013508 - 1 - Изобретение относится к полипептидам, их

013508
Изобретение относится к полипептидам, их фармакологически приемлемым солям, производным
и/или конъюгатам, их использованию для получения фармацевтического препарата и к упомянутому
фармацевтическому препарату. Полипептиды применимы для лечения заболеваний, связанных с увеличением численности моноцитов.
Склероз артериальных сосудов является морфологической предпосылкой сердечно-сосудистых заболеваний. В данном случае ключевую роль в генезисе ранних патологических изменений артерий играет первоначальное увеличение численности моноцитов. Началом патогенеза сердечно-сосудистых заболеваний, таких как артериосклероз, стенозы и тромбозы является сцепление моноцитов с эндотелием, так
называемое угнетение моноцитов. Известно, что в этих процессах в качестве сигнальных молекул участвуют хемокины, такие как RANTES (регулируемые при активации, нормальные Т-клеточные экспрессированные и секретированные хемокины, от английского regulated on activation, normal T cell expressed and
secreted).
Известная из уровня техники первичная и вторичная профилактика в основном включает снижение
уровня липидов и ингибирование агрегации тромбоцитов, а также применение лекарственных препаратов, таких как аспирин или клопидогрель. Недостатком лечения данными препаратами является, вопервых, их слабая специфичность и, во-вторых, их серьезное отрицательное действие, такое как миопатия и повышенный риск кровотечений.
Кроме того, из уровня техники известно применение пептидных антагонистов RANTES. Например,
в патенте DE 10014516 А1 описано применение metRANTES в качестве антагониста рецептора RANTES
CCR1. Недостатком применения этих антагонистов является то, что, поскольку хемокины в качестве
сигнальных молекул участвуют в ряде физиологических процессов, применение такого антагониста оказывает влияние на непредсказуемое число физиологических процессов, и могут возникать многочисленные побочные эффекты и последствия.
Таким образом, задачей настоящего изобретения является создание доступных веществ для преодоления по меньшей мере одного из недостатков известного уровня техники. В частности, задачей настоящего изобретения является создание доступных веществ с улучшенной специфичностью.
Данная задача решена с помощью полипептида, его фармакологически приемлемых солей, производных и/или конъюгатов с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO. 1 согласно приведенной
ниже формуле (1)
в которой
X1 выбирают из группы, включающей лизин, глутамин, аргинин, гистидин и/или аспарагин или
аминокислотную делецию,
Х2 выбирают из группы, включающей глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту и/или глутамин или аминокислотную делецию,
Х3 выбирают из группы, включающей глицин, серин и/или аланин,
Х4 выбирают из группы, включающей лизин, лейцин и/или аргинин,
Х5 выбирают из группы, включающей серин, цистеин, глицин и/или треонин,
Х6 выбирают из группы, включающей серин, глицин и/или треонин,
Х7 выбирают из группы, включающей аспарагин и/или глутамин,
X8 выбирают из группы, включающей пролин, тирозин и/или глицин,
Х9 выбирают из группы, включающей глицин, аланин и/или серин,
Х10 выбирают из группы, включающей изолейцин, валин и/или аспарагин,
Х11 выбирают из группы, включающей валин, изолейцин и/или аспарагин,
Х12 выбирают из группы, включающей фенилаланин, тирозин, изолейцин, валин, лейцин и/или метионин,
Х13 выбирают из группы, включающей изолейцин, валин, лейцин, метионин и/или фенилаланин,
Х14 выбирают из группы, включающей треонин, глицин, аланин, серин и/или тирозин,
X15 выбирают из группы, включающей аргинин, лизин, глутамин, гистидин и/или аспарагин или
аминокислотную делецию.
Предложенные в изобретении полипептиды могут успешно применяться в качестве антагониста
взаимодействия между RANTES и фактором 4 роста тромбоцитов.
Подразумевается, что термин "антагонист взаимодействия между RANTES и фактором 4 роста
тромбоцитов" в контексте настоящего изобретения включает пептиды, протеины или другие соединения,
способные функционировать в качестве антагониста взаимодействия между хемокинами RANTES и фактором 4 роста тромбоцитов.
К удивлению оказалось, что предложенные в изобретении полипептиды способны оказывать специфическое действие на увеличение численности моноцитов, опосредованное взаимодействием хемокинов RANTES и фактора 4 роста тромбоцитов (PF4). В данном случае особо выгодно, что предложенные в
изобретении полипептиды оказывают незначительное действие или не оказывают действия на многочисленные функции хемокинов. В частности, выгодно, что избирательное блокирование увеличения чис-1-
013508
ленности моноцитов способно влиять на эндотелий.
Подразумевается, что термин "увеличение численности моноцитов" в контексте настоящего изобретения включает перемещение моноцитов внутрь, через или из эндотелия, их сцепление и распространение, например, в эндотелиальных разрывах. Сцепление моноцитов также называют угнетением моноцитов, когда сцепление происходит в сдвиговом потоке, как в физиологических условиях, например, в
кровеносных капиллярах, системе микрососудистого или артериального кровообращения.
Особо выгодно, что предложенные в изобретении полипептиды способны обеспечивать высокую
специфичность и оказывают незначительное отрицательно действие или не оказывают отрицательного
действия на множество процессов метаболизма, опосредованных хемокинами RANTES и PF4, например,
иммунную систему или коагулирующую систему. В частности, путем введения предложенных в изобретении полипептидов можно предотвратить риск кровотечения, как это делают с помощью традиционных
лекарственных средств при сердечнососудистых заболеваниях.
Используемые в контексте настоящего изобретения обычные однобуквенные коды аминокислот означают: "С" - цистеин, a "Y" -тирозин, "F" - фенилаланин, "Т" - треонин и "S" - серин.
Предложенный в изобретении полипептид имеет один цистеиновый радикал с аминоконцевой стороны и другой радикал с карбоксиконцевой стороны, что позволяет осуществлять циклизацию полипептида. Особо выгодно, что циклизованный полипептид обладает улучшенной стабильностью. Предложенный в изобретении полипептид способен оказывать более длительное действие и, следовательно, может
использоваться в меньшем количестве.
Подразумевается, что термин "полипептид" в контексте настоящего изобретения относится к синтетическим или несинтетическим пептидным соединениям, а также очищенным и модифицированным
фрагментам натуральных протеинов, нативным формам или рекомбинатным пептидам или протеинам.
Аналогичным образом, термин "полипептид" в контексте настоящего изобретения включает фармакологически приемлемые соли, фармакологически приемлемые производные и/или конъюгаты соответствующего полипептида.
