратном
буфере) является важным параметром, влияющим на температуру коллапса и температуру
стеклования. При лиофилизации в стандартной
установке, концентрация хлорида натрия должна быть достаточно высокой (предпочтительно
325 мМ при содержании аПС в лекарственной
форме 2,5 мг/мл и 650 мМ при 5 мг/мл аПС) для
того, чтобы обеспечить выкристаллизовывание
хлорида натрия на этапе замораживания при
лиофилизации. Композиции аПС можно лиофилизировать в стандартных установках с целью
получения лиофилизированных продуктов с
весовым соотношением 1 часть аПС, 6 частей
сахарозы и 7,6 частей хлорида натрия.
004881
12
Пример 2. Стабильность аПС в композициях с разными наполнителями.
Для исследования эффектов различных наполнителей на стабильность молекулы были
получены композиции аПС. Всего было протестировано шесть веществ, которые добавляли к
раствору аПС в фосфатном буфере без соли.
Исследовали следующие наполнители: глицин,
маннит, сахарозу, трегалозу, рафинозу и гидроксиэтилкрахмал (ГЭК). Стабильность аПС в
фосфатном буфере без соли и наполнителя
(«контроль») сравнивали с его стабильностью в
композициях с разными наполнителями. Образцы хранили при температуре 50, 40 и 25°С в
течение различных периодов времени. Данные,
полученные при анализе этих образцов, сравнивали с начальными значениями (время=0). Физическую и химическую стабильность исследуемых композиций оценивали по эффективности в тесте АРТТ, а также с использованием
высокоэффективной жидкостной хроматографии по размеру молекул (ОИ-ВЭЖХ), электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН (ДСНПААГ), а также по содержанию белка.
Композиции аПС были получены путем
растворения аПС в фосфатном буфере до концентрации 5 мг/мл аПС. Наполнитель добавляли
к образцам раствора аПС в соотношении 6:1
(наполнитель:аПС), или в концентрации 30
мг/мл. Образцы лиофилизировали таким образом, чтобы содержание аПС во флаконе составило 5 мг (5 мг аПС/флакон). Стабильность полученных композиций исследовали после их
хранения в следующих условиях : 14 и 28 дней
при 50°С; 28, 48 дней и 6 месяцев при 40°С; 6 и
12 месяцев при 25°С. Для каждой временной
точки анализировали по два флакона каждой
композиции как отдельные образцы, и сравнивали полученные данные с начальными значениями (время=0). Использовали следующие методы: эффективность в тесте АРТТ, ЭФ в ДСНПААГ, определение процентного содержания
мономерной формы аПС и содержания белка.
Таблица 2
Таблица 1
Технология лиофилизации композиций аПС
Состав композиции
Таблица 3
13
004881
Таблица 4
Таблица 5
Таблица 6
Таблица 7
Таблица 8
По истечении года не наблюдали никаких
значительных изменений рН, цвета, параметров
упаковки и физического состояния образцов. По
данным теста АРТТ и ОИ-ВЭЖХ, физическая
(по агрегации) и химическая (по эффективности
в тесте АРТТ) стабильность композиций с ГЭК
и глицином оказалась ниже, чем в контроле.
Несколько более высокую физическую и химическую стабильность по сравнению с контролем
выявили в композициях с маннитом, самая высокая физическая и химическая стабильность по
сравнению с контролем отмечалась в композициях с сахарозой, трегалозой и рафинозой. Таким образом, маннит, сахароза, рафиноза и трегалоза, используемые в качестве наполнителей в
композициях аПС, обеспечивают более высокую химическую и физическую стабильность
аПС по сравнению с его стабильностью в композициях с глицином и ГЭК или без наполнителя.
Пример 3. Стабильность рекомбинантного
активированного протеина С человека.
