Лекция 6. Синтез белка, аминокислотный код Раскрытие механизма
advertisement
Лекция 6. Синтез белка, аминокислотный код Раскрытие механизма белкового синтеза позволило создать бесклеточную систему, способную к синтезу белка in vitro. Ферменты, активирующие и связывающие аминокислоты, тРНК и рибосомы, можно приготовить в виде относительно чистых фракций из самых различных клеток. При введении в эту систему АТФ, ГТФ, К+ , Mg2+, глутатиона и полного набора аминокислот синтез белка в ней не происходит до тех пор, пока в систему не будет внесена соответствующая мРНК. Сразу же после добавления м РНК в системе будет синтезироваться белок в количестве, прямо пропорциональном количеству внесенной мРНК (или ее стабильности). Тип белка, синтезируемого in vitro, полностью определяется природой матричной РНК. Все остальные компоненты системы совершенно не влияют на структуру синтезируемых полипептидных цепей. Исследование синтеза белка в бесклеточных системах позволяет детально изучить механизм трансляции информации. При внесении в бесклеточную систему мРНК, состоящей только из урацила (поли-Урацил), синтезированный в ней белок содержал только одну аминокислоту –фенилаланин. Таким путем было определено, что фенилаланин кодируется триплетом УУУ. Аналогичным образом использование поли-Аденина приводит к синтезу белка, содержащего только остатки лизина. Однако использование синтетических мРНК не позволяет достичь той точности, которая необходима для полной расшифровки кода. Пользуясь методом, который полностью основывается на случайном размещении нуклеотидов в молекуле синтетического полимера, трудно различить триплеты УУА и АУУ. К тому же анализ осложняется вырожденностью генетического кода. Эта вырожденность проявляется, в частности, в том, что при использовании в качестве матрицы сополимера, содержащего как урацил и цитозин, так и урацил и гуанин, образуемый полипептид наряду с другими аминокислотами будет содержать лейцин. В действительности, небольшие количества лейцина включались в белок даже при использовании полиУрацила. Проще всего объяснить указанные наблюдения, предположив значительную вырожденность кода, т.е. тем, что включение лейцина кодируемая триплетом УУх, где Х может быть любым нуклеотидом. Тот факт, что при использовании поли-Урацила включение фенилаланина в 30 раз превосходит включение лейцина, также поддерживает предположение о вырожденности кода. Окончательное раскрытие природы триплетного кода было получено благодаря обнаружению того факта, что молекулы РНК различных классов, входящие в белок –синтезирующую бесклеточную систему, образуют между собой на нитроцеллюлозном фильтре комплексы. В начале такие фильтры использовали для выделения рибосом из бактериальных клеток. В процессе работы с фильтрами была обнаружена адгезия различных типов тРНК на фильтре содержащем рибосомы и мРНК. Для определения специфичности такой адгезии к расположенным на фильтре рибосомам была добавлена синтетическая матрица поли-Урацила, после чего через фильтр пропускали поочередно различные типы аминоацил-тРНК, содержащие меченные 14 С –аминокислоты. Как и следовало ожидать на основании сказанного, на фильтре задерживалась только фенилаланин-тРНК; все же другие аминокислоты легко смывались с фильтра. Следовательно, данная методика позволяет определить аминокислотный код. Нанося на фильтр, содержащий рибосомы, мРНК определенного состава можно затем определить, какая именно аминоацил-тРНК связывается с рибосомами. Если строение матрицы известно, то легко определить ту последовательность оснований в аминокислотного триплете, которая остатка. Основным кодирует включение преимуществом такой данного системы является возможность использования в качестве матрицы тринуклеотидов (УУУ, УУА и т. д.) а не высокомолеку-лярного полимера. Взяв определенный тринуклеотид, можно наблюдать специфическое связывание соответствующей аминоацил-тРНК. Благодаря использованию таких “миниматриц” был полностью определен аминокислотный код. Было установлено, что основное смысловое значение имеют первые две буквы триплета, хотя это не всегда так. Кроме того, существует три “бессмысленных” триплета, которые кодируют терминацию синтеза пептидной цепи. Используя в работе связанные с фильтром рибосомы, удается получить ряд сведений относительно механизма считывания кода. Например, было установлено, что триплеты, содержащие дезоксирибонуклеотиды, не могут быть считаны. Поэтому очевидно, что 2/ ОН -группы рибозы необходимы для связывания матрицы с поверхностью рибосомы. Удается также приготовить синтетические тринуклеотиды одинакового состава, но различной полярности, в частности олигонуклеотиды с 5/ -концевой и 3/ -концевой фосфатными группами (фУфУфУ и УфУфУф). При использовании таких олигонуклеотидов было найдено, что наибольшей легкостью считывается олигонуклеотид с фосфорилированным 5/ -концом. К тому же было установлено, что удаление терминального фосфата заметно уменьшает эффективность белкового синтеза; при этом все кодовые слова –дуплеты остаются непрочтенными. По-видимому, из этого следует, что триплеты мРНК, присоединяясь к рибосоме, ориентируются на ней таким образом, чтобы считывание оснований каждого триплета проходило всегда в одном и том же направлении. Этот вывод подтверждает представление о полярном строении матричного полинуклеотида, считывание которого идет всегда в строго определенном направлении (от 5/ - к 3/ -концу). Изменение полярности матрицы всегда вызывает ослабление специфического связывания ее с рибосомой, т.е. процесса, который необходим для считывания информации. Аминокислотный код определяет включение в полипептидную цепь только двадцати различных видов аминокислот. Есть, однако, две аминокислоты, цистин и оксипролин, о которых следует упомянуть особо. Молекула цистина образуется в результате соединения двух молекул цистеина. При этом возникают дисульфидные связи, которые так часто выполняют важную роль в поддержании третичной структуры белковых молекул. В действительности, рассматривая молекулу белка, мы всегда имеем дело с цистином, а не цистеином; тем не менее первичная структура ее цепей образуется путем включения цистеина. Последующее окисление остатков цистеина приводит к образованию между ними дисульфидных мостиков. Аналогичным образом остатки оксипролина входят в состав ряда белков (в частности, коллагена). Гидроксильная группа присоединяется к остатку пролина уже после завершения синтеза полипептидной цепи, и, таким образом, один и тот же триплет кодирует включение в белок как пролина, так и оксипролина. Как много аминокислотных остатков модифицируется после образования первичной структуры полипептидной цепи, пока не выяснено.