Предпочтительные фармакологически приемлемые производные включают, например, сложные
эфиры, амиды, N-ациловые и/или О-ациловые производные, карбоксилированные, ацетилированные,
фосфорилированные и/или гликозилированные полипептиды. Предпочтительные конъюгаты включают,
например, сахар или конъюгаты полиэтиленгликоля, биотинилированные радиоактивные или меченные
флуоресценцией полипептиды.
Длина полипептида предпочтительно составляет самое большее 25 аминокислот. Число аминокислот в полипептиде предпочтительно составляет от ≥15 до ≤25, более предпочтительно от ≥15 до ≤22
аминокислот. В ходе исследований было установлено, что длина полипептида способна влиять на его
эффективность. В частности, аминокислотная последовательность такой длины способна инициировать
ингибирование угнетения моноцитов.
В предпочтительных вариантах осуществления число аминокислот в полипептиде составляет от ≥18
до ≤23, более предпочтительно от ≥18 до ≤22 аминокислот, в особо предпочтительных вариантах осуществления число аминокислот в полипептиде составляет от ≥19 до ≤22, а в более предпочтительных вариантах осуществления полипептид включает от ≥20 до ≤21 аминокислот. Наиболее предпочтительно полипептид имеет 22 аминокислоты. Термин "число аминокислот" в контексте настоящего изобретения,
конечно, также включают значение "длина аминокислотной последовательности полипептида".
В предпочтительных вариантах осуществления предложенного в изобретении полипептида X1 соответствует лизину или положение X1 аминокислотной последовательности соответствует делеции, особо предпочтительно X1 соответствует аминокислотному лизину. Кроме того, в предпочтительных вариантах осуществления полипептида Х2 соответствует аминокислотной глутаминовой кислоте или аминокислотной делеции. Особо предпочтительно Х2 соответствует аминокислотной глутаминовой кислоте.
Полипептид с делецией а положении X1 и/или Х2 способен демонстрировать антагонистическое действие. Можно предусмотреть, чтобы X1 и Х2 соответствовали аминокислотной делеции.
Предпочтительно Х3 соответствует небольшой, нейтральной и гибкой аминокислоте. В предпочтительных вариантах осуществления полипептида Х3 выбирают из группы, включающей глицин и/или серин, особо предпочтительно Х3 соответствует аминокислотному глицину. Было установлено, что эти
аминокислоты оказывают положительное влиянием на стабильность структуры полипептида. Такое
улучшение стабильности особо выгодно, поскольку в этом случае можно продлить взаимодействие полипептида с хемокином PF4. Таким образом, улучшение стабильности пептида способно усилить его
антагонистические свойства.
В предпочтительных вариантах осуществления полипептида Х4 соответствует аминокислотному
лизину.
Предпочтительно X5 выбирают из группы, включающей серин, глицин и/или треонин. В особо
предпочтительных вариантах осуществления полипептида X5 соответствует серину. В данном варианте
осуществления полипептида может быть обеспечено улучшение растворимости полипептида. В частности, за счет улучшения растворимости полипептида может улучшиться применимость полипептида в
-2-
013508
воде. Это позволяет упростить введение полипептида обычными способами на основе воды. К тому же,
за счет такой улучшенной растворимости полипептида может быть улучшена дисперсность полипептида
в водных системах организма, в частности в крови.
Предпочтительно Х6 соответствует аминокислотному серину. В других предпочтительных вариантах осуществления полипептида Х7 соответствует аминокислотному аспарагину.
Предпочтительно X8 соответствует аминокислоте, выбранной из группы, включающей пролин
и/или тирозин. Особо предпочтительно X8 соответствует аминокислотному пролину.
В особо предпочтительных вариантах осуществления полипептида X9 соответствует глицину. Было
установлено, что аминокислотный глицин в этом положении аминокислотной последовательности способен обеспечивать удивительную стабильность полипептидного соединения.
Х10 и Х13 независимо друг от друга предпочтительно выбирают из группы, включающей валин
и/или изолейцин. В предпочтительных вариантах осуществления полипептида Х10 соответствует изолейцину. В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления полипептида Х13 соответствует
изолейцину. В особо предпочтительных вариантах осуществления полипептида Х10 и Х13 соответствуют
изолейцину. Было установлено, что изолейцин в положениях Х10 и Х13 полипептида способен улучшать
стабильность структуры полипептида.
Предпочтительно Х11 соответствует аминокислотному валину. Предпочтительно Х12 выбирают из
группы, включающей фенилаланин и/или тирозин, особо предпочтительно Х12 соответствует аминокислотному фенилаланину. Предпочтительно Х14 соответствует аминокислотному треонину.
Предпочтительно Х15 соответствует аргинину; положение Х15 в аминокислотной последовательности также может соответствовать аминокислотной делеции. Аминокислотные делеции предпочтительно
соответствуют положениям Х1, Х2 и/или X15. Предпочтительно может быть удалена одна из аминокислот
Х1, Х2 или X15, но аминокислотные делеции также могут соответствовать положениям Х1 и Х2. В других
вариантах осуществления делеции могут соответствовать положениям Х1, Х2 и X15. В предпочтительных
вариантах осуществления полипептида на участке аминокислот от Х3 до Х14 отсутствуют делеции.
В предпочтительных вариантах осуществления полипептида Х5 соответствует аминокислотному
серину, Х9 соответствует глицину, Х10 соответствует лейцину и/или Х13 соответствует изолейцину. В
особо предпочтительных вариантах осуществления полипептида Х5 соответствует аминокислотному серину, Х9 соответствует глицину, Х10 соответствует изолейцину и Х13 соответствует изолейцину. Было
установлено, что полипептид, у которого Х5 соответствует аминокислотному серину, Х9 соответствует
глицину, Х10 соответствует изолейцину и Х13 соответствует изолейцину, обладает особо высоким потенциалом антагониста.
В другом предпочтительном варианте осуществления полипептида Х5 соответствует аминокислотному серину, Х9 соответствует глицину, Х10 соответствует изолейцину, Х13 соответствует изолейцину, X1
соответствует аминокислотной делеции и/или Х15 соответствует аминокислотной делеции. В особо предпочтительных вариантах осуществления полипептида Х5 соответствует аминокислотному серину, Х9
соответствует глицину, Х10 соответствует изолейцину, Х13 соответствует изолейцину, X1 соответствует
аминокислотной делеции и X15 соответствует аминокислотной делеции. Данный полипептид также может обладать особо высоким потенциалом антагониста.