Две партии лиофилизированной композиции рекомбинантного активированного протеина С (аПС) человека хранили в течение месяца
при температуре 40°С и относительной влажно-
14
сти 75%, после чего анализировали возможную
степень деградации. Стабильность аПС также
оценивали после растворения лиофилизированного аПС в стерильной воде и его хранения в
течение 72 ч при комнатной температуре. Лиофилизированный продукт содержал 10 мг аПС,
60 мг сахарозы, 76 мг хлорида натрия и 15,1
цитрата на флакон. В составе данной композиции аПС остается стабильным в сухом состоянии при хранении, по меньшей мере, в течение
месяца при 40°С и относительной влажности
75% и в течение 24 ч при комнатной температуре в растворе.
Препараты в обеих партиях были приготовлены по следующей прописи: 10 мг аПС, 60
мг сахарозы, 76 мг хлорида натрия и 15,1 мг
цитрата на флакон. Обе партии лиофилизированного аПС хранили в течение месяца при
40°С и относительной влажности 75%, после
чего стабильность аПС оценивали по эффективности в АРТТ, а также с использованием ионпарной ВЭЖХ для количественного определения пептидов аПС и масс-спектрометрии для
количественного определения различных форм
протеина. Препараты одной партии растворяли
в стерильной воде до концентрации 1 мг/мл аПС
и оставляли при комнатной температуре. Стабильность аПС в полученном растворе определяли в следующих временных точках: 0, 1, 4, 8,
24, 48 и 72 ч в тесте АРТТ и методами массспектрометрии.
Хранение в сухом виде препарата в течение месяца при 40°С и относительной влажности 75% не приводит к потере активности аПС и
ведет к незначительной структурной деградации
молекулы белка. В данной композиции аПС остается стабильным, по меньшей мере, в течение
24 ч в растворе при концентрации 1 мг/мл.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Лиофилизированная композиция, содержащая рекомбинантный человеческий активированный протеин С; наполнитель, выбранный из группы, состоящей из маннита, трегалозы, рафинозы и сахарозы, а также их смесей; и
буферную систему, такую, что при восстановлении результирующая композиция имеет рН
приблизительно между 5,5 и 6,5.
2. Композиция по п.1, содержащая дис-(19)-инактивированный протеин С и дис-(1-10)инактивированный протеин С в количестве приблизительно менее 10% суммарного веса композиции.
3. Композиция по п.1, содержащая дис-(19)-инактивированный протеин С и дис-(1-10)инактивированный протеин С в количестве приблизительно менее 5% суммарного веса композиции.
4. Композиция по пп.1, 2 или 3, где рН заключено приблизительно между 5,9 и 6,1.
15
004881
5. Композиция по п.4, где буферная система представляет собой цитрат натрия.
6. Композиция по любому из пп.1-5, которая дополнительно содержит фармацевтически
приемлемую соль.
7. Лиофилизированная композиция, содержащая рекомбинантный человеческий активированный протеин С, соль и наполнитель,
выбранный из группы, состоящей из маннита,
трегалозы, рафинозы и сахарозы, причем весовое отношение составляет одну часть рекомбинантного человеческого активированного протеина С примерно к 7-8 частям соли и примерно
к 5-7 частям наполнителя.
8. Композиция по п.7, где весовое отношение составляет одну часть рекомбинантного
человеческого активированного протеина С к
7,6 частям соли и к 6 частям наполнителя.
16
9. Композиция по любому из пп.6-8, где
солью является хлорид натрия, а наполнителем
является сахароза.
10. Композиция по любому из пп.6-9 такая,
что при восстановлении результирующая композиция содержит 5 мг/мл рекомбинантного
человеческого активированного протеина С, 30
мг/мл сахарозы и 38 мг/мл хлорида натрия.
11. Применение композиции по любому из
пп.1-10 в качестве лекарственного средства при
лечении болезненных состояний, связанных с
внутрисосудистым свертыванием.
12. Применение композиции по любому из
пп.1-10 в качестве лекарственного средства при
лечении тромботического мозгового удара.
13. Единичная лекарственная форма, содержащая композицию по любому из пп.1-10 и
заключенная в упаковку для единичной дозы.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6