В еще более предпочтительном варианте осуществления полипептида Х5 соответствует аминокислотному серину, X8 соответствует тирозину, Х9 соответствует глицину, Х10 соответствует изолейцину,
Х13 соответствует изолейцину, X1 соответствует аминокислотной делеции и/или Х15 соответствует аминокислотной делеции. В особо предпочтительных вариантах осуществления полипептида Х5 соответствует аминокислотному серину, X8 соответствует тирозину, Х9 соответствует глицину, Х10 соответствует
изолейцину, Х13 соответствует изолейцину, X1 соответствует аминокислотной делеции и Х15 соответствует аминокислотной делеции.
В другом предпочтительном варианте осуществления полипептида Х3 соответствует аминокислотному серину, Х5 соответствует серину, Х8 соответствует тирозину, Х9 соответствует глицину, Х10 соответствует изолейцину, Х13 соответствует изолейцину, X1 соответствует аминокислотной делеции и/или
Х15 соответствует аминокислотной делеции. В особо предпочтительных вариантах осуществления полипептида Х3 соответствует аминокислотному серину, Х5 соответствует серину, X8 соответствует тирозину,
Х9 соответствует глицину, Х10 соответствует изолейцину, Х13 соответствует изолейцину, X1 соответствует аминокислотной делеции и/или X15 соответствует аминокислотной делеции.
В еще более предпочтительном варианте осуществления полипептида Х3 соответствует аминокислотному серину, Х5 соответствует серину, X8 соответствует пролину, Х9 соответствует глицину, Х10 соответствует изолейцину, Х13 соответствует изолейцину, Х1 соответствует аминокислотной делеции, Х2
соответствует аминокислотной делеции и/или X15 соответствует аминокислотной делеции. В особо предпочтительных вариантах осуществления полипептида Х3 соответствует аминокислотному серину, Х5
соответствует серину, Х5 соответствует пролину, Х9 соответствует глицину, Х10 соответствует изолейцину, Х13 соответствует изолейцину, X1 соответствует аминокислотной делеции, Х2 соответствует аминокислотной делеции и Х15 соответствует аминокислотной делеции.
В другом предпочтительном варианте осуществления полипептида Х3 соответствует аминокислот-3-
013508
ному серину, Х5 соответствует серину, X8 соответствует тирозину, Х9 соответствует глицину, Х10 соответствует изолейцину, Х12 соответствует тирозину, Х13 соответствует изолейцину, X1 соответствует аминокислотной делеции, Х2 соответствует аминокислотной делеции и/или X15 соответствует аминокислотной делеции. В особо предпочтительных вариантах осуществления полипептида Х3 соответствует аминокислотному серину, Х5 соответствует серину, X8 соответствует тирозину, Х9 соответствует глицину,
Х10 соответствует изолейцину, Х12 соответствует тирозину, X13 соответствует изолейцину, X1 соответствует аминокислотной делеции, Х2 соответствует аминокислотной делеции и X15 соответствует аминокислотной делеции.
В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления полипептид может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 2 согласно приведенной ниже формуле (2)
и/или полипептид с последовательностью SEQ ID NO. 2 согласно формуле (2) может иметь по меньшей
мере одну или несколько аминокислотных делеций, аминокислотных замен и/или аминокислотных вставок по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO. 2 согласно формуле (2).
Аминокислотные замены предпочтительно касаются с девятой по двадцатую аминокислоту в аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 2 согласно формуле (2) в диапазоне от аминокислотного
глицина в положении 9 до треонина в положении 20 аминокислотной последовательности. Предпочтительно одну или несколько аминокислот выбирают из группы, включающей глицин, цистеин, пролин,
валин, фенилаланин и/или аланин, в которой они заменены аминокислотами, выбранными из группы,
включающей серин, тирозин, изолейцин и/или глицин. Одно из преимуществ этих аминокислотных замен состоит в том, что они способны повышать стабильность полипептида и/или улучшать антагонистическое действие полипептида.
Аминокислотные замены предпочтительно выбирают из замен, включающих глицин на серин, неконцевой цистеин на серин, пролин на тирозин, валин на изолейцин, фенилаланин на тирозин и/или аланин на глицин. Эти аминокислотные замены могут сочетаться друг с другом любым желаемым способом.
В частности, предпочтительно, чтобы, по меньшей мере, неконцевой цистеин в положении 11 аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 2 согласно формуле (2) был заменен серином. Такая замена может способствовать повышению растворимости пептида, в частности его растворимости в воде.
Особо предпочтительно в варианте осуществления полипептида с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO. 2 согласно формуле (2) аминокислотные замены выбирают из замен, включающих
глицин на серин, цистеин на серин и/или пролин на тирозин, что затрагивает аминокислоты с 9 по 14 в
диапазоне от глицина до пролина аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 2 согласно формуле
(2). В данном диапазоне делают по меньшей мере одну из замен, предпочтительно, по меньшей мере,
цистеин в положении 11 аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 2 согласно формуле (2) заменяют серином. В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления пролин также заменяют
на тирозин и/или глицин заменяют на серин. Замена цистеина в положении 11 аминокислотной последовательности может сочетаться с любыми другими заменами, в частности, с заменой пролина на тирозин
и/или глицина на серин.
В данных вариантах осуществления также предпочтительно, чтобы аминокислотные замены в полипептиде с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO. 2 согласно формуле (2) затрагивали диапазон с 15 по 20 аминокислоты, с аланина по треонин. Предпочтительные аминокислотные замены в
данном диапазоне выбирают из замен, включающих аланин на глицин, валин на изолейцин и/или фенилаланин на тирозин. Особо предпочтительно аланин заменяют глицином. Предпочтительно, по меньшей
мере, валин в положении 16 аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 2 согласно формуле (2)
заменяют изолейцином; предпочтительно по меньшей мере два из валинов заменяют изолейцином; валины в положениях 16 и 19 предпочтительно заменяют на изолейцин. Также предпочтительно каждый валин аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 2 согласно формуле (2) заменяют изолейцином. В
других предпочтительных вариантах осуществления полипептида фенилаланин может быть заменен тирозином.
Кроме того, в данных вариантах осуществления также предпочтительно, чтобы аланин в положении
15 последовательности SEQ ID NO. 2 согласно формуле (2) был заменен глицином, валин в положении
16 был заменен изолейцином и валин в положении 19 был заменен изолейцином. Было установлено, что
эти замены обеспечивают удивительную стабильность полипептидного соединения.
Замены и/или аминокислотные делеции могут сочетаться любым желаемым способом, в частности
замены могут любым способом сочетаться друг с другом.
Кроме того, полипептид в данных вариантах осуществления может иметь делеции аминокислот.
Предпочтительные аминокислотные делеции включают делеции аминокислотного лизина, глутамина
и/или аргинина. Делеции предпочтительно затрагивают аминокислотный лизин в положении 2 последовательности SEQ ID NO. 2 согласно формуле (2), аминокислотный глутамин в положении 3 и/или аминокислотный аргинин в положении 21 аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 2 согласно формуле (2). Эти делеции могут сочетаться любым способом. Предпочтительно удаляют одну аминокислоту,
-4-
013508
но также может быть удален лизин в положении 2, а также аргинин в положении 21. В дополнительных
вариантах осуществления может быть удален лизин в положении 2, глутамин в положении 3 и аргинин в
положении 21.
Предпочтительно на участке аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 2 согласно формуле
(2) с 4 по 20 аминокислоту отсутствуют делеции. В особо предпочтительных вариантах осуществления
на участке с 4 по 20 аминокислоту отсутствуют аминокислотные делеции или аминокислотные замены.
В ходе исследований было установлено, что аминокислотная последовательность SEQ ID NO. 2 согласно
формуле (2), имеющая на участке с 9 по 20 аминокислоту по меньшей мере две аминокислотные замены,
предпочтительно три аминокислотные замены, более предпочтительно четыре аминокислотные замены,
еще более предпочтительно пять аминокислотных замен, обладает хорошими свойствами антагониста.
Число аминокислот в полипептиде согласно данному варианту осуществления предпочтительно составляет от ≥15 до ≤25, более предпочтительно от ≥18 до ≤23, особо предпочтительно от ≥19 до ≤22, еще
более предпочтительно от ≥20 до ≤21, наиболее предпочтительно 22 аминокислоты.
В особо предпочтительном варианте осуществления полипептид согласно настоящему изобретению, его фармакологически приемлемые соли, производные и/или конъюгаты имеют аминокислотную
последовательность SEQ ID NO. 3 согласно следующей формуле (3):
В ходе исследований было установлено, что полипептид с аминокислотной последовательностью
SEQ ID NO. 3, представленной формулой (3), обладает особо высоким потенциалом антагониста. В частности было установлено, что полипептид может обладать особо сильным антагонистическим действием.
Было также установлено, что полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO. 3 согласно формуле (3) способен заметно и повторяемо ингибировать взаимодействие RANTES и PF4, что инициирует потенцирование угнетения моноцитов.
Особо выгодно, что полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO. 3 согласно
формуле (3) обладает специфичностью в отношении взаимодействия RANTES и PF4. Таким образом,
может быть ослаблено или даже предотвращено подавление функции хемокинов. Это позволяет направленно использовать полипептид при лечении заболеваний, в частности сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с увеличением численности моноцитов или зависящего от RANTES увеличения численности популяций других лейкоцитов, таких как эозинофилы.
В одном предпочтительном варианте осуществления предложенный в изобретении полипептид, его
фармакологически приемлемые соли, производные и/или конъюгаты имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 4 согласно следующей формуле (4):
В другом предпочтительном варианте осуществления предложенный в изобретении полипептид,
его фармакологически приемлемые соли, производные и/или конъюгаты имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 5 согласно следующей формуле (5):
В еще одном предпочтительном варианте осуществления предложенный в изобретении полипептид, его фармакологически приемлемые соли, производные и/или конъюгаты имеют аминокислотную
последовательность SEQ ID NO. 6 согласно следующей формуле (6):
В еще более предпочтительном варианте осуществления предложенный в изобретении полипептид,
его фармакологически приемлемые соли, производные и/или конъюгаты имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 7 согласно следующей формуле (7):
Одним из преимуществ данных полипептидов согласно предпочтительным вариантам осуществления является то, что они предпочтительно обладают повышенной стабильностью. Это позволяет полипептидам лучше достигать области действия и вступать в стабильные взаимодействия с протеиновыми
или пептидными соединениями. В частности, за счет повышенной стабильности полипептида он может
применяться in vivo и in vitro. Другим преимуществом полипептида согласно предпочтительным вариантам осуществления является его повышенная растворимость в воде. В частности, за счет повышенной
растворимости может облегчаться и упрощаться введение полипептида.
Кроме того, соответствующие L-аминокислоты также могут быть заменены на D-аминокислоты. За
счет этого может быть дополнительно повышена стабильность.
Полипептиды могут быть получены обычными способами синтеза пептидов.
Предложенные в изобретении полипептиды могут успешно применяться в качестве антагониста
взаимодействия между RANTES и фактором 4 роста тромбоцитов. В частности, предложенные в изобретении полипептиды способны вызывать ингибирования взаимодействия между RANTES и фактором 4
роста тромбоцитов.
Предложенные в изобретении полипептиды, их фармакологически приемлемые соли, производные
и/или конъюгаты могут применяться в качестве антагонистов взаимодействия между RANTES и факто-5-
013508
ром 4 роста тромбоцитов.
За счет выгодных свойств предложенных в изобретении полипептидов они могут применяться в качестве фармацевтических препаратов.
Другим предметом настоящего изобретения является применение предложенных в изобретении полипептидов, в частности, для получения фармацевтического препарата согласно предпочтительным вариантам осуществления.
Предложенные в изобретении полипептиды могут вводиться обычными способами, но предпочтительным является парентеральное введение, например пероральное введение, чрескожное введение, подкожное введение и/или внутривенное введение. Например, полипептиды могут вводиться ex vivo, например, до имплантации сосудистой вставки или интраваскулярно, например, до или после введения
катетера или имплантации стента. Хорошая растворимость полипептидов в воде является большим преимуществом при таком применении.
К тому же, при лечении острых форм или лечении в течение ограниченного времени предложенные
в изобретении полипептиды также могут предпочтительно вводиться в течение более длительного времени. Предложенные в изобретении полипептиды также могут вводиться в виде форм с замедленным
высвобождением или с пролонгированным действием, инъекций вещества замедленного всасывания или
осмотических помп.
Предложенный в изобретении полипептид также может вводиться в виде нуклеиновой кислоты, кодирующей соответствующий полипептид. В данном случае молекула нуклеиновой кислоты может присутствовать в обычных векторах. Предпочтительно вводят ДНК-последовательность, кодирующую соответствующий полипептид. Также может вводиться РНК, кодирующая предложенный в изобретении полипептид.
Другим предметом изобретения являются нуклеиновые кислоты, включающие последовательности
нуклеиновых кислот, кодирующие предложенные в изобретении полипептиды, предпочтительно последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептиды с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO. 1 согласно формуле (1), SEQ ID NO. 2 согласно формуле (2), SEQ ID NO. 3 согласно
формуле (3), SEQ ID NO. 4 согласно формуле (4), SEQ ID NO. 5 согласно формуле (5), SEQ ID NO. 6 согласно формуле (6), SEQ ID NO. 7 согласно формуле (7). Нуклеиновой кислотой, которая может применяться согласно настоящему изобретению, предпочтительно является ДНК или РНК. Специалистам в
данной области техники известны ДНК-последовательности, кодирующие полипептиды, имеющие приведенные выше формулы, т.е. последовательности.
В одном из примеров молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с аминокислотной
последовательностью SEQ ID NO. 3 согласно формуле (3), имеет ДНК-последовательность SEQ ID NO. 8
согласно следующей формуле (8):
Специалистам в данной области техники известны другие последовательности, кодирующие полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO. 3 согласно формуле (3). К тому же, известно, что последовательности нуклеиновых кислот могут меняться, например, в результате генерирования
генетического кода.
В одном из примеров молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с аминокислотной
последовательностью SEQ ID NO. 2 согласно формуле (2) имеет ДНК-последовательность SEQ ID NO. 9
согласно следующей формуле (9):
В одном из примеров молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с аминокислотной
последовательностью SEQ ID NO. 4 согласно формуле (4) имеет ДНК-последовательность SEQ ID NO.
10 согласно следующей формуле (10):
В одном из примеров молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с аминокислотной
последовательностью SEQ ID NO. 5 согласно формуле (5) имеет ДНК-последовательность SEQ ID NO.
11 согласно следующей формуле (11):
В одном из примеров молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с аминокислотной
последовательностью SEQ ID NO. 6 согласно формуле (6) имеет ДНК-последовательность SEQ ID NO.
12 согласно следующей формуле (12):
-6-
013508
В одном из примеров молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с аминокислотной
последовательностью SEQ ID NO. 7 согласно формуле (7) имеет ДНК-последовательность SEQ ID NO.
13 согласно следующей формуле (13):
Специалистам в данной области техники известны другие ДНК-последовательности, кодирующие
полипептиды с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO. 1 согласно формуле (1), SEQ ID NO. 2
согласно формуле (2), SEQ ID NO. 3 согласно формуле (3), SEQ ID NO. 4 согласно формуле (4), SEQ ID
NO. 5 согласно формуле (5), SEQ ID NO. 6 согласно формуле (6) и SEQ ID NO. 7 согласно формуле (7).
Аналогичным образом, специалистам в данной области техники известны РНК-последовательности, кодирующие полипептиды с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO. 1 согласно формуле (1),
SEQ ID NO. 2 согласно формуле (2), SEQ ID NO. 3 согласно формуле (3), SEQ ID NO. 4 согласно формуле (4), SEQ ID NO. 5 согласно формуле (5), SEQ ID NO. 6 согласно формуле (6) и SEQ ID NO. 7 согласно
формуле (7).
Предпочтительные дозы предложенных в изобретении полипептидов для введения людям составляют от ≥10 мг в сутки/75 кг веса тела до ≤1000 мг в сутки/75 кг веса тела, предпочтительно от ≥50 мг в
сутки/75 кг веса тела до ≤200 мг в сутки/75 кг веса тела, более предпочтительно в пределах 150 мг в сутки/75 кг веса тела.
Предложенные в изобретении полипептиды, их фармакологически приемлемые соли, производные
и/или конъюгаты и/или нуклеиновые кислоты могут, в частности, применяться для лечения и/или профилактики, диагностики и/или лечения заболеваний, связанных с увеличением численности моноцитов.
Эти заболевания включают, например, сердечно-сосудистые и/или воспалительные заболевания, в частности артериосклероз, стенозы, гипертензию и/или реакции отторжения трансплантата.
Предложенные в изобретении полипептиды и/или нуклеиновые кислоты применимы, в частности,
для лечения млекопитающих, в частности людей.
Предложенные в изобретении полипептиды способны оказывать положительное влияние на сцепление моноцитов с эндотелием. В частности, к удивлению, оказалось, что в особо предпочтительных вариантах осуществления предложенные в изобретении полипептиды способны ингибировать потенцирование такого угнетения моноцитов, опосредованного гетерофильным взаимодействием RANTES и PF4.
Согласно экспериментам в особо предпочтительных вариантах осуществления предложенные в изобретении полипептиды могут успешно обеспечивать усиленное ингибирование потенцирования угнетения
моноцитов, опосредованного гетерофильным взаимодействием RANTES и PF4 по сравнению с ингибированием, которое способны обеспечивать ранее известные протеиновые или пептидные соединения.
Особым преимуществом предложенных в изобретении полипептидов является тот факт, что путем
введения этих полипептидов можно ослабить или предотвратить развитие артериосклероза, послеоперационных или послехирургических рестенозов, например, после расширения с помощью баллона, атерэктомии или шунтирования. Особым преимуществом предложенных в изобретении полипептидов является
то, что они способны предотвращать или уменьшать дальнейшее увеличение численности моноцитов на
активированном эндотелии даже при запущенном и/или клиническом заболевании и/или морфологических артериосклеротических изменениях.
Особо выгодно, что предложенные в изобретении полипептиды, в частности, могут применяться
для профилактического лечения, например, пациентов с повышенным риском гипертензии. Такое применение в целях профилактики возможно, в частности, за счет того, что предложенные в изобретении
полипептиды оказывают незначительное действие или вообще не оказывают действия на общие опосредованные хемокинами процессы.
Другой задачей настоящего изобретения является применение предложенных в изобретении полипептидов, их фармакологически приемлемых солей, производных и/или конъюгатов для получения фармацевтического препарата для лечения и/или профилактики заболеваний, выбранных из группы, включающей
заболевания, связанные с увеличением численности моноцитов, такие как сердечно-сосудистые
и/или воспалительные заболевания, в частности артериосклероз, атеросклероз, нестабильные бляшки,
стенозы, рестенозы, гипертензия, артрит, миокардит, аутоиммунные заболевания, включая энцефаломиелит, воспалительные кишечные заболевания, реперфузию после инфаркта, например, инфарктов миокарда или церебральных инфарктов, отторжение трансплантата и/или кожные заболевания, такие как псориаз, и/или
заболевания, связанные с зависящим от RANTES увеличением численности популяций других лейкоцитов, таких как эозинофилы, в частности, при аллергических заболеваниях, таких как астма или
пневмония.
Так, при использовании предложенных в изобретении полипептидов может быть достигнуто эффективное действие на течение болезни при лечении атеросклеротических изменений у людей. В частности, может быть ослаблено потенцирование артериосклеротических изменений вследствие угнетения
-7-
013508
моноцитов. Другое преимущество предложенных в изобретении полипептидов основано на их способности ослаблять или даже предотвращать эти реакции отторжения после пересадки органов и/или тканей.
В данном случае особо выгодно, что предложенные в изобретении полипептиды предпочтительно
оказывают незначительное отрицательное действие или не оказывают отрицательного действия. За счет
этого предложенные в изобретении полипептиды могут применять в целях профилактики. К тому же,
особо выгодно, что за счет специфичности предложенных в изобретении полипептидов они не влияют на
другие процессы метаболизма, что делает возможным их профилактическое введение, например, пациентам с повышенным риском гипертензии или для профилактики артериосклеротических изменений.
Другим предметом изобретения являются фармацевтические препараты, включающие предложенные в изобретении полипептиды, предпочтительно полипептиды с последовательностью SEQ ID NO. 1
согласно формуле (1), их фармакологически приемлемые соли, производные и/или конъюгаты. Предпочтительными являются фармацевтические препараты, включающие полипептиды, выбранные из группы,
включающей полипептиды с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO. 3 согласно формуле
(3), SEQ ID NO. 4 согласно формуле (4), SEQ ID NO. 5 согласно формуле (5), SEQ ID NO. 6 согласно
формуле (6) и/или SEQ ID NO. 7 согласно формуле (7). Особо предпочтительными являются фармацевтические препараты, включающие полипептиды с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO. 3
согласно формуле (3). Фармацевтический препарат предпочтительно содержит полипептиды, имеющие
одну из перечисленных выше формул или номеров SEQ ID, при этом фармацевтический препарат может
содержать полипептиды, имеющие несколько формул или номеров SEQ ID.
Фармацевтические препараты, включающие предложенные в изобретении полипептиды, могут, в
частности, применяться для лечения in vivo, например, людей. Предпочтительным применением фармацевтических препаратов, включающих предложенные в изобретении полипептиды, является лечение
и/или профилактика заболеваний, связанных с увеличением численности моноцитов, таких как сердечнососудистые или воспалительные заболевания, в частности артериосклероз, атеросклероз, нестабильные
бляшки, стенозы, рестенозы, гипертензия, артрит, миокардит, аутоиммунные заболевания, включая энцефаломиелит, воспалительные кишечные заболевания, реперфузию после инфаркта, например, инфарктов миокарда или церебральных инфарктов, отторжение трансплантата и/или кожных заболеваний, таких
как псориаз, и/или заболеваний, связанных с зависящим RANTES увеличением численности популяций
других лейкоцитов, таких как эозинофилы, в частности, аллергических заболеваний, таких как астма или
пневмония.
Предметом настоящего изобретения также являются фармацевтические препараты, включающие
нуклеиновые кислоты, кодирующие предложенные в изобретении полипептиды. Молекула нуклеиновой
кислоты может присутствовать в обычных векторах.
Другим предметом настоящего изобретения являются средства для предотвращения угнетения моноцитов, включающие предложенные в изобретении полипептиды, их фармакологически приемлемые
соли, производные и/или конъюгаты, предпочтительно включающие полипептиды или аминокислотную
последовательность SEQ ID NO. 3 согласно формуле (3).
В контексте настоящего изобретения термин "средства для предотвращения угнетения моноцитов"
означает средства, способные оказывать положительное влияние на заболевания, связанные с угнетением
моноцитов, например сцепление моноцитов с эндотелием. В частности, с их помощью может быть ослаблено или даже предотвращено развитие артериосклеротических бляшек. Применение предложенных
в изобретении полипептидов предпочтительно приводит к уменьшению или полному или почти полному
предотвращению увеличения численности моноцитов и/или их сцепления с активированным эндотелием,
в частности с артериосклеротическими бляшками и/или неоинтима.
Далее приведены примеры, иллюстрирующие настоящее изобретение.
Материалы и способы.
Культивирование клеток.
В среде для выращивания клеток эндотелия (PromoCell, Гейдельберг) культивировали клетки эндотелия, выделенные из пуповины человека (HUVEC, эндотелиальные клетки пупочной вены человека, от
английского - human umbilical vein endothelial cells, PromoCell, Гейдельберг), и использовали после от
двух до четырех пассажей.
Моноцитарные клетки Mono Mac (MM6, DSMZ) культивировали в среде RPMI 1640 (РАА Laboratories, Пашинг, Австрия) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, 2 мл L-глутамина
(Biowhittaker), 1 мм пирувата натрия, 50 μг/мл гентамицина и 9 μг/мл инсулина (среда ММ6). Клетки
высеяли с плотностью 2×105/мл в 2 мл среды ММ6 на 24-луночные пластинки и в течение от 3 до 4 суток
культивировали при температуре 37°С во влажной атмосфере с содержанием СО2 5% до их использования для экспериментов.
Полипептиды.
Полипептид с последовательностью SEQ ID NO. 3 согласно формуле (3), его мышиный аналог с последовательностью SEQ ID NO. 15 согласно формуле (15) и контрольный пептид с последовательностью
SEQ ID NO. 14 согласно формуле (14) химически синтезировали путем твердофазного синтеза пептидов
-8-
013508
на основе t-Boc с использованием 4-метилбензгидриламиновой смолы, затем очистили путем высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой и необязательно подвергли циклизации в 6М
гуанидин HCl/трис с рН, равным 8. Методом масс-спектрометрии электрораспылением (Dawson, P.E.,
Kent, S. В. (2000), Annu. Rev. Biochem. 69:923-960; Hackeng, T. M., Griffin, J. H., Dawson, P.E. (1999), Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, т. 96, стр. 10068-10073) определили молекулярную массу.
Пример 1. Исследования плазмонного резонанса с целью анализа ингибирующего действия полипептида с последовательностью SEQ ID NO. 3 согласно формуле (3) на образование гетероагрегатов
RANTES и PF4.
Были проведены исследования плазмонного резонанса с использованием буфера HBS-EP (10 мМ
HEPES, 150 мМ NaCl, 0,005% Tween 20, рН 7,4).
Две проточные кюветы пластинки Cl (Biacore AB, Упсала, Швеция) активировали путем инъекции
50 μл этил(диметиламинопропил)карбодиимид/N-оксисукцинимида (0,2 М/0,05 М, Pierce), после чего
осуществили перфузию 20 μл стрептавидина (0,2 мг/мл, Sigma-Aldrich) на активированную поверхность.
Затем поверхность инактивировали путем четырех подряд инъекций 20 μл этилендиамина (1М, рН 8,
Sigma-Aldrich).
Путем твердофазного синтеза пептидов на основе t-Boc и нативного химического лигирования PF4
(Dawson, P.E., Kent, S.В. (2000), Annu. Rev. Biochem. 69:923-960, Hackeng, T.M., Griffin, J.H., Dawson, P.E.
(1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, т. 96, стр. 10068-10073) химически синтезировали биотинилированный
PF4 (bPF4) человека на N-конце. bPF4 иммобилизовали на покрытой декстраном поверхности сенсорной
пластинки Cl путем инъекции 200 μг/мл bPF4 в HBS-EP через одну из проточных камер и зарегистрировали 240 единиц резонанса (RU). Вторую проточную камеру не обрабатывали bPF4 и использовали как
эталон.
Связывание RANTES (0,5 μМ рекомбинатного RANTES человека, Peprotech, Rocky Hill, НьюДжерси, США) или RANTES (0,5 μМ), который предварительно инкубировали с использованием различных концентраций (0 μМ, 10 μМ и 100 μМ) полипептида с последовательностью SEQ ID NO. 3 согласно формуле (3) в буфере HBS-EP в течение ночи при комнатной температуре, с bPF4 определяли путем инъекции 15μл соответствующей смеси пептида/RANTES и наблюдения за связыванием в течение
180 с. Определение связывания и измерения проводили в устройстве Biacore 2000 (Biacore AB) при скорости потока 5 μл/мин. Данные связывания RANTES корректировали с использованием программы анализа BIA 3.0 (Biacore AB) для внесения поправки на неспецифические фоновые сигналы и определяли
равновесные единицы резонанса (RU) для каждой инъекции.
Было установлено, что полипептид с последовательностью SEQ ID NO. 3 согласно формуле (3) способен вызывать зависящее от концентрации ингибирование взаимодействия RANTES и PF4, за счет чего
в присутствии пептида с последовательностью SEQ ID NO. 3 согласно формуле (3) в концентрации 100
μМ до 35% уменьшается связывание RANTES, иммобилизирующее PF4.
Пример 2. Исследования плазмонного резонанса с целью анализа ингибирующего действия полипептида с последовательностью SEQ ID NO. 3 согласно формуле (3), SEQ ID NO. 2 согласно формуле (2)
и контрольного пептида на связывание гетероагрегатов RANTES и PF4.
В другом эксперименте, условия проведения которого описаны в примере 1, исследовали связывание RANTES (0,5 μM) или RANTES (0,5 цМ), который предварительно инкубировали с использованием
0, 10, 50 и 100 μМ полипептида с последовательностью SEQ ID NO. 3 согласно формуле (3), SEQ ID NO.
2 согласно формуле (2) или контрольного пептида с последовательностью SEQ ID NO. 14 согласно следующей формуле (14):
В результате этого эксперимента было установлено, что полипептид с последовательностью SEQ ID
NO. 3 согласно формуле (3) в концентрации 10 μМ, 50 μM и 100 μМ достоверно способен более эффективно ингибировать взаимодействие RANTES и PF4, чем полипептид с последовательностью SEQ ID
NO. 2 согласно формуле (2). Контрольный пептид с последовательностью SEQ ID NO. 14 согласно формуле (14) не продемонстрировал поддающегося обнаружению ингибирования при концентрации 100 μМ.
Пример 3. Ингибирование угнетения моноцитов на активированном эндотелии.
Было исследовано взаимодействие моноцитарных клеток Mono Mac 6 на клетках активированного
эндотелия.
В проточную камеру поместили чашки Петри со сплошными слоями клеток HUVEC, активированных с помощью IL-1β (интерлейкин 1β, Peprotech, 10 нг/мл, 12 ч). Клетки Mono Mac 6 (0,5×106 клеток/мл) ресуспендировали в сбалансированном растворе Хэнкса (HBSS с 10 мМ HEPES (Gibco BRL), рН
7,3, 0,5% бычьего сывороточного альбумина (Serva)) и выдерживали на льду. За пять минут до эксперимента в моноцитарные клетки Mono Mac 6 добавили Са2+ и Mg2+, в результате чего конечная концентрация хемокинов RANTES (Peprotech, Rocky Hill, Нью-Джерси, США) и PF4 (ChromaTec, Грайсвальд) составила 1 мМ и 60 нМ соответственно, а концентрация полипептидов с последовательностью SEQ ID
NO. 2 согласно формуле (2), последовательностью SEQ ID NO. 3 согласно формуле (3) или контрольного
пептида с последовательности SEQ ID NO. 14 согласно формуле (14) составила 6 μМ, после чего раствор
-9-
013508
нагрели до 37°С. Затем осуществили перфузию клеток, предварительно обработанных данным способом,
на клетки эндотелия с усилием 1,5 дин/см2 с помощью микроскопа модели IX 50 компании Olympus. Через 4 мин путем визуального анализа фотографий с помощью видеокамеры (3CCD, JVC) и записывающего устройства определили число моноцитов, прилипших вследствие взаимодействия с клетками эндотелия в различных областях. Для анализа данных использовали среднее значение (n=5) ± стандартное
отклонение (р<0,02) по сравнению с контрольными данными.
Было установлено, что потенцирование угнетения моноцитов вследствие гетерофильного взаимодействия RANTES и PF4 существенно ингибируется, например, до 80% полипептидом с последовательностью SEQ ID NO. 3 согласно формуле (3), а полипептид с последовательностью SEQ ID NO. 2 согласно
формуле (2) продемонстрировал более слабое ингибирование. Контрольный пептид с последовательностью SEQ ID NO. 14 согласно формуле (14) не продемонстрировала существенного ингибирования.
Пример 4. Эксперименты in vivo на модели атеросклероза у мышей.
В качестве модели атеросклероза использовали от 9- до 12-недельных самок мышей из одного помета, с повышенным фактором риска АроЕ (The Jackson Lab, Бар-Харбор, штат Мэн, США). Мыши в
течение 12 недель получали рацион с высоким содержанием жира (21% жира, Altromin® С1061). В течение этого времени мышам в двух группах три раза в неделю делали внутрибрюшные инъекции 50 μг полипептида с последовательностью SEQ ID NO. 15 согласно следующей формуле (15):
(n=12 мышей) или соответствующие инъекции контрольного пептида с последовательностью SEQ ID
NO. 14 согласно следующей формуле (14):
KEYFYTSGK (14) (SEQ ID NO. 14)
(n=7 mice) в физиологическом растворе. Для дополнительного контроля использовали нелеченую группу
мышей (n=12).
Мыши были умерщвлены с целью гистологического исследования. В период проведения эксперимента мыши были здоровы и не демонстрировали каких-либо признаков заболевания. В начале и конце
периода экспериментального питания были взяты пробы крови. Методом гемоцитометрии было определено количество лейкоцитов, взяты образцы сыворотки и определено содержание холестерина с помощью наборов Infinity (Thermo Electron, Мельбурн, Австралия).
Путем окрашивания липидных отложений методом Oil Red-0 (N.R. Veillard, В. Kwak, G. Pelli, F.
Mulhaupt, R.W. James, A.E. Proudfoot, F. Mach, Antagonism of RANTES receptors reduces atherosclerotic
plaque formation in mice. Circ. Res. 2004; 94:253-61) и quantified by means of computerized image analysis
(Diskus software, Hilgers, Aachen) определили степень атеросклероза на аортальном пути и в торакоабдоминальной аорте. Области поражения атеросклерозом определяли на поперечных срезах сердца и аортального пути толщиной 5 μм. Это делали для каждого аортального пути, исходя из окрашенных липидных областей шести срезов на расстоянии 50 μфм друг от друга. Области поражения атеросклерозом разделили на общую площадь поверхности клапана каждого среза. Торакоабдоминальную аорту вскрыли
вдоль вентральной срединной линии, и методом Oil Red-0 окрасили области поражения контрастным
препаратом. Путем деления окрашенной площади на общую площадь торакоабдоминальной поверхности
вычислили пропорциональное количество липидных отложений.
Было установлено, что у мышей, которых лечили полипептидом с последовательностью SEQ ID
NO. 15 согласно формуле (15), мышиным аналогом полипептида последовательности SEQ ID NO. 3 согласно формуле (3), было отмечено значительно уменьшение развития атеросклеротических поражений
по сравнению с мышами, получавшими контрольный пептид. К тому же, было установлено, что у леченых мышей площадь аортального пути с признаками тромбоцитов значительно уменьшилась относительно общей площади поверхности клапана. Также было установлено, что в пораженных областях значительно снизилось содержание макрофагов.
Таким образом, продемонстрировано, что с помощью мышиного аналога полипептида последовательности SEQ ID NO. 3 согласно формуле (3) у мышей может быть задержано развитие атеросклероза in
vivo, и, следовательно, предложенные в изобретении полипептиды применимы для терапии.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Полипептид, его фармакологически приемлемые соли, производные и/или конъюгаты, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 1 согласно следующей формуле (1):
в которой
X1 выбирают из группы, включающей лизин, глутамин, аргинин, гистидин и аспарагин или аминокислотную делецию,
Х2 выбирают из группы, включающей глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту и глутамин
или аминокислотную делецию,
Х3 выбирают из группы, включающей глицин, серин и аланин,
Х4 выбирают из группы, включающей лизин, лейцин и аргинин,
- 10 -
013508
Х5 выбирают из группы, включающей серин, цистеин, глицин и треонин,
Х6 выбирают из группы, включающей серин, глицин и треонин,
Х7 выбирают из группы, включающей аспарагин и глутамин,
Х8 выбирают из группы, включающей пролин, тирозин и глицин,
Х9 выбирают из группы, включающей глицин, аланин и серин,
Х10 выбирают из группы, включающей изолейцин, валин и аспарагин,
X11 выбирают из группы, включающей валин, изолейцин и аспарагин,
Х12 выбирают из группы, включающей фенилаланин, тирозин, изолейцин, валин, лейцин и метионин,
Х13 выбирают из группы, включающей изолейцин, валин, лейцин, метионин и фенилаланин,
Х14 выбирают из группы, включающей треонин, глицин, аланин, серин и тирозин
X15 выбирают из группы, включающей аргинин, лизин, глутамин, гистидин и аспарагин или аминокислотную делецию.
2. Полипептид по п.1, содержащий от 19 до 22 аминокислот.
3. Полипептид по п.1, в котором
X1 представляет собой лизин или аминокислотную делецию,
Х2 представляет собой глутаминовую кислоту или аминокислотную делецию,
Х3 представляет собой глицин или серин,
Х5 представляет собой серин,
Х8 представляет собой пролин или тирозин,
Х9 представляет собой глицин,
X10 представляет собой изолейцин,
X12 представляет собой фенилаланин или тирозин,
Х13 представляет собой изолейцин и
X15 представляет собой аргинин или аминокислотную делецию.
4. Полипептид по п.1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 2 согласно
следующей формуле (2):
или полипептид с последовательностью SEQ ID NO. 2 согласно формуле (2) содержит по меньшей мере
одну или несколько аминокислотных делеций, аминокислотных замен и/или аминокислотных вставок по
сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO. 2 согласно формуле (2).
5. Полипептид по п.1, его фармакологически приемлемые соли, производные и/или конъюгаты, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 3 согласно следующей формуле (3):
6. Полипептид по п.1, его фармакологически приемлемые соли, производные и/или конъюгаты, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 4 согласно следующей формуле (4):
7. Полипептид по п.1, его фармакологически приемлемые соли, производные и/или конъюгаты, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 5 согласно следующей формуле (5):
8. Полипептид по п.1, его фармакологически приемлемые соли, производные и/или конъюгаты, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 6 согласно следующей формуле (6):
9. Полипептид по п.1, его фармакологически приемлемые соли, производные и/или конъюгаты, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 7 согласно следующей формуле (7):
10. Применение полипептида по любому из пп.1-9, его фармакологически приемлемых солей, производных и/или конъюгатов в качестве антагонистов взаимодействия между RANTES и фактором 4 роста тромбоцитов.
11. Применение полипептида по любому из пп.1-9, его фармакологически приемлемых солей, производных и/или конъюгатов для получения фармацевтического препарата.
12. Применение полипептида по любому из пп.1-9, его фармакологически приемлемых солей, производных и/или конъюгатов для получения фармацевтического препарата для лечения и/или профилактики заболеваний, выбранных из группы, включающей заболевания, связанные с увеличением численности моноцитов, таких как сердечно-сосудистые и/или воспалительные заболевания, в частности артериосклероз, атеросклероз, нестабильные бляшки, стенозы, рестенозы, гипертензия, артрит, миокардит; аутоиммунные заболевания, включая энцефаломиелит, воспалительные кишечные заболевания, реперфузию
после инфаркта, отторжение трансплантата и/или кожные заболевания; и/или заболевания, связанные с
зависящим от RANTES увеличением численности популяций других лейкоцитов, таких как эозинофилы,
в частности, при аллергических заболеваниях, таких как астма или пневмония.
13. Фармацевтический препарат, содержащий полипептид по любому из пп.1-9, его фармакологиче- 11 -
013508
ски приемлемые соли, производные, и/или конъюгаты, и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид по любому из пп.1-9.
14. Агент для предотвращения угнетения моноцитов, содержащий полипептид по любому из пп.1-9,
его фармакологически приемлемые соли, производные и/или конъюгаты.
15. Нуклеиновая кислота, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид по любому из пп.1-9.
16. Полипептид, его фармакологически приемлемые соли, производные и/или конъюгаты, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 15 согласно следующей формуле (15):
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 12 